DK173699B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af gæren Kluyveromyces, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i Kluyveromyces, anvendelse af Kluyveromyces som vært, transformet Kluyveromyces-celle og Kluyveromyces-ekspressionsvektor, samt plasmider - Google Patents

Description

DK 173699 B1

Opfindelsens område.

Opfindelsen vedrører området med rekombinant-DNA-bioteknologi. Den angår særlig anvendelsen af rekombi-nant-DNA-bioteknologi i fremstillingen af polypeptider.

5 Mere specielt angår opfindelsen hidtil ukendte rekombi-nant-DNA-kloningshjælpemidler og egnede værtsorganismer for disse, hvilke organismer kan anvendes til produktion af polypeptider i stort udbytte, f.eks. enzymer, såsom 3-galactosidase (lactase) og chymosin og dets precurso-10 rer.

Opfindelsens baggrund.

I de forløbne få år har mikroorganismer vist sig at være i stand til at danne fremmede peptider og proteiner, for hvilke der kodes ved hjælp af fremmede gener, 15 kunstigt indførte ved hjælp af et transformationssystem og eksprimeret eller udtrykt under kontrol af regulatoriske sekvenser.

Noget af den grundlæggende teknik for denne fremgangsmåde er blevet omtalt i eksempelvis US-patent nr.

20 4.237.224.

De grundlæggende bestanddele i rekombinant-DNA-teknologi udgøres af: genet, som indeholder kode for den ønskede egenskab og er udstyret med tilstrækkelige kontrolsekvenser, 25 som kræves til ekspression i værtsorganismen, en vektor, sædvanligvis et plasmid, hvori genet kan indsættes under garanti af stabil replikation og et højt ekspressionsniveau for genet, og en egnet værtsorganisme, hvori vektoren med det nævn- 30. te gen kan transformeres, og som har de til ekspression af det nævnte gens information nødvendige cellulære systemer.

Blandt de således dannede produkter kan nævnes enzymer, hormoner, antigener og andre nyttige peptider 35 og proteiner.

Nogle af disse produkter anvendes som farmaceutiske midler, f.eks. væksthormon og interferon, andre som hjælpemidler i levnedsmiddelindustrien, f.eks. ,3-galac- DK 17:J699 B1 2 tosidase (lactase), chymosin og amyloglucosidase, og atter andre kan virke som biologiske katalysatorer for omdannelsen af visse forbindelser.

Enhver kontamination af farmaceutiske midler el·· 5 ler levnedsmidler skal udelukkes. Værtsorganismerne mS også være uskadelige for de personer, som arbejder med mikroorganismerne under forsøg eller i produktionsprocesser i stor målestok. Det er derfor nødvendigt, at værtsorganismen ikke er pathogen.

10 De første år med rekombinant-DNA-arbejde var ka rakteriserede ved strenge regler og restriktioner for .= t forhindre eller begrænse uønskede bivirkninger, navnlig den ukontrollerede spredning af pathogene mikroorganis· mer til omgivelserne.

15 Selv om bekymringen for de formodede risici synes at have været overdrevet, er der stadigvæk et behov fo:: værtsorganismer, hvortil der ikke knytter sig nogen skadelig effekt.

Hidtil har de kommercielle anstrengelser i for-20 bindelse med rekombinant-genetisk manipulation af plas-mider til fremstilling af forskellige stoffer rettet sig mod Escherichia coli som værtsorganisme. Hovedårsagen hertil er, at E. coli er den historisk bedst studerede mikroorganisme. De første opdagelser og opfindelser, 25 der er gjort indenfor rekombinant-DNA-teknologi, er blevet gjort med E. coli som værtsorganisme.

E. coli er imidlertid ikke den mest hensigtsmæssige organisme at anvende til kommerciel produktion af stoffer, som anvendes i den farmaceutiske industri og 30 levnedsmiddelindustrien. Den kan endogså vise sig at være uegnet som et vært/vektor»Bystem i nogle situationer på grund af tilstedeværelsen af et antal toksiske pyrogene faktorer. Fjernelsen af disse kan ofte forårsage problemer. E. coli har derfor kun en meget begran-35 set anvendelse som produktionsorganisme i gæringsindustrien. Også den proteolytiske virksomhed i E. coli kan i alvorlig grad begrænse udbytterne af visse anvendelige produkter.

DK 173699 B1 3

Disse og andre overvejelser har ført til en forøget interesse i alternative vært/vektor-systerner. Interessen koncentrerer sig især om anvendelsen af euka-ryotiske systemer for anvendelsen af eukaryotiske pro-5 dukter. Der eksisterer et stadigt behov for nye værtsorganismer, som er hævet over mistanke, hvad angår anvendelsen som produktionsorganismer for kemiske stoffer, navnlig produkter af levnedsmiddelkvalitet og farmaceutisk kvalitet, og som desuden er egnede til gæringspro-10 cesser i stor målestok i industrien.

På den såkaldte GRAS (Generally Recognized as Safe)-liste findes navnene på mange skadelige mikroorganismer. Imidlertid kendes der indtil nu kun nogle få genetiske fremgangsmåder til kloning og ekspression af 15 gener i GRAS-organismer.

Blandt de eukaryotiske organismer, som er egnede til kommerciel udnyttelse, er gærarter måske de letteste at have med at gøre. Gær, navnlig bagerigær, er forholdsvis billig, let