NO892683L - Fremgangsmaate for fremstilling av animalsk lysosom c via sekresjon fra pichia pastoris og sammensetning derfor. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt en mikrobiologisk fremgangsmåte for fremstilling av et animalsk lysozym c ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi og mer spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse fremstillingen av et animalsk lysozym c ved dyrking av Pichia pastoris gjærceller som inneholder et gen som, i slike celler, er i stand til å uttrykke pre-formen av lysozymet i slike celler, DNA'ene anvendt for å transformere slike celler til å uttrykke pre-formen av lysozymet, og kulturer og subkulturer av de transformerte celler.

Lysozymer er basiske enzymer som direkte utviser anti-bakteriell virkning, som et resultat av deres evne til å lyse bakterieceller, og indirekte, som et resultat av deres evne til å gi en stimulerende virkning ved den fagocytisk aktivitet av polymorfonukleære leukocytter og markofager (Jollés et al., Mol. and Cell. Biochem. 63, 165 (1984)). Lysozymer finnes i en rekke vev og sekreter hos mennesker, andre hvirveldyr og hvirvelløse dyr, såvel som i planter, bakterier og fag. Ved utførelsen av deres primære funksjon som omfatter beskyttelse av organismer mot bakterielle infeksjoner, kutter lysozymer, som også er kjent som 1,4-|3-N-acetylmuramidaser, den glykosidiske binding mellom C-l i N-acetylmuraminsyren og C-4 i N-acetylglukosaminet i det bakterielle peptidoglykan, et polysakkarid av aminosukkere bundet til korte tverrbundne peptider som er en bestanddel av bakteriecellevegger. Gram-negative bakterier har cellevegger som inneholder mono- eller bi-lag av peptidoglykan mens gram-positive bakterier har cellevegger som inneholder svært komplekse multi-lag av peptidoglykan. Som et resultat av den ovennevnte kutting, vil alle slike bakterier lysere og følgelig dø. Noen lysozymer utviser også en mer eller mindre utpreget chitinase-aktivitet, tilsvarende en tilfeldig hydrolyse av 1,4-p-N-acetylglukosamin-bindinger i chitin, og har følgelig den ytterligere kapasitet omfattende beskyttelse av organismer overfor en rekke chitin-dekkende patogener. En liten esteraseaktivitet hos lysozymer er også rapportert.

På grunn av deres bakteriolytiske aktivitet, anvendes lysozymer, alene eller i kombinasjon med andre bestanddeler, slik som laktotransferrin, som inhiberer veksten av visse mikroorganismer ved hjelp av chelaterende jern, komplement, antistoffer, vitaminer, andre enzymer og forskjellige antibiotika, slik som tetracyklin og bacitracin, som antimikrobielle midler, som konserveringsmidler for nærings-midler, slik som ost, pølse og marine produkter, som modningsmidler for ost og for forskjellige andre anvendelser. Da lysozymer også har evnen til indirekte å stimulere dannelsen av antistoffer mot en rekke antigener, kan slike enzymer også anvendes for å øke resistensen overfor infeksjoner.

Lysozymer av c- eller "kylling"-typen inneholder 129-130 aminosyrer i deres modne, utskilte former. 40 av disse 129-130 er funnet å være invariant blant forskjellige species. To av de mange karboksyl-grupper i lysozym c (tilsvarende til Glu-3 5 og Asp-52 i lysozym-aminosyre-sekvensen i hvite fra kyllingegg) som deltar i enzymets katalytiske aktivitet og som er essensielle for lysozym-aktivitet, opptrer i omtrent de samme posisjoner i alle c-type lysozymer. En tredje karboksyl-gruppe (tilsvarende til Asp-101 i lysozym fra kyllingegghvite), som er involvert i en substrat-bindings-interaksjon, opptrer i de fleste c-type lysozymer. De åtte halv-cystein-rester i alle c-type lysozymene er invariante. Disulfid-broene dannet ved hjelp av cysteinene spiller en viktig rolle i dannelsen og opprettholdelsen av enzymenes sekundære og tertiære strukturer. Disse tredimensjonale strukturer, og prosesser for sammenfolding for å danne disse strukturer ved translasjon av mRNA synes å være svært like for alle lysozymer c. De fullstendige primære strukturer er kjent for de modne lysozymer c oppnådd fra følgende kilder: (1) høne, vaktel, kalkun, italiener, and, fasan og kylling-egghviter; (2) human melk og urin; (3) møll; (4) bavian, rotte og bovin mavesekk; og (5) T2 og T4 fag. DNA-sekvenser som koder for modent lysozym c fra human melk er kjent. Se EP patentansøkning med publikasjonsnummer 0181 634, 0 208 472 og 0 222 366.

Bare tre fullstendige aminosyre-sekvenser i modne lysozymer av den andre hovedtypen, nemlig g eller "gåse"-typen er bestemt. Disse omfatter lysozym g sekvenser fra Emden-gås, svart svane og strutsegghvite.

Skjønt lysozymer av både typene c og g har sure aminosyre-rester som del av deres aktive seter, eksisterer det en rekke forskjeller mellom de to typer. g-type lysozymer inneholder omtrent 185 aminosyrer i deres modne form, utviser lav aktivitet på N-acetylglukosamin-polymerer og tverrbinder ikke immunologisk med lysozymer av c-typen. Lysozymer av g-typen har en uvanlig høy forekomst av parede aminosyrer (dvs. de samme aminosyrer forekommende i nabostillinger i sekvensen) i molekylene, og alle de fire halv-cysteinrester i molekylene av typen g er beliggende i den N-terminale halvdelen av kjeden. c-type lysozymer er likeledes aktive på peptid-substituert eller ikke-substituert peptidoglykan, og er også aktiv på chitin-oligosakkarider. g-type lysozymer, som har aktivitet overfor det lineære peptidoglykan lik den for c-type enzymene, virker ikke på chitin-oligosakkarider. Videre, i motsetning til c-type lysozymer, som er i stand til både hydrolyse og transglykosylering, virker g-type enzymer bare som hydrolaser.

Forekomsten av andre særskilte lysozym-typer, som er forskjellig fra typene c og g på basis av strukturelle, katalytiske og immunologiske kriterier, er også rapportert. En rekke pattedyr-specier som har en fortarm-fermentering og som anvender lysozym i deres fordøyelsessystemer er kjent. Tamt kveg av arten Bos taurus og andre drøvtyggende pattedyr i arten Artiodactyla (dvs. drøvtyggere) har utviklet et symbiose-forhold med mikrober som lever i tarmen (fortarmen) og nedbryter cellulose og andre f6rbestanddeler. Slike pattedyr har et usedvanlig høyt lysozymnivå i mageslimhinnen. Som et resultat av denne nedbrytningsformen, vil en rekke mikrober komme inn i fundus-området (fremre del) av den fjerde mage, hvor lysozymer utskilles fra slimhinnelaget, og bli nedbrutt av lysozymene, og således føre til at drøv-tyggerne anvender næringsinnholdet i mikrobene. Metabolske likevektsstudier som er gjennomført, foreslår at drøvtyggeren anvender lyserte bakterier som en karbon-, nitrogen- og fosfor-kilde for energi og vekst.

De tre former av lysozym som er tilstede i den fjerde mage hos tamt kveg utgjør omtrent 10% av det totale protein som kan utskilles fra slimhinnen i den fjerde mage. Disse tre, ikke-alleliske lysozymer, som er av typen c (og betegnet cl, c2 og c3) er antigenisk og i aminosyre-sammensetning nær beslektet med hverandre.

Jolles et al., J. Biol. Chem. 259, 11617 (1984), bestemte den fullstendige 129 aminosyre-sekvensen i et modent bovint lysozym c2, som er det mest tallrike av de tre lysozymer funnet i den bovine magesekk, til å være som følger:

De tre lysozymer c tilstede i abomasum i tamt kveg er forskjellige, i visse henseender, fra andre lysozymer c ved at (1) den optimale pH for enzymatisk aktivitet av lysozymer c tilstede i bovin abomasum er omtrent 5, i stedet for 7 for andre lysozymer c; og (2) lysozymene c tilstede i den bovine abomasum er mer stabile i sure omgivelser, slik som i abumasum, og er mer resistente overfor proteolytiske enzymer, slik som pepsiner, som finnes i abomasum, enn andre lysozymer c .

Fremstillingen av heterologe proteiner ved sekresjon til dyrkingsmediumet formidlet ved signalsekvenser, er beskrevet for en rekke organismer, omfattende forskjellige Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, og forskjellige typer pattedyr-celler. I disse species, har man vist at både native (dvs. intra-generisk) og signalsekvenser av pattedyr-opprinnelse er i stand til å lede sekresjon av bestemte heterologe proteiner inn i dyrkings-mediumene. Hvert av disse vert-systemer har imidlertid forskjellige ufordel-aktigheter.

Aspergillus-stammer utskiller f.eks. store mengder endogene proteiner inn i dyrkings-mediene, og øker således komplek-siteten og utgiften med rensing av et ønsket heterologt proteinprodukt betydelig. Produktiviteten av heterolog proteinproduksjon ved sekresjon fra S. cerevisiae viser seg å være alvorlig begrenset for de proteiner som i det hele tatt kan utskilles. En vesentlig ufordelaktighet i forbindelse med pattedyrcelle-verter er vanskeligheten av, og de store utgifter assosiert med opprettholdelse av slike vertssystemer og dyrking av slike verter i stor skala.

Enkelte polypeptider som er uttrykt i, og utskilt fra heterologe verter utviser ingen, eller redusert, grad av biologisk akitivitet sammenlignet med deres naturlig forekommende motstykker. Denne reduserte biologiske aktivitet kan være et resultat av en rekke faktorer, omfattende polypeptidets manglende evne til å passere inn og gjennom vertssystemets sekresjonsapparat uten aktivitets-reduserende nedbrytning eller spalting og til å folde seg riktig og danne disulfidbroer under sekresjonsprosessen.

Gjær gir visse fordeler over andre vertssystemer med hensyn til produksjon i stor skala av heterologe proteiner i biologisk aktiv form. Gjær kan generelt dyrkes til høyere celletetthet enn bakterier. En særlig foretrukket gjær er P. pastoris. Den metylotropiske gjær, Pichia pastoris, er kjent innen teknikken. Slik gjær er funnet å være særlig fordelaktig for anvendelse som et vertssystem for produksjon i stor skala av de heterologe proteiner som den er i stand til å utskille i signifikante mengder i biologisk aktiv form i sitt dyrkingsmedium. P. pastoris kan lett tilpasses kontinuerlig fermenteringsbehandling i industriell skal, hvorved gjæren vokser til en høy celletetthet i et definert og billig fermenteringsmedium. Med P. pastoris, kan produksjonsvolumene vanligvis oppscaleres fra rysteflaske-kulturer til store fermenteringskulturer. Enkle dyrkingsmedier som er billige og uten ubestemte bestanddeler, som kan være potensielle kilder for pyrogener og toksiner, kan anvendes for denne gjæren. Dessuten, da mange kritiske funksjoner i gjæren, slik som oksydativ fosforylering, gjennomføres i organeller, er slike funksjoner ikke, som de er i prokaryotiske verter, direkte utsatt for de mulige skadelige virkninger ved fremstilling av polypeptider som er fremmede overfor vertscellene. Da også gjær er eukaryoter, har deres intercellulære miljø en tilbøyelighet til å være mer passende enn det hos prokaryoter, for den korrekte sammenfolding av eukaryotiske proteiner. I tillegg, er dyrking av gjær, særlig P. pastoris, lettere enn dyrking av de fleste andre vertssystemer. Kontaminering av P. pastoris kulturer dyrket på metanol kan lettere forhindres enn kontaminering av kulturer av andre vertstyper, idet man dermed kan øke påliteligheten og sikkerheten av de heterologe polypeptidprodukter.

I de tilfeller hvor en gjær utskiller et ønsket protein i dyrkingsmediumet, forenkles separasjonen av proteinet fra cellulære bestanddeler og derfor rensing av proteinet.

Skjønt P. pastoris er et særlig fordelaktig vertssystem for fremstilling av heterologe proteiner som den tilfeldigvis utskiller i mediumet, kan det ikke forutsies at en spesiell protein-type, f.eks. lysozymer c, vil utskilles av gjæren i en biologisk aktiv form og, dersom denne type utskilles i det hele tatt, hvor effektiv sekresjonen vil være. Når imidlertid et spesielt protein er funnet å være utskilt på en effektiv måte fra gjæren, er det sannsynlig at andre proteiner med lignende sekvens og med tredimensjonal struktur også vil utskilles.

Selv for gjæren S. cerevisiae som er blitt studert i betydelig større grad enn P. pastoris, forblir sekresjons-systemer for proteiner dårlig forstått. Sekresjon av et modent protein i biologisk aktiv form til mediumet krever, ved ekpressjon, at det modne protein har en "signal-sekvens"

(også omtalt som "signal-peptid") tilknyttet til sin amino-terminale ende. Denne signal-sekvens har en lite forstått rolle når det gjelder å føre et protein inn i cellens sekresjons-apparat og kuttes under translasjonen til å gi det modne protein.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny, overraskende og uventet effektiv metode for fremstilling av store mengder av et biologisk aktivt animalsk lysozym c som er lett å rense ved dyrking av P. pastoris celler som inneholder et gen som er i stand til å uttrykke pre-formen av det animalske lysozym c (dvs. det animalske lysozym c med dets naturlig forekommende signalsekvens tilknyttet til den N-terminale enden av det modne protein) i slike celler, under betingelser slik at genet transkriberes i cellene.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, utskilles store mengder av et animalsk lysozym c effektivt fra P. pastoris celler i mediumene. Dessuten opprettholdes produksjonsnivåene når transformerte P. pastoris kulturer oppscaleres fra rysteflaske-kulturer til store fermenterings-kulturer. Praktisk talt alt animalsk lysozym c som utskilles i og utvinnes fra mediumene er korrekt behandlet ved knutepunktet for signalsekvensen og det modne protein, har disulfidbroer som er dannet korrekt til å gi det korrekte sammenfoldede protein, og er biologisk aktivt. Videre har det utskilte modne protein i alt vesentlig de samme immunologiske egenskaper og spesifikke aktivitet som det naturlig forekommende animalske lysozym c. I tillegg, omfatter det utskilte animalske lysozym c minst 50% av proteinet tilstede i mediumene og proteiner forskjellig fra animalsk lysozym c er tilstede i små mengder i forhold til det animalske lysozym c.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også DNA1 er, for transformering av P. pastoris celler til å uttrykke et animalsk pre-lysozym c, og kulturer av P. pastoris celler som er blitt transformert med slike DNA'er.

P. pastoris celler som er blitt transformert med DNA'ene i henhold til oppfinnelsen dyrkes for å gjennomføre metoden i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av et animalsk lysozym c.

Endelig, medfører den foreliggende oppfinnelse oppdagelsen av signalpeptidet, av bovint lysozym c2 og av bovint pre-lysozym c2, og oppfinnelsen omfatter DNA'er med sekvenser som koder for disse polypeptider.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er et restriksjonskart av den generaliserte Pichia pastoris ekspresjons-vektor pA0804. Viktige funksjonelle trekk og restriksjonsseter for plasmidet er indikert og er beskrevet i eksemplene. Figur 2 tilveiebringer et restriksjonskart for bovint pre-lysozym c2 ekspresjonsplasmid pSL12A og illustrerer konstruksjon av plasmidet fra plasmid pA0804 og det EcoRI sete-terminerte, bovine pre-lysozym c2-kodende segment av plasmid pBLI6C (avledet fra klon XBL3). Viktige funksjonelle trekk og restriksjonsseter for pSL12A er indikert i figuren og er beskrevet i eksemplene som følger. Figur 3 er et restriksjonskart av bovint pre-lysozym c2 ekspresjonsplasmid pBLll. Viktige funksjonelle trekk og restriksjonsseter for plasmidet er indikert og er beskrevet i eksemplene som følger.

I figurene, er seter med restriksjonsenzymer indikert i parentes, seter hvor et fragment, på en ende derav dannet med et av de indikerte enzymer, ble forenet med et annet fragment, på en ende derav dannet med det andre av de indikerte enzymer, og, som et resultat av foreningen av fragmenter i setet, ble seter for begge av de indikerte enzymer eliminert.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I et aspekt, omfatter den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et animalsk lysozym c

omfattende dyrking av P. pastoris celler, som har et gen, som er i stand til ekspresjon av det tilsvarende pre-lysozym c i P. pastoris, idet nevnte dyrking gjennomføres under betingelser slik at genet transkriberes i cellene.

Oppfinnelsen vedrører ytterligere et DNA som omfatter (1) et promotor-segment av et første P. pastoris gen, idet nevnte segment omfatter promotoren og transkripsjons-initierings-setet av nevnte første gen, og et terminatorsegment av et annet P. pastoris-gen, idet nevnte terminator-segment omfatter polyadenylerings-signal-kodingssegmenter og polyadenylerings-sete-kodingssegmenter og transkripsjons-termineringssignalet av nevnte andre gen, idet nevnte første og andre gener er like eller forskjellige og nevnte terminatorsegment er orientert, med hensyn til transkripsjonsretningen fra promotoren av nevnte første gen i nevnte promotorsegment, operativt for terminering av transkripsjon fra nevnte promotor på nevnte transkripsjons-terminator av nevnte andre gen i nevnte terminatorsegment; og (2) et DNA-segment som koder for et animalsk pre-lysozym c som er orientert og anbragt, mellom nevnte promotor og terminatorsegmenter, operativt for transkripsjon, fra nevnte promotor av nevnte første gen av det animalske pre-lysozym c kodende DNA-segment og polyadenylerings-signalkodings-segmenter og polyadenylerings-setekodings-segmenter av nevnte andre gen i nevnte terminator-segment.

