DK175569B1 - Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid - Google Patents

Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid Download PDF

Info

Publication number
DK175569B1
DK175569B1 DK198800545A DK54588A DK175569B1 DK 175569 B1 DK175569 B1 DK 175569B1 DK 198800545 A DK198800545 A DK 198800545A DK 54588 A DK54588 A DK 54588A DK 175569 B1 DK175569 B1 DK 175569B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
dna
recombinant dna
dna molecule
pli
gene
Prior art date
Application number
DK198800545A
Other languages
English (en)
Other versions
DK54588A (da
DK54588D0 (da
Inventor
Jutta Heim
Jacob Visser
Christof Gysler
Hermanus Cornelius Mari Kester
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10611694&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK175569(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of DK54588D0 publication Critical patent/DK54588D0/da
Publication of DK54588A publication Critical patent/DK54588A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK175569B1 publication Critical patent/DK175569B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Complex Calculations (AREA)
  • Image Generation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Multi-Process Working Machines And Systems (AREA)

Description

i DK 175569 B1
Den foreliggende opfindelse vedrører gensplejsningsteknik. Nærmere betegnet angår opfindelsen hidtil ukendte rekombi-nante DNA-molekyler, der indeholder DNA-sekvenser, som koder for pectinlyase I (PLI) fra Aspergillus niger 5 og/eller promotoren, signalsekvensen eller terminatoren deraf, en fremgangsmåde til fremstilling af de rekombi-nante DNA-molekyler, transformerede værter, som indeholder et rekombinant DNA-molekyle, en fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt en fremgangsmåde 10 til fremstilling af et polypeptid ved udtrykkelse af en rekombinant hybridvektor og isolering af.PLI. De nye DNA-molekyler er nyttige til konstruktionen af hybridvektorer, som udtrykker fremmede gener i trådsvampe.
15 Selv om der inden for genspiejsningsområdet allerede kendes adskillige polypeptidekspressionssystemer for pro-karyotiske og eukaryotiske værter, er der et fortsat behov for nye systemer, som er fordelagtige i forhold til de kendte systemer.
20 I meget stor udstrækning anvendes den prokaryotiske Escherichia coli-vært og den eukaryotiske gærvært, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, for hvilke der er udviklet et stort antal forskellige ekspressionshybridvektorer, for 25 det meste plasmider. Ulemperne ved E. coli-værter er, at de ikke kan glycosylere det dannede polypeptid, og at det fremmede peptid på grund af mangel på udskillelse kan akkumulere i værtscellen og forhindre yderligere vækst. Gærværterne gennemfører glycosylering,. men ligesom E. coli 30 udskiller de imidlertid ikke polypeptiderne, bortset fra nogle meget små, til næringsmediet. I gær sker der kun udskillelse til det periplasmatiske rum. Højere eukaryotiske værter er pattedyrcancerceller, som er i stand til at glycosylere og udskille til næringsmediet, men 35 dyrkningen af disse celler er imidlertid meget langsom og kostbar, og der er fare for, at oncogene nucleinsyrer isoleres sammen med det ønskede peptid, hvorfra de ikke senere kan fjernes.
2 DK 175569 B1
Som følge af behovet for andre værter har man også undersøgt trådsvampe, såsom Neurospora crassa, Aspergillus nidulans og Aspergillus niger. Sådanne svampe anvendes i vid udstrækning til industrielle formål, men inden for 5 gensplejsningsteknikken har de imidlertid kun været anvendt i ringe omfang, hovedsagelig på grund af mangel af et passende transformationssystem. I modsætning til S. cerevisiae indeholder trådsvampe ikke plasmider, som kunne anvendes til indføring af fremmede gener og fænotypeselek-10 tion. Det er imidlertid muligt at transformere trådsvampe med fremmede plasmider, som indeholder et selekterbart markørgen. Alle de hidtil kendte vektorer for trådsvampe replicerer ikke autonomt, som det er tilfældet ved gær, men er integreret i svampekromosomet. Dette sker kun med 15 en meget lav frekvens. På den anden side er det imidlertid fordelagtigt, at integreret transformation giver transfor-manter, som med hensyn til mitose er meget stabile, selv under ikke-selektive betingelser. Stabil integrering af mere end 100 kopier er beskrevet.
20
Den første beskrevne vektor for trådsvampe indeholder qa~2~genet fra N. crassa som selekterbar markør. Dette gen indkoder enzymet katabol sk dehydroquinase og kan anvendes til funktionel komplementering af aro-mutanter af N.
25 crassa [M.E. Case, M. Schweizer, S.R. Kushner og N.H.
Giles (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263].
Aro-mutanter er ikke i stand til at vokse på minimalmedium uden tilsætning af en aromatisk aminosyre. Transformation af N. crassa ved hjælp af qa-2-vektoren sker ved 3 0 integration af en enkel kopi af pi asmi det i kromosomet.
30% af stabile aro+-integranter bibeholdt det integrerede qa-2-gen bundet til bakteriepiasmidsekvenserne [M.E. Case (1982) i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (A. Hollander, D. DeMoss, S. Kaplan, J. Konisky, 35 D. Savage og R.S. Wolfe, red.), side 87-100, Plenum].
Denne iagttagelse gør det muligt at foretage cotransformation af ikke-selektive DNA-sekvenser med selektive DNA-sekvenser.
I A. nidulans, som har kønnet formering og derfor kan 3 DK 175569 B1 undergå klassisk gensplejsning, er der identificeret såvel negative som positive selekteringssystemer. Ved enten at anvende heterologt DNA fra N. crassa eller homologt DNA 5 har man opnået funktionel komplettering af A. nidulans pyrG-mutanter ved transformation med plasmider, som indeholder pyrG-genet (Ballance et al., BBRC 112, 284 1983,
Tilburn et al., Gene 25, 205, 1983). I andre systemer er mutationer ved trpC- eller argB-stedet funktionelt 10 kompletteret ved transformation med de egnede plasmider [Yelton et al. PNAS 83^, 1470, 1984, Yelton og Timberlake J. Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173, 1985, Johnstone et al., EMBO 4, 1307, 1983 J.
Der er også udviklet et dominant positivt selekterings-15 system under anvendelse af amdS-genet isoleret fra A. nidulans, som gør det muligt, at A. niger, som er transformeret dermed, kan vokse på acetamid som eneste nitrogenkilde {Tilburn et al., Gene, 26, 205, 1983, Wernars et al., Curr. Genet. 9, 361, 1985, J. M. Kelly et al., EMBO 20 J. 475, 1985).
Sammenlignet med N. crassa eller A. nidulans er A. niger langt den vigtigste organisme. Den anvendes i stor udstrækning ved den industrielle enzymproduktion, f.eks. til anvendelse i fødevareindustrien. A. niger adskiller 25 sig fra A. nidulans med hensyn til sekretionskapacitet, idet den sekreterer forskellige hydrolytiske enzymer, f.eks. glucomylase, ct-amylase, pectinase, cellulase, j3-glucanase, /3-galactosidase, naringinase, pentosanase, sur protease og lignase, hvor glucoamylase- og pentinase-30 komplekset er de mest vigtige.
A. niger har ingen kendt kønnet formering. Mutanter kan derfor ikke indføres ved hjælp af meiotiske rekombinationer. Ved hjælp af klassiske muterings- og selekteringsprocesser har man imidlertid opnået kraftige stanunefor-35 bedringer med hensyn til sekretionen af hydrolytiske en- 4 DK 175569 B1 zymer.
Blandt generne for A. niger-enzymer er kun generne for glycoamylase (Boel et al., EMBO J. 3, 1581, 1984) og 5 alkohol- og aldehyd-dehydrogenase (WO 85/05097) samt deres promotor- og signalsekvenser blevet karakteriseret og anvendt ved transformationsforsøg med henholdsvis A. nidulans og A. niger.
Som selekteringsmarkører for A. niger har man anvendt det 10 heterologe amds-gen (Kelly og Hynes, EMBO 3. 4, 475 1985) og argB-genet (Buxton et al., Gene 37, 207, 1985, EP
184.438, WO 86/06097), begge opnået fra A. nidulans.
A. niger er den vigtigste organisme til industriel fremstilling af pectinspaltende enzymer. Pectiner er polyga-15 lacturonider med høj molekylvægt (20.000-40.000 D) bestående af a-1,4-glycosidisk bundne D-galacturonsyrepolymerer og optræder i naturen som bestanddele i højere planteceller, hvor de er bundet til cellulosemolekyler, der hovedsagelig findes i den primære cellevæg og midter-20 lamellen. Blandt de righoldigste kilder for pectin kan nævnes citron- og appelsinskræller, som indeholder ca. 30% af dette polysaccharid. Pectiske enzymer spalter kulhy-dratpolymersubstratet enten ved hydrolyse af den of-1,4-glycosidiske binding (polygalacturonase) eller ved 25 transelimenering af den a-4,5-umættede galacturonsyrerest fra pectinmolekylet (forskellige pectinlyaser). Det systematiske navn for pectinlyase er pectintranseliminase (EC 4.2.2.10).
I A. niger udtrykkes proteinerne i pectinkomplekset ikke 30 væsentligt. Under induktionsbetingelser under anvendelse af pectin eller pectinnedbrydningsprodukter udtrykker A. niger ovennævnte enzymer, herunder PLI, når forekomsten af andre kulstofkilder, såsom glucose eller saccharose, er begrænset. I overfladekulturer har pectinenzymerne tendens 5 DK 175569 B1 til at forblive forbundet med den ydre cellevæg. Forøget pectin- og Ca2+-koncentration i mediet fører til fuldstændig udskillelse.
5 Pectinaser, såsom PLI, anvendes af fødevareindustrien, hovedsagelig til klaring af frugtsaft.
Fra A. niger har man oprenset og delvis karakteriseret to forskellige pectinlyaser, PLI og PLII, jf. F.E.A. van Houdenhoven (1). PLI indeholder fire mannoserester, 10 hvorimod PLII indeholder to mannoserester og to glucose- rester. Enzymerne har forskellige molekylvægte PLI: 37,5 kD, PLII: 36 kD). De totale eller partielle aminosyrese-kvenser har ikke været beskrevet.
Den foreliggende opfindelse er baseret på en partiel 15 strukturbestemmelse af pectinlyase I (PLI), der muliggør fremstillingen af DNA-prober, som koder for relevante dele af proteinet. Ved hjælp af DNA-proberne er det muligt at screene for og isolere DNA, der koder for PLI, til sidst sammen med præ- og postsekvenser derfor, fra et genbiblio-20 tek fra A. niger.
Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe rekombinant DNA-molekyler, som koder for et pectiniyase-ekspressionssystem, og derivater deraf, såsom strukturgenet for PLI og tilsvarende reguleringssekvenser, f.eks.
25 promotor-, signal- og terminatorsekvenser, og hybridvektorer indeholdende tilsvarende DNA'er, herunder hybridvektorer med DNA, som koder for homologe eller heterologe polypeptider, værter, især trådsvampe, f.eks. Aspergillus-værter, transformeret med vektorerne, metoder til frem-30 stilling af rekombinant DNA-molekylerne og værterne samt anvendelsen af rekombinant DNA-molekylerne til fremstilling af nye ekspressionssystemer. Det er tillige formålet at fremstille polypeptider ved hjælp af DNA'erne og værterne.
6 DK 175569 B1
Pectinlyaseekspressionssystemet indeholder DNA-sekvenser, som koder for promotoren, signalsekvensen, strukturgenet og terminatoren i et pectinlyasegen.
5 Nærmere betegnet er det formålet med den foreliggende opfindelse at konstruere hybridekspressionsvektorer, som indeholder DNA-sekvenser, der koder for promotoren for PLI, eventuelt for signalsekvensen for dette protein, og eventuelt for en egnet terminator for det samme gen. Disse 10 hybridekspressionsvektorer anvendes til inkorporering af gener, som koder for specielle proteiner, og til transformeringen af trådsvampe, såsom Aspergillus, Penicillium og Cephalosporium. Cotransformation af A. niger med to forskellige plasmider kan gennemføres, hvor et af plasmi-15 derne er valgt blandt ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen og det andet er et specielt fremstillet selek-teringsplasmid, som arbejder i forbindelse med en mutantstamme af en trådsvamp.
Den foreliggende opfindelse angår tillige overproduktionen 20 af PLI i Aspergillus-arter.
Formålet med opfindelsen fremgår af den efterfølgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen.
Rekomblnant DNA-molekylerne
Opfindelsen angår nærmere betegnet et rekombinant DNA-25 molekyle, som indeholder DNA-sekvensen med formlen I (fig.
4) eller et derivat deraf.
Udtrykket "derivat" anvendt i forbindelse med DNA-sekvensen med formlen I omfatter større derivater med flankeringssekvenser, fragmenter af denne DNA-sekvens, mutanter, 30 især naturligt forekommende mutanter, og DNA-sekvenser, som er degenererede.
7 DK 175569 B1 j
Større derivater af DNA-molekylerne med formlen I er deri- | vater, som kan udskæres fra A. niger-genomet, og som inde- | holder DNA-sekvensen med formlen I, som eksempelvis kan 5 forekomme i et genombibliotek fra A. niger opnået ved fragmentering af nucleinsyrerne, behandling af fragmenterne med et egnet restriktionsenzym, f.eks. Sau3A, ligering til et egnet plasmid, f.eks. pUN121, kloning, f.eks. i E. coli, og skæring igen med det samme restrik-10 tionsenzym. Et sådant derivat er f.eks. insertet i plasmid pCG3Bll vist i fig. 1.
Fragmenter af DNA-sekvensen med formlen I er fragmenter, som findes mellem to restriktionssteder valgt blandt restriktionsstederne for PstI, EcoRI, Hindlll, Sau3AI, 15 Knpl, Ncol, Accl, Salll, Pvul, Sall, Spel, Bgll, EcoRV,
Bglll, Aval, Nhel, BssHI, Xmnl, BamHI, BssHII, og lignende som vist i på tegningen.
Der foretrækkes fragmenter, som indeholder promotorsekvensen, signalsekvensen, strukturgenet for PLI og/eller 20 terminatorsekvensen.
Fragmenterne af DNA-sekvensen med formlen I kan Indeholde linkere, som tilvejebringer god binding til andre DNA-molekyler.
PLI-promotorsekvensen forekommer i DNA-området mellem 25 nucleotidpositioner -1 til -688, hvor sekvensen mellem nucleotider ca. -100 og -146 er essentiel. For promotorsekvensen er TATAA-boxen ved nucleotider -120 til -146 vigtig, hvilket også er tilfældet med RNA-polymerasegen-kendelsesstedet. Egnede linkere kan være bundet til disse 30 fragmenter.
Promotoren for PLI fra A. niger er inducerbar, dvs. ekspressionen af strukturgenet knyttet dertil, f.eks. strukturgenet, der koder for PLI eller et vilkårligt andet DK 175569 B1 8 fremmed gen, induceres ved tilsætning af pectin eller pectinspaltningsprodukter til mediet.
Signalsekvensen ligger fra nucleotider 1 til 57. Signal-5 sekvensen er en foretrukken sekvens, og DNA-molekyler, som omfatter den, f.eks. DNA-molekyler indeholdende sekvensen og eventuelt egnede linkere, er foretrukne DNA-molekyler.
Strukturgenet for PLI starter ved nucleotid 58 og går til nucleotid 1366. Som det fremgår af formlen I indeholder 10 strukturgenet flere introns. Strukturgenet kan også indeholde egnede linkere.
Terminatoren starter med stopkodonen TAA ved nucleotid 1367 og kan gå op til nucleotid 1570 eller op til 2029, især op til et af restriktionsstederne i sekvensen.
15 Terminatorfragmentet kan indeholde egnede linkere.
Egnede linkere til de ovenfor omtalte fragmenter har en DNA-sekvens, som passer til restriktionsstedet i DNA, hvortil fragmentet skal bindes, eller som indeholder et restriktionssted.
