DD284693A5 - Verfahren zur herstellung rekombinanter dna-molekuele mit einer codierung fuer pektonlyaseexpressionssysteme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung rekombinanter DNA-Molekuele mit einer Codierung fuer Pektinlyaseexpressionssysteme (PL-Expressionssysteme) und deren Derivate, wie die Strukturgene von PLA, PLB, PLC, PLE und PLF, und die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, z. B. Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen, und Hybridvektoren, welche aus entsprechenden DNA bestehen, einschlieszlich Hybridvektoren mit einer DNA-Codierung fuer homologe oder heterologe Polypeptide, Wirte, insbesondere Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, die durch diese Wirte transformiert wurden, Methoden fuer die Herstellung der rekombinanten DNA-Molekuele und der Wirte und der Einsatz der rekombinanten DNA-Molekuele fuer die Herstellung von neuen Expressionssystemen.{DNA-Molekuele; rekombinant-Herstellung; fuer Pektinlyaseexpressionssystem codierend; Sequenzen regulatorisch; Wirt-Fadenpilze}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und beschreibt neue DNA-Moleküle, die aus DNA-Folgen gebildet sind, welche für verschiedene Pektinlyasen von Aspergillus niger und/oder deren Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen codieren. Die neuartigen DNA-Moleküle sind von Nutzen für die Überproduktion von Pektinlyasen in Aspergillus und/oder für die Konstruktion von Hybridvektoren, welche Fremdgene in Faden- und anderen Pilzen expressieren. Es ist nun möglich, eine einzelne Pektinlyase zu produzieren, die nicht mit anderen Pektinlyasen kontaminiert ist.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Obwohl auf dem Gebiet der Gentechnik bereits zahlreiche Polypeptidexpressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Wirte bekannt sind, besteht weiterhin ein Bedarf an neuartigen Systemen, die Vorteile gegenüber den bekannten Systemen aufweisen.

Sehr verbreitet eingesetzt werden der prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaryotische Hefewirt, z. B. Saccharomyces cerevisiae, für welche eine große Zahl unterschiedlicher Hybridexpressionsvektoren, vor allem Plasmide, entwickelt worden ist. Die Nachteile von E. coli-Wirten bestehen darin, daß sie das gebildete Polypeptid nicht glykolysieren können und daß sich auf Grund fehlender Sekretion das Fremdpeptid innerhalb der Wirtszelle akkumulieren und ein weiteres Wachstum verhindern kann. Die Hefewirte glykolysieren, aber wie E. coli scheiden sie die Polypeptide, von ganz kleinen abgesehen, nicht in das Nährmedium aus. Hefen sekretieren nur in den periplasmatischen Raum. Höhere eukaryotische Wirte sind Krebszellen von Säugetieren, die in der Lage sind, zu glykosylieren und in das Nährmedium zu sekretieren, ihre Kultivierung erfolgt jedoch sehr langsam und ist sehr teuer, und es besteht die Gefahr, daß zusammen mit dem gewünschten Peptid onkogene Nukleinsäuren isoliert werden, von denen das Peptid nicht befreit werden kann.

Bei der Suche nach anderen Wirten wurden auch Fadenpilze, beispielsweise Neurospora crassa, Aspergillus nidulans und Aspergillus niger, untersucht. Solche Pilze werden für industrielle Zwecke bereits verbreitet angewendet, ihre Anwendung in der Gentechnik dagegen blieb zurück, vor allem auf Grund des Fehlens entsprechender Transformationssysteme. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze keine Plasmide, welche für die Einführung von Fremdgenen und für die Phänotypauswahl genutzt werden könnten. Es ist jedoch möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, welches ein wählbares Markergen enthalten, zu transformieren. Alle bisher für Fadenpilze beschriebenen Vektoren replizieren nicht autonom, wie das bei Hefen der Fall ist, sondern werden in das Pilzchromosom integriert. Das geschieht nur mit einer sehr geringen Frequenz. Vorteilhaft ist es dagegen, daß die integrative Transformation die Transformanten mitotisch sehr stabil macht, selbst unter nicht-selektiven Bedingungen. Es wurde über die stabile Integration von mehr als einhundert Kopien berichtet. Der erste beschriebene Vektor für Fadenpilze enthielt als selektierbaren Marker das qa-2-Gen von Neurospora crassa. Dieses Gen codiert die enzymkatabolische Dehydrochinase und kann als funktionell Komplentierung von Aro-Mutanten von N.crassa verwendet werden (Case, M. E., Schweizer, M., Kushner, S. R. und Giles, N. H. [1979], Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 5259-5263). Aro-Mutanten können ohne ein aromatisches Aminosäurensupplement nicht auf Minimalmedium wachsen. Die Transformation von N.crassa durch den qa-2-Vektor erfolgte durch Integration einer einzelnen Kopie des Plasmids in das Chromosom. Bei 30% der stabilen Aro⁺-Integranten war das integrierte qa-2-Gen noch an die bakteriellen Plasmidfolgen gebunden (Case, M.E. [1982] in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals [Gentechnik von Mikroorganismen für Chemikalien] [Hollander, A.,

DeMoss, D., Kaplan, S., Konisky, J., Savage, D. und Wolfe, R.S., Hsg.L S.87-100, Plenum). Durch diese Beobachtung wurde die Kotransformation von nichtselektiven DNA-Folgen zusammen mit selektiven zu einer realisierbaren Aufgabe. Bei Asperglllus nidulans, das einen Sexualzyklus hat und damit für klassische genetische Manipulationen geeignet ist, wurden

sowohl negative als auch positive Selektionssysteme identifiziert. Unter Verwendung von heterologer DNA von N.crassa oderhomologer DNA wurde die funktionell Komplementierung von A.nidulans-pyrG-Mutanten durch Transformation mit

Plasmiden, welche das pyrG-Gen enthielten, erreicht (Bailance u. a., BBRC112,284 [1983]; Tilburn u. a., Gene 26,205,1983). Bei

anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Lokus durch Transformation mit den geeigneten Plasmidenfunktionell komplementiert. (Yelton, u.a., PNAS 81,1470,1984; Yelton et Timberlake, J.Cell Biochem. Suppl. 9C173,1985;

Johnstone u.a., EMBOJ. 4,1307,1983) Ein dominantes positives Selektionssystem wurde auch unter Verwendung des amdS-Gens entwickelt, das aus A. nidulans

isoliert wurde und es ermöglicht, daß damit transformierte A. niger auf Azetamid als der einzigen Stickstoffquelle wachsen(Tilburn u.a., Gene26,205,1983; Wernars u.a.,Curr. Genet.9,361,1985; Kelly, J.M. u.a., EMBOJ.4,475,1985).

Im Vergleich zu N.crassa oder A. nidulans ist A. niger der bei weitem wichtigere Organismus. Er wird verbreitet bei der

industriellen Produktion von Enzymen eingesetzt, z. B. zum Einsatz in der Nahrungsmittelindustrie. A. niger unterscheidet sichvon A. nidulans dahingehend in seiner sekretorischen Kapazität, daß es eine Vielfalt von hydrolytischen Enzymen sekretiert, z. B.

Glukoamylase, a-Amylase, Pektinase, Zellulase, ß-Glukanase, ß-Galaktosidase, Naringinase, Pentosanase, Säureprotease und Lignase, wobei der Glukoamylase- und Pektinasekomplex die wichtigsten sind. A. niger hat keinen bekannten Sexualzyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt

werden. Durch klassische Mutations- und Selektionsverfahren sind jedoch umfassende Stammverbesserungen in der Sekretionvon hydrolytischen Enzymen erreicht worden.

Von den Genen der A.niger-Enzyme wurden nur die von Glukoamylase (Boel u.a., EMBO J. 3,1581,1984) und Alkohol und Aldehyddehydrogenase (WO 86/06097) zusammen mit ihren Promotor- und Signalsequenzen charakterisiert und bei Transformationsexperimenten mit A. nidulans bzw. A. niger eingesetzt. Als Selektionsmarker für A. niger wurden das heterogene

amds-Gen (Kelly und Hynes, EMBO J. 4,475,1985) und das argB-Gen (Buxton u.a., Gene 37,207,1985; EP 184438; WO 86/06097), die beide von A. nidulans gewonnen wurden, verwendet.

A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Produktion von pektinabbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalakturonide mit hohem Molekulargewicht (20000 bis 40000 D) die aus a-1,4-glykosidisch gebundenen D-Galakturonsäurepolymeren bestehen und in der Natur als Bestandteile von höheren Pflanzenzellen vorkommen, wo sie an Zellulosemoleküle gebunden werden und wo sie vor allem in der Primärzellwand und der mittleren Lamelle vorkommen. Zu den

reichsten Pektinquellen gehören Zitronen- und Orangenschale, die etwa 30% dieses Polysaccharids enthalten. Pektinenzymebauen das Kohlenhydratpolymersubstrat entweder durch Hydrolyse der a-1,4-Glykosidbindung(Polygalakturonase) oder durch

Transelimination des a-4,5-ungesättigten galakturonischen Restes des Pektinmoleküls (unterschiedliche Pektinlyasen) ab. Der Systemname von Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC 4.2.2.10). In A. niger werden die Proteine des Pektinkomplexes nicht konstitutiv expressiert. Unter induzierenden Bedingungen expressiert A. niger bei Verwendung von Pektin oder dessen Abbauprodukten die oben genannten Enzyme, einschließlich PLI, wenn andere Kohlenstoffquellen, wie Glukose oder Sukrose, begrenzend sind. Bei Oberflächenkulturen besteht für Pektinenzyme die Tendenz,

der äußeren Zellwand zugeordnet zu bleiben. Eine Zunahme der Pektin- und der Ca²⁺-Konzentration im Medium führt zurvollständigen Sekretion.

Pektinasen, beispielsweise PLI, werden von der Nahrungsmittelindustrie vor allem zum Klären von Fruchtsäften eingesetzt. Aus A. niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise von F. E. A. Van Houndenhoven (22)

charakterisiert. PLI enthält vier Mannosereste, während PLII jeweils zwei Mannose- und Glukosereste enthält. Die Enzyme habenunterschiedliche Molekulargewichte (PLI: 37,5kD, PLII: 36kD). Die Aminosäurefolge von PLI wurde bestimmt und in

EP 88101397.3 offengelegt. Diese Erfindung basierte auf einer partiellen Strukturbestimmung von Pektinlyase I (PLI), was die Synthese von DNA-Sonden mit einer Codierung für relevante Teile des Proteins ermöglichte. Mit Hilfe der DNA-Sonden war es

möglich, auf DNA-Codierung für PLI zu screenen und diese, eventuell zusammen mit deren Vor- und Nachfolgen, aus einer

Genbibliothek von A. niger zu isolieren. Durch Hybridisieren von Teilen des PLI-Gens auf eine genomische Bibliothek von A. niger konnten weitere PL-Gene entdeckt

werden, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind. Das PLI-Strukturgen mit dem N-Endflankierungsbereich, das von

A. niger N756 gewonnen wurde, ist am N-Ende mit dem PLD-Gen identisch, das von A. niger N400 gewonnen wurde. Demzufolge

ist letztgenanntes nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Das vorliegende PLA scheint Teil des früher gereinigten PL-Gemischesmit der Bezeichnung PLII zu sein.

Nachstehend wird PLI auch als PLD bezeichnet, und das PLI-Strukturgen hat die Bezeichnung pe1D. Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung werden rekombinante DNA-Moleküle, die aus DNA-Folgen bestehen, welche neuartige Pektinlyaseexpressionssysteme und deren Derivate codieren, wie die Strukturgene dieser Pektinlyasen und entsprechende regulatorische Sequenzen, z.B. Promotor-, Signal- und Terminatorsequenzen, und Hybridvektoren, die aus entsprechenden DNA bestehen, einschließlich Hybridvektoren mit einer DNA-Codierung für homologe oder heterologe Polypeptide, Wirte, vor allem Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, welche durch diese Vektoren transformiert wurden, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Moleküle und dieser Wirte und der Einsatz der rekombinanten DNA-Moleküle für die Herstellung von neuen Expressionssystemen bereitgestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung neuartiger Pektinlyaseexpressionssysteme

zur Verfügung zu stellen.

Die neuartigen Pektinlyaseexpressionssysteme bestehen aus DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotoren, die Signalsequenzen, die Strukturgene und die Terminatoren dieser neuartigen Pektinlyasegene. Die neuartigen Pektinlyasen

werden als PLA, PLB, PLC, PLE und PLF bezeichnet.

Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung. Hybridvektoren zu konstruieren, die aus DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotoren von PLA, PLB, PLC, PLE und PLF bestehen, wahlweise für die Signalsequenz dieser Proteine und

wahlweise für deren Terminatoren. Diese Hybridvektoren werden für die Einbeziehung von Genen mit der Codierung fürbestimmte Proteine und für die Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium verwendet.

Die Kotransformation von A. niger mit zwei verschiedenen Plasmiden kann durchgeführt werden, wobei eine der Plasmide aus

der Gruppe der neuartigen Hybridvektoren der Erfindung ausgewählt wird und das andere ein speziell konstruiertes

Selektionsplasmid ist, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines Fadenpilzes wirksam wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Überproduktion dieser neuartigen Pektinlyasen in den Aspergillus-Spezies und die Produktion von einzelnen PL, die durch andere PL unkontaminiert sind, oder von deren festgelegten künstlichen Gemischen. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion jedes Proteins, dessen Strukturgen bei Vorhandensein oder unter Kontrolle der vorliegenden rekombinanten PL-DNA expressiert werden kann. Die verschiedenen Ziele der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das aus einer DNA-Folge

mit der Codierung für die Expressionssysteme der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder deren Derivate besteht.

Unter dem Begriff „Expressionssystem" versteht man eine DNA-Folge, die in der Lage ist, ein Polypeptid zu expressieren, und

aus dem Promotor, der Signalsequenz, dem Strukturgen und dem Terminator besteht.

Wird der Begriff „Derivat" in Verbindung mit den neuartigen DNA-Folgen verwendet, soll er größere Derivate oder Ableitungen

mit Flankierungssequenzen, Fragmente der genannten DNA-Folge, Mutanten, vor allem natürlich vorkommende Mutanten, und

DNA-Folgen einschließen, die entsprechend dem genetischen Code degeneriert sind. Größere Derivate der neuartigen rekombinaten DNA-Moleküle sind die, welche aus dem A.niger-Genom herausgeschnitten

werden können und aus den DNA-Folgen bestehen, die in den Abbildungen 1 bis 3,5 und 6 gezeigt werden, wie sie beispielsweisein einer genomischen Bibliothek von A. niger N400 gefunden werden, gewonnen durch Fragmentierung der Nukleinsäuren,

Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z.B. EcoRI, BamHI oder Hindlll, Ligierung in einen

geeigneten Vektor, z.B. das Lambda-Phag und Plasmid pBR322, Klonieren, z.B. in E.coli, und erneutes Schneiden mit demgleichen Restriktionsenzym. Solche Derivate sind z. B. die Inserte der Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW 860und pGW880, die in den Abbildungen 1,2,3,4,5 und β gezeigt werden.

Fragmente der DNA-Folge mit der Formel I (Abb.9) sind die, welche sich zwischen zwei Restriktionsstellen dieser Plasmide

befinden und Promotor-, Signal-, Struktur-oder Terminatorfunktionen beibehalten.

Bevorzugte Fragmente sind die, welche die Promotorsequenz, die Signalfrequenz, das Strukturgen eines neuartigen PL oder die Terminatorsequenz oder jede Kombination dieser Elemente enthalten. Die Fragmente der DNA-Folge können Linker enthalten, die eine erfolgreiche Bindung an andere DNA-Moleküle ermöglichen. Die PL-Promotorfolge ist im DNA-Bereich vor dem Strukturgen enthalten und besteht aus bis zu 2000, vorzugsweise bis zu etwa

1000 bis 1400 Nukleotiden. In pGW820 befindet sich der Promotor auf der Sequenz zwischen Sail (1240) und Pstl (2420) als

Restriktionsstellen. Für die Promotorsequenz sind die TATAA-Boxen als die RNA-Polymeraseerkennungsstellen wichtig. Auf PeIA befindet sich die TATAA-Box an der Position 1221 (Abb. 10), auf pelB in Position 951 (Abb. 11) und auf pelC bei Position 1261

(Abb. 12). Die kurzen Promotoren etwa von den TATAA-Boxen bis zum Beginn der Signalsequenzen sind für die nichtinduzierte

Expression der Polypeptide von besonderem Interesse. Wenn eine pektininduzierte Expression erforderlich ist, sind die Sequenzen oberhalb der TATAA-Boxen für die Regulierung der Stärke des Promotors erforderlich. Diesen Fragmenten können

geeignete Linker angefügt werden.

Der Promotor des PLI von A. niger ist induzierbar, d. h., die Expression des diesem angefügten Strukturgens, z. B. das Strukturgen

mit der Codierung für ein PL oder ein Fremdgen, wird durch den Zusatz von Pektin oder Pektinabbauprodukten zum Mediuminduziert. Fehlt Pektin und ist ausreichend Glukose vorhanden, wird der Promotor nicht wirksam. Fehlen die oberhalb gelegenenregulatorischen Sequenzen, wird der Promotor konstitutiv.

Die DNA-Codierung für die Signalsequenz erstreckt sich zwischen dem Ende des Promotors und dem Beginn der Sequenz mit der Codierung für das reife Protein. Bei PLA und PLB enthält die Signalsequenz etwa 20 Aminosäuren, bei pelC sind es etwa

18 Aminosäuren. Der entsprechende Codierungsbereich erstreckt sich bei pelA vom ATG-Codon in der Position 1361 bis hinunterzur Pstl-Schneidestelle in der Position 1420, bei pelB von der Position 1134 bis wenigstens zur Position 1191 und bei pelC von der

Position 1368 bis zur Position 1422. Wie aus den Formeln I, Il und III hervorgeht, enthalten die Strukturgene von PLA, PLB und PLC mehrere Introns. Die Strukturgene

können auch geeignete Linker enthalten.

Die Terminatoren beginnen mit den Stoppcodons, z. B. TAA, und können bis zu einer der Restriktionsstellen innerhalb dieser Sequenzen reichen. Das Terminatorfragment enthält wenigstens 300bρ und kann geeignete Linker enthalten. Geeignete Linker für die obigen Fragmente haben eine DNA-Folge, die in die Restriktionsstelle der DNA paßt, an die das Fragment

gebunden ist. Sie können eine festgelegte Restriktionsstelle enthalten.

Fragmente der DNA-Folge der Erfindung sind auch die, welche aus kleineren Fragmenten zusammengesetzt sind, z. B. solche, die

den Promotor, den Promotor und die Signal- oder Struktursequenz, das Signal und die Struktursequenz oder das Strukturgenohne die Introns und ähnliche, enthalten.

Mutanten der DNA-Folge der Erfindung sind z.B. natürlich vorkommende Mutanten. Die Erfindung beinhaltet auch natürliche

oder synthetische Mutanten der Signalsequenz mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z. B., wenn Codonsfür die polaren Aminosäuren Lysin (K⁵⁺), Tyrosin (Y⁸") und Arginin (R⁸⁺) ausgetauscht werden durch Codons für andere

Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leuzin (L) und Threonin (T) ersetzt

werden durch Codons für andere hydrophobe Aminosäuren. Beispielsweise kann das Codon für das positiv geladene Lysin durch einen Codon für Arginin ersetzt werden und umgekehrt, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nichtpolare, hydrophobe Alanin durch eines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleuzin, Leuzin, Methionin oder Phenylalanin und ähnliches. Andere Mutationen sind „schweigende Mutationen", bei denen ein oder wenige Nukleotide, z. B. bis zu etwa 30, durch ein oder mehrere andere Nukleotide ersetzt werden, wodurch die neuen Codons die Codierung für dieselbe(n) Aminosäure(n) aufweisen.

DNA-Folgen der Erfindung, die abgebaut werden, sind wie die schweigenden Mutationen solche, die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes dahingehend abgebaut werden, daß eine unbegrenzte Zahl von Nukleotiden durch andere Nukleotide ersetzt wird, ohne die Aminosäurenfolge zu verändern, für die sie codieren. Solche degenerierten DNA-Folgen können auf Grund ihrer unterschiedlichen Restriktionsstellen von Nutzen sein.

Rekombinante DNA-Moleküle, die eine DNA-Folge der Erfindung oder deren Derivat enthalten, sind vor allem rekombinante Vektoren, auch als Hybridvektoren bezeichnet, welche diese DNA-Folgen als Inserts enthalten. Sie können zum Klonieren in Wirten, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden von jedem Vektor abgeleitet, der auf dem Gebiet der Gentechnik eingesetzt wird, beispielsweise von Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder Chromosomal-DNA, wie die Derivate von Phag λ, ζ. B. NM 989, oder von Phag M13, z. B. M13mp8-Phag-DNA (Lit. 15), linearisiert durch BamHI-Verdauung, bakterielle Plasmide, z.B. pBR322, pUN121, pUC18, oder Hefeplasmide, z.B. Hefe-2u-Plasmid, oder auch Chromosomal-DNA, abgeleitet z. B. von Aspergillus, z. B. A. niger, z. B. die durch EP 184438 offengelegten, oder defekte Phage oder defekte Plasmide bei Vorhandensein eines Helferphags oder eines Helferplasmids, welche die Replikation dieser defekten Phage oder Plasmide ermöglichen, z.B. M 13(+)KS-Vektor bei Vorhandensein von z. B. dem Helferphag M13KO7. Ein Hybridvektor nach der Erfindung enthält, neben den DNA-Folgen nach der Erfindung oder deren Derivat, eine Replikationsstelle und wahlweise, in Abhängigkeit vom Typ des DNA-Derivats, eine Expressionssteuerungssequenz, wie eine Erweiterungssequenz, oberhalbe Aktivierungsstelle, eine Promotor- und Signalsequenz und/oder ein Strukturgen, das sich von dem unterscheidet, das in A.niger-abgeleiteten Sequenzen vorhanden ist. Eine solche Erweiterungssequenz kann von der extrachromosomalen ribosomalen DNA von Physarum polyce-phalum (PCT/EP 8500278) abgeleitet sein, oder es kann die Flußaufwärts-Aktivierungsstelle des Säurephosphatase-PHO5-Gens (EP Appl. Nr.86111 820.6) oder das PHO5, trp PHO5-GAPDH-Hybrid (EP Appl. Nr.86111 820.6) oder der ähnliche Promotor sein.