I et annet aspekt, omfatter oppfinnelsen et DNA, som er i stand til å transformere P. pastoris celler til å uttrykke et animalsk pre-lysozym c og som har egenskapene av et DNA i henhold til oppfinnelsen beskrevet i det foregående avsnitt, og som i tillegg omfatter et gen for å tilveiebringe en selekterbar markør til celler som inneholder DNA 'et.

I et ytterligere aspekt, omfatter oppfinnelsen en kultur av P. pastoris celler transformert med et DNA i henhold til oppfinnelsen.

I et ytterligere aspekt, omfatter oppfinnelsen et polypeptid med sekvensen av bovint pre-lysozym c2, et polypeptid med sekvensen av signal-peptidet av bovint pre-lysozym c2, og et DNA-segment som omfatter et segment som koder for bovint pre-lysozym c2 eller signal-peptidet derav.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny, overraskende og uventet effektiv metode for fremstilling av store mengder av et biologisk aktivt animalsk lysozym c som lett kan renses.

De forskjellige betegnelser som anvendes i den foreliggende ansøkning er definert generelt som følger: (1) Betegnelsen "kultur" betyr en propagasjon av celler i et medium som fører til deres vekst, og alle subkulturer derav. (2) Betegnelsen "subkultur" betyr en kultur av celler dyrket fra celler av en annen kultur (stamkultur), eller enhver subkultur av stamkulturen, uten hensyn til antall sub-dyrkinger som er gjennomført mellom subkulturen av interesse og stamkulturen. (3) Uttrykket "animalsk pre-lysozym c" betyr pre-formen av det animalske lysozym c proteinet, som består av det naturlige forekommende signalpeptid av lysozymet c fusjonert til den amino-terminale enden av den modne lysozym c. Pre-bovint lysozym c2 fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har 147 aminosyre-sekvensen som indikert i eksempel 1, omfattende signalpeptidet med 18 aminosyrer og det modne protein med 129 aminosyrer. Pre-humant lysozym c fremstilt i overensstemmelse med oppfinnelse har 148 aminosyre-sekvensen som beskrevet i eksempel 12, omfattende signalpeptidet med 18 aminosyrer og det modne protein med 130 aminosyrer. (4) Aminosyrene, som forekommer i de forskjellige aminosyre-sekvenser som fremkommer heri, kan identifiseres i overensstemmelse med følgende forkortelser av tre eller en bokstav: (5) Nukleotidene, som forekommer i de forskjellige nukleotidsekvenser som forekommer heri, har deres vanlige betegnelser på en bokstav, som anvendes rutinemessig innen den kjente teknikk. (6) Betegnelsen "animalsk lysozym c" betyr et lysozym c fra en organisme fra dyreriket og fra enten gruppen Aves eller gruppen Mammalia (fugler og pattedyr).

Metoder for transformering av Pichia pastoris med DNA'er, inkluderende vektorer omfattende gener for ekspresjon av heterologe proteiner, er kjent innen teknikken. Likeledes, er det kjent metoder for dyrking av P. pastoris celler, som har et gen for et heterologt protein, for ekspresjon av det heterologe protein fra et slikt gen. Videre er det kjent metoder for isolering av heterologe proteiner fra mediumet av slike kulturer av P. pastoris, som er utskilt fra cellene inn i mediumet. Disse kjente metoder kan anvendes for fremstilling av kulturer av P. pastoris i henhold til oppfinnelsen og for gjennomføring av metoden i henhold til oppfinnelsen med slike kulturer for fremstilling av et animalsk lysozym c. Noen av disse metoder er beskrevte mer detaljert i eksemplene som følger.

I et DNA i henhold til den foreliggende oppfinnelse som omfatter et selekterbart markør-gen, kan ethvert selekterbart markør-gen anvendes som virker i P. pastoris celler til å tillate at cellene transformert med DNA i henhold til oppfinnelsen skjelnes fra celler som ikke er transformert således. Blant typene av selekterbare markørgener, kan det selekterbare markør-gen på et DNA i henhold til oppfinnelsen tilveiebringe en dominerende selekterbar markør eller en markør som komplementerer en auksotropisk mutasjon i celler som skal transformeres. Et gen som kan tilveiebringe en dominerende selekterbar markør i P. pastoris celler er det velkjente neomycin resistensgenet fra bakteriell transposon Tn5 som tilveiebringer resistens overfor det antibiotiske G418. Blant genene som tilveiebringer komplementering for euksotropiske mutasjoner er P. pastoris HIS4-genet (for transformasjon av His4~ stammer av P. pastoris),

S. serevisiae HIS4 genet (for transformasjon av His4~ stammen av P. pastoris), P. pastoris ARG4 (arginosuccinat lyase) genet (for transformasjon av Arg4~ stammene av P. pastoris), og S. cerevisiae ARG4 genet (for transformasjon av Arg4~ stammene av P. pastoris).

I promotor-segmentet av et DNA i henhold til oppfinnelsen, omfattende DNA'er for transformasjon av P. pastoris for å danne et animalsk lysozym c (omtalt heri som

"transformasjons-DNA'er i henhold til oppfinnelsen"), kan promotoren av ethvert P. pastoris-gen anvendes for å drive transkripsjonen av det animalske pre-lysozym c-kodende DNA-segment av DNA<1>et i henhold til oppfinnelsen. Foretrukket vil promotoren som driver transkripsjonen av det animalske pre-lysozym c-kodende segment være promotoren av et P. pastoris-gen hvis transkripsjon er nøye regulert ved hjelp av faktorer som lett kan varieres i P. pastoris kulturer, f.eks. karbonkilden. Blant slike P. pastoris-gener, er det foretrukne gen det viktige alkohol-oksydase-genet (A0X1 gen), hvis promotor i alt vesentlig er fullstendig inaktiv med mindre metanol er tilstede i kulturmediumet, men som er svært aktivt, og gir store mengder av gen-produktet når metanol er tilstede. I promotor-segmentet av et DNA i henhold til oppfinnelsen, vil transkripsjons-initierings-signalet og segmentet mellom promotoren og transkripsjons-initierings-signalet foretrukket være fra det samme P. pastoris gen som promotoren.

"Terminator-segmentet" av et DNA i henhold til oppfinnelsen (omfattende transformasjons-DNA'er) har et subsegment som koder for et polyadenylerings-signal og polyadenylerings-sete i transkriptet, fra promotoren av DNA'et i henhold til oppfinnelsen, hvis transkript omfatter transkriptet av det animalske pre-lysozym c-kodene DNA-segment av DNA'et i henhold til oppfinnelsen, og et subsegment som tilveiebringer et transkripsjons-terminerings-signal for transkripsjon fra nevnte promotor. Hele "terminator-segmentet" av et trans-formasjons-DNA i henhold til oppfinnelsen vil foretrukket være tatt fra et P. pastoris protein-kodende gen, som kan være det samme eller forskjellig fra P. pastoris-genet hvorfra promotoren av DNA'et i henhold til oppfinnelsen er tatt, og som driver transkripsjonen av det animalske pre-lysozym-kodende segment og polyadenyliderings-signal- og sete-kodende segmenter. I det foretrukne tilfelle, vil både terminator-segmentet og promotoren som kontrollerer

transkripsjon av DNA-segmentet som koder for det animalske pre-lysozym c være fra P. pastoris AOXl-genet.

I et DNA i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan DNA-segmentet som koder for et animalsk pre-lysozym c være ethvert DNA-segment som har en sekvens som er fri for introner, som omfatter en translasjons-start-sete-kodende triplett (heretter omtalt som "translasjons-start-triplett") og en translasjons-stopp-signal-kodende triplett (heretter omtalt som "translasjons-stopp-triplett") og som koder for, idet man starter med translasjons-start-tripletten og ender med tripletten i nabostilling til translasjons-stopp-tripletten (i 5'-retningen fra stopp-tripletten), et fullstendig animalsk pre-lysozym c. Et eksempel på et slikt DNA-segment, med sekvens for et bovint pre-lysozym c2, er det omtrentlige 4 60 bp EcoRI-sete-terminerte segment oppbygget som beskrevet i eksempel 2 under. Selvfølgelig er et annet segment, som skiller seg fra dette segment oppbygget som beskrevet i eksempel 2 ved en eller to nukleotid-forandringer, som ikke endrer lengden eller aminosyre-sekvensen av det kodede polypeptid, også et bovint pre-lysozym c2-kodende segment som kan anvendes i et DNA i henhold til oppfinnelsen.

I overensstemmelse med prosedyrer som er vel kjent innen den molekylære biologiske teknikk, kan DNA-segmenter med sekvenser som koder for pre-lysozyme c andre enn bovint lysozym c2 isoleres. F.eks. kan slike DNA-segmenter isoleres ved anvendelse av prober, basert på aminosyre-sekvensen av det modne lysozym c av interesse, for å screene et cDNA bibliotek av de involverte species for å isolere et passende cDNA, som omfatter DNA-segmentet av interesse. Det henvises også til de etterfølgende eksempler. Foruten de bovine lysozymer c, er de humane lysozymer foretrukket.

Et DNA i henhold til oppfinnelsen som omfatter et segment som koder for bovint pre-lysozym c2 eller signal-segmentet av bovint pre-lysozym c2, kan være ethvert DNA som (A) har et segment som har en sekvens av 441 basepar som koder for bovint pre-lysozym c2 (med enten histidin eller lysin, men foretrukket histidin, i stilling 9 8 i den modne proteindel) eller en sekvens på 54 basepar som koder for signal-segmentet av bovint pre-lysozym c2 (se sekvensen i det siste hele avsnittet i eksempel 1 under); og (B) er (i) i stand til, ved transformering inn i en vert, å bli uttrykt for å danne pre-lysozym c2 eller signal-segmentet derav (fusjonert til et modent animalsk lysozym c2, eller ethvert annet ønsket protein), eller (ii) er i stand til å ligeres inn i et annet DNA som har evnen til å bevirke ekspresjon av et protein som beskrevet i ovennevnte trinn (B)(i). Således kan f.eks. et DNA i henhold til oppfinnelsen som omfatter et segment som koder for signal-segmentet av bovint pre-lysozym c2, være et DNA som omfatter et segment som koder for fusjonerings-polypeptidet hvori signal-segmentet av det bovine pre-lysozym c2 er fusjonert til den aminoterminale ende av modent humant melkelysozym.

I DNA'et i henhold til den foreliggende oppfinnelse med promotor og terminator-segmenter som avgrenser et pre-lysozym c-kodende segment, er det animalske pre-lysozym c-kodende segment plassert og orientert, med hensyn til P. pastoris promotoren og terminator-segmentene, operativt for transkripsjon av det animalske pre-lysozym c-kodende segment under kontroll av promotoren av nevnte promotor-segment inn i et transkript som er i stand til å tilveiebringe ekspresjon i P. pastoris av det animalske pre-lysozym c. Fagkyndige på området forstår hvordan man utfører slik plassering og orientering, operativt for å tilveiebringe ekspresjon i P. pastoris av det animalske pre-lysozym c fra DNA'et i henhold til oppfinnelsen, forutsatt at det animalske pre-lysozym c-kodende segment er transkribert fra nevnte promotor. Som forstått innen teknikkens stand, må det animalske pre-lysozym c-kodende segment, omfattende dets translasjons-start- og translasjons-stopp-tripletter, være nedstrøms fra transkripsjons-initierings-setet hva angår transkripsjons- retningen fra nevnte promotor, og oppstrøms fra det polyadenylerings-signal- og polyadenylerings-sete-kodende subsegment av terminator-segmentet, som, i sin tur, må være oppstrøms fra transkripsjons-terminerings-setet av terminator-segmentet. Segmentet som koder for det animalske pre-lysozym c må være orientert med tanslasjons-start-tripletten oppstrøms fra translasjons-stopp-tripletten. Foretrukket vil intet transkripsjons-terminator-sete være lokalisert mellom promotoren og polyadenylerings-setet oppstrøms fra transkripsjons-terminatoren av terminator-segmentet på nedstrøms-enden av DNA'et i henhold til oppfinnelsen. Foretrukket, i et DNA i overensstemmelse med oppfinnelsen, i transkripsjonsretningen fra promotoren som driver transkripsjonen av det animalske lysozym c-kodende segment, mellom nevnte promotor og transkripsjons-terminatoren som terminerer nevnte transkripsjon fra nevnte promotor, vil der kun være en enkel, lang åpen avlesnings-ramme som har sekvensen som koder for et animalsk pre-lysozym c. Likeledes vil dette transkript foretrukket ha et enkelt polyadenyleringssignal og sete.

Uttrykkene "nedstrøms" og "oppstrøms" i et DNA i henhold til oppfinnelsen betyr henhv. "nedstrøms" og "oppstrøms" med hensyn til transkripsjons-retningen fra promotoren som driver transkripsjon av det animalske pre-lysozym c-kodende segment. Konstruksjon av en rekke transformasjons-DNA'er i overensstemmelse med oppfinnelsen, omfattende pSL12A, pBLll ogPHLZ103, er beskrevet i følgende eksempler.

Av disse tre plasmid-DNA'er, er Clal-(BamHI/Bglll) fragmentet av pSL12A, som omfatter den Clal-sete terminerte bovine pre-lysozym c2 ekspresjons-kasetten og P. pastoris HIS4-genet, og Clal-(BamHI/Hpal) fragmentet av pBLll, som omfatter den Clal-sete-terminerte bovine pre-lysozym c2 ekspresjons-kasetten og S. cerevisiae ARG4-genet, og Clal-(BamHI/Bglll) fragmentet avPHLZ103, som omfatter den Clal-sete-terminerte humane pre-lysozym c ekspresjons-kasetten og P. pastoris HIS4-genet, også DNA'er i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Et transformerende DNA i henhold til oppfinnelsen kan omfatte elementer som er nødvendig for dets seleksjon og replikasjon i bakterier, særlig E. coli, hvorved produksjonen av store mengder av DNA'et ved replikasjonen i bakterier vil forenkles. I dette henseende, er et foretrukket DNA i henhold til oppfinnelsen et plasmid som inkluderer et segment omfattende startpunktet for replikasjon og ampicillin-resistens eller tetracyklin-resistens gener av plasmid pBR322.

Et DNA i henhold til oppfinnelsen kan, etter transformasjon inn i P. pastoris, bibeholdes som et episomalt DNA (f.eks. lukket sirkulært plasmid), forutsatt at det inkluderer et startpunkt for replikasjon eller autonom replikasjonssekvens (ARS) funksjonell for episomal bibeholdelse i P. pastoris. En rekke DNA-segmenter omfattende startpunkter for replikasjon og ARS'er funksjonelle i Pichia pastoris er kjent innen teknikkens stand.

Et DNA i henhold til oppfinnelsen kan integrere via homolog rekombinering inn i P. pastoris genomet i en viss del av cellene. Slik integrering kan gjennomføres ved transformering av P. pastoris celler med lineariserte eller sirkulariserte plasmider, eller lineariserte fragmenter av begge, bestående av homologe DNA-fragmenter. Således, i de foretrukne P. pastoris kulturer i henhold til oppfinnelsen, vil DNA i henhold til oppfinnelsen bibeholdes i cellene som del av cellenes genomer. Metoder for å gi integrering av heterolog DNA inn i gjær-genomer, omfattende dem av P. pastoris, er vel kjent innen teknikkens stand og kan anvendes for DNA'er i henhold til oppfinnelsen. Se f.eks. europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 226 7 52. Særlig, som illustrert i eksemplene som følger, økes muligheten for integrering av et DNA inn i P. pastoris genomet med fraværet, fra DNA'et, av ethvert startpunkt for replikasjon eller ARS funksjonell i P. pastoris for å bibeholde DNA'et i episomal form. Videre, gjennomføres targetisering av integrasjons- setet til foretrukne seter i P. pastoris genomet ved innlemmelse i de transformerende DNA "targetiserings-segmenter", som er segmenter, vanligvis på de to endene av et linearisert DNA i henhold til oppfinnelsen, hvis segmenter har sekvenser som er homologe til de ønskede seter av integrasjon inn i genomet. Dersom det transformerende DNA er et plasmid, kan det lineariseres, eller kuttes til lineariserte fragmenter, vanligvis ved kutting med et eller flere restriksjonsenzymer som kutter på et eller flere passende steder, til å gi et lineært transformerende DNA i henhold til oppfinnelsen med targetiserings-segmenter på endene. Passende targetiserings-segmenter vil ha en lengde på minst omtrent 200 bp. Eksempler på behandling av transformerende plasmid-DNA<1>er i henhold til oppfinnelsen på denne måte er gitt i eksemplene. F.eks., oppnås et linearisert transformerende plasmid-DNA ved å kutte, med SacI, (en isoschizomer av Sstl), et derivat av pAO804, som har et animalsk pre-lysozym c-kodende segment (som mangler et SacI-sete) innskutt på EcoRI-setet, og et linearisert transformerende fragment av en transformerende DNA oppnås ved å kutte, med Bglll, et derivat av pAO804, som har et animalsk pre-lysozym c-kodende segment (som mangler et Bglll-sete) innskutt i EcoRI-setet.

Ved anvendelse av de native animalske lysozym c signalsekvenser (eller den humane lysozym c eller bovine lysozym c2 signal-sekvensen), tillater den foreliggende oppfinnelse at et animalsk lysozym c utskilles med uventet effektivitet fra P. pastoris celler inn i dyrkingsmediene. Overraskende, har det animalske lysozym c som utskilles til mediene den samme biologiske aktivitet som det naturlig forekommende enzym og pre-enzymet er korrekt behandlet ved knutepunktet for signalsekvensen med det modne protein. Således og uventet, er de animalske pre-lysozym c signal-sekvensene korrekt gjenkjent og behandlet i P. pastoris sekresjonssporet.