20 Fragmenter af DNA-sekvensen med formlen X er endvidere sådanne fragmenter, som er sammensat af mindre fragmenter, f.eks. fragmenter sammensat af promotoren og signal- eller struktursekvensen eller af signal- og struktursekvensen, strukturgenet uden intronerne og lignende. 1 2 3 4 5 6
Mutanter af DNA-sekvensen med formlen I er f.eks. natur 2 ligt forekommende mutanter, såsom den mutant, hvis 3 nucleotid Tøg er erstattet med Aøg, hvorved kodonen GTG, 4 som koder for valin, er ændret til GAG, som koder for 5 glutaminsyre. Sidstnævnte aminosyre findes i den PLI, som 6 er isoleret fra en blanding af pecnolytiske enzymer ( "Ultrazym"®, Novo Industri, København) opnået fra en A. niger-stamme. Opfindelsen omfatter også naturlige eller 9 DK 175569 B1 syntetiske mutanter af signalsekvensen med en lignende eller identisk hydrofobicitetsprofil, f.eks. hvor kodonerne for de polære aminosyrer lysin (Κδ+), tyrosin (Υδ_) 5 og arginin (R5 + ) er ombyttet med kodoner for andre aminosyrer med lignende ladninger, og de hydrofobe aminosyrer alanin (A), leucin (L) og threonin (T) er ombyttet med kodoner for andre hydrofobe aminosyrer. Eksempelvis kan kodonen for det positivt ladede lysin 10 ombyttes med en kodon for arginin og omvendt, kodonen for den negativt ladede tyrosin med en kodon for glutamat eller aspartat, og/eller kodonen for det upolære, hydrofobe alanin med en vilkårlig af kodonerne for threonin, prolin, valin, isoleucin, leucin, methionin 15 eller phenylalanin, og lignende. Andre mutanter er såkaldte "stille mutanter" (silent mutations), hvor en eller nogle få nucleotider, f.eks. op til ca. 30, er ombyttet med en eller flere andre nucleotider, hvor de nye kodoner koder for den eller de samme aminosyrer.
20 DNA-sekvenser med formlen I, som er degenererede, er ligesom stille mutanter sådanne, som er degenereret inden for betydningen af den genetiske kode, idet et ubegrænset antal nucleotider er erstattet med andre nucleotider uden ændring af aminosyresekvensen, som de koder for. Sådanne 25 degenererede DNA-sekvenser kan være nyttige på grund af ! deres forskellige restriktionssteder.
Rekombinant DNA-molekyler, som indeholder en DNA-sekvens med formlen I eller et derivat deraf, er især rekombinant-vektorer, som eventuelt betegnes hybridvektorer, der inde-30 holder sådanne DNA-sekvenser som inserter. De kan anvendes til kloning i værter, såsom bakterier, svampe eller dyreceller. Disse hybridvektorer er afledt af en hvilken som helst vektor, som kan anvendes ved gensplejsningteknologien, f.eks. af fager, cosmider, plasmider eller 35 kromosom-DNA, såsom derivater af gaf λ, f.eks. NM 989, M13mp8-fag DNA(15) linerariseret ved BamHI-spaltning, bakterieplasmider, f.eks. pBR322, pUNl21, pUCl8 eller 10 DK 175569 B1 gærplasmider, f.eks. gær 2 μ-plasmid, eller tillige kromo-som-DNA afledt af f.eks. Aspergillus, f.eks. A. niger, f.eks. de i EP 184.438 beskrevne.
5 En hybridvektor ifølge opfindelsen indeholder foruden DNA-sekvensen med formlen I eller et derivat deraf et replika-tionssted og eventuelt, afhængigt af typen af DNA-deriva-tet, en ekspressionskontrolsekvens, såsom en enhancer-sekvens, upstream-aktiveringssted, promotor- og signalse-10 kvenser og/eller strukturgener, som er forskellige fra tilsvarende foreliggende A. niger-afledte sekvenser.
Sådanne enhancer-sekvenser kan afledes af det ekstrakro-mosomale ribosomale DNA fra Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) eller er upstream-aktiveringsstederne fra sur 15 phosphatase PH05-genet (EP ans. nr. 86.111.820.6), eller PH05-, trp-, PH05-GAPDH-hybriden (EP ans. nr. 86.111.820.6), eller lignende promotorer. Disse ekspressionskontrolsekvenser kan være bundet til PLI-struktur-genet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Strukturgener ligeret til de omhandlede promotor-, signal- 2 og/eller terminatorsekvenser er foruden de, som koder for 3 PLI med eller uden introns, også homologe andre pectinly- 4 asegener og heterologe strukturgener, som koder for mange 5 forskellige polypeptider, herunder glycosylerede polypep- 6 tider, som stammer fra især højere eukaryoter, specielt 7 pattedyr, og især af human oprindelse, såsom enzymer, der 8 eksempelvis kan anvendes til fremstilling af næringsmidler 9 og til gennemførelse af enzymatiske reaktioner inden for 10 kemien eller ikke-enzymatiske polypeptider, som er nyttige 11 og værdifulde til behandling af sygdomme hos mennesker og dyr eller til forebyggelse deraf, f.eks. hormoner, polypeptider med immunomodulerende og antivirale egenskaber og antitumoregenskaber, antistoffer, virusantigener, vacciner, koaguleringsfaktorer, levnedsmidler og lignende.
11 DK 175569 B1
Som eksempler på sådanne heterologe strukturgener kan eksempelvis nævnes gener, som koder for insulin, vækstfaktorer, såsom epidermal-, insulinlignende-, mastcelle-, 5 nerve- eller transformationsvækstfaktor, væksthormoner, såsom humane eller bovine væksthormoner, interleukin, såsom interleukin-1 eller -2, human makrofagmigreringsin-hiberingsfaktor (MIF), interferoner, såsom human a~interferon, f.eks. interferon-αΑ, -gB, -aD eller aF, 10 β-interferon, γ-interferon eller et hybridinterferon, f.eks. et gA-gD- eller αΒ-aD-hybridinterferon, hepati-tisvirusantigener, såsom hepatitis B-virusoverfladeantigen eller -kerneantigen eller hepatitis A-virusantigen, plasminogenaktivatorer, såsom vævplasminogenaktivator 15 eller urokinase, tumornecrosisfaktor, somatostatin, renin, (S-endorphin, immunogluboliner, såsom de lette og/eller tunge kæder af immunoglobulin D, E eller G, immunoglobu-linbindingsfaktorer, såsom immunoglobulin E-bindingsfak-tor, calcitonin, human caicitoninbeslægter peptid, 20 blodkoaguleringsfaktorer, såsom faktor IX eller Ville, eglin, såsom eglin C, desulfatohirudin, såsom desulfato-hirudinvariant HV1, HV2 eller PA, eller human superoxid-dismutase. Der foretrækkes gener, som koder for et humant G-interferon eller et humant hybridinterferon, human væv-25 plasminogenaktivator (t-PA), hepatitis B-virusoverfladeantigen (HBVsAg), insulinlignende vækstfaktor I, eglin C og desulfatohirudin, f.eks. variant HV1. 1 hybridvektorerne ifølge opfindelsen er den omhandlede promotor- og/eller signalsekvens operabelt bundet til polypeptidkodnings-30 området for at sikre effektiv ekspression af polypeptidet.
DNA-molekylerne ifølge opfindelsen kan indeholde selektive markører afhængigt af værten, som skal transformeres, selekteres og klones. Der kan anvendes et vilkårligt markørgen, som letter selekteringen af transformanter som 35 følge af den fænotypiske ekspression af markøren. Egnede markører er især sådanne, som udtrykket antibiotikumresistens, f.eks. mod tetracyclin eller ampicillin, eller, i DK 175569 B1 12 tilfælde af auxotrophe gærmutanter, gener, som kompletterer værtslæsioner. Tilsvarende gener tilvejebringer resistens mod antibiotiket cycloheximid eller tilvejebrin-5 ger prototrophy i en auxotroph gærmutant, f.eks. ura3- , leu2-,his3- eller trpl-genet. Som markører er det endvidere muligt at anvende strukturgener, som er forbundet med et autonomt replicerende segment, forudsat at værten, som skal transformeres, er auxotroph for 10 produktet, som udtrykkes af markøren.
Særlig betydning har markørgener, som kompletterer A. niger-værtlæsioner, såsom argB-genet, der koder for ornithincarbamoyltransferasen, f.eks. afledt af A. niger eller A. nidulans (EP 184.438), eller A. nidulans-DNA-15 fragmenter, som er homologe med N. crassa pyr4-genet (26).
Foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse er hybridvektorer, hvori strukturgenet, især det fremmede strukturgen, er operativt bundet til promotor- og signalsekvenserne ifølge opfindelsen. Sådanne 20 hybridvektorer er f.eks. pCG3Bll, M13mp8PL (Sall-EcoRl) BssHII/BE5, pUBE5, pLHK3, pLHL5 og pLHLT7. Andre nyttige hybridvektorer er pPL29-5 og pPL35-5 (se eksemplerne og tegningen).
DNA'et med formlen I og derivaterne deraf, herunder 25 fragmenter kan anvendes til screening af DNA-genbanker eller mRNA for lignende DNA'er eller mRNA'er.
Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant DNA-moleky-ler
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til 30 fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, som koder for et pectinlyaseekspressionssystem eller et derivat deraf, ved hvilken man dyrker en vært transformeret med et DNA-molekyle, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for 13 DK 175569 B1 pectinlyaseekspressionssystemet, eller et derivat deraf, og isolerer det ønskede rekombinant DNA-molekyle eller derivatet deraf eller fremstiller det ved in vitro-syn-5 tese-
Dyrkningen af værterne gennemføres i et almindeligt næringsmedium, som kan være tilsat eller mangle kemiske forbindelser, som tillader negativ eller positiv selektering af transformanterne, dvs. sådanne værter, som inde-10 holder det ønskede DNA-molekyle sammen med en selekteringsmarkør, fra de ikke-transformerede, f.eks. værter, der mangler det ønskede DNA-molekyle.
Der kan anvendes en hvilken som helst transformerbar nyttig vært, f.eks. bakterier, såsom E. coli, svampe, 15 såsom Saccharomyces cerevisiae, eller især trådsvampe, såsom Aspergillus, f.eks. A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori og især A. niger. En foretrukken vært er A. niger An8, der er en ny mutant, som mangler pyrA-genet, som beskrives nærmere i det følgende. Trans-20 formationen af værterne gennemføres på sædvanlig måde.
DNA-sekvensen, som koder for PL-ekspressionssystemet, opnås fra en trådsvamp, som indeholder et sådant system, især fra et genombibliotek derfra eller tillige via mRNA’et.
25 I det følgende beskrives fremstillingen af PLI-ekspres~ sionssystemet mere detaljeret.
Et genombibliotek kan eksempelvis fremstilles ved partiel spaltning af genom-DNA fra en A. niger-stamme, f.eks.
N756, med Sau3AI, og kloning af DNA-fragmenterne med høj 30 molekylvægt i E. coli-plasmidet pUNl21. Der kan anvendes en hvilken som helst anden A. niger-stamme, som producerer PLI, som kilde for genombiblioteket, og der kan ligeledes anvendes andre egnede vektorer som recipient for fragmen- DK 175569 B1 14 terne.
For at opnå god screening af genorobiblioteket for DNA-se-kvenser, som koder for PLI, er det nødvendigt at foretage 5 sekvensbestemmelse af dette enzym eller dele deraf. PLI oprenses fra en kommerciel blanding af pectinolytiske enzymer fra A. niger ("Ultrazym"®, Novo Industri) og sekvenseres. N-terminalen i modent PLI har sekvensen v1-g-v-x4-g-t6-p-e-g-f-a 10 og et fragment af PLI, som fås ved spaltning af PLI med bromcyanid, har den N-terminale sekvens
Vi29-S-G-V-S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-Xi43-D-I-N-Xi47-E
hvori aminosyrerne X endnu ikke er identificerede.
Baseret på disse aminosyresekvenser fremstilles et antal 15 DNA-prober, f.eks. blandinger af DNA-sekvenser, som koder for dele af aminosyresekvenserne og de tilsvarende degenererede DNA-sekvenser, ad kemisk vej og anvendes til screening. Sådanne DNA-prober er eksempelvis blandingerne med formlen 20 3' TGRX GGRx CTR2 CCR3 AAR3 CG5' (2014) (la) eller 3’ TGRx GGRy CTR2 CCR2 AAR3 CG5’ (2015) (Ib) hvori Ry er A, C, G eller T, R2 er C eller T, og R3 er A eller G, eller DNA-blanding 2060 med formlen 5’ AARx ATR2 ATR2 ATR2 CAR3 A 3' (2060) (Ic) 25 hvori Ry er A eller T, R2 er A, T eller C, og R3 er A eller G.
15 DK 175569 B1
Da den totale DNA-sekvens i PLI-genet blev fastlagt under arbejdet med den foreliggende opfindelse, kan alle dele deraf, der indeholder mindst ca. 14 bp, anvendes til 5 screening, herunder også screening for mRNA, der koder for PL-systemet.
Med henblik på screening foretages 5’-radioaktiv markering af DNA-proberne på kendt måde under anvendelse af γ^Ρ-ΑΤΡ og T4-kinase. Værtmikroorganismer, som indeholder nuklein-10 syre ifølge opfindelsen som et insert, identificeres ved hybridisering med den mærkede DNA-probe på filterkopier af genbiblioteket.
Til tilvejebringelse af et underbibliotek kan kloner af biblioteket, som viser et radioaktivt respons på den 15 radioaktivt mærkede DNA-probe, der koder for den N-terminale del af PLI, isoleres, dyrkes og hybridiseres med den anden DNA-prooe, som Koder for de N-termianle aminosyrer i CNBr-fragmentet, som beskrevet ovenfor.
Kloner, som giver et hybridiseringsrespons på den ene 20 eller begge DNA-prober, isoleres og forstærkes.
Eksempelvis giver screening med DNA-prober 2014 og 2015 henholdsvis 33 og 39 positive kloner. De 72 kloner forstærkes, og de opnåede underbiblioteker genscreenes med DNA 2050, hvorved 3 positive kloner kan identificeres. En 25 klon udvælges og betegnes E. coli BJ 5183/pCG3Bll. Den indeholder plasmid pCG3Bll, hvoraf et partielt restriktionskort er vist i fig. 1. Sau3AI-fragmentet af pCG3Bll indeholder Spel-Nhel-fragmentet vist i fig. 4 og formlen I. 1
Plasmid pCG3Bll kan anvendes til konstruktion af andre DNA-molekyler ifølge opfindelsen ved anvendelse af konventionel gensplejsningsteknik.
16 DK 175569 B1
Eksempelvis fører restriktion af pCG3Bll med EcoRI og kloning af de to fragmenter i plasmid pUN121 til plasmid pPL 29-5 (fig. 2), som indeholder promotoren, signalse-5 kvensen og delen af struktur PLI-genet op til det centrale EcoRI-restriktionssted ved position 649/650, samt til plasmid pPL35-5 (fig- 3), som indeholder en del af PLI-strukturgenet startende ved position 650 og termlnatoren. pPL 29-5 indeholder desuden de N-terminale flankerings-10 sekvenser, og pPL35-5 indeholder de C-terminale flankeringssekvenser af pCG3Bll.
Fragmenter af inserterne i plasmider pPL29-5 og pPL35-5 kan opnås til sekvensering ved restriktion med egnede enzymer, f.eks. Ahalll, PstI, Aval, Hindlll, EcoRI, Kpnl, 15 Clal, Ncol, Accl, Sall, Pvul, Sall I, Nhel, Bgll, EcoRI og EcoRV. Fragmenterne kan underklones, f.eks. i forskellige Ml3-fager, fortrinsvis M13mp8 og M13mpl8, og sekvenseres, f.eks. under anvendelse af M13 klonings- og sekvenseringssættet (M13 Sequencing Kit N.4502, Amersham) under de 20 betingelser, som er anført af leverandøren (16). Fuldstændig sekvens for 2,7 kb Spel-Nhel-fragmentet, som indeholder den fuldstændige sekvens af PLI-genet, er vist i fig. 4. Den omfatter 688 nucleotider fra promotorområdet, 1369 nucleotider fra den strukturelle del af PLI-25 genet og 661 nucleotider fra terminatorområdet. Sekvensen af pPL29-5, svarende til aminosyresekvensen for N-terminalen af PLI som bestemt ved aminosyresekvensanalyse (eksempel 1), har foran sig 57 nucleotider, som koder for signalpeptidet med formlen 30 Mx-K-Y-A-A-A-L-T-A-I-A-A-L-A-A-R-A-A-Asy
Aminosyresekvensen for N-terminalen af det C-terminale CNBr-fragment fra PLI (eksempel 3) indkodes ikke kontinuerligt af det klonede DNA-fragment fra pPL35-5 (nucleo-tid 1257-1379). En computerundersøgelse for consensus-35 sekvenser af exon/intron-forbindelsespunkter samt for 17 DK 175569 B1 indre intronsekvenser (E. Boel et al., (18) og S.M. Mount (19)) fører til antagelsen af tilstedeværelsen af fire introns med længder på henholdsvis 65 bp, 62 bp, 63 bp og 5 57 bp (fig. 4).