Strukturgene, die mit den vorliegenden Promotor·, Signal- und/oder Terminatorsequenzen ligiert sind, sind neben denen mit der Codierung für die Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE und PLF mit oder ohne Introns auch andere homologe Pektinlyasegene, z. B. das PLD- (oder PLI-) Gen, oder andere Aspergiltus-Gene und heterologe Strukturgene, die von genomischer DNA oder von cDNA abgeleitet wurden, die über die mRNA-Route hergestellt oder chemisch synthetisiert werden können, mit einer Codierung für eine breite Vielzahl von nützlichen Peptiden, einschließlich glykosylierten Polypeptiden, vor allem von höherem eu karyotischen, besonders Säugetier-, wie tierischen oder speziell menschlichen, Ursprung, wie Enzymen, die beispielsweise für die Produktion von Nahrungsmitteln und für die Durchführung von enzymatischen Reaktionen in Chemie eingesetzt werden können, oder Polypeptide, die nützlich und wertvoll für die Behandlung von Krankheiten bei Mensch und Tier oder für deren Verhinderung sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, antiviralen und Antitumoreigenschaften, Antikörper, Virenantigene, Vakzine, Gerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und ähnliche.

Beispiele für solche heterologe Strukturgene sind z. B. die mit der Codierung für Hormone wie Sekretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierende Hormone, Parathyroidhormon, Adrenokortikotropin, melanozytstimulierendes Hormon, ß-Liptropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor, insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF), z. B. IGF-I und IGF-II, Mastzellenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, gliaabgeleiteter Nervenzellenwachstumsfaktor oder transformierenden Wachstumsfaktor (TGF) wie TGFß, Wachstumshormone wie Menschen- oder Rinderwachstumshormone, Interleukin wie lnterleukin-1 oder -2, menschlicher makrophagmigrationshemmender Faktor (MIF), Interferone wie menschliches α-Interferon, beispielsweise Interferon-aA, aB, aD oder aF, ß-lnterferon, γ-lnterferon oder ein Hybrid-Interferon, beispielsweise ein aA-aD- oder ein aB-aD-Hybridinterferon, vor allem das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren wie α,-Antitrypsin, SLPI und ähnliche, Hepatitisvirusantigene, wie Hepatitis-B-Virus-Oberflächen- oder -Kernantigen oder Hepatitis-A-Virusantigen oder Hepatitis-NonA-NonB-Antigen, Plasminogenaktivatoren wie Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, ß-Endorphin, Immunoglobuline wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunoglobulin D, E oder G oder Mensch-Maus-Hybridimmunoglobuline, Immunoglobulinbindungsfaktoren wie -Immunoglobulin E-bindungsfaktor, Calzitonin, menschliches calzitoninverwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie die Faktoren IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin wie Eglin C, Hirudin, Desulfatorhirudin, wie Desulfatorhirudinvariante HV1, HV2 oder PA, menschliche Superoxiddismutase, Virenthymidinkinase, ß-Laktamase, Glukoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die mit einer Codierung für ein menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, menschlichen Gewebeplasminogenaktivator U-PA), Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAG), insulinähnlichen Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, z. B. Variante HV1. Bei den Hybridvektoren der vorliegenden Erfindung sind die vorliegende Promotor- und/oder Signalfolge operabel mit dem Polypeptidcodierungsbereich verbunden, um so die effektive Expression des Polypeptids zu gewährleisten. Die DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung können in Abhängigkeit von dem Wirt, der transformiert, selektiert und Moniert werden soll, selektive Marker enthalten. Es kann jedes Marker-Gen verwendet werden, welches die Auswahl von Transformanten auf Grund der phänotypen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Mai .:er sind vor allem solche, die eine antibiotische Resistenz expressieren, z.B. gegen Tetrazyklin oder Ampizillin oder, bei auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene übermitteln beispielsweise Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Zykloheximid oder vermitteln Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise die Gene ura3, Ieu2, his3 oder trp1. Möglich ist es auch, als Marker Strukturgene einzusetzen, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt für das Produkt, das durch den Marker expressiert wird, auxotroph ist. Von besonderer Bedeutung sind Markergene, welche A. niger-Wirtsläsionen komplentieren, sie das argB-Gen mit der Codierung für Ornithinkarbamoyltransferase, z. B. abgeleitet von A. niger oder A. nidulans (EP 184438), oder A. nidulans-DNA-Fragmente, die zum N.crassa-pyr4-Gen homolog sind (26).

Bevorzugte Ausführungsbeispiele für die vorliegende Erfindung sind Hybridvektoren, bei denen das Strukturgen, insbesondere

das heterologe Strukturgen, operativ an die Promotor- und Signalsequenzen der vorliegenden Erfindung gebunden ist. Einsolcher bevorzugter Hybridvektor ist z. B. pUCl9/pel;-IFN AM 119. Ein anderer bevorzugter Hybridvektor ist z. B.

M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119. Bei einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel nach der vorliegenden Erfindung ist das Strukturgen, insbesondere das

heterologe Strukturgen, operativ direkt mit den Promotorsequenzen nach der vorliegenden Erfindung verbunden. Ein solcherbevorzugter Hybridvektor ist z.B. M 13(+)KS/pelA ss-IFN AM 119.

Die DNA-Moleküle nach der Erfindung und deren Derivate, einschließlich Fragmente, können zum Screenen von DNA-Genbänken oder mRNA nach weiteren ähnlichen DNA oder mRNA genutzt werden. Die Erfindung betrifft vor allem ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls mit einer Codierung für das Expressionssystem von Pektinlyase PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder dessen Derivat, welches darin besteht, einen Wirt zu

züchten, der mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, das eine DNA-Folgencodierung für das

Pektinlyaseexpressionssystem oder dessen Derivat enthält, und das gewünschte rekombinante DNA-Molekül oder dessen Derivat zu isolieren oder dieses durch In-vitro-Synthese herzustellen. Die Züchtung der Wirte erfolgt in einem herkömmlichen Nährmedium, das durch chemische Verbindungen, welche eine positive

oder negative Selektion der Transformanten ermöglichen, ergänzt oder von diesen befreit werden kann, d. h„ solchen Wirten, diedas gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker aus den Nichttransformanten, d.h., solchen Wirten,denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt.

Es können alle auf diesem Gebiet anwendbaren Wirte eingesetzt werden, z. B. Bakterien wie E. coli, Pilze wie Saccharomyces

cerevisiae oder vor allem Fadenpilze wie Aspergillus, z. B. A.nidulans, А.огугае, A.carbonarius, A. Awamori und vor allem

A. niger. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger An8, ein neuartiger Mutant ohne das pyrA-Gen, wie weiter unten beschrieben wird. Die Transformation der Wirte erfolgt nach herkömmlichen Methoden. Die DNA-Folgecodierung für das PL-Expressionssystem erhält man aus Fadenpilzen, die ein solches System enthalten, vor allem

aus deren genomischer Bibliothek, oder auch über die mRNA.

Nachfolgend wird die Herstellung der vorliegenden PL-Expressionssysteme ausführlicher beschrieben. Eine genomische Bibliothek kann hergestellt werden z. B. durch partielle Verdauung von genomischer DNA eines A. niger· Stammes, z. B. N 756 oder N400, mit z. B. Sau3AI oder Mbol und Klonierung der DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht in

einen geeigneten Wirtsvektor, z. B. das E. coli-Plasmid pUN 121, oder einen Lambda-Vektor, z. B. EMBL4.

Jeder andere A. niger-Stamm, der die gewünschten PL erzeugt, kann ebenfalls als Quelle für die genomische Bibliothek dienen,

und ebenso kann jeder andere geeignete Vektor als Rezipient für die Fragmente eingesetzt werden.

Um die genomische Bibliothek erfolgreich nach DNA-Folgen mit der Codierung für PL screenen zu können, wird eine

hybridisierende DNA-Sonde gebraucht. Das kann eine synthetische DNA-Sonde sein, wenn die Folge des gewünschten PLbekannt ist, oder es kann ein bekanntes PL-Gen oder Teile davon können es sein. Die erste Methode wurde angewendetem das

PLI-Gen zu finden, wie das in EP 88101397.3 beschrieben wird. Die zweite Methode wurde in der vorliegenden Erfindung

angewendet. Da die gesamte DNA-Folge des PLI-Gens verfügbar wurde, können nun entweder DNA-Folgen, die das gesamte

Gen enthalten, oder jeder Teil davon mit wenigstens 14bpzum Screenen verwendet werden, was auch das Screenen nach

mRNA mit Codierung für das PL-System einschließt.

Für Screening-Zwecke werden die DNA-Sonden 5'-radioaktiv nach den bekannten Methoden unter Verwendung von Y³²P-ATP

und T4-Kinase markiert. Wirtsmikroorganismen, welche die Nukleinsäuren nach der vorliegenden Erfindung tragen, als Insert,werden durch Hybridisierung mit der markierten DNA-Sonde auf Filterkopien der Genbibliothek identifiziert.

Klone, die eine Hybridisierungsreaktion auf eine oder mehrere DNA-Sonden aufweisen, werden isoliert und vermehrt. Die angewendeten Hybridisierungsbedingungen können mehr oder weniger streng sein, z. B. einfach durch Wahl

unterschiedlicher Temperaturen, und in Kombination mit dem Einsatz unterschiedlicher DNA-Sonden, die vom PLI (oder

PLD-)Gen abgeleitet wurden, z.B. durch Messung der verschiedenen Hybridisierungsreaktionen auf das komplette 1,6-kbp- BamHI/Pstl-Fragment, das 649-bp-BamHI/Xhol-Fragment (das N-Endfragment) und das 244-bp-Xhol/Pstl-Fragment (das C-Endfragment) von pCG3B11 oder pGW840 (Abb.4), können die Klone in verschiedene Klassen auf der Grundlage ihre Grades

von Homologie eingeteilt werden (Tabellen Il oder IV). Fünf λ-Vektoren (λ-PL113, X-PL122, \-PL109, \-PL102 und λ-PL116) wurdenschließlich identifiziert, restriktiert und in pBR 322 Subklone ihre pel-Gene hergestellt, was zu den Plasmiden pGW820, pGW830,pGW850, pGW860 und pGW880 führte (Abbildungen 1 bis 3,5 und 6). Die fünf Gene dieser Klone werden als pelA, pelB, pelC,pelE bzw. pelF bezeichnet.

Die Gene können sequenziert werden. Vollständige Sequenzen von pelA, pelB und pelC werden durch die Formeln I, Il und III

dargestellt (Abbildungen 10,11 und 12).

Eine rechnergestützte Suche nach Konsensus-Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungsstellen sowie nach Intron- Innensequenzen (Boel E. u.a. [24] und Mount S.M. [25]) führt dazu, wie in pelDdas Vorhandensein von vier Introns in pelAund

pelB (Abbildungen 10 und 11) und von drei Introns in pelC (Abb. 12) zu postulieren.

Die Plasmide pGW820, ρGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 werden zur Herstellung anderer rekombinanter DNA-Moleküle nach der Erfindung verwendet. Diese anderen DNA-Moleküle werden auf herkömmliche Weise durch Anwendung herkömmlicher Restriktionsenzyme, Linker, Ligierungs-, Vermehrungs- und Isolierungsprozesse r ergestellt. Beispielsweise wird das Plasmid pGW820 mit Hindlll restriktiert. Das 3,9-kbp-Hindlll-Fragment wird in die Hindlll-Stelle von

pBR322 subkloniert. Das 3,3-kbp-BamHI-Hindlll-Fragment des gewonnenen Plasm ids pGW822 mit dem pelA-Gen wird in die

BamHI- und Hindlll-Stelle des Vektors pUC 19 kloniert und ergibt einen als pUC 19/pelA bezeichneten Vektor. Das Strukturgen

von pelA wird durch Verdauung mit Sail und Pstl herausgeschnitten. In das verbleibende Fragment, das die pelA-Promotor-,-Signal- und -Terminatorsequenzen enthält, wird zwischen die Signal- und die Terminatorsequenz ein Gen mit einer Codierungfür das Interferonhydrid BDBB durch einen geeigneten Linker ligiert. Das gewonnene Plasmid wird als pUC19/pelA-IFN AM 119(Abb. 11) bezeichnet und enthält die Promotor- und Signalsequenz von pelA, das IFN-BDBB-Gen und den pelA-Terminator, deran das

Hindlll-BamHI-Fragment von pUC 19 angefügt ist. Dieses Plasmid wird mit pCG59D7 in den uridinauxotrophen A. niger-Mutanten An8(DSM 3917)kotransformiert. Transformanten werden in Minimalmedium, das Arginin und Bacto-Agar enthält, selektiert

und auf Interfereon-Expression analysiert.

Bet einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Signalsequenz von pelA gelöscht werden. Das gewonnene Plasmid wird als M13(+)KS/pelA_uss-IFN Am 119 bezeichnet und enthält die Promotorsequenz von pelA, das IFN-BDBB-Gen und den pelA-Terminator, der an das Hindlll-BamHI-Fragment des Bluescript-M13(+)KS-Vektors angefügt ist. Dieses Plasmid wird mit pCG59D7 in den uridinauxotrophen A. niger-Mutanten An8 (DSM3917) kotransformiert. Transformanten werden in Minimalmedium, das Arginin und Bacto-Agar enthält, selektiert und auf Interferon-Expression analysiert.

Mutanten, die neue Restriktionsstellen enthalten, können beispielsweise in vitro durch stellengerichtete Mutagenese nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden (siehe Übersichtsartikel von M. J. Zoller und M. Smith, Methods Enzymol. 100,468 [1983]; D.Botstein und D.Shortle, Science229,1193 [1985] oder K.!Morris u.a., Nucl. Acids Res. 11,5103 [1983]).

Für höhere Expressionsraten kann jede eukaryotische Terminatorsequenz an das Ende des Strukturgens ligiert werden.

Bakterien werden nach einer herkömmlichen Methode transformiert, und die Transformanten werden durch ihre Resistenz, z.B.

gegen Tetrazykiin, identifiziert.

Speziell werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB101, vermehrt, transformiert und nach gebräuchlichen Methoden für das Fachgebiet selektiert. Die vermehrte Plasmid-DNA wird nach herkömmlichen Methoden, wie sie vor allem von Birnboim und DoIy (23) beschrieben wurden, von den Bakterien isoliert.

Auf ähnliche Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterologen Genen konstruiert werden.

Die DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung können auch nach herkömmlichen Methoden durch eine In-vitro-Synthese hergestellt werden. Die In-vitro-Synthese kann vor allem für die Herstellung kleinerer Fragmente des PL-Expressionssystems eingesetzt werden, z. B. von DNA-Folgen mit der Codierung für die Promotor- oder die Signalsequenz der PL oder deren Mutanten.

DNA-Moleküle nach der vorliegenden Erfindung, die einen PL-Promotor und wahlweise eine PL-Signalsequenz, ein PL-Strukturgen, jedes andere heterologe Strukturgen und/oder einen PL-Terminator enthalten, können auch für die Transformation von Fadenpilzen wie Asperglllus, Penlcllllum oder Cephalosporium, z. B. A. nidulan, A. oryzae, A. carbonarius, A.

awamori und vor allem A. niger, eingesetzt werden.

Um die Selektion der transformierten von den nichttransformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder werden als Alternative die Pilze mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, kotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein expressierbares Strukturgen, dessen expressiertes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen Verbindungen vermittelt, die für den Transformanten toxisch sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten vervollständigt, dem ein solch wesentliches Polypeptid fehlt. Solche Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.

Wie in EP 88101397.3 beschrieben wird, wurde aus der genomischen Bibliothek von A. niger ein neuartiges Markergen mit der Bezeichnung pYrA isoliert, das mit pyrG von A. nidulans und pyr4 von N. crassa verwandt ist und ähnliche Funktion hat, nämlich die Produktion des Enzyms Orotidin-5'-phosphatdekarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Dekarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat in Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluoroorotinsäure in das toxische Fluorouridin. Ein E.coli-Klon, der das pyrA-Gen enthält, wurde durch Hybridisieren mit dem 1,1 -kb-Hindlll-Fragment von pDJB2 (24), welches einen Teil des pyr4-Gens enthält, identifiziert, es kann jedoch auch DNA von jedem anderen руг-Gen, das Orotidin-5'-phosphatdekarboxylase codiert, verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E. coil B75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7 mit dem pyrA-Gen isoliert und für die Kotransformation eines A. niger-pyrA'-Mutanten verwendet. Einem solchen pyrA~- Mutanten fehlt das Orotidin-5'-phosphatdekarboxylasegen, und es ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Ein solcher Mutant wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N756 unter einer mutierenden UV-Bestrahlung hergestellt, und die bei Vorhandensein von Fluoroorotinsäure und Uridin überlebenden Kolonien wurden ausgewählt. Kolonien, die bei Vorhandensein von Fluoroorotinsäure und Fehlen von Uridin überleben, wurden ausgeschaltet.

Die verbleibenden uridinbenötigenden Mutanten gehören nach ihrer Fähigkeit, transformierbar zu sein, zu zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An 8 bzw. An 10 dargestellt werden. Sie werden in Form ihrer Protoplaste unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA-haltigen Plasmid pCG59D7 behandelt. Es wurde festgestellt, daß nur die An 8-Kolonien transformiert worden waren und das pyrA-Gen enthalten, wie durch die Hybridisierungsfähigkeit von verdauter DNA mit DNA von pU N121 ausgewiesen wird.

Die Erfindung betrifft außerdem Wirte, die mit den Hybridvektoren der Erfindung transformiert werden, und Methoden zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind beispielsweise Bakterien wie E.coli oder Fadenpilze wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium und insbesondere A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und vorzugsweise A. niger, z. B. A. niger An8. Die Erfindung betrifft auch eine Methode für die Herstellung solcher Transformanten, welche die Behandlung eines Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, insbesondere einem Hybridvektor, nach der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und die Selektion der Transformanten einschließt.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNA oder deren Derivate für die Herstellung von Hybridvektoren, welche nützliche homologe oder heterologe Polypeptide expressieren. Beispiele für Gene, welche solche nützlichen Polypeptide codieren, werden vorstehend gegeben.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode für die Herstellung von Polypeptiden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in einem geeigneten Wirt ein Hybridvektor nach der Erfindung expressiert wird. Bei Bedarf wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit von der Konstruktion des Vektr/s werden die Produkte entweder expressiert oder, wenn eine Signalsequenz verbunden ist, expressiert und sekretiert.

Diese Methode beinhaltet die Produktion von nützlichen homologen oder heterologen Proteinen in einem geeigneten Wirt, z. B.

den Aspergillus-Spezies, durch Kultivierung eines mit einem Expressionshybridvektor transformierten Wirts. Beispiele für Gene, welche solche Proteine codieren, werden vorstehend gegeben.

Es ist nun auch möglich, einzelne Polypeptide PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLFzu produzieren, d.h., in reiner Form und nicht durch andere PL kontaminiert, wobei verschiedene Methoden angewendet werden können. Beispielsweise ist eine Methode für die Produktion eines einzelnen Polypeptids, das aus der von PLA, PLB, PLC, PLD, PLE und PLF gebildeten Gruppe ausgewählt wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirt, der nicht in der Lage ist, eine Pektinlyase PL zu expressieren, mit einem DNA-Expressionsvektor transformiert wird, der das Produkt von PLA, PLB, PLC, PLD, PLE oder PLF expressiert.

Ein Wirt, der nicht in der Lage ist, eine Pektinlyase PL zu expressieren, ist entweder ein Mikroorganismus ohne ein entsprechendes Gen, z.B. ein PL-Aspergillus-Stamm, ein anderer, nicht zu den Aspergillus gehörender Pilz oder jeder andere eukaryotische oder prokaryotische Mikroorganismus oder ein Aspergillus-Stamm, dessen Produktion von PL in einem entsprechend konditionieren Wachstumsmedium unterdrückt wird. Beispielsweise kann ein einzelnes PL-Gen expressiert werden unter der Kontrolle des Glukoamylasepromotors in A. niger oder A. awamori, unter der Kontrolle des PH05-Promotors in S. cerevisiae oder unter der Kontrolle eines PL-Promotors in einem PL-A. niger-Stamm.