Et animalsk lysozym c isolert fra dyrkingsmedier av kulturer i overensstemmelse med oppfinnelsen er bedømt til å være det samme som det autentiske lysozym c ved hjelp av en rekke kriterier. Først, er den N-terminale sekvensen av det modne, utskilte protein identisk med den for det naturlig forekommende enzym. Deretter, viser Western-blot-analyser av det utskilte lysozym c en enkel immunoreaktiv specie med samme molekylvekt som det naturlig forekommende modne enzym. Til slutt, i bioassays basert på den evnen som det utskilte lysozym c har til å lysere mikrococcus luteus (tidligere benevnt Micrococcus lysodeikticus) celler, har proteinet utskilt til mediene fra P. pastoris celler en spesifikk aktivitet som i alt vesentlig er den samme som den for lysozym c isolert fra kildene hvori det er naturlig forekommende .

Det overraskende og fordelaktige resultat at et animalsk lysozym c fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse ikke er kontaminert med betydelige mengder fragmenter av det utskilte enzym (eller ukorrekt bearbeidet protein med molekylvekt større enn den for det modne enzym), er etablert ved elektroforese- og aminoterminal sekvens-analyser, som indikerer fraværet av slike kontaminerende fragmenter eller proteiner som er større enn det modne enzym.

Det animalske lysozym c som er tilstede i mediene av en P. pastoris kultur i henhold til oppfinnelsen, kan lett renses ved hjelp av teknikker som er vel kjent innen området vedrørende proteinrensing, på grunn av den høye enzym-konsentrasjonen og den lave konsentrasjonen av kontaminerende proteiner og protein-fragmenter i mediene. En enkel to-trinns renseprosedyre er beskrevet i de etterfølgende eksempler.

De animalske lysozymer c tilveiebragt ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse kan anvendes som kjent innen teknikkens stand for slike lysozymer generelt. F.eks. kan lysozymene c anvendes for nedbrytning av E. coli for å isolere klonede, genetisk konstruerte plasmider. Se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, US (19 82). Lik andre lysozymer, kan lysozymene c tilveiebragt ved den foreliggende oppfinnelse anvendes, enten alene eller i kombinasjon med andre komponenter, som modningsmidler for ost, som antimikrobielle midler for kosmetikk, detergenter og forskjellige matvareprodukter, som konserveringsmidler for visse matvareprodukter, slik som ost, pølse og marine produkter, og som et middel for behandling av mikrobielle infeksjoner hos dyr, omfattende mennesker. Når lysozymet c anvendes i forbindelse med andre antibiotika, er det imidlertid viktig å unngå aminoglykosidiske antibiotika, slik som neomycin B, gentamicin c^a, kanamycin A eller dihydrostreptomycin, hvis strukturer er beslektet med sakkaridsubstratet for enzymet. Andre rapporterte anvendelser for lysozymene c tilveiebragt ved hjelp av metoden i henhold til oppfinnelsen omfatter behandlingen av forskjellige smertetilstander, allergier og inflammasjoner, colitt, herpes zoster, reumatisk feber, rheumatoid arthritt, såvel som innen pediatrien (maternalisering av bovin melk ved tilsetning av lysozym). Se f.eks. Jolles et al., Mol. Cell. Biochem. 63, 165 (1984).

En annen mulig anvendelse for lysozymene c tilveiebragt ved den foreliggende oppfinnelse, særlig de bovine lysozymer c, er som et tilsetningsmiddel til f6r for drøvtyggere, for å øke effektiviteten hvorved slike dyr anvender f6ret for vekst. Vombakterier er en viktig næringskilde for drøv-tyggere. En viktig faktor i deres anvendbarhet er imidlertid dyrets evne til å nedbryte bakteriene. Som nevnt tidligere, er de sistnevnte omgitt av peptidoglykaner som inneholder glykosidiske bindinger som kan spaltes ved hjelp av lysozym. Konsumpsjon av et lysozym c, som et tilsetningsmiddel til f6r, kan resultere i et økt nivå av lysozymet i fundusområdet i drøvtygger-abomasum, som, i sin tur, kan øke mengden fordøyd mikrobiell masse som kommer inn i et slikt område av magen fra vommen. Økt fordøyelse av denne mikrobielle masse kan resultere i at drøvtyggeren har tilgjengelig en økt mengde bakterieinnhold for energiproduksjon og vekst.

De etterfølgende eksempler beskriver og illustrerer den foreliggende oppfinnelse mer detaljert.

Alle patenter og publikasjoner som det er henvist til i den foreliggende ansøkning er innlemmet som referanse i ansøkningen.

EKSEMPEL 1

ISOLERING OG KARAKTERISERING AV ET cDNA KLON MED FULL LENGDE SOM KODER FOR BOVINT LYSOZYM c

Et partielt bovint lysozym c genomisk klon, betegnet pLl, og dets DNA-sekvens ble oppnådd fra Dr. Gino Cortopassi.

Friskt bovint abomasum-vev ble oppnådd fra Talone Meat Packing Co., Escondido, California, USA. XgtlO og E. coli-stamme C600HF1 ble oppnådd fra Clontech Labs, Inc. 4055 Fabian Way, Palo Alto, California 94303. Pakningssettet anvendt for XgtlO ble fremstilt i henhold til Maniatis et al., supra. Restriksjons- og DNA-modifikasjons-enzymer ble oppnådd fra Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.

(Indianapolis, Indiana), og New England Biolabs, Inc.

(Beverly, Massachusetts), og ble anvendt som anbefalt av produsentene.

Etterat totalt intakt RNA var isolert fra omtrent 20 g bovint abomasum-vev, ved modifikasjon av metoden etter Shields og Blobel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:2059 (1977), ble polyadenylerte RNA-species separert fra ikke-polyadenylerte species ved en standard teknikk ved anvendelse av en oligo-dT-kolonne.

Da fundus-området i drøvtygger-abumasum inneholder en høy konsentrasjon pankreas-ribonuklease, er hastighet og rett behandling av vevet, omfattende opprettholdelse av en lav temperatur, essensiell for å bevare RNA.

Lett, frosset bovint abomasum-vev ble pulverisert i en manuell pulveriseringsanordning av rustfritt stål i nærvær av flytende nitrogen. Det pulveriserte vev ble tilsatt til 100 ml proteinase K-buffer (.14 M NaCl, .05 M Tris/7.4, .01 M EDTA/8.0, 1% natrium-dodecyl-sulfat (SDS)) inneholdende 400 ug/ml proteinase K (Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.). Blandingen ble straks rystet godt og ble deretter inkubert ved romtemperatur i 15 minutter.

Etter inkubering, ble preparatet ekstrahert med et likt volum PCIA (fenol:kloroform:isoamylalkohol, 25:24:1) etterfulgt av ekstraksjon med et likt volum CIA (kloroform:isoamylalkohol, 24:1). Den oppnådde DNA/RNA- blanding ble precipitert ved innstilling av NaCl-konsentrasjonen til 0,25 M, tilsetning av to volumdeler etnaol, og løsningen ble plassert ved -20°C over natten. Etter sentrifugering ved 5000 x g i 60 min., ble DNA/RNA resuspendert i 20 ml ETS buffer (0,1 M Tris, pH 7,6, 0,01 M EDTA, 0,2% SDS). PCIA og CIA ekstråksjoner, og DNA/RNA-presipiteringer ble gjennomført som beskrevet over. DNA/RNA-presipitatet ble samlet ved sentrifugering og resuspendert i 32 ml 10 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7,4.

Etter resuspendering, ble RNA tilstede i løsningen anriket ved at preparatet ble fordelt i fire rør, idet det ble lagt over et 4 ml CsCl (1 g CsCl/ml) underlag i hvert rør. Preparatet ble deretter sentrifugert (Beckman SW41 rotor) ved 37.000 x g i 20 timer. Etter sentrifugering, ble supernatanten forsiktig fjernet og RNA-pelletene ble resuspendert i 8 ml ETS-buffer, etanol-presipitert to ganger (ved tilsetning av NaCl til en endelig konsentrasjon på 0,25 NaCl hvorpå to volumdeler 9 5% etanol ble tilsatt), og resuspendert i 5 ml ETS-buffer. Polyadenylert (poly (A)+) RNA ble selektert fra løsningen ved affinitets-kromatografi på oligodeoksythymidylert cellulose-kolonner, som beskrevet av Aviv et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:1408 (1972). Etterat RNA var bundet til oligo-dT-kolonnen i 0,5 M NETS-buffer (0,5 M NaCl, 0,01 M Tris, 0,01 M EDTA og 0,2% SDS, pH 7,6), ble kolonnen vasket med 30 ml 0,5 M NETS. Dette ble etterfulgt av eluering av polyadenylert RNA med 5 ml ETS-buffer og etano-presipitering.

Ti ug av det polyadenylerte RNA ble denaturert i 2 mM CI^HgOH (Alpha Products, Danver, Massachusetts) i 5 minutter ved romtemperatur. Ved å følge forskriften etter Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach (D. Glover, ed.), IRL Press, Oxford (1984), ble dette RNA underkastet en cDNA-syntesereaksjon og et cDNA bibliotek ble utviklet fra totalt polyA-mRNA og konstruert inn i XgtlO (Gubler et al., Gene 25:263 (1983); Lapeyer et al., Gene 37:215 (1985)). MMLV revers transkriptase ble anvendt forsiktig for å danne et cDNA fra mRNA. Dette ble etterfulgt av RNase H behandling og DNA polymerase I-mediert syntese av den andre cDNA-kjede til å danne en dobbeltkjedet cDNA. Etter syntese av den andre kjede, ble cDNA gjort butt-endet med S]_ nuklease og endene ble ytterligere behandlet med E. coli DNA polymerase I Klenow fragment (Telford et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 76:2590

(1979)). EcoRI adaptorer (Wood et al., Nature 312:330 (19 84)) ble ligert til det dobbelt-kjedete cDNA som gjør at

man unngår behovet for metylering og påfølgende EcoRI kutting av cDNA. Overskudd av adaptorer ble fjernet ved kromatografi på en Sepharose CL-4B kolonne ekvilibrert med 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA. De kolonne-fraksjoner som inneholdt cDNA<1>er med over 400 bp ble samlet og ligert inn i cDNA bakteriofag kloningsvektor XgtlO, som var blitt EcoRI-kuttet og fosfatase-behandlet. Ligeringer ble gjennomført i et volum på 5 yl og inkubert ved 16°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen inneholdt lyg XgtlO vektor (slutt-konsentrasjon = 200 ug/ml) og 50-100 ng cDNA (2- til 4-ganger molart overskudd av inskudd i forhold til vektor).

Det oppnådde cDNA ble pakket, ved anvendelse av et lambda pakningssett, og de oppnådde vektorer ble platet på E. coli-stamme C600HF1, og plaquer ble screenet med radioaktivt merket pLl. De plaquer som ble identifisert til å inneholde cDNA som koder for minst en del av bovint lysozym c ble plaque-renset (Maniatis et al., supra) og screenet med både pLl og en oligo-nukleotidprobe syntetisert fra DNA-sekvens-informasjonen tilveiebragt av Dr. Cortopassi. Sekvensen av en slik probe er sekvensen av en enkel kjede av et DNA-segment på 5'-enden av exon 2 av det bovine lysozym c gen, som omfatter sekvenser som koder for aminosyrer 29-3 8 av modent bovint lysozymC2>og er som følger:

Plaquer-overføringer ble i alt vesentlig gjennomført som beskrevet av Benton et al., Science 196:180 (1977). Nitrocellulose-filtere ble prehybridisert i 4 timer ved 42°C i 5 x SSPE (0,9 M NaCl, 0,04 M NaoH, 0,05 M NaH2P04-H20, 0,00 5 M EDTA, pH 7,0), 5 x Denhardt's [50 x Denhardt's: 5 g Ficoll 400 (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey, katalog nr. 17-0400-01, gjennomsnittlig molekylvekt omtrent 400.000 dalton), 5 g polyvinylpyrrolidon PVP-360 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, gjennomsnittlig molekylvekt omtrent 360.000 dalton), 5 g bovint serum-albumin i H2O for å bringe volumet til 500 ml], 50%, (v/v) formamid, 0,2% (w/v) SDS og 200 ug/ml kuttet sildespermie DNA (Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.). Etterat den nick-translaterte probe pLl var tilsatt direkte til prehybridiseringsløsningen i lx IO<6>cpm/ml, ble filtrene hybridisert i 16 timer ved 42°C og deretter vasket flere ganger, i 15 minutter pr. vask, i 0,1 x SSPE, 0,1% (w/v) SDS ved 65°C, og autoradiografert. For oligonukleotid-screening, ble filtrene prehybridisert i 6 x SSPE, 5 x Denhardt's, 25% formamid, 0,2% (w/v) SDS og 200 ug/ml sildespermie DNA i 2 timer ved 42°C. De ble deretter hybridisert i 3 timer i den samme buffer ved 42°C og vasket flere ganger i 1 x SSPE ved 45°C.

En av de plaque-rensede kloner som hybridiserte til oligonukleotidet ble betegnet XBL3, og størrelsen på dets innskutte cDNA ble bestemt, etter EcoRI restriksjonsenzym-kutting av fag "mini-preps" (Benson et al., Biotechniques, 2 3, 126 (1984)), til å være 950 bp.

Nukleotid-sekvensen av cDNA-innskuddet av klon XBL3 ble bestemt ved anvendelse av subklonet Ml3 templater og dideoksynukleotid-forskriften beskrevet av Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 74:5463 (1977) og den M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Manual, Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland (1980) til å være:

Resultatene indikerte at XBL3 cDNA inskuddet består av et kodingsområde på 436 bp av bovint lysozym c2 og 482 bp av 3'-utranslatert ikke-kodende sekvens. Den 3<1->ikke-kodende sekvens i XBL3 inneholder ikke a polyadenylerings-signal eller en poly (A)<+>hale. DNA-sekvensering på 5'-terminalen av cDNA-innskuddet i XBL3 indikerte at innskuddet inneholder 450 bp som koder for den C-terminale del av proteinsignal-sekvensen, men inneholder ikke ATG-tripletten tilsvarende til translasjons-initierings-kodonet av pre-lysozymet c2 mRNA. Således koder cDNA-inskuddet for seksten amino-syrer amino-terminalt til den amino-terminale enden av det modne protein.

Aminosyre-sekvensen av proteinet tilsvarende cDNA-innskuddet av X-BL3, avledet fra nukleotid-sekvensen, og indikert i den forutgående sekvens under nukleotid-sekvensen, har et histidin i aminosyre-stillingen 98 i det modne protein, mens den publiserte proteinsekvens (Jolles et al., J. Biol. Chem. 259, 11617 (1984)) indikerer et lysin i denne posisjon. Tilstedeværelse av histidinresten i denne posisjon ble bekreftet ved N-terminal analyse av det C-terminale CNBr-fragment av proteinet uttrykt fra innskuddet. Videre viste sekvensering av lysozymet c2 fra bovint abomasum-vev at aminosyren i stilling 98 faktisk er histidin, i det minste i dyret som anvendes som RNA-kilde i dette arbeid.

Påfølgende sekvensering av bovint lysozym mRNA ble gjennomført ved anvendelse av variasjonene av dideoksy-sekvenserings-forskriften som er rekommandert i Karanthanasis, Bethesda Res. Lab. Focus 4:3, 6 (1982)

(Bethesda Research Laboratories, Inc.). Fire ug abomasum poly (A)<+>RNA ble anvendt som et templat og et syntetisk 27-rest-oligonukleotid med sekvens

som var kopiert fra DNA-sekvensen i 5'-enden av det bovine lysozym-gen og som var syntetisert ved hjelp av standard fosforamiditt-kjemi på et Applied Biosystems synthesizer (Modell 380A), ble anvendt for initiering av ekstensjonen ved revers transkriptase. Sekvenseringen av mRNA viste at XBL3 innskuddet manglet 5 bp av kodesekvensen på dens 5'-ende, inkluderende et initierings ATG-kodon. I tillegg, indikerte RNA-sekvensen at basen i stilling 2 i XBL3 innskuddet skulle være en G heller enn en A. Slik sekvensering viste ytterligere aminosyre-sekvensen av den amino-terminale ende av den bovine lysozym c signal-sekvensen, inkluderende stillingen av det initierende metionin. En slik signal-sekvens ble funnte å være følgende: MKALVILGFLFLSVAVQG. Ved sammenligning med kjente sekvenser (Jolles et al., supra), er det bovine lysozym c kodet for av cDNA innskuddet av klon XBL3 svært likt bovint lysozym c2, det mest tallrike av de tre bovine lysozymer c. Den eneste forskjell mellom dette og sekvensen for bovint lysozym c2 rapportert av Jolles et al. er en lysin til histidin-forandring i stilling 98 i det modne protein, som diskutert over. Et større antall aminosyre-forandringer og/eller en forskjell i totalt antall aminosyrer utelukker den mulighet at proteinet kodet for av cDNA innskuddet i XBL3 er lysozym cl eller c3. Den enkle, konservative aminosyre-forandring mellom lysozymet kodet for av XBL3 og bovint lysozym c2, som rapportert av Jolles et al., som er resultatet av to nukleotid-forandringer, kan mest sannsynlig forklares ved hjelp av alleliske forskjeller. Uansett, som beskrevet i de påfølgende eksempler, har lysozym c2 med histidin i stilling 9 8 i alt vesentlig de samme egenskaper som lysozymet c2 isolert fra bovint abomasum vev.