En fag, som er opnået fra fager Ml3mp8 og 0,8 kb SalI-EcoRI-fragmentet af plasmid pPL29-5, som indeholder 130 nucleotider af promotoren og den N-terminale del af PLI-genet, betegnes M13mpl8(Sall-EcoRI) og anvendes i de 10 efterfølgende trin til fremstillingen af andre DNA-mole-kyler ifølge opfindelsen.
Andre DNA-molekyler ifølge opfindelsen, som omfatter fragmenter af DNA-sekvensen med formlen I, kan konstrueres som illustreret i fig. 5-9, hvorved man, om ønsket, 15 kan indføre nye restriktionssteder, f.eks. et BssHII- restriktionssted i signalsekvensen i PLI-genet. Sådanne DNA-molekyler er plasmiderne eller fagerne pUBE5, MPmp8-PL(Sall-EcoRI)BssHII/BE5 (fig. 5), pLHK3 (fig. 7) og pLHL5, M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5 pLHLT7 (fig. 9), 20 blandt hvilke de tre sidstnævnte plasmider indeholder strukturgenet, som koder for desulfatohirudin.
Mutanter, som indeholder nye restriktionssteder, kan eksempelvis fremstilles in vitro ved steddirigeret mutagenese under anvendelse af sædvanlige fremgangsmåder 25 [jf. Oversigtsartikel af M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 (1985) eller K. Norris et al., Nucl.
Acid. Res. 11, 5103 (1983)].
Eksempelvis afledes en mutant af de omhandlede DNA-sekvenr 30 ser fra M13mp8PL(Sal-EcoRI)-fagen, som omfatter promotoren og sekretionssignalgenet for PLI. Indføring af et nyt BssHll-sted i signalsekvensområdet i MN13mp8PL(Sal-EcoRI)-genet gennemføres ved anvendelse af et kemisk fremstillet primeroligonucleotid, som er komplementært til DNA-sekven- 18 DK 175569 B1 sen i positionerne 36-54 anbragt nær den C-terminale del af PLI-signalsekvensen bortset fra, at der i position 45 er indført en C/G-transversion (mutagenprimer).
5 Den muterede fag, som bærer det ny BssHIi-sted, betegnes Ml3mp8PL (Sal-EcoRI) BssHIl og kan anvendes til kontruk-tionen af ekspressionsvektorer for homologe eller heterologe gener.
I et tilsvarende eksempel reklones desulfatohirudingenet 10 fra pML3l0 (EP 168.342) i fag Ml3mpl8-PL(Speel-EcoRI)-BssHii/AC5 (fig. 6-9). For at gøre Hgal-restriktionsstedet i desulfatohirudingenet i pML301L foreneligt med BssHII-stedet i M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHlI/AC5, konstrueres en Hgal/BssHII-linker. Linker DNA'et ligeres til det 15 spaltede fag DNA. Fag DNA'et, som bærer linkerfragmentet, spaltes med Hindlll, som giver to fragmenter. 0,7 kb-frag-mentet, der indeholder signalstrukturen for PLI og linkerfragmentet, isoleres. Et egnet replikationsplasmid, som bærer et BamHI-restriktionssted, såsom pBR322, spaltes med 20 BamHI. Genet, som skal klones, skæres ud af genom-DNA, plasmid eller fag-DNA med egnede restriktionsenzymer og forsynes, om nødvendigt, med de nødvendige kompatible restriktionssteder.
En anden fremgangsmåde, som kan anvendes til at gøre 25 restriktionsstederne kompatible, er in vitro-mutagenese, som f.eks. gennemført ved konstruktionen af pML30lL (fig.
6). En linker, som indeholder et Hgal-restriktionssted konstrueres og bindes til 5'-terminalen af desulfato-hirudingenet. 1
Til opnåelse af højere ekspressionsrater kan en vilkårlig eukaryotisk terminatorsekvens ligeres til strukturgenets ende. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen anvendes terminatorområdet i PLI-genet. Eksempelvis kan en ekspressionsvektor, som indeholder terminatorstedet fra 19 DK 175569 B1 PLI, opnås ved at ændre den ovenfor beskrevne fremgangsmåde som følger: Promotor- og sekretionssignalsekvenserne opnås fra plasmid M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHII/AC5. Termi-5 natorområdet opnås fra pPL35-5. Ml3mpl8-PL(Spel-EcoRI)-
BssHII/AC5 spaltes med BssHII, og en BssHlI-Hgal-linker ligeres. Ved ændringen spaltes plasmid pPL35-5 med Pstl, som giver to fragmenter, hvortil der igen ligeres en egnet linker, som er forenelig med 3'-enden af det klonede gen.
10 De klæbrige ender af Pstl-restriktionsstederne udfyldes ved hjælp af enzymet T4-polymerase, og der adderes en BamHI-linker, som eksempvis kan fås fra Biolabs, New England. pPL35-5-plasmidet spaltes med Nhel, og det dannede 0,7 kb-fragment, som indeholder terminatorområdet 15 for PLI, isoleres. Til forstærkning kan man anvende et hvilket som helst plasmid, som har kompatible restriktionssteder, f.eks. pUC18. I tilfælde af pUC18 spaltes plasmidet md Hindlll og Xbal. Fire DNA-fragmenter, Ml3mpl8-PL(Spel-EcoRI)BssHli/AC5-fragmentet, som bærer 20 BssHII-Hgal-linkeren, 0,7 kb-fragmentet af pPL35-5, som bærer BamHI-linkeren, HindiII/Xbal spaltet pUC18 og
Hgal-BamHI-fragmentet af desulfatorhirudingenet, ligeres til dannelse af pLHL7 (fig. 9).
Bakterie transformeres på sædvanlig måde, og transfor-25 manterne identificeres ved hjælp af deres resistens, f.eks. mod tetracyclin.
Specielt forstærkes de beskrevne ekspressionsvektorer i egnede E. coli-værtstammer, såsom HB101, transformeret (10) og selekteret under anvendelse af sædvanlige kendte 30 fremgangsmåder. Det forstærkede plasmid DNA isoleres fra bakterierne på sædvanlig måde, især som beskrevet af Birnboim & Doly (17).
På tilsvarende måde kan der konstrueres andre plasmider med andre homologe eller heterologe gener.
20 DK 175569 B1 DNA-molekylerne ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved en in vitro-syntese under anvendelse af kendte fremgangsmåder. In vitro-syntesen er særlig anvendelig til 5 fremstillingen af mindre fragmenter af PL-ekspressionssy-stemet, f.eks. DNA-sekvenserne, som koder for promotoren eller især signalsekvensen for PLI, eller mutanter deraf.
DNA-molekyler ifølge opfindelsen indeholdende PLI-promo-toren og eventuelt PLI-signalsekvensen, PLl-strukturgenet, 10 et vilkårligt andet heterologt strukturgen og/eller PLI-terminatoren kan også anvendes til at transformere trådsvampe, såsom Aspergillus, Penicillium eller Cephalosporium, f.eks. A. nidulans, A. oryzae, A. bonarius og især A. niger.
15 For at kunne foretage selektering af de transformerede svampe fra de ikke-transformerede svampe bærer DNA-molekylerne ifølge opfindelsen en selektionsmarkør, eller svampene cotransformeres eventuelt med en anden vektor, som indeholder en sådan markør. Som i andre 20 systemer er en sådan selektionsmarkør et ekspressibelt strukturgen, hvor det udtrykte polypeptid (et enzym) tilvejebringer resistens mod forbindelser, som er giftige over for transformanten, eller som kompletterer enzymsystemet hos en mutant, som mangler et sådant 25 essentielt polypeptid. Sådanne markørgener er eksempelvis de kendte qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS- eller argB-gener.
I forbindelse med den foreliggende opfindelse er der isoleret et nyt markørgen med betegnelsen pyrA fra 30 genombiblioteket for A. niger, som er beslægtet med og har lignende funktion som pyrG fra A. nidulans og pyr4 fra N. crassa, dvs. producerer enzymet orotidin 5'-phosphat-decarboxylase. Dette enzym katalyserer decarboxyleringen af orotidin 5'-phosphat til uridylsyre (uridin 35 5'-phosphat) og decarboxylerer også fluor-orotsyre til det 21 DK 175569 B1 giftige fluor-uridin. En E. coli-klon, som indeholder pyrA-genet, identificeres ved hybridisering med 1,1 kb HindiII-fragmentet af pJDB2 (26), som indeholder en del af pyr4-genet, men der kan imidlertid anvendes DNA fra et 5 vilklårligt andet pyr-gen, som koder for orotidin-5'-phos-phat-decarboxylase. Fra en positiv klon med E. coli B75183/pCG59D7 isoleres plasmidet pCG59D7, som indeholder pyrA-genet, og det anvendes til cotransformation af en A. niger pyrA'-mutant. En sådan pyrA"-mutant har fejl i iO orotidin-5'-phosphat-decarboxylasegenet og er derfor ikke i stand til at producere det tilsvarende enzym. En sådan mutant fremstilles ved behandling af conidiosporer af A. niger N756 under imiterende UV-bestråling, og kolonier, som overlever i nærværelse af fluor-orotsyre og uridin, udvælges. Kolonier, der overlever i nærværelse af fluor-orotsyre og i fravær af uridin elimineres. De tilbageblevne uridin-krævende mutanter, hører i overensstemmelse med deres evne til at være transformerbare til to komplementeringsgrupper pyrA og pyrB, repræsenteret ved 2 0 mutanterne henholdsvis Ab8 og AnlO. De behandles i form af protoplaster under transformeringsbetingelser med det pyrA-holdige plasmid pCG59D7. Det viser sig, at kun
An8-kolonierne er transformeret og indeholder pyrA-genet, hvilket påvises ved hybridiseringsevnen ved spaltet DNA -5 derfra med DNA fra pUN121.
Opfindelsen angår endvidere værter transformeret med hybridvektorerne ifølge opfindelsen samt fremgangsmåder 30 til deres fremstilling. Sådanne transformanter er f.eks. bakterier, såsom E. coli, eller trådsvampe, såsom
Aspergillus, Penicillium eller Cephalosporium, og især A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius eller fortrinsvis A. niger, f.eks. A. niger An 8. Opfindelsen angår tillige en 35 fremgangsmåde til fremstilling af sådanne transformanrer, ved hvilken en vært behandles under transformeringsbeting- 22 DK 175569 B1 eiser med et rekombinant DNA-molekyle, især en hybridvektor, ifølge opfindelsen, eventuelt sammen med et selektionsmarkørgen, og transformanterne selekteres.
5 Opfindelsen angår desuden anvendelsen af rekombinant DNA'erne eller et derivat deraf til fremstilling af hybridvektorer, som udtrykker nyttige polypeptider, f.eks.
PLI, desulfatohirudin og lignende forbindelser.
20 Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af polypeptider, og fremgangsmåden er ” — ejendommelig ved, at en hybridvektor ifølge opfindelsen udtrykkes i en egnet vært, og polypeptidet isoleres på konventionel måde. Denne fremgangsmåde omfatter overpro-15 duktionen af PLI i Aspergillus-arter ved dyrkning af en Aspergillus-vært transformeret med en ekspressionshybridvektor til ekspressionen og udskillelsen af PLI, hvorpå PLI isoleres fra dyrkningsmediet.
2o Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser restriktionskortet for plasmid pCG3Bll, som indeholder et Sau3AI-fragment fra A. niger-stammen N756, 25 fig. 2 viser restriktionskortet for plasmid pPL29-5, som indeholder det N-terminale EcoRI-fragment af DNA'et med formlen I, 30 fig. 3 viser restriktionskortet for plasmid pPL35-5, som indeholder det C-terminale EcoRI-fragment af DNA'et med formlen I, fig. 4 viser DNA'et med formlen I med angivelse af nogle 35 restriktionssteder og signal- og strukturaminosyresekven-serne for PLI, 23 DK 175569 B1 fig. 5 viser konstruktionen af pUBE5 fra Ml3mp8-PL(Sall-EcoRI)BssHII/BE5 og pUNl21, pUBE5 indeholder en del af PLI-promotoren, signalsekvensen med BssHII-restriktions-5 sted og en del af PLI-strukturgenet, fig. 6 viser konstruktionen af pML310L, som indeholder desulfatohirudingenet, fig. 7 viser konstruktionen af pLHK3, som indeholder en del af PLI-promotoren, signalsekvensen med BssHII-re-10 striktionsstedet, linkeren BssHII-Hgal og desulfatohirudingenet , fig. 8 viser konstruktionen af pLHL5, som indeholder PLI-promotoren, signalsekvensen med BssHII-restriktionsstedet og desulfatohirudingenet og 15 fig. 9 viser konstruktionen af pLHLT7, som indeholder PLI-promotoren, signalsekvensen med BssHII-restriktionsstedet, desulfatohirudingenet og PLI-terminatoren.
Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, hvori der anvendes følgende forkortelser: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 bp basepar 2 BSA bovint serumalbumin 3 cpm tællinger pr. minut (radioaktivt henfald) 4 dATP 2'-deoxyadenosintriphosphat 5 dCTP 2'-deoxycytidin-triphosphat 6 dGTP 2'-deoxyguanosin-triphosphat 7 dTTP 2'-deoxythymidin-triphosphat 8
dNTP blanding af dATP, dCTP, dGTP og dTTP
9 CIAP alkalisk phosphatase fra kalvetarm 10 DNA deoxyribonucleinsyre 11 DTT 1,4-dithiothreitol EDTA ethylendiamintetraeddikesyre-dinatriumsalt IPTG isopropyl-Ø-D-thio-galactopyranosid 24 DK 175569 B1 kb kilobaser
PL pectinlyase I
PTH phenylthiohydantion 5 RF-DNA dobbeltstrenget DNA på replikativ form RNA ribinucleinsyre SDS natriumdodecylsulfat ss enkeltstrenget
Tris tris(hydroxymethyl)-aminomethan
10 tRNA transfer RNA
U enheder X-GAL 5-brom-4~chlor-3-indolyl-/3-galactosid Puffere, medier og reagenser: ss-Denhardt 0,02% ficoll (Sigma), 0,02% polyvinyl- 15 pyrrolidon (Sigma), 0,02% BSA (Sigma), 100 ^g/ml denatureret laksesperma DNA (Sigma)
EcoRl-puffer 0,01 M Tris HC1 pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol 20 Hgal-puffer 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 ^g/ml BSA, 6 mM Tris-HCl pH 7,4 IPTG 100 mM isopropyl-f?-D-thio-galactopy- ranosid (23,8 mg/ml i H2O) fremstilles lige inden anvendelse 25 LB-medium 1% Bacto trypton (Difco), 0,5% Bacto
gærekstrakt (Difco), 170 mM NaCl, indstillet til pH 7,5 med NaOH
ligeringspuffer 20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM di- thiothreitol, 0,6 mM ATP, pH 7,6 30 TBE-puffer 1 liter indeholdende 10,8 g Tris, 5,5 g borsyre, 4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
TE-puffer 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA
lav TE-puffer 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA
topagar 10 g Bacto trypton, 8 g NaCl, 8 g agar 35 pr. liter 2xTY-medium 16 g Bacto trypton, 10 g gærekstrakt, 5 g NaCl pr. liter 25 DK 175569 B1 X-GAL 2% (5-brom-4-chlor-3-indolyl-b-galacto- sid) i dimethylformamid fremstillet lige inden brug 5 SOC-medium 2% Bacto trypton (Gibco), 0,5% gæreks trakt (Gibco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1,
10 mM MgCl2, 5 mM MgS04, 20 glucose kinasepuffer 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DDT
(pH 7,5)
10 X-gal-plader 0,002% X-Gal, 0,07 mM IPTG
NET 0,15 M NaCl, 0,015 M Tris.HCl (pH 7,5),
1 mM EDTA
minimalmedium 0,5% Na2HP04, 0,1% NH4CI, 0,05% NaCl, 1 mM MgS0,j, 0,01 mM CaCl2, 1 mM thi- 15 amin-HC1, 0,2% glucose minimalmedium 1 liter indeholder 5 g NaN03, 0,52 g
KC1, 0,52 g MgS04 x 7 H20, 1,52 g KH2PO4, spor af Zn, FGe, 10 g glucose, indstillet til pH 6,5 med NaOH
20 kompletmedium til A. niger Mycophil-Agar (BBL) PCT 25% polyethylenglycol 6000 (Merck,
Darmstadt) i 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM CaCl2 25 sporulerings- medium 10 g/1 phytonpepton, 10 g/1 glucose, 10 g/1 agar SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat
Alle plademedier størknes ved tilsætning af 1,5% Bacto 30 agar (Difco).