Ausführungsbeispiele Die Erfindung wird veranschaulicht durch die beigefügten Zeichnungen, in denen Abb. 1: eine Restriktionskarte von pGW820 mit dem pelA-Gen zeigt; Abb.2: die Restriktionskarte von pGW830 mit dem pelB-Gen zeigt; Abb.3: die Restriktionskarte von pGW850 mit dem pelC-Gen zeigt; Abb.4: die Restriktionskarte von pGW840 mit dem pelD-Gen zeigt; Abb. 5: die Restriktionskarte von pGW880 mit dem pelE-Gen zeigt; Abb. 6: die Restriktionskarte von pGW860 mit dem pelF-Gen zeigt; Abb.7: die Sequenzierungsstrategie für das pelA-Gen zeigt; Abb.8: die Sequenzierungsstrategie für das pelB-Gen zeigt; Abb. 9: die Sequenzierungsstrategie für das pelC-Gen zeigt; Abb. 10: die Sequenz eines DNA-Moleküls pelA mit der Formel I zeigt, welches die Gencodierung für PLA enthält; Abb. 11: die Sequenz des DNA-Moleküls pelB mit der Formel Il zeigt, welches die Gencodierung für PLB enthält; Abb. 12: die Sequenz des DNA-Moleküls pelC mit der Formel III zeigt, welches die Gencodierung für PLC enthält; Abb. 13: die Homologie beim Aminosäurefolgenpegel zwischen PLD, PLA und PLC zeigt; Abb. 14: die Konstruktion des Vektors pUC 10/pelA-IFN AM 119 mit der Gencodierung für das Hybridinterferon BDBB zeigt; Abb. 15: den nichtcodierenden Strang eines Teils der pelA-IFN-Fusion am Plasmid pelA-IFN AM 119 mit herausgezogener Signalsequenz zeigt, die mit dem Oligonukleotidstarter ausgerichtet ist, der für die Deletionsmutagenese der pelA- Signalsequenz verwendet wird.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, sind jedoch in keiner Weise als Einschränkung zu betrachten.

Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung: Amp Ampizillin ATP Adenosintriphosphat BSA Rinderserumalbumin CIP Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm DNA Deoxyribonukleinsäure DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz EGTA Bis-(Aminoethyl)glykolether)N,N,N',N'-tetraessigsäure

kbp Kilobasenpaar

LMP Niedriger Schmelzpunkt

mOsm Milliosmole

PEG Polyethylenglykol RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen/min

SDS Natriumdodekylsulfat Tc Tetrazyklin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan U Einheiten

V Volt

Puffer, Medien, Reagenzien: HHA B/g 10facher Restriktionsenzympuffer, der für BamHI-, BgIII-, Hlndlll-, Mbol-, Pstl- und Xhol-Verdauungen

verwendet wird und 6OmMTHs-HCI (pH-Wert 7,4), 60 mMß-Merkaptoethanol, 6OmM MgCI₂,50OmM NaCI,

0,1 %BSA, 0,1 % Gelatine enthält. EcoRI-Puffer öfacher Restriktionsenzympuffer, die für EcoRI-Verdauungen verwendet wird und 500 m Tris-HCI

(pH-Wert 7,2), 25 mM MgCI₂,250 mM NaCI, 0,05 % BSA, 0,05 % Gelatine enthält. IPTG 10OmM Isopropyl-ß-thio-galaktopyranosid (23,8 mg/ml) in H₂O.

LC-Medium 1%Tryptikasepepton (BBL), 0,5%Hefeextrakt (BBL),0,8% NaCI, imlTris-HCI, pH-Wert7,5, je Liter. Minimalmedium 1,05% K₂HPO₄,0,45 KH₂PO₄,0,1 % (NH₄I₂SO₄,0,05% für E. coli Natriumzitrat. 2 H₂0,1 mM MgSO₄,

1mM Thiamin-HCI, 0,2% Glukose.

2XTY-Medium je Liter 16g Tryptikasepepton (BBL), 10g Hefeextrakt, 5g NaCI.

TBE-Puffer 1 Literenthält 10,8gTris,5,5gBorsäure,4mlO,5M EDTA (pH-Wert8,0). TE-Puffer 10mM Tris-HCI (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA (pH-Wert 8,0).

geringerTE-Puffer 10mM Tris-HCI (pH-Wert 8,0), 0,1 mM EDTA (pH-Wert 8,0). X-gal 2%(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-galaktosid) in Dimethylformamid.

SSC 0,15 M NaCI, 0,015 M Natriumzitrat. Minimalmedium 1 Liter enthält 1,5 kg KH₂PO₄,0,5g KCI, 0,5g MgSO₄ · 7 H₂0,4,0g NH₄CI, 10,0g Glukose, Spuren von FeSO₄,

für A. niger MnSO₄, ZnCI₂, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,5 abgestimmt.

Komplettmedi- Minimalmedium plus 0,2 %Tryptikasepepton für (BBL) 0,1 % Kasaminosäuren (Difco), 0,1 % Hefeextrakt

um für A. Niger (BBL), 0,05% Ribonukleinsäurenatriumsalz für Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 ml Vitaminlösung je Liter.

Vitaminlösung je 100ml 10mg Thiamin, 100mg Riboflavin, 10 mg Panthoteinsäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure, 100mg Nikotinamid, 50mg Pyridoxin-HCI.

Für Platten werden alle Medien durch den Zusatz von 1,5% Agar (BBL) verfestigt, für Topagar(ose) werden 0,7 % Agar (BBL) oder Agarose (SEAkem) verwendet. PBS je Liter 0,37 g NaH₂PO₄,2,7g Na₂HPO₄,8,5g NaCI. PSB lOmMTris-HCI (pH-Wert 7,6), 10OmM NaCI, 1OmM MgCI₂,0,05% Gelatine. LDB lOmMTris-HCI (pH-Wert7,6), 10OmM NaCI, 1OmM MgCI₂. Es wurden folgende Stämme verwendet: A. niger Wildtyp N400 A. niger N 593 cspA, pyrA A. niger N 756 ausgewählt für die starke Produktion von Pektinasekomplexenzymen A. niger An 8 DSM 3917, uridinauxotropher Mutant von A. niger N 756 E. coli NM 539 metB, supE, hsdM⁺, hsdR", supF, (P2cox3) E. coli MH1 ara D139, AlacX 74, galU, galK, hsr", hsm⁺, strA E. coli JM103 ДІас-рго, thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR 4 F\ traD 36, proAB, laclq, Ζ_ΔΜ15 E. collJM 109 Д(Іас-ргоАВ), recAI, endAI, gyrA96, thl, hsdR 17, »upE44, relAI, λ", [F', traD 36, proAB, laclq, ΖΔΜ15] E. coli CJ 236 (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ 105 [Cm']; BIO-RAD Muta-Gene M13 In-vitro-Mutagenesesatz) E. coil MV1190 [Д(Іас-ргоАВ), thi, supE, A(srl-recA) 360:Tn 10 (tef) (F':traD36, proAB, Iac 1⁴Ζ_ΔΜ15)]. Stamm MV1190 wird im Handbuch für den BIO-RAD MUTA-GENE M13-ln vitro-Mutagenesesatz beschrieben.

Es werden folgende Vektoren verwendet: EMBL4

EMBL4 ist ein Lambda-Austauschvektor mit einer Klonierungskapazität von 9-23kbp (Frischauf u.a.. Lit.2). Er enthält einen Mehrfachkionierungsbereich zwischen den Lambda-Armen und der nichtwesentlichen Füllregion. Das ermöglicht die Durchführung mehrfacher Restriktionsenzymverdauungen in einer Weise, bei der die Religation des Füllelementes an die Vektorenarmen verringert wird, da interessierende Fremd-DNA eingefügt wird. Der Vektor nutzt auch den Spi-Phänotypus, um

eine direkte Selektion für Rekombinanten zu ermöglichen (Zissler u.a.. Lit. 20).

PCG3B11

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das pelD- (PLI-) Gen von A. niger N756, kloniert in pBR332.

PPL29-S

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das N-Terminal-EcoRI- Fragment des pelD- (PLI-) Gens.

PPL35-5

Dieses Plasmid wurde in der europäischen Patentanmeldung 88101397.3 beschrieben, es enthält das C-Terminal-EcoRI- Fragment des pelD- (PLI-) Gens.

pBR322

Plasmid pBR322 trägt Gene für die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampizillin (amp·) und Tetrazyklin (tet®). Das Plasmid

weist mehrere eindeutige Klonierungsstellen auf, von denen sich einige entweder im amp- oder tet-Gen befinden, so daß die

Insertion von klonierter DNA zu antibiotikasensitiven Bakterien führt.

pEMBL18 und pEMBL19

Diese Plasmide wurden von Dente u.a. (Lit. 7,8) beschrieben.

PGW613

Dieses Plasmid wurde von Goosen u.a. (Lit. 12) beschrieben.

PhagM13mp

Die Vektoren M13mp 18 und M13mp19(Norrander u.a., Lit.21) sind Derivate des einzelsträngigen DNA-Bakteriophagen M13

und wurden zur Erleichterung der DNA-Sequenzierung aufgebaut, da sie die Klonierung von DNA-Fragmenten an einervielseitigen Polylinkerstelle und die Klonierung desselben Restriktionsfragments in beiden möglichen Orientierungen gestatten.

Sequenzen, welche in diese Vektoren kloniert werden, können leicht als Matrizen für Sequenzierungsreaktionen oder für die Produktion von einzelsträngigen Sonden unter Verwendung eines Oligodeoxyribonukleotid-Standardstarters und des Klenow- Fragmentes von E. coli-DNA-Polymerase I genutzt werden. Die Vektor-DNA trägt den E. coli-lac-operon-Promotor und die

genetische Information der ersten 145 Aminosäuren von ß-Galaktosidase. Die Polylinkersequenzen, welche die

Mehrfachrestriktionsstellen enthalten, werden in die Sequenz lacZ eingefügt. Der Polylinker erhält das lacZ-Leseraster und der Vektor gibt die allelische Komplementierung eines LacZa-Wirtstammes, was auf den Platten blaue Plaques ergibt, die IPTG und X-gal enthalten. Rekombinante Phage, welche Inserts enthalten, die das Leseraster zerstören oder anderweitig die Expression

des Peptids lacZa beeinträchtigen, erscheinen als farblose Plaques (Flecken).

pCG59D7

Dieses Plasmid wird in EP88101397.3 beschrieben und kann aus Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) gewonnen

werden. Das Plasmid beinhaltet das pyrA-Gen und wird für die Kotransformation von A. niger-pyrA"-Mutanten verwendet.

M13(+)KS (Bluescript) (STRATEGENE, San Diego, CA, USA) dsDNA-Vektor, den Replikationsursprung von Phag M13 umfassend. Bei Vorhandensein eines Helfer-Phags, z.B. M13K07 (Lh. 29) oder R408 (Lit.9) wird der (+!-Strang des Vektors repliziert, gepackt und in das Medium freigesetzt.

M13K07

Helfer-Mi3-PhagfürM13(+)KS. Von Mead u.a. (Lit. 29) beschrieben.

Helfer-Mi3-Phag für M 13(+)KS. Von Russell u.a. (Lit 9) beschrieben.

Beispiel 1 Konstruktion einer genomischen Bibliothek von Aspergillus niger Beispiel 1.1 Isolierung des hochmolekulargewichtigen DNA aus A. nlger

Konidiosporen von Aspergillus niger-Stamm N400 werden in 200ml Minimalmedium mit einer abschließenden Sporendichte von 10⁶ Sporen/ml inokuliert und in einem Erlenmeyer-Kolben von 11 Fassungsvermögen 24 Stunden lang bei 28°C mit 300 U/min unter Verwendung eines Rotationsschüttlers von New Brunswick geschüttelt. Das Myzel wird unter Verwendung eines Bücher-Trichters mit Myracloth durch Filtern geerntet, mit kalter, steriler Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder bei -6O⁰C aufbewahrt oder direkt verwendet. Die Methode, die für die Isolierung der DNA zur Herstellung der genomischen Bibliothek angewendet wird, basiert auf dem Verfahren, das von Yelton u.a. (Lit. 1) beschrieben wurde. Der DNA-Ertrag beträgt bei dieser Methode etwa 50-100цд/д Myzel.

Für die Konstruktion der Bibliothek werden 10g Myzel in flüssigem Stickstoff in Portionen zu je 1 g in einem Braun-Mikrodismembrator gemahlen. Das gemahlene Myzel wird in einen sterilen Erlenmeyerkolben von 11 Fassungsvermögen gebracht, der 200ml Extraktionspuffer (5OmM EDTA,pH-Wert 8,5,0,2% SDS) und 200μΙ Diethylpyrokarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Zimmertemperatur erhitzt und dann 20 min auf 68⁰C unter gelegentlichem Schütteln erhitzt. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und 15 Minuten lang bei 12000 χ g zentrifugiert. Der obenaufschwimmenden Schicht werden Vie Volumen einer 8-M-Kaliumazetatlösung, pH-Wert 4,2, zugesetzt, und man läßt das Gemisch eine Stunde lang auf Eis. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (20min; 16000 χ g; 4⁹C) entfernt. Die Nukleinsäuren werden aus der obenaufschwimmenden Schicht durch Inkubation mit 0,6 Volumen Isopropanol auf Eis für die Dauervon 15min ausgefällt. Das Pellet wird durch Zentrifugieren (10min; 6000 χ g; 4°C) aufgefangen, mit 70% Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10ml TE, das 20μg/ml RNase A (Boehringer, Mannheim) enthält, suspendiert und 15 min bei 37°C inkubiert. Die DNA wird mit nukleasefreier Pronase (1 mg/ml Endkonzentration) behandelt (Kochlight, Coinbrook), Dauer 1 Stunde bei 37⁰C. Die Pronasevorratslösung in TE-Puffer enthält 20mg/ml Enzym, das eine Stunde lang bei 37°C inkubiert wird, um die Nukleasen zu verdauen.

In 9ml DNA-Lösung werden 8,5g CsCI aufgelöst, es werden 0,2ml 10mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt, und diese Lösung wird entweder in einem Beckman-Rotor SW41 60 Stunden bei 33000U/min zentrifugiert oder in einem Beckman-Rotor 50Ti mit Schnellverschlußröhren 40 Stunden lang bei 45000U/min. Das DNA-Band wird durch Seitdurchschlagen des Rohres aufgenommen. Ethidiumbromid wird durch Mehrfachextraktion mit wasser- und NaCI-gesättigtem Isopropanol entfernt. Es werden 5 Volumen TE zugesetzt, die DNA wird mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1, extrahiert. Die DNA wird durch den Zusatz von 0,1 Volumen von 3-M-Natriumazetat, pH-Wert 5,2,2,5 Volumen Ethanol und Inkubation bei -20°C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (1 h; 30000 χ g; 4°C) aufgefangen, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.2 Partielle Verdauung von A. niger-DNA mit Mbol und Isolierung der Fragmente

Um die Mbol-Konzentration, die die größte Menge an Fragmenten zwischen 13,6 und 23kbp ergibt, zu bestimmen, werden Portionen von 1 цд von A. niger N400-DNA in einem geeigneten Puffer mit abnehmenden Mengen an Mbol (0,5-0,001 Einheiten) für die Dauervon einer Stunde bei 37°C in einem Volumen von 10μΙ verdaut. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1 μΙ 0,25 M EDTA gestoppt, und die Proben werden auf ein 0,6%iges Agarosegel in TBE gebracht, das 1 Mg/ml Ethidiumbromid enthält. Geeignete Marker sind ein Gemisch aus Lambda-DNA und mit BgIIII verdauter Lambda-DNA, die Bänder von 49,22,8,13,6,9,8, 2,3 kbp und ein nichtsichtbares Fragment von 0,45 kbp ergibt. Die erforderliche Mbol-Konzentration, bei der ein hoher Ertrag der gewünschten Fragmente von 13,6-23 kbp erzielt wird, beträgt 0,02 Einheiten/^g DNA. Folglich werden 200 μg DNA in einem gesamten Volumen von 2ml verdaut und unmittelbar nach Zusatz des Enzyms in 20 Portionen von gleicher Größe geteilt. Nach einer Stunde bei 37⁰C werden diese Portionen auf Eis gegeben und eine Probe von 1 μg wird auf einem Gel erprobt, um die richtige Verdauung zu testen. Wenn das Ergebnis positiv ist, wird EDTA auf eine Endkonzentration von 25 mM zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, das Enzym wird bei 65°C über 10min wärmeinaktiviert, die Proben werden zusammengefaßt und die DNA wird ausgefällt, gewaschen, getrocknet und in 400μΙ TE-Puffer aufgelöst.

Die fragmentierte DNA wird über Nachtauf einem 0,4%igen präparativen Agarosegel (Mittelvertiefung 120mm χ 1,5 mm) getrennt. Mit BgIII verdaute Lambda-DNA wird als Marker verwendet, um die Größe der partiell verdauten DNA-Fragmente nach Elektrophorese bei 4°C und 40 V (3 V/cm) zu bestimmen. Der Gelbereich, welcher die Fragmente mit der.richtigen Größe enthält, wird außerdem aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird aus dem Gel in einem sterilen Dialyse-Rohr in 2 ml TBE-Puffer über 2 bis 3 Stunden bei 100V elektroeluiert. Der Strom wird 30s umgekehrt, und der die DNA enthaltende Puffer wird aufgefangen. Dann werden die Fragmente durch Ethanolausfällung konzentriert und in 10 μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.3

Herstellung von Vektor-DNA und Klonierung der hochmolekulargewichtigen DNA-Fragmente von A. niger in EMBL4 Die genomische Bibliothek des A. niger-Stammes N400 wird in den Lambda-Vektor EMBL4 konstruiert. Der Vektor, der eine Klonierungskapazität von 9 bis 23kbp hat, wird von Frischauf, u.a. (Lit.2) und von Kam u.a. (Lit.3) beschrieben und wurde von der Promega Biotechn. Inc. bezogen. Um Doppelinserts mit Ursprung in unterschiedlichen Teilen des Genoms zu vermeiden, wurde beim Klonieren mit einer minimalen Fragmentlänge von 13,6 kbp gearbeitet.

Es werden Юцд Lambda-EMBL4-DNA vollständig mit 50 Einheiten BamHI in einem geeigneten Puffer in einem Volumen von 10μΙ über die Dauer von 2 Stunden bei 37°C verdaut. Das Enzym wird über 10 min bei 65⁰C inaktiviert. Die NaCI-Konzentration wird auf 15OmM erhöht, und es werden 50 Einheiten Sail zugesetzt, anschließend wird weitere 2 Stunden bei 37"C inkubiert. Nach dem Zusatz von EDTA auf 25mM und der Inaktivierung des Enzyms (10 min, 65"C) wird die Lösung mit gleichen Mengen von Phenol (TE-gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Um die kleinen BamHI/Sall-Polylinkerfragmente auszusondern, wird die DNA mit 0,6 Volumen Isopropanol ausgefällt, nachdem 0,1 Volumen 3M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, zugesetzt worden waren. Nach 15 min auf Eis und 15 min Zentrifugieren bei 12000 x g und 4°C wird der Niederschlag gründlich mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 40μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Beispiel 1.4 Ligation und In-vitro-Verpackung von genomischen A. niger-DNA-Fragmenten

Es ist wesentlich, daß die cos-Stellen des Vektors, der nach Beispiel 1.3 hergestellt worden ist, vor der Ligationsreaktion hybridisiert werden. Der Vektor in 10OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 1OmM MgCI₂ wird über 10min auf 65⁰C erhitzt und dann eine Stunde lang bei 42⁰C hybridisiert. Aus Probeligationen wird ein Verhältnis von Vektor zu Fragmenten von etwa 1:1 (Gewichtsgrundlage) ermittelt, das ein Maximum von Rekombinanten ergibt. Die Ligation erfolgt in 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 1OmM MgCI₂,1OmM DTT und 1 mM ATP, wobei 9,5 цд Vektor und Юцд DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von ΙΟΟμΙ eingesetzt werden. Dann wird DNA-Ligase (BRL) mit einer Konzentration von 0,5 Einheiten/pg DNA zugesetzt, und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 14°C inkubiert. Um auf Ligation zu prüfen, wird eine Probe der ligierten DNA auf einem Agarosegel erprobt. Außerdem wird eine Menge von 0,5цд Vektor ohne den Zusatz von Fragmenten in einem Volumen von 5 μΙ ligiert.

Das Ligationsgemisch mit dem großen Volumen wird durch Ethanolausfällung konzentriert und in 20 μΙ geringem TE-Puffer vor der In-vitro-Verpackung aufgelöst. Die In-vitro-Verpackung erfolgt mit Promega Packagene-Extrakten nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von ΙΟ-μΙ-Portionen zum Verpacken von 1 цд der DNA. Von dem hochmolekulargewichtigen Lambda-cl857-Sam7, das mit den Extrakten mitgeliefert wird, werden 1 цд getrennt verpackt, um eine Kontrolle zu schaffen. Nach dem Verpacken werden 500 μΙ Phaglösungspuffer (PSB) und 5 μΙ Chloroform zugesetzt. Die rekombinanten Phag-Vorräte können bei 4°C gelagert werden. Die gewonnene Bibliothek wurde aus zwei getrennten Ligationsexperimenten konstruiert.

Beispiel 1.5 Titration und Amplifikation der genomischen Bibliothek des A. niger-Stammes N400

Zellen von E. coli NM 539 werden auf einem LC-Medium, das 0,2% Maltose, 1OmM MgSO₄ und 1 mM CaCI₂ enthält, auf eine optimale Dichte von 1,0 (600nm) gezogen. Dann werden Aliquote dieser Kultur zu 0,2 ml 0,1 ml einer Phag-Verdünnungsreihe in PSB zugesetzt. Nach der Adsorption der Phage über 20min bei 37⁰C werden 3ml 0,6%iges LC-Topagar zu 45⁰C zugesetzt, das Gemisch wird auf LC-Agar-Platten plattiert, und diese werden bei 37⁰C über Nacht inkubiert. Die Titrationsergebnisse, ausgedrückt als Anzahl der plaque-bildenden Einheiten (pfu) je ml Phag-Suspension, lauten 12 χ 10⁵ und 4,2 χ 10⁵pfu/mlfürdie beiden Phag-Vorratslösungen, die nach Beispiel 1.4 hergestellt worden sind. Nach der Subtraktion des Hintergrundes, der aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wird (17% bzw. 40%), beträgt die absolute Zahl der Rekombinanten 6 χ 10^s, was mehr als das 200fache der Genomlänge ist.