EKSEMPEL 2

KONSTRUKSJON AV EKSPRESJONS-VEKTORER

To in vitro Ml3 mutagenese prosedyrer ble gjennomført, en på hver av 5'- og 3'-endene av det bovine pre-lysozym c2 kodende område av XBL3, før innskyting av det kodende området inn i Pichia pastoris ekspresjonsvektor pAO804 (beskrevet under), for å modifisere kodeområdet for å gjøre området kompatibelt med ekspresjonsvektoren og for å gjør enkelte andre ønskede forandringer. 3'-enden av kodeområdet ble mutagenisert for å fjerne de 482 bp av ikke-kodende sekvens og for å introdusere et AsuII restriksjons-sete (5'-TTCGAA-3'), og et EcoRI-restriksjons-sete (5'-GAATTC-3'), umiddelbart 3' til TAA-tripletten som koder for translasjons-stoppkodonet. 5'-enden av innskuddet, i et klon (betegnet pBL4C) identifisert til å ha disse forandringer på 3'-enden, ble mutagenisert for å introdusere en sekvens på syv basepar (5'-ATGAAGG-3') som er den korrekte sekvens som indikert ved RNA-sekvensering. Denne modifikasjon på 5'-enden kompletterte kodings-sekvensen for N-terminalen av signal-sekvensen (Met-Lys-Ala...) og tilføyde et annet EcoRI restriksjons-sete direkte før det Met kodon-kodende ATG. Klon pBLI6C ble identifisert til å ha begge de ønskede mutageniserte ender.

I den første in vitro mutagenese-prosedyre, ble en mutagen oligomer, av sekvens 5'-dGAGCTGAAGAATGATATTACAGGGTGCAACCC-3' syntetisert og anvendt som en primer for mutagenese av 3'-enden av det bovine lysozym gen-innskudd i XBL3 og for screening. Fire av de positive plaquer fra et annet hybridiserings-screen ble anvendt for å fremstille templat DNA for sekvensering. Et av templat DNA'ene, pBL4C, ble funnet å inneholde den korrekte sekvens, med EcoRI-setet 3' av TAA kodende for translasjons-terminerings-kodonet.

En annen mutagen oligomer, med sekvens

ble anvendt for å initiere fra pBL4c templat DNA for den andre mutagenese. For denne modifikasjon, ble et syntetisk oligonukleotid med sekvens 5'-dTAACGAGAGCCTTCATGAATTC-3' anvendt for screening. Et klon pBLI6C, som ble identifisert til å ha den ønskede sekvens, omfattende EcoRI-setet, ATG-tripletten som koder for translasjons-initieringskodonet og

sekvensen som spesifiserer de neste to aminosyrer, lys og ala, på 5'-enden, ble anvendt for å danne templat DNA.

Basepar-tilpasning av mutagene oligonukleotider, initiator-ekstensjoner og alkalisk sukrosegradient-separasjoner ble gjennomført ved anvendelse av de forskrifter som er beskrevet i Zoller et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York (1983). Screening for positiver ble gjennomført ved anvendelse av løsningshybridisering og elektroforese gjennom agarosegeler, som beskrevet av Hobden et al., Anal. Biochem. 144:75 (1985).

Den generaliserte Pichia pastoris ekspresjons-kasettvektor pA0804, illustrert i fig. 1, har to Bglll seter som avgrenser et fragment som har, idet man beveger seg med urviserne i fig. 1 fra Bglll setet omtrent 100 bp fra et Clal sete, (1) et fragment med omtrent 900 basepar (bp) (betegnet "5'-AOXl" i figurene) som er et "promotor-segment" i overensstemmelse med oppfinnelsen og er fra det P. pastoris viktigste alkoholoksydase (AOX1) genstedet, inkluderende promotoren og transkripsjons-initieringssetet, og ender i en EcoRI-linker, som ble tilføyd umiddelbart oppstrøms av translasjons-initierings-kodonet av AOX1 genproduktet (Ellis et al., Mol. Cell. Biol. 5:1111 (1985)) og som tilveiebringer det eneste EcoRI sete i pAO804; (2) en fragment med omtrent 300 bp (betegnet "3'-AOXl" i figurene), som er et "terminator-segment" i overensstemmelse med oppfinnelsen og er fra P. pastoris AOX1 genet, idet nevnte fragment har EcoRI-linkeren på 5'-enden, og Clal setet på 3'-enden, og inkluderende polyadenylerings-signal- og sete-kodings-segmentene og transkripsjons-terminatoren av AOX1 genet; (3) et Bglll fragment med omtrent 2700 bp (i orienteringen som indikert i fig. 1) omfattende P. pastoris histidinol-dehydrogenase (HIS4) 'genet, for å tilveiebringe en selekterbar markør til His4~ stammer av P. pastoris (Cregg et al., supra), idet nevnte fragment er innskutt på BamHI-setet av pBR322 anvendt for å danne pAO804; og (4) et fragment med omtrent 800 bp (betegnet " 3'-fra-AOXl" i figurene) av 3'-sekvens tatt nedstrøms fra transkripsjons-terminatoren av P. pastoris A0X1 gen-stedet, idet nevnte fragment terminerte på en ende med et Bglll sete (dannet ved modifisering av pBR322 på dens PvuII sete) og på den andre ende med resten fra kombinering av et Xhol sete med pBR322 Sali setet. pAO804 inkluderer også en rekke fragmenter fra pBR322: (1) segmentet med omtrent 3 50 bp fra Clal setet på enden av fragmentet merket "3-AOX1" til resten av BamHI setet på en ende av segmentet med P. pastoris HIS4 genet; (2) de omtrentlige 280 basepar fra resten av BamHI segmentet på den andre ende av segmentet med P. pastoris HIS4 genet til resten av Sali setet på en ende av "3'-fra-AOXl" segmentet; og (3) fragmentet med omtrent 2320 basepar fra resten av pBR322 PvuII setet (ikke vist i figurene) innenfor noen få baser av Bglll setet på en ende av "3<1->fra-AOXl" segmentet (og utenfor dette segment) til Clal setet nær Bglll setet på en ende av "5'-AOXl" segmentet. 2320 bp pBR322 segmentet er blitt modifisert for å eliminere pBR322 EcoRI setet og inkluderer pBR322 startpunktet for replikasjon og beta-laktamase- genet (tilveiebringelse av ampicillin-resistens hos bakterier transformert med plasmidet).

Konstruksjon av pAO804 er beskrevet i eksempel 15.

■En "ekspresjonsenhet" bundet ved Bglll-setene (eller, f.eks., Clal-Bglll fragmentet som inkluderer fragmentet bundet ved Bglll setene) vist for pAO804 i figur 1 er dannet ved innskyting, på EcoRI setet, av et intron-fritt DNA-segment hvis transkript, sammen med polyadenylerings-signalet og setet tilveiebragt av 3'-AOXl segmentet fra A0X1 promotoren, vil være translatert inn i proteinet av interesse.

Bglii-EcoRI segmentet med omtrent 900 bp, omfattende A0X1 promotoren og transkripsjons-startsetet, og genom-segmentet med omtrent 800 bp fra 3' av AOX genet ("3'-A0Xl" i figurene) anvendes for sete-rettende integrering av den Bglll-sete-terminerte ekspresjonsenhet inn i AOX1 stedet i P. pastoris celler transformert med plasmidet.

Med det bovine pre-lysozym c2-kodende fragment bundet ved EcoRI seter fra pBLI6C innskutt inn i det entydige EcoRI sete av pAO804 på en slik måte at lysozym-sekvensen er orientert operativt for transkripsjon fra A0X1 .promotoren, vil pre-lysozym c2 uttrykkes, under transkripsjonen kontroll av A0X1 promotoren, når P. pastoris celler transformert med plasmidet

(eller den Bglll-sete-terminerte ekspresjonsenhet derav)

dyrkes med metanol som en karbonkilde, slik at promotoren er aktiv i transkripsjon.

Studier av P. pastoris har vist at visse metanol-regulerte promotorer fra P. pastoris, slik som den av det viktigste alkohol-oksydase-genet (A0X1) eller p76 genet (dihydroksyaceton-syntase (DAS), europeisk patentansøkning publikasjonsnummer 0 183 071), er særlig gunstige for heterolog genekspresjon i prosesser i industriell skala. Slike promotorer tilveiebringer transkripsjon på et høyt nivå, selv i enkel kopi, og er strengt regulert, og tillater således at ekspresjonsperioden begrenses. I etanol-, glyserol- eller glukose-dyrkede villtype-celler, er alkohol-oksydase fraværende. Den utgjør imidlertid så mye som 3 0% av totalt celleprotein i celler dyrket på metanol.

A0X1 "deletion" mutanter produserer omtrent 15% villtype alkoholoksydase-enzymaktivitet (fra det mindre viktige alkoholoksydase (AOX2) gen), mens AOX2 "deletion" stammer produserer villtype-nivåer av alkoholoksydase når cellene dyrkes på metanol.

P. pastoris AOX1 promotoren er blant de sterkeste og strengest regulerte kjente promotorer. Når P. pastoris celler dyrkes på glukose eller glyserol, undertrykkes AOX1 promotoren og alkoholoksydase mRNA dannes ikke og alkohol-oksydase uttrykkes ikke. I motsetning til dette, når slike celler dyrkes på metanol, induseres AOX1 promotoren og alkoholoksydasen uttrykt fra AOX1 genet kan utgjøre så mye som 30% av totalt celleprotein under visse betingelser. AOX1 genet, inkluderende dets promotorer, er isolert og omfattendekarakterisert. Studier indikerer at regulering av A0X1 skjer på transkripsjonsnivået og at, når genet er transkribert, er A0X1 mRNA en overveldende species i "steady state" mRNA.

Skjønt P. pastoris A0X2 genet også er metanol-regulert, transkriberes det ikke så sterkt som A0X1. Følgelig, skjønt de er i stand til å vokse på metanol, har A0X1-manglende mutanter, som er A0X2 normale, en betydelig lengre utviklingstid på metanol enn villtype-stammer.

Dobbel-kjedet DNA fra den replikative form av pBLI6C ble kuttet med EcoRI, og det resulterende, omtrent 460 bp, EcoRI fragment ble legert inn i EcoRI-kuttet og alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.)-behandlet pAO804 DNA. En av de to resulterende ekspresjonsplasmider, som er betegnet pSL12A og som er vist i fig. 2, har den korrekte 5' til 3' orienteringen av den bovine lysozym-kodende sekvens vedrørende stillingen og orienteringen av AOX1 promotoren og transkripsjons-start-setet i "5'AOXl" promotor-segmentet og "3'-AOX1" terminator-segmentet.

EKSEMPEL 3

TRANSFORMASJON AV GS115 CELLER MED pSL12A; STAMME A37

Pichia Pastoris stamme GS115 ((His4~); Cregg et al., supra), en histidin-krevende auksotrop av P. pastoris, som tidligere er bestemt til å være mangelfull med hensyn på histidinol-dehydrogenase (His4) og til å gi en reversjons-frekvens til histidin-prototropi på mindre enn 10<->^, ble anvendt som gen-ekspresjonsverten for transformasjon med pSL12A. P. pastoris GS115 dyrkes effektivt på metanol i et definert minimalt medium supplert med histidin, til en høy celletetthet og er ønskelig som et vertssystem for enkelcelle-proteinproduksjon. Stammen inneholder ingen bakterielle replicons, gener resistente overfor antibiotika eller andre heterogene sekvenser som kan betraktes som en potensiell biologisk fare. Plasmid pSL12A ble kuttet med restriksjons-endonuklease Bglll og den resulterende blanding av DNA-fragmenter ble anvendt for å transformere P. pastoris stamme GS115 ved anvendelse av det hel-celle LiCl gjær-transformasjonssystem. Detaljer i transformasjonsprosedyren er gitt under.

Kutting av pSL12A med Bglll frigir et DNA-fragment med ender som er homologe til områder 5' og 3' av P. pastoris A0X1 genet, som beskrevet over. Når dette fragment transformeres inn i en His4" P. pastoris stamme og holdes der under selektive betingelser (vekts i fravær av histidin), utføres en utskiftnings-type-integrering på A0X1 stedet i det Bglll-sete-terminerte, ekspresjons-kasett-inneholdende fragment (inkluderende His4-genet) i enkelte celler.

Denne integrering resulterer i celler med en fenotype betegnet Mut<+>/~ (for "metanol-anvendelse +/-"), som skyldes tap av A0X1 genproduktet, men retensjon av det mindre viktige alkoholoksydase-genproduktet (A0X2), og tillater sakte vekst på metanol. Denne et-trinns genutskiftnings-teknikk, som resulterer i kromosomal integrering av det heterologe gen, unngår vanskeligheter assosiert med plasmid-ustabilitet, fordeling og kopiantall og tilveiebringer et svært nøyaktig ekspresjonssystem. Teknikken resulterer også i innlemmelsen av en minimal mengde heterolog DNA inn i P. pastoris genomet. Celler som bærer den rette integrering vil være His<+>og kan skjelnes, ved hjelp av en redusert veksthastighet på metanol, fra celler hvori integreringen har forekommet på seter utover A0X1 stedet. I celler hvori integrering ikke har forekommet, eller hvori integrering ikke har forekommet på A0X1 stedet forblir A0X1 genet funksjonelt og slike cellers evne til å vokse på metanol er ikke svekket.

Et hel-celle-litiumklorid gjær-transformasjonssystem, modifisert fra det som er beskrevet for Saccharomyces cerevisiae (Ito et al., Agric. Biol. Chem. 48:341 (1984)), ble anvendt for å introdusere de lineære DNA-fragmenter inn i GS115. Da en slik metode ikke krever dannelse av og opprettholdelse av speroplaster, er den mer passende og mindre tidskrevende enn speroplast-metoden. Speroplast-teknikken som er nøyaktig som beskrevet i Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5,3376 (1985) med det ene unntak at regenerasjons-agaren ikke inneholder sorbital, men inneholder 0,6 M KCl i stedet, og som også kan anvendes for å transformere P. pastoris cellene, er imidlertid foretrukket ved at en slik metode gir et større antall transformanter.

En 50 ml ryste-flaske-kultur av P. pastoris stamme GS115 ble dyrket i YPD (10 g Bacto-gjærekstrakt, 20 g Bacto-pepton, 20 g dekstrose, 20 g Bacto-agar, 1000 ml destillert vann) ved 30°C med rysting til en OD,nnomtrent 1,0 (5 x 10<7>

b U U

celler/ml). Tettheten ved høsting kan være fra 0,1 til 2,0 OD600enheter- Etterat cellene var vasket en gang i 10 ml sterilt H2O, og etter pelletering ved sentrifugering ved omtrent 1600 x g i 3-5 min., ble cellene pelletert igjen ved den samme prosedyre og deretter vasket en gang i 10 ml steril TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA). Cellene ble resuspendert i 20 ml steril litiumklorid + TE buffer (0,1 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) og inkubert ved 30°C, med tilfeldig rysting, i en time.

Et sterilt polypropylenrør på 12 x 75 mm, inneholdende 10 ug Haelll-kuttet E. coli bærer DNA, 2 ug av Bglll-kuttede DNA fra plasmid pSL12A og 0,1 ml kompetente P. pastoris celler i TE buffer med LiCl ble inkubert i et vannbad ved 3 0°C i 30 min. Omtrent 0,1-20 ug av vektor DNA kan anvendes for å transformere cellene. 0,7 ml 40% polyetylenglykol (PEG-^-^q, Fischer Scientific, Fair Lawn, New Jersey) i litiumklorid + TE buffer ble tilsatt, og røret ble vortex-blandet forsiktig og inkubert igjen i et vannbad i 30 min. ved 30°C. Etterat cellene hadde fått et varmesjokk i 5 min. ved 37°C, ble blandingen sentrifugert og deretter resuspendert i 0,1 ml sterilt H20. Cellene ble deretter spredt på selektive plater (0,67% gjær-nitrogenbase, uten aminosyrer, 2% glukose, 2% agar) og deretter inkubert i 3 døgn ved 30°C. Transformanter med Mut+^ fenotypen ble identifisert som følger: His<+>transformanter ble platet ut for å oppnå kolonier som stammer fra enkle celler. Individuelle kolonier ble overført til master-plater med minimal glukose (2%). Etter inkubasjon over natten ved 3 0°C, ble master-platene replica-overført til minimale plater med lavt glukoseinnhold (0,2%) og igjen inkubert over natten ved 30°C. Den påfølgende dag, ble platene med lavt glukoseinnhold replica-overf ørt til minimale metanol-plater (0,5%) og deretter inkubert ved romtemperatur i 2 til 5 døgn. Kolonier som viste synlig vekst ble merket som Mut<+>og dem uten synlig vekst ble merket som Mut+// .

Transformant-kolonier ble gjenvunnet fra overflaten av agar-platene ved tilsetning av 5 ml sterilt H2O til platen og suspendering av cellene med en spreder, hvorpå, etter fortynning, cellene ble ultralydbehandlet og utplatet for å oppnå kolonier av enkle celler. Ultralydbehandlingstrinnet var nødvendig for å separere P. pastoris celler, da slike celler har en tendens til å vokse i klumper.

Omtrent 20% av de oppnådde 276 His<+>transformantene vokste sakte på metanol og åpenbarte følgelig den ovennevnte Mut"1"^ fenotypen. Southern-blot analyser av 9 Mut<+//>transf ormanter viste identiske hybridiseringsspor og bekreftet at den forutsagte integrering i AOX1 stedet hadde forekommet i cellene. En av disse AOXl<_>transformanter, betegnet A37, ble selektert for videre analyse.

