DD283837A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinanten dna-molekuels - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Molekuels, welches DNA-Sequenz enthaelt, die fuer das Pektinlyase * oder ein Derivat desselben kodieren, wobei ein mit einem DNA-Molekuel transformierter Wirt gezuechtet wird und das gewuenschte rekombinante DNA-Molekuel oder ein Derivat desselben isoliert wird. Das DNA-Molekuel kann auch durch In-Vitro-Synthese hergestellt werden. Durch die Entwicklung der neuen erfindungsgemaesz hergestellten Polypeptid-Expressionssysteme wird das Gebiet der Gentechnologie erweitert.{rekombinantes DNA-Molekuel; DNA-Sequenz; Gentechnologie; Pektinlyase I von Aspergillus niger; Konstruktion von Hybridvektoren}

Description

Hierzu 14 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnologie und schafft neue DNA-Moleküle, umfassend DNA-Sequenzen, die die Pektinlyase I (PLI) von Aspergillus niger und/oder den Promotor, die Signalsequenz oder den Terminator davon kodieren. Die neuen DNA-Moleküle sind für die Überproduktion von PLI in Aspergillus und/oder die Konstruktion von Hybridvektoren, welche Fremdgene in Fadenpilzen zum Ausdruck kommen lassen, nützlich.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Obzwar auf gentechnologischem Gebiet zahlreiche Polypeptid-Expressionssysteme für prokaryotisch „ und eukaryotische Wirte bereits bekannt sind, besteht ein fortlaufender Bedarf für neue Systeme, welche gegenüber dan bekannten Systemen Vorteile haben könnten.

In großem Maße werden lar prokaryotische Wirt Escherichia coli und der eukaryotische Hefe-Wirt, z. B. Saccharomyces cerevisiae, für die eine große Anzahl von verschiedenen Expressionshybridvektoren, meistens Plasmide, entwickelt wurden, angewandt. Die Nachteile der E.coli-Wirte bestehen darin, daß sie das gebildete Polvpeptid nicht glykosylieren können und daß aufgrund des Fehlens von Ausscheidung das fremde Peptid innerhalb der Wirtszelle akkumuliert werden könnte und weiteres Wachstum verhindern könnte. Die Hefe-Wirte glykosylieren, jedoch scheiden sie nicht wie E.coli, die Polypeptide in das Nährmedium aus, außer sehr kleinen. Hefen scheiden nur in den periplasmischen Raum aus. Höhere eukaryotische Wirte sind Säugetierkrebsz allen, welche in der Lage sind, zu glykosylieren und in das Näh[mediur auszuscheiden, jedoch ist die Kultivierung hif rvon sehr langsam und kostspielig, und is besteht die Gefahr, daß onkogene Nucleinsäuren zusammen mit dem gewünschten Peptid, wovon das letztere nicht befreit werden kann, isoliert werden.

Aufgrund des Bedarfs für andere Wirte wurden auch Fadenpilze, wie Neurosporaa crassa, Aspergillus m Julans und Aspergillus niger, untersucht. Solche Pilze werden bereits in hohem Maße für industrielle Zwecke verwendet, jedoch wurde ihre Anwendung in der Gentechnologie vernachlässigt, hauptsächlich wegen des Fehlens eines geeigneten Transformationssystems. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae enthalten Fadenpilze keine Plasmide, welche zur Einführung von Fremdgenen und phänotypischer Selektion verwendet werden könnten. Es i;t jedocli möglich, Fadenpilze mit Fremdplasmiden, die ein ielektierbares Markergen enthalten, zu transformieren. AIIu bisher für Fadenpilze beschriebenen Vektoren sind nicht selbstreplizierend wie diejenigen der Hefen, werden aber in das Pilzchromosom integriert. Dies tritt nur mit sehr niedriger Frequenz auf. Andererseits macht die integrative Transforr la'ion dieTransformanten vorteilhafterweise mitotisch sehr stabil, selbst unter non-selektiven Bedingungen. Es wurde von einer stabilen Integration von mehr als einhundert Kopien berichtet. Der erste beschriebene Vektor für Fadenpilze enthielt das qa-2-Gen von Neurospora crassa als selektiven Marker. Dieses Gen kodiert die Enzym-katabolische Dehydrokinase und kann zur funktioneilen Vervollständigung von Aromutanton von N.crassa verwendet werden (M.E. Case, M. Schweizer, S. R. Kushner und N. H. Giles [1979] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76,5^59-5263). Aromutanten sind nicht in der Lage, auf Minimalmedium ohne Zusatz einer aromatischen Aminosäure zu wachsen. Transformation von N.crassa durch den qa-2-Vektor trat durch Integration einer Einzelkopie des Plasmids in das Chromosom auf. 30% der stabilen Aro⁺-Integranten hielten das integrierte qa-2-Gen, das noch an die bakterielle Plasmid-Sequenzen gebunden war, zurück (M. E.Case (1982) in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (A. Holländer, D. DeMoss, S. Kaplan, J.Konisky, D. Savege und R. S.Wolfe, Editoren], Seiten 87-100, Plenum). Diese Beobachtung machte die Kotransformation von pichtseiektiven DNA-Sequenzen zusammen mit selektiven zu einer durchführbaren Aufgabe.

In Ascergillus nidulans, der einen Sexualzyklus hat und daher klassischen genetischen Manipulationen unterworfen werden kenn, wurden sowohl negative als auch positive Selektionssysteme Identifiziert. Sowohl unter Verwendung von heterologer DNA von N.crassa als auch homologer DNA wurde eine funktioneile Vervollständigung von A. nidulanspyrG-Mutanten durch Transformation mit Plasmiden, die das pyrG-Gen enthielten, erhalten (Bailance et al. BBRC112,284,1983; Tilburn et al. Gene 26, 205,1983). In anderen Systemen wurden Mutationen am trpC- oder argB-Locus funktionell durch Transformation mit den geeigneten Plasmiden vervollständigt (Yelton et al. PNAS 81,1470,1984; Yelton und Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C173, 1985; Johnstone et al. EMBO J. 4,1307,1983).

Ein dominantes, positives Selektionssystem wurde auch entwickelt, indem das amdS-Gen verwendet wurde, das aus A. nidulans isoliert wurde, welches den damit transformierten A. niger in die Lage versetzt, auf Acetamid als einziger Stickstoffquelle zu wachsen {Tilburn et al., Gene 26,205,1083; Wernars et al., Curr. Genet. 9,361,1985; J. M. Kelly et al., EMBO J. 4,475,1985). Verglichen mit N.crassa oder A. nidulans ist A. niger bei weitem der wichtigere Organismus. Er wird in weitem Umfang bei der industriellen Produktion von Enzymen, z. B. zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie, verwendet. A. niger unterscheidet sich von A. nidulans durch seine sekretorische Kapazität in der Weise, daß er eine Vielzahl von hydrolytischen Enzymen ausscheidet, z. B. Glucoamylase, a-Amylase, Pectinase, Cellulase, ß-Glucanase, ß-Galactosidase, Naringinase, Pentosanase, Säureprotease und Lignase, wobei der Glucoamylase- und Pectinase-Komplex die bei weitem wichtigsten sind. A. niger hat kainen bekannten Sexualzyklus. Mutationen können daher nicht über meiotische Rekombinationen eingeführt werden. Mittels klassischer Mutatinns- und Selektionsverfahren wurden jedoch ausgedehnte Stammverbesserungen in der Sekretion von hydrolytischen Enzymen erreicht

Von den Genen der A. niger-Enz/me wurden nur diejenigen der Glucoamylase (Boel et al. EMBO J. 3,1581,1984) und Alkohol-

und Aldehyd-Dehydrogenasa (WO 86/06097) zusammen mit ihrem Promoter und Signalsequenzen charakterisiert und bei Transformationsexperimenten mit A. nidulans bzw. A. niger verwendet.

Als Selektionsmarker für A. niger wurden die heterologen amds-Gene (Kelly und Hynes, EMBO 3,4,475,1985) und das argB-Gen (Buxtonetal., Gene 37,207,1985; EP184438; WO 86/06097), welche beide aus A.nidulans erhalten wurden, verwendet. A. niger ist der wichtigste Organismus für die industrielle Produktion von Pektin abbauenden Enzymen. Pektine sind Polygalacturonide mit hohem Molekulargewicht (20000 bis 40000 D), die aus a-1,4-glykosidisch gebundener-D-Galacturonsäure-Polymeren bestehen und in der Natur als Bestandteile von Zellen höherer Pflanzen auftreten, wo sie an Cellulosemolekülen gebunden sind, die hauptsächlich in der primären Zeil wand und den Mittellamellen gefunden werden. UnUT den reichsten Quellen für Pektin sind Zitronen- und Orangenrinde, welche etwa 30% dieses Polysaccarids enthalten. Pektischr Enzyme bauen das Kohlenhydrat-Polymersubstrat ab entweder durch Hydrolyse der a-1,4-glykosidischen Bindung (Polygalacturonase) oder durch Transeiemination des a-4,5-ungesättigt-Galacturonischen Restes aus dem Pektinmolekül (verschiedene Pektinlyasen). Der systematische Name der Pektinlyase ist Pektintranseliminase (EC 4.2.2.10). In A. niger werden die Proteine des pektischen Komplexes konstitutiv nicht exprimiert. Unter induzierenden Bedingungen und Verwendung von Pektin oder Bruchstücken davon drückt A. niger die oben erwähnten Enzyme einschließlich PLI aus, wenn andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose oder Saccharose, begrenzt sind. Bei Oberflächenkulturen neigon die pektischen Enzyme dazu, mit der äußeren Zellwand verbunden zu bleiben. Steigende Pektin- und Ca²⁺-Konzentration im Medium führt zu vollständiger Ausscheidung.

Pektinasen, wie PLI, werden von der Nahrrngsmittelindustrie hauptsächlich für die Fruchtsaftklärung verwendet. Aus Aspergillus niger wurden zwei verschiedene Pektinlyasen, PLI und PLII, gereinigt und teilweise durch F. E. A. Van Houdenhoven(i) charakterisiert. PLI enthält vier Reste von Mannose, während PLII zwei Reste von jeweils Mannose und Glukose hat. Die Enzyme haben verschiedene Molekulargewichte (PLI: 37,5kD, PLII: 36kD). Vor der vorliegenden Erfindung wurden keine Gesarrn- oder Teilaminosäure-Sequenzen veröffentlicht.

Die vorliegende Erfindung basiert auf einer teilweisen Struktuibestimmung von Pektinlyase I (PLI), welche die Synthese von DNA-Teilstücken erlaubte, die für relevante Teile des Proteins kodieren. Mit Hilfe der DNA-Teilstücke war es möglich, aus einer Genbank von A. niger DNA zu screenen und zu isolieren, welche für PLI, gegebenenfalls zusammen mit Prä- und Post-Sequenzen davon, kodiert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, das Gebiet der Gentechnologie durch Entwicklung neuer Polypeptid-Expressionssysteme zu erweitern, die gegenüber den bekannten Systemen Vorteile haben.

Darlegung des Wesenu der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von rekominanten DNA-Molekülen, die für ein Pektinlyese-Expressionssystem und Derivate davon kodieren, wie das Strukturgen von PLI und entsprechenden regulatorischen Sequenzen, z. B. Promotor-, Start- und Stopsequenzen, und Hyuridvektoren, umfassend die entsprechenden DNAs einschließlich Hybridvektoren mit DNA, die für homologe oder heterologe Polypeptide kodieren, Wirte, insbesondere Fadenpilze, z. B. Aspergillus-Wirte, transformiert durch diese Vektoren, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Moleküle und ihrer Wirte und die Verwendung der rekombinanten DNA-Moleküle zur Herstellung von neuen Expressionssystemen zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe ist die Herstellung von Polypeptiden rnittels dieser DNAs und ihrer Wirte.

Das Pektinlyase-Expressionssystem umfaßt DNA-Seciuenzen, die für den Promotor, die Startsequenz, das Strukturgen und den Terminator eines Pektinlyasegens kodieren.

Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Konstruktion von Hybridexpressionsvektoren, umfassend DNA-Sequenzen, die für den Promotor von PLI kodieren, gegebenenfalls für die Startsequenz dieses Proteins und gegebenenfalls für einen geeigneten Terminator des gleichen Gens zu finden. Diese Hybridexpressionsvektoren werden zum Einschluß der

Gene, die für besondere Proteine und für die Transformation von Fadenpilzen, wie Aspergillus, Penicillium und Cephalosporium, kodieren, verwendet. Die Kotransformaiion von A. nigor mit zwei verschiedenen Plasmiden kann durchgeführt werden, wobei eines der Plasmide aus der Gruppe von Expressionsvektoren der Erfindung ausgewählt wird und das andere ein besonders konstruiertes Selektionsplasmid, das in Verbindung mit einem mutierten Stamm eines Fadenpilzes arbeitet, ist. Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe die Überproduktion von PLI in Aspergillus-Species zu schaffen. Erfindungsgemäß wird zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches DNA-Sequenzen enthält, die für das Pektinlyase (PL)-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodieren, ein mit einem DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz enthält, die für das Pektinlyase-Expressionssystem oder ein Derivat desselben kodiert ein transformierter Wirt gezüchtet und das gewünschte rekombinierte DNA-Molekül oder das Derivat desselben isoliert. Das rekombinierte DNA-Molekül kann erfindungsgemäß auch durch in-Vitro Synthese hergestellt werden.

Weitere erfindungswesentliche Details werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines kombinanten DNA-Moleküls, umfassend die DNA-Sequenz der Formel I (Fig. 4) oder ein Derivat davon.

Der Ausdruck „Derivat", sofern im Zusammenhang mit der DNA-Sequenz der Formel I verwendet, soll größere Derivate mit flankierenden Sequenzen, Fragmente dieser DNA-Sequenz, Mutanten, insbesondere natürlich auftretende Mutanten, und DNA-Sequenzen, welche degeneriert sind, umfassen.

Größere Derivate der DNA-Moleküle der Formel I sind solche, die aus dem A. niger Genom ausgeschnitten werden können und die DNA-Sequenz der Fcrmel I umfassen, wie sie in einer Genbank von A. niger gefunden werden kann, erhalten durch Fragmentieren der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneter. Restriktionsenzym, z. B. Sau 3A, Ligieren an ein geeignetes Plasmid, z.B. pUN 121, Klonen, z.B. in E.coli, und Wiederausschneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym. Ein solches Derivat ist z.B. der Einschub des Plasmids pCG3E! 11, dargestellt in Fig. 1.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I sind solche, die sich zwischen zwei Restriktionsstellen ausdehnen, ausgewählt aus denjenigen von Pst I, EcoRI, Hindill, Sau 3Al, Kpnl, CIaI, Ncol, Accl SaIII, Pvul, Sail, Spei, BgII, EcoRV, BgIII, Aval, Xhol, Nhel, BssHI, Xmnl, BamHI, BssHII und dergl., wie dies in den beigefügten Figuren gezeigt ist.

Bevorzugte Fragmente sind solche, welche die Promotor-Sequenz, die Start-Sequenz, das Strukturgen von PLI und/oder die Stop-Sequenz enthalten.

Die Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I können Linker onthalten, welche für eine erfolgreiche Verbindung zu anderen DNA-Molekülen sorgen.

Die P' I-Promotor-Sequenz ist in der DNA-Region zwischen den Nuclectid-Positionen -1 bis -688 enthalten, wobei die Sequenz zwischen den Nucleotiden etwa -100 bis -146 wesentlich ist. Für die Promotor-Sequenz ist der TATAA-Abschnitt bei den Nucleotiden -120 bis -146 als RNA-Polymerase-Erkennungszone wichtig. An diese Fragmente können geeignete Bindeglieder angeknüpft werden.