Um die Bibliothekzu erweitern, werden Portionen zu 80μΙ von beiden Phag-Vorratslösungen verwendet, um E. coli NM 539-Zellen zu infizieren, die in LC-Topagarose auf LC-Agarplatten plattiert und dann bei 37⁰C über Nacht inkubiert werden. Die Phage werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5ml PSB je Platte über eine Stunde bei Zimmertemperatur eluiert. PSB wird aufgefangen, zur Entfernung der Bakterien zentrifugiert (10 min bei 6000 x g), und es wird Chloroform zugesetzt (Endkonzentration 0,5%). Beide Phag-Vorratslösungen, die etwa im gleichen Umfang erweitert werden, werden dann gemischt (40ml Vorrat), titriert (8 χ 10⁹pfu/ml) und bei 4°C aufbewahrt.

Beispiel 2

Screening der genomischen Bibliothek von A. niger N400 auf das Pektinlyase-D-Gen (pelD) und Isolierung des Gens

Beispiel 2.1

Screening der Bibliothek

Zur Isolierung des pelD-Gens aus der Lambda-genomischen Bibliothek, die nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewonnen wurde, werden 2,5 χ 10⁴ Phage mit verflüssigter LC-Topagarose gemischt und auf 5 LC-Agarplatten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert und 2 Stunden lang bei 4°C abgekühlt. Aus jeder Platte werden nach Beton und Davis (Lit.4) und ihrer Plaque-Hybridisationsmethode 2 Replikate hergestellt. Der erste Filter (Schleicher und Schüll, BA85, oder Millipore, HATF085) wird für eine Minute oben auf die Platte gelegt, das zweite Replikat für 2 min und die Position der Replikate wird unter Verwendung von Ausziehtusche markiert.

Nach der Entfernung der Filter werden sie in eine Schale gegeben, die 100 ml einer Denaturierungslösung (1 M NaCI, 0,5 M NaOH) enthält, dort bleiben sie 1 min, anschließend gibt man sie ebenfalls für eine Minute in 100 ml Renaturierungslösung (0,5 M Tris/HCI, pH-Wert 7,5,1,5 M NaCI). Dann werden die Filter in eine Schale gegeben, die 3 χ SSC enthält (SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M Natriumzitrat, pH-Wert 7,0). Die Filter werden vorsichtig mit einer behandschuhten Hand geschrubbt, um Bakterientrümmer zu entfernen, in eine frische Schale mit 3 x SSC gegeben und 20 min bei Zimmertemperatur vorsichtig geschüttelt. Die Filter werden auf Whatman-Papier 3 MM übertragen und 10 min bei Zimmertemperatur getrocknet. Die Filter werden auf 3 Whatman-Papier MM in einem Ofen bei 80°C für die Dauer von 2 Stunden gebacken. Anschließend werden sie 0,5 Stunden in 6 χ SSC bei Zimmertemperatur gewaschen und dann auf 50 ml vorgewärmtes (56"C) Vorhybridisierungsgemisch übertragen, das aus 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,10 mM EDTA, 1 M NaCI, 0,5% SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 1Ox Denhard-Losung (5OS Denhard-Lösung = 1 % BSA, Boehringer-Fraktion V; 1 % Polyvinylpyrrolidon -40; 1 % Ficoll 400) besteht. Dem Vorhybridisationsgemisch werden frisch zugesetzt: 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA (Maniatis u. a., S. 327; Lit. 5) und 0,01 mg/ml Poly-rA. Die Vorhybridisierung erfolgt unter sanftem Schütteln bei 56°C über die Dauer von 4 Stunden. Als Sonde für

die Hybridisierung wird das einzelstrangbruchtranslatierierte 3,5kbp-EcoRI-Fragment von ρ PL 35-5 verwendet, welches den C-Terminalbereich des pelD-Gens des A.niger-Stammes N756 (erhältlich von E. coli BJ 5183/pCG 3B11, DSM 3916, EP 88101397.3) enthält. Das Fragment wird vorher aus einem niedrigschmelzenden Agarosegel isoliert, und 0,3 μg des Fragments werden einzelstrangbruchtranslateriert (Maniatis u. a., S. 109-112; Lit. 5). Die einzelstrangbruchtranslaterierte DNA wird 10 min lang in einem siedenden Wasserbad denaturiert, auf Eis gekühlt und 50 ml vorgewärmtem Vorhybridisationsgemisch zugesetzt. Die vorhybridisierten Filter werden einer nach dem anderen auf das Hybridisierungsgemisch übertragen. Die Hybridisierung erfolgt unter sanftem Schütteln über Nacht bei 56°C. Die Filter werden bei 56°C gewaschen: 2 x 30min mit 0,514 χ SSC, 0,1 % SDS und 2 x 30min mit 2 x SSC, 0,1 % SDS. Die Filter werden auf 3 MM-Papier übertragen und über eine Stunde durch Luft getrocknet. Nachdem sie auf 3 MM-Papier geklebt wurden und eine entsprechende Markierung mit radiomarkierter Tusche erfolgt ist, werden die Filter mit Saran-Deckmaterial abgedeckt und über Nacht bei -70⁰C autoradiografiert, wozu Konica-Röntgenfilme und röntgen-omatische Kodak-Kassetten sowie normale Intensivierungsschirme verwendet werden. Auf diese Weise erhält man 44 positive Signale von den 5 gescreenten Platten. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette aufgenommen, wozu die Platten auf dem Autoradiogramm sorgfältig in der richtigen Weise positioniert werden und die Tuschemarkierungen genutzt werden. Die Agarstücke, welche die positiven Plaques enthalten, werden in 1 ml PSB dispergiert. Man läßt die Phage über eine Stunde bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Wirbel aus dem Agar diffundieren. Das Agar und die bakteriellen Zelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugieren entfernt, es werden 10μΙ Chloroform zugesetzt und die Phag-Vorratslösungen bei 4°C aufbewahrt. Die positiven Klone erhalten die Bezeichnungen X-PL1 bis X-PL44. Da Phage in hoher Dichte plattiert werden, müssen die positiven Plaques zweimal gereinigt werden, wozu sie in geringer Dichte (±100Phag je Platte; 0,1 ml einer 10³-Verdünnung der Phag-Vorratslösung) plattiert und das gesamte Verfahren der Replikatplattierung, Hybridisierung und Aufnahme der positiven Plaques wiederholt werden.

Beispiel 2.2

Isolierung der Lambda-DNA

Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, wird zuerst eine Amplifikation der Phage durch Infektion wie E. coli NM 539 mit 0,1 ml der Phag-Vorratslösungen, die von gereinigten Klonen stammen, wie im Beispiel 1.5 vorgenommen und werden dann die Zellen in LC-Togagarose auf LC-Agar-Platten plattiert. Dadurch erhält man Platten mit konfluenter Lysis der Indikatorbakterien. Über die Platten werden 5ml PSB gegeben, und die Phage werden über einen Zeitraum von zwei Stunden durch sanftes Schütteln eiuiert. Die eluierten Phage werden geerntet, Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren entfernt, und es wird Chloroform bis zu 1 % zugesetzt. Das resultierende Plattenlysat wird bei 4°C aufbewahrt. Es hat in der Regel ein Titer von etwa10"pfu/ml.

Da Isolierungsverfahren im kleinen Maßstab aus Plattenlysatvorratslösungen und aus kleinangelegten flüssigen Kulturen (Maniatis, u. a., S. 65-68; Lit. 5) nicht immer verdauungsfähige DNA ergeben, werden Phage aus 250ml-Lysaten isoliert. Diese werden hergestellt durch Züchten des Wirts, E. coli NM539, auf einen O. D.eoo von 0,3 in LC + 0,2% Maltose, 1OmM MgSO₄,1 mM CaCI₂ und anschließendes Zufügen von etwa 10¹⁰pfu des Plattenlysats. Nach weiterem Wachstum lösen sich die Bakterien innerhalb von 4 Stunden auf.

RNase und DNase werden den Lysaten bis zu einer Endkonzentration von 2цд/тІ zugesetzt, und man läßt das Lysat bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen. Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren (20min, Zimmertemperatur, 10000 χ g) entfernt. In der obenaufschwimmenden Schicht werden 14,8g NaCI und 25g PEG 6000 aufgelöst, um Endkonzentrationen von 1 M NaCI und 25% PEG zu erhalten. Man läßt die Phage über eine Stunde auf Eis oder über Nacht bei 4°C ausfällen und erntet sie durch Zentrifugieren (20min; 10000 χ g; 4°C). Die Pellets werden in 3ml Lambda-Verdünnungspuffer (LDB = 1OmM Tris/HCI, pH-Wert 7,5,2OmM MgCI₂,10OmM NaCI) suspergiert. In 4ml der Phagsuspension werden 2,5g CsCI aufgelöst, und das Gemisch wird mit der Pipette in 5-ml-Beckman-Schnellschlußröhrchen gegeben, die dann bis zur selben CsCI-Konzentration in LDB gefüllt werden. Die Röhrchen werden verschlossen und über Nacht in einem Beckman-Rotor VTi 65.2 bei 50000U/min und 4°C zentrifugiert. Das trübe Phagband, das unter einer normalen Lampe sichtbar ist, wird von der Seite des Röhrchens punktiert. CsCI wird durch Dialyse in sterilen Röhren anhand von 211OmM Tris/HCI, pH-Wert 7,5,19mM MgCI₂,5OmM NaCI bei 4°C über die Dauer von 4 Stunden entfernt. Der Puffer wird einmal ausgewechselt. Phage werden in sterilen Greiner-Rohren aufgefangen, das Volumen wird mit dem Dialysepuffer auf 1 ml abgestimmt, es werden 50 μ110% SDS, 50 μΙ 0,5 M EDTA, pH-Wert 8,0, und 25 μΙ von 20 mg/ml nukleasefreier Pronase zugesetzt und die Röhrchen 1 Stunde lang bei 37⁰C inkubiert. Das Volumen wird mit TE auf 3 ml erhöht, und diese Lösung wird mit gleichen Volumen von TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, 25:24:1, und Chloroform/Isoamylalkohol, 24:1, extrahiert. Nachdem 0,1 Volumen von 3M Natriumazetat, pH-Wert 5,2, und 2,5 Volumen Ethanol zugesetzt worden sind, wird die DNA bei -20⁰C über Nacht ausgefällt und durch Zentrifugieren (1 h, 20000 χ g bei 4⁰C) aufgefangen. Das Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst. Die Ausbeute an Phag-DNA beträgt etwa 200pg/250ml Lysat.

Beispiel 2.3

Restriktionsanalyse von pelD-Klonen

Von den positi 'en Phagen wurden 10 willkürlich für die weitere Analyse ausgewählt. Es wird 1 μg Phag-DNA mit 10 Einheiten EcoRI oder BgIII in einem Volumen von 20μΙ für die Dauer von 2 Stunden bei 37⁰C in den Puffern verdaut, die vom Hersteller empfohlen werden. Die Proben werden auf einem 0,6%igen Agarosegel getrennt, wozu 1 μg Lambda cl857-SAM7-DNA verwendet wird, die mit Hindill (Lambda χ Hindill) verdaut wurde, als Marker, und EMBL4-DNA und pCG 3 B11 -DNA, verdaut mit EcoRI, dient als Kontrolle. Das Gel wird auf einem UV.Transilluminator unter Verwendung von Polaroid-Filmen 667 (4 s. Blende 8) fotografiert. Die DNA wird auf Nitrozellulosefilter von Schleicher und Schü II, BA85, nach der Methode von Southern (1975), wie das von Maniatis, S.382-386 (Lit. 5) beschrieben wurde, übertragen. Die Filter werden mit einem Gemisch von ³²P-markierten (einzelstrangbruchtranslaterierten) Fragmenten des pelD-Gens, die den Bereich des gesamten Gens erfassen, markiert. Diese Fragmente sind das 2,9 kbp EcoRI-Fragment von pPI29-5 und das 3,5kbp EcoRI-Fragment von pPL35-5. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.

Die Bandlängen werden aus den Fotografien und Autoradiogrammen durch grafischen Vergleich auf einfachlogarithmischem Papier mit den bekannten Marker-Bändern errechnet. Die Restriktionskarten der Klone werden in der Abb. 1 gegeben. Die Klone X-PL 4, -14 und -40 enthalten sowohl das 2,9- als auch das S.Skbp-EcoRI-Hybridisierungsfragment, wie es in pCG3B 11 gefunden wird. X-PL5, -6, -10 und -33 enthalten das S.ökp-EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden EcoRI-Fragment. Die Klone X-PL2 und 28 enthalten das 2,9 kbp-EcoRI-Fragment zusammen mit einem anderen hybridisierenden Fragment, während X-PL9 nur ein kleines hybridisierendes EcoRI-Fragment von 1,2kbp enthält. Das vollständige 5,0kpb-Bglll-Fragment von pCG 3 B11, welches das gesamte pelD-Strukturgen enthält, ist nur in den Klonen X-PL 4, -14 und -40 enthalten. Das 3,7kbp-Hybridisationsband, das in den Klonen XPL5, -6, -10, -14, -33 und -40, nicht aber in pCG 3B11 vorhanden ist, befindet sich flußabwärts des pelD-Gens im 5,0kbp-Fragment. Einige hybridisierende Bglll-Fragmente enthalten noch 1,2 kbp des rechten Armes des Vektors. Alle Klone enthalten auch nichthybridisierende Fragmente, die identisch sind. Da es also offensichtlich den Anschein hat, daß die Restriktionsmuster sowohl des Strukturgens als auch den Gens in der Umgebung in allen Klonen identisch sind, wird geschlußfolgert, daß sie ihren Ursprung im selben Gen haben, dem pelD-Gen des A.niger-Stammes N400. Aus der Anzahl der plattierten Klone und der angenommenen Genomlänge von 3 χ 10⁷bp wird abgeleitet, daß bei 25000 Klonen mit einer durchschnittlichen Insert-Länge von 15 kbp wenigsten 12 pelD-Klone gefunden werden. Da nur 2 der 10 analysierten Klone identisch sind, ist die Komplexität der Bibliothek sogar noch höher als angenommen (siehe Beispiel 3).

Beispiel 2.4 Subklonieren von pelD-Fragmenten

Die 5,0kbp-Bglll-Fragmente von X-PL4 und pCG3B 11, welche die pelD-Gene von A.niger N400 bzw. N756 enthalten, werden in die BamHI-Stelle von Plasmid pBR322 subkloniert (siehe Klonierungsvektoren). In 20μΙ werden 4цд X-PL4 und 2цд pCG3B11 mit 10 Einheiten BgIII über zwei Stunden bei 37°C bis zur Kompletion verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (BRL) in TBE + 1 pg/ml Ethidiumbromid bei 50V getrennt. Das 5,0 kbp-Fragment wird aus dem Gel herausgeschnitten, mit 0,4ml TE verdünnt, es wird ein gleiches Volumen Phenol zugesetzt, und das Gemisch wird 10 min auf 65⁰C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen. Nach einem fünfminütigen Zentrifugieren bei 12 000 U/min in einer Eggendorf-Tischzentrifuge 5414S wird die wäßrige Phase mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, gewaschen, getrocknet und schließlich in 10μΙ geringem TE-Puffer aufgelöst.

Es werden 1 pg pBR322-DNA, die nach der Plasmidherstellungsmethode im großen Maßstab (Maniatis, u.a., S.86; Lit.5) hergestellt wurde und durch CsCI-Gradientenzentrifugation gereinigt worden ist, mit 5 Einheiten BamHI für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C in einem Volumen von 20 μΙ verdaut. Es werden 2 μΙ von 10 χ CiP-Puffer und 0,02 Einheiten von CIP zugesetzt und weitere 30min inkubiert. EDTA wird auf eine Endkonzentration von 25mM zugesetzt, und das Gemisch wird für 10min auf 65⁰C erhitzt. Die Lösung wird mit TE auf 200 μΙ verdünnt und dreimal mitTE-gesättigtem Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach der Ethanolausfällung wird die DNA in 50 μΙ gerimgen TE-Puffer aufgelöst. Ein DNA-Fragment zu 100 ng wird mit 20 ng der Vektor-DNA in einem Volumen von 20 μΙ unter den in Beispiel 1.4 beschriebenen Bedingungen ligiert. Die Hälfte des Ligationsgemischs wird für die Transformation von E.coli-MH 1-kompetenten Zellen verwendet, die nach der CaCI₂-Methode (Maniatis u. a., S. 250; Lit. 5) hergestellt wurden. Die Zellen werden auf LC-Agar-Platten, die 50мд/тІ Ampizillin enthalten, plattiert und über Nacht bei 37⁰C inkubiert. Die Transformanten werden auf ihre Tetrazyklinsensitivität getestet, wozu sie in Kolonien zuerst auf LC-Platten mit 20цд/тІ Tc und dann auf LC + amp-Platten gestrichen werden. Die Transformanten werden über Nacht bei 37°C in 5 ml von LC + amp gezogen, und die DNA wird unter Anwendung der alkalischen Lysis-Miniprep-Methode (Maniatis, u.a., S. 368; Lit. 5) aus 1,5ml der Kultur isoliert. Die Miniprer-DNA werden mit BamHI und Pstl verdaut, und die Fragmente werden auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert. Zwei Plasmide mit ihrem Ursprung von X-PL4, welche das 5,0 kbp-Bglll-Fragment in entgegengesetzten Orientierungen enthalten, werden mit pGW840 bezeichnet. Weitere Plasmide, die von pCG 3B11 stammen, werden mit pGW870 und pGW871 bezeichnet. Die MH1 -Zellen, welche sie aufnehmen, werden bei -7O⁰C auf Glyzerol gehalten. Plasmid-DNA von 0,51-Kulturen dieser Klone wird im großen Maßstab isoliert (Maniatis u.a., S.86; Lit.5), durch CsCI-Zentrifugation gereinigt, phenolisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 400 μI gerimgen TE-Puffer aufgelöst. Die Ausbeute beträgt etwa 500 μg. Die Plasmide werden der Restriktionska rtierung unterzogen. Die Karte für Plasmid pGW 840 wird in der Abb. 2 gezeigt und ist nicht von der für pGW870zu unterscheiden. Auch die Plasmide pGW841 und pGW871, welche das Fragment in der entgegengesetzten Orientierung enthalten, sind nichtunterscheidbar, was auf die Identität der pelD-Gene von den A.niger-Stämmen N400 und N756 hinweist.

Beispiel 3 Screenen nach, Isolierung und Charakterisierung von pelD-verwandten Genen Beispiel 3.1 Schaffung der Hybridisationsbedingungen durch Analyse von genomischen Übertragungen von A. niger-N400-DNA

In einem Volumen von 20μΙ werden bei 37°C über die Dauer von 4 Stunden 2pg-DNA-Proben des A.niger-Stammes N400, die wie im Beispiel 1.1 isoliert worden sind, unter Verwendung von BamHI (BRL) oder Hindill (BRL) in HHA BOg Puffer verdaut. Die verdauten Proben werden auf 0,6%igen Agarosegels bei 40V über die Dauer von 18 Stunden elektrophoretisch getrennt. Die DNA wird auf Nitrozellulosefilter transferiert und wie im Beispiel 2.3 gebacken. Die (Vor-) Hybridisationslösungen sind mit den im Beispiel 2.1 beschriebenen identisch.