Syv avMut+^~stammene ble dyrket i 100 ml rysteflaske kulturer. Seks av stammene inneholdt lysozym-genet i den korrekte orientering og en stamme hadde genet i den motsatte orientering. Rysteflaske kulturer ble først dyrket i 0,67% gjær-nitrogenbase (Difco Labs, Detroit, Michigan) og 2% glyserol som eneste karbon- og energi-kilde ved 30°C og med rysting i omtrent 1 døgn. Etter sentrifugering og vasking av celle-pelleten i sterilt vann, ble cellene transformert til medier inneholdende 0,5% metanol, i stedet for glyserol, som eneste karbonkilde. Inkubering ved 30°C med rysting ble deretter fortsatt og prøvene ble høstet etter 1 og 4 døgns vekst i metanol.

Etterat cellene fra de syv Mut+/^ stammene var fjernet fra prøvene ved steril filtrering, ble 200 ug av hver medium-prøve påført på et nitrocellulose-filter ved anvendelse av et spalt-avtrykks-apparat. Nitrocellulose-filteret ble bearbeidet ved hjelp av en standard Western-avtrykks-prosedyre, ved anvendelse av en 1:2500 fortynning av antiserum fra kanin nr. 156 (beskrevet i eksempel 6).

Resultatene av Western-spalt-avtrykks-forsøket, etter en påføring av 200 pl medium-prøver fra stammer etter vekst i glyserol og fra stammer etter 1 og 4 døgn i metanol, såvel som fortynninger av en renset bovin lysozym c2 standard, var som følger: (1) celler med det bovine pre-lysozym c2 innskuddet i den ukorrekte orientering og celler dyrket i glyserol utskilte intet påvisbart bovint lysozym; (2) signifikante mengder bovint lysozym c2 ble utskilt i mediene ved hjelp av cellene som hadde det bovine lysozym-innskudd i den korrekte orientering og som var dyrket i metanol; (3) med hensyn til cellene beskrevet i (2), økte lysozym-konsentrasjonen i mediumene ti ganger mellom 1 døgns cellevekst i metanol og 4 døgns vekst i metanol (lysozym-nivåer på omtrent 125 ug utskilt/ml ble målt på dag 1 mens lysozym-nivåer på omtrent 1,25 mg utskilt/ml ble målt på dag 4); (4) der var svært liten innbyrdes variasjon i sekresjons-nivåene blant stammene med det lysozym-kodende segment i den korrekte orientering.

EKSEMPEL 4

OPPSKALERING AV PRODUKSJONEN AV PICHIA PASTORIS STAMME A37 FRA RYSTE-FLASKE-KULTURER TIL STORE FERMENTERINGS-KULTURER OG KARAKTERISERING AV FERMENTERINGSPRODUKTET

Som nevnt tidligere, er transkripsjonen fra alkoholoksydase- promotoren sterkt undertrykt ved vekst i glyserol og indusert ved vekst i metanol. I fermenterings-kulturer, er transformanter som bærer ekspresjons-kasetter i A0X1 stedet dyrket i et enkelt 2-trinns produksjonssystem. I det første trinn utvikles cellemasse i fravær av ekspresjon av det heterologe gen ved anvendelse av glyserol som en karbonkilde. Når glyserol er oppbrukt, initieres en metanol-tilførsel. Da stammer som mangler A0X1 vokser sakte på metanol, og tiden for formering til det dobbelte er omtrent ti ganger lengre på metanol sammenlignet med villtype-stammer, er der en lengre produksjonsfase på 30 til 200 timer med et minimum av celledeling. Ved dyrking av en ekspresjonsvert initielt på undertrykkende karbonkilder, slik som glukose eller glyserol, kan en stor cellemasse dannes uten signifikant seleksjon for mutanter som mangler heterolog gen-ekspresjon. Deretter, ved å tillate cellene å bruke den undertrykkende karbonkilde og tilsette metanol, kan et høyt nivå av heterolog gen-ekspresjon initieres.

For produksjon i stor skala av bovint lysozym c2 fra GS115 stamme A37, ble et to-trinns verts-fermenteringssystem med høy celletetthet anvendt. I det første trinn eller vekst-trinnet, ble A37 dyrket i et definert minimalt medium med glyserol som karbonkilde. Den ønskede celletetthet som skulle oppnås ble etablert ved å justere den initiale glyserol-konsentrasjon i mediumet. Når glyserol var oppbrukt, ble kulturen, da med ønsket tetthet, overført til det andre trinn eller produksjonstrinnet ved tilsetning av metanol.

Fermenterings-kulturer ble dyrket i et uorganisk salt-basert medium fremstilt fra kommersielt tilførte analytiske reagenser bestående av følgende: uorganiske salter i slutt-konsentrasjoner på 0,3 M H3PO4, 4,4 mM CaS04-2H20, 65 mM K2S04og 38 mM MgS04; sporsalter ved endelige konsentrasjoner på 0,4 uM CuS04-5H2, 2,5 uM Kl, 9,0 uM MnS04-H20, 4,0 p Na2Mo04-2H20, 1,5 uM H3BO3, 35 uM ZnS04~7H20 og 89 uM FeCl3<->6H20, fremstilt som en 200 x stamløsning og filter- sterilisert; 2 mg/ml biotin; og enten 2% glyserol for den 2 liters New Brunswick Bioflo fermenteren eller 6% glyserol for den 15 liters Biolafitte fermenteren. NH3ble tilsatt for å justere pH i mediumet til 5,5 før inokkulering og for å opprettholde denne pH under fermenteringen. Når glyserol var oppbrukt, ble en metanoltilførsel initiert for å opprettholde metanolkonsentrasjonen mellom 0,2 og 1,0%. For å forhindre mangel på sporsalter under fermenteringene, ble det til kulturene med jevne mellomrom tilsatt en ny løsning av sporsalter.

Resultater fra en rekke 2 liters og 15 liters (1 liter og 10 liter arbeidsvolum) fermenteringsforsøk med stamme A37 indikerte at stamme A37 klart er i stand til å opprettholde et høyt produksjons- og sekresjons-nivå av bovint lysozym c2 når den dyrkes i 5 til 7 døgn på metanol i 2 liters og 15 liters kulturer. Ved fermenterings-gjennomkjøring nr. 182, ble bovinet lysozym c2 konsentrasjoner på omtrent 200 mg/l målt i det cellefrie fermenteringsmedium, ved en OD60Q_<0>76.

I et annet tilfelle, ble et cellefritt fermenteringsmedium fra fermenteringsgjennomkjøring nr. 207, dyrket i 7 døgn på metanol til en cellekonsentrasjon på OD,- =195, målt ved

0 u u

hjelp av radioimmunoassay (RIA), som beskrevet i eksempel 6, til å ha 200 mg/l bovint lysozym c2. Den spesifikke produksjonsevne målt for fermenteringsdyrkede kulturer ble innen området observert for A37 celler dyrket i 100 ml ryste-flaske-kulturer. Således var der intet tap av pr. celle produksjonsevne i oppscallering til 21 og 151 fermentere.

En mediumprøve på 124 ml fra fermenteringsgjennomkjøring nr. 182 ble justert med konsentrert eddiksyre til pH=4 og plassert i et vannbad på 100°C i 3 til 5 min. Etter en andre justering til pH=5 med NH4OH, ble det bovine lysozym c2 renset på en kationebytter harpiks (Whatman CM-52), som beskrevet av Dobson et al., J. Biol. Chem. 259:11607 (1984); 12,5% denaturerende polyakrylamid-geler indikerte en renhet på minst 95%. Den fargede gel indikerte at bovint lysozym c2 omfattet omtrent 50% av proteinet tilstede i fermenterings- mediumet og at alle andre proteiner var tilstede i svært små mengder i forhold til bovint lysozym c2. Dessuten, synes det rekombinante bovine lysozym c2 og det native bovine lysozym c2 å komigrere nøyaktig. Fra den fargede gel av celle ekstraktet, var intet bånd tilsvarende bovint lysozym c2 tydelig.

En renset prøve rekombinant bovint lysozym c2 (250 pmol) utskilt fra P. pastoris A37 dyrket i fermenterings-gj ennomkj øring nr. 182 ble analysert ved automatisert, N-terminal sekvensanalyse (Applied Biosystems 470A, Foster City, California). Sekvensen, som ble verifisert gjennom fjorten sykluser, med svært liten ledsagende bakgrunn, viste at mer enn 88% av det delvis rensede bovine lysozym c2 var korrekt behandlet ved knutepunktet mellom signalsekvensen og det modne protein. De første fjorten aminosyrer av det rekombinante material var identiske med de første fjorten aminosyrer av den publiserte proteinsekvens i det modne enzym.

Kort eksponering av Western avtrykk av Laemmli-geler av en prøve av utskilt bovint lysozym c2 tatt fra fermenterings-gj ennomkj øring nr. 250, en 10 liters fermentering av stamme A37, viste en enkel immun-reaktiv species med korrekt molekylvekt. I de oppløselige og uoppløselige celle-fraksjoner, ble et immunreaktivt bånd som vandret til samme posisjon som standarden sett, skjønt i en mye mindre mengde enn i mediumet. Material som vandret i samme grad ble ikke sett fra kontroll Aoxl<+/>^ celler som ikke bar noen ekspresj onskasett.

En rekke andre gjennomkjøringer testet virkningen av begrenset cellevekst på sekresjon av bovint lysozum c2. Begrensende mengde (2,5 ml/l, 5 ml/l og 10 ml/l) sporsalter ble anvendt i henhv. gjennomkjøringer nr. 239, nr. 240 og nr. 241, for å begrense cellevekst. Kurven for lysozym utskilt i mediumene var parallell med cellevekstkurven. Ut fra disse data viser det seg at akkumulering av bovint lysozym c2 i

mediumet er forbundet med kraftig cellevekst.

EKSEMPEL 5

KARAKTERISERING OG KVANTIFISERING AV REKOMBINANT BOVINT LYSOZYM c2 PRODUKSJON ETTER' POLYAKRYLAMID-GEL-ELEKTROFORESE AV FERMENTERINGSPRØVE

Det ble utført parallelle gjennomkjøringer på 15% polyakrylamid-Laemmli-geler (Laemmli, Nature 227:680 (1970)). En gel ble farget med sølvfarge og den andre ble behandlet som et immunoavtrykk. Det ble utført gjennomkjøringer på begge geler med (1) bovint lysozym c2 renset fra bovin mage-slimhinne; (2) bovint lysozym c2 renset, som beskrevet i eksempel 9, fra mediene av en A0X1<+>lysozym-utskillende stamme; og (3) celleekstrakt og medier fra en 10 liters fermenter midt i gjennomkjøringen av P. pastoris stamme A37 (gjennomkjøringer. 250). For medieprøver, ble celler med en tetthet på 308 g/celler/l og som hadde vært på metanol i 111,5 timer, renset ved hjelp av sentrifugering ved lav hastighet. Celleekstrakter ble fremstilt ved å nedbryte cellene ved anvendelse av glasskuler i en buffer bestående av 10 mM natriumfosfat, pH 7,5, 500 mM natriumklorid, 0,1% Triton X-100 og 2 mM fenylmetyl-sulfonyl-fluorid (PMSF). Med hensyn til medieprøvene og celleekstraktprøvene, var mengden celleekstrakt som ble påført på den fargede gelen ekvivalent volumetrisk til 0,1 ganger mengden tilsatt medium. For immunoavtrykket, ble celleekstrakt i like mengder og 0,1 ganger mengden av medium påført. Antiserum for immunoavtrykket ble fremstilt, som beskrevet i eksempel 6, i kaniner mot det bovine lysozym renset fra abomasum og anvendt i en fortynning på 1:2500.

Fra gelene, var det tydelig at nativt og rekombinant bovint lysozym c2 komigrerte, at bovint lysozym c2 omfatter minst 50% av proteinet i urent fermenteringsmedium, og at ingen signifikante mengder lysozym-nedbrytningsprodukter var

tilstede.

Relative mengdeandeler av bovint lysozym c2 i celle-ekstraktet og i dyrkingsmediumet kan estimeres ut fra immunoavtrykket hvorpå volumetrisk ekvivalente prøver basert på celletetthet ble påført. Skjønt det var umulig å beregne hvor effektiv sekresjonen var ut fra disse data, noe som skyldes den konstante akkumulering av bovint lysozym c2 i fermenteren, viste det seg, fra disse data, og fra konsen-trasjonsdata dannet ved hjelp av RIA, som beskrevet i eksempel 6, at mindre enn 5% av det bovine lysozym c2 dannet ved hjelp av cellen, forble i cellen.

EKSEMPEL 6

IMMUNOASSAYS FOR BOVINT LYSOZYM C2

Bovint lysozym c2 ble renset i overensstemmelse med prosedyren som beskrevet av Dobson et al. supra, fra 25 g frossent bovint abomasumvev. Da utgangsmaterialet var 15 ganger mindre enn det som ble anvendt av Dobson et al., ble kolonnestørrelsen og strømningshastigheten henhv. nedsatt. Som angitt hos Dobson et al., var tre adskilte topper tilsvarende til de bovine magelysozymer cl, c2 og c3, tydelige ved absorbsjon ved 280 nm etter kolonne-kromatografering på Whatman CM5 2.

Hver av de tre bovine magelysozym-topper inneholdt lysozym-aktivitet, som målt i et spektrofotometrisk forsøk, beskrevet i eksempel 7, og omtrent 2 mg protein. Renheten av det bovine lysozym c2 protein ble estimert til større enn 9 5% etter polyakrylamid-gel-elektroforese (Laemmli, supra) på en 15% polyakrylamid-gel.

Alle forsøksresultatene er avhengig av kvantifisering med en prøve av det rensede bovine lysozym dialysert mot 1 x PBS og lagret ved -20°C. For resultatene som er beskrevet under, er standarden kvantifisert ved anvendelse av den publiserte ekstingsjons-koeffisient for en 1% løsning målt ved 280 E=28,2 (Jolles et al., Mol. and Cell.Biochem, 63 165

(1984)) .

Antisera fremstilt i kaniner mot bovint lysozym c2, ble fremstilt ved hjelp av standard prosedyrer. Kort sagt, ble to unge, hvite, New Zealand-hankaniner hver immunisert med 250 ug bovint lysozym c2, renset som beskrevet over og dialysert mot PBS før injeksjonene. Hver av kaninene ble igjen gitt en innsprøytning med 20 ug lysozym c2 3 0 døgn senere og gitt en ny innsprøytning 10 døgn senere med ytterligere 100 ug protein. Mens de initiale immuniseringer ble gjennomført med lysozym c2 emulgert med Freunds fullstendige hjelpestoff (Difco Labs, Detroit, Michigan), ble Freunds ufullstendige hjelpestoff (Difco Labs, Detroit, Michigan) anvendt for de nye innsprøytninger. Det ble tatt blodprøver av kaninene for å oppnå antisera en uke etter den siste ytterligere innsprøytning.

Antisera fra begge kaniner ble testet ved å plassere forskjellige mengder nativt og denaturert renset bovint lysozym c2 og bovint serumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) i fosfat-buffret saltløsning, og binding til nitrocellulosefiltre som var blitt inkubert med forskjellige fortynninger av antiseraene, ved anvendelse av et "spalt-avtrykks"-apparat (Schleicher and Schuell, Inc., Keene, New Hampshire), og anvendelse av en standard immunavtrykks-prosedyre (Towbin et al., J. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:4350 (1979)). Bufferen som ble anvendt for filter-

125

blokkering og vasking, og antistoff- og I-protein A fortynningen, var sammensatt av 1 x PBS (140 mM natriumklorid, 3 mM kalium-klorid, 10 mM dinatrium-fosfat, 2mM monokalium-fosfat, pH 7,2), 0,25% gelatin (Bio-Rad, Inc. Richmond, California), 0,05% Tween-20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) og 0,02% natrium-azid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Serum fra en kanin, betegnet nr. 156, ble valgt på grunn av den vesentlig lavere kryss-

reaktivitet av dette sera med bovint serumalbumin. Ved anvendelse av en 1:25 00 fortynning av serumet fra kanin nr. 156, var 2,5 ng av lysozym-standarden lett påvisbar på et spalt-avtrykk, og 25 ng ga et svært sterkt signal.

Radio-jodering av lysozym, for anvendelse som markør i RIA,

TM

ble gjennomført ved anvendelse av IODOBEAD metoden. Kort, ble et jodkorn (Pierce Chemical Co., Rockville, Illinois)

125 tilsatt til en reaksjonsblanding inneholdende 1 mCi Na I (New England Nuclear, Boston, Massachucetts), 50 ug renset lysozym c2 i 50 pl, og 10 pl 0,5 M natrium-fosfat-buffer, pH 7,3, og inkubert i 3 0 min. på is. Deretter ble innholdene i reaksjonsrøret overført til en forhåndspakket G-25 avsaltnings-kolonne (PD-10 fra Pharmacia, Piscataway, New Jersey) og eluert med 50 ml 0,05 M natrium-fosfat-buffer, pH 7,3, inneholdende 0,05% krystallinsk bovint serumalbumin. Fraksjonene ble talt i en Micromedic Gamma Counter, og

125

posisjonen av I-lysozym ble bestemt. Det joderte preparat ble testet ved presipitering i 10% triklor-eddiksyre (TCA)

125

for å estimere andelen av intakt peptid. Typisk var I-lysozym-preparatene anvendt i RIA mer enn 9 8% TCA-presipiter-bar.