Der anvendes følgende stammer: E. coli-stamme HB101: Fp, hsdS20(r~Bm-B), recA13, ara!4, proA2, lacYl, galK2, rpsL20(strR), xyl-5, mtl-1, supE44, λ (Maniatis et al. (8)) 26 DK 175569 B1 E. coli-stamme BJ5183: F“, endA, sbcB~, recBC~, galK, met-, strR, thi-1, bioT, hsdR( rj<, mjj£),X Hanahan (10)) E. coli-stamme JM101: supE, thi, A(lac-proAB), (F1, 5 traD36, proAB,lac!9ZAM15) (Yanish-Perron et al. (25))
Aspergillus niger-stamme N756: A. niger-stamme N756 er blevet udvalgt til storproduktion af enzymer i det pec-tinolytiske kompleks.
Der anvendes følgende vektorer: 10 Ml3mp-fag
Ml3mp8, -9, -18, -19-vektorerne (28) er derivater af den enkeltstrengede DNA-bateriofag M13 og er udformet for at lette DNA-sekvensering ved at tillade kloning af DNA-fragmenter til et bevægeligt polylinkersted og kloningen af 15 det samme restriktionsfragment i de to mulige orienteringer. Sekvenser klonet til disse vektorer kan let anvendes som templater til sekvenseringsreaktioner eller fremstillingen af enkeltstrengede prober under anvendelse af en oligodeoxynucleotidstandardprimer og Klenow-fragmentet af 20 Escherichia coli-DNA-polymerase I. Vektor-DNA'et bærer E. coli 1ac-operonpromotoren og den genetiske information for de første 145 aminosyrer i β-galactosidase. Polylinkerse-kvenserne, som indeholder multiple restriktionssteder, indsættes i lacZ-sekvensen. Polylinkeren bevarer lacZ-af-25 læsningsstrukturen, og vektoren giver allel komplemen-tering af en 1acZa-værtstamme, hvilket fører til blå plaque på plader, som indeholder IPTG og X-gal. Rekombi-nantfager, som indeholder inserter, der ødelægger aflæsningsstrukturen eller på anden måde forstyrrer ekspres-30 sionen af lacZa-peptidet, viser sig som farveløse plaque.
27 DK 175569 B1 pUCl8-plasmid pUC18-plasmidet (28) kan anvendes til kloning af DNA-sekvenser i lacZa-området, forudsat en påvisning af 5 transformanter indeholdende rekombinantplasmider på basis af deres Lac-phenotype. Bakterier, som indeholder plasmi-der uden inserter, danner blå kolonier på indikatorplader (plader med X-gal), medens bakterier, som indeholder rekombinantplasmider, danner hvide kolonier. Plasmid pUC18 10 indeholder entydige kloningssteder i lacZn-området, som passer til kloningsstedeme i Ml3mpl8-fag. Plasmidet bærer et gen for ampR.
pML 31Q-plasmid pML3l0 er beskrevet i beskrivelsen til europæisk patent-15 ansøgning nr. 0.168.342, og pML 310 er karakteriseret ved amp”, trp-promotoren og et gen, som koder desulfatohiru-din, en thrombininhibitor, der forekommer naturligt i igler.
pUNl21-plasmid 20 Plasmid pUNl21 [Nilsson et al. (9)] kan anvendes som en kloningsvektor, som tillader positiv selektering af transformanter, som indeholder plasmider med DNA-inserter. Plasmidet indeholder cl^-genet fra bakteriofag-X og tet-genet. Bakterier, som indeholder pUN121, er følsomme 25 for tetracyclin, da tet-genet er transskriberet fra den højere promotor for bakteriofag-X, og denne promotor kan undertrykkes ved hjælp af den cl-indkodede repressor. Indsætning af DNA-fragmenter i et af stederne i cl-genet inaktiverer repressorgenet, hvilket giver tetracyclin-30 resistente transformanter. Desuden har plasmid pUN121 et funktionelt amp-gen, således at forstærkningen af plasmid DNA kan gennemføres under selekteringsbetingelser.
28 DK 175569 B1 pBR322-plasmid
Plasmid pBR322 bærer gener for resistens mod antibiotikaene ampicillin (ampR) og tetracyclin (tetR).PIasmiderne ! 5 bærer flere entydige kloningssteder, hvoraf nogle findes i enten amp- eller tet-genet, således at indsætning af klonet DNA fører til antibiotkafølsomme bakterier.
pPJB2-plasmid
Dette plasmid er beskrevet af Ballance og Turner (26).
10 Eksempel 1
Isolering og karakterisering af pectinlyase I
i 1.1: Aminosyresekvensbestemmelse for den N-terminale del
af pectinlyase I
Pectinlyase I oprenses fra "Ultrazym"® (en blanding af 15 pectinolytiske enzymer udvundet fra A. niger, Novo Industri, København) analogt med fremgangsmåden beskrevet af F.E.A. von Houdenhoven (1). 2 mg pectinlyase I
dialyseres mod flere flere destilleret vand, hvorpå der lyofiliseres. Proteinet opløses i 1,5 ml 100 mM NaHCOg, pH 20 10,0, og opbevares ved stuetemperatur i 3 timer. Denne behandling viser sig at forøge antallet af trin, som kan sekvenseres pålideligt ved hjælp af den automatiske Edman-nedbrydningsmetode (2). Efter basebehandlingen dialyseres proteinet mod 1 liter destilleret vand, 1% myresyre og 25 derpå mod destilleret vand. Der foretages automatisk
Edman-nedbrydning på en Beckman-sekvensator med roterende ; ! bærer, model 890 C. Det intakte reducerede og carboxymeth- | ylerede protein spaltes under anvendelse af et kvadrol i enkeltspaltningsprogram (modifikation af Beckman-program ! 30 072172 C). Nedbrydningen af peptidet gennemføres under anvendelse af et dimethylbenzylamin-enkeltspaltningspro- 29 DK 175569 B1 gram (Beckman program 082773) eller programmet dannet af Hunkapillar og Hood. For at undgå udvaskning af peptidet anvendes 2,5 mg torskeparvalbumin som bærer (3).
5 Phenylthiohydfantoinderivater af aminosyrer identificeres ved high-perfomance-væskekromatografi i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Frank og Strubert (4). For pectinlyase I findes følgende N-terminale aminosyrese-kvens:
10 V-G-V-X4-G-T-P-E-G-F-A
Aminosyre X4 er højt sandsynligt Ser, men dens nærværelse er ikke entydigt fastlagt.
1.2: Fremstilling af bromcyanidfragmenter af pectin
lyase I
15 Reduktion og S-carboxymethylering af pectinlyase I gennemføres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Crestfield et al. (5). 3 g urinstof (ultrarent) opløses i 5 ml destilleret vand, og opløsningen omrøres med 0,5 g mixed-bed-ionbytter (Biorad Ag 50 1-X8) i 1 time. Efter 20 fjernelse af ionbytterperlerne sættes 10 mg EDTA og 200 mg Tris til 4 ml af urinstofopløsningen, og pH-værdien indstilles på 8,5 med HCl. Opløsningen indstilles på et slut-rumfang på 5 ml i et hætteglas med destilleret vand. Derpå tilsættes 5-20 mg pectinlyase I renset som beskrevet af 25 F.E.A. van Houdenhoven (1), og hætteglasset opbevares under et nitrogenspærrelag.
Til sidst tilsættes 33 μΐ /3-mercaptoethanol, og reduktionen fortsættes i 4 timer ved stuetemperatur under et nitrogenspærrelag. Til reaktionsblandingen sættes 0,33 ml 30 af en frisk fremstillet opløsning (0,258 g iodeddikesyre i en 1 ml 1 N natriumhydroxidopløsning) under nitrogen, og blandingen holdes i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur.
30 DK 175569 B1
Reaktionen afbrydes ved tilsætning af β-mercaptoethanol.
Derpå sættes det carboxymethylerede protein på en "Sephadex"® G-25-gelfiltreringssøjle (100 ml lagrumfang), 5 som er omviklet i aluminiumfolie, og der elueres med 0,5% myresyre. Proteinfraktionerne hældes sammen og lyofiliseres.
Den carboxymethylerede pectinlyase I (2-10 mg) opløses i 70% myresyre, og der tilsættes fast bromcyanid i oratrent-10 ligt 100-dobbelt molært overskud i forhold til methionin, hvoraf der forekommer en rest pr. pectinlyase I.
Reaktionsblandingen omrøres kontinuert i 24 timer ved stuetemperatur i en lukket reaktionsbeholder. Der udtages prøver på 5 μΐ med regelmæssig tidsrum, og prøverne 15 analyseres på 15% SDS-PAGE for at kontrollere omfanget af proteinspaltningen. Efter 24 timers forløb tilsættes vand, og blandingen inddampes delvis ved skylning med nitrogen.
Dette trin gentages til fjernelse af myresyren.
SDS-PAGE-analysen identificerer foruden noget restpectin-20 lyase I, to bromcyanidpeptider, CBI og CBII, med en tilsyneladende molekylvægt på henholdsvis 16,5 og 30 kD.
Disse fragmenter renses ved gelpermeeringskromatografi under anvendelse af en "Sephacryl-S200"®-søjle (længde 190 cm, diameter 1 cm) ækvilibreret i 20 mM natriumphosphat-25 puffer pH 6,0, 100 mM NaCl 4 M urinstof og 1% (r/r) β- mercaptoethanol. CBII-Fragmentet fremkommer i to toppe, hvor den ene top eluerer før den resterende mængde intaktprotein, som derfor må repræsentere et aggregat, og en anden top i mellem det intakte protein og det lille 30 CBI-fragment.
1.3: Aminosyresekvensbestemmelse af den N-terminale del af CBII fra pectinlyase I 1 μg af det rensede ikke-aggregerede CBll-fragment fra eksempel 1.2 anvendes til de automatiske Edman-nedbrydnin- 31 DK 175569 B1 ger (2) under anvendelse af en Beckman-sekvensator med roterende bærer. Omdannelsen til PTH-aminosyrerne gennemføres efter inddampning af fraktionerne og tilsæt-5 ning af 200 μ 2 N HC1 i methanol til remanensen i 15 min. ved 65°C. Opløsningen inddampes derpå igen, og remanensen optages i 50 μΐ THF/CH3CN (1:1). PTH-Aminosy-rerne identificeres ved hjælp af HPLC under anvendelse af en "Zorbax CN"®-søjle (DuPont) i overensstemmelse med R.
10 Knecht et al. (5).
Den N-terminale aminosyresekvens for CBII er sin følger:
V-S-G-V“S-N-I-I-I-Q-N-I-A-V-X1s-D-I-N-X1g-E
X^5 og X^9 er aminosyrerester, som ikke er blevet identificeret.
15 Eksempel 2
Konstruktion af et genombibliotek fra Aspergillus niger 2.1: Isolering af højmolekylært DNA fra Aspergillus niger
Isoleringen af DNA med høj molekylvægt fra A. niger gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden ifølge 20 Yelton et al. (7). Conidiosporer af A. niger-stamme N756 inokuleres i 200 ml minimalmedium indeholdende 0,1% arginin og rystes i 500 ml-kolber med en brønd ved 28°C på et roterende rysteapparat i 2-3 dage. Myceliet høstes ved filtrering, vaskes med koldt sterilt vand, fryses og 25 pulveriseres i flydende nitrogen. Cellerne suspenderes hurtigt i 20 ml 50 mM EDTA pH 8,5, 0,2% SDS og 20 μΐ diethylpyrocarbonat og lyseres ved kraftig rystning i 1 min. ved stuetemperatur. Lysatet opvarmes ved 68°C i 15 min., afkøles til stuetemperatur og centrifugeres i 15 30 min. ved 12.000 G ved stuetemperatur. 16 ml af super-natanten overføres til et nyt rør, og efter tilsætning af 32 DK 175569 B1 1 ml 8 M kaliumacetat pH 4,2 anbringes røret på is i 1 time. Bundfaldet centrifugeres ved 25.000 G i 15 min. ved 4°C. 12 ml af supernatanten udvindes, og nucleinsyrerne 5 fældes med 12 ml isopropanol. Bundfaldet pelletteres ved centrifugering i 1,5 min. ved 12.000 G, og pelletten resuspenderes i 2 ml TE indeholdende 10 /ig/ml RNAseA (Boehringer, Mannheim). DNA-fragmenterne ekstraheres med chloroform/phenol og fældes med ethanol som beskrevet af 10 Maniatis et al. (8) på side 458-459 og 461-462.
2.2: Kloning af DNA-fragmenter med høj molekylvægt fra
Aspergillus niger i pUN121 DNA med høj molekylvægt fra eksempel 2.1 (100 /*g) fældes ved centrifugering, og pelletten resuspenderes i 750 μΐ 15 puffer bestående af Tris-HCl 6 mmol/1, NaCl 50 mmol/1,
MgCl2 6 mmol/1, pH 7,5. Der foretages partielle spaltninger med Sau3AI, idet koncentrationerne ligger i området 0,25-0,01 Ό/μgr i 60 min. ved 37°C. Reaktionerne afbrydes ved tilsætning af EDTA til slutkoncentrationer på 20 mM.
20 De delvis spaltede DNA-fragmenter adskilles på en 0,45%'s agarosegel. λ-DNA spaltet med Hindlll anvendes som markør til bestemmelse af størrelsen af de partielt spaltede DNA-fragmenter. Gelområdet, som indeholder de ønskede fragmenter i området 15-20 kb, udskæres og overføres til 25 prøvehullet i en ISCO-elektroforetisk koncentrator (ISCO GmbH), dækkes med 0,1% TBE og elektroelueres ved 1 W i 90 min. DNA-fragmenterne ekstraheres med chloroform/phenol og fældes med ethanol.
4 ,ug af de partielt spaltede DNA-fragmenter resuspenderes 30 i vand og ligeres i 15 timer ved 15°C til 1 μg pUN12l- plasmid-DNA (Nilsson et al. (9)), linerariseret med Bell,, i et samlet rumfang på 106 μΐ ligeringspuffer med 6 U T4- , DBA-ligase (Boehringer, Mannheim). 10 μΐ alikvoter af denne annelleringsblanding sættes til 210 μΐ kompetente 33 DK 175569 B1 E. coli BJ5183-celler, som er blevet præpareret til transformation som beskrevet af Hanahan (10). Cellerne opbevares på is i 30 min., hvorpå de opvarmes til 42°C i 5 90 sek. og derpå atter opbevares på is i 2 min., der tilsættes 800 μΐ SOC-medium, og cellerne inkuberes ved 37eC i 1 time. Cellerne udspredes på en 10 cm agarplade, som indeholder LB-medium tilsat 8 mg/1 tertacyclin (Sigma). Pladen inkuberes ved 37°C i 16 timer. Der opnås 10 ca. 6000 transformerede kolonier karakteriseret ved deres tetracyclinresistens. Effektiviteten er ca. 12.000 til
20.000 tetracyclinresistente kolonier pr. jtg pUNl21 DNA
Plasmidanalysen af 11 tilfældigt udvalgte rekombinantklo-ner indicerer et gennemsnitligt DNA-insert på 10 kb. For 15 at repræsentere genomet af A. niger (4,5 x 107 bp) i biblioteket udtages næsten 4 gange, 15.360 tetracyclinresistente kolonier, som dyrkes individuelt natten over i hullerne på mikrotiterpiader i LB-medium tilsat 8 mg/l tetracyclin. Efter inkubering tilsættes glycerol til 50% 20 r/r, og mikrotiterpladerne opbevares ved -70°C.