Die bei der Vorhybridisation angewendete Temperatur ist immer die gleiche wie die Hybridisationstemperatur. Das einzelstrangbruchtranslaterierte BamHI/Pstl-Fragment von pGW840, das den Codierungsbereich des pelD-Gens enthält, wurde als Sonde verwendet. Die Hybridisation wird über 16 Stunden und über 40 Stunden bei unterschiedlichen Temperaturen (52°C, 6O⁰C und 68°C) ausgeführt. Bei den drei unterschiedlichen Temperaturen wird mit den beiden folgenden Waschbedingungen gearbeitet^ x30min5 χ SSC, 0,1 % SDS, gefolgt von 2 хЗОтіпЗ x SSC, 0,1% SDS im Vergleich zu 4 хЗОтіпб xSSC,0,1% SDS. Bei 68°C wird außerdem eine Waschung zweimal mit 2 x SSC, 0,1 % SDS und zweimal mit 0,2 x SSC, 0,1 % SDS einbezogen. Bei 68°C und Verwendung der 0,2 χ SSC-Waschungen tritt nur homologe Hybridisation ein. Werden höhere Salzkonzentrationen angewendet, treten einige andere schwache Signale auf. Bei 52⁰C ist der Hintergrund stark und die Hybridisation schwach. Die besten Bedingungen für eine „heterologe" Hybridisation erreicht man bei 60⁰C über die Dauer von

40 Stunden bei Anwendung der Waschkombination 5 χ SSC und 3 χ SSC. Diese können noch weiter optimiert werden, wenn man 4 χ SSC in Verbindung mit 2 χ SSC anstelle von 5 x SSC in Verbindung mit 3 χ SSC anwendet, die Signale, die bei diesen genomischen Übertragungen von A.niger N400 bei einer Sondierung mit dem 1,6kpb-8amHI/Pst!-Fragment von pGW840 sichtbar werden, werden in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Hybridisationssignale in genomischer DNA von A.niger N400, sondiert mit dem 1,6kb-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840

BamHI Hindlll

7,5 kbp stark homolog; 21,0kbp stark homolog; pelD pelD

4.3 kbp stark 3,9 kbp stark

4,1 kbp schwach 7,1 kbp schwächer

18,0kbp schwach 4,4kbp schwach

8.4 kbp sehr schwach 4,6 kbp schwach

1,5 kpb sehr schwach

Beispiel 3.2 Screenen der Bibliothek

Auf 5 Platten werden 2,5 χ 10⁴ Phage der N400-Lambda-Bibliothek plattiert und von jeder Platte 3 Nitrolzellulosereplikate gemacht, wie das im Beispiel 2.1 beschrieben wurde. Auch der (Vor-)Hybridisationspufferwird im Beispiel 2.1 beschrieben. Das erste Rep/ikat von jeder Platte wird bei 60°C über 40 Stunden mit dem 1,6kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840 hybridisiert und zweimal bei dieser Temperatur über 30min mit 4 χ SSC, 0,1 % SDS, und zweimal über 30 min mit 2 χ SSC, 0,1 % SDS gewaschen, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde. Diese Bedingungen werden als heterologe Bedingungen bezeichnet. Daszweite Replikat von jeder Platte wird bei 68 ⁰C mit dem gleichen Fragment hybridisiert und zweimal über 30 min mit 2 χ SSC, 0,1 % SDS, und zweimal über 30min mit 0,2 x SSC, 0,1 % SDS, gewaschen. Diese Bedingungen werden als homologe Bedingungen bezeichnet. Das dritte Replikat von jeder Platte wird homolog mit dem 0,35kbp-BamHI-Fragment von pGW840 hybridisiert, das sich im Promotorbereich von pelD direkt im Anschluß an das 1 ,бкЬр-ВатНІ/Pstl-Fragment befindet. Man erhalt 29 Plaques, die heterolog hybridisieren, nicht aber (oder sehr schwach) homolog. Sie werden als λ-PL 101 bis pPL129 bezeichnet. Man erhält 19 Plaques, die stark homolog und heterolog mit der BamHI/Pstl-Sonde hybridisieren. Sie werden als λ-PL 130 bis λ-PL 148 bezeichnet und als pelD-Klone betrachtet. Davon hybridisieren 2 nur schwach mit der 0,35-BamHI-Sonde (λ-PL 145 und λ-PL 146) und enthalten daher wahrscheinlich nur einen Teil des Promotorbereiches. Die anderen hybridisieren stark. Man erhalt nur einen Klon, der nur mit der 0,35 kbp-BamHI-Sonde hybridisiert (λ-PL 149).

Alle Klone werden aufgenommen und zweimal durch Plattieren und heterologes Hybridisieren mit der 1,6 kbp-BamHI/Pstl-Sonde gereinigt. Bei ejnem zweiten Screening-Experiment wurden zusätzlich 23 pelD-Klone und 25 andere Klone ermittelt (λ-PL 151 bis λ-PL 198).

Beispiel 3.3 Charakterisierung von Lambda-Klonen durch Plaque-Hybridisierungssignal mit unterschiedlichen, von pelD abgeleiteten

Sonden

Bei diesem Experiment wird eine Klassifizierung der isolierten Klone unter Verwendung unterschiedlicher Teile des Codierungsbereichs von pelD als Sonde beschrieben. Einbezogen werden λ-PL 101 bis -130, wahrend X-PL4 als positive Kontrolle verwendet wird. Einbezogen wird auch λ-PL 145. Die Klone werden plattiert, und es wird nur ein Replikat hergestellt, das in 6 Teile unterteilt wird. Auf diese Weise sollen Unterschiede im Hybridisationssignal zwischen Replikaten ausgeschlossen werden. Getrennte Teile der Replikate werden mit den folgenden ³²P-markierten Sonden sowohl homolog als auch heterolog hybridisiert:

1 das komplette 1,6kbp-BamHI/Pstl-Fr§gment von pGW840

2 das649bp-BamHI/Xhol-Fragmentvon pGW840(N-Terminalcodierungsbereich von pelD)

3 das 244Pb-XhOlZPStI-FrBQmCnIvOn pGW840 (C-Terminalcodierungsbereich von pelD)

Wie fur pelD-Klone erwartet wurde, hybridisieren λ-Ρί4, -130 und -145 sowie λ-PL 101 unter homologen und heterologen Bedingungen stark mit diesen Sonden. Der letztgenannten Klon, λ-PL 101, befindet sich am Rand eines Filters in Beispiel 3,2 und wird daher beim ersten Screening nicht als pelD aufgeführt. Die eben genannten Klone werden als (pelD-) Klone der Klasse I klassifiziert. Alle anderen Klone können in zwei andere Klassen unterteilt werden: Klasse Il hybridisiert nicht nur heterogen mit der gesamten Sonde, sondern auch mit der N-Terminalsonde. Die homologe Hybridisation ist mit dem gesamten pelD-Gen als Sonde nur schwach Klone der Klasse III hybridisieren überhaupt nicht mit der N-Terminalsonde und auch nicht homolog mit der gesamten Sonde. Die C-Sonde hybridisiert nicht mit Klonen der Klassen Il und III. Aus diesen Experimenten wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß wenigsten zwei verwandte Gene bei den isolierten Klonen sind. Zu den Klonen der Klasse Il gehören: λ-Ρί104, -105, -109, -113, -114, -115, -119, -122, -124, -125, -128 und -129. Die Klone der Klassen Hl sind. λ-Ρί102,-103,-106,-107,-108,-110,-111,-116,-117,-118,-120,-121 und-123.

Beispiel 3.4 Restriktionsanalyse der isolierten Lambda-Klone (Klasse I, II)

Plattenlysatvorratslosungen, 250ml flussige Lysate und Phag-DNA-Praparate im großen Maßstab aus diesen Lysaten werden wie im Beispiel 2 2 hergestellt. Das geschieht fur 24 Klone, von den ЗреЮ-Klone (λ-Ρί4, -130, -145) sind. Eine Klon-DNA geht

wahrend der DNA-Isolierung verloren (X-PL124). Die aus diesen Klonen isolierte DNA wird in 1 цд-РгоЬеп in insgesamt 20 μΙ mit 10 Einheiten Enzym verdaut. Alle Klone werden mit EcoRI, BamHI, Hindill, EcoRI/BamHI, BamHI/Hindlll, EcoRI/Hindlll und EcoRI/BamHI/Hindlll verdaut. Die Fragmente werden auf 0,6%igem Agarosegel getrennt und wie im Beispiel 2.3 auf Nitrozellulosefilter übertragen. Übertragungen werden heterolog mit dem 1,6kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840 hybridisiert, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde.

Zwei Klone (X-PL 112 und λ-PL 129) hybridisieren nicht. Die Bandlangen werden sowohl aus den Fotografien wie auch aus den Autoradiogrammen berechnet. Vom Klon λ-PL 113 abgesehen, enthalten alle Klone zu viele Fragmente, um eine vollständige Karte abzuleiten.

Es ist jedoch möglich, eine Karte des Hybridisierungsbereiches abzuleiten und durch Kombination von Daten zu anderen nichthybridisierenden Bandern zuzuweisen, welche Klone vom selben Gen abgeleitet sind. Es ist klar, daß von den restlichen analysierten Klone der Klasse Il und III 5 Gene vorhanden sind. Sie werden als pelA, pelB, pelC, pelE und pelF bezeichnet. Die Zuweisung von Klonen zu diesen Genen wird in der Tabelle Il zusammengefaßt.

Tabelle Il

Zuweisung von isolierten Klonen zu unterschiedlichen pel-Genen

(part heißt, daß die Hybridisierungsbänder nur teilweise in diesen Klonen vorhanden sind) Klasse Gen -Klone

I. pelD PL4,PL130,PL145,(part)

II. pelA PL113,PL104,PL115,PL125(part)

pelB PL 119, PL 122, PL 128, PL 105 (part)

pelC PL 109

III. pelE PL 116, PL 107 (part)

pelF PL 102, PL 103, PL Π 0, PL 120, PL 121 (part), PL123 (part)

Tabelle III

Vergleich der Hybridisationsbänder in Chromosomalubertragungen und isolierten Genen

Die Bandiange wird in kbp angegeben.

EcoRI BamHI Hindill

Chromosomal	2,9 + 3,5	7,5	21,0 Homologes Signal pelD
	+ größere Bander	4,3	3,9 Stärkste heterologe Signale
		18,0	7,1 Schwächere Signale
			4,4 Schwache Signale
		8,4	4,6 Schwache Signale
		4,1	1,5 Schwache Signale
pelD	2,9 + 3,5	7,5	groß
pelA	7,5	4,3	3,9
pelB	8,7	groß	7,1
pelC	5,0	groß	4,4
pelE	6,2	8,4	4,6
pelF	groß	4,1	1,5 + 2,8 (sehr schwach)

Ein Vergleich der Lange des Hybndisationsfragmentes der isolierten Gene und der Lange der Hybridisationsfragmente von genomischen DNA-Ubertragungen wird in der Tabelle III gegeben. Aus diesen Daten wird geschlußfolgert, daß alle Bander, die in den genomischen Übertragungen hybridisieren, in den isolierten Klonen vorhanden sind und daß unter diesen Hybridisationsbedingungen keine anderen verwandten Gene isoliert werden konnen Die Plaque-Hybridisationsergebnisse (Beispiel 3.3) zeigen, daß jedes Gen, wenn man partielle Klone nicht berücksichtigt, ein spezifisches Hybridisationsmuster mit den getesteten Sonden hat. Das wird in der Tabelle IV zusammengefaßt

Tabelle IV

Vergleich der Signalstarke von unterschiedlichen Genen bei der homologen und heterologen Plaque-Hybndisation mit unterschiedlichen pelD-Sonden nach dem Experiment in Beispiel 3 3

Der Grad der Hybridisation wird durch die Anzahl der +/-Zeichen ausgedruckt. Das homologe pelD-Gen hybridisiert mit wenigstens 10 +/—Zeichen, ± sehr schlechte Hybridisation, - keine Hybridisation

Heterologe Hybridisation Homologe Hybridisation

Sonde Ganzes Gen N-Term. C-Term. Ganzes Gen N-Term. C-Term

Beispiel 3.5

Sulklonieren von pelD-verwandten Genen in pBR322

Su bklone der Hybridisationsfragmente, die aus den im Beispiel 3.3 gewonnenen λ-Klonen gewonnen werden, werden im Vektor pBR322 hergestellt, der durch EcoRI, BamHI oder Hindlll verdaut und anschließend dephosphoryliert wird. Fragmentisolierung aus LMP-Agarosegels, Vektorherstellung, Ligation, Transformation von E. coli MH1, Miniprep-DNA-Isolierung und großangelegte Plasmidisolierung werden nach den Standardverfahren durchgeführt, die im Beispiel 2.4 beschrieben worden sind.

Die Fragmente werden in den geeigneten Vektor ligiert, wie das im Beispiel 2.4 beschrieben wurde. Transformierte E. coli MH1-Zellen werden auf LC + 50цд/гпІагпр plattiert. Die Transformanten werden auf Tetrazyklinsensitivität getestet. Die EcoRI-Klone sind alle resistent. Dann werden Miniprep-DNA mit geeigneten Enzymen verdaut, um auf die richtigen Inserts zu prüfen und die Orientierung der Fragmente zu bestimmen. Die ausgewählten Plasmide werden in der Tabelle V zusammengefaßt. Zellen, welche diese aufgenommen haben, werden bei -7O⁰C auf Glyzerol gelagert.

Tabelle V

Subklone von pel-Genen in pBR322

Plasmid Gen Fragment Ursprung Orientierung

pGW820 pelA 7.5 EcoRI λ-ΡΙ.113 2

pGW821 4.3 BamHI 2

pGW822 3.9 Hindlll 2

pGW823 7.5 EcoRI 1

pGW824 4.3 BamHI 1

pGW825 3.9 Hindlll 1

pGW830	pelB	7.1 Hindlll	λ-ΡΙ.122	1
pGW850 pGW851	pelC	5.0 EcoRI 5.0 EcoRI	λ-ΡΙ_109	1 2
pGW860	pelF	4.1 BamHI	X-PL102	1
pGW880 pGW881	pel E	4.6 Hindlll 4.6 Hindlll	\-PL109	1 2

Die Plasmide pGW820, -830, -850, -860 und -880 wurden im großen Maßstab isoliert und einer Restriktionskartierung unterzogen.

Karten dieser Plasmide werden in den Abbildungen 1 bis 6 gegeben.

Um die Genlage und-orientierung zu bestimmen, werden Southern-Transfers von Plasmidverdauungen heterolog mit dem 1,6 kbp-BamHI/Pstl-Fragment von pGW840 hybridisiert, und identische Transfers werden heterolog mit einem N-Terminalfragment desselben Plasmids hybridisiert, welches das 649-bp-BamHI/Xhol-Fragment für die Kartierung von pGW820 und -830 und das 766 bp-BamHI/EcoRI-Fragment für pGW850 und -860 ist.

Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW860 und pGW880 wurden in E.coli HB101 kloniert und am I.Februar 1988 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Grisebachstr.8,3400 Göttingen, hinterlegt. Sie erhielten die DSM-Nr.4388, 4389,4390,4391 bzw. 4392.

Beispiel 4

Sequenzbestimmung der Gene pelD, pelA, pelB und pelC

Beispiel 4.1

Partielle Sequenz des pelD-Gens des A. niger-Stammes N 400 und deren Identität mit pel I von A. niger-Stamm N 756 Nach der LMP-Agarosegel-Elektrophorese, wie sie im Beispiel 2.4 beschrieben wurde, werden geeignete Restriktionsfragmente von pGW840 isoliert. Diese werden nach dem BRL-MIS-Cloning/Dideoxysequenzierungshandbuch (S. 26, 27; Lit. 6) in die Vektoren M13mp18RFund M13mp19RF kloniert. Die Transformation von E. coli JM103, die Plattierung auf Minimal-X-galfndikatorplatten und die Isolierung von einzelsträngiger DNA aus rekombinanten Phagen erfolgen nach den Anweisungen im gleichen Handbuch (S. 29-34). Einige Klone werden nach der Dideoxykettenterminationsmethode nach Sanger sequenziert, die auf den Seiten 38-74 des BRL-Handbuches beschrieben wird.

Die zwischen den Nukleotiden -457 und +100 bestimmten Sequenzen sind mit der entsprechenden Sequenz des PLI-Gens identisch, das von A. niger N756 abgeleitet wurde und im Plasmid pCG3B11 (EP 88101397.3) vorhanden ist. Die Sequenz, die aus BamHI von der Position -457 bis zur Position +100 bestimmt wurde, besteht aus 457 Nukleotiden der Promotorsequenz, den 57 Nukleotiden mit der Codierung der Signalsequenz und 43 Nukleotiden mit der Codierung für die ersten 13 N-Terminal-Aminosäuren des reifen PLD-Proteins.

Auf Grund der identischen Restriktionskarten des N400-pelD-Gens in ρGW840 und des N756-pelD-Gens in pCG3B11 und der vollständig idemischen Daten der N-Terminalsequenz wird angenommen, daß die beiden Gene identisch sind. Demzufolge wird angenommen, daß das PLD-Protein mit dem früheren PLI-Protein identisch ist.

Beispiel 4.2

Sequenzbestimmung des pelA-, pelB- und pelC-Gens

Fragmente von pGW820, pGW830 und pGW850 werden in M13mp18RF und M13mp19RF (siehe Beispiel 4.1) oder in die Plasmide pEMBL18 und pEMBL19 (Dente u. a., Lit. 7,8) subkloniert. Einzelsträngige DNA von den Plasmidklonen erhält man durch Infektion mit dem Helfer-Phag R408 (Russell u. a., Lit. 9).

Exonuklease-Ill-Deletionsklone wurden aus pGW850 nach der Methode von Henikoff (Lit. 28) hergestellt. Das 3,0 kb-Smal-Bglll-Fragment von pGW850, an dem sich das pelC-Gen befindet, wird in pEMBLI9 subkloniert. Mit Smal und Sacl werden 50 цд dieses Klons verdaut und nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und der Ethanolausfällung mit Exonuklease III verdaut. Zu unterschiedlichen Zeitintervallen werden Proben genommen, die Exonuklease IM wird durch den Zusatz von NaCI und EDTA inaktiviert, und es wird 10min bei 70⁰C inkubiert. Überstehende ssDNA-Enden werden durch S1-Nuklease entfernt, und die kohäsiven Enden werden mit T4-DNA-Polymerase glatt gemacht. Nach der Selbstligierung und der Transformation von E. coli JM103 mit diesen Deletionsklonen erhält man einzelsträngige DNA durch Infektion mit dem Helfer-Phag R408. pGW820 wird von der PvullStelle an Position 1000 bis zur Clal-Stelle an Position 4175 sequenziert (siehe Abb. 1). Bei pGW830 wird das 2774 bp-Xhol-Fragment sequenziert (siehe Abb. 2). pGW850 wird von der EcoRI-Stelle in Position 0 bis zur Position 3168 sequenziert (siehe Abb.3).

Die Sequenzstrategien für diese Gene werden in den Abbildungen 7,8 und 9 angegeben. Es werden mehrere Oligonukleotide unter Anwendung der Phosphoramiditmethode von Caruthers (Lit. 10) bei Einsatz eines Oligonukleotidsynthesizers von Applied Biosystems (Modell 380B) synthetisiert. Sie werden als Sequenzierungsstarter verwendet, ihre Position wird in den Abbildungen 7 und 8 angegeben.

Die gesamte Sequenz des pelA-Gens wird in der Abb. 9 in der 5' -» З'-Richtung gegeben. Die 3175 bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nukleotiden der Pvull-Stetle in der Position 1000 von pGW820 und endet beim letzten Nukleotiden der Clal-Stelle in der Position 4175 in pGW820.

Die pelA-Sequenz besteht aus 1360 Nukleotiden des Promotorbereichs, 1355 Resten des Strukturteils und 360 Nukleotiden des Terminatorbereichs.

Der Aminosäurefolge von PLA (siehe Beispiel 6.3) geht eine Signalsequenz von 20 Aminosäuren voraus, wie aus der Nukleotidfolge abgeleitet werden kann.

MET-LYS-TYR-SER-THR-ILE-PHE-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-VAL-PHE-ALA-GLY-SER-ALA-ALA-ALA

Die Homologie mit der Signalfolge des pelD-Gens wird durch ein Sternchen angegeben. Auch die ersten 5 Reste des reifen Proteins haben dieselbe Aminosäurefolge in pelA und pelD.

Die gesamte Folge des pelB-Gens wird in der Abb. 10 gegeben, ebenfalls in der 5' —* З'-Richtung. Die 2774 bp-Sequenz beginnt mit dem ersten Nukleotid der Xhol-Stelle in pGW830 und endet am letzten Nukleotiden der zweiten Xhol-Stelle.

Die pelB-Sequenz umfaßt 1133 Nukleotide des Promotorbereichs, 1373 Reste des Strukturteils und 268 des Terminatorbereichs.

Das pel B-Gen codiert eine Signalfolge von wenigstens 20 Aminosäuren.

Die pelC-Sequenz besteht aus 1367 Nukleotiden des Promotorbereichs, 1340 Resten des Strukturteils und 461 des Terminatorbereichs. Das pelC-Gen codiert eine Signalsequenz von 18 Aminosäuren.

pelC MET-LYS-VAL-PRO X-X -PHE-LEU-GLN-LEU-LEU-CYS-LEU

pelB * *

pelA * ♦ *

pelD * * * *

pelC ASN-ALA-ALA pelB *

pelA *

pelD *

pelC LEU-ALA-SER-ALA pelB * *

pelA * *

pelD * * *

Die Homologie mit der Signalsequenz des pelA-, pelB- und pelD-Gens wird an den einzelnen Positionen mit einem Sternchen bezeichnet. Die X's werden zur Ausrichtung der Sequenzen einbezogen.

Die Suche nach Konsensus-Sequenzen für Pilz-Exon/Intron-Spleißungsverbindungen in Intron-Innensequenzen (Bailance, Lit. 11) führt dazu, das Vorhandensein von vier Introns in den Genen pe'A, B und C zu postulieren. Die Positionen, an denen sich die Introns innerhalb der Codierungsbereiche dieser pel-Gene befinden, bleiben in dem Sinne erhalten, daß potentiell fünf Intron-Positionen vorhanden sind, in jedem Gen aber ein anderes Intron fehlt. Für das pelC-Gen werden jedoch nur drei Introns postuliert. Von diesen befindet sich nur eines in einer Position, die einer Position eines Introns in pelD und pelA (Intron 5) entspricht. Die Positionen dieser Introns und ihre entsprechende Länge werden in der Tabelle Vl a zusammenfassend gegeben.