Der Promotor «/on PLI von A. niger ist induzierbar, d. h. die Expression des daran geknüpften Strukturgens, z. B. des Strukturgens, das für PLI oder irgendein anderes Fremdgen kodiert, wird durch Zugabe von Pektin oder Pektinabbauprodukten zum Medium induziert.

Die Start-Sequenz dehn, sich zwischen den Nucleotiden 1 bis 57 aus. Die Start-Sequenz ist eine bevorzugte Sequenz und diese umfassende DNA-Moleküle, z. B. solche, welche diese Sequenz und gegeuenenfalls geeignete Bindeglieder enthalten, sind bevorzugte DNA-Moleküle.

Das Strukturgen von PLI beginnt bei Nucleotld 58 und dehnt sich bis Nucleotid 1366 aus. Wie aus der Formel I ersichtlich, enthält das Strukturgen mehrere Introns. Auch das Strukturgen kann geeignete Linker enthalten.

Der Terminator beginnt mit dem Stopcodon TAA bei Nucleotid 1367 und kann sich bis zu Nucleotid 1570 oder bis zu 2029 ausdehnen, besonders bis zu einem der Restriktionspunkte innerhalb dieser Sequenz. Das Terminatorfragment kann geeignete Linker enthalten.

Geeignete Linker für obige Fragmente haben eine DNA-Sequenz, welche in die Restriktionsstelle der DNA, an welche das Fragment gebunden werden soll, hineinpaßt oder welche eine Restriktionsstelle" enthalten.

Fragmente der DNA-Sequenz der Formel! sind auch solche, welche aus kleineren Fragmenten zusammengesetzt sind, z. B. solchen, die aus dem Promotür und der Start- oder Struktursequenz oder der Start- und der Struktursequenz, dem Strukturgen ohne die Introns, und dergl. bestehen.

Mutanten der DNA-Sequenz der Formel I sind beispielsweise natürlich vorkommende Mutanten, wie die Mutante, deren Nucleotid T_M durch A₈₀ ersetzt ist, wobei das Codon GTG, die das für Valin kodiert, in GAG, das für Glutaminsäure kodiert, geändert wird. Die letztere Aminosäure ist in dem PLI vorhanden, das aus einem Gemisch von pektinolytischen Enzymen (Ultrazym¹¹¹¹, Novo Industries, Kopenhagen), erhalten aus einem A. niger-Stamm, isoliert wurde. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten der Start-Sequenz mit einem ähnlichen ocier identischen Hydrophobizi ätsprofil, z. B. worin die Codons für die polaren Aminosäuren Lysin (K⁸⁺), Tyrosin (Y⁸~) und Arginin (R⁸⁺) durch Codons für andere .Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht wurden und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und Threonin (T; d^||r«-h Codons für andere hydrophobe Aminosäuren ausgetauscht sind. Beispielsweise kann das Codon für das positiv geladene Lysin durch ein Codon für Arginin und umgekehrt ersetzt werden, das Codon für das negativ geladene Tyrosin durch ein Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder das Codon für das nichtpolare, hydrophobe Alanin durch irgendeines der Codons für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin und dergl. ersetzt sein. Andere Mutationen sind „stille Mutationen", worin eine oder einige andere Nucleotide, z. B. bis zu etwa 30, durch eine oder mehrere andere Nucleotide ersetzt sind, wobei die neuen Codons die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.

DNA-Sequenzen der Formel I, welche degeneriert sind, sind, wie die stillen Mutationen, solche, welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes derart degeneriert sind, daß eine unbegrenzte Anzahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt ist, ohne daß die Aminosäuresequenz, für die sie kodieren, geändert ist. Solche degenerierte DNA-Sequenzen können wegen ihrer verschiedenen Restriktionsstellen nützlich sein.

Rekombinante DNA-Moleküle, umfassend eine DNA-Sequenz der Formel I oder ein Derivat davon, sind besonders rekombinante Vektoren, alternativ auch Hybridvektoren genannt, die solche DNA-Sequenzen als Einschübe enthalten. Sie sind zum Klonen in Wirten, wie Bakterien, Pilzen oder tierischen Zellen, verwendbar. Solche Hybridvektoren stammen von irgendeinem Vektor, der in der Geniechnologie verwendbar ist, wie von Phagen, Kosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNa, wie Derivaten von

Phage λ, z.B. NM 983, M13 mp 8 Phagen-DNA(15), linearislert durch BamHI-Abbau, bakteriellen Plasmiden, z.B. pBR322, pUN 121, pUC 18, oder Hefeplasmiden, z.B. Hefe 2μ Plasmid, oder auch chromosomalor DNA, stammend z. B. von Aspergillus, z. B. A. niger, beispielsweise solchen, die von EP184438 zugänglich gemacht werden.

Ein Hybridvektor gemäß der Erfindung enthält zusätzlich zu der DNA-Sequenz der Formel I oder eines Derivats davon einen Replikationspunkt und gegebenenfalls, in Abhängigkeit von dem Typ des DNA-Derivats, eine Expressionskontrollsequenz, wie eine Beschleuniger-Sequenz, eine stromaufgelegene Aktivierungsstelle, einen Promotor und Start-Sequenzen und/oder Strukturgene, die verschieden sind von den entsprechenden Sequenzen, die von dem vorhandenen A. niger abgeleitet sind. Solche Enhancer-Sequenzen können abgeleitet werden von der exti achromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) oder sind die stromaufgelegenen Aktivierungsstellen vom Säurephosphates PHO5-Gen (EP-Anmeldung Nr.86111820.6) oder dem PHO5, trp, PHO5-GAPDH-Hybrid (EP-Anm. Nr.86111820.6) oder ähnlichen Promotorn. Solche Expressions-Kontrollsequenzen können an das PLI-Strukturgen gebunden sein.

Strukturgene, die mit dem vorhandenen Promotor, Start- und/oder Stopsequenzen verbunden sind, sind außer solchen, die PLI mit oder ohne Introns kodieren, auch homologe andere Pektinlyase-Gene und heterologe Strukturgene, die für eine große Vielzahl von Polypeptiden kodieren, einschließlich glykosylierter Polypeptide, insbesondere von höheren eukarvotischen, insbesondere Säugetier-, wie tierischen und besonders menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, welche verwendet werden können, beispielsweise zur Erzeugung von Nahrungsmitteln und zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in der Chemie, oder nichtenzymatischer Polypeptide, welche zur Behandlung von menschlichen oder tierischen Krankheiten oder zur Vorbeugung davon nützlich und wertvoll sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunsteuernden, anti-viralen und Anti-Tumor-Eigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Vakzinen bzw. Impfstoffe, Blutgerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergl. Beispiele für solche heterologe Strukturgene sind beispielsweise solche, die kodieren für: Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermale oder insulinähnliche Wachstumsfaktoren, Mastzellen-, Nerven- oder Transformierungsv -ichitumsfaktor, Wachstumshormone, wie Human- oder Rinder-Wachstumshormone, Interleukin, wie Interleukine odb. I₁ Humanmakrophagen-Migrationsinhibitorfaktor (MIF), Interferone, wie Human-a-lnterferon, z.B. Interferon-aA, aB, aD oder aF, 0-lnterferon, 7-lnterferon oder ein Hybrid-Interferon, z.B. ein aA-aD- oder ein aBaD-Hybrid-lnterferon, Hepatitisvirus-Antigene, wie Hepatitis B-Virus-Oberflächen- oder -Core-Antigen oder Hepatitis A-Virus-Antigen, Plasminogen-Aktivatoren, wie Gewebeplasminogen-Aktivator oder Urokinase, Tumor-Nekrose-Faktor, Somatostatin, Renin, ß-Endorphin, Immunoglobuline, wie ύτΛ leichten und/oder schweren Ketten von Immune-globulin D, E oder G, Immunoglobulin-bindende Faktoren, wie Immunoglobuin E-Bindungsfaktor, Calcitonin, Humancalcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Eg'in, wie Eglin C, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudin-Variant HV1, HV2 oder PA, oder Human-Superoxid-Dismutase. Bevorzugte Gene sind solche, die kodieren für menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, menschlichen Plasminogen-Aktivator (t-PA), Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Antigen (HBVsAg), ΙηευΙίη-änlichen Wachstumsfaktor I, Eglin C und Desulfatohirudin, z. B. Variant HV1. In den Hybridvektoren gemäß vorliegender Erfindung kann der vorliegende Promotor und/oder die Start- bzw.. Signal- Sequenz operabel mit der Polypeptid kodierenden Region verbunden sein, um eine wirkungsvolle Expression des Polypeptide zu sichern.

Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können selektive Marker in Abhängigkeit von dem Wirt, der transformiert, selektiert und geklont werden soll, enthalten. Irgendein Markergen kann verwendet werden, welches die Selektion der Transformanten aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind besonders solche, welche antfbiotische Resistenz aufweisen, z. B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder, im Falle von auxotrophen Hefemutanten, Gene, welche die Wirtsläsionen ergänzen. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegenüber dem antibiotischen Cycloheximid oder schaffen Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, z. B. dem ura 3-, leu 2-, his3- oder trp 1 -Gen. Es ist auch möglich, als Marker strukturelle Gene zu verwenden, welche mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist. Von besonderer Wichtigkeit sind Markergene, welche A. niger-Wirtsläsionen ergänzen, wie das argB-Gen, das für die Ornithincarbamoyl-Transferase kodiert, z. B. abgeleitet von A. niger oder A. nidulans (EP 184438) oder A. nidulans •DNA-Fragmente, die dem N.crassa pyr 4-Gen (26) homolog sind.

Bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, worin das Strukturgen, insbesondere das fremde Strukturgen, mit dem Promotor und den Startsequenzen gemäß vorliegender Erfindung wirksam verbunden ist. Solche bevorzugten Hybridvektoren sind z.B. pCG3B11, M13 mp8-PL(Sall-EcoRI)BssHII/BE5,pUBE5, pLHK3, pLHL5 und pLHLT7. Weitere brauchbare Hybridvektoren sind pPL35-5 (vergl. Beispiele una Figuren).

Die DNA der Formel I und deren Derivate einschließlich Fragmente können zum Screenen von DNA-Genbanken oder mRNA für ähnliche DNAs oder mRNAs verwendet werden.

Die Züchtung der Wirte zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls wird in einem üblichen Nährmedium durchgeführt, welches mit chemischen Verbindungen ergänzt oder von solchen befreit ist, welche eine negative oder positive Auswahl der Transformanten, d. h. solchen Wirten, die das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, von den Nichttransformanten, d. h. solchen Wirten, denen das gewünschte DNA-Molekül fehlt, ermöglichen. Irgendweiche transformierbaren Wirte, die auf diesem Gebiet verwendbar sind, z. B. Bakterien, wie E. coli, Pilze, wie Saccharomyces cerevisiae, oder insbesondere Fadenpilze, wie Aspergiilus, z. B. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und insbesondere A. niger, können eingesetzt werden. Ein bevorzugter Wirt ist A. niger An 8, eine neue Mutante, der das pyrA-Gen fehlt, wie im folgenden beschrieben. Die Transformation der Wirte wird nach üblichen Methoden durchgeführt. Die DNA-Sequenz, welche für das PL-Expressionssystem kodiert, wird aus Fadenpilzen erhalten, die ein solches System enthalten, insbesondere aus einer Genbank davon oder auch über die mRNA. Im folgenden ist die Hersteilung des PLI-Expressionssystems detaillierter beschrieben.

Eine Genbank kann hergestellt werden, z. B. durch partiellen Abbau von genomischer DNA eines A. niger-Stamms, z. B. N 756, mit Sau 3Al und Klonen von hochmolekularen DNA-Fragmenten in das E.coli-Plasmid pUN 121. Irgendein anderer A. niger-Stamm, der PLI produziert, kann als Quelle für die Genbank dienen und gleichermaßen können andere geeignete Vektoren als Rezipienten für die Fragmente verwendet werden.

Um die Genbank für DNA-Sequenzen, die für PLI kodieren, erfolgreich zu screenen, war eine Sequenzbestimmung dieses Enzyms oder von Teilen davon notwendig. PLI wurde aus einer handelsüblich erhältlichen Mischung von pektionolytischen Enzymen von A. niger (Ultrazym®, Novo Industries) gereinigt und sequenziert. Der N-Terminus von reifem PLI ergab die Sequenz

V₁-G-V-X₄-G-T₆-P-E-G-F-A,

und ein Fragment von PLI, das durch Spalten der PLI mit Bromcyan erhalten wurde, ergab die N-terminale Sequenz V₁₂₉-S-G-V-S-N-I-I -l-ü-N-kA-V-X,4T-D-l-N-X,47-E,

worin die Aminosäuren X damals nicht identifiziert worden waren.

Basierend auf jenen Aminosäure-Sequenzen wurde elno Anzahl von DNA-Teilstücken, d. h. Mischungen von DNA-Sequenzen, die für Teile der Aminosäure-Sequenzen kodieren und die entsprechenden degenerierten DNA-Sequenzen, chemisch synthetisiert und zum Screenen verwendet. Solche DNA-Teilstücke sind beispielsweise die Mischungen der Formeln

3'TGR₁ GGR₁ CTR, CCR₃ AAR₃ CG 5'(2014) (la)

3'TGR₁QGR₁CTr₂CCR₂AAR₃CGB' (2015) (Ib)

worin R₁ für A, C, G oder T steht, R₂ für C oder T steht und R₃ für A oder G steht, oder DNA-Gemisch 2060 der Formol

5' AAR, ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃ A3' (2060) (I c)

worin R₁ für A oder T steht, R₂ für A, T oder C steht und R₃ für A oder G steht.

Da die Gesamt-DNA-Sequenz des PLI-Gens im Verlauf der vorstehenden Arbeit aufgeklärt wurde, kann irgendein Teil davon mit wenigstens etwa 14 bp zum Screenen verwendet werden, was auch das Screenen für mRNA, welche für das PL-System kodiert, einschließt.

Für Screeningzwecke werden die DNA-Teilstücke nach bekannten Methoden unter Verwendung von Y³²P-ATP- und T4-Kinase 5' radioaktiv markiert. Wirt-Mikroorganismen, die die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als Insert tragen, werden durch Hybridisierung mit dem markierten DNA-Teilstück auf Filtorreplikas der Genbank identifiziert.

Zum Anfertigen einer Unterbank können Klone der Genbank, welche ein radioaktives Ansprechen auf das radioaktiv markierte DNA-Teilstück zeigen, das für den N-terminalen Teil der PLI kodiert, isoliert, kultiviert und mit dem zweiten DNA-Teilstück hybrisiert werden, das für die N-terminalen Aminosäuren des CNBr-Fragments kodiert, wie oben beschrieben.

Klone, weiche eine Hybridisationsreaktion auf eines oder beide DNA-Teilstücke zeigen, werden isoliert und vermehrt.

Beispielsweise ergab das Screenen mit DNA-Teilstücken 2014 und 201533 bzw. 39 positive Klone. Die 72 Klone wurden vermehrt und die erhaltenen Jubgenbanken erneut mit DNA-Teilstücken 2060 gescreent, wodurch drei positive Klone iaentifiziert werden konnten. Ein Klon wurde selektiert und als E.coliBJBiea/gCGSBII bezeichnet. Er enthält Plasmid pCG3B11, wovon eine Teilrestriktionskarte in Fig. 1 gezeigt ist. DasSau3AI-Fragment von pCG3B11 umfaßt das Spel-Nhel-Fragment, das in Fig.4 und Formell gezeigt wird.

Das Plasmid pCG3B11 kann zum Aufbau anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung durch Anwendung üblicher gentechnologischer Methoden verwendet werden.

Beispielsweise führt die Restriktion von pCG3B11 mit EcoRI und Klonen der beiden Fragmente in Plasmid pUN121 zum Plasmid pPL29-5 (Fig. 2), enthaltend den Promotor, die Start-Sequenz und den Teil des Struktur-PLI-Gens bis zur zentralen EcoRI-Restriktionsstelle in Stellung 649/650, und zu Plasmid pPL35-5 (Fig. 3), enthaltend einen Teil des PLI-Strukturgens, beginnend bei Position 650, und den Terminator. pPL29-5 enthält weiterhin die flankierenden N-terminalen Sequenzen und pPL35-5 die flankierenden C-terminalen Sequenzen von pCG3B11.

Fragmente der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35-5 können für das Sequenzieren durch Restriktion mit geeigneten Enzymen,wie Ahalll, Pstl, Aval,Hindill, EcoRI,Kpnl,CIaI, Ncol, Accl, SalI, Pvul, SailI, Nhel, BgI!, EcoRI und EcoRV, erhalten werden. Die Fragmente können subkloniert, z.B. in verschiedene MI3-Phagen, vorzugsweise MI3mp8 und MI3mpl8, und sequenziert werden, z. B. unter Verwendung des MI3-Kloning- und Sequencing Kit (M 13 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den Bedingungen, die vom Hersteller (16) angegeben sind. Die ganze Sequenz des 2.7 kb Spel-Nhel-Fragments, enthaltend die vollständige Sequenz vom PLI-Ger* .st in Fig.4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide der Promotorregion, 1369 Nucleotide des strukturellen Teils des PLI-Gens und ι '61 Nucleotide der Terminatorregion. Der Sequenz von pPL29-5, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Terminus vo·* PLI, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse bestimmt (Beispiel 1), gehen 57 Nucleotide voraus, die für das Signalpeptid der Formel

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A₆₇

kodieren.

Die Aminosäure-Sequenz des N-Terminus des C-terminalen CNBr-Fragments von PLI (Beispiel 3) wird nicht kontinuierlich kodiert durch das geklonte DNA-Fragment von pPL35-5 (Nucleotid 1257-1379). Eine Computeruntersuchung auf Sequenzübereinstimmungen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen [E.Boel et al. (18) und

S. M. Mount (19)1 führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65 bp, bzw. 62 bp bzw. 63 bp bzw. 57 bp (Fig.4) zu postulieren.

Ein Phage, der aus Phagen M13mp8 und dem 0,8kb Sall-EcoRI-Fragment von Plasmid pPL29-5 erhalten wurde, enthaltend 130 Nucleotide des Promotors und des N-terminalen Teils des PLI-Gens, wird mit M13mp8(Sall-EcoRI) bezeichnet und in weiteren Schritten zur Herstellung anderer DNA-Moleküle gemäß der Erfindung verwendet.

Solche anderen DNA-Moleküle gemftß der Erfindung, die Fragmente der DNA-Sequenz der Formel I enthalten, können, wie in den Fig. 5 bis 9 beschrieben, aufgebaut werden, wobei gewünschtenfalls neue Restriktionsstellen eingeführt werden können, z. B. eine BssHII-Restriktionsstelle innerhalb der Start-Sequenz dei PLI-Gens. Solche DNA-Moleküle sind die Plasmide oder Plagen pUBE5, MBrnpe-PUSall-EcoROBssHII/BEö (Fig.5), pLHK3 (Fig.7), pLHL5, MISrnpie-PLISpel-EcoRUBssHII/ACS pi HLT7 (Fig.9), wovon die letzteren drei Plasmide das Strukturgen enthalten, das für Desi'lfatohirudin kodiert. Mutanten, die neue Restriktionsstellen enthalten, können beispielsweise in vitro durch gezielte Mutagenese gemäß üblichen Methoden hergestellt werden (vergl. Review-Artikel von MJ. Zoller und M.Smith, Methods Enzymol. 100,468 (1983|, D.Botstein und D.Shortla, Science 229,1193 [19851 oder K. Norris et al., Nucl. Acids Res. 11,5103 [1983)).

Beispielsweise wird eine Mutante der vorliegenen DNA-Sequenzen vom M13mp8PL(Sal-EcoRI)-Phagen abgeleitet, der don Promotor und das Ausschoidungssignalgen von PLI enthält. Die Einführung einer neuen BssHII-Restriktionsstelle in die Startbzw. Signal-Sequenzregion des M13mp8PL(Sal-EcoRI)-Gens wird unter Verwendung eines chemisch synthetisierten Primer-Oligonucleotids durchgeführt, welches komplementär zu der DNA-Sequenz in Positionen 36-54 ist, die nahe dem Gterminalen Teil der PLI-Signal-Sequenz gelegen ist, mit Ausnahme, daß bei Position 45 eine C/G-Transversion (mutagener Primer) einführt wird.

Der mutierte Phage, der die neuo BssHII-Stelle trägt, wird als M13mp8PL (sal-EcoRI) BssHII bezeichnet und kann zum Aufbau der Expressionsvektoren für homologe oder heterologe Gene verwendet werden.

In einem entsprechenden Beispiel wird das Desulfatohirudin-Gen von pML310 (EP 168342) in den Phagen M13mp18-PL(Spel-EcoR!)BssHII/AC5 (Fig.6 bis 9) rekloniert. Ein Hgal/BssHII-Linker wird aufgebaut, um die Hgal-Restriktionsstelle des Desulfatohirudin-Gens von pML30IL mit der BssHII-Stelle von MIGmpie-PLISpel-EcoRDBssHII/ACo kompatibel zu machen. Die Linker-DNA wird an die gespaltene Phagen-DNA gebunden. Die Phagen-DNA, die das Linkerfragment trägt, wird mit Hindill aufgetrennt, was zv,ei Fragmente ergibt. Das 0,7 kb-Fragment, welches die Signal- bzw. Startstruktur von PLI und das Verbindungsiragment enthält, wird isoliert. Ein geeignetes Replikationsplasmid, das eine BamHI-Restriktionsstello trägt, wie pBR322, wird mit BamHI gespalten. Das zu Monierende Gen wird mit geeigneten Restriktionsenzymen aus der genomischen DNA, Plasmid- oder Phagen-DNA herausgelöst und, falls notwendig, mit den erforderlichen kompatiblen Restriktionsstellen verseilen.

Eine andere Methode, um die Restriktionspunkte kompatibel zu machen, ist die In-vitro-Mutagenese, wie sie beispielsweise beim Aufbau von pML301 L (Fig. 6) durchgeführt wird. Ein Verbindungsstück, enthaltend eine Hgal-Restriktionsstelle, wird hergestellt und an das 5'-terminale Ende dos Desulfatohirudin-Gens geknüpft.

Für höhere Expressionsraten kann irgendeine eukaryotische Terminator-Sequenz mit dem Ende des Strukturgens veiknüptt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Terminatorregion des PL1-Gens verwendet. Beispielsweise kann ein Expressionsvektor, der den Terminatorpunkt von PLI enthält, durch Modifikation des oben beschriebenen Verfahrens in der folgenden Weise erhalten werden. Der Promotor und die Ausscheidungs-Start-Sequenzen werden aus dem Plasmid MiSmpie-PUSpel-EcoRD-BssHII/ACS erhalten. Die Terminatorregion wird aus pPL35-5 erhalten. MiSmpie-PLISpel-EcoRD-BssHÜ/ACS wird mit BssHIII gespalten, und ein BssHII-Hgal-Linker wird angefügt. In einer Modifikation wird Plasmid pPL35-5 mit Pstl gespalten, was zwei Fragmente ergibt, an die wiederum ein geeigneter Linker, der mit dem 3'-Ende des geklonten Gens kompatibel ist, angekoppelt wird. Die „sticky ends" der Pstl-Restriktionsstellen werden durch das Enzym T4-Polymerase aufgefüllt und es wird ein BamHI-Linker zugefügt, der beispielsweise von Biolabs, New England, bezogen werden kann. Das pPL35-5-Plasmid wird mit Nhel gespalten und das sich ergebende 0,7-kb-Fragment, das die Terminatorregion von PLI enthält, wird isoliert. Zur Verbreiterung bzw. Vermehrung kann irgendein Plasmid, das verträgliche Restriktionsstellen besitzt, verwendet werden, z.B. pUC 18. Im Falle von pUC 18 wird das Plasmid mit Hindill und Xbal gespalten. Vier DNA-Fragmonte, das MiSmpie-PLISpel-EcoROBssHII/ÄCB-Fragment, das den BssHII-Hga-l-Linker trägt, das 0,7-kb-Fragment von pPL35-5, das den BamHI-Linker trägt, Hindlll/Xbal-gespaltenes pUC 18 und das Hgal-BamHI-Fragment des Desulfatohirudin-Gens, werden ligiert, um pLHL7zu bilden (Fig.9).

Bakterien werden durch eine übliche Methode transformiert und die Transformanten werden aufgrund ihrer Resistenz, z. B. gegenüber Tetracyclin, identifiziert.

Insbesondere werden die beschriebenen Expressionsvektoren in geeigneten E.coli-Wirtsstämmen, wie HB101, vermehrt, transformiert (10) und nach auf diesem Gebiet üblichen Methoden selektiert. Die vermehrte Plasmid-DNA wird aus den Bakterien durch übliche Methoden, insbesondere wie von Birnboim & DoIy beschrieben (17), isoliert. In ähnlicher Weise können andere Plasmide mit anderen homologen oder heterologen Genen aufgebaut werden. Die In-vitro-Synthese ist besonders anwendbar zur Herstellung von kleineren Fragmenten des PL-Expressionssystems, z. B. der DNA-Sequenzen, welche für den Promotor oder besonders die Start-Sequenz von PLI oder Mutanten davon kodieren. DNA-Moleküle, gemäß der Erfindung hergestellt, die den PLI-Promotor und gegebenenfalls die PLi-Start-Sequenz, das PLI-Strukturgen, irgendein anderes heterologes Strukturgen und/oder den PLI-Terminator enthalten, können auch verwendet werden, um Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, z.B. A. nidulans, A.oryzae. A.carbonarius und insbesondere A. niger, zu transformieren.

Um die Selektion der transformierten von den nichttransformierten Pilzen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder, alternativ, werden die Pilze mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, kotnnsformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegen Verbindungen verleiht, die für den Transformanten toxisch sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten, dem ein solches wesentliches Polypeptid fehlt, ergänzt. Solche Markergene sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- oder argB-Gene.

Innerhalb des Bereichs der Erfindung wurde ein neues Markergen mit dem Namen pyrA aus der Genbank von A. niger isoliert, das mit dem pyrG von A. nidulans und pyr4 von N. crassa verwandt ist und eine ähnliche Funktion hat, nämlich die Erzeugung des Enzyms Orotidin-ö'-phosphat-decarboxylase. Dieses Enzym kate'ysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zum toxischen Fl'ioro-uridin. Ein E.coli-Klon, enthaltend das pyrA-Gen, wurde durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb Hindlll-Fragment von pL JB2 (26), enthaltend einen Teil des pyr4-Gens, identifiziert, jedoch kann DNA von irgendeinem anderen pyr-Gen, das Orotidin-5'-phosphat-decarboxylase kodiert, verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coli B75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7, welches das pyrA-Gen enthält, isoliert und zur Kotransformation einer A. niger pyrA"-Mutante verwendet. Einer solchen pyrA"-Mutante fehlt

dts Orotidin-S'-phosphat-decarboxylase-Gen, und sie ist daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Eine solche Mutante wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N 756 unter mutagener UV-Bestrahlung hergestellt und Kolonien, welche in Anwesenheit von Fluor-Orotsäure und Uridin überloben, werden ausgewählt. Kolonien, weiche in Anwesenheit von Fluororotsäuro und in Abwesenheit von Uridin überleben, werden entfernt. Die verbleibende "Jridin benötigenden Mutanten gehören je nach ihrer Fähigkeit, transformiert zu werden, zu zwei ergänzenden Gruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An 10 repräsentiert werden. Sie werden in Form ihrer Protoplasten unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 behandelt. Es wurde gefunden, daß nur die An8-Kolonien transformiert wurden und das pyra-Gen enthielten, wie dies durch die hybridisierende Fähigkeit von deren abgebauter DNA mit DNA von pUN 121 gezeigt wurde.

Die Erfindung betrifft auch das Selektionsmarker-Plasmid pCG59D7, einen Wirt, der dieses enthält und die pyrA-Mutante A. niger An8 und Verfahren zu deren Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin Wirte, die mit den Hybridvektoren der Erfindung transformiert sind, und Methoden zu ihrer Herstellung. Solche Transformanten sind beispielsweise Bakterien, wie E.coli, oder Fadenpilze, wie Aspergillus, Penicillium oder Cephalosporium, und insbesondere A. nidulans, A.oryzao, A.carbonarius oder vorzugsweise A. niger, z. B. A. niger An8. Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung solcher Transformanten, umfassend die Behandlung eines Wirts unter transformierenden'Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, insbesondere einem Hybrirtvektor gemäß der Erfindung, gegenbenfalls zusammen mit einem Selektionsmarkergen und Selektieren der Transformanten. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der rekombinanten DNAs oder eines Derivats davon zur Herstellung von Hybridvektoren, welche nützliche Polypeptide, z.B. PLI, Desulfatohirudin und clergl., exprimieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode- zur Herstellung von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridvektor der Erfindung in einem geeigneten Wirt exprimiert und das Polypeptid durch übliche Methoden isoliert wird. Diese Methode umfaßt die Übe^rproduktion von PLI in Aspergillus-Arten durch Züchtung eines Aspergillus-Wirts, der mit einem Expressionshybrid-Vektor für die Expression und Sekretion von PLI transformiert wurde, und Sammeln von PLI aus dem Nährmedium.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll anhand von Figuren in Beispielen näher erläutert werden.

Fig. 1: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pCG3B11, enthaltend ein Sau3AI -Fragment des A. niger-Stammes N 756; Fig. 2: zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pPI29-5, enthaltend das N-terminäle EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; Fig. 3: zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pPI35-5, enthaltend das C-terminale EcoRI-Fragment der DNA der Formel I; Fig. 4: zeigt die DNA der Formel (I) mit Angaben einiger Restriktionsstellen und die Start- und Struktur-Aminosäure-Sequenzen

von PLI; Fig. 5: zeigt den Aufbau von pUBE5 aus MISmpe-PLfSall-EcoRD-BssHII/BEB und pUN 121. pUBE.5 enthält einen Teil des

PLI-Promotors, die Start-Sequenz mit dem 3ssHII-Restriktionspunkt und einen Teil des PLI-Strukturgens; Fig.6: zeigt den Aufbau von pML310L, enthaltend das Desulfatohirudin-Gen; Fig. 7: zeigt den Aufbau von pLHK3, enthaltend einen Teil des PLI-Promotors, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle,

den Linker BssHII-Hgal und das Desulfatohirudin-Gen; Fig. 8: zeigt den Aufbau von pLHL5, enthaltend den PLI-Promotor, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle und das

Desulfatohirudin-Gen; und Fig. 9: zeigt den Aufbau von PLHLT7, enthaltend den PLI-Promotor, die Start-Sequenz mit der BssHII-Restriktionsstelle, das Desulfatohirudin-Gen und den PLI-Terminator.

Die in den Anmeldeunterlagen angeführten Literaturstellen sind am Ende der Unterlagen in einem Literaturverzeichnis zusammengefaßt.

In den Beispielen, die zur Erläuterung der Erfindung dienen, sie jedoch in keiner Weise beschränken sollen, haben die Abkürzungen folgende Bedeutungen:

bp	Basenpaare
BSA	Rinderserumalbumin
cpm	Impulse pro Minute (radioaktiver Zerfall)
dATF	2'-Desoxyadenosin-triphosphat
dCTP	2'-Desoxycytidin-triphosphat
dGTP	2'-Desoxyguanosin-triphosphat
dTTP	2'-Desoxythymidin-triphosphat
dNTP	Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP
CIAP	alkalische Phosphatase aus Kalbsdärmen
DNA	Desoxyribonucleinsäure
DTT	1,4-Dithiothreit
EDTA	Ethylendiarrin-tetraessigsäure-dinatriumsalz

h	Stunden
IPTG	Isopropyl-ß-D-thio-galactopyranosid
kb	Kilobasen
min	Minuten
PL	Pektinlyasel
PTH	Phenylthiohydantoin
RF-DMA	Doppelstrang replikative Form von DNA
RNA	Ribonuclelnsäure
rpm	Umdrehungen pro Minute
SDS	Natriumdodecylsulfat
SS	einzelstrangig
RT	Raumtemperatur
Tris	Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA	Transfer-RNA
υ	Einheiter.
MO	Mikrogramm
vo I	Volumen
X-GAL	ö-Brom^-chlor-S-indonyl-ß-galactosid.

Puffer, Medien, Reagenzien

ss-Denhardt: 0,02% Ficoll (Sigma), 0,02%Polyvinylpyrrolidon (Sigma), 0,02% BSA (Sigma), lOOpg/ml denaturierte Lachsspermen-DNA (Sigma)

EcoRI-Puffer: 0,01 M Tris-HCI pH 7,5 0,1 M NaCI

0,01 M MgCI₂ 1 mM 2-Mercaptoethanol

Hgal-Puffer: 5OmM NaCI, 1OmM MgCIj, 1 mM DTT, 100Mg/ml BSA, 6mM Tris-HCI pH 7,4 IPTG: 10OmM Isopropyl-ß-D-thio-galactopyranosid (23,8 mg/ml in H]O)-unmittelbar vor Verwendung herzustellen LB-Meciium: 1 % Bacto-trypton (Difco), 0,5% Bacto-Hefeextrakt (Difco), 17OmM NaCI, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH Verbindungspuffer: 2OmM Tiis-HCI, 1OmM MgCI₂,1OmM Dithioerythrit, 0,6mM ATP, pH 7,6 TBE-Puffer: 11 enthält 10,8 g Tris, 5,5g Borsäure, 4 ml 0,5 M EDTA {pH 8,0)

TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA niedriger TE-Puffer: 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 0,1 mM EDTA Topagar: pro Liter 10g Bacto-trypton, 8g NaCI, 8g Agar

2xTY-Medium: pro Liter 16g Bacto-trypton, 10g Hefeextrakt, 5g NaCi

X-GAL: 2% (5-Brom-4-chlor-3-indonyl-ß-galactosid) in Dimethylformamid - unmittelbar vor Verwendung herzustellen SOC-Medium: 2% Bacto-trypton (Gibco), C,5% Hefeextrakt (Gibco), 1OmM NaCI, 2,5mM KCI, 10 mM MgCI₂,5 mM MgSO₄,20mM Glukose

Kinase-Puffor: 5OmM Tris-HCI, 1OmM MgCI₂,5mM DDT (pH 7,5)

X-gal-Platten: 0,002% X-GaI, 0,07mM IPTG

NET: 0.15M NaCI, 0,015M Tris. HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA

Minimalmedium für E.coli: 0,6% Na₂HPO₄,0,1 % NH₄CI, 0,05% NaCI, 1 mM MgSO₄,0,01 mM CaCI₂,1 mM Thiamin-HCI, 0,2% Glukose

Minimalmedium für A. niger: 1 Liter enthält 6g NaNO₃,0,52g KCI, 0,52g MgSO₄ x 7H₂0,1,52g KH₂PO₄, Spuren an Zn, Fe, 10g Glukose, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH

Komplettmedium für A.niger: Mycophil-Agar (BBL)

PCT: 25% Polyethylenglykol 6000 (Merck, Darmstadt) in 1OmM Tris · HCI (pH 7,5), 5OmM CaCI₂ Sporulationsmedium: 10g/l Phytonpepton, 10g/l Glukose, 10g/l Agar

SSC: 0.15M NaCI,0,015M Natriumeitrat.

Für die Platten werden alle Medien durch Zugabe von 1,5% Bacto-Agar (Difco) verfestigt.

Die folgenden Stämme werden verwendet

E.coli Stamm HB101 :F~,hsdS20 (r~_Bm-B),recA13,ara 14, proA2,lacY1,galK2,rpsL20(str^R),xyl-5, mtl-1,supE44,\~(Maniatis et

E.coli Stamm BJ5183: F", endA, sbcB", recBC", galK, met", str^R, thi-1, bioT, hsdR(r_k, i%⁺), λ (Hanahan [10]) E.coli Stamm JM101: supE, thi, A(lac-proAB), (F',traD36, proAB,lac19ZAM 15) ,Yanish-Perron et al. [25]) Aspergillus niger Stamm N 756: Det A. niger Stamm N756 wurde ausgewählt wegen der hohen Produktion von pektinolytischen Komplexen2ymen.

Die folgenden Vektoren werden verwendet

M13mp-Phage

Die M 13mp8,9,18,19-Vektoren (28) sind Derivate des Einzelstrlang-DNA-Bakteriophagen M13 und werden benutzt, um die DNA-Sequenzierung zu erpichtem, indem das Klonen der DNA-Fragmente an einer anpassungsfähigen Polylinkerotelie und das Klonen des gleichen Restriktionsfragments in beiden möglichen Richtungen ermöglicht wird. Sequenzen, die in diese Vektoren geklont sind, können leicht als Vorlage für sequenzierende Reaktionen oder die Produktion von Einzelstrang-Teilstücken unter Verwendung eines Standard-Oligodesoxyribonucleotid-Primers und des Klenow-Fragments von E.coli DNA-Polymerase I verwendet werden. Die Vektor DNA trägt den E. coli lac-Operon-Promotor und die genetische Information der ersten 145 Aminosäuren dor ß-Galactosidase. Die Polyverbindungssequenzen, die mehrere Restriktionsstellen enthalten, werden in die lacZ-Sequenz eingeschoben. Die Polylinkersequenz behält den lacZ-Ableserahmen und der Vektor ergibt eine allele Komplementation eines LacZa-Wirtsstamms und gibt blaue Plaques auf Platten, die IPTG und X-gal enthalten. Rekombinate Phagen, welche inserts enthalten, die den Ableserahmen zerstören oder anderweitig mit der Expression des lacZa-Poptids interferieren, v/erden als farblose Plaques gefunden.

pUC18-Plasmid

Das pUC 18-Plasmid (28) kann zum Klonen der DNA-Sequenzen in dar lacZa-Region verwendet werden und liefert den Nachweis für Transformanten, weiche rekombinante Pl jsmlde auf Basis ihres Lac-Phänotyps enthalten. Die Bakterien, welche die Plasmide aufgenommen haben, ohne daß sie eingefügt wurden, ergeben blaue Kolonien auf Indikatorplatten (Platten mit X-gal), während solche, welche rekombinante Plasmide aufgenommen haben, weiße Kolonien ergeben. Plasmid pUC 18 enthält bestimmte Klonierungsstellen in der lacZa-Region, komplementär zu denen des M 13mp 18-Phsgen. Das Plasmid trägt ein Gen für amp®.

pML310Plasmld

pML310 Lt in der europäischen Patentanmeldung 0168342 beschrieben, pML310 wird durch amp®, den trp-Promoter und ein Gen, das für Desulfatohirudin kodiert, einen Thrombin-Inhibitor, der in der Natur in Blutegeln vorkommt, charakterisiert.

pUN121-Plasmid

Plasmid pUN 121 [Nilbson et al. (9)] kar.n als Monierender Vektor verwendet werden, der eine positive Selektion von Transformanten erlaubt, die Plasmide mit DNA-Einschüben aufnehmen. Das Plasmid enthält das cl-Gen des Bakteriophagen lambda und das tet-.Gen. Bakterien, die pUN 121 aufgenommen haben, sind für Tetracyclin empfindlich, da das tet-Gen von dem rechten Promotor des Bakteriophagen lambda transkribiert wird, und dieser Promotor kann durch den cl-kodierten Rep ressor unterdrückt werden. Der Einschub der DNA-Fragmente in eine der Restriktionsstellen des cl-Gens inaktiviert das Reprer.sorgen und liefert Tetracyr.lin-resistente Transformanten. Außerdem hat das Plasmid pUN 121 ein funktionelles amp-Gen, so el aß eine Vermehrung der Plasmid DNA unter selektiven Bedingungen durchgeführt werden kann.

pBR322-Plasmld

Das Plasmid pBR322 trägt Gene für die Resistenz gegenüber den Antibiotika Ampicillin (amp®) und Tetracyclin (tat*). Das Plasmid trägt mehrere günstige Klonierungsstellen, wovon einige entweder in dem amp- oder tet-Gen lokalisiert sind, so daß der Einschub von geklönter DNA zu antibiotisch empfindlichen Bakterien führt.

pDJB2-Placmld

Dieses Plasmid wurde von Ballance und Turner beschrieben (26). Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von Pektinlyase I Beispiel 1.1 Aminosäure-Sequenzbestimmung des N-terminalen Abschnitts der Pektintyase I Pektinlyase I wird gereinigt von Ultrazym* (ein Gemisch von pektinolytischen Enzymen, erhalten von A. niger, Novo Industries, Kopenhagen) in Analogie zu der von F. E. A. van Houdenhoven (1) beschriebenen Methode. 2 mg Pektinlyase I werden gegen

mehrere Liter destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Das Protein wird in 1,5 ml 10OmM NaHCO₃, pH 10,0gelöst und 3 h bei Raumtemperatur gehalten. Diese Behandlung verursacht die Erhöhung der Anzahl der Stufen, die zuverlässigdurch die automatische Edman-Abbaumethode (2) sequenziert werden können. Nach der alkalischen Behandlung wird das

Protein gigen 11 destilliertes Wasser, 1 % Ameisensäure und anschließend destilliertes Wasser dialysiert. Der automatische Edman-Abbau wird in einem Beckman spinning-cupsequenator, Modell 890C, durchgeführt. Das intakte, reduzierte und

carboxymethylierte Protein wird unter Verwendung eines Quadrol Einzelspaltungsprogramms (Modifikation des Beckman·

Programms 072172 C) abgebaut. Der Abbau des Peptids wird unter Verwendung eines Dimethylbenzylamin-Einzel- Spaltungsprogramms (Beckman Programm 082773) oder nach dem Programm von Hunkapiller und Hood durchgeführt. Um das Auswaschen des Peptids zu verhindern, werden 2,5mg Dorsch-Parvalbumin als Träger verwendet (3). Phenylthiohydantoin- Derivate der Aminosäuren werden durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatogiaphie gemäß der Methode von Frank und Strubert (4) identifiziert. Die folgende, N-terminale Aminosäure-Sequenz wird für die Pektinlyase I bestimmt:

V-G-V-X₄-G-T-P-E-G-F-A Aminosäure X₄ ist sehr wahrscheinlich Sarin, jedoch wurde seine Anwesenheit nicht zweifelsfrei festgestellt.

Beispiel 1.2 Herstellung von Cvanbromid-Fragmenten von Pektinlyase I Die Reduktion und S-Carboxymethylierung von Pektinlyase I wird nach Crestfield et al. (5) durchgt 'ührt. 3g Harnstoff (ultrarein) W6rden in 5ml destilliertem Wasser gelöst und mit 0,5g eines Mischbett-Ionenaustauschers (Bio:ad Ag 50 1-X8) während 1 h

gerührt. Nach Entfernen der lonenaustauscher-Kügelchen werden 10mg EDTA und 200mg Tris. j 4mi der Harnstofflösunggegeben und das pH wird mit HCI auf 8,5 eingestellt. Die Lösung wird auf ein Endvolumen von 5ml ir, einem Fläschchen mitdestilliertem Wasser aufgefüllt. Dann werden 5 bis 20mg Pektinlyase I, die gemäß F. E. A. van Houdenhoven (1) gereinigt wird,zugesetzt, und das Fläschchan wird unier einem Stickstoffmantel gehalten.

Schließlich werden 33μΙ ß-Mercaptoethanol zugesetzt und die Reduktion 4h bei Raumtemperatur unter einem Stickstoffmantel

fortgesetzt. 0,33 ml einer frisch hergestellten Lösung (0,268g Jodessigsäure in 1ml 1 N NaOH) werden unter Stickstoff zu dem

Reaktionsgemisch gegeben und das Gemisch 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten. Die Reaktion wird durch Zugabe von ß-Mei captopthanol gestoppt. Anschließend wird das carboxymethylierte Protei ι auf eine SephadexG-25-Gelfiltrationssäule (100 ml Bettvolumen) aufgebracht, welcha mit einer Aluminiumfolie umwickelt ist, und mit

0,5% Ameisensäure eluiert. Die Proteinfraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.

Die carboxymethylierte Pektlnlyase I (2~10mg) wird in 70%iger Ameisensäure gelöst, und festes Bromcyan wird in dem etwa lOOfachen molaren Überschuß zu Methionin gegeben, wovon 1 Rest pro Pektinlyase I auftritt. Das Reaktionsgemisch wird kontinuierlich während 24hr» bei Raumtemperatur in einem geschlodsenen Reaktionsgefäß gerührt. Proben von 5μΙ werden in regelmäßigen Zeitabständen abgezogen und auf 15% SDS-PAGE analysiert, um das Ausmaß der Proteinspaltung zu kontrollieren. Nach 24hrs wird Wasser zugesetzt und das Präparat teilweise durch Spülung mit Stickstoff eingedampft. Dieser Schritt wird zur En nung der Ameisensäure wiederholt.

Durch die SDS-PAC Xnaiyse werden neben etwas restlicher Pektinlyase I zwei Bromcyan-Peptide, CBI und CBII, mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16,5kD und 3OkD identifiziert. Die Reinigung dieser Fragmente wird durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung einer Sephacryl-S200-Säule (Länge 190cm, Durchmesser 1 cm), die in 2OmM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, äquilibriert is·., 10OmM NaCI, 4 M Harnstoff und 1 % (Vol./Vol.) ß-Merci.ptoethanol durchgeführt. Das CBII-Fragment erscheint in zwei Peaks, wobei ein Peak sogar vor dem restlichen, intakten Protein eluiert wird, welches daher ein Aggregat darstellen muß, und ein anderer Peak zwischen dem intakten Protein und dem kleinen CBI-Fragment.

Beispiel 1.3

Aminosäuresequenz-Bestimmung des N-terminalen Abschnitts von CBII der Pektinlyase I 200Mg des gereinigten, nichtaggregierten CBII-Fragments von Beispiel 1.2 werden für den automatischen Rdman-Abbau (2) unter Verwendung eines Beckman spinning-cup sequenators eingesetzt. Die Umwandlung in die PTH-Aminosäuren wird nach Eindampfen der Fraktionen und Zugabe von 200|il 2 N HCI in Methanol zum Rückstand während 15min bei 65⁰C durchgeführt.

Die Lösung wird dann erneut eingedampft und der Rückstand in 50 μΙ THF/CHaCN (1 /1) aufgenommen. Die PTH-Aminosäuren werden durch HPLC unter Vervendung einer Zorbax CN^e-Säule (DuPont) nach R. Knecht et al. (6) identifiziert.

Die N-terminale Aminosäure-Sequenz von CBII ist die folgende:

V-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X₁₆-D-I-N-X-X₁₉-E X]6 und Xi9 s^:nd Aminosäurereste, die nicht identifizib.'t wurden.

Beispiel 2

Erstellung einer Genbank von Aspergillus niger

Beispiel 2.1

Isolierung von hochmolekularer DNA aus Aspergillus niger

Die Isolierung von hochmolekularer A. niger-DNA wird nach Yelton et al. (7) durchneführt. Konidiosporen eines A. niger Stamms N 756 werden in 200 ml Minimalmedium, enthaltend 0,1 % Arginin, beimpft und in 500-ml-Kolben mit einem seitlichen Einstich bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine während 2 bis 3 Tagen geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtrieren geerdet, mit kaltem, sterilem Wasser gewaschen, gefroren und in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die Zellen werden rasch in 20 ml 50 mM EDTA, pH 8,5,0,2% SDS und 20μΙ Diethylpyrocarbonat suspendiert und durch kräftiges Schütteln während 1 min bei Raumtemperatur lysiert. Das Lysat wird 15min auf 68⁰C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und 15min bei 12000g bei RT zentrifugiert. 16ml des Llbe^ipnds werden in ein neues Rohr überführt und nach Zugabe von 1 ml8M Kaliumacetat, pH 4,2,1h auf Eis belassen. Der Niederschlag wird bei 25000 g während 15min bei 4⁰C zentrifugiert. 12ml dieses Überstands werden gewonnen, und die Nucleinsäuren werden mit 12ml Isopropanol ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren während 1,5min bei 12000g pelletiert und die Kügelchen werden erneut in 2ml TE suspendiert, enthaltend 10Mg/ml RNAseA (Boehringer, Mannheim). Die DNA-Fragmente werden mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol wie von Maniatis et al.

(8) auf den Seiten 458-459 und 461-462 beschrieben gefällt.

Beispiel 2.2

Klor en von hochmolekularen DNA-Fragmenten aus Aspergillus niger in pUN 121 Die hochmolekulare DNA von Beispiel 2.1 (100Mg) wird durch Zentrifugieren gefällt und das Kügelchen wird erneu* in 750 μΙ Puffei, bestehend aus Tris-HCI 6mMol/l, NaCI 50mMol/l, MgCI₂ 6mMol/l, pH 7,5, suspendiert.

Partielle Verdauungen werden während 60min bei 37°C mit Sau 3Al durchgeführt, wobei die Konzentrationen im Bereich von 0,25-0,01 U/Mg liegen. Die Reaktionen werdon durch Zugabe von EDTA zu den Endkonzentrationen von 20mM beendet.

Die teilweise abgebauten DNA-Fragmente werden auf einem 0,45% Agarosegel getrennt. Lambda DNA, die mit Hindill abgebaut ist, wird als Marker verwendet, um die Größe der teilweise abgebauten DNA-Fragmente zu bestimmen. Die Gelregion, welche die gewünschten Fragmente im Bereich von 15kb bis 20kb enthält, wird ausgeschnitten und in d< s Probengefäß eines ISCO elektrophorctischen Konzentrators (ISCO GmbH) überführt, mit 0,1 TBE bedeckt und 90min bei 1 vVatt elektroeluiert. Die DNA-Fragmente werden mit Chloroform/Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.

4 pg der teilweise verdauton DNA-Fragmente werden erneut in Wasser suspendiert und 15h bei 15°C an I pg pUN121 Plasmid DNA (Nilsson et al. [91), linearisiert mit Bell, in einem Gesamtvolumen von Ί06μΙ Ligationspuffer mit 6U T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) ligiert.

10 μΙ aliquote Anteile dieses Gemisches werden zu 210 μΙ kompetenten E. coli BJ 5183-Zellen gegeben, welche zur Transformation, wie in Honahan (10) beschrieben, hergestellt worden waren. Die Zellen werden 30min auf Eis gehalten und 90s auf 42⁰C erwärmt, 2 min auf Eis zurückgestellt, 800μΙ SOC-Medium werden zugesetzt, und die Zellen werden 1 h bei 37⁰C inkubiert. Die Zellen werden auf lOcm-Agarplatten ausgestrichen, die LB-Medium, ergänzt mit 8 mg/1 Tetracyclin (Sigma), enthalten. Die Platten werden 16hrs. bei 37⁰C inkubiert. Etwa 6000 transformierte Kolonien werden erhalten, die durch ihre Tetracyclin-Resistenz charakterisiert smd. Die Effizienz beträgt etwa 12000 bis 20000 tetracyclinresistenter Kolonien pro Mg PUN121DNA.

Die Plasmid-Analysa von 11 willkürlich ausgewählten, rekombinanten Klonen zeigt einen mittleren DNA-Insert von 10kb. Um das Genom von A. niger (4,5 x 10⁷ bp) in der Genbf nk fast 4fach darzustellen, werden 15360 tetracyclinresistente Kolonien aufgenommen und über Nacht in den Vertiefur gen von Mikrotiterplatten in.LB-Medium, ergänzt mit 8mg/l Tetracyclin, gezüchtet. Nach der Inkubation wird Glycerin ? jf 50% Vol./Vol. zugesetzt, und die Mikiotiterpiatten werden bei -70⁰C gelagert.

Beispiel 3 Screening der genomischen Karte von A, nlge? auf PLI verwandle Nucleinsäuren Beispiel 3.1 Herstellung von Fllterrepllkas der Genbank Zur Isolierung des Pektinlyase I-Gens aus der DNA-Bank, die gemäß Beispiel 2.2 erhalten wurdo, werden Filterreplikas von den

15 360 ausgewählten, transformierten E. coli BJ 5183-Zallen nach der ν on Gergen et al. (11) beschriebenen Methode gemacht. Die

Zellen wurden aus den Mikrotiterplatten auf Agarplatten, die mit 8mg/l Tetracyclin ergänzt wurden, mittels der Stempeltechnik

überführt ur.d über Nacht bei 37 "C gezüchtet. Wie üblich geschnittene Whatman 541 Filterpapiere (114mm χ 175mm/192 Klone)werden auf die Kolonien gegeben. Nach 2 h bei 37⁰C werden die Filter auf LB-Platten, welche 250mg/ml Chloramphenicol (Sigma, St.

Louis, USA) enthalten, überführt und über Nacht bei 37⁰C bebrütet. Die Filter werdrtn zwoimal in 0,5M NaOH, zweimal in 0,5M Tris-HCI, pH 7,4, und zweimal in SSC gewaschen und luftgetrocknet. Die Filterreplikas können für mehrere Hybridisierungsversuche

verwendet werden, wobei vorhor jedesmal die oben erwähnten Waschstufen durchgeführt werden.

Beispiel 3.2 Synthese von Oligonucleotid-Mischungen

Die Oligonucleotide zum Screenen der DNA-Bank A. niger, erhalten gemäß Beispiel 2.2, werdon gemäß der Aminosäure-Sequenz, bestimmt in den Beispielen 1.1 und 1.3, synthetisiert unter Verwendung der Phosphoramidit-Methode (M H. Caruthers [12]) mit einem angewandten Biosystem (Modell 380 BJ-Oligonuclaotid-Synthesiier.

Synthese eines Ollgonucleotlds, des für den N-terrr'naler Abschnitt der Pektinlyase I von Ar^ertjülus nlger kodiert Das Oligonucleotid, das für den N-terminalen Abschnitt des Pektinlyase I-Proteins kodiert, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung, wie in Beispiel 1.1 bestimmt, synthetisiert. Aufgrund der genetischen Degeneration sind 256 Oligonucleotide erforderlich, um alle Möglichkeiten zu erfassen.

Zwei getrennte Mischungen von Oligonucleotiden werden chemisch synthetisiert, da es aus technischen Gründen erforderlich ist, die Anzahl der Nucleotide in dem Gemisch zu verhindern. Beide enthalten 128 verschiedene Oligonucleotide, wobei jedes ein komplementärer Strang derjenigen Stränge ist, die für die Aminosäure-Sequenz T₆-P-E-G-F-An kodieren. Im folgenden worden sie .ils Mischung 2014 und 2015 bezeichnet und bestehen aus Oligonucleotiden wie folgt:

Mischung 2014 3TGR₁ GGR₁CTR₂ CCR₃ AAR₃ CG5' Mischung 2015 3'TGfI₁ GGR₁ CTR₂ CCR₂ AAR₃ CG6'

worin R, für A, C, G oder T stehi, R₂ für C oder T steht und R₃ für A oder G steht.

Beispiel 3.2.2

Synthese eines Ollgonucleotids, das den N-terminalen Abschnitt des C-termlnalen Fragments des CNBr-zersetzten Pektinlyase I-Protelns kodiert Das Oligonucleotid, das für d< η N-termina!en Abschnitt des C-terminalen Fragments des CNBr-zersetzten Pektinlyase I-Proteins

kodiert, wird in bezug auf seine Aminosäure-Zusammensetzung synthetisiert, wie in Beispiel 1.3 angegi/ben. Ein Gemisch von108 Oligonucleotiden wird synthetisiert, das aus komplementären Strängen zu denjenigen Strängen besteht, die für die

Aminosäure-Sequenz N₁₃₄-I-M-Q₁₃₈ kodieren, urd das aus Oligonucleotiden wie folgt zusammengesetzt ist; Gemisch 2060 5'AAR₁ATR₂ ATR₂ ATR₂ CAR₃ A 3'

worin R₁ = C oder T, R₂ = A, T oder C und R₃ = A oder G sind.

Beispiel 3.2.3

"P-Marklerung der Oligonucleottd-Mlschungen

67pMol der jeweiligen Oligonucleotid-Mischungen 2014,2015 und 2060 der Beispiele 3.2.1 und 3.2.2 werden b-mdrkiert unter

Verwendung von COpMoI [V³²P]ATP (Amersham, Buckinghamshire, England, 500CCi/mMol). Die Bebrütung wird bei 37°C mit

150 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (New England, Nuclear) in 500μI Kinasepuffer durchgeführt. Die Bindungsreaktion desradioaktiv markierten ATP an die Oligonucleotide wird ermittelt, indem man aliquote Anteile der Reaktionsmischungen an 20%

Polyacrylamidgel laufen läßt und anschließend autoradiographiert. Beispiel 3.3 Screening der Genbank mit radioaktiv markierten Oligonucleotid-Gemischen 2:014 und 2015 Das Screening der Genbank wurde durch die Hybridisierung mit den radioaktiv markierten Oligonucleotid-Mischungen 2014

und 2015 des Beispiels 3.2.1 durchgeführt. Partien von 20 Filterreplikas der Genb&nk (Beispiel 3.1) werden in 6 χ NETbefeuchtetund in 200ml 6 χ NET, 1 χ ss Denhardt, 0,1% SDS bei 49,3°C während 4h vorhybridisiert. Dann werden 67pMol der radioaktivmarkierten Oligonucleotid-Mischung 2014 zugesetzt und die Hybridisierungen über Nacht bei 49,3⁰C durchgeführt. Das gleiche

Verfahren wird unter Verwendung der radioaktiv markierten Oligonuclpotid-Mischung 2015 durchgeführt. Die Filter werden

zweimal während 5min in 2 x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur, zweimal 1 h lang in 2 x SSC 0,1%SDSbei49,3°Cundeinmal während 2h in 0,2 χ SSC, 0,5% SDS bei 49,3⁰C gewaschen. Die Filter werden luftgetro^knet und 3 Tage unter

Verwendung von KODAK X-omat SO282-Filmen autoradiogrsphiert.

rV.it der Oligonucleotid-Mischung 2014 werden 33 Klone und mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 werden 39 Klone gefunden,welche eine ziemlich starke Hybi idisationsantwort geben. Um eine Subbank zu erstellen, werden die 72 Klone in einer neutn

Mikrotiter-Platte gezüchtet u.id auf Whatman 541 Filter gemäß Beispiel 3.1 übertragen. Zwei FMtei replikas der Subbank werden

mit beiden Teilstücken individuell hybridisiert, gewaschen und autoradiograph'iert. Mit der Oligonucleotid-Mischung 2014hybridisieren nur die Klone, welche durch Hybridisierung mit der Oligonucleotid-Mischung 2014 erhalten wurden. In gleicher

Weise hybridisieren mit der Oligonucleotid-Mischung 2015 f'ir die Klone, welche durch Hybridicierung mit der Oligonucloutid-Mischung 2'J15 erhalten wurden.

Beispiel 3.4 Screening der Subbank mit der Oligonucleotid-Mischung 2060

Die Filterreplikas der Subbonk (72 Klone), die in Beispiel 3.3 erhalten wurde, werden in β χ NET befeuchtet und 4h in 15ml 6 χ NET.1 χ ss-Denhardt, 0,1% SDS bei 32⁰C vorhybridisiert. 8 pMol der Oligonucleo'id-Mischung 2060, die wie in Beispiel 3.2.3 beschrieben radioaktiv markiert ist, werden zugesetzt, und die Hybridisierung wird über Nacht bei 32°C durchgeführt. Die Filter werden zweimalwährend0minjeweilsin2 χ SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur, zweimal für 1h jeweils in 2 χ SSC,0,1%SDS bei 32⁰C und einmal für 2 h in 0,2 χ SSC, 0,5% SD^C bei 32°C gewaschen. Die Filter werden luftgetrocknet und während 3 Tagen unter Verwendung von KODAK X-omat SO 282-FiIr, ,£·. autoradiographiert. 3 positive Klone werden gefunden, welche alle zu der Gruppe gehören, die mit dem 2014-Abschnitt, wie in Beispiel 9 beschrieben, hybridisieren; ein Klon wird als E. coli BJ 5183/ pCG3B11 (kurz 3 B11) bezeichnet.

Beispiel 4

Isolierung des Plasmlds pCG3B11 und Restriktionsanalyse demselben

Vom Klon 3 B11, der gemäß Beispiel 3.4 erhalten wurde, werden große Plasmidpräparate (14) hergestellt.

Das entsprechende Plasmid, mit pCG3 B11 bezeichnet, wild d uch vollständige Restriktionsverdauung mit Hindill, EcoRI und Pstl (alle Boehringer, Mannheim) analysiert und der elektrophonischen Trennung über 1 % Agarosegel (Fig. 1) unterworfen.

Beispiel 5

Subklonon der EcoRI-Fragmente von pCG3B11, enthaltend die N-termlnalen und C-termlnalen Fraktionen des Pektlnlyase ! Gens

Beispiel 5.1

Isolierung der Sau 3 Al-Fragmente von pCG3B11 und Einblndung In die M13 DNA ^Λ μg des Plasmids pGC3B11 (Beispiel 4) wird bis zur Vollständigkeit mit 18 Einheiten Restriktions-Endonuklease Sau 3Al (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ 10mMol/lTris-HCI, 75mMol/l NaCI, 10mMol/l MgCI₂, pH 7,2, während 1 h bei 37°C abgebaut. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 2OmM beendet. Die DNA-Fragmente werden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 20 μΙ TE-Puffer wiedergelöst. 100 ng.der Sau 3ΑΙ-verdauten DNA werden an 20ng M 13mp8-Phagen-DNA (15), die durch BamHi-Verdauung (Boehringer, Mannheim) linearisiert ist, ligiert. Die Bindung wird 4h bei 15°C mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 10μΙ Ligationspuffer durchgeführt. Empfindliche E. coli JM101-Zellen werden in 5OmM CaCI₂ in Übereinstimmung mit dem Amersham handbook (16), S.25, hergestellt. 0,3ml aliquote Anteile der empfindlichen JM101 -Zellen werden in 15ml sterile Kulturgefäße auf Eis übertragen. 5μΙ der gebundenen Phagen-DNA werden jedem Gefäß zugesetzt. Die Mischungen werden 40min auf Eis gehalten. Die Zellen werden 3min bei 42⁰C einem Hitzeschock unterworfen und die Gefäße in das Eisbad zurückgegeben. Für jedes Gefäß werden die folgenden Mischungen hergestellt: 40μΙ IPTG 10OmM, 40μΙ X-gal 2% in Dimethylformamid und 200μΙ E. coli JM 101-Zellen aus einer frischen, in exponentiell Wachstumsphase befindlichen Kultur. 270μΙ dieses Gemisches werden jedem Gefäß, das die hitzegeschockten E. coli JM 101-Zellen enthält, zugesetzt. 3 ml verflüssigter Topagar (bei 42°C gehalten) werden jedem Gefäß zugesetzt, und der Inhalt der Gefäße wird auf Agarplatten gegossen. Die Platten werden umgekehrt bei 37⁰C über Nacht bebrütet.

Beispiel 5.2

Screening der rekombinanten Phagen mit dem Oligonucleotid-Teilstück 2060

E. coli JM101, transformiert mit der rekombinanten Phagen-DNA, zeigen weiße Plaques auf den X-gal enthaltenden Agarplatten von Beispiel 5.1.384 davon werden aufgenommen und individuell bei37°Cin 1,5ml 2 χ TY-Medium, beimpft mit 15μΙ exponentiell wachsenden E. coli JM101-Zellen, wachsengelassen. Nach 6h werden die 384 Kulturen 5min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert und und die Phagenüberstände bei 4°C aufbewahrt. Jeweils ΙΟΟμΙ der 384 Überstände werden auf vier Gen-Screen-Membranen (New cngland Nuclear) unter Verwendung einer BioDot-Vorrichtung mit 96 Schlitzen (BioRad) übertragen. Die Membranen werden 5min in 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI und 5min in 3 M NaCI, 1M Tris-HCI, pH 5,6, eingeweicht, an der Luft getrocknet unr* 2 h im Vakuum bei 80°C gebacken. Schließlich werden die vier Membranen vorhybridisiert, mit der Oligonucleotid-Mischung 2060, die wie in Beispiel 8 beschrieben, radioaktiv markiert ist, hybridisiert, gewaschen und gemäß Beispiel 3.4 autoradiographiert. Aus dem Bindungsversuch des Beispiels 5.1 wird ein positiver, rekombinanter Phage für die weitere Analyse, bezeichnet als mp8-3 A, ausgewählt.

Beispiel 5.3

Sequenzanalyse des rekombinanten mp8-3A-Fhagen

Der Überstand, enthaltend den Phagen mρ8-3A, erhalten gemäl Beispiel 5.2, wird zur Herstellung einer einzelstrangigen und replikativen Fo; in DNA (RF-DNA), wie im Amersham handbook (16) auf S. 18-27 beschrieben, verwendet. Die einzplstrangigen Templates (Vorlagen) werden unter Verwendung der Ketten-Terminator-Methode, beschrieben im Amersham handbook auf den Seiten 30-35, sequenziert. Es stellt sich heraus, daß der Phage das 574 bp Sau 3 Al-Fragment mit der vorhersagten Nucleotid-Sequenz des Oligonucleotid-Teilstücks 2060 in Position 584 bis 59S enthält.

Beispiel 5.4

Identifizierung der N-terminalen und C-terminalen EcoRI-Fragmente des Pektinlyase I-Gens Die sequanzierte EcoRI-Restriktionsstelle des Phagen mp8-3A (Beispiel 5.3) wird verwendet, um zwei EcoRi-Fragmente, einen mit einem Gehalt des C-terminalen Teils des die Terminator-Region umfassenden PLI-Gens, und einen mit einem Gehalt des N-termi.ialen Teils des die Promoter-Region umfassenden Gens, zu identifizieren und zu subklonieren. Es werden die folgenden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, synthetisiert.

Oligonuclaotid 6052: B'TGGATGATGATGTTGGAGACS' beginnt bei Position 697,5' zu dem zentralen EcoRI-Punkt in Position 649/650, und erstreckt sich bis Position 577 (Komplementärstrang).

Ollgonucleotid 5066:5'AGGTCCAGuACAACACCTACa' beginnt bei Position 1020,3' zur zentralen EcoRI-Stelte und erstreckt sich bis Position 1039.

Die Oligonucleotid-Mischungen 5052 und 5066 werden gemäß Beispiel 3.3 radioaktiv markiert.

1μg der Plasmid-pCG 3B11 (Beispiel 11 )-DNA wird mit EcoPI (Boehringer, Mannheim) vollständig abgebaut und die Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gel getrennt. Die DNA-Fragmonte werden auf eine Gene Screen membrane (New England Nuclear), wie vom Lieferanten auf S. 383-386 beschrieben, aufgetragen und die Membranen mit radioaktiv markierten Teilstücken der Oligonucleotide 5052 und 5066, wie von Maniatis et al. (8), S.387-389 beschrieben, hybridisiert. Das Teilstück 506C hybridisiert mit einem 3,5 kb EcoRI-Fragment welches den C-terminalen Abschnitt und die Terminator-Region des PLI-Gens enthält. Das Teilstück 5052 hybridisiert mit einem 2,9kb EcoRI-Fragment, das den N-Terminus und die Promotor-Region des Gens enthält.

Beispiel 5.5

Aufbau von pPL29-5 und pPL35-5 durch Reklonen der EcoRI-Fragmente von pCG3 B111n pUN 121 4,5pg der gemäß Beispiel 4 erhaltnnen Plasmid pCG3B11-DNA werden mit 50 Einheiten EcoRI (Boehringer, Mannheim) in 50μΙ 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5,0,1 M NaCI 0,01 M MgCI₂,1 mM Mercaptoethanol während 2h bei 37⁰C bebrütet. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-Gul abgetrennt, die das 2,9kb-Fragment und das 3,5kb-Fragment enthaltenden Gelscheiben werden gemäß Beispiel 5 eluiert und die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Niederschläge werden erneut in 40μΙ niedrigem TE-Puffer suspendiert, und 10 μΙ dieser Lösung werden an lOOngpUN 121 (9), linearisiert durch EcoRI-Abbau, gebunden. Die Ligierung wird 4h bei 15⁰C mit 5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) in 35,5μΙ 2OmMoITris-HCI, 1 mMol EDTA, 5mMol Dithioerythrit, 6OmMoI KCI, 50% Glycerin, pH 7,6, durchgeführt.

17,5μΙ aliquotor Anteile dieser Mischung werden getrennt zu 200μΙ der empfindlichen E. coli HEt 101-Zellen gegeben, welche zur Transformation durch Behandlung mit Calciumchlorid, wie von Maniatis et al. (8), S. 250, beschrieben, hergestellt worden waren.

Die Mischungen werden 30min auf Eis gehalten und 2min auf 42°C erwärmt, dann mit 1 ml SOC-Medium verdünnt und 1 h bei 37"C bebrütet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 2000g währond 5min gesammelt. Jedes Zellkügelchen wird in 600μΙ SOC-Medium resuppendiert und auf drei Agarplatten mit einem Gehalt des LB-Mediums, ergänzt mit 8 mg/l Tetracyclin, ausgestrichen. Die Platten werden 16h bei 37°C bebrütet.

Die Plasmide von 6 rekombinanten tet^R-Klonen werden von jeder Transformation durch die Methode von Birnboim & DoIy (17) isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon, der das 2,9kb EcoRI-Fragment von pCG 3B11 enthält, wird für die weitere Analyse ausgewählt und als pPL29-5 (Fig.3) bezeichnet. Ein anderer Klon, enthaltend das 3,5kB EcoRI-Fragment von pCG3B11, wird ausgewählt und als pPL35-5 (Fig.3) bezeichnet.

Beispiel 6

Sequenzanalyse des Pektinlyase I-Gens

Die DNA von pPL29-5 (Beispiel 5.5) enthaltend den N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens und die DNA von pPL35-5 (Beispiel 5.5) enthaltend den C-terminalen Abschnitts des PLI-Gens werden, wie von Humphreys ot al. (14) beschrieben, isoliert. Tsile der Inserts der Plasmide pPL29-5 und pPL35-5 werden durch Restriktion mit geeigneten Enzymen erhallen. Die Fragmente werden in M13 mp8 und M13 mp 18 subkloniert und unter Verwendung des M 13-Cloning and Sequencing Kit (M 15 Sequencing Kit N.4502, Amersham) unter den vom Lieferanten (16) angegebenen Bedingungen sequenziert.

Die gesamte Sequenz des 2,7 kb Spel-Nhel-Fragments, umfassend die vollständige Sequenz des PLI-Gens, ist in Fig.4 dargestellt. Sie umfaßt 688 Nucleotide der Promotor-Region, 1369 Reste des Strukturteils des PLI-Gens nnd 660 Nucleotide der Terminator-Region.

Der Sequenz von PLI, entsprechend der Aminosäure-Sequenz des N-Terminus von PLI, wie durch Aminosäure-Sequenzanalyse (Beispiel 1) bestimmt, gehen 57 Nucleotide voraus, die für die Startsequeri7

M₁-K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-A₅₇

kodieren.

Eine computergesteuerte Untersuchung auf übereinstimmende Sequenzen von Exon/Intron-Spleißverbindungen sowie auf Intron-interne Sequenzen (E. Boel et al. (18) und S. M.Mount (19)! führt dazu, die Anwesenheit von vier Introns mit Längen von 65bpbzw. 62bpbzw. 63bpbzw. 57bp(Fig.4, unterstrichen) zu postulieren.

Die Sequenz des PLI-Gens wird durch Kombination der Sequenzen des EcoRl-Spel-Fragments des Plasmids pPL29-5 und der EcoRI-Nhel-Fragments von pPL35-5 (beide bestimmt durch Subklonen in M13) bestimmt.

Beispiel 7

Aufbau der Expressionsvektoren

Beispiel 7.1

Einführung eir.es neuen Rostriktionspunktes in die Start- bzw. Signal-Sequenz des PLI-Gens Die Einführung einer neuen BssHII-Stelle in die Start-Sequenzregion des PLI-Gens (sequenziert in Beispiel 6) durch in vitro-Mutagenese wird gemäß Zcller und Smith (20) durchgeführt. Ein Oligonucleotid, bestehend aus 19 Resten, wird nach der in Beispiel 3.2 beschriebenen Methode synthetisiert, das komplementär zu der DNA-Sequenz (Pos. 36-54), welche für den C-terminalen Abschnitt der PLI-Start-Sequenz kodiert, mit Ausnahme des Nucleotids 10 (45), was zu einer C/G-Transversion (mutagener Primer) führt, ist. Das ausgetauschte Nucleotid 45 des niutagenen Primers wird mit * bezeichnet.

Abschnitt der PLI-

Start-Sequenz 5' CCTCGCTGCCCGCGCCGCT3'

36 AO 50 54

mutagener 5'CCTCGCTGCGCGCGCCGCT3^I

Primer 5158

Für die in vitro-Mutagenese werden 200 pMol des Oligonucleotids 5156 mit 2OnMoI rATP S'-phosphoryliert. Die Reaktion wird 1 h bei 37⁰C mit 10 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ Kinase-Puffer durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erwärmen auf 65⁰C während 10min beendet.

Beispiel 7.2

In vltro-MutagenesederTemplate-MUmpe-PLISal-EcoRIl-DNA

Das erste in vitro-Mutagenese-E.'periment betrifft einzelstrangige DNA aus dem Phagen M 13mp8-PL(Sall-EcoRI), erhalten in Beispiel 6, welche das 0,8kB Sall-EcoRI-Fragment des Plasmids pPL29-5, enthaltend 117 Nucleotide des Promotors und den N-terminalen Teil des PU-Gens, enthält. 1 pMol einzelstrangige M 13mp8-PL(Sall-EcoRI)-DNA wird mit 2OpMoI mutagenem Primer 5156 (Beispiel 7.1) und 1OpMoI Universal M 13-sequenzierendem Primer (N.4511, Amersham) in 10,5μΙ 0,02M Tris-HCI, pH 7,5,0,01 M MgCI₂,0,05M NaCI, 0,001 M DDT vermischt. Die Mischung wird schnoll auf 56⁰C erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 1 μΙ 0.2 M Tris-HCI, pH 7,5,0,1 M MgCI,,, 0,01 M DDT, 4μΙ 2 mivl dNTP, 1 μΙ 1OmM ATP werden dem Gemisch zugesetzt, 3 Einheiten T4-DNA-Ligase {Boehringer, Mannheim) und 2 Einheiten DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, Amersham) werden zubegeben und die Polymerisationsreaktion wird 15h bei 15⁰C durchgeführt. Es werden drei Verdünnungen des Polymerisationsgomisches (1:20,1:100 und 1:500) in niedrigem TE-Puffer durchgeführt. Von jeder Verdünnung werden 1 μΙ und 5μΙ zu 300 μΙ kompetenter E. coli JM 101-Zellen getrennt zugesetzt, welche zur Transformation nach der in Beispiel 5.1 beschriebenen Methode hergestellt worden waren. Die Zellen werden auf X-gal-Platten gegossen und weiße Plaques bildende Kolonien werden erhalten. 100 der weißen Plaques werden aufgenommen und auf LB-Platten überführt. Die mit Phagen-DNA transformierten Bakterien werden über Nacht bei 37⁰C wachsengelassen und anschließend auf Whatman 541-Filter gemäß Beispiel 3.1 überfuhrt. Die FiItU' werden gewaschen (Beispiel 3.1), dann in 6 χ NET, 1 χ ss-Denhardt, 0,1% SDS während 30 min bei 67⁰C vorhybridibiert. Die Hybridisierung wird bei RT (Beispiel 3.4) während 30min mit 15pMol radioaktiv markiertem (Beispiel 3.3) Oligonucieotid 5156 pro Filter in 6 χ SSC durchgeführt. Nach der Hybridisierung werden die Filter während 4 χ 40sec in 6 x SSC bei Raumtemperatur gewaschen und nach dem Lufttrocknen 1 h den Kodak-XAR-5-Filmen unter Verwendung eines Ilford-Screens ausgesetzt. Die Filter we den ein zweites Mal 5min in 6 χ SSC bei 72⁰C (Tm des mutagenen Primers 5156 ist 70"C) gewaschen, getrocknet und über Nacht einem Kodak XAR-5-Film ausgesetzt.

Kolonien, welche nach der zweiten Waschstufe positive Signale zeigen, werden von der Original-LB-Platte aufgenommen, in 1 ml LB-Medium suspendiert und 20min auf 7O⁰C erhitzt. Diese Bakteriophagen- ösung wird 1:10,1:1000 und 1:100000 verdünnt und 10μΙ jeder Verdünnung werden dazu verwendet, 300 μΙ exponentiell wachsender E. coli JM 101-Zellen durch Übertragung zu infizieren, und auf X-gal-Platten gegossen. 6 Plaques der 1:100000-Verdünnung werden individuell in 1,5ml 2 χ TY, enthaltend 15μΙ exponentiell wachsender E. coli MJ 101-Zellan, aufgenommen und auf X-gal-Platten gegossen und 6h bei 37⁰C wachsengelassen. Die Kulturen werden 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, die Überstände bei 4⁰C (Phagen-Vorrat) aufbewahrt und die Zellkügelchen werden dazu verwendet, RF-Präparate nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) herzustellen. Nach der Restriktionsanalyse mit BssHII wird ein mutierter Phage, der einen neuen BssHII-Locus in dem PLI Sall-EcoRI-Fragment trägt, für weitere Vt rsuche ausgewählt und als [MISmpie-PLISall-EcoRD-BssHII/BEö] bezeichnet.

Beispiel 7.3

In-vitro-Mutagenese von Template-M 13 mp 18-PL(Spel-EcoRI)

Das zweite in vitro-Mutageneseexperiment wird mit Einzelstrang-DNA aus dem Phagen M ISmpie-PLISpel-EcoRI), erhalten in Beispiel 6, durchgeführt. Dieaer rekombinante Phage enthält das 1,4kb SpelEcoRI-Fragment des Plasmids pPL29-5 und somit 688 Nucleotide des Promotors plus dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens. Mutagenese dieses Templates wird genai· wie in Beispiel 7.2 beschrieben durchgeführt. Ein Phage, der den neuen BssHII-Punkt in dem PLI Spel-EcoRI-Einschub trägt, wird für vier Versuche ausgewählt und als M 13mp18-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5 bezeichnet.

Beispiel 7.4

Der Aufbau des Plasmids pUBE5

Zur einfacheren Handhabung wird das BamHI-EcoRI-Fragment des Phagen M 13mp8-PL(Sall-E:coRI)BssHII/BE5, erhalten gemäß Beispiel 7.2, einschließlich 130 bp der Promotor-Region und des N-terminalen Abschnitts des PLI-Gens einschließlich der neu eingeführten BssHII-Stelle in der Start-Sequenzregion, in den Plasmid-Vektor pUN 121 (9), wie in Fig.5 dargestellt und im folgenden beschrieben, subkloniert.

4 Mg RF DNA des Phagen M13mp8-PL(Sall-EcoRI)BssHII/BE5 werden gemäß Beispiel 5.3 isoliert und vollständig mit Restriktions-Endonuclease BamHI und EcoRI (Boehringer, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und der Gelabschnitt, enthaltend das 0,8kb BamHI-EcoRI-Fragment, bestehend aus 177bp des Promotors und dem N-terminalen Abschnitt des PLI-Gens, wird elektroeluiert, wie in Beispiel 2.2 beschrieben. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit. Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10μΙ Wasser (50 ng/μΙ) resuspendiert.

2Mg pUN 121 werden vollständig mit Bull und EcoRI (Boehringer, Mannheim) verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das 4,0kb-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 elektroeluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Fällen mit Ethanol wird die DNA in 18μΙ Wasser dOOng/μΙ) aufgelöst.

300 ng des BamHI-EcoRI-Fragmentd, umfassend die BssHII-Stelle werden an 500 ng von Bcll/EcoRI ausgeschnittene pUN 121 DNA angekoppelt. Die Kopplung wird 4h bei 15⁰C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 20μΙ von 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP durchgeführt. 10μΙ des Kopplungsgemisches werden dazu verwendet um

ΙΟΟμΙ kompetente E. coli-HB 101 -Zellen (8) zu transformieren. Die Zellen werden auf LB-Platten, enthaltend 8 mg/l Tetracyclin (Sigma), ausgestrichen und über Nacht bei 37⁰C bebrütet.

Plasmid-Präparate werden aus 12 tet^R-Kolonien gemäß der Methode von Birnboim & DoIy (17) hergestellt und ein Plasmid mit dem gewünschten Restriktionsmuster, dargestellt in Fig. 5, wird als pUBE 5 bezeichnet und für die weitere Analyse verwendet.

Beispiel 7.5 Einführung einer Hgal-Restrlktlonsstelle vor dem Desulfatohirudln-Qen von pML310 und Isolierung das 0,22kB Hgal-BamHI- Gen-Fragment»

Zur Einführung eines Hgal-Restriktionspunktes vor dem Desulfatchirudin-Gen (Fig. 6) werden εμg der Plasmid-pML310-DNA vollständig mit Restriktions-Endonuclease EcoRI verdaut. Die aufgetrennte DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Um 5' überzählige Enden zu entfernen, werden 4ug pML310/EcoRI-DNA in ΙΟΟμΙ 15OmM NaCI, 1 mM ZnSO₄, 3OmM Natriumacetat, pH 4,6, und 20 U/ml Nuclease S, (Sigma) während 45min bei 37°C verdaut. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA !pML310/EcoRI/Si) wird in 100μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 8,0) resuspendiert und mit 2 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdärmen (CIAP, Orthophosphorsäuremonoesterpliosphprylase, EC 3.1.3.1, b'oehringer) 1 h bei 37⁰C bebrütet. Das Enzym wird 1,5h bei 65⁰C inaktiviert. Die NaCI-Konzentration wird auf 150 mM eingestellt. Die desphosphorylierte DNA (pML310/EcoRI/S,/CIAP) wird durch Adsorption an DE 52 (Whatman)-Ionenaustauschsäule in einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration (15OmM NaCI, 1OmM Tris.HCI, pH 8,0, 1mM EDTA) gereinigt. Die Elution wird mit einer Pufferlösung hoher Salzkonzentration (1,5 M NaCI, 1OmM Tris.HCI, pH 8,0,1 mM EDTA) durchgeführt. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und in H)O bei einer Konzentration von 0,8 mg/ml resuspendiert. Zur Einführung einer Hgal-Stelle wird ein Oligonucleotid der Formel

5'-AGCGTCGACGCt-S'

nach der Phosphotriester-Methode (21) synthetisiert. Die Sequenz des Oligonucleotids ist selbst-komplementär, enthaltend die Erkennungsstelle-GACGC- für die Restriktions-Endonuclease Hgal. Anlagerung von zwei Einzelsträngen führt zu einem doppelstrangigen DNA-Verbindungsstück.

1^g des synthetischen, einzelstrangigen Oligodesoxynucleotids werden in 10μΙ 6OmM Tris-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 30μΰ; Iy-³²PI ATP (3000Ci.mMol"¹, Amersham) und 6 Einheiten T4 Polynucleotidkina.se (Boehringer) während 30min bei 37⁰C phosphoryliert und danach einem 15minütigen „Chase" bei 37T in Anwesenheit von 0,5mM ATP unterworfen. Das Gemisch wird weiter 10min bei 75°C bebrütet, um das Enzym zu inaktivieren. Die Mischung wird zwecks Anlagerung der Enden auf Raumtemperatur gekühlt.

0,6pg (17OpMoI) der"P-markierten Unker-DNA werden mit 2,4 μΙ (1,75 pMol Enden) von pMLSIO/EcoRI/St/CIAP vermischt und in 20μΙ6OmMTris.HCI,pH 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT,3,5mM ATP,800EinheitenT4DNA-Ligase(Biolabs)20hboi 15⁰Cligiert Die Ligase wird 10min bei 85°C inaktiviert und der Überschuß der Linkermoleküle durch Fällen der DNA in Anwesenheit von 1OmM EDTA, pH 7,5,30OmM Natriumacetat, pH 6,0, und 0,54VoI Isopropanol entfernt. Nach 30min bei Raumtemperatur wird die DNA pelletiert in 45μΙ Ligierungsmischung (wie oben spezifiziert) resuspendiert und 6h bei 15⁰C ligiert, um zirkuläre DNA zu bilden.

Aliquote Anteile von 1 μΙ und 3 μΙ der Ligierungsmischung werden zu 100μΙ Calcium-behandolten, transformationsfähigen E. coli HB101-Zellen [hergestellt gemäß der Methode von D. Hanahan (10)] gegeben. Die Zellen werden 30min auf Eis belassen, dann 3 min bei 42⁰C bebrütet, 2 min auf Eis gekühlt und dann 1 h bei 37⁰C in 400μΙ SOC-Medium bebrütet. Die Zellen werden in 100μΙ SOC-Medium konzentriert, jeweils auf LB-Agarplatten, enthaltend 50pg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 37⁰C wachsengelassen.

12 transformierte amp^R-Kolonien werden isoliert und individuell in LB-Medium, enthaltend 100μς/ηηΙ Ampicillin, wachsengelassen. Plasmid-DNA wird nach der Methode von D. S. Holmes et al. {22) hergestellt. Die Anwesenheit des synthetischen Oligonucleotid-Linkers wird durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Einzelstrang-DNA-Fragments als Primer, das den kodierenden Strang von Hirudin hybridisiert, bestätigt. Ein Klon, der die Verbindungs-DNA in der korrekten Position vor dem Hirudin-Gen enthält, wird al« pML310L bezeichnet.

Zur Isolierung des 0,22kb Hgal-BamHI-Desulfatohirudin-Gen-Fragments werden 40 μς des Plasmids pML31 OL vollständig mit Restriktions-Endonucleasen Pvul und BamHI (Boehringer) in 150μΙ 0,01 M Tris.HCI, pH 7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol während 2 h bei 37 ⁰C verdaut. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das Gelstück, das das 0,84kb Pvul-BamHI-Fragment enthält, wird gemäß Beispiel 5 elektroeiuiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird die DNA in 20μΙ Hgal-Puffer resuspendiert und vollständig mit Restriktions-Endonuclease Hgal (Biolabs) abgebaut. Die Fragmente werden auf einem 2% Agarosegel abgetrennt, und das Gelstück, das das 0,22 kb-Hgal-BamHI-Fragment enthält, wird wie vorstehend eluiert. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung wird das Fragment in 55 μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

Beispiel 7.6

Fusion der PLI-Start-Sequenz und des Desulfatohirudin Strukturgens

Um einen Linker zu schaffen zur Ligierung der BssHII-Stelle der die Signal-Sequenz (Beispiel 7.2) kodierenden Region des PLI-Gens mit der Hgal-Stelle des Desulfatohirudin-Gens (Beispiel 7.5), werden zwei Oligonucleotide, wie in Beispiel 3.2 beschrieben, synthetisiert.

PLI-Signal-Sequenz ι N-terminale Aminosäuren

¹ von Desulfatohirudin I

ALA ALA LEU ALA ALA AKG ALA ALA ALAI VAL VAL

I I

5¹ 3¹ I

GCC GCC CTC GCT Gcg cgc _Ccc get gctlGTT GTT Oligonucleotid 5172 CGG CGG GAG CGA CGC GCg egg ega egaleaa caA Oligonucleotid 5173

3' I 5'

DssHII

(kleine Buchstaben: Linker).

30OpMoI jedes Oligonucleotids werden getrennt mit 40OpMoI rATP und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Nuclear) in 15μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50Mg/ml BSA behandelt. Beide mit Kinase behandelten Oligonucleotide werden in einem Verhältnis von 1:1 vermischt, auf 95⁰C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur zum Anlagern heruntergekühlt. Die doppelsUängigen Linkerfragmente werden bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 7.7 Aufbau von pLHK3

Zum Aufbau eines Desulfatohirutin-Expressionsvektors (Fig. 7), der den verkürzten Promoter von PLI enthält, werden 7 Mg pUBE5-DNA (Beispiel 7.4) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssKli (Boehringer) verdaut mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA (1,9pMol) wird in 10μΙ sterilem Wasser resuspendiert. 30OpMoI des zusammengefügten Linkers 5172/5173 (Beispiel 7.6) werden an 1,9pMol BssHII geschnittenes pUBE5 mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 60μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50pg/ml BSA ligiert. Die Ligierunywird 15h bei 15⁰C durchgeführt. Die Ligase wird durch Erhitzen auf 85°C während 10 min inaktiviert. Der Puffer wird auf 0,01 M Tris-HCI, pH 8,0,0,1 M NaCI, 0,005M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 36 Einheiten von BamHI (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2 h bei 37⁰C durchgeführt. Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel getrennt und das 3,4kB BamHI-|Bsshll]Hgal-Linkerfragment durch Elektroelution des Gelstücks, nachfolgende Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Ausfällung isoliert. Die DNA wird in 14 μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ resuspendiert. 0,2pMol des 0,22kb Desulfatohirudin-Hgal-BamHI-Fragments werden an 0,1 pMol der abgebauten pUBE5-DNA ligiert. Die Ligierung wird 15h bei 15⁰C mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt.

2μΙ des Ligierungsgemisches werden dazu verwendet, um 100μΙ von empfänglichen E. coli HB101-Zellen (8) zu transformieren, welche dann auf LB-Plhtten, enthaltend 50mg/l Ampicillin (Sigma), ausgestrichen worden. Die DNA von 12amp^R-Kolonien wird nach der Methode von Birnboim & DoIy (17) hergestellt und durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein Klon wird für die Sequenzanalyse nach der Didesoxy-Kettenterminator-Methode von Sanger et al. (23) ausgewählt. Ein Klon, der das gewünschte Restriktionsmuster und die korrekte Sequenz innerhalb der PLI-Startsoquenz-Desulfatohirudin-Verbindung zeigt, wird isoliert und mit pLHK3 bezeichnet.

Beispiel 7.8 Der Aufbau von pLHL5

Zum Aufbau des Desulfohirudin-Expressionsvektors, der die vollständige Promfotor-Sequenz des PLI-Gens enthält, werden 10,3μg RF DNA des Phagen M13mp 1 e-PLISpel-EcoRIJ-BssHII/ACö (Beispiel 3.3) vollständig mit Restriktions-Endonuclease BssHII (Boehringer) verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10μΙ sterilem Wasser auf eine Konzentration von 1,9pMol resuspendiert. 30OpMoI des doppelsträngigen Linkerfragmentes 5172/5173 (siehe oben) werden an 1,9pMol der BssHII-ausgeschnittenen Phagen-DNA, wie in Beispiel 7.7 beschrieben, ligiert. Nach Inaktivierung der T4 DNA-Ligaae wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI, pH 7,6,0,Ü5 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,0,014 M DTT eingestellt.

36 Einheiten der Restriktions-Endonuclease Hindill (Boehringer) werden zugesetzt und der Abbau wird 2 h bei 37⁰C durchgeführt.

Die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegel abgetrennt und das 1,4 kb Hindlil-[BssHII]Hga-l-Linkerfragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15μI sterilem Wasser resuspendiert und führt zu einer Konzentration von 0,1 ρΜοΙ/μΙ.

3μ9 Plasmid pBR322 (24) werden vollständig mit Restriktions-Endonucleasen BamHI und Hindill (Boehringer, Mannheim) in 20μΙ 0,01 M Tris.HCI, pH 7,5,0,1 M NaCI, 0,01 M MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol verdaut, und die Fragmente werden auf einem 1 % Agarosegei getrennt. Das große 4,15kb Hindlll-BamHI-Fragment wird gemäß Beispiel 2.2 eluiert und in 8μΙ sterilem Wasser (0,1 pMol/μΙ) resuspendiert.

0,2 pMol des 0,2ky Hgal-BamHI-Fragments von Desulfohirudin und 0,2pMol des 1,4kb PLI-Promotor-Startsequenz-Hindll![BssHII]Hgal-Linkerfragments werden an 0,1 pMol Hindlll/BamHI-ausgeschnittenem pBB322 15h bei 15⁰C ligiert. Die Kopplung wird mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) in 10μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt. 1 μΙ des Ligierungsge nisches wird dazu verwendet, um 100μΙ empfindliche E. coü-HB101-Zellen (8) zu transformieren. 12amp^R-Kolonien werden isoliert und die DNA gemäß Beispiel 7.7 analysiert. Ein Klon wird für weitere Versuche ausgewählt und als pLHL5 (Fig. 8) bezeichnet.

Beispiel 7.9

Dor Aufbau von pLHLT7

Um eine Terminator-Region tür das PU-Desulfatohirudin-ExpressionJsystemzu schaffen, wird das 0,7 kb Pstl-Nhel-Fragment des Plasmi'Js pPL36-5 mit dem 3' Desulfatohirudin-Gen, wie in Fig.9 dargestellt, vereinigt.

10Mg pPL35-6 werden vollständig mit Pstl (Bohringer) abgebaut. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefallt. Die Fragmente werden in 0,033M Tris Acetat (pH 7,9), 0,066M Kaliumacetat, 0,01 M Magnesiumacetat, 0,5mM DTT und 1 OOng/ml BSA resuspendiert.

10 Einheiten T4 DNA-Polymeraae (Boehiinger) werden zugesetzt und die Reaktion wird 180sec. bsi 37⁰C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegeben, jeweils 20 nMol dATP, dCTP, dGTP, dTTP werden zugefügt, der Puffer auf d>e obigen Bedingurgen eingestellt und die Reaktion 35rnin bei 37⁰C durchgeführt. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Eihanol-Fällung v/ird die DNA in 10μΙ sterilem Wasser (1,9 pMol = 11,4 pMol stumpfe Enden) resuspendiert. 900 pMol mit Kinase behandelte, doppelsträngige (Beispiel 7.6) BamHI-Linkerfragmente (Biolabs) werden zugesetzt und die Kopplung 15hrs bei 15⁰C mit400EinheitenT4 DNA-Ligase(Biolabs) inGOμΙ5OmMTris-HCI (pH7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50Mg/m ι BSA durchgeführt. Nach Inaktivierung dnr Ligase durch lOminütiges Erhitzen auf 85^CC wird der Puffer auf 0,01 M Tris-HCI (pH 8,0), 0,4 M NaCI, 5mM MgCI₂,1 mM 2-Mercaptoethanol eingestellt. 20 Einheiten Restriktions-Endonuclease Nhel (Biolabs) werden zugesetzt und der Abbau 2 h bei 37⁰C durchgeführt. Die Fragmente werden nuf einem 1,2% Agarosegel abgetrennt, und das 0,7 kb Nhel-[Pstl]BamHI-Fragment wird durch Elektroelution gemäß Beispiel 2.2 isoliert. Das Fragment wird in 15μΙ sterilem Wasser resuspendiert, um nine Konzentration von 0,1 pMol/μΙ zu ergeben.

Eine Ligierung wird mit 0,2pMol 0,7kb Nhel-[Pstll-BamHI-Terminatorfragment, 0,2 pMol 1,4kb Hindlll-[BssHII]Hgal-Promotorfragment (Beispiel 7.4), 0,2pMol 0,2 kb Hgal-BamHI-Desulfatohirudin-Fragment (Beispiel 7.5) und 0,1 pMol pUC18-Vektor (25), linearisiert mit Hindill und Xbal, durchgeführt. Die Reaktion wird mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (Biolabs) während 15h bei 15⁰C in 10μΙ bOmM Tris-HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreit, 1,OmM ATP, 50μg/ml BSA durchgeführt.

2μΙ der Ligation werden zum Transformieren von E.coli HB101 -Zellen verwendet. 12 amp^R-Transfcrmanten werden gemäß Beispiel 7.6 analysiert, und das Plasmid, v/elches die korrekten Fusionssequenzen zeigt, wird als pLHLT7 bezeichnet.

Beispiel 8

Aufbau einas Cotransformationssystemu für A.niger

Beispiel 8.1

Herstellung von pCG59D7, enthaltend oas pyrA-Gen von Asperglllus nlger

300ng eines 1,1 kb Hindlll-Fragments von pDJB2 (26), des einen Abschnitt des N.crassa pyr4-Gens trägt, werden radioaktiv durch Nicktranslation nach Maniatis et al. (8) markiert. Dip Filterreplikas der Genbank (Beispiel 3.1) werden 6x NET befeuchtet und in 6x NET, 1 χ ss-Denhardt, 0,1 % SDS während 4 h bei 50°C vorhybridisiert. Das der Nicktranslation unterworfene Hindlll-Fragment wird zugesetzt (300ng/80 Filter), und die Hyhridisierung wird 15h bei 5O⁰C durchgeführt. Nach der Hybridisierung werfen die Filter 1 x 5 min in 4χ SSC, 0,1 % SDS bui 50°C gewaschen. Nach dem Lufttrocknen werden die Filter 3 Tage Kodak X-Omat SO282-Filmen ausgesetzt. Eine stark hybridisierende Kolonie, mit Eschorichia coli BJ5183/pCG59D7 (kurz 59D7) bezeichnet, wird isoliert und ein großes Plasmidpräpar.at davon gemacht (14). Das Plasmid wird als pCG59D7 bezeichnet und zur Transformation in Beispiel 9.2 verwendet.

Beispiel 8.2

M itation von A.niger Stamm N 756 und Isolierung der für Uridin auxotrophen Mutanten Die Selektion für Mutanten von A.niger Stamm N 756, denen speziell Orotidin-ö'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, kann durch positive Selektion gegen die toxische analoge Fluororotsäure (27) in Anwesenheit von Uridin durchgeführt werden. 3 x 10^e Konidiosporen von A.niger Stamm N 756 werden auf 10mi Minimalmediumplatten, ergänzt mit 1 g/l Arginin und 50 mg/l Uridin, ausgestrichen. Die Sporen werden der Kurzwellen-UV-Bestrahlung (2600A) in einer Dosierung ausgesetzt, welche 0,5% überlebende Kolonien ergibt. Nach 2 Tagen Bebrütung bei 28⁰C, wenn das auswachiende Myzel schwach sichtbar ist, werden 10mg Fluororotsäure zu jeder Pl&tte zugesetzt, und die Bebrütung wird weitere 2 bis 3 Tage fortgesetzt. Fluororotsäure-resistente Kolonien treten als stark wachsende und spekulierende Xolonien auf einem Untergrundwachstum von weißlichem, sensitivem Myzel auf. Von etwa 40000 Überlabenden der mutagenun Behandlung werden 8 Mutanten isoliert. 2 davon, welche gegenüber Fluororotsäure ohne Uridin-Bednrf resistent sind, werden nicht weiter verfolgt. 6 davon zeigen eine Uridin-Auxotrophie. Es werden Heterokaryonten hergestellt, indem ein Gemisch von Konidiosporen der zwei Fluorsäure-resistenten Mutanten jeweils auf Komplettmedium über Nacht angezüchtet wird. Myzelblöcke werden in Minimalmedium überführt. Mutanten, die einander in ihrer Mutation komplementär sind, zeigen Auswachsen von prototrophem, heteroka'ryotischem Myzel an den Enden, Stämme mit einer Mutation in dem gleichen AIIeI nicht. Die 6 Uridin-erfordernden Mutanten von Stamm N 756 fallen, wie bei S.cerevisiae (27), in zwei Komplementgruppen. Jeweils einer-An 8 und An 10-wird zur Transformation verwendet.

Beispiel 8.3

Herstellung von Protoplasten und Transformation der Uridin-Mutanten An 8 und An 10 von A.niger N 756 Konidiosporen der Mutanten An 8 und An 10 werden getrennt auf schrägen Platten 4 bis 5 Tage bei 28⁰C in Komplettmedium gezüchtet. 2 χ 10⁸ Konidiosporen von An 8 und An 10 werden dazu verwendet, um getrennt 200 ml Minimalmedium, ergänzt mit 1 g/l Arginin und Uridin (Beispiel 8.2), zu beimpfen. Nach 20stündigem Wachstum bei 28°C und 180rpm wird das Myzel durch Filtrieren durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen und in 20μΙ 0.8M KCI, 5OmM CaCI₂, 0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50rpm) bebrütet, bis eine maximale Protoplasten-Freisetzung mikroskopisch festgestellt werden kann (SO bis 120min). Die Protoplasten-Suspension wird durch einen Glaswollepfropfen in einem Trichter filtriert, um Myzelrückstände zu entfernen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Zentrifugieren (10min, 2000rpm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200-500μι 0,8M KCI. 5OmM CaCI₂ resuspendiert, um eine Konzentration von 1 x 10⁸ ml zu ergeben.

Zur Transformation werden 200μΙ aliquote Anteile der Protoplasten-Suspensionen (An 8 und An 10) getrennt zusammen mit Lösungen, bestehend aus 10μς/20μΙ pCG59D7 DNA, 50μΙ PCT, (1OmM Tris-HCI, pH 7,5,5OmM CaCI₂,25% PEG 6000), bebrütet. Die Inkubationsmischungen werden 20min auf Eis gehalten, weitere 2,0ml PCT werden zugesetzt und die Gemische weitere

5min bei Raumtemperatur bebrütet. 4ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCI₂ werden zugesetzt und 1 ml aliquote Anteile dieser

Endtransformationslösungen mit verflüssigtem Minimalagarmodium (MM + 1 g/l Arginin + 10g/l Bacto-Agar (Difco)),

stabilisiert mit 0,8 M KCI, vermischt. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten des gleichen Mediums gegossen und bei 28⁰Cbebrütet.

Nach 3tägigem Wachstum bei 28⁰C treten stabile Transformanten als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Untergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vahrscheinlich abortiven Transformanten auf. Die Transformation mit pCG59D7 ist nur erfolgreich im Mutanten An 8, nicht in An 10. An 8 wird daher angesehen, daß ihm die Ornithin-5'-phosphatdecarboxylase-Aktivität fehlt, die durch das gesamte Genprodukt des Selektionsplasmids pCG59D7

ergänzt ist. In An 8 werden etwa 20-30 Transformanten pro \ig pCG59D7 erhalten.

10 Transformanten von An 8 werden aufgenommen, auf Minimalmedium subkultiviert und die DNA wird isoliert und auf

Anwesenheit von pCG59D7-Sequenzen analysiert. DNA der Transformanten wird nach Pulverisierung des gefrorenen Myzels in

flüssigem Stickstoff gemäß einer veröffentlichten Methode (7) isoliert. 1 pg DNA jedes Transformanten wird vollständig mit Xholabgebaut, durch Elektrophorese über 1 % Agarosegels fraktioniert und auf Nitrocellulose-Fiiter gemäß Maniatis (8), S.382-386,aufgetragen. Dio Auftragungen werden mit (a-¹²p)-markierter pUN121-DNA nach von Maniatis et al. (8), S. 387-389,beschriebenen Standardverfahren hybridisiert. Die erhaltenen, verschiedenen Hybridisierungsmuster zeigen die chromosomale

Integration des transformierenden Plasmids pCG59D7 an verschiedenen Stellen in das Wirtsgenom an. Beispiel 9 Expression des Desulfatohlrudin-Gens unter Steuerung des PLI-Promoters in A.niger Beispiel 9.1 Cotransformatlon des Mutanten An 8 mit pCG59D7, pLHK3, pLHL5 oder pLHLT7 Protoplasten des Mutanten An 8 werden gemäß Beispiel 8.2 hergestellt und mit 5\ig Selektionsplasmid pCG59D7 und entweder

10pg Plasmid pLHK3 (Beispiel 7.7), 10μα. Plasmid pLHL5 (Beispiel 7.8) oder 10pg Plasmid pLHLT7 (Beispiel 7.9) gemäß dem in

Beispiel 8.2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die transformierten An 8-Zellen werden auf Minimalmedium auf Uridin-Prototrophie, wie in Beispiel 8.2 beschrieben,

ausgewählt. 50 Transformanten jedes Cotransformationsversuchs werden willkürlich genommen und auf Desulfatohirudin-

Expression analysiert. Die Desulfatohirudin-Aktivität wird in einer Thrombin-Inhibierungsbestimmung nach den Herstellerinformationen für chromogenes Peptidsubstrat getestet (Boehringer, Mannheim, BRD). Beispiel 9.2

Expression von Desulfatohlrudin unter der Steuerung des PLI-Promoters in Transformanten der Mutanten An 8 Konidiosporen von gemäß Beispiel 8.3 erhaltenen Transformanten werden individuell vorgezünhtet in 50 ml eines Vorkulturmediums (Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Frankreich] 3g/l, NH₄CI 2g/l, KH₂PO₄ 0,5g/l, NaCI 0,5g/l, Mg₂SO₄ x 7 H₂ 0,5g/l, Ca₂SO₄ x 2 H₂O0,5g/l, pH 7,0). Die Vorkulturwird72hrs bei 250rpm und 28⁰C bebrütet. 10% der Vorkultur werden dazu verwendet, um 50ml eines Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl 20g/l, Pectin Slow Set 5g/l) zu beimpfen. Die Kultur wird 72-96 h (höchste Rate der Pektinlyase-Produktion) bui 250 rpm und 28⁰C (bezeichnet als induzierende Bedingungen) gezüchtet. Transformanten des Mutanten An 8 werden ebenfalls unter nicht-induzierenden Bedingungen in Phyton-pepton 10g/l, Glukose 10g/l anstelle des Hauptkulturmediums gezüchtet.

Bei verschiedenen Zeiten (alle 20h) werden Proben entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und durch Ultraschallzerkleinerung gebrochen. Überstehendes und Zellextrakte werden beide auf Desulfatohirudin-Aktivität gemäß Beispiel 9.1 getestet. Es wird keine Desulfatohirudin-Aktivität festgestellt anschließend an die Cotransformation mit Plasmid pLHK3. pLHL5 und pLHL7, enthaltend den gesamten PLI-Promoter, sind beide in der Lage, die Expression des Desulfatohirudins in A.niger Mutant An 8 voranzutreiben. Von den 50 Transformanten, die von den Cotransforma'.ions-Experimenlen (Beispiel 9.1) genommen wurden, zeigen jeweils 10 Desulfatohirudin-Aktivität im Medium.

Die Expression des Desulfatohirudins in Mutante An 8 unter Steuerung des gesamten PLi-Promotors und unter Zuhilfenahme des PLI-Startpeptids wird daher reguliert durch Induzieren von Substratpektin und führt zur Sekretion von Desulfatohirudin in das Medium.

Hinterlegung der Mikroorganismen Die folgenden Mikroorganismen wurden unter dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Grisebachstr.8. 3400 Göttingen, hinterlegt:

nummer Hinterlegungstag

11. Dezember 1986 H.Dezembei 1986

2. Februar 1987

Mikroorganismen	Hinterlegt
Escherichiacoli
BJ5183/pCG3B11	DSM 3916
Aspergillusniger An8	DSM 3917
Escherichiacoli
BJ5183/pCG59D7	DSM39Ö8

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das die DNS-Sequenzen enthält, die für die pyrA-Gen von Aspergillus niger kodieren, gekennzeichnet durch Züchtung eines Wirts, der mit besagtem DNA-Molekül transformiert ist, und Isolierung des besagten rekombinanten DNA-Moleküls.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pCG59D7, welches das pyrA-Gen enthält, hergestellt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Wirt, der ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 enthält, durch Behandlung eines Wirtes unter Transformationsbedingungen mit dem genannten rekombinanten DNA-Molekül hergestellt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) hergestellt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus niger An8(DSM 3917) mit pyrA-Mangel verwendet wird, hergestellt indem Konidiosporen von Aspergillus niger N756 mit mutierender UV-Bestahlung behandelt werden und die Kolonien, die in Gegenwart von Fluororotsäure und Uridin überleben, ausgelassen werden.