Eksempel 3
Screening af genombiblioteket for A. niger for nuclein-syrer beslægtet med PLI
3.1: Fremstilling af filterkopier af biblioteket 25 Til isoleringen af pectinlyase I-genet fra DNA-biblioteket opnået som beskrevet i eksempel 2.2 fremstilles filterkopier af de 15360 valgte transformerede E. coli BJ5183 eller under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Gergen et al. (11). Cellerne overføres fra mikrotiterpla-30 derne til agarplader tilsat 8 mg/l tetracyclin under anvendelse af et frimærke og dyrkes natten over ved 37°C. Almindeligt udskårne Whatman 541-filterpapir (114 x 175 mm pr. 192 kloner) anbringes oven på kolonierne. Efter 2 ti 34 DK 175569 B1 mer ved 37“C overføres filtrene til LB-plader, som indeholder 250 mg/ml chloramphenicol (Sigma, St. Louis, USA), hvorpå de inkuberes natten over ved 37°C. Filtrene 5 vaskes to gange i 0,5 M NaOH, to gange i 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, vaskes to gange i SSC og lufttørres. Filterkopierne kan anvendes til flere hybridiseringsforsøg, hvor der hver gang foretages de ovenfor beskrevne vasketrin.
3.2: Fremstilling af oligonucleotidblandinger 10 Oligonucleotiderne til screening af DNA-biblioteket fra A. niger, opnået som beskrevet i eksempel 2.2, fremstilles svarende til aminosyresekvensen bestemt i eksempel 1.1 og 1.3 under anvendelse af phosphoramiditmetoden (M.H. Caruthers (12)) med et oligonucleotidsyntetiseringsappa-15 ratur fra Appålied Biosystem (model 380B).
3.2.1: Fremstilling af oligonucleotid, som koder for den N-terminale del af pectinlyase I fra Aspergillus niger
Oligonucleotidet, som koder den N-terminale del af pectin-20 lyase I-proteinet, fremstilles med hensyn til aminosyre-sammensætningen som bestemt i eksempel 1.1. Som følge af genetisk degenerering kræves der 255 oligonucleotider for at omfatte alle muligheder.
Der fremstilles to adskilte blandinger af oligonucleotider 25 ved kemisk syntese, da det af tekniske årsager er nødvendigt at nedsætte antallet af nucleotider i blandingen.
Begge indeholder 128 forskellige nucleotider, som hver er en komplementær streng af de strenge, som koder for aminosyresekvensen Tg-P-E-G-F-Aji. I det følgende betegnes de 30 blanding 2014 og 2015 og er sammensat af oligonucleotider på følgende måde: blanding 2014 3’TGR^ GGR^ CTR2 CCRg AAR3 CG5 ’ 35 DK 175569 B1 blanding 2015 3 r TGR^ GGRi CTR2 CCR2 AAR3 CG5' hvori Rjl er A, C, G eller T, R2 er C eller T, og R3 er A eller G.
5 3.2.2: Fremstilling af et oligonucleotid, som koder for den N-terminale del af det C-terminale fragment af det CNBr-spaltede pectinlyase I-proteln
Oligonucieotidet, som koder for den N-terminale del af det C-terminale fragment af det CNBr-spaltede pectinlyase Ι-ΙΟ protein, fremstilles med hensyn til aminosyre s ammensaet - ningen som bestemt i eksempel 1.3. Der fremstilles en blanding af 108 oligonucleotider, som er en komplementær streng til de strenge, som koder for aminosyresekvensen N134-I-I-I-Q138, °9 er sammensat af nucleotider på føl-15 gende måde: blanding 2060 5’AARX ATR2 ATR2 ATR2 CAR3 A 3' hvori Ri er C eller T, R2 er A, T eller C, og R3 er A eller G.
3.2.3: 32p-mærkning af oiigonucleotidblanåingerne 20 67 pmol af de enkelte oligonucleotidblandinger 2014, 2015 og 2060 fra eksempel 3.2.1 og 3.2.2 5'-mærkes under anvendelse af 50 pmol [ -y32p J^TP (Amersham, Buckinghamshire, england, 5000 Ci/mmol). Inkuberingen gennemføres ved 37°C med 150 enheder T4 polynucleotidkinase (New England, 25 Nuclear) i 500 μΐ kinasepuffer. Ligeringsreaktionen mellem radioaktivt mærkede ATP og oligonucleotiderne påvises ved at behandle en alikvot fra reaktionsblandingen på en 20% polyacrylamidgel, hvorpå der foretages autoradiografi.
36 DK 175569 B1 3.3: Screening af qenbiblioteket med radioaktivt mærkede oligonucleotidblandinger 2014 og 2015
Screeningen af genbiblioteket gennemføres ved hybridise-5 ring med de radioaktivt mærkede oligonucleotidblandinger 2014 og 2015 fra eksempel 3.2.1. Partier på 20 filterkopier af genbiblioteket (eksempel 3.1) fugtes i 6 x NET og præhybridiseres i 200 ml 6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1% SDS ved 49,3°C i 4 timer. Derefter tilsættes 67 pmol 10 af den radioaktivt mærkede oligonucleotidblanding 2014, og hybridiseringerne gennemføres natten over ved 49,3°C. Den samme proces gentages under anvendelse af radioaktivt mærket oligonucleotidblanding 2015. Filtrene vaskes to gange i 5 min. i 2 x SSC, 0,1% SDS ved stuetemperatur, to 15 gange i 1 time i 2 x SSC, 0,1% SDS ved 49,3°C og en gang i to timer i 0,2 x SSC, 0,5% SDS ved 49,3°C. Filtrene lufttørres og autoradiograferes i 3 dage under anvendelse af "KODAK X-omat” S0282-film.
Med oligonucleotidblandingerne 2014 og 2015 findes 20 henholdsvis 33 og 39 kloner, som giver et temmeligt kraftigt hybridiseringsrespons. Til oprettelse af et underbibliotek opdyrkes de 72 kloner i en ny mikrotiterplade og overføres til Whatman 541-filtre som' beskrevet i eksempel 3.1. To filterkopier af underbib-25 lioteket hybridiseres individuelt med begge prober, vaskes og autoradiograferes. Med oligonucleotid 2014-blandingen hybridiserer kun de kloner, som er opnået ved hybridise-ring med oligonucleotid 2014-blandingen. Ligeledes ved oligonucleotid 2015-blandingen hybridiserer kun de kloner, 30 som er opnået ved hybridisering med oligonucleotidblanding 2015.
3.4: Screening af underbiblioteket med ollgonucleotid- blandingen 2060
Filterkopierne af underbiblioteket (72 kloner), opnået i 37 DK 175569 B1 eksempel 3.3 fugtes i 6 x NET og præhybridiseres 1 4 timer i 15 ml 6 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1% SDS ved 32°C. Der tilsættes 8 pmol oligonucleotidblanding 2050, som er 5 mærket radioaktivt som beskrevet i eksempel 3.2.3, og hybridiseringen gennemføres natten over ved 32°C. Filtrene vaskes to gange i 5 min. i 2 x SSC, 0,1% SDS ved stuetemperatur, to gange i 1 time i 2 x SSC, 0,1% SDS ved 32°C og en gang i 2 timer i 0,2 x SSC, 0,5% SDS ved 32°C. Filtrene 10 lufttørres og autoradiograferes i 3 dage under anvendelse af henholdsvis "KODAK X-omat" S0282-film. Der findes 3 positive kloner, som alle hører til gruppen, der hybridiserer med 2014-proben som beskrevet i eksempel 9.
En klon betegnes E. coli BJ5183/pCG3Bll (forkortet 3B11).
15 Eksempel 4
Isolering af plasmid pCG3Bll og restriktionsanalyse deraf
Der fremstilles store plasmidpræparater (14) af klonen 3B11 opnået som beskrevet i eksempel 3.4. Det tilsvarende plasmid, som betegnes pCG3Bll analyseres ved fuldstændig 20 restriktionsspaltning med Hindlll, EcoRI og PstI (alle fra Boehringer, Mannheim) og elektroforeseadskillelse på en 1%'s agarosegel (fig. 1).
Eksempel 5
Subkloning af EcoRI-fragmenterne af pCG3Bll indeholdende 25 de N-terminale og C-terminale fraktioner af pectinlyase I-genet 5.1: Isolering af Sau3AI-fragmenter af pCG3Bll og
ligering til M13DNA
1 μg plasmid pCG3Bll (eksempel 4) spaltes fuldstændigt med 30 18 enheder restriktionsendonuclease Sau3AI (Boehringer,
Mannheim) i 20 μΐ 10 mmol/1 Tris-HCl, 75 mmol/1 NaCl, 10 38 DK 175569 B1 mmol/1 MgCl2, pH 7,2 i 1 time ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til en slutkoncentration på 20 mM. DNA-fragmenterne ekstraheres med phenol/chloro-5 form, fældes med ethanol og opløses i 20 μΐ TE-puffer. 100 ng af det Sau3AI-spaltede DNA ligeres til 20 ng M13mp8-fag-DNA (15) linerariseret ved BamHI-spaltning (Boehringer, Mannheim). Ligeringen gennemføres i 4 timer ved 15°C med en enhed T4-DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) 10 i et samlet rumfang på 10 μΐ ligeringspuffer. Der fremstilles kompetente E. coli JMlOl-celler i 50 mM CaCl2 i overensstemmelse med Amersham's håndbog (16) s. 25. 0,3 ml alikvoter af de kompetente JMlOl-celler overføres til 15 ml sterile dyrkningsrør på is. 5 μΐ ligeret fag-DNA sættes 15 til hvert rør. Blandingerne holdes på is i 40 minutter.
Cellerne underkastes varmechok ved 42°C i 3 min., hvorefter rørene atter anbringes i isbadet. Til hvert rør fremstilles følgende blandinger: 40 μΐ IPTG 100 mM, 40 μΐ X-gal 2% med hensyn til dimethylformamid og 200 μΐ E. coli 20 JMlOl-celler fra en frisk kultur i eksponentielvækst. 270 μΐ af denne blanding sættes til hvert rør indeholdende varmechokbehandlede E. coli JMlOl-celler. 3 ml smeltet topagar (opbevares ved 42°C) sættes til hvert rør, hvorefter rørene hældes på agarplader. Pladerne inkuberes 25 vendt om ved 37°C natten over.
5.2: Screening af rekombinantfager med oliqonucleotid- proben 2060 E. coli JM101 transformeret med rekombinantfag-DNA'et udviser hide plaque på i X-gal-holdige agarplader fra 30 eksempel 5.1, 384 af disse udtages og dyrkes hver for sig ved 37°C i 1,5 ml 2 x TY-medium inokuleret med 15 μΐ E. coli JMlOl-celler i eksponentialvækst. Efter 6 timers forløb centrifugeres de 384 kulturer i 5 min. i en Eppendorf-centrifuge, og fagsupernatanterne opbevares ved 35 4°C. 100 μΐ fra hver af de 384 supernatanter overføres til fire "Gene Screen"-membraner (New England Nuclear) ved i 39 DK 175569 B1 anvendelse af et "BioDot"-apparat med 96 spalter (BioRad). Membranerne udblødes i 5 min. i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl og 5 min. i 3 M NaCl, 1 M Tris-HCl, pH 5,6, tørres i luft og 5 opvarmes i vakuum til 80°C i 2 timer. Til sidst præhybridiseres de fire membraner, hybridiseres med oligonucleotidblandingen 2060 mærket radioaktivt som beskrevet i eksempel 8, vaskes og autoradiograferes som beskrevet i eksempel 3.4. Fra ligeringsforsøget i eksempel 10 5.1 udvælges en positiv rekombinantfag til yderligere analyse. Denne fag betegnes mp8-3A.
5.3: Sekvensanalyse af rekombinant mp8-3A-faq
Supernantanten, som indeholder fag mp8-3A opnået som beskrevet i eksempel 5.2, anvendes til fremstilling af 15 enkeltstrenget DNA og DNA på replikativ form (RF-DNA) som beskrevet i Amersham's håndbog (16) på s. 18-27. De enkeltstrengede templater sekvenseres under anvendelse af kædeterminatormetoden beskrevet i Amersham's håndbog på s. 30-35. Fagen viser sig at indeholde 574 bp Sau3AI-frag-20 mentet med den forventede nucleotidsekvens for oligonu-cleotidprobe 2060 i position 584 til 599.
5.4: Identificering af de N-terminale og de C-terminale
EcoRi-fragmenter af pectinlyase I-genet
Det sekvenserede EcoRI-restriktionssted af fag mp8-3A 25 (eksempel 5.3) anvendes til identificering og subkloning af to EcoRI-fragmenter, hvor det ene indeholder den C-terminale del af PLI-genet omfattende terminatorområdet, og den anden indeholder den N-terminale del af genet omfattende promotorområdet. Der fremstilles følgende to 30 oligonucleotider som beskrevet i eksempel 3.2.
Oligonucleotid 5052: 5'TGGATGGATGATGTTGGAGAC3' starter ved position 597, 5' til det centrale EcoRI-sted ved position 649/650 og går til position 577 (komplementær 40 DK 175569 B1 streng).
Oligonucleotid 5066: 5'AGGTCCAGGACAACACCTAC3 ' starter ved position 1020, 3' til det centrale EcoRI-sted 5 og går til position 1039.
Oligonucleotidblandingerne 5052 og 5066 mærkes radioaktivt som beskrevet i eksempel 3.3.
1 jig plasmid pCG3Bll (eksempel 11) DNA spaltes fuldstændigt med EcoRI (Boehringer, Mannheim), og fragmenterne 10 adskilles på en 1%'s agarosegel. DNA-fragmenterne aftrykkes (blottet) på "Gene Screen"-membran (New England Nuclear) som beskrevet af leverandøren, s. 383-386. og membranerne hybridiseres med radioaktivt mærkede prøver af oligonucleotider 5052 og 5066 som beskrevet af Maniatis et 15 al., (8) s. 387-389. Probe 5066 hybridiserer med et 3,5 kb EcoRI-fragment, som indeholder den C-terminale del og terminatorområdet af PLI-genet. Probe 5052 hybridiserer med et 2,9 kb EcoRI-fragment, som indeholder N-terminalen og promotorområdet af genet.
20 5.5: Konstruktion af pPL29-5 og pPL35-5 ved rekloning af EcoRI-fragmenter af pCG3Bll i pUN!21 4,5 μg plasmid pCG3Bll DNA, opnået som beskrevet i eksempel 4, inkuberes med 50 enheder EcoRI (Boehringer, Mannheim) i 50 μΐ 0,01 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,01 25 M MgClg, 1 mM mercaptoethanol i 2 timer ved 37°C. DNA- fragmenterne adskilles på en 1%'s agarosegel, gelskiven, som indeholder 2,9 kb fragmentet og 3,5 kb fragmentet, elueres som beskrevet i eksempel 5, og DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol. Bundfaldene 30 resuspenderes i 40 μΐ lav TE-puffer, og 10 μΐ af denne opløsning ligeres til 100 ng plFN121 (9) lineariseret ved spaltning med EcoRI. Ligeringen gennemføres ved 15eC i 4 timer med 5 enheder T4-DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) 41 DK 175569 B1 i 35,5 μ 1 20 mmol Tris-HCl, 1 mmol EDTA, dithiothreitol 5 mmol, 60 mmol KC1, 50% glycerol, pH 7,6.
17,5 μΐ alikvoter af denne annelleringsblanding sættes 5 separat til 200 μΐ kompetente E. coli HBlOl-celler, som er blevet præpareret til transformation ved behandling med calciumchlorid som beskrevet af Maniatis et al., (8), s.
250. Blandingen opbevares på is i 30 min., hvorpå den opvarmes til 42°C i 2 min., fortyndes derpå med 1 ml 10 SOC-medium og inkuberes ved 37°C i 1 time. Cellerne isoleres ved centrifugering ved 2000 G i 5 min. Hver cellepellet resuspenderes i 600 μΐ SOC-medium og udspredes på tre agarplader, som indeholder LB-medium tilsat 8 mg/1 tetracyclin. Pladerne inkuberes ved 37°C i 16 timer.
15 Plasmiderne fra seks rekombinant tetR-kloner isoleres fra hver transformation ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Birnboim og Boly (17), og de analyseres ved restriktionsanalyse. En klon indeholdende 2,9 kb EcoRI-fragmentet af pCG3Bll udvælges til yderligere 20 analyse og betegnes pPL29-5 (fig. 3). En anden klon, som indeholder 3,5 kb EcoRI-fragmentet af pCG3Bll udvælges og betegnes pPL35-5 (fig. 3).
Eksempel 6
Sekvensbestemmelse for pectinlyase I-genet 25 DNA'et fra pPL29-5 (eksempel 5.5), som indeholder den N--terminale del af PLI-genet, og DNA'et fra pPL35-5 (eksempel 5.5), som indeholder den C-terminale del af PLI-genet, isoleres som beskrevet af Humphreys et al.