Tabelle Via

Positionen von Introns in den Sequenzen von pelD, pelA, pelB und pelC

Die Positionen beziehen sich auf die Codierungssequenzen in den Abbildungen 10,11 und 12 und auf die

Sequenz von pelD

Gen pelD pelA pelB pelC

Intron

Positionslänge, bp

Positionslänge, bp

Positionslänge, bp

Positionslänge, bp

1	202-26766	fehlen	1337-139862	fehlen
2	410-47162	1708-175952	1543-159856	fehlen
3	598-66063	1886-193348	1725-1781 57	fehlen
4	fehlen	fehlen	fehlen	1853-193078
5	1446-150257	2031-209464	fehlen	1998-206265
6	fehlen	fehlen	fehlen	2232-229463
7	fehlen	2329-238254	2113-216957	fehlen

Die Länge der Exons zwischen den Introns ist in diesen Fällen bei den vier pel-Genen dieselbe. In der Abb. 13 werden die ausgerichteten, abgeleiteten Aminosäurefolgen von PLA, PLB, PLC und PLD gezeigt. Im N-Terminalteil der Codierungsbereiche von pelA, pelB und pelD wird auf der Grundlage der Nukleotidfolgenhomologie einer Homologie von etwa 80% beobachtet und von mehr als 80% auf der Grundlage der Aminosäurefolgenhomologie. Dieser Prozentsatz ist bei pelC weit geringer. Im C-Terminalteil von pelA, pelB und pelD geht jenseits von des Restes 285 des reifen Proteins (was dem Rest 305 in der Abb. 13 entspricht) die Homologie zum großen Teil verloren und kehrt erst in der Nähe des C-Terminus zurück.

Abgesehen von den Konsensus-Sequenzen des Spleißungssignals und den 5'- und З'-Spleißungsstellen (Tabelle VIb) wird bei den Introns keine Homologie festgestellt.

Tabelle VIb

Vergleich Von Intron-Konsensus-Sequenzen

Intron	Donor Exon1	Intron	.32 .32.	Lasso	.12. ..8.	Akzeptor Intron	Exon2	I
pelD 1 pelB 1	AAGAC AGAAC	GTUAGTTT. GTAGGTCG.	.37. .29. .31.	GGCTGACC. .GCCTAACA.	..3. ..1. ..3.	.TGCCAG .ATCCAG	TTTCG CTTCG
pe ID 2 pelA 2 pelB 2	ACCTA GAATA ACTTA	GTAAGTTG. GTATCiCC. GTATGTTG.	.32. .25. .33.	.TGCTGACA. .ATCTAACT. .TGCTGATA.	..9. ..1. ..2.	.GGATAG .GGATAG .GTATAG	CAACA CTACA TGATA
pelD 3 pe IA 3 pe IB 3	ATCCA ATCCA ATCCA	GTATGCAT. GTAGGTTA. GTGAGTGC.	.31. .40. .39.	.AACTAACC. .CTCTAACG. .TGCTAATA.	..4. ..2. ..4.	.CCACAG .AATCAG .GGCCAG	GAACA GAACA GAACA I
pelD 5 pe IA 5 pelC 5	TTACT TTACT GCGAG	GTAAGTCG. GTACGTCT. GTAAGACA.	.30.	.CACTAATG. .AGTTAACA. .CGTTGACT.	.11.	.CTTCAG .TGACAG .GATTAG	ACTGC ACCGC ACCTC
pelC 6	CCAGA	GTACGTGT.	.24. .28.	.AACTAACA.	..8. ..7.	.TCACAG	ACAAC
pe IA 7 pelB 7	ACTGT ACGCC	GTAAGTTG. GTATGTCG.	.24. 40	.ACCTGACT. .TACTGACA.	..1. 12	.TTGCAG .CTACAG	GTCAA GTGAA
CONSENSUS		GTA-GT-. g с a	.--CTAAC-. t G t	. CAG T

Die abgeleiteten Aminosäurefolgen für die Proteine PLA, PLB, PLC und PLD geben eine Gesamtzahl von 359 Resten für die ersten beiden Proteine, 360 für POC und 354 für PLD an. Im Zusammenhang mit der N-Glykosylation ist in allen vier Proteinen eine potentielle Glykosylationsstelle an Position 109 (im reifen Protein) vorhanden (bei PLC entspricht das der Position 105 in der nichtausgerichteten Folge). Bei PLB ist in der Position 232 eine zweite potentielle Stelle vorhanden, während bei PLD zwei andere potentielle Glykosylationsstellen an den Resten 255 und 329 vorhanden sind.

Beispiel 5 Kotransformation von A. niger unter Verwendung des A. niger pyrA-Gens als Selektionsmarker und von verschiedenen A. niger

pel-Genen als kontransformierenden Plasmiden

Beispiel 5.1 Fortpflanzung und Reinigung von Plasmiden, die für die Transformation von A. niger verwendet werden

Alle Plasmide werden im E. coli-Stamm MH1 vermehrt, und die Plasmid-DNA wird aus 500-ml-Kulturen, die über Nacht gebildet wurden, nach der Methode von Maniatis u. a. (s.90-91, Lit. 5) gewonnen. Zu 2,5 ml DNA-Lösung in TE, der bis zu 1 mg DNA enthielt, wurden 2,2g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg/ml in Wasser) gegeben. Die Lösung wird in Schnellschlußröhrchen gegeben, die so gefüllt und verschlossen werden, wie das der Hersteller (Beckman) empfiehlt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Rotor VTi 65.2 bei 20°C über die Dauer von 16 Stunden mit 45000 U/min. Von den beiden fluoreszenten Bändern, die unter Ultraviolettlicht sichtbar sind, wird das untere, in dem sich die Plasmid-DNA befindet, durch seitliches Punktieren des Röhrchens isoliert. Die DNA-Lösung (etwa 1 ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird die DNA durch Ethanol ausgefällt, wieder in TE zur Suspension gebracht, einmal mit Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert, erneut ausgefällt und bei —20⁰C gelagert.

Das Plasmid pGW 613, welches das OMP-Dekarboxylase-Gen tpyrA) auf einem 5-kbp-DNA-Fragment von A. niger trägt, wird dazu genutzt,Transformanten auszuwählen (Goosen u. a.; Lit. 12). Die Plasmide pGW820, pGW830, pGW840, pGW850, pGW860 und pGW880, die im Beispiel 3.5 beschrieben wurden, werden als kotransformierende Plasmide verwendet.

Beispiel 5.2 Herstellung von Protoplasten und Transformation des uridinauxotrophen mutanten A. niger-Stammes N 593

Der A.niger-Stamm N593 (cspA, pyrA), derein Derivat des Parentalstammes N400 ist, wurde durch positive Selektion anhand des toxischen, 5-fluoroorotinsäuregleichen Analogs in Hefe (Boeke u. a.; Lit. 13) bei Vorhandensein von Uridin gewonnen, wie das von Goosen u.a. (Lit. 12) beschrieben wurde.

Flüssiges Minimalmedium, ergänzt mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2 Kacasaminosäuren, 1OmM Uridin (Janssen Chimica) und 5OmM Glukose, wird mit 10⁶ Konidiosporen von A. niger N 593 inokultiert und 20 Stunden bei 30⁰C in einem Orbitalschüttelapparat von New Brunswick inkubiert. Myzel wird durch Filtern durch Miracloth geerntet, mit isoosmotischem Minimalmedium (STS STC) mit folgender Zusammensetzung gewaschen: 1,33 M Sorbitol, 1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI₂, abgestimmt auf 1,7m0sm. Eine Menge von 1 g Myzel wird in 20 ml STC wieder zur Suspension gebracht. Innerhalb von 2 Stunden werden aus dem Myzel durch den Zusatz von 250mg filtersterilisiertem Novozym 234 (Novo Industries, Dänemark) und Inkubation des Gemisches bei 30⁰C in einem Schüttelapparat mit 95U/min Protoplasten freigesetzt. Die Protoplasten werden vom restlichen Myzel durch Filtern unter Verwendung eines Trichters mit einem Stöpsel aus Glaswolle getrennt und durch Zentrifugieren (10 min 2 500 U/min) gereinigt, pelletiert und erneut in STC zur Suspension gebracht.

Zur Transformation werden 5 χ 10^е Protoplaste in 200μΙ gegeben, die dann zusammen mit 1цд pGW631 und Юцд eines der Plasmide pGW 820, pGW830, pGW 850, pGW 860 oder pGW 880 (Volumen weniger als 20 μΙ) inkubiert werden. Für pGW 840 wird ein Verhältnis von 1:3 unter Verwendung von бцд pGW613 angewendet. Nach dem Zusatz von Plasmid-DNA zu den Protoplasten werden 50μΙ PCT (1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, 5OmM CaCI₂, 25% PEG6000) zugesetzt, und das Inkubationsgemisch wird 20 min auf Eis gehalten.

Dann werden weitere 2ml PCT zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5min bei Zimmertemperatur inkubiert. Abschließend werden 4ml STC zugesetzt und gemischt. Aliquote von 1 ml dieser abschließenden Transformationslösung werden mit 4ml verflüssigtem isoosmotischen M M-Top-Ag ar gemischt, das durch 0,95 M Sukrose stabilisiert worden war (abgestimmt auf 1,7 mOsm). Das Protoplastgemisch wird sofort auf Agar-Platten plattiert, die das gleiche isoosmotische Minimalmedium enthalten, und diese werden bei 3O⁰C inkubiert. Entsprechende Kontrollexperimente beinhalten Protoplaste, die ebenso, aber ohne Plasmid-DNA, und auf nichtstabilisiertem Minimalmedium mit2,5mM Uridin behandelt wurden.

Nach 3 Tagen Wachstum bei 30⁰C erscheinen gut wachsende Transformanten, die Sporen bilden (50-150 Transformanten je μg pGW613). Außerdem erscheint eine große Zahl von vermutlich abortiven Transformanten. Die Sporen von einzelnen Transformanten werden dann genommen und getrennt auf 50mM-Glukose-Minimalmedium plattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten, die zur Vermehrung der Sporen für die weitere Analyse der Transformanten verwendet werden.

In jedem Fall werden wenigstens zehn Transformanten auf flüssigem Minimalmedium gezogen, die DNA wird extrahiert und auf das Vorhandensein von kotransformierenden Plasmid-DNA analysiert. Pilz-DNA wird nach einem Verfahren isoliert, das gegenüber dem Verfahren zur Isolierung von Pflanzen-RNA leicht modifiziert ist (Slater; Lit. 14). Das Myzel wird mit Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren, und 0,5g werden unter Verwendung eines Mikrodismembrators (Braun) aufgebrochen. Das Myzelpulver wird mit frisch hergestelltem Extraktionspuffer extrahiert. Der Extraktionspuffer wird folgendermaßen hergestellt: 1 ml Triisopropylnaphthalensulfonsäure (TNS), 20 mg/ml, wird mit 1 ml p-Aminosalizylsäure (PAS), 120mg/ml, und 0,5ml 5x RNB-Puffer (5x RNB-Puffer enthält 121,1 g Tris, 73,04g NaCI und 95,1 EGTA in 11, pH-Wert 8,5) gemischt. Nach dem Zusatz von 1,5 ml Phenol wird der Extraktionspuffer für die Dauer von 10 min bei 55°Cäquilibriert. Der warme Puffer wird dann dem Myzelpuffer zugesetzt, und die Suspension wird eine Minute lang mit einem Vortex-Mischer gründlich gemischt. Dann wird ein Milliliter Chloroform zugesetzt, und es wird 1 min lang gemischt.

Durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) wird die wäßrige Phase abgetrennt und ein weiteres mal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) und anschließend zweimal mit Chloroform extrahiert.

Die wäßrige Phase enthält sowohl RNA als auch DNA. Die DNA wird bei Zimmertemperatur mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) aufgefangen, zweimal durch Auflösen in destilliertem, sterilen Wasser und erneutes Ausfällen mit Ethanol gewaschen. Die RNA wird durch den Zusatz von RNase A (20μg/ml) zur Endlösung entfernt. Das Verfahren ergibt hochmolekulargewichtige DNA (100 bis 200 kbp) in einer Ausbeute von etwa 300 цд DNA/g Myzel, die weiter gereinigt wird durch CsCI/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation, wie das im wesentlichen von Maniatis u.a., S. 93; Lit5, beschrieben wurde.

Verdauungen von Chromosomal-DNA (2μς) werden durch Inkubation bei 37°C mit EchoRI für pelA-(pGW820) und pelC-(pGW850) Transformanten, Hindill für pelB-(pGW830) Transformanten und EcoRI oder BgIII für pelD-Transformanten über die

Dauer von 2 Stunden hergestellt. In allen Fällen werden anfangs 20 Einheiten Restriktionsenzym verwendet, anschließend wird

die Inkubation durch den Zusatz von erneut 20 Einheiten Restriktionsenzymen um weitere 2 Stunden verlängert. Die

Verdauungen werden in den geeigneten Reaktionspuffern ausgeführt, die von BRL geliefert werden. Dann wird die DNA auf 0,6% Agarose fraktioniert, auf Nitrozellulose übertragen und im wesentlichen so hybridisiert, wie das von Maniatis u.a. (Lit.5), S.382-386 beschrieben wurde, wozu die entsprechend [a-³²P]-markierten Sonden eingesetzt werden. Es werden folgende Kotransformationshäufigkeiten gefunden: pGW820 (pelA) 70%; pGW830 (pelB); 70%; pGW840 (pelD)

15%; pGW850 (pelC) 60%.

Das Massenverhältnis von pGW613zum ^transformierenden Plasmid pGW820, pGW830, pGW950 (1:10) und pGW840 (1:3)

führt in der Mehrzahl der beobachteten Fälle zur Mehrfachkopie der chromosomalen Integration von kotransformierendenPlasmiden.

Beispiel 5.3 Genomische Analyse des pelA-transformierenden A. niger-Stammes A15

Eine Reihe der Mehrfachkopietransformanten, die in Beispiel 5.2 beschrieben worden sind, wurde analysiert, und die Analyse des pelA-Transformanten A15 wird als ausführliches Beispiel gegeben.

DNA des A. niger-Stammes N 593 und des mehrfachkopietransformierten pelA-Stammes A15 werden isoliert und durch Hybridisierung von Southern Transfers analysiert, wie das im Beispiel 3.1 beschrieben wurde. Als pelA-Sonde wird das 7,5-kbp-EcoRI-Fragment verwendet (siehe Abb. 3 a). In der genomischen Übertragung findet man ein intensives Band von 7,5 kbp im transformierten Stamm A15, das aus Integrationsereignissen vom Typ I und/oder Typ Il resultiert (siehe Hinnen u.a.; Lit. 14a). Es werden auch einige kleinere Bänder von unterschiedlicher Länge gefunden, die Grenzfragmente von Integrationsereignissen Typ Il von Umstellungen darstellen.

Die optischen Dichten der 7,4-kbp-EcoRI-Bänder in den A. niger-pelA-Transformanten A15 und den A. niger N 593-Autoradiogrammen werden unter Verwendung eines Gerätes Ultroscan XL (LKB) abgetastet. Die Werte werden für geringe Unterschiede in der DNA-Konzentration zwischen N 593 und dem Transformanten A15 durch Abtasten der ermittelten Dichten mit einer zweiten Sonde korrigiert, welche mit dem Pyruvatkinasegen hybridisiert, das als Einzelkopie in beiden Stämmen vorhanden ist. Aus diesen Daten wird berechnet, daß im pelA-Transformanten von A15 etwa 19 intakte Kopien des pelA-Gens vorhanden sind.

Unter Verwendung des Hindlll-Inserts von pGW830 (Abb. 3b) als Sonde, zeigt die Analyse des Southern-Transfer des transformierten Stammes A15, daß die Integration der pel-Sequenzen nicht an der pelB-Stelle erfolgt ist. Ebenso ergibt die Analyse des transformierten pelB-Stammes B13, des pelC-Stammes C15 und des pelD-Stammes D12 mit entsprechenden, geeigneten Sonden Kopiezahlen von etwa 15,50 und 10.

Beispiel 5.4

Northern-Transfer-Analyse von induzierten und nichtinduzierten Myzelien des pel Α-transformierten A. niger-Stammes A15 und von A.niger N400

Minimalmedium (250ml), das 5OmM Glukose oder 1 % Apfelpektin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%, Obipektin AG, Bischofszell) enthält, wird mit einer Sporendichte von 10^е Sporen/ml mit Sporen des Transformanten A15 oder Sporen des Wildtypstammes N400 inokuliert, und nach 30 Stunden Wachstum bei 30⁰C wird geerntet. Es werden auch Proben des Kulturmediums (2ml) aufgenommen, anhand von 211OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0, bei 4°C dialysiert und bei -20⁰C aufbewahrt. Aus dem Myzel werden Nukleinsäuren isoliert, wie das im Beispiel 5.2 beschrieben wurde. Die RNA wird aus der wäßrigen Phase nach Chloroformextraktion durch den Zusatz von Ѵз Volumen von 8 M LiCI ausgefällt. Die RNA wird durch Zentrifugieren (300 U/ min, 30 min) unter Verwendung einer Zentrifuge MSE Spuer-Mlnor aufgefangen und dann einmal mit kaltem (-20°C) 2 M LiCI und einmal mit kaltem (-20⁰C), 96%igen Ethanol gewaschen. Anschließend wird die RNA in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von etwa 1 mg/ml aufgelöst. Die Präparate sind im wesentlichen frei von DNA und ergeben eine Ausbeute von 1-2 mg RNA je Gramm Myzel. Mengen von etwa Юцд RNA werden behandelt nach Maniatis u.a., S. 202-203 (Lit. 5) auf denaturiertem Formaldehyd-1 %-Agarosegel unter Verwendung von Hindlll-verdauter Lambda-DNA oder der RNA-Leiter von BRL als Molekulargewicht-Marker. Die Gels werden übertragen und auf Nytran (Schleicher und Schuell) gebacken, wie das vom Hersteller empfohlen wird, und 16 Stunden lang bei 68⁰C mit der 7,4-kbp-EcoRI-pelA-DNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisations- und Waschverfahren sind die gleichen wie bei der DNA-Hybridisation unter homologen Bedingungen nach Beispiel 3.2.

Beide A. niger-Stämme erzeugen eine pektininduzierbare mRNA mit einer Länge von etwa 1,6kbp. Das Abtasten der optischen Dichte der beiden Autoradiogramme weist eine 15- bis 20fache Differenz in der Intensität zwischen dem A15-Transformanten und dem Wildtypstamm auf, was in Korrelation mit der Zunahme der Kopienzahl steht, die aus der Analyse des Southern-Transfer berechnet wurde.

Beispiel 5.5 Pektinlyaseproduktion durch den transformierten A.niger-Stamm D12

Der A. niger-pelD-Transformant D12, der nach Beispiel §.2 gewonnen wurde wird in einem zweistufigen Kultivationsverfahren ähnlich dem Verfahren gezogen, das von Hermersdörfer u.a. (27) für die Produktion von Polygalakturonase beschrieben wurde. Oben auf einer flüssigen Kultur wird eine Myzelschicht gebildet durch Modulation von 10⁶ Sporen je Milliliter des Vorkultivationsmediums (PCM), das aus Zuckerrübenbrei (4%) und NH₄NO₃ (1 %), pH-Wert 4,5, besteht. Nach einer Wachstumsperiode von 5 Tagen bei 30⁰C wird das in 30ml Medium gezogene Myzel mit Salzlösung gewaschen und auf 50ml Hauptkultivationsmedium (MCM) übertragen. Diese Kultur wird bei 30°C in einem Orbitalschüttelapparat bei 100 U/min gezogen. Das Hauptkulturmedium ist je Liter Medium zusammengesetzt aus Glukose (5%), Pektin (d.e. 72,8%; 0,1 %), NH₄NO₃ (0,75%), KH₂PO₄ (0,5%), FeSO₄ · 7H₂O (0,03%), MgSO₄ · 7H₂O (0,03%), CaCO₃ (0,03%), NaNO₃ (0,03%), pH-Wert 4,5. Innerhalb von 24 Stunden werden zu unterschiedlichen Zeitintervallen Proben genommen und durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert. Die Expression von pelD ist bereits innerhalb von 7 Stunden nach Kultivierungsbeginn maximal. Das Protein wandert identisch wie PLI, das als Referenz verwendet wurde.

Beispiel 5.6 Produktion von Pektinlyase A durch den transformierten A. niger-Stamm A15 und durch A. niger N 400

Die dialysierten Kulturfiltrate (Beispiel 5.4) werden lyophiliert, in 0,2 ml destilliertem Wasser resuspergiert und einer SDS-Polyakrylamid-Gelelektrophorese (10% Gel) nach Standardmethoden (Laemmli; Lit. 15) unterzogen. Die abgetrennten Proteine werden auf Nitrozellulose übertragen (Towbin u.a.; Lit. 16). Die Übertragungen werden fünf Stunden lang bei Zimmertemperatur mit 1 % BSA-Lösung in 10 mM Tris-HCI-Puffer, pH-Wert 7,5, mit 0,35 M NaCI gesättigt. Daran schließt sich eine sechzehnstündige Inkubation bei Zimmertemperatur mit polyklonalem Antikörper (0,1 %) an, gezogen anhand von zwei Pektinlyasen, die nach van Houdehoven (1975) in 50ml des gleichen Puffers gereinigt wurden, der 15OmM NaCI, 0,5% BSam 1 % Triton X-100,0,5% Deoxycholat und 0,1 % SDS enthält. Die Übertragungen werden dann fünfmal mit 200ml PBS gespült, bevor die Inkubation mit 30μΙ Ziegen-Antikaninchen-lgG-HRP (Sigma) als 2. Antikörper je 50ml erfolgt, und anschließend erneut 5mal mit PBS gewaschen. Abschließend werden die Übertragungen unter Verwendung von 4-Chloro-1 -naphthol als Substrat gefärbt. Es werden 40mg des Substrats in 0,5 ml 96%igem Ethanol aufgelöst und mit 100 ml 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 30 μΙ 30%igem Wasserstoffperoxid gemischt und dann den Übertragungen zugesetzt.

Beispiel 5.7 Screenen der pelA-transformierten Stämme durch Halobildung auf pektinhaltigen, festen Medien

Conidia von pelA-transformierten Stämmen werden mit einer Sporendichte von etwa 40 Kolonien je Petrischale auf steriles Filterpapier (Schleicher und Schuell) inokuliert, das oben auf 1 % agarverfestigtes Minimalmedium aufgebracht wird, welches 0,01 %Triton-X100 und Apfelpektin (1 %, D.e. 72,8%, Obipektin) als Kohlenstoffquelle enthält. Die Inkubationszeit beträgt 72 Stunden bei 30⁰C und ergibt einzelne Kolonien (2—4mm). Das Filterpapier wird auf eine andere sterile Petrischale übertragen, und das Medium in dieser Schale wird mit wenigstens 5ml einer Ruthenium-Rot-Lösung (0,1 %) in destilliertem Wasser gefärbt, 2 Stunden inkubiert und dann mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um den nichtadsorbierten Farbstoff zu entfernen, gefolgt von im wesentlichen dem Verfahren, das von Ried und Collmer (Lit. 17) für Polygalakturonat beschrieben wurde, um die bakterielle Pektatlyaseenzymaktivität zu charakterisieren.

Transformanten mit einer Überproduktion an PL Α-Protein werden anhand einer Zunahme des Halodurchmessers um die einzelnen Kolonien im Vergleich zum Parentalstamm N400 festgestellt.

Beispiel 6 Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase A (PLA) vom A.niger-pelA-Transformanten A15 Beispiel 6.1 Kulturbedingungen zur Herstellung von Pektinlyase A

Ein A. niger-pelA-Transformant A15, wie er im Beispiel 5 beschrieben wurde, wird auf Komplettmedium in Petrischalen für die Dauer von 3 Tagen bei 28°C gezogen, um Conidia zu produzieren. Die Conidia werden von diesen Platten durch Suspendieren der Sporen in 5ml steriler Salzlösung, die 0,005% Tween 80 enthält, geerntet. Die Suspension wird auf einem Griffin-Schüttelapparat 20min stark gerührt.

Minimalmedium (Lit. 21), das 1 % Apfelpektin (Brown Ribbon, d.e. 72,8%; Obipektin AG, Bischofzell) enthält, wird mit einer Sporendichte von 10^е Sporen/ml unter Verwendung von 250 ml Medium in 1-l-Erlenmeyerkolben, die silikonisiert sind, inokuliert. Das Myzel wird 40 Stunden lang bei 3O⁰C auf einem Gallenkamp-Orbitalschüttelapparat bei 200 U/min gezogen. Nach dem Kultivieren wird das Myzel durch Filtern über Miracloth unter Verwendung eines Bücher-Trichters entfernt. Das Kulturf iltrat (Lit. 21) wird mit destilliertem Wasser verdünnt (Lit. 21), der pH-Wert des Filtrats (pH-Wert 3,7) wird unter Verwendung von 1 N NaOH auf 6,0 gebracht, anschließend wird erneut mit Filterpapier Whatman I gefiltert.

Beispiel 6.2 Reinigen der PLA

Das verdünnte Kulturfiltrat (41) wird in eine Schnellflußkolonne DEAE-Sepharose (Pharmacia) (10cm χ 2,6cm) gebracht, die mit 2OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, voräquilibriert wurde. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorbanz bei 280 nm einen Wert von 0,1 OD erreicht. Die Pektinlyaseaktivität wird dann aus der Kolonne unter Verwendung eines linearen Gradienten eluiert, der sich aus 2OmM Natriumphosphatpuffer (150 ml) und 2OmM Natriumphosphatpuffer mit 1 M NaCI (150ml) zusammensetzt.

Die Fraktionen werden auf das Vorhandensein von aktiver Pektinlyase nach dem Verfahren überprüft, das von van Houdenhoven (Lit. 18, S. 11) beschrieben wurde, wozu Pektin von Brown Ribbon (d.e. 72,8%) als Substrat verwendet wurde. Die Aktivität erscheint um eine Konzentration von 0,43 M NaCI im Salzgradienten. Die aktiven Fraktionen werden dann zusammengefaßt und zweimal anhand von 11 2OmM Piperazin-HCI-Puffer, pH-Wert 5,5, dialysiert (Probengroße 45,5ml). Im nächsten Schritt wird die dialysierte Probe in 3 Portionen von gleicher Größe unterteilt, die einer anionischen Austauschchromatografie in drei getrennten Durchgängen unter Verwendung einer Standardkolonne MONOQ von Pharmacia in Verbindung mit dem FPLC-System von Pharmacia unterzogen werden. Die Kolonne wird mit 2OmM Piperazin-HCI-Puffer, pH-Wert 5,5, voräquilibriert. Nach der Einführung der Enzymprobe wird die Kolonne mit dem gleichen Puffer bei einer Flußrate von 1 ml/min eluiert, bis erneut die Grundlinienabsorbanz erreicht ist. Dann wird ein linearer Salzgradient angelegt. Im Rahmen von 22 ml des der Kolonnen zugeführten Eluierungspuffers wird eine Endkonzentration von 0,6M NaCI erreicht. Die aktiven Fraktionen (4,4ml) werden aufgefangen, unter Verwendung des Äquilibrationspuffers auf 25ml verdünnt, und es wird dasselbe Chromatografieverfahren wiederholt. Zwei Fraktionen, die das aktive Enzym enthalten (Gesamtvolumen 3ml) werden dann anhand von 25mM Piperazin-Puffer, pH-Wert 5,0, dialysiert und in 1-ml-Portionen auf eine Kolonne MONO P (Pharmacia) gespritzt, die mit dem gleichen Puffer voräquilibriert wurde. Nach den Injektionen wird unter Verwendung einer 5%igen Lösung von PolypufferTM 74 (in destilliertem Wasser, das unter Verwendung von 4 N HCI auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht wurde) ein pH-Wert-Gradient geschaffen. Das aktive Enzym (3,2 ml) tritt um einen pH-Wert von 3,2 auf. Das Präparat

wird extensiv anhand von 5OmM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, dialysiert und bei -2O⁰C aufgehoben. Die Reinigungsergebnisse werden in der Tabelle Vila zusammengefaßt und mit den Daten einer ähnlichen Reinigung von Pektinlyase, die durch den A. niger-Stamm N 400 produziert wurde, verglichen (Tabelle VII b).

Tabelle VII a und VIIb

Reinigungsschema für Pektinlyase A aus dem A.nlger-pelA-Transformanten N593 und für Pektinlyase aus dem A. niger-Stamm N400

Vila Schritt	Volumen ml	Gesamt aktivität (I. U.)	Spezifische Pek- tinlyaseaktivität (I. U./mg Protein)
DEAE-Sepharose MONOQ-Chromatografie(2x) MONO P-Chromatogr.	45,5 2,3 3.2	39,8 19,9 17,4	4,9 18,4 28,6
VIIb Wildtyp Schritt	Volumen ml	Gesamt aktivität (I. U.)	Spezifische Pek- tinlyaseaktivität (I.U./mg Protein)
DEAE-Sepharose MONO Q-Chromatographie (2 x) MONO P-Chromatogr.	43,0 1,1 1,4	10,1 2,5 1,7	0,9 6,3 10,0

Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des BCA-Proteinprobereagens (Pierce) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Die Gesamtaktivität von A.niger N 593, transformiert mit pGW820, hat im Vergleich zur Gesamtaktivität des Wildtyps nach der Reinigung etwa um das Zehnfache zugenommen, die spezifische Aktivität etwa das Dreifache.

Beispiel 6.3 Bestimmung der Aminosäurenfolgen des N-Termlnalteils von Pektinlyase A

Es werden 500 цд Pektinlyase (PLA), die nach Beispiel 6.2 gereinigt wurden, dreimal anhand von 11 destilliertem Wasser, das durch Millipore gefiltert wurde, dialysiert und lyophiliert. Die Aminosäurefolgen werden mit einem Proteinsequenziergerät von Applied Biosystems, Modell 470A, das direkt mit einem 120 A-PTH-Analysegerät verbunden ist, nach der von Hunkapiller (Lit. 17) beschriebenen Methode bestimmt.

Für das Enzym wird folgende N-Terminalaminosäurefolge bestimmt:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-SER-ALA-GLU-GLY-PHE-ALA-GLU-T-VAL-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA.

Die so bestimmte Aminosäurefolge entspricht genau der auf der Grundlage der Nukleotidfolge des pelA-Gens (siehe Beispiel 4.2).

Beispiel 6.4 Eigenschaften der Pektinlyase A

Der A.niger-Stamm N400 und der pelA-TransformantA15 werden wie im Beispiel 6.1 kultiviert, und das Enzym wird aus dem Kulturfiltrat nach dem Verfahren in Beispiel 6.2 gereinigt. Die so gewonnenen zwei Enzympräparate werden mit Pektinlyase Il verglichen, die nach van Houdenhoven (Lit. 18) gereinigt wurde.

SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von 10%igem Gel ergibt ein einziges Band mit identischem Molekulargewicht in allen drei Fällen, wenn in jedem Fall 2 bis 5цд Protein eingesetzt werden.

Unter Anwendung von Standardverfahren (siehe z. B. Anweisungsblatt von Pharmacia, Isoelektric Focussing, 1982) wurde eine isoelektrische Fokussierung durchgeführt. Es wurden ein Gerät FSBE-3000 und die entsprechende Stromversorgung ECPS 3000/ 150 (Pharmacia) eingesetzt. Die gewonnene PLA ist nach dem isoelektrischen Fokussieren homogen und hat einen niedrigeren isoelektrischen Punkt (O,2pH-Einheiten) als PLII, der nach van Houdenhoven (Lit. 18) mit 3,75 angegeben wird. Die aus dem N400-Filtrat gereinigte PLII ist nach dem isoelektrischen Fokussieren heterogen. Das Hauptband stimmt in der Position mit PLA-Protein überein. Zwei kleinere Bänder sind geringfügig nach der Kathode verschoben. Folglich fehlen beim A. niger-Mehrfachkopietransformanten A15 die kleineren Emzymformen, die bei N400 sichtbar sind.

Ein direkter Vergleich der kinetischen Parameter von PLA und PLII, die im letzteren Fall von van Houdenhoven (Lit. 18) ermittelt wurden, unter Verwendung von 95%igem vetesterten Apfelpektin als Substrat, zeigt identische K_m- und V_max-Werte für beide Enzyme.

Beispiel 7

Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase D (PLD) aus dem A.niger-pelD-Transformanten D12

Beispiel 7.1

Kulturbedingungen für die Herstellung von Pektinlyase D

Der A. niger-pelD-Transformant D12, der nach Beispiel 5.2 gewonnen wurde, wird anfangs nach Beispiel 5.5 in Aliquoten von 300ml gezogen. Nach einer Wachstumsperiode von 5 Tagen in PCM bei 30⁰C wird die Myzelmatte auf 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,1 M Natriumchlorid enthält, übertragen. Durch Schütteln des Myzels in 150 ml auf einem Orbitalschüttelapparat mit 200 U/min für die Dauer von 2 Stunden wird der größte Teil der Pektinlyase in das Medium freigesetzt.

Beispiel 7.2 Reinigung von PLD

Nach der Entfernung des Myzels durch Filtern wird die Enzymlösung einer DEAE-Sepharose-Schnellflußkolonne (Pharmacia) (25cm χ 1,25cm) zugeführt, die mit 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,2M Natriumchlorid enthalt, voraquilibriert war. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorbanz bei 280 nm einen Wert von < 0,1 erreicht. Die Pektinlyaseaktivität wird aus der Kolonne durch Anwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0,2 bis 0,7M) in 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) 800ml Gesamtvolumen) eluiert. Die Fraktionen werden nach dem Vorhandensein von Pektinlyase D durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese und Western-Transfer (Towbin u. a., Lit. 16) screeniert, wie das im Beispiel 5.6 beschrieben wurde. Die Fraktionen, die Pektinlyase D enthalten, werden zusammengefaßt und dialysiert anhand von 2OmM Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,15M Natriumchlorid enthalt, und einer Anionenaustauschchromatografie unter Verwendung einer Standard-ΜΟΝΟ Q-Kolonne von Pharmacia in Verbindung mit FPLC-System unterzogen. Nach der Beschickung wird die Kolonne mit dem gleichen Puffer gewaschen, bevor ein linearer Natriumchloridgradient zu 50 ml in 2OmM Natriumphospharpuffer (pH-Wert 6,0) angewendet wird. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen, und Aliquote zu 1 ml werden einer Superose-12-Gel-PermeationskoIonne zu 100 ml zugeführt, die in 20 mM Natriumphosphat (pH-Wert 6,0) äquilibriert wurde, das 0,2 M Natriumchlorid enthalt, und mit dem FPLC-System verbunden. Aktive Enzymfraktionen (jeweils 1 ml), die von der GPC-Kolonne gewonnen wurden, werden durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese analysiert, um die Reinheit der gewonnenen Pektinlyase zu überprüfen.

Tabelle VIII

Reinigungsschema von Pektinlyase D aus dem A. niger-pelD-Transformanten D12

Schritt Volumen Aktivität Spezifische Pek-

(ml) (I. U.) tinlyaseaktivitat

(I. U./mg Protein)

Kulturfiltrat 1950 109 0,096

DEAE-SepharoseFF 103 32,2 5,65

MONO Q und GPC 14,5 10,4 7,5

Beispiel 7.3 Bestimmung der Aminosäurenfolge des N-Terminalteils von Pektinlyase D

Es werden 500 pg Pektinlyase D, gereinigt nach Beispiet 6 2, dreimal anhand von destilliertem Wasser, 11, gefiltert durch MiJfipore, gereinigt und lyophiliert. Die Aminosaurefolgen werden mit einem Proteinsequenziergerat Applied Biosystems Modell 470 A bestimmt, das direkt mit einem Analysegerat 120 A PTH verbunden wurde, dabei wurde die von Hunkapillar (Lit 19) beschriebene Methode angewendet.

Fur das Enzym wird folgende N-Terminalaminosaurefolge bestimmt:

VAL-GLY-VAL-SER-GLY-THR-PRO-VAL-GLY-PHE-ALA-SER-SER-ALA-THR-GLY-GLY-GLY-ASP-ALA-THR Die bestimmte Aminosaurefolge stimmt genau mit der auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des pelD-Gens uberein

Beispiel 8 Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Pektinlyase B (PLB) aus dem A niger-Transformanten B13 Beispiel 8.1 Kulturbedingungen für die Herstellung von Pektinlyase B

Der A.niger-pelB-Transformant B13, der nach Beispiel 5 2 gewonnen wurde, wird nach Beispiel 5 3 auf seinen Mehrfachkopiecharakter analysiert. Die Northern-Transfer-Analyse nach dem im Beispiel 5.4 beschriebenen Verfahren zeigt, daß eine pektinmduzierbare mRNA mit einer Lange von etwa 1,6 kb hergestellt wird. Nach einem Wachstum über 35 Stunden bei 30°C in einem Minimalmedium, das 1 %Zitruspektin (d.e. 72,8%) und 1 % Weizenkleieenthalt, wird das Enzym wie im Beispiel 5.4 produziert. Das Enzym wird auch unter Verwendung eines Mediums erzeugt, das aus4%Zuckerrubenbrei und 1% NH₄HO₃ besteht.

Beispiel 8.2 Reinigung der PLB

Das Kulturfiltrat wird zweifach mit destilliertem Wasser verdünnt, und der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 6,0 gebracht, anschließend wird mit Filterpapier Whatman 1 erneut gefiltert Das verdünnte Filtrat (21) wird dann einer DEAE-Sepharose-Schnellflußkolonne (Pharmacia) 9cm χ 3,2cm) zugeführt die mit 5OmM Natriumazetatpuffer, pH-Wert 5,0, voraquilibriert wurde Ein Teil der Pektinlyaseaktivität ist im Eluat vorhanden, wie durch das Verfahren gezeigt werden kann, das von van Houdenhoven (Lit. 18, S 11) beschrieben wurde, dabei wird Brown-Ribbon-Pektm (d.e. 72,8%) oder stark verestertes Pektin (d e 94%) eingesetzt Die Mehrheit der Pektinlyaseaktivität kann durch Zufuhrung eines Salzgradienten eluiert werden Diese Aktivität erscheint im Salzgradienten, und es wird festgestellt, daß sie mit PLA auf der Grundlage des Eluierungsverhaltens und des scheinbaren Molekulargewichts bei SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese identisch ist, wie das im Beispiel 6 beschrieben wurde.

Das Eluat aus der DEAE-Schnellflußkolonne wird anhand destillierten Wassers dialysiert und einer Kolonne MONO S (Pharmacia) zugeführt, die vorher mit einem 2OmM Natriumazetatpuffer, pH-Wert 4,5, äquilibriert wurde Das Enzym wird aus der Kolonne durch Einsatz eines Natriumchlond-Salzgradienten von 0-1,OM in dem gleichen Puffer eluiert. Das Enzym wird beinahe sofort aus der Kolonne eluiert. Die aktiven Fraktionen werden zusammengefaßt und dann mit destilliertem Wasser etwa vierfach verdünnt. Die Rechromatografie der Enzymlosung ergibt Fraktionen, die auf der Grundlage der SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese das reine PLB-Protein enthalten

Beispiel 8.3 Eigenschaften von Pektinlyase B

Die Eigenschaften des Enzyms, das nach Beispiel 8.2 aus dem pelB-Transformanten B13 gereinigt wurde, werden bestimmt und mit denen der Pektinlyase A und D verglichen.

SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unter Verwendung von 10%Gelen fuhrt zu einem einzelnen Band mit einer scheinbaren Molekularmasse von 39,7 kDa. Unter den gleichen Bedingungen ist die scheinbare Molekularmasse von PLA und PLD 49,1 kDa bzw. 52,3 kDa.

Die isoelektrische Fokussierung wird so durchgeführt, wie das im Beispiel 6.4 beschrieben wurde. Der isoelektrische Punkt von PLB ist 6,0, wenn mit einem pH-Wert-Gradienten zwischen pH-Werten von 3 und 7 gearbeitet wird. Die Probe wird etwa in einer Position zugeführt, die einem pl von 5,0 entspricht.

Das gereinigte Enzym PLB ist auch mit polyklonalen Antikörpern reaktiv, die anhand von PLI und PLII hergestellt wurden, wie durch die Western-Transfer-Analyse geprüft wurde. PLD, A und B können auf diese Weise leicht anhand der Werte ihrer scheinbaren Molekularmasse unterschieden werden.

Beispiel 8.4 Kinetische Eigenschaften von PLB

Das nach Beispiel 8.2 gereinigte Enzym wird kinetisch charakterisiert. Das Enzym katalysiert eine Pektinlyasereaktion und ist über einem breiten Bereich von pH-Werten (pH-Wert 5-9,5) aktiv, wie in einem Mcllvaine-Puffer (μ = 0,5) mit unterschiedlichen pH-Werten getestet wurde (van Houdenhoven; Lit. 18). Das pH-Wert-Optimum ist breit (pH-Wert 7,5-8,5). Bei einem pH-Wert von 6,0 beträgt die Aktivität etwa 55%; bei einem pH-Wert von 9,5 betragt sie immer noch 85% der Aktivität bei einem pH-Wert von 8,0. Sowohl stark verestertes Pektin (d.e [= Veresterungsgrad] = 94%) als auch Pektine mit einem niedrigeren Veresterungsgrad, wie Brown Ribbon-Apfelpektin (d.e. 72,8%1 Obipektin AG, Bischoffzeil), können als Substrat verwendet werden. Die höchste Aktivität erreicht man jedoch mit stark verestertem Pektin. Das Enzym reagiert nicht mit Polygalakturomat. Die Pektinlysedereaktion, die durch PLB katalysiert wird, kann durch den Zusatz von EDTA zum Reaktionsgemisch (es wird mit einer Endkonzentration von 3mM gearbeitet) unterbunden werden; reaktiviert wird das Enzym durch den Zusatz eines Überschusses an Ca²⁺-lonen. Also codiert pelB eine Ca²⁺-abhängige Pektinlyase. Bei 25°C hat das Enzym eine angenäherte Umschlagzahl von 6500 und einen K_m-Wert von 2,5 mM, wenn stark verestertes Pektin als Substrat eingesetzt wird. Diese Werte werden nach dem Verfahren von van Houdenhoven (Lit. 18) unter Einsatz eines Mcllvaine-Puffers, pH-Wert 8,0 (μ = 0,5), bestimmt.

Beispiel 9 Expression und Sekretion von Fremdgenen unter der Kontrolle des pelA-Promotors

Das 3,9-kb-Hind Ill-Fragment von Plasmid pGW820 wird in die Hindlll-Stelle von pBR322 subkloniert. Die Plasmid-DNA von ampizillinresistenten Transformanten wird durch Hind III- und Sall-Restriktionsverdauungen analysiert. Em Klon, der das pelA-lnsert in Uhrzeigerorientierung enthalt, wird als pGW822 bezeichnet. Der induzierbare Promotor von pelA wird dazu genutzt, in A. niger-Fremdgene zu expressieren. Auf Plasmid pGW822 ist das vollständige pelA-Gen vorhanden Der Promotor und die pelA-Signalsequenz befinden sich auf einem 1-kb-BamHI-Pstl-Fragment. Die Pstl-Schneidstelle in der Nukleotidposition 1420 (Abb. 10) fallt mit dem З'-Ende der Signalsequenz zusammen und kann fur die Rahmenfusion an die Codierungssequenz eines Fremdgens genutzt werden. Die Transkriptionterminationssignale von pelA befinden sich auf einem 1,3-kb-Sal I-Hind Ill-Fragment.

Beispiel 9.1 Subklonieren des pelA-Gens in den Vektor pUC19

Das 3,3-kb-BamH I-Hind Ill-Fragment von Plasmid pGW322 enthalt das pelA-Gen. Das Fragment wird in den Vektor pUC19 (Pharmacia) Moniert, der mit BamH I und Hindlll geschnitten wurde. Die gereinigten Fragmente werden ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird dazu verwendet, Ca²~-behandelte, kompetente JM 109-Zellen zu behandeln. Die erfolgreiche Klonierung des 3,3-kb-BamH I-Hind HI-Fragmentes in pUC19 wird nachwahl auf Ampizillinplatten bei Vorhandensein von X-GaI und IPTG vorgenommen (T. Maniatis u. a., in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Molekularklomerung, ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S.52). Weiße, ampizillinresistente Transformanten werden herausgegriffen Die Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamH I/Hind Ill-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit einer korrekten Einfügung wird als pUC 19/pelA bezeichnet. Eine analoge Konstruktion mit pUC 18 ergibt pUC 18/pelA.

Beispiel 9.2

Expression von Humanhybridinterferon-BDBB unter der Kontrolle des pelA-Promotors 92 1 Konstruktion des PlasmidspUC 19/pelA-IFN AM119 (siehe Abb. 14)

Plasmid pUCi9/pelAwird mit Sail verdaut. Die kohasiven Enden des linearen Fragments werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) bei Vorhandensein von jeweils 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP, dTTP, 6OmM Tris-HCI, pH-Wert7,5, und 1OmM MgCI₂ über die Dauer von 30 min bei Zimmertemperatur gefüllt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA auf eine Endkonzentrbiion von 12,5mM gestoppt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefallt Das lineare Fragment wird mit Pst I verdaut Nach der Phenol/Chloroform-Extraktion wird die DNA mit Ethanol ausgefallt

Ein Oligodesoxynukleotid-Linker mit der Formel

Pst I Ddel

(I) 5'- TGTGATCTGCC -3'

(II) S'-ACGTACACTAGACGGAGT-Ö'

wird in die Pst (-Stelle des lineansierten Plasmids ligiert. Der Linker füllt das 3'-rezessierte Ende der Pst I-Stelle, die mit dem Ende der pelA-Signalsequenz zusammenfallt und gewährleistet die Im-Rahmen-Fusion an die Codierungssequenz von Interferon-BDBB (I) stellt die 5'-Termmalnukleotidsequenz des Interferon-BDBB-Gens bis zur Ddel-Restriktionsstelle dar

Es werden jeweils 20OpMoI der Oligonukleotide (I) und (II) phosphoryliert und hybridisiert. Das Pstl-geschnittene pUC19/pelA-Plasmid und ein einhundertfacher Molüberschuß der doppelsträngigen Linker-DNA werden in 6OmM Tris-HCI, pH-Wert7,5, 1OmM MgCI₂,1 mM ATP, 5mM DTTund 400 EinheitenT4-DNA-Ligase über 16 Stunden bei 15°C ligiert. Die DNA-Ligase wird über 10min bei 85°C inaktiviert. Die überschüssigen Linker werden durch Ausfällung bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, 30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt.

Das große 5 kb-Fragment wird auf einem 0,6%igen präparativen Agarosegel isoliert. Das Fragment enthält den pelA-Promotor und die Signalsequenz (BamHI[Pstl]/Linker) und den pelA-Terminator ([SaI I]glatt-Hind III) im Vektor pUC 19. Das Plasmid pJDB207/PH05-IFN AM 119 (EP 205404) enthält das Gen für Hybrid-a-lnterferon-BDBB unter der Kontrolle des regulierten Promotors der Hefesäurephosphate (PHO5). Die Plasmid-DNA wird mit BamHI und Hind III verdaut. Das 1,3 kb-BamH I-Hind HI-Fragment wird isoliert, welches den PHO5-Promotor, die Codierungssequenz von IFN BDBB und die PHO 5-Transkriptionsterminationssequenzen enthält. Das Fragment wird durch DE 52-Chromatografie und Ethanolausfällung gereinigt und weiter mit Taq I verdaut. Die kohäsiven Enden der Taq I-Restriktionsfragmente werden in einer Reaktion mit Klenow-DNA-Polymerase I (BRL) bei Vorhandensein von 0,1 mM von jeweils dCTP und dGTP, 6OmM Tris-HCI, pH-Wert7,5,1OmM MgCI₂ für die Dauer von 30 min bei Zimmertemperatur gefüllt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 12,5mM gestoppt. Die DNA-Fragmente werden mit Ethanol ausgefällt und weiter mit Dde I verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 0,8%igen präparativen Agarosegel getrennt. Das 549bp-Ddel-[Taql]-glatte Fragment wird aus dem Gel elektroeluiert, durch DE 52-lonenaustauschchromatografie gereinigt und mit Ethanol ausgefällt. Das DNA-Fragment wird in H₂O mit einer Konzentration von etwa 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht.

Es werden 0,2pMol des 549bp-Ddel-[Taql]-glatten Fragmentes und 0,1 pMol des 5kb-Vektorfragmentes in 10μΙ von 6OmM Tris-HCI,pH-Wert7,5,1OmM MgCI₂,3,5mM ATP, SmM DTTund 200 Einheiten vonT4-DNA-Ligase (Biolabs) über 16Stunden bei 15°C ligiert. Eine Menge von 1 μΙ des Ligationsgemischs wird zur Transformation von Ca²⁺-behandelten, kompetenten HB101-Zellen verwendet.

Plasmid-DNA wird aus 12 ampizillinresistenten, transformierten Kolonien hergestellt und durch EcoRI-, Pvull-, CIaI- und EcoRI/ Hind »-Verdauung analysiert. Es wird ein Klon mit dem erwarteten Restriktionsmuster ausgewählt. Die korrekte In-Rahmen-Fusion der peA-Signalsequenz und der reifen Codierungssequenz von Interferon-BDBB wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Plasmid-DNA des ausgewählten Klons wird als pUC 19/pelA-IFN AM 119 bezeichnet. Eine analoge Konstruktion mit pUC18/pelA ergibt das Plasmid pUC18/pelA-IFN AM 119.

Beispiel 9.2.2

Kotransformation des Aspergillus niger-Mutanten An 8 mit pCG59D7 und pUC19/pel A-IFN AM 119

Deruridinauxotrophe Mutant An8 (= DSM3917, offengelegt in EP 88101397.3) wird mit Plasmid pCG 59 D7 transformiert, um Uridinprototrophe zu ergeben. Zusammen mit dem transformierenden Plasmid wird das nichtselektive Plasmid pUC 19/pelA-IFN AM 119 zugesetzt, um bei Kotransformation zufällige Kointegranten zu ergeben.

Conidiaisporen von A.niger An8 werden 4 Tage langbei 28°C bis zur vollständigen Sporenbildung in einem Komplettmedium gezogen. Es werden 2x 10⁸ Contdiosporen eingesetzt, um 200ml Minimalmedium, das mit 1 g/l Arginin und Uridin ergänzt wurde, zu inokulieren.

Nach 20 Stunden Wachstum bei 28°C und 180 U/min wird das Myzel durch Filtern durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen und wieder zur Suspension gebracht in 20 ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI₂,0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Das Gemisch wird in einem Rüttel-Wasserbad (30⁰C, 50U/min) inkubiert, bis mikroskopisch eine maximale Protoplastenfreisetzung festgestellt werden kann (90-120 min). Die Protoplastsuspension wird durch einen Glaswollstöpsel in einem Trichter gefiltert, um Myzeltrümmer zu entfernen. Die Protoplaste werden durch sanftes Zentrifugieren (10 min, 2000U/ min) bei Zimmertemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen. Abschließend werden die Protoplaste in 200 bis 500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ wieder zur Suspension gebracht, wobei eine Konzentration von 1 x 10^s/ml erreicht wird.

Zur Transformation wird ein Aliquot von 200μΙ der Protoplastdispersion mit 5μg pCG 59D7 und 10μg pUC 19/pelA-IFN AM 119-DNA, 50 μΙ PCT (1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI₂,25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird 20min auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Es werden 4ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI₂ zugesetzt, und Aliquote zu 1 ml der abschließenden Transformationslösung werden mit lignifiziertem Minimal-Agar-Medium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10g/l Bacto-Agar [Difco]), stabilisiert mit 0,8 M KCI, gemischt. Das Gemisch wird sofort auf Agar-Platten mit dem gleichen Medium gegossen und bei 28°C inkubiert.

Nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 28⁰C erscheinen stabile Transformanten als kräftig wachsende und sporenbildende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abortiven Transformanten.

Beispiel 9.2.3

Expression des Hybrid-Interferon-BDBB-Gens unter der Kontrolle des pelA-Promotors Es werden 37 Transformanten des Kotransformationsexperimentes (Beispiel 9.2.2) herausgenommen und auf Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird nach dem Verfahren von Armstrong (J.A.Armstrong, Appl. Microbio. 21,732 [19711) unter Verwendung von menschlichen CCL-23 Zellen und des vesikularen Stomatitisvirus (VSVaIs Herausforderungsvirus durchgeführt.

Conidiaisporen von Transformanten werden einzeln in 50 ml eines Vorkulturmedium vorkultiviert (Pectin Slow Set I [Unipectin, SA, Redon, Frankreich], 3g/l, NH₄CI, 2g/l, KH₂PO₄,0,5g/l, NaCI, 0,5g/l, Mg₂SO₄ 7H₂0,0,5g/l, Ca₂SO₄ · 2H₂O, 0,5g/l, pH-Wert 7,0). Die Vorkultur wird 72 Stunden lang bei 250U/min und 28°C inkubiert. Es werden 10% der Vorkultur dazu genutzt, 50ml des Hauptkulturmediums [Sojabohnenmehl, 20g/l, Pectin Slow Set, 5 g/l]) zu inokulieren. Die Kultur wird über 72 bis 96 Stunden bei 250U/min und 28°C gezogen.

Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschalldesintegration aufgebrochen. Die obenaufschwimmende Schicht und die Zellextrakte werden beide auf ihre Interferonaktivität untersucht, wie das beschrieben wurdeHsiehe oben). Es wird festgestellt, daß die Masse der Interferonaktivität in das Medium sekretiert wird.

-26- 284 863

Beispiel 10 Konstruktion von Plasmid M 13(+)KS/pelA_uss-IFN AM 119

Die 2,8 kb-umfassende Expressionskassette von Plasmid M13-(+)KS/pelA_Äss-IFN AM 119 beinhaltet den induzierbaren pelA-Promotor, die Codierungssequenz von Hybrid-Interferon-BDBB und den pelA-Transkriptionsterminator auf dem Bluescript-M 13(+)KS-Vektor. Hybrid-Interferon-BDBB wird expressiert und befindetsich in der Wirtszelle. Plasmid M 13(+)KS/pelA_uss-IFN AM 119 wird von pUC 18/pelA-IFN AM 119 (siehe Beispiel 9.2.1) abgeleitet. Die pelA-Signalsequenz (ss) wird durch seitlich gerichtete Mutagenese ausgeschaltet (siehe Abb. 15). Es wird erwartet, daß sich Hybrid-Interferon, das ohne Signalsequenz aus der Konstruktion expressiert wurde, im Zytosol befindet.

Beispiel 10.1

Subklonieren der pelA-IFN AM 119-Kassette in den Bluescript-M 13(+)KS-Vektor

Plasmid pUC 18/pelA-IFN AM 119 (siehe Beispiel 9.2.1) wird mit BamH I und Hind 111 verdaut. Das 2,8 kb-BamH I-Hind HI-Fragment enthält den pelA-Promotor, die Signalsequenz, die IFN-BDBB-Codierungssequenz und den pelA-Terminator. Das BamH I-Hind Ill-Fragment wird isoliert und an den Bluescript-M 13(+)KS-Vektor (Stratagene), der mit BamH I und Hind III geschnitten wurde, ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wird zur Transformation von Ca²⁺-behandelten, kompetenten JM 109-Zellen verwendet. Das erfolgreiche Klonieren des 2,8 kb-BamH I-Hind Il-Fragments in M 13(+)KS wird für Ampizillinplatten bei Vorhandensein von X-GaI und IPTG ausgewählt. Es werden 12 weiße, ampizillinresistente Kolonien aufgenommen. Die Plasmid-DNA dieser Kolonien wird durch BamH I/Bgl Il-Doppelverdauung analysiert. Ein Transformant mit dem korrekten Insert wird als M 13(+)KS/peIA-IFN AM 119 bezeichnet.

Beispiel 10.2

Gewinnung von einzelsträngiger DNA aus Zellen, die das Bluescript M 13(+)KS-Plasmid enthalten

Plasmid M13(+)KS/pelA-IFN AM 119 wird dazu genutzt, den kompetenten E. coli-Stamm CJ 236zu transformieren (dut-1, ung-1, thi-1, relA-1; pCJ 105 [Cm']; BIO-RAD Muta-Gene M 13-ln-vitro-Mutagene-Satz). Dieser Stamm ermöglicht die Einbeziehung von Urazii in die DNA. CJ 236 wird in 10 ml LB-Medium gezogen, das 100 mg/1 Ampizillin enthält. Bei ODeoo von 0,5 werden die Zellen mit Phag M13KO7 (Mead u.a.; Lit29) mit einer Infektionsmultiplizität von 50 überinfiziert. Nach einer Stunde bei 37°C wird Kanamyzin (50mg/l) zugesetzt, und die Kultur wird bei 37 °C 5 bis 6 Stunden lang auf einem Schüttelapparat inkubiert. Der nichtcodierende Strang in bezug auf das pelA-IFN AM 119-lnsert von Plasmid M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119 wird synthetisiert, verpackt und an das Medium freigesetzt. Aus der obenaufschwimmenden Schicht der Kultur wird einzelsträngige DNA nach Kunkel u.a. (Lit.30) hergestellt.

Beispiel 10.3

Seitlich gerichtete Oligonukleotidmutagenese an der einzelstrSnglgen DNA-Matrize

Eine seitlich gerichtete Deletionsmutagenese wird an der nichtcodierenden, einzelsträngigen pelA-IFN AM119-Matrize durchgeführt, um die pelA-Signalsequenz herauszulösen (Abb. 15).

Der mutagene Starter besteht aus einem Teil der pelA-Promotorsequenz, einschließlich ATG (Nukleotidpositionen 1343 bis 1363 in der Abb. 10), und 21 Nukleotiden mit der Codierung für die Aminosäuren 1 bis 7 des reifen IFN-BDBB. Für die Mutagenese werden 200 pMol des mutagenen Starters in 20 μΙ von 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,10 mM MgCI₂,5 mM DTT und 0,5 mM ATP unter Verwendung von 8 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase (Boehringer) phosphoyliert. Nach einer Stunde bei 37°C wird die Reaktion durch Erhitzen auf 65⁰C für die Dauer von 10min gestoppt.

Es werden 0,2 pMol der einzelsträngigen Matrize mit 10 pMol des phosphorylierten, mutagenen Oligodeoxyribonukleotidstarters und 1OpMoI des universellen Sequenzierungsstarter М13іп30цІ20тМТгіз.НСІ,рНЛѴв«7,5,1OmMMgCI^SOmMNaCI, 1mM DTT bei 80⁰C über 5min inkubiert. Man läßt die Lösung langsam über eine Zeitspanne von 30 min auf Zimmertemperatur abkühlen; dem hybridisierten Gemisch werden 10 μΙ der Enzym-dNTP- (-dATP-, -dGTP-, -dCTP-, -dTTP-) Lösung zugesetzt, die 1 μΙ Puffer (0,2 M Tris.HCI, pH-Wert 7,5,0,1 M MgCI₂), 5μΙ 2 mM dNTP-Gemisch, 0,5 ul 20 mM ATP, 1 μΙ 0,2 M DTT, 0,5 μΙ T₄-DNA-Ligase (Biolabs, 400 Einheiten/μΙ) und 1,2μΙ Klenow-DNA-Polymerase (BRL, 5 Einheiten/μΙ) enthält. Das Gemisch wird bei 15°C 16 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65°C über die Dauer von 10 min gestoppt. Es werden 1 μΙ und 3μΙ des Ligationsgemischs zur Transformation von 0,2 ml der kompetenten Zellen des Reparatur-Minus-Stammes E.coli МѴП90 [д(Іас-ргоАВ), thi, supE, a(sr1-recA)306:Tn10(tet^r) (F':traD36, proAB, Iac l^qZ_uM15)] verwendet. Stamm MV1190 wird im Handbuch für den In-vitro-Mutagene-Satz BIO-RAD MUTA-GENE M13 beschrieben. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch Seal-Verdauung analysiert. Das erfolgreiche Auslösen der pelA-Signalsequenz entfernt eine Seal-Stelle. Korrekte Plasmide werden an der Seal-Stelle im Bluescript-Vektor linearisiert. Ein Plasmid wird weiter analysiert. Die korrekte Verbindung zwischen dem pelA-Promotor und der Codierungssequenz für Hybrid IFN BDBB mit ATG wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Eine korrekte Konstruktion wird als M13(+)KS/pelA_uss-IFN AM119 bezeichnet.

Beispiel 10.4

Kotransformation von A.niger und Expression von Hybrid-Interferon

Die Plasmide M13(+)KS/pelA_uss-IFN AM119 und pCG59D7 werden zur Kotransformation des A.niger-Mutanten An8 nach Beispiel 8.2.2 verwendet. Die Transformanten werden wie im Beispiel 8.2.3 kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschalldesintegration aufgebrochen. Die Zellextrakte werden auf Interferonaktivität getestet (siehe oben). Die Masse der Interferonaktivität wird intrazellulär gefunden.

Deponierung der Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden nach dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1 b, D - 3300 Braunschweig, deponiert:

Mikroorganismen Dep.-Nr. Deponierungsdatum

EscherichiacoliHB101/pGW820 DSM 4388 I.Februar 1988

EscherichiacoliHBIOI/pGWeSO DSM 4389 I.Februar 1988

EscherichiacoliHBIOI/pGWSSO DSM4390 1.Februar1988

EscherichiacoliHBIOVpGWeeO DSM 4391 I.Februar 1988

EscherichiacoliHBIOI/pGWSSO DSM 4392 I.Februar 1988

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Claims (32)

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das eine DNA-Folge aufweist, die das Expressionssystem der Pektinlyasen PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF oder deren Derivat codiert, gekennzeichnet durch das Züchten eines Wirts, der mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, welches eine DNA-Folge mit einer Codierung für das Expressionssystem der Pektinlyase PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF enthält oder dessen Derivat, und das Isolieren des gewünschten rekombinanten DNA-Moleküls oder dessen Derivat oder durch dessen Herstellung durch eine In-vitro-Synthese.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül, den Promotor, die Signalsequenz, das Strukturgen oder den Terminator eines der PL-Expressionssysteme oder eine beliebige Kombination dieser Fragmente enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine DNA-Folge mit der Formel I oder dessen Derivat.

4. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet durch eine DNA-Folge mit der Formel Il oder dessen Derivat.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine DNA-Folge mit der Formel III oder dessen Derivat.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül pGW820 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül pGW830 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül pGW850 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül pGW850 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül pGW860 ist.

11. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet durch ein Fragment, das sich zwischen zwei Restriktionsstellen der Plasmide pGW820, pGW830, pGW850, pGW880 oder pGW860 erstreckt und Promotor-, Signal-, Struktur- oder Terminatorfunktion oder eine Kombination dieser Fragmente enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Promotorsequenz von pelA.

13. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Promotorsequenz von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF.

14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Signalsequenz von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF.

15. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch durch PLI-Strukturgen von pelA, pelB, pelC, pelEoderpelF.

16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Strukturgene von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF ohne Introns.

17. Verfahren nach Anspruch ^gekennzeichnet durch den Terminator von pelA, pelB, pelC, pelE oder pelF.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül ein rekombinanter Hybridvektor mit einem Strukturgen ist, das heterolog zu Aspergillus niger ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül ein Hybridvektor mit dem heterologen Strukturgen ist, welches das Hybrid-Interferon-BDBB codiert.

20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül der Hybridvektor pUC 19/pelA-IFN AM 119 ist.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül der Hybridvektor M 13(+)KS/pelAAss-IFN AM 119 ist.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Molekül der Hybridvektor M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119 ist.

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Wirt durch die Behandlung eines entsprechenden untransformierten Wirts unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarker-Gen, und die Auswahl derTransformanten hergestellt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli HB 101/pGW820 (DSM 4388) hergestellt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli HB101 /pGW830 (DSM 4389) hergestellt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli HB 101/pGW850 (DSM 4390) hergestellt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli HB101 /pGW860 (DSM 4391) hergestellt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli HB101/pGW880 (DSM 4392) hergestellt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG59D7 unter transformierenden Bedingungen behandelt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) mit pUC19/pelA-IFN AM 119 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG 59 D7 unter transformierenden Bedingungen behandelt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) mit M 13{+)KS/pelAAss-IFN AM 119 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG 59 D7 unter transformierenden Bedingungen behandelt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) mit M 13(+)KS/pelA-IFN AM 119 und dem Selektionsmarkerplasmid pCG59D7 unter transformierenden Bedingungen behandelt wird.