RIA-ene hvorved konsentrasjonen av bovint lysozym c2 i P. pastoris kulturprøver ble bestemt, ble gjennomført ved en standard prosedyre omfattende inkubering av varierende mengder standard eller ukjente prøver med en endelig fortynning på 1:25.000 av kanin anti-lysozym antistoff,

125

10.000-20.000 pulser I-lysozym i et endelig volum på 500 pl forsøksbuffer (50 ml natriumfosfat, 0.1 M NaCl, 25 mM EDTA, 0,1% natrium-azid, 0,1% bovint serum-albumin (Fraksjon V), 0,1% Triton X-100, pH 7,4). Etter inkubering over natten ved 4°C, ble 100 pl av en 1:40 fortynning av Pansorbinv (R)'

(Calbiochem, San Diego, California) suspensjon av S. aureus celler belagt med protein A tilsatt og inkubert i 15 min. ved romtemperatur. Rørene ble sentrifugert i 60 min. ved 23 60 x g etter tilsetning av 2 ml av en iskald vaskebuffer (0,9% NaCl, 5mM EDTA og 0,1% Triton X-100). Supernatanten ble dekantert

125

og pelletene ble talt for I-lysozym. Under disse

125

betingelser, ble omtrent 50% av totalt I-lysozym gjenvunnet i pelleten i referanse-røret og 10% i det ikke-spesifikke bindingsrør dvs. i nærvær av overskudd av ikke-merket lysozym. Sensitivitets-området for forsøket var 0,2-20 ng med en EDcb n U på omtrent 2 ng. De ukjente prøvene ble målt ved tre fortynninger av hver prøve, in duplo.

EKSEMPEL 7

BIOASSAYS FOR UTSKILT BOVINT LYSOZYM c2

Mikrocuccus luteus celler ble oppnådd fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri.

To typer bioassays (spektrofotometrisk assay og halo assay) ble anvendt for å analysere bioaktiviteten av det utskilte bovine lysozym c2 (Grosswics et al., Meth. Biochem. Analys. 29:435 (1983)). Hvert forsøk målte den evnen som lysozymet har til å lysere mikrocuccus luteus celler. Aktivitetsforsøk ble gjennomført ved pH 5,0, heller enn ved pH 7,0, som er standard for egghvite-lysozym, på grunn av det varierende pH optimum for enzymene.

Halo-assay er et in vitro assay som resulterer i en halo av lysering av Micrococcus luteus celler på agar-plater. Ved anvendelse av halo assay, ble 10 ul prøver tilsatt til hull på 2 mm som var utstanset i en agarose-plate bestående av 1% agarose og 1,2 mg/ml tørkede M. luteus celler i 0,1 M fosfat-buf f er, pH 5,0. Prøvene kan være urent medium, lysozym renset fra medium eller lysozym-standard. Diametrene av de resulterende haloer ble målt etter en 16 timers inkubasjon ved romtemperatur og kvantifisert ved å sammenligne med et semilog-plot av halo-diameter mot mengde, avledet ved anvendelse av lysozym-standarden (bovint lysozym c2 renset fra bovint abomasumvev). Plottet var lineært fra 100 ng til 10 ug. Den nedre sensitivitets-grense for forsøket er omtrent 5 0 ng og, ved anvendelse av dette forsøk, var den minimale påvisbare konsentrasjon 5 mg/l renset bovint lysozym c2.

I det andre forsøk, et spektrofotometrisk forsøk som måler in vitro lysering av tørkede M. luteus celler, ble forskjellige mengder renset lysozym tilsatt til en bufret suspensjon av M. luteus celler. Prøver ble tilsatt til en 0,3 mg/ml suspensjon av tørkede mikrococcus luteus celler i 0,1 M fosfat-buffer, pH 5,0. Celle-lysering ble målt ved å måle reduk-sjonen i absorbsjon ved 450 nm hvert 15. sek. i 2 min. Helningen av kurven ble beregnet ved hjelp av lineær regresjon og kvantifisert ved å sammenligne denne helningen med en kurve hvor helning mot konsentrasjon av den rensede standard var plottet. Den minste påvisbare konsentrasjon i det spektrofotometriske forsøk var 5 mg/l.

EKSEMPEL 8

TRANSFORMASJON AV GS115 CELLER MED pSL12A; STAMME LI

En A0X1<+>, His<+>stamme, betegnet LI, som er en enkel-kopi integrant av bovint lysozym c2 uttrykt fra AOX1 promotoren i A0X1<+>celler, var resultatet etter at GS115 celler var transformert, som beskrevet i eksempel 3, med pSL12A, kuttet med Sali (som kutter i P. pastoris HIS4 gen-området) til å integrere på HIS4-stedet.

Celler ble dyrket i ryste-flasker i 4-5 døgn i 100 mM natrium-fosfat bufret minimalt medium inneholde 0.2% glyserol og 1,0% metanol, til en tetthet mellom 4 og 5 OD,nA

b U U enheter/ml. Sluttkonsentrasjonen av bovint lysozym c2 akkumulert fra cellen var mellom 0,24 og 0,56 mg/l (definert ved RIA ).

Fra enkel-celle protein-produksjonsforsøk er det kjent at ekspresjonen av alkohol-oksydase er svært avhengig av fortynningshastigheten. Ved en steady state tilstand, er fortynningshastigheten (D) direkte relatert til genererings-tiden (td) ved ligningen D=0,69/td.

Fortynningshastighets-forsøk gjennomført med LI i kontinuer-lige fermenteringer, hvor veksthastigheten kunne kontrol-leres, viste at eksepresjonsnivåene var avhengig av veksthastigheten .

Data fra gjennomkjøring nr. 255, en metanol-begrenset kontinuerlig fermentering gjennomført i en 1 liters fermenter med en 33% MeOH tilførsel, hvori fortynningshastigheten varierte mellom 0,lt<_1>og 0,04t_1 (td henhv. = 6,9 og 17,25 timer pr. generering) viste at fortynningshastigheten hadde en markert virkning på den spesifikke produktivitet (mengden produkt/celler/time) av bovint lysozym c2 fra stamme LI. Tre prøver tatt etter tre fermentervolum ved hver fortynningshastighet ble målt for å bestemme steady state verdier. Den maksimale spesifikke produktivitet på 20 ug/g våte celler/t som ble sett ved en fortynningshastighet på 0,065t , eller en genereringstid på 10,6 t, er betydelig større enn den spesifikke produktivitet på 7 ug/g våte celler/t for AOX1<->stammen, A37.

Under fortynningshastighets-forsøket, ble en markert nedgang i konsentrasjonen av bovint lysozym c2 i fermenteren observert etter 600 t med kontinuerlig dyrking. I løpet av de første 550 t, varierer produktsjonen av bovint lysozym c2 som en funksjon av fortynningshastigheten. Southern avtrykks-analyser av DNA ekstrahert fra celleprøvene tatt fra fermenteren ved 550, 643 og 717 t viste, ved de siste to tidspunkter, at en signifikant andel av cellene i fermenteren viste et endret restriksjonskart. Endringen var en omtrent-lig 300 bp deletion i DNA-fragmentet som inkluderer den bovine lysozym c2 kodende sekvens og alkohol-oksydase-promotoren. Det nye fragment som inneholder deletion var tilstede i omtrent 50% av cellene i fermenteren etter 643 t og i omtrent 90% av slike celler etter 717 t.

EKSEMPEL 9

TRANSFORMASJON AV GS115 MED pSL12A; STAMME C6

En AOXl<+>, His4<+>stamme, betegnet C6, som er en enkel-kopi integrant av et heterologt gen som uttrykker bovint pre-lysozym c2 fra AOXl-promotoren, var resultatet etter at GS115 cellene var transformert, som beskrevet i eksempel 3, med pSL12A kuttet med Sstl (eller SacI på samme sete), i 5'A0X1 området, indikert i figurene, oppstrøms av promotoren (med hensyn til transkripsjons-retningen fra promotoren). Noen av transformantene hadde pSL12A integrert på AOXl-stedet, 5" av A0X1 promotoren.

Celler ble dyrket i ryste-flasker i 4-5 døgn i 100 mM natriumfosfat-bufret minimalt medium inneholdende 0,2% glyserol og 1% metanol til en tetthet mellom 4 og 5 OD,An

bUU enheter/ml. Den endelige konsentrasjon av bovint lysozym c2 akkumulert fra cellene i mediumet var 0,24 og 0,42 mg/l.

EKSEMPEL 10

RENSE-PROSEDYRE I STOR SKALA; STAMME LI

Rense-prosedyrer som kan anvendes ved produksjon i stor skala ble anvendt for å rense rekombinant bovint lysozym c2 utskilt fra stamme LI i gjennomkjøring nr. 253.

Celler fra 80 1 fermenterings-kultur i gjennomkjøring nr. 253 ble fjernet ved anvendelse av en Ceraflow patron (1 mikron, Amicon Corp., Danvers, Massachusetts), og det resulterende filtrat (80 liter) ble konsentrert med en 3.000 molekylvekts sikrings-spiralpatron (Amicon). Konsentratet ble diafiltrert med destillert vann for å redusere ledningsevnen til under 4 ms. To og en halv liter av diafiltratet ble pumpet ved en strømningshastighet på 15 mg/min. på en ZetaChrom SP-100 kapsel (Western Analytical, Temecula, California) som på forhånd er ekvilibrert med 5 0 mM natrium-acetat, pH 5,8. Etter at påføringen var fullstendig, ble kapslen vasket med ekvilibrert buffer og det bovine lysozym c2 ble eluert med en lineær gradient bestående av 1 1 50 mM natrium-acetat, pH 5,8, og 1 1 300 mM natrium-acetat, pH 8,0. Det bovine lysozym c2 som eluerte i den første tredjedelen av toppen inneholdt små mengder (ikke mer enn 15%) av kontaminerende proteiner som estrimert ved SDS-gel-elektroforese og høytrykks-væske-kromatografi (HPLC). Disse kontaminanter ble fjernet ved gjentagende binding, vasking og eluering fra SP-100 kapslen. HPLC analyser ble gjennomført ved anvendelse av en ubondapak C-18 kolonne (Waters Associates, Milford, Massachusetts) og en acetonitril-gradient i vandig trifluoreddiksyre. Denne HPLC-metode ble også anvendt for å kvantifisere lysozym under fermenterings- og rense-prosedyren. Lysozym-aktiviteten ble bestemt ved den spektrofotometriske metode som beskrevet i eksempel 7.

En enhet er definert som en 1% forandring i OD^g pr. min. ved 25°C. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt, enten ved metoden etter Lowry et al., J. Biol. Chem. 193:265 (1951) etter presipitering med trikloreddiksyre (TCA) eller ved kvantitative aminosyre-analyser ved anvendelse av norleucin som intern standard.

Under denne tre-trinns prosedyre, kan det bovine lysozym c2 utskilt av Pichia pastoris renses til nær homogenitet. Totalt enzym-utbytte fra den cellefrie kultur er omtrent 60% av den initiale mengde lysozym målt i urent medium og økes til 75% når urene fraksjoner re-kromatograferes på sulfopropyl-platen. Renheten er større enn 90%, som bedømt ved SDS-elektroforese og HPLC.

EKSEMPEL 11

TRANSFORMASJON AV PPF1 CELLER MED PLASMIDER pBLll og pSL12A;

STAMMENE CSBL11 OG CSBL3

P. pastoris celler, av stamme PPF1 (His4~ Arg4~), ble transformert med et ikke-kuttet plasmid, betegnet pBLll, på den måten som er beskrevet i eksempel 3. En A0X1<+>, Arg<+>transformant, betegnet CSBL11, ble utvalgt for videre bearbeidelse.

Plasmid pBLll, som er illustrert i fig. 3, er lik plasmid pSL12A, med unntak av at det bærer et Hpal-sete-terminert segment med S. cerevisiae ARG4 genet klonet inn i pBR322 BamHI setet av pSL12A for seleksjon i stedet for det Bglll-sete-terminerte fragment med P. pastoris HIS4 genet. S. cerevisiae ARG4-genet er funksjonelt i P. pastoris.

5'-AOXl-sekvensen på pBLll styrte sirkulær integrering på 5'-enden av A0X1 stedet i noen av transformantene. Transformanter ble først screenet for Arg<+>fenotype. Arg<+>, A0X1<+>transformanter ble vist ved Southern hybridisering til å ha integrert plasmidet på 5'-enden av AOXl-stedet.

CSBL11 celler ble retransformert med ikke-kuttet pSL12A DNA. His<+>transformanter ble selektert og screenet ved hjelp av Southern hybridisering. Transformantene var dobbelt-kopi-integranter av det bovine pre-lysozym c2, A0X1 promotor-dreven ekspresjonskasett. Lokaliseringen av pSL12A DNA i genomet av dobbelt-kopi integrantene forblir ukjent, skjønt det ikke er på HIS4 eller A0X1 stedet. En A0X1<+>, His<+>, Arg<+>transformant, betegnet CSBL3, ble utvalgt for videre bearbeiding.

En fermenter-gjennomkjøring (gjennomkjøring nr. 274) med stamme CSBL3 resulterte i en spesifikk produktivitet på 33ug/g våte celler/time med en fortynningshastighet på

0 081~~

og en spesifikk produktivitet på 28 ug/g våte celler/time med en fortynningshastighet på 0,06t<_1>.

Autentiske og rekombinante lysozymer c ble funnet å ha sammenlignbar biologisk aktivitet når de ble testet parallelt ved anvendelse av den samme assay.

EKSEMPEL 12

KONSTRUKSJON AV HUMAN LYSOZYM EKSPRESJONSVEKTOR pHLZ10 3

Et plasmid, betegnet av søkerne som pHLZlOO, ble fremstilt ved hjelp av standard teknikker. Se europeisk patent-ansøkning, publikasjonsnr. 0 222 366 og Castanon et al., Gene 66, 223-234 (1988). Plasmid pHLZlOO består av pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19, 259 (1982)) med et innskudd, mellomm Sali og Hindlll setene, som omfatter et segment av 435 basepar som koder for, i tillegg til et translasjons-stoppsignal, hele sekvensen, unntatt de fire N-terminale aminosyrer av signal-peptidet, av det humane pre-lysozym c av placenta- opprinnelse. Det modne lysozym c som tilsvarer til dette pre-lysozym c har den samme aminosyre-sekvens som humant melkelysozym. Se Jolles and Jolles (1984), supra.

Ved anvendelse av Sanger dioksy-metoden, ble sekvensen av dette 4 35-bp segmentet funnet å være som indikert i følgende figur XII:

Ved simpelthen å anvende den genetiske kode for 3' 393 baseparene indikert i fig. XII, kan aminosyre-sekvensen utledes for det 130-aminosyre, modne lysozym c, hvor alle, unntagen de 4 N-terminale aminosyrer av det tilsvarende pre-lysozym c er kodet for av DNA'et med sekvensen i fig. XII. Som indikert i beskrivelse av den sete-rettede mutagenese av pHLZlOl for fremstilling av pHLZ102 i det følgende, er sekvensen av de fire aminosyrer av N-terminalen av pre-lysozymet c, for hvilket den nukleotid-sekvens som koder for de 114 karboksyl-terminale aminosyrer og translasjons-stopp-kodonet som er gitt i fig. XII, MKAL.

435-bp-segmentet, for hvilket sekvensen er gitt i fig. XII, bortsett fra forskjeller i to basepar, har den samme sekvens som 4 35-bp cDNA'et som koder for hele, unntatt de 4 N-terminale aminosyrer i signal-peptidet, det humane pre-lysozym c som ble fremstilt med mRNA isolert fra en human histiocytisk lymfoma-cellelinje U-937 (Sundstrøm og Nilsson, Intl. J. Cancer 117, 565-577 (1976)).

Aminosyre-sekvensene i pre-lysozymet c av placenta-opprinnelse og av cellelinje U-9 37 opprinnelse er de samme, da de to forskjeller i nukleotid-sekvens i cDNA-ender som koder for pre-lysozym c ikke endrer aminosyre-sekvens. Castanon et al., Gene 66, 223-234 (1988). Posisjonene av de to forskjeller i nukleotid-sekvens er indikert ved under-strekning i sekvensen i fig. XII. I U-937 cellelinje-avledet cDNA, er der en T i stedet for C i GTC i fig. XII som koder for Val i stilling -3 i signal-peptidet og der er en A i stedet for G i CAG i fig. XII som koder for Gin i stilling -2 i signalpeptidet.

I pHLZlOO, mellom 5'- enden i 435-bp-segmentet indikert i

fig. XII og 5'-GTCGAS-3<*>i Sall-setet, er der et segment med en sekvens 5'-CTGCA{C}-3', hvori 5'-CTGCA-3' er resten i Pstl setet av pUC9 og {C} betegner en polydC-blokk (med ikke nøy-aktig kjent lengde) som skyldes polydC-forlengelser av

polydC-forlenget, Pstl-kuttet pUC9 hvor en polydG-forlenget

cDNA omfattende 4 3 5-bp-segmentet var ligert inn i for å danne pHLZlOO. Videre, i pHLZlOO, mellom 3'-enden av 435-bp-segmentet indikert i fig. XII og 5'-AAGCTT-3' i Hindlll-setet, er der et segment med sekvensen 5'-CTCCAGAATTTT{G}TGCAGCC-3<1>, hvori {G} betegner en polydG-blokk (av ikke nøyaktig kjent lengde) som skyldes, i det minste delvis, polydG-forlengelse av cDNA omfattende 435-bp-segmentet før ligering av cDNA inn i polydC-forlenget pUC9 for å danne pHLZlOO og eventuelt delvis fra en blokk av en eller flere dG'er på 3'-enden av dette cDNA før det polydG-forlenges; 5'-CTCCAGAATTTT-3' tilsvarer de første 12 ikke-translaterte ribonukleotider etter translasjons-stopp-kondonet i det lysozym-kodende mRNA hvorfra cDNA'et anvendt for å danne pHLZlOO var fremstilt; og 5'-TGCAGCC-3' tilsvarer til (i) 5'-GCC-3' umiddelbart foran Hindlll setet av pUC9 og (ii) 5'-TGCA-3' som skyldes fyllingen av gapet, mellom 3'-enden av polydG-forlenget cDNA basepar forlenget til 31 enden av polydC-forlenget, Pstl-kuttet pUC9, i fremstillingen av pHLZlOO.

Omtrent 1 ng HLZ-100 ble transformert inn i E. coli stamme MC1061. Transformanter ble identifisert ved hjelp av resistens overfor ampicillin. Plasmid ble fremstilt fra transformanter og kuttet med BamHI og Hindlll i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Riktig plasmid ble indikert ved et mønster på omtrent 2750 bp (Hindlll-BamHI-segmentet av pUC9) og omtrent 540 bp (BamHI-Hindlll segment omfattende 435-bp-segmentet indikert i fig. XII).

Det Sall-Hindlll sete-bundne, humane pre-lysozym c innskudd i pHLZlOO ble innskutt i M13mpl8 for sete-rettet mutagenese som følger, for å tilføye de 12 nukleotider som kreves på 5' - enden av 435-bp-segmentet i fig. XII for å kode for de første fire aminosyrer av pre-lysozym c og for å tilføye EcoRI-ender like før ATG som koder for translasjons-starten og den første aminosyren av signalpeptidet og like etter TAA som koder for translasjons-stopp-kodonet. Således, ble M13mpl8 kuttet med Hindlll og Sali og ble fosfatase-behandlet. Likeledes, ble et Hindlll/Sall-kutt gjennomført på pHLZlOO og det omtrentlige 530-bp-fragment med det 435-bp, delvis pre-lysozym c-kodende segment ble isolert på en 1,0% agarose-gel. 750 ng vektor og 250 ng fragment ble ligert sammen i en standard ligerings-reaksjon og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli JM103 celler. Hvite plaques ble utvalgt og plasmid ble isolert derfra. Et Hindlll/Sall-kutt av plasmidet ga fragmenter med omtrent 7240 bp og 530 bp, som indikerer det korrekte plasmid.

3<1->enden av innskuddet i M13mpl8 ble deretter modifisert for å tilføye et EcoRI-sete umiddelbart etter translasjons-stopp-kodings TAA tripletten. For å gjennomføre dette, ble sete-rettet mutagenese gjennomført i overensstemmelse med prosedyren etter Zoller og Smith, Methods in Enzymology 100, 468 (1983) og ved anvendelse av oligonukleotidet med sekvensen:

Plaques ble screenet med screening-oligonukleotidet med sekvensen:

og et mini-templat preparat ble gjennomført på positivene.

E. coli JM103 celler ble transformert med det 3<1->ende-modifiserte templat fra mini-preparatet og plaques ble igjen screenet med det samme screening-oligonukleotidet. Positiver i denne andre screening-omgangen ble anvendt for fremstilling av templat for sekvensering. Sekvensering ble gjennomført ved Sanger-dideoksy-metoden ved anvendelse av den universelle initiator med sekvens:

Et plasmid (RF-form av M13mpl8) hvori 3'-enden av det pre-lysozym-kodende segment hadde den ønskede modifikasjon, ble identifisert og betegnet pHLZlOl.

5'-enden av det 435-bp, pre-lysozym-kodende segment i pHLZlOl ble deretter modifisert, idet man fulgte den samme sete-rettede mutagenese-prosedyre som for 3'-enden, med unntak av at det mutagenerende oligonukleotid hadde sekvensen:

og screening-oligonukleotidet hadde sekvensen: Et plasmid ble identifisert, ved hjelp av Sanger-dideoksy-sekvensering ved anvendelse av den universelle initiator og to initiatorer med sekvenser

til å ha begge ender av det pre-lysozym c-kodende segment modifisert som ønsket. Plasmidet ble betegnet pHLZ102.

Plasmid (RF-form M13mpl8) pHLZ102 ble isolert ved anvendelse av en CsCl-gradient.

For å konstruere P. pastoris ekpresjons-vektoren, ble det omtrentlige 450-bp, pre-lysozym-c-kodende, EcoRI sete-terminerte fragment fjernet fra pHLZ102 ved hjelp av EcoRI-kutting og isolert på en 1,2% agarose-gel. Plasmid pA0804 ble deretter kuttet med EcoRI og endene ble fosfatase- behandlet. 25 ng kuttet, fosfatasebehandlet pAO804 og 250 ng av det pre-losozym c-kodende fragment ble ligert sammen i en standard ligerings-reaksjon og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli MC1061. Transformanter ble identifisert ved hjelp av ampicillinresistens og en transformant med plasmid med den korrekte struktur ble identifisert ved hjelp av et minipreparert plasmid DNA fra transformanten, det minipreparerte DNA ble kuttet med Pstl og fragmentstørrelsene av det kuttede plasmid DNA ble analysert. Et plasmid med det pre-lysozym-kodende segment innskutt i den korrekte orientering, i forhold til transkripsjons-retningen fra AOXl-promotoren, vil ha et Pstl-fragment med en lengde på omtrent 2100 bp. Et plasmid med det pre-lysozym-kodende segment innskutt i den ukorrekte orientering, i forhold til transkripsjons-retningen fra AOXl-promotoren, vil ha et Pstl-fragment med en lengde på omtrent 1960 bp. Et plasmid med den korrekte struktur ble funnet og betegnet pHLZ103.

EKSEMPEL 13

HUMANE P. PASTORIS STAMMER FOR EKSPRESJON AV LYSOZYM

Plasmid pHLZ103 ble renset på en CsCl gradient.

5 ug Sacl-kuttet pHLZ103 ble transformert inn i P. pastoris stamme GS115 (ATCC nr. 20864) ved anvendelse av spheroplast-transformasjons-metoden (Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 1985). (SacI er en isoschizomer av Sstl). His<+>Mut<+>celler ble identifisert og DNA fra flere transformanter ble karakterisret ved hjelp av Southern-avtrykks hybridiserings-analyser. Således ble DNA'ene kuttet med EcoRI og probet med plasmid pAO803 DNA. Fragmenter på 2000 og 11200 bp, med tap av et villtype 5700 bp fragment, indikerte at i en transformant hadde det lineariserte pHLZ10 3 plasmidet integrert ved tilføying i AOX1 stedet 5' av AOX1-kodingssekvensen, etterlatende transformanten Mut<+>. En slik transformant ble selektert for videre beiarbeiding og betegnet G+HLZ103S.

For å utvikle Mut<+//>humane lysozym-ekspresjonsstammer, ble plasmid pHLZ103 kuttet med Bglll og 5 ug fragment ble transformert inn i GS115 celler ved hjelp av spheroplast-metoden. His<+>celler ble identifisert og screenet for deres Mut fenotype.

Screening for Mut fenotypen ble gjennomført ved å plate His<+>transformanter ut på minimal-glyserol (2%) master plater for å oppnå kolonier som stammer fra enkle celler. Etter 2 døgns inkubasjon ved 30°C, ble master platen replikaoverført til minimale glyserolplater og plater som ikke inneholdt noen karbonkilde hvortil metanol var tilsatt i dampfase. Dette ble gjennomført ved å tilsette en dråpe, omtrent 200 pl, metanol til undersiden av lokket av petriskålen som inneholder plategelen. Platene ble deretter inkubert ved 30°C i 2 døgn med ytterligere tilsetning av metanol i dampfase hvert døgn. Kolonier som viste synlig vekst ble merket som Mut<+>og dem med ingen synlig vekst ble merket som Mut<+/>~.

Mut+^ transformanter blekarakterisert vedSouthern-avtrykks-hybridiseringsanalyser. DNA i transformantene ble kuttet med EcoRI og probet med plasmid pA0803 DNA. Fragmenter på 2000 bp og 5100 bp (med tap av vi11type 5700 bp fragmentet) indikerte integrasjon av ekspresjonskasetten ved brudd på AOX1 stedet. En slik Mut<+//>transformant ble utvalgt for ytterligere bearbeiding og betegnet G-HLZ103S.

EKSEMPEL 14

YTTERLIGERE PROSEDYRER FOR DYRKING AV LYSOZYM-UTSKILLENDE P.

PASTORIS STAMMER

Prosedyren som er beskrevet i dette eksempel er fordelaktig anvendt med bovine lysozym c2 utskillende P. pastoris stammer A37 (Mut+// ) og LI (Mut+) . Prosedyrene kan anvendes for å danne humant lysozym med P. pastoris stammene G-HLZ103S og

G+HLZ103S.

De forskjellige stammer er blitt oppbevart på gjær-nitrogen-basis (YNB) uten aminosyrer (Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan, USA) + 2% glukose-agarplater med over-føringer hver måned. Inokulater for prosedyrer beskrevet i dette eksempel ble dyrket over natten ved 30°C med rysting ved 200 rpm i YNB uten aminosyrer + 2% glukose + fosfatbuffer (PH 6,0). 1. Oppstarting av fermentering og generell operasjon.

2-liters fermentorer (L.H. Fermentation, Hayward, California, USA; eller Biolafitte, LSL Biolafitte, Princeton, New Jersey, USA) ble autoklavert ved et volum på 700 ml inneholdende 225 ml 10X basale salter (42 ml/l 85% fosforsyre, 1,8 g/l kalsium-sulfat-2H20, 28,6 g/l kalium-sulfat, 23,4 g/l magnesium-sulfat-7H20, 6,5 g/l kalium-hydroksyd) og 30 g glyserol. Etter sterilisering, ble 3 ml av en YTM4sporsalt-løsning (5,0 ml/l svovelsyre, 65,0 g/l jernsulfat-7H20, 6,0 g/l kobbersulfat-5H20, 20,0 g/l sinksulfat-7H20, 3,0 g/l mangansulfat-H20, 0,1 g/l biotin) tilsatt og pH ble justert til 5,0 med tilsetning av konsentrert ammoniumhydroksyd. Fermentorene ble deretter inokulert med et 10-50 ml volum inokulum. Når den opprinnelige mengde glukose var oppbrukt, ble en glyseroltilførsel startet som beskrevet under i avsnitt 2, 3 eller 4 i dette eksempel. I løpet av en fermentering, ble pH kontrollert til 5,0 med tilsetning av 20% ammoniumhydroksydløsning inneholdende 0,1% Struktol J673 antiskummemiddel (Struktol Co., Stow, Ohio, USA) og kraftig

skum ble observert ved hjelp av en skum-sonde og kontrollert ved tilsetning av 2% Struktol J67 3 antiskummemiddel. Oppløst oksygen ved fermenteringen ble bibeholdt over 20% luftmetning ved å øke luftstrøm-hastigheten opp til 3 1 /min. og omrøringshastighet opp til 1500 rpm under fermenteringen.

10-liters fermenteringer (i en 14-liters Biolafitte fermentor) ble startet med et 7,0 liters volum inneholdende

1,9 1 10X basalsalter og 300 g glyserol for den Mut<->blandede-tilførsel, metanol-ikke-begrensende, porsjonsvis tilførsel, eller et 5,0 liters volum inneholdende 2,4 liter 10X basalsalter og 360 g glyserol for den Mut<+>metanol porsjonsvise tilførsel, eller et 8-liters volum inneholdende 3,2 1 10X basalsalter og 480 g glyserol for den Mut<->metanol porsjonsvise tilførsel. Etter steriliseringen, ble 29 ml av en YTM4sporsaltløsning tilsatt og pH ble justert og deretter kontrollert til 5,0 ved tilsetning av ammoniumgass under fermenteringen. Sterk skumming ble kontrollert ved tilsetning av 10% Struktol J67 3 antiskummemiddel. Fermentoren ble inokulert med et inokulum med et volum på 200-500 ml. Når den opprinnelige glyserolmengde var oppbrukt, ble en tilførsel startet som angitt i avsnittene 2, 3 eller 4 i dette eksempel. Det oppløste oksygen ble opprettholdt over 20% ved å øke luftstrømshastigheten opp til 40 l/min., omrøring opp til 1000 rpm og/eller trykket i fermentoren opp til 1,5 bar under fermenteringen.

2. Mut+^ celler: Blandet-tilførsel, metanol ikke-begrensende, porsjonsvis tilførsel-fermentering

Etterat glyserol-porsjonsfasen var fullstendig (dvs. når den opprinnelige glyserolmengden var oppbrukt), ble en 50 vekt% glyserol-tilførsel, inneholdende 12 ml/l YTM4sporsalter startet med 5,4 ml/t for 2-liters fermentoren eller 4 ml/t for 10-liters fermentoren. Etter tilførsel av glyserol i 6 timer, ble glyseroltilførselen nedsatt til 3,6 ml/t (36 ml/t til 10-liters fermenteren) og en metanoltilførsel inneholdende 12 ml/l YTM4sporsalter ble initiert med 1,1 ml/t for 2-liters fermentoren eller 11 ml/t for 10-liters fermentoren. Etter 5 timer, ble metanoltilførselen justert til å gi en rest-metanolkonsentrasjon opp til omtrent 1%, foretrukket mellom 0,2 og 0,8%. Fermenteringen gjennomføres i 40-50 timer på metanol- og glyserol-tilførslene.

3. Mut celler: Fermentering med porsjonsvis tilførsel av metanol

Etterat den opprinnelige glyserolmengden var oppbrukt, ble en 50% glyseroltilførsel, inneholdende 12 ml/l YTM4sporsalter, startet med 12 ml/t for 2-liters fermentoren eller 200 ml/t for 10-liters fermentoren og kjørt totalt 7 timer. Etter 6 timer med glyseroltilførselen, ble metanoltilførselen, inneholdende 12 ml/l YTM4sporsalter, startet med 1,1 ml/t for 2-liters fermentoren og 11 ml/t for 10-liters fermentoren i 5 min. Når det ble registrert en økning i oppløst oksygen etter at metanoltilførselen var avstengt, ble metanol-tilførselen satt på igjen i ytterligere 5 min. Den sistnevnte prosess ble gjentatt flere ganger inntil en umiddel-bar respons med hensyn til oppløst oksygen ble observert når metanoltilførselen ble stanset. Når dette skjedde, ble metanoltilførselen økt med 20% pr. time i 30 minutters intervaller. Metanoltilførselen ble økt inntil det ble oppnådd en tilførselshastighet på 7,6 ml/t for 2-liters fermentoren eller 126 ml/t for 10-liters fermentoren. Fermenteringen ble deretter gjennomført i 40-60 timer for 2-liters fermentoren eller 25-35 timer for 10-liters fermentoren.

4. Mut<+//>celler: Fermentering med porsjonsvise tilførsler av metanol

Etter at den opprinnelige glyserolmengde var oppbrukt, ble metanol tilsatt til fermentoren for å opprettholde en rest-metanol-konsentrasjon mellom 0,2% og 0,8%. For gjennom-kjøringer i 10-liters fermentoren, ble YTM4sporsalter ikke anvendt, men i stedet ble 40 ml IM^_ sporsalter (5 ml/l svovelsyre, 4,8 g/l jernklorid-2H20, 2,0 g/l sinksulfat-H20, 0,02 g/l borsyre, 0,2 g/l natrium-molybdat, 0,3 g/l mangan- sulfat-H20, 0,08 g/l kaliumjodid, 0,06 g/l kobbersulfat-5H20) og 2 mg/l biotin injisert inn i fermentoren hver annen dag. Fermenteringen ble gjennomført opp til 192 timer for 2-liters fermentoren eller opp til omtrent 144 timer for 10-liters fermentoren.

Ytterligere informasjon angående forskrifter for dyrking av lysozym c-utskillende P. pastoris stammer er gitt i US patentansøkning med serienr. 249.446, innsendt 26. september 1988, og som er innlemmet som referanse heri.

EKSEMPEL 15

FREMSTILLING AV PLASMIDER pAO803, PAO804, OG pA0811

Prosedyren i dette eksempel ble gjennomført ved anvendelse av standard teknikker, som f.eks. skrevet av Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, New York (1986) og Maniatis et al., supra.

Plasmid pBR322 ble modifisert som følger for å eliminere EcoRI setet og innskyte et Bglll sete inn i PvuII setet: pBR322 ble kuttet med EcoRI, idet de utstikkende ender ble utfylt med Klenow-fragmentet av E. coli DNA polymerase I, og det oppnådde DNA ble på nytt ringdannet ved anvendelse av T4 ligase. DNA som var ringdannet på nytt ble anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens og transformanter ble screenet for å ha et plasmid med størrelse omtrent 4,37 kbp uten et EcoRI sete. En slik transformant ble utvalgt og dyrket til å gi et plasmid, betegnet pBR322 RI, som er pBR322 med EcoRI setet byttet ut med sekvensen:

pBr322 RI ble kuttet med PvuII og linkeren, med sekvens

ble ligert til de resulterende butte ender ved anvendelse av T4 ligase. De oppnådde DNA'er ble ringdannet på nytt, også med T4 ligase, og deretter kuttet med Bglll og igjen ringdannet ved anvendelse av T4 ligase for å eliminere multiple Bglll seter som skyldes ligering av mer enn en linker til det PvuII-kuttede pBR322 RI. DNA'ene, behandlet til å eliminere multiple Bglll seter, ble anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens. Transformanter ble screenet for et plasmid med omtrent 4,38 kbp med et Bglll sete. En slik transformant ble utvalgt og dyrket til å gi et plasmid, betegnet pBR322 RIBG, for ytterligere bearbeiding. Plasmid pBR322 RIBG er det samme som pBR322 RI med unntak av at pBR322 RIBG har sekvensen

i stedet for PvuII setet i pBR322 RI.

pBR322 RIBG ble kuttet med sali og Bglll og det store fragment (omtrent 2,97 kbp) ble isolert. Plasmid pBSAGI5I, som er beskrevet i europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 226 752, ble kuttet fullstendig medBglll og Xhol og et fragment med omtrent 850 bp fra et område av P pastoris A0X1 stedet nedstrøms fra A0X1 gen-transkripsjons-terminatoren (relativt til transkripsjonsretningen fra AOX1 promotoren) ble isolert. Dette Bglll-Xhol fragment fraPBSAGI5I og det omtrentlige 2,97 kbp, Sall-Bglll fragmentet fra pBR322 RIBg ble kombinert og underkastet ligering med T4 ligase. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens og transformanter ble screenet for et plasmid med den forventede størrelse (omtrent 3,8 kbp) med et Bglll sete. Dette plasmid ble betegnet

PAO801. Den fremstikkende ende i Sali setet fra pBR322 RIBG fragmentet ble ligert til den fremstikkende ende i Xhol setet på 850 bp pBSAGI5I fragmentet og, i prosessen, ble både Sali setet og Xhol setet i pAO801 eliminert.

pBSAGI5I ble deretter kuttet med Clal og fragmentet med omtrent 2,0 kbp ble isolert. 2,0 kbp fragmentet har et segment med omtrent 1,0 kbp som omfatter P. pastoris AOX1 promotoren og transkripsjons-initieringssetet, et segment med omtrent 700 bp som koder for heptatitt B virus-overflate-antigenet ("HBsAG") og et segment med omtrent 300 bp som omfatter P. pastoris AOX1 gen-polyadenyleringssignal- og sete-kodende segmenter og transkripsjonsterminator. Det HBsAg-kodende segment av 2,0 kbp fragmentet er terminert, på enden i nabostilling til 1,0 kbp segmentet med AOX1 promotoren med EcoRI setet og, på enden i nabostilling til 300 bp segmentet med AOX1 transkripsjonsterminatoren, med et Stul sete, og har sitt subsegment som koder for HBsAG orientert og plassert, med hensyn til de 1,0 kbp promotor-inneholdende og 300 bp transkripsjons-terminator-inneholdende segmenter, operativt for ekspresjon av HBsAG ved transkripsjon fra AOX1 promotoren. EcoRI setet som kobler promotorsegmentet til HBsAG kodingssegmentet forekommer rett oppstrøms (med hensyn til transkripsjonsretningen fra AOX1 promotoren) fra translasjons-initierings-signal-kodings-tripletten av AOX1 promotoren.

For ytterligere detaljer vedrørende promotor- og terminator-segmentene av det 2,0 kbp, Clal-sete-terminerte fragment av pBSAGI5I, se europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 226 846 og Ellis et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1111 (1985).

Plasmid pAO801 ble kuttet med det Clal-sete-terminerte fragment med omtrent 2,0 kbp fra pBSAGI5I. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli MCC1061 til ampicillin-resistens, og transformanter ble screenet for et plasmid med forventet størrelse (omtrent 5,8 kbp) som, ved kutting med Clal og Bglll, ga fragmenter med omtrent 2,32 kbp (med startpunktet for replikasjon og ampicillin-resistens-gen fra pBR322) og omtrent 1,9 kbp, 1,48 kbp og 100 bp. Ved kutting med Bglll og EcoRI, ga plasmidet et fragment med omtrent 2,48 kbp og med 300 bp terminatorsegmentet fra A0X1 genet og det HBsAG-kodende segment, et fragment på omtrent 9 00 bp som inneholder segmentet oppstrøms fra det AOX1 protein-kodende segment av AOX1 genet i AOX1 stedet, og et fragment med omtrent 2,42 kbp inneholder startpunktet for replikasjon og ampicillin-resistens-genet fra pBR322 og et Clal-Bglll segment med omtrent 100 bp av AOX1 stedet (ytterligere oppstrøms fra det AOXl-kodende segment enn det første nevnte 900 bp EcoRI-Bglll segment). Et slik plasmid hadde Clal fragmentet fra pBSAGI5I i ønsket orientering; og i motsatt uønsket orientering vil der være EcoRI-Bglll fragmenter med omtrent 3,3 kbp, 2,38 kbp og 900 bp.

En av transformantene som inneholder det ønskede plasmid, betegnet pAO802, ble utvalgt for ytterligere bearbeiding og ble dyrket til å gi dette plasmid. Den ønskede orientering av Clal fragmentet fra pBSAGI5I i pAO802 hadde AOX1 steds-fragmentene som avgrenser det HBsAG-kodende segment og det omtrentlige 800 bp Bglll-sete-terminerte fragment fra nedstrøms av AOX1 genet i AOX1 stedet orientert korrekt for å føre til den korrekte integrering inn i P. pastoris genomet på AOX1 stedet av det lineariserte plasmid fremstilt ved kutting på Bglll setet på den terminale ende av 800 bp fragmentet fra nedstrøms av AOX1 genet i AOX1 stedet.

pAO802 ble deretter behandlet for å fjerne det HBsAG kodende segment terminert med et EcoRI sete og et Stul sete. Plasmidet ble deretter kuttet med Stul og en linker med sekvens:

ble ligert til de butte ender ved anvendelse av T4 ligase. Blandingen ble deretter behandlet med EcoRI og igjen underkastet ligering ved anvendelse av T4 ligase. Ligeringsblandingen ble deretter anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens og transformantene ble screenet for et plasmid med forventet størrelse (5,1 kbp) med EcoRI-Bglll fragmenter på omtrent 1,78 kbp, 900 bp og 2,42 kbp og Bglll-Clal fragmenter på omtrent 100 bp, 2,32 kbp, 1,48 kbp og 1,2 kbp. Dette plasmid ble betegnet pAO803. En transformant med det ønskede plasmid ble utvalgt for ytterligere bearbeiding og ble dyrket til å gi pAO803.

Plasmid pAO804 ble deretter dannet fra pAO803 ved å innskyte, inn i BamHI setet fra pBR322 i pAO803, et Bglll fragment med omtrent 2,7 5 kbp fra P. pastoris genomet som inneholder P. pastoris HIS4 genet. Se f.eks. Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985) og europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 180 899 og 0 188 677. pAO803 ble kuttet med BamHI og kombinert med det HIS4 gen-inneholdende Bglll sete-terminerte fragment og blandingen ble underkastet ligering ved anvendelse av T4 ligase. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens og transformanter ble screenet for et plasmid med forventet størrelse (7,85 kbp), som kuttes ved hjelp av Sali. En slik transformant ble utvalgt for ytterligere bearbeiding, og plasmidet som den inneholder ble betegnet pAO804.

PAO804 har et Sall-Clal fragment på omtrent 1,5 kbp og et annet på omtrent 5,0 kbp og et Clal-Clal fragment på 1,3 kbp; dette indikerer at transkripsjonsretningen av HIS4 genet i plasmidet er den samme som transkripsjonsretningen for ampicillin-resistens genet og motsatt transkripsjonsretningen fra A0X1 promotoren.

Orienteringen av HIS4 genet i pAO804 er ikke kritisk for virkningen av plasmidet eller dets derivater med cDNA-kodende segmenter innskutt på EcoRI setet mellom AOX1 promotoren og terminatorsegmentene. Således, vil et plasmid med HIS4 genet i en orientering som er motsatt den for HIS4 genet i pAO804 også være effektivt for anvendelse i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse.

Det er verdt å legge merke til at andre plasmider, som er like med pAO804, men med selekterbare markørgener som er forskjellige fra P. pastoris HIS4 genet og som er i stand til å tilveiebringe seleksjon til P. pastoris, kan konstrueres ved å innskyte et fragment inn i BamHI setet av pAO80 3 som omfatter et selekterbart markørgen som er forskjellig fra P. pastoris HIS4 genet. Blant slike fragmenter som er kjent innen teknikkens stand, er fragmenter med S. cerevisiae ARG4 genet, P. pastoris ARG4 genet og S. cerevisiae HIS4 genet.

For å danne et plasmid, betegnet pA0811, som er analogen av pAO804 med et S. cerevisiae ARG4 gen i stedet for P. pastoris HIS4 genet, og som ble anvendt for å danne plasmid pBLll i henhold til oppfinnelsen, ble f.eks. følgende prosedyre fulgt: pAO80 3 ble kuttet med BamHI og de utstikkende ender ble utfylt ved anvendelse av Klenow fragmentet av E. coli DNA polymerase I. Deretter ble det lineariserte, utfylte plasmid kombinert med et Hpal fragment med omtrent 2,1 kbp fra S. cerevisiae genomet som innehar S. cerevisiae ARG4 genet. Se Tschumper and Carbon, J. Mol. Biol. 156, 293 (1982); europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 211 455. Hpal fragmentet er også tilgjengelig fra et plasmid, betegnet pYM25, som er tilgjengelig fra the Northern Regional Research Laboratory depository of the US Department of Agruculture in Peoria, Illinois, USA, hvor plasmidet er deponert i E. coli MC1061 under NRRL deponeringsnummer B-18015. Fragmentene ble buttende-ligert ved anvendelse av T4 ligase og ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli MC1061 til ampicillin-resistens. Transformanter ble deretter screenet for plasmider med forventet størrelse (omtrent 7,2 kbp). En slik transformant ble utvalgt for ytterlige bearbeiding. Plasmidet som det inneholder ble betegnet pA0811. Skjønt orienteringen av ARG4 genet i pA0811 ikke er bestemt, bør det bemerkes at der er et Bglll sete i det Hpal-sete-terminerte fragment som er omtrent 400-500 baser fra et Hpal sete på en fragmentterminal og som er nær 3'-enden av ARG4 genet.

P. pastoris ARG4 genet er gitt i europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 211 455. Et plasmid, som inkluderer et fragment med P. pastoris ARG4 genet, er tilgjengelig fra the Northern Regional Research Laboratory depository in Peoria, Illinois, hvor det er deponert i E. coli MC1061 under NRRL deponeringsnummer B-18016.

S. cerevisiae HIS4 genet er gitt i Donahue et al., Gene 18:47

(1982). Et plasmid, betegnet pBPGl-1, som omfatter et fragment med S. cerevisiae HIS4 genet, er beskrevet i europeisk patentansøkning med publikasjonsnummer 0 226 7 52 og er tilgjengelig fra the Northern Regional Research Laboratory depository in Peoria, Illinois, hvor det er deponert i E. coli MC1061 under NRRL deponeringsnummer B-18020.

DEPONERINGER

Kulturer av P. pastoris stammene GS115 og PPF1 og E. coli K-12 stammen MC1061 som inneholder plasmid pBSAGI5I er deponert med the American Type Culture Collection (ATCC), 12301Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA, på.følgende datoer og med de tilsvarende ATCC aksesjonsnummere:

Nevnte' deponeringer ble gjennomført og akseptert av ATCC i henhold til betingelsene for "the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedures and the Regulations promulgated under said Treaty". Prøver av nevnte deponeringer vil være tilgjengelige, i overensstemmelse med nevnte konvensjon og bestemmelser, for patentverk og andre personer og institusjoner som legalt er berettiget til å motta dem under patentlovene og bestemmelsene for USA og eventuelt andre nasjonale eller internasjonale organisasjoner hvori den foreliggende ansøkning, eller en ansøkning med samme prioritet som den foreliggende ansøkning, innsendes. Alle restriksjoner når det gjelder almen tilgjengelighet av prøver av nevnte deponeringer vil bli ugjenkallelig fjernet, senest ved utstedelse av et US patent for denne ansøkning.

Mens de ulike aspekter av den foreliggende oppfinnelse er utførlig beskrevet heri, vil den fagkyndige på området oppfatte de modifikasjoner og variasjoner som er innenfor oppfinnelsestanken. Disse modifikasjoner og variasjoner er innen rammen for den foreliggende oppfinnelse som er beskrevet og søkt beskyttelse for heri.

Claims (30)

1 . Et DNA karakterisert vedat det omfatter (1) et promotorsegment av et første P. pastoris gen og et terminatorsegment av et andre P. pastoris gen, idet nevnte første og andre gen er like eller forskjellige; og (2) et DNA segment som koder for et animalsk pre-lysozym c, idet nevnte segment er orientert og plassert, med hensyn til nevnte promotor- og terminator-segmenter, operativt for transkripsjon i P. pastoris, fra promotoren av nevnte promotorsegment, av nevnte pre-lysozym c-kodende segment og de polyadenylerings-signal-kodende- og polyadenylerings-sete-kodende segmenter av nevnte terminatorsegment.

2. Et DNA som angitt i krav 1, karakterisert vedat nevnte første P. pastoris gen og nevnte andre P. pastoris gen er like og er P. pastoris A0X1 genet.

3. Et DNA som angitt i krav 2, karakterisert vedat det pre-lysozym c-kodende segment koder for et pre-lysozym c fra en pattedyr-art.

4. Et DNA som angitt i krav 3, karakterisert ved-at arten er human.

5. Et DNA som angitt i krav 4, karakterisert vedat det humane pre-lysozym c-kodende segment har sekvensen av det prelysozym c-kodende, EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pHLZ102 eller sekvensen som er den av nevnte pre-lysozym c-kodende, EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pHLZ102 endret til å ha tripletten 5'-GTT-3' som koder for Val i stilling -3 av signalpeptidet av pre-lysozymet c og tripletten 5'-CAA-3' som koder for Gin i stilling -2 av signalpeptidet av pre-lysozymet c.

6. Et DNA som angitt i krav 3, karakterisert vedat arten er bovin.

7. Et DNA som angitt i krav 6, karakterisert vedat det bovine pre-lysozym c-kodende segment har sekvensen av det pre-lysozym c2-kodende, EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pBLI6C.

8. Et DNA som angitt i krav 1, karakterisert vedat det er i stand til å transformere P. pastoris celler til ekspresjon av nevnte pre-lysozym c og omfattende et gen for å tilveiebringe en selekterbar markør til P. pastoris celler som inneholder nevnte DNA.

9. Et DNA som er angitt i krav 7,karakterisert vedat genet som tilveiebringer den selekterbare markør er valgt fra gruppen bestående av P. pastoris HIS4 genet, P. pastoris ARG4 genet, S. cerevisiae ARG4 genet og S. cerevisiae HIS4 genet.

10. Et DNA som angitt i krav 9, karakterisert vedat nevnte første P. pastoris gen og nevnte andre P. pastoris gen er like og er P. pastoris AOX1 genet.

11. Et DNA som angitt i krav 10,karakterisert vedat det pre-lysozym c-kodende segment koder for et pre-lysozym c fra en patte-dyrart.

12. Et DNA som angitt i krav 11,karakterisert vedat arten er human.

13. Et DNA som angitt i krav 12,karakterisert vedat det humane pre-lysozym c-kodende segment har sekvensen av det pre-lysozym c-kodende, EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pHLZl02 eller sekvensen av nevnte pre-lysozym c-kodende EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pHLZ102 endret til å ha tripletten 5'-GTT-3' som koder for Val i stilling -3 av signalpeptidet av pre-lysozymet c og tripletten 5'-CAA-3' som koder for Gin i stilling -2 av signalpeptidet av pre-lysozymet c.

14. Et DNA som angitt i krav 1, karakterisert vedat det er plasmid pHLZ103.

15. Et DNA som angitt i krav 11,karakterisert vedat arten er bovin.

16. Et DNA som angitt i krav 15,karakterisert vedat det bovine pre-lysozym c-kodende segment har sekvensen av det pre-lysozyme c2-kodende, EcoRI-sete-terminerte segment av plasmid pBL16C.

17. Et DNA som angitt i krav 16,karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av pSL12A og pBLll.

18. En kultur av P. pastoris karakterisert vedat den er transformert med et DNA som angitt i krav 8-17.

19. En kultur som angitt i krav 18,karakterisert vedat nevnte kultur er av en P. pastoris stamme valgt fra gruppen bestående av G-HLZ103S og G+HLZ103S.

20. En kultur som angitt i krav 18,karakterisert vedat nevnte kultur er av en P. pastoris stamme valgt fra gruppen bestående av A37, LI, C6, CSBL11 og CSBL3.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et animalsk lysozym c,karakterisert veddyrking av P. pastoris celler som har et gen som er i stand til ekspresjon av det tilsvarennde pre-animalske lysozym c i P. pastoris, idet nevnte dyrking gjennomføres under betingelser slik at nevnte gen transkriberes i nevnte celler.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 21,karakterisert vedat cellene er av en kultur, eller en subkultur av en kultur, som er transformert med et DNA som angitt i krav 8-17 som er i stand til ekspresjon av det tilsvarende pre-lysozym c i P. pastoris.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 22,karakterisert vedat cellene er av en stamme valgt fra gruppen bestående av G-HLZ103S og G+HLZ103S.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 22,karakterisert vedat cellene er av en stamme valgt fra gruppen bestående av A37, LI, C6, CSBL11 og CSBL3.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 21 - 24,karakterisert vedat nevnte dyrking gjennomføres i et medium som inneholder metanol som er karbonkilde.

26. Et polypeptid med 18 aminosyrer,karakterisert vedat det omfatter sekvensen MXALVILGFLPL5VAVQG.

27. Et DNA, karakterisert vedat det omfatter et segment valgt fra gruppen bestående av et segment med 54-bp i en sekvens som koder for polypeptidet med sekvensen MKALVILGFLPLSVAVQG, og segmentene med 441-bp i sekvenser som koder for et polypeptid med sekvens

hvori Xgg er K eller H, og et segment med 444-bp i en sekvens som koder for fusjons-polypeptidet hvori polypeptidet med sekvens MKALVILGFLFLSVAVQG er fusjonert til aminoterminalen av modent humant melkelysozym.

28. Et DNA som angitt i krav 27,karakterisert vedat det omfatter et segment med 54-bp i en sekvens som koder for polypeptidet med sekvensen

29. Et DNA som angitt i krav 28,karakterisert vedat det omfatter et segment med 441-bp i en sekvens som koder for polypeptidet med sekvensen:

30. Et DNA som angitt i krav 28,karakterisert vedat det omfatter et segment med 444 bp i en sekvens som koder for fusjons-polypeptidet hvori polypeptidet med sekvensen MKALVILGFLFLSVAVQG er fusjonert til aminoterminalen av det modne humane melkelysozym.