(14). Dele af inserterne af plasmider pPL29-5 og pPL35-5 30 opnås ved restriktion med egnede enzymer. Fragmenterne underklones i M13mp8 og M13mpl8 og sekvenseres under anvendelse af Ml3-klonings- og sekvenseringssættet (M15 Sequencing Kit N.4502, Amersham) under de af leverandøren 42 DK 175569 B1 angivne betingelser (16).
Hele sekvensen af 2,7 kb Spel-Nhel-fragmentet, som indeholder fuldstændige sekvens af PLI-genet, er vist i fig.
5 4. Den omfatter 688 nucleotider af promotorområdet, 1369 rester af strukturdelen af PLI-genet og 660 nucleotider af terminatorområdet.
Foran PLI-sekvensen, der svarer til aminosyresekvensen af N-terminalen af PLI som bestemt ved aminosyresekvensana-10 lyse (eksempel 1), findes 57 nucleotider, som koder for signalsekvensen M]_-K-Y-A-A-A-L-T-A—I-A-A-L-A-A-R-A-A-A57
En computerundersøgelse for consesussekvenser af exon/intron-splejsningsforbindelsespunkter samt for 15 interne intronsekvenser (E. Boel et al. (18) og S.M. Mount (19)) fører til antagelsen af forekomsten af fire introns med længder på henholdsvis 65 bp, 62 bp, 63 bp og 57 bp (fig. 4, understreget).
Sekvensen for PLI-genet bestemmes ved kombination af 20 sekvenserne for EcoRI-Spel-fragmentet af plasmid pPL29-5 og EcoRI-Nhel-fragmentet af pPL35-5 (begge bestemt ved subkloning i M13).
Eksempel 7
Konstruktion af ekspressionsvektorer 25 7.1: Indføring af et nyt restriktionssted i signalsekven sen i PLI-genet
Indføringen af et nyt BssHII-sted i signalsekvensområdet for PLI-genet (sekvenseret i eksempel 6) ved in vitro-mutagenese gennemføres i overensstemmelse med fremgangs- 43 DK 175569 B1 måden ifølge Zoller og Smith (20). Et oligonucleotid bestående af 19 rester syntetiseres ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i eksempel 3.2. Dette er 5 komplementært til DNA-sekvensen (pos. 36-54), som koder for den C-terminale del af PLI-signalsekvensen, bortset fra nucleotid 10 (45), der fører til en C/G-transversion (mutageniseringsprimer). Det ombyttede nucleotid 45 i mutageniseringsprimeren er markeret med *.
10 Del af PLI signalsekvens 5'CCTCGCTGCCCGCGCCGCT3' 36 40 50 54 * mutageniseringsprimer 5156: 5'CCTCGCTGCGCGCGCCGCT3' 15 Til in vitro-mutagenesen 51-phosphoryleres 200 pmol ooligonucleotid 5156 med 20 nmol rATP. Reaktionen gennemføres i 1 time ved 3/“C med enheder 10 T4-poIynu-cleotidkinase (Boehringer, Mannheim) i 20 μΐ kinase-puffer. Reaktionen afbrydes ved opvarmning til 65°C i 10 20 min.
7.2: In vitro-mutagenese af templat M13mp8-PL (Sal-
EcoRI)-DNA
Det første in vitro-mutageneseforsøg vedrører enkeltstrenget DNA fra fag M13mp8-PL (Sall-EcoRI), 25 fremstillet i eksempel 6, som indeholder 0,8 kb SalI-EcoRI-fragmentet af plasmid pPL29-5, der indeholder 117 nucleotider af promotoren og den N-terminale del af PLI-genet. 1 pmol enkeltstrenget Ml3mp8-PL(Sall-EcoRI) DNA blandes med 20 pmol mutageniseringsprimer 5156 (eksempel 30 7.1) og 10 pmol universel Ml3-sekvenseringsprimer (N.4511,
Amersham) i 10,5 μΐ 0,02 m Tris-HCl pH 7,5, 0,01 M MgClg,
0,05 M NaCl, 0,001 ; DDT. Blandingen opvarmes hurtigt til 560C og afkøles langsomt til stuetemperatur. Til blandingen sættes 1 øl 0,2 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 0,01 35 M
44 DK 175569 B1 DDT, 4 μΐ 2 mM dNTP, 1 μΐ 10 mM ATP, og der tilsættes 3 enheder T4-DNA-ligase (Boehringer, Mannheim) og 2 enheder DNA-polymerase I (Klenow-fragment, Amersham), og 5 polymerisationsreaktionen gennemføres i 15 timer ved 15°C.
Der fremstilles tre fortyndinger af polymeriseringsblandingen (1:20, 1:100 og 1:500) i lav TE-puffer. Af hver fortynding sættes 1 μΐ og 5 μΐ til 300 μΐ kompetente E. coli JMlOl-celler, som er blevet fremstillet ved trans-10 formation ved anvendelse af den i eksempel 5.1 beskrevne fremgangsmåde. Cellerne hældes på X-gal-plader, og der opnås kolonier, som danner hvide plaque. 100 af de hvide plaque udtages og overføres til LB-plader. Bakterierne transformeret med fag-DNA dyrkes natten over ved 37°C og 15 overføres derefter til Whatman 541-filtre som beskrevet i eksempel 3.1. Filtrene vaskes (eksempel 3.1), hvorpå de præhybridiseres i 5 x NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1% SDS i 30 min. ved 67°C. Hybridiseringen gennemføres ved stuetemperatur (eksempel 3.4) i 30 min. med 15 pmol radioaktivt 20 mærket (eksempel 3.3) oligonucleotid 5156 pr. filter i 6 x SSC. Efter hybridisering vaskes filtrene i 4 x 40 sekunder i 6 x SSC ved stuetemperatur, og efter tørring i luft eksponeres de i 1 time på "Kodak” XAR-5-film under anvendelse af en Ilford Screen. Filtrene vaskes endnu en 25 gang i 5 min. i 6 x SSC ved 72°C (Tm for mutageniserings-primeren 5156 er 70°C), tørres og eksponeres natten over på en "Kodak" XAR-5-film.
Kolonier, som fremkalder positive signaler efter det andet vasketrin, udtages fra den oprindelige LB-plade, 30 suspenderes i 1 ml LB-medium og opvarmes til 70°C i 20 min. Denne bakteriofagopløsning fortyndes 1:10, 1:1000 og 1:100.000, og der anvendes 10 μΐ af hver fortynding til transf icering af 300 μΐ E. coli JMlOl-celler i eksponentialvækst, og der udhældes på X-gal-plader. 6 35 plaque af 1:100.000-fortyndingen udtages hver for sig og sættes til 1,5 ml 2 x TY indeholdende 15 μΐ E. coli JMlOl-celler i eksponentialvækst og dyrkes ved 37°C i 6 45 DK 175569 B1 timer. Kulturerne centrifugeres i 5 min. i en Eppendorf-centrifuge, supernatanterne opbevares ved 4’C (stamfag), og celiepelletterne anvendes til fremstilling af RF-præpa-5 rater i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Birnboim og Doly (17). Efter restriktionsanalyse med BssHII udvælges en mutantfag, som bærer et nyt BssHII-sted i PLI SalI-EcoRI-fragmentet, til yderligere forsøg. Mutantf agen betegnes M13mpl8-PL(SalI-EcoRI)BssHII/BE5).
10 7.3: In vitro-mutagenese af templat M13mpl8-PL(Spel-
EcoRl)
Det andet in vitro-mutageneseforsøg gennemføres med enkeltstrenget DNA fra fag Ml3mpl8-PL(Spel-EcoRI) opnået i eksempel 6. Denne rekombinantfag indeholder 1,4 kb 15 SpeI-EcoRI-fragmentet af plasmid pPL29-5 og således 688 nucleotider af promotoren plus den N-terminale del af PLI-genet. Mutagenese af denne templat gennemføres nøjagtigt som beskrevet i eksempel 7.2. En fag indeholdende det ny BssHII-sted i PLI Spel-EcoRI-insertet udvæl-20 ges til fire forsøg og betegnes M13mpl8-PL(Spel-EcoRI)
BssHII/AC5.
7.4: Konstruktion af plasmid pUBE5
For at lette håndteringen subklones BamHl-EcoRI-fragmentet af fag Ml3mp8-PL(SaJLI-EcoRI)BssHII/BE5, opnået som 25 beskrevet i eksempel 7.2, indeholdende 130 bp af promotorområdet og den N-terminale del af PLI-genet omfattende det nyindførte BssHII-sted i signalsekvensområdet, i plasmid-vektor pUN121 (9) som illustreret i fig. 5 og beskrevet i det følgende. 1 4 μg RF DNA fra fag M13mp8-PL (Sall-EcoRI)BssHII/BE5 iso leres i overensstemmelse med eksempel 5.3 og spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaser BamHI og EcoRI {Boehringer, Mannheim). Fragmenterne adskilles på en 1%'s 46 DK 175569 B1 agarosegel, og gelskiven, som indeholder 0,8 kb BamHI-EcoRI-fragmentet, bestående 117 bp af promotoren og den N-terminale del af PLi-genet, elektroelueres som 5 beskrevet i eksempel 2.2. DNA'et ekstraheres med phenol/ chloroform og fældes med ethanol. DNA-pelletten resuspen-deres i 10 μΐ vand (50 ng/μΐ).
2 μg pUNl21 spaltes fuldstændigt med Bell og EcoRI (Boehringer, Mannheim). Fragmenterne adskilles på en 1%'s 10 agarosegel, og 4,0 kb fragmentet elektroelueres som beskrevet i eksempel 2.2. Efter phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolfældning opløses DNA-' et i 18 μΐ vand (100 ng/μΐ).
300 ng af BamHI-EcoRI-fragmentet, som indeholder BssHII-15 stedet, ligeres til 500 ng BelI/EcoRI-skåret pUN121 DNA. Ligeringen gennemføres i 4 timer ved 15CC med 400 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs) i 20 /*1 50 mM Tris-HCl (ph 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol, 1,0 mM ATP. 10 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til transformering af 100 μΐ 20 kompetente E. coli HBlOl-celler (8). Cellerne udplades på LB-plader indeholdende 8 mg/l tetracyclin (Sigma) og inkuberes natten over ved 37°C.
Der fremstilles plasmidpræparationer ud fra 12 tetR-kolo-nier i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Birnboim 25 og Doly (17), og et plasmid med det ønskede restriktionsmønster vist i fig. 5 betegnes pUBE5 og anvendes til yderligere analyse.
7.5: Indføring af et Hgal-restriktionssted foran desulfa- tohirudingenet af pML310 og isolering af 0,22 kb 30 Hgal-Ba,HI-gen-fragmentet '
Til indføringen af et Hgal-restriktionssted foran desulfatohirudingenet (fig. 6) spaltes 8 μg plasmimd PML310 DNA fuldstændigt med restriktionsendonuclease DK 175569 B1 47
EcoRI Det spaltede DNA ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol. Til fjernelse af 5'-udhængende ! ender spaltes 4 μg pML310/EcoRI DNA i 100 μΐ 150 mM NaCl, - 5 1 mM ZnS04, 30 mM natriumacetat pH 4,6 og 20 U/ml nuclease (Sigma) i 45 min. ved 37°C.
i DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ' ethanol. DNA'et (pML310/EcoRI/Si) resuspenderes i 100 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 8,0 og inkuberes med 2 enheder alkalisk 10 phosphatase fra kalvetarm (CIAP, orthophosphorsyre-mono-
esterphosphorylase, EC 3.1.3.1, Boehringer) i 1 time ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved 65°C i 1,5 timer. NaCl-kon-centrationen indstilles på 150 mM. Det dephosphorylerede DNA (pML310/EcqRI/St/CIAP) renses ved adsorption på en 15 DE52 (Whatman)-ionbyttersøj le i en lavsaltpuffer (150 mM
NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Eluering gennem- j føres med en høj saltpuf feropløsning (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA' et fsides med eth 5,riOl resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,8 mg/ml.
20 Til indføring af et Hgal-sted fremstilles et oligonucleo-tid med formlen 5’-AGCGTCGACGCT-3' ved hjælp af phosphotriestermetoden (21). Oligonucleotid-sekvensen er selvkomplementær, idet den indeholder genken- , 25 delsesstedet -GACGC- for restriktionsendonuclease Hgal. ;
Annellering af to enkelte strenge fører til en dobbeltstrenget DNA-linker.
1,2 μς af det syntetiske enkeltstrengede oligodeoxynucleo-tid phosphoryleres i 10 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM
30 MgCl2, 5mM DTT, 30 μΟχ [ γ-32Ρ ] ATP (3000 Ci.mmol-1,
Amersham) og 6 enheder T4 polynucleotidkinase (Boehringer) i 30 min. ved 37eC efterfulgt af 15 min. ved 37°C i nærværelse af 0,5 mM ATP. Blandingen inkuberes i yderligere 48 DK 175569 B1 10 min. ved 75 °C for at inaktivere enzymet. Blandingen afkøles til stuetemperatur til annellering.
0,6 ftg (170 pmol) af det 32p_m2erj<;eije linker DNA blandes 5 med 2,4 μg (1,75 pmol ender af pML310/EcoRI/S·; /CIAP og ligeres i 20 μΐ 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM
DTT, 3,5 mM ATP, 800 enheder T4 DNA-igase (Biolabs) i 20 timer ved 15°C. Ligasen inaktiveres ved 85°C i 10 min., og overskud af linkermolekylerne fjernes ved fældning af 10 DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM
natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. Efter 30 min. ved stuetemperatur pelletteres DNA'et, resuspenderes i 45 μΐ ligeringsblanding (beskrevet ovenfor) og ligeres i 6 timer ved 15°C til dannelse af cirkulært DNA.
15 Alikvoter på 1 μΐ og 3 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μ 1 calciumbehandlede, transformationskompetente E. coli HBlOl-celler (præpareret i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge D. Hanahan (10)). Cellerne henstår på is i 30 min. , hvorpå de inkuberes i 3 min. ved 42°C, 20 afkøles på is i 2 min. og inkuberes derefter i 1 time ved 37eC i 400 μΐ SOC-medium. Cellerne koncentreres i 100 μΐ SOC-medium, udplades på LB-agarplader indeholdende 50 μg/πil ampicillin og dyrkes natten over ved 37“C.
12 transformerede ampR-kolonier isoleres og dyrkes hver 25 for sig i LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge D.S. Holmes et al. (22). Tilstedeværelsen af den syntetiske oligonucleotidlinker bekræftes ved DNA-sekvensering under anvendelse af et enkeltstrenget 30 DNA-fragment som primer, der hybridiserer til den kodende streng af hirudin. En klon, som indeholder linker DNA'et i den rigtige position foran hirudingenet, betegnes pML310L.
Til isoleringen af 0,22 kb Hgal-BamHI-desulfatohirudin-genfragmentet spaltes 40 μg plasmid pML310L fuldstændigt 49 DK 175569 B1 med restriktionsendonucleaser Pvul og BamHl (Boehringer) i 150 μΐ 0,01 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol i 2 timer ved 37°C. Fragmenterne 5 adskilles på en 1%'s agarosegel, og gelskiven indeholdende 0,84 kb Pvul-BamHl-fragmentet elektroelueres som beskrevet i eksempel 5. Efter phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolfældnlng resuspenderes DNA'et i 20 μΐ Hgal-puffer og spaltes fuldstændigt med restriktionsendonuclease Hgal 10 (Biolabs). Fragmenterne adskilles på en 2%'s agarosegel, og gelskiven indeholdende 0,22 kb Hgal-BamHI-fragmentet elueres som ovenfor. Efter phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolfældning resuspenderes fragmentet i 55 μΐ sterilt vand (0,1 pmol/μΐ).
15 7.6: Fusion af PLI-signalsekvensen og desulfatohirudin- strukturgenet
Tri tilvejebringelse af en linKer til ligering af BssHii-stedet i signalsekvens (eksempel 7.2) kodningsområdet af PLi-genet og Hgal-stedet af desulfatohirudingenet (eksem-20 pel 7,5), fremstilles 2 oligonucleotider som beskrevet i eksempel 3.2.
PLI signalsekvens I N-terminale aminosyrer 1 i desulfatohirudin i
ALA ALA LEU ALA ALA ARG ALA ALA ALA I VAL VAL
l t
5' 3' I
GCC GCC CTC GCT Gcg cgc gec get gctIGTT GTT oligonucleotid 5172 CGG CGG GAG CGA CGC GCg egg ega cgalcaa.caA oligonucleotid 5173 3' I 5’ L_---1
BssHII
(små bogstaver: linker) 50 DK 175569 B1 300 pmol af hvert oligonucleotid kinasebehandles separat med 400 pmol rATP og 10 enheder T4 polynucleotidkinase (New England Nuclear) i 15 μΐ 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 5 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 μg/ml BSA.
De to kinaserede oligonucletider blandes i forholdet 1:1, opvarmes til 95°C og afkøles langsomt til stuetemperatur til annellering. De annellerede linkere opbevares ved -20°C.
10 7.7: Konstruktion af pLHK3
Til konstruktionen af en desulfatohirudinekspressionsvek-tor (fig. 7) indeholdende den formindskede promotor for PLI, spaltes 7 μg pUBE5 DNA (eksempel 7.4) fuldstændigt med restriktionsendonuclease BssHlI (Boehringer), 15 ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol.
DNA'et (1,9 pmol) resuspenderes i 10 μΐ sterilt vand. 300 pmol annelleret linker 5172/5173 (eksempel 7.6) ligeres til 1,9 pmol BssHll-skåret pUBE5 med 400 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs) i 60 μΐ 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10
20 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol 1,0 mM ATP, 50 ^g/ml BSA. Ligeringen gennemføres i 15 timer ved 15°C. Ligasen inaktiveres ved opvarmning til 85eC i 10 min. Pufferen indstilles på 0,01 M Tris.HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 0,005 M
MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol. Der tilsættes 36 enheder 25 BamHI (Boehringer), og spaltningen gennemføres i 2 timer ved 37°C. Fragmenterne adskilles på en 1%’s agarosegel, og 3,4 kb BamHI-f BssHII iHgal-linkerfragmentet isoleres ved elektroeluering af gelskiven efterfulgt af phenol/chloro-form-ekstraktion og fældning med ethanol. DNA*et resuspen-30 deres i 14 μΐ sterilt vand til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ 0,2 pmol 0,22 kb desulfatohirudin Hqal-BamHI-frag-mentet ligeres til 0,1 pmol af det spaltede pUBE5 DNA. Ligeringen gennemføres i 15 timer ved 15°C med 400 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 35 10 mM MgClg, 20 mM dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 μg/ml BSA.
51 DK 175569 B1 2 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til at transformere 100 /il kompetente E. coli HBlOl-celler (8), som derefter udplades på LB-plader indeholdende 50 mg/1 ampicillin 5 (Sigma). DNA'et fra 12 ampR-kolonier fremstilles ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Birnboim og Doly (17) og analyseres ved restriktionsanalyse. Der udvælges en klon til sekvensanalyse ved hjælpa f dideoxykædetermina-tormetoden ifølge Sanger et al. (23). En klon, som udviser 10 det ønskede restriktionsmønster og den korrekte sekvens i PLI-signalsekvens-desulfatohirudinsamlingspunktet, isoleres og betegnes pLHK3.
7.8: Konstruktion af pLHL5
Til konstruktionen af desulfatohirudinekspressionsvekto-15 ren, som indeholder den fuldstændige promotorsekvens af PLI-genet, spaltes 10,3 μg RF DNA af fag Ml3mpl8-PL(Spel- '.r^AUTT /ΆΓ*Έ --- ^ O O \ χ-.,Ί -3 i ^.-L- — ^ J---J 1 - t-t vui\ -x ) uoonx x / ηθ-j S, ^/voctujjCJ- vi - si ) x uxu^> cacx mcu x cx xn.
tionsendonuclease BssHll (Boehringer), ekstraheres med phenol/chloroform, fældes med ethanol og resuspenderes i 20 10 μΐ sterilt vand til en koncentration på 1,9 pmol. 300 pmol annelleret linker 5172/5175 (se ovenfor) ligeres til
1,9 pmol af det BssHII-skårne fag DNA som beskrevet i eksempel 7.7. Efter inaktivering af T4 DNA-ligasen indtilles pufferen til 0,01 M Tris.HCl, pH 7,6, 0,05 M
25 NaCl, 0,01 M MgCl2, 0,014 M DTT. Der tilsættes 35 enheder restriktionsendonuclease Hindlll (Boehringer), og spaltningen gennemføres i 2 timer ved 37”C. Fragmenterne adskilles på en 1%’s agarosegel, og 1,4 kb Hindlll-[BssHII ]HgaI-linkerfragmentet isoleres ved elektroeluering 30 sm beskrevet i eksempel 2.2. Fragmentet resuspenderes i 15 μΐ sterilt vand, hvorved der opnås en koncentration på 0,1 pmol//tl.
3 /tg plasmid pBR322 (24) spaltes fuldstændigt med restrik-tionsendonucleaser BamHI og Hindlll (Boehringer, Mannheim) 35 i 20 μΐ 0,01 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,01 M MgCl2, 52 DK 175569 B1 1 mM 2-mercaptoethanol, og fragmenterne adskilles på en 1%'s agarosegel. Det store 4,15 kb HindiII-BamHI-fragment elueres som beskrevet i eksempel 2.2 og resuspenderes i 8 5 μΐ sterilt vand (0,1 pmol/μΐ).
0,2 pmol af 0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet af desulfatohiru-din og 0,2 pmol af 1,4 kb PLI-promotorsignalsekvens-Hindlll-f BssHII ]HgaI-linkerfragmentet ligeres til 0,1 pmol HindiII/BamHI-skåret pBR322 i 15 timer ved 15°C. Ligerin-10 gen gennemføres med 400 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) i 10 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM
dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 /ig/ml BSA. 1 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til at transformere 100 μΐ kompetente E. coli HBlOl-celler (8). Der isoleres 12 15 ampR-koionier, og DNA'et analyseres som beskrevet i eksempel 7.7. En klon udvælges til yderligere forsøg og betegnes pLHL5 (fig. 8).
7.9: Konstruktion af pLHLT7
Til tilvejebringelse af et terminatorområde til PLI-desul-20 fatohirudinekspressionssystemet, fusioneres 0,7 kb
PstI-Nhel-fragmentet af plasmid pPL35-5 i 3'-stilling til desulfatohirudingenet som illustreret i fig- 9.
10 μ3 pFL35-5 spaltes fuldstændigt med Pst I (Boehringer).
DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med 25 ethanol. Fragmenterne resuspenderes i 0,033 M tris-acetat pH 7,9, 0,066 M kaliumacetat, 0,01 M magnesiumacetat, 0,5 mM DTT og 100 ng/ml BSA. 10 enheder T4 DNA-polymerase (Boehringer) tilsættes, og reaktionen gennemføres i 180 sekunder ved 37°C. Reaktionsblandingen stilles på is, der 30 tilsættes 20 nmol dATP, dCTP, dGTP og dTTP, pufferen indstilles til de ovenfor anførte betingelser, og reaktionen gennemføres i 35 min. ved 37°C. Efter ekstraktion med phenol/chloroform og fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 10 μΐ sterilt vand (1,9 pmol = 11,4 pmol korte 53 DK 175569 B1 ender). 900 pmol kinasebehandlet og annelleret (eksempel 7.6) BamHl-linker (Biolabs) tilsættes, og ligeringen gennemføres i 15 timer ved 15°C med 400 enheder T4 DNA-5 ligase (Biolabs) i 60 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 jig/ml BSA.
Efter inaktivering af ligasen ved opvarmning til 85°C i 10 min. indstilles pufferen til 0,01 M Tris-HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol. Der tilsættes 20 10 enheder restriktionsendonuclease Nhel (Biolabs), og spaltningen gennemføres i 2 timer ved 37°C. Fragmenterne adskilles på en 1,2%'s agarosegel, og 0,7 kb Nhel-f PstI ]-BamHI-fragmentet isoleres ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 2.2. Fragmentet resuspenderes i 15 μΐ 15 sterilt vand til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ.
Der foretages ligering med 0,2 pmol 0,7 kb Nhel-f PstI ]-BamHl-terminatorfragment, 0,2 pmol 1,4 kb Hindlll-[BssHII ]HgaI-promotorfragmenfc (eksempel 7.4), 0,2 pmol 0,2 kb Hgal-BamHl-desulfatohirudinfragment (eksempel 7.5) og 20 0,1 pmol pUC18-vektor (25) lineraiseret med Hindlll og
Xbal- Reaktionen gennemføres med 400 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs) i 15 timer ved 15°C i 10 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH
7,8), 10 mM MgCl2^ 20 mM dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 μg/ml BSA. 2 μΐ af ligeringen anvendes til transformering 25 af E. coli HBlOl-celler. 12 ampR-transformanter analyseres som beskrevet i eksempel 7.6, og plasmidet med den korrekte fusionssekvens betegnes pLHLT7.
Eksempel 8
Konstruktion af et cotransformationssystem for A. niger 30 8.1: Fremstilling af pCG59D7 indeholdende pyrA-genet fra
Aspergillus niger 300 ng af et 1,1 kb Hindi 11 -fragment af pDJB2 (26), som bærer en del af N. crassa pyr4-genet, mærkes radioaktivt 54 DK 175569 B1 ved hjælp af nicktranslationi overensstemmelse med Maniatis et al. (8). Filterkopierne af genbiblioteket (eksempel 3.1) fugtes i 6 x NET og præhybridiseres i 5 x 5 NET, 1 x ss-Denhardt, 0,1% SDS i 4 timer ved 50°C. Nicktransleret HindiII-fragment tilsættes (300 ng/80 filtre), og hybridiseringen gennemføres i 15 timer ved 50°C. Efter hybridiseringen vaskes filtrene en gang i 5 min. i 4 x SSC, 0,1% SDS ved 50°C. Efter tørring i luft 10 eksponeres filtrene på "Kodak" X-omat S0282-film i 3 dage.
En stærkt hybridiserende koloni, som betegnes E. coli BJ5183/pCG59D7 (forkotet 59D7), isoleres, og der fremstilles et stort plasmidpræparat deraf (14). Plasmidet betegnes pCG59D7 og anvendes til transformationen i 15 eksempel 9.2.
8.2: Mutation af A. niger-stamme N 756 og isolering af mutanter, som er auxotrophe for uridin
Selektion for mutanter af A. niger-stamme N 756, der specifikt mangler orotidin-5'-phosphat-decarboxylase-20 aktivitet, kan opnås ved positiv selektion mod den toksiske analoge fluororotsyre (27) i nærværelse af uridin. 3 x 10^ konidiesporer af A. niger-stamme N 756 udplades på 10 ml minimalmediumplader tilsat 1 g/1 arginin og 50 mg/1 uridin. Sporerne udsættes for kortbølget 25 UV~bestråling (2600 Å) i en dosis, der resulterer i 0,5% overlevende kolonier. Efter 2 dages inkubering ved 28°C, når det udvoksende mycelie er svagt synligt, 10 mg fluor-orotsyre til hver plade, og inkuberingen fortsættes i yderligere 2-3 dage. Fluororotsyreresistente kolonier 30 fremkommer som kraftigt voksende og sporedannende kolonier på en baggrundsvækst af hvidligt følsomt mycelium. Fra ca.
40.000 overlevende fra mutageniseringsbehandlingen isoleres 8 mutanter. 2 af disse, som er resistente mod fluororotsyre uden uridinkrav, videreføres ikke. 6 af dem 35 har en uridinauxotrophi. Der fremstilles heterocaryoner ved dyrkning af en blanding af konidiesporer fra 2 fluor- 55 DK 175569 B1 orotsyreresistente mutanter natten over begge på komplet medium. Mycelieblokke overføres til minimalmedium. Mutanter, som er indbyrdes komplementære i deres mutation, 5 viser udvækst af et prototropht heterocaryotisk mycelie ved kanterne, hvilket ikke er tilfældet med stammer med mutation i den samme allel. De 6 uridinkrævende mutanter fra stamme N 755 falder i to kompletteringsgrupper som det er tilfældet i S. cerevisiae (27). En af hver - An 8 og An 10 10 - anvendes til transformation.
8.3: Fremstilling af protoplaster og transformation af uridinmutanter An 8 og An 10 af A. niger N 756
Konidiesporer af mutanter An 8 og An 10 dyrkes, hver for sig på skrårør i 4-5 dage ved 28°C i komplet medium. 2 x 15 108 konidiesporer af An 8 og An 10 anvendes til særskilt inokulering af 200 ml minimalmedium tilsat 1 g/1 arginin og uridin (eksempel 8.2). Efter 20 timers vækst ved 28“C og 180 o/m høstes myceliet ved filtrering gennem "Miracloth", vaskes to gange med 10 ml 0,8 M KCl 50 mM 20 CaCl2 og resuspenderes i 20 (il 0,8 M KCl, 50 mM Cacl2, 0,5 mg/ml "Novozym" 234 (Novo Industri). Blandingen inkuberes i et rystevandbad (30°C, 50 o/m), indtil der mikroskopisk kan påvises maksimal protoplastafgivelse (90-120 min.). Protoplastsuspensionen filtreres gennem en glasuldsprop i 25 en skilletragt for at fjerne mycelierester. Protoplasterne pelletteres ved forsigtig centrifugering (10 min., 2000 o/m) ved stuetemperatur og vaskes to gange med 10 ml 0,8 M KCl 50 mM CaCl2- Protoplasterne suspenderes til sidst i 200-500 μΐ 0,8 M KCl, 50 mM CaCl2 til en koncentration på 30 1 x 108/ml.
Til transformation inkuberes 200 μΐ alikvoter af proto-plastsuspensioner (An 8 og An 10) hver for sig sammen med opløsninger bestående af 10 /ig/20 μΐ pCG59D7 DNA, 50 μΐ PCT, (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25% PEG 6000).
35 Inkuberingsblåndingerne holdes på is i 20 min., der til- 56 DK 175569 B1 sættes yderligere 2,0 ml PCT, og blandingen inkuberes i yderligere 5 min. ved stuetemperatur. Derpå tilsættes 4 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2, og 1 ml alikvoter af disse 5 sluttransformationsopløsninger blandes med smeltet minimalagarmedium (MM + 1 g/1 arginin + 10 g/1 Bacto-agar (Difco)) stabiliseres med 0,8 M KC1. Blandingerne hældes strakt på agarplader af det samme medium og inkuberes ved 28°C.
10 Efter 3 dages vækst ved 28°C fremkommer stabile transformanter som kraftigt voksende og sporedannende kolonier på en baggrundvækst af mange hundrede små, formentlig ufrugtbare transformanter.
Transformation med pCG59D7 har kun ført til det ønskede 15 resultat i mutant An 8 ikke i An 10. An 8 antages derfor at mangle ornithidin-5'-phosphatdecarboxylaseaktiviteten, som kompletteres ved hjælp af fuldlængdegenproduktet fra selektionsplasmid pCG59D7. I An 8 opnås ca. 20-30 transformanter pr. //g pCG59D7. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 10 transformanter af An 8 udtages, underdyrkes på minimal 2 medium, og DNA'et isoleres og analyseres for tilstedevæ 3 relse af pCG59D7-sekvenser. DNA fra transformanterne 4 isoleres efter pulverisering af det frosne mycelium i 5 flydende nitrogen i overensstemmelse med en kendt 6 fremgangsmåde (7). 1 /xg DNA fra hver transformant spaltes 7 fuldstændigt med Xhol, fraktioneres ved elektroforese over 8 1% agarosegeler, og der fremstilles aftryk på nitrocellu 9 losefiltre i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge 10
Maniatis (8), s. 382-386. Aftrykkene hybridiseres med 11 [ or-32p ] pUN121 DNA under anvendelse af standardfremgangs måder som beskrevet af Maniatis et al. (8), s. 387-398. De forskellige opnåede hybridiseringsmønstre indicerer kromosomal integrering af det transformerende plasmid pCG59D7 på forskellige steder i værtsgenomet.
57 DK 175569 B1
Eksempel 9
Ekspression af desulfatohirudin-qenet under kontrol af PLI-promotoren i A. niqer 5 9.1; Cotransformation af mutant An 8 med pCG59D7, pLHK3, pLHL5 eller pLHLT7
Protoplaster af mutant An fremstilles som beskrevet i eksempel 8.2 og cotransformeres med 5 μg selektionsplasmid pCG59D7 og enten 10 μg plasmid 1PHK3 (eksempel 7.7), 10 μg 10 plasmid pLHL5 (eksempel 7.8) eller 10 μg plasmid pLHLT7 (eksempel 7.9) under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i eksempel 8.2.
Transformerede An 8-celler selekteres på minimalmedium for uridinprototrophi som beskrevet i eksempel 8.2. 50 trans- Ί Γ JZ — O- ^ Æ 1» ^ _ J—^ _ J_ J ^ Λ 4-,· 1 -l j-j-o iiv τζχ. uu li aiibiviiiia txvubl vi wi-xxctx digt og analyseres for desulfatohirudinekspression. Desul-fatohirudinaktivitet afprøves ved hjælp af en thrombinin-hiberingsanalyse i overensstemmelse med anvisningerne fra fabrikanten af det kromogene peptidsubstrat (Boehringer, 20 Mannheim) 9.2: Ekspression af desulfatohirudin under kontrol af PLI-promotoren i transformanter af mutant An 8
Konidiesporer fra transformanter opnået i overensstemmelse med eksempel 8.3 fordyrkes hver for sig i 50 ml 25 forkulturmedium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, FR) 3 g/1, NH4C1 2 g/1, KKH2P04 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1,
Mg2S04 x 7 H20 0,5 g/1, Ca2S04 x 2 H20 0,5 g/1, pH 7,0). Forkulturen inkuberes i 72 timer ved 250 o/m og 28“C. 10% af forkulturen anvendes til inokulering af 50 ml hovedkul-30 turmedium (sojabønnemel 20 g/1, pectin Slow Set 5 g/1). Kulturen opdyrkes i 72-76 timer (højeste værdi for pectinlyaseproduktion) ved 250 o/m og 28°C (betegnet som 58 DK 175569 B1 induceringsbetingelser) . Transformanter af mutant An 8 dyrkes også under ikke-inducerende betingelser i Phytone pepton 10 g/1, glucose 10 g/1 i stedet for hovedkultur-5 medium.
Der udtages prøver på forskellige tidpunkter (hver 20. time), cellerne pelletteres ved centrifugering og oplukkes ved ultralydsbehandling. Supernatant og celleekstrakter testes begge for desulfatorhirudinaktivitet som beskrevet 10 i eksempel 9.1. Der påvises ingen desulfatohirudinaktivi-tet efter cotransformation med plasmid pLHK3. pLHL5 og pLHLT7 indeholdende fuldlængde PLI-promotoren er begge i stand til at fremkalde ekspression af desulfatohirudin i A. niger-mutant An 8. Ud af de 50 transf ormanter udtaget 15 fra cotransformationsforsøgene (eksempel 9.1) udviser 10 desulfatohirudinaktivitet i mediet.
Ekspression af desulfatohirudin i mutant An 8 under kontrol af fuldlængde PLI-promotoren og under anvendelse af PLI-signalpeptidet er derfor reguleret af det 20 inducerende substrat pectin og fører til udskillelse af desulfatohirudin til mediet.
Deponering af mikroorganismer
De nedenfor anførte mikroorganismer er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten i Deutsche 25 Sammlung von Mikroorganismen, Griesebachstr. 8, 3400
Gottingen, DE:
Mikroorganisme Dep. nr. Deponeringsdato
Escherichia coll BJ5183/pCG3Bll DSM 3916 11.12.1986
Aspergillus niger An 8 DSM 3917 11.12.1986 30 Escherlcla coli BJ5183/pCG59D7 DSM 3968 02.02.1987 59 DK 175569 B1
Litteraturhenvisninger: ^ 1) F.E.A. van Houdenhoven, Ph. D. Thesius Agricultural University, Wageingen in Communications Agricultural 5 University Wageningen, NL 75-13 (1975) 2) P. Edman og G. Begg (1967) Eur. 3. Biochem. 1, 80-91 3) J.M. Vereijken, J. Hofsteenge, H.J. Bak og J.J.
Beintema. Eur. J. Biochem. 113, 151 (1980) 4) G. Frank og W. Strubert. Chromatographia, 522 (1973) 10 5) A.M. Crestfield, S. Moore og W. H. Stein. J. Biol.
Chem. 238, 622 (1963) 6) Knecht et al., Anal. Biochem. 130, 65 (1983) 7) M.M. Yelton, J.E. Hamer, W.E. Timberlake (1984), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 15 8) T. Maniatis, E.F.Fritsch, J. Sambrook, Molecular cloning, en laboratoriehåndbog, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 9) B. Nilsson, M. Uhlen, S. Josephson, S. Gatenbeck og L. Philipson (1983). Nucleic Acids Research 11, 20 8019-8030 10) D. Hanahan, (1983). J. Mol. Biol. 166, 557-580 11) J.P. Gergen, R.H. Stern, P.C. Wensink (1979). Nucleic Acids Research 7, 2115-2136 1 2 3 M.H. Caruther, Chemical and Enzymatic Synthesis of 2 25 Gene Fragments: en laboratoriehåndbog, Verlag Chemie 3 (1982) 60 DK 175569 B1 14) G.O. Humpreys, G.A. Willshaw, E.S. Anderson (1975). Biochimica et Biophysica Acta, 383, 457-463 15) J. Messing (1983), Methods in Enzymology 101, 21-78 5 16) M13 cloning and sequencing handbook, Amersham Interna
tional pic., Buckinghamshire, GB
17) H.C. Birnboim og J. Doly (1979). Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 18) E. Boel, M.T. Hansen, I. Hoegh og N. P. Fiil (1984).
10 EMBO J. 3, 1581-1585 19) S.M. Mount (1982). Nucleic Acids Res. 10, 459-472 20) M.J. Zoller og M. Smith (1984). DNA 3, 479-488 21) Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 22) D.S. Holmes, M. Quigley (1981). Anal. Biochem 114, 15 193-197 23) T. Sanger, S. Nickler og A.R. Coulson (1977). Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 24) F. Bolivar, R. L. Rodriguez, P.J. Greene, M.C.
Betlach, H.L. Heineker, H, Boyer, J.H. Crosa og S.
20 Falkow (1977). Gene 2, 95-113 1 2 3 4 C. Yanish-Perron, J. Vieira og J. Messing (1984).
Submitted to Gene 2 D.J. Ballance og G. Turner (1985), Gene 36, 321-331 3 J.D. Boeke, F. Lacroute og G.R. Fink. Mol. Gen. Geret.
25 1984, 197, 345-346 4 J. Norrander et al.. Gene 26, 101-106 (1983).

Claims (19)

1. Rekombinant DNA-molekyle, kendetegnet ved, at indeholder DNA-sekvenser, som koder for pectinlyase (PLI)- 5 ekspressionssysteinet eller et derivat deraf.
2. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder promotoren, signalsekvensen og strukturgenet med eller uden terminatoren for PLI-ekspressionssystemet.
3. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens med formlen I eller et derivat deraf.
4. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det er pCG3Bll.
5. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kende tegnet ved, at det indeholder promotorsekvensen mellem nucleotider -1 til -688, eller -100 og -146, signalsekvensen mellem nucleotider 1 og 57, PLI-strukturgenet mellem nucleotider 58 og 1366 og/eller terminatoren mellem 20 nucleotider 1367 og en hvilken som af nucleotiderne 1570 op til 2029.
6. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det indeholder PLI-strukturgenet uden intro-nerne.
7. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det indeholder en DNA-sekvens med formlen I, som er degenereret.
8. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendeteg net ved, at det er en rekombinanthybridvektor. 62 DK 175569 B1
9. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er en hybridvektor, som indeholder PLI-strukturgenet eller et homologt pectinlyasegen eller 5 heterologt strukturgen.
10. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridvektoren pLHL5.
11. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er hybridvektoren pLHLT7.
12. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker en vært transformeret med et DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens, der koder for pectinlyaseekspressionssyste-met, eller et derivat deraf, og isolerer det ønskede 15 rekombinant DNA-molekyle eller derivatet deraf, eller fremstiller det ved en in vitro-syntese.
13. Transformeret vært, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1.
14. Transformeret vært ifølge krav 13, kendetegnet 20 ved, at den er Escherichia coli BJ5183/pCG3Bll (DSM 3916).
15. Transformeret vært ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den er Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1 og selektionsmarkørplasmidet pCG59D7.
16. Transformeret vært ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den er Aspergillus niger An 8 (DSM 3917) transformeret med pLHK3, pLHL5 eller pLHLT7 og selektionsmarkørplasmidet pCG59D7. 1 Fremgangsmåde til fremstilling af en transfor- 30 meret vært ifølge krav 13, kendetegnet ved, at en sådan 63 DK 175569 B1 vært behandles under transformeringsbetingelser med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1, eventuelt sammen med et selektionsmarkørgen, og transformanterne 5 selekteres.
18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at Aspergillus noger An 8 cotransformeres med et rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 1 og selektlonsmarkørplasmidet pCG59D7.
19. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, kendetegnet ved, at en hybridvektor ifølge krav 8 udtrykkes i en egnet vært, og polypeptidet isoleres.
20. Fremgangsmåde ifølge krav 17 til overproduktion af PLI i Aspergillus-arter, kendetegnet ved, at man dyr-15 ker en Aspergillus-vært transformeret med en ekspressionshybridvektor til udtrykkeisen og udskillelsen af PLI, og PLI isoleres fra dyrkningsmediet.
DK198800545A 1987-02-04 1988-02-03 Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid DK175569B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878702475A GB8702475D0 (en) 1987-02-04 1987-02-04 Expression system
GB8702475 1987-02-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK54588D0 DK54588D0 (da) 1988-02-03
DK54588A DK54588A (da) 1988-08-05
DK175569B1 true DK175569B1 (da) 2004-12-13

Family

ID=10611694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198800545A DK175569B1 (da) 1987-02-04 1988-02-03 Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid

Country Status (23)

Country Link
EP (2) EP0278355B2 (da)
JP (1) JP2633885B2 (da)
KR (1) KR970001116B1 (da)
AT (1) ATE133706T1 (da)
AU (1) AU625773B2 (da)
CA (1) CA1327330C (da)
DD (3) DD267511A5 (da)
DE (1) DE3854947T3 (da)
DK (1) DK175569B1 (da)
ES (1) ES2082746T5 (da)
FI (1) FI105484B (da)
GB (1) GB8702475D0 (da)
GR (1) GR3018863T3 (da)
HU (1) HU214005B (da)
IE (2) IE960902L (da)
IL (1) IL85293A (da)
MX (1) MX10286A (da)
NO (1) NO179078C (da)
NZ (1) NZ223392A (da)
PH (1) PH26106A (da)
PT (1) PT86684B (da)
YU (1) YU21688A (da)
ZA (1) ZA88757B (da)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5447862A (en) * 1987-02-04 1995-09-05 Ciba-Geigy Corporation Pectin lyase genes of aspergillus niger
AU627443B2 (en) * 1988-01-11 1992-08-27 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
DE68926882T2 (de) * 1988-01-11 1997-02-13 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
DE68913846T3 (de) * 1988-07-28 2002-10-02 Novartis Ag Expressionssystem.
EP0421919A3 (en) * 1989-09-02 1992-04-15 Ciba-Geigy Ag Polygalacturonase encoding fungal expression system
US5624834A (en) * 1992-12-24 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Cloning and expression of the exo-polygalacturonase gene from aspergillus
WO1994021786A1 (en) * 1993-02-16 1994-09-29 Novo Nordisk A/S An enzyme with pectin lyase activity
US5674728A (en) * 1993-11-03 1997-10-07 Novartis Corporation Aspergillus niger vacuolar aspartyl protease
US6027888A (en) * 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6083715A (en) * 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
WO1999027083A1 (en) * 1997-11-24 1999-06-03 Novo Nordisk A/S PECTIN DEGRADING ENZYMES FROM $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
US6187580B1 (en) 1997-11-24 2001-02-13 Novo Nordisk A/S Pectate lyases
US6165769A (en) * 1997-11-24 2000-12-26 Novo Nordisk A/S Pectin degrading enzymes from Bacillus licheniformis
EP1187925B1 (en) * 1999-06-02 2005-03-30 Novozymes A/S Pectate lyase fusion for expression and secretion of polypeptides
US8765442B2 (en) 2008-12-19 2014-07-01 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for production of an enzyme product
TR201809053T4 (tr) 2012-08-16 2018-07-23 Bangladesh Jute Res Institute Macrophomina phaseolina'dan elde edilen pektin parçalama enzimleri ve bunların kullanımları.
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4885249A (en) 1984-12-05 1989-12-05 Allelix, Inc. Aspergillus niger transformation system
ATE161881T1 (de) 1985-04-15 1998-01-15 Gist Brocades Nv Verwendung von promotoren von filamentösen pilzen
DE68913846T3 (de) * 1988-07-28 2002-10-02 Novartis Ag Expressionssystem.

Also Published As

Publication number Publication date
HU214005B (hu) 1998-08-28
KR880010126A (ko) 1988-10-07
PH26106A (en) 1992-02-06
AU1123488A (en) 1988-08-18
FI105484B (fi) 2000-08-31
ZA88757B (en) 1988-08-04
GR3018863T3 (en) 1996-05-31
JP2633885B2 (ja) 1997-07-23
NO179078C (no) 1996-07-31
ATE133706T1 (de) 1996-02-15
IL85293A (en) 1992-12-01
DD267511A5 (de) 1989-05-03
NZ223392A (en) 1991-05-28
EP0278355B1 (en) 1996-01-31
DD283837A5 (de) 1990-10-24
CA1327330C (en) 1994-03-01
DE3854947T2 (de) 1996-11-14
MX10286A (es) 1993-12-01
YU21688A (en) 1991-04-30
EP0278355B2 (en) 2002-10-23
PT86684A (pt) 1988-03-01
DK54588A (da) 1988-08-05
IL85293A0 (en) 1988-07-31
FI880439A (fi) 1988-08-05
EP0278355A3 (en) 1989-12-20
EP0278355A2 (en) 1988-08-17
KR970001116B1 (en) 1997-01-28
ES2082746T5 (es) 2003-06-16
NO880470D0 (no) 1988-02-03
AU625773B2 (en) 1992-07-16
PT86684B (pt) 1992-04-30
DE3854947D1 (de) 1996-03-14
NO880470L (no) 1988-08-05
DE3854947T3 (de) 2003-04-30
DD283838A5 (de) 1990-10-24
IE880292L (en) 1988-08-04
EP0683228A2 (en) 1995-11-22
IE72506B1 (en) 1997-04-23
JPS63273480A (ja) 1988-11-10
ES2082746T3 (es) 1996-04-01
FI880439A0 (fi) 1988-02-01
NO179078B (no) 1996-04-22
IE960902L (en) 1988-08-04
GB8702475D0 (en) 1987-03-11
DK54588D0 (da) 1988-02-03
EP0683228A3 (en) 1996-03-06
HUT46357A (en) 1988-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK175569B1 (da) Rekombinant DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling deraf, transformeret vært indeholdende det rekombinante DNA-molekyle, fremgangsmåde til fremstilling af den transformerede vært samt fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid
DK173699B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af gæren Kluyveromyces, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i Kluyveromyces, anvendelse af Kluyveromyces som vært, transformet Kluyveromyces-celle og Kluyveromyces-ekspressionsvektor, samt plasmider
JP4307563B2 (ja) 糸状菌、特にアスペルギルス属に属する糸状菌のアグロバクテリウム媒介性形質転換
FI104497B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta
US4816405A (en) Vectors for transformation by ascomycetes
Herreros et al. A reorganized Candida albicans DNA sequence promoting homologous non‐integrative genetic transformation
EP0353188B1 (en) Novel expression system
NO315330B1 (no) Isolert DNA-molekyl, hybridvektor omfattende denne, Aspergillusstamme defisient i et A. niger asparaginproteasegen, A. niger protease og entransformert vert samt fremgangsmater for a fremstille de ulike elementene
US5447862A (en) Pectin lyase genes of aspergillus niger
Picknett et al. Development of a gene transfer system for Penicillium chrysogenum
EP1040197A1 (en) A process for site-directed integration of multiple copies of a gene in a mould
IL95553A (en) Recombinant dna molecules comprising a dna sequence from aspergillus niger and process for their preparation
CA1335081C (en) Expression system comprising aspergillus niger pectin lyase i gene sequences
KR0166956B1 (ko) 펙틴 리아제의 발현 시스템을 암호화하는 재조합 dna분자
JPH0832241B2 (ja) 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体、及びその利用
CS270703B1 (cs) Způsob sekreční produkce cizorodých proteinů kultivací transformovaných kvasinkových buněk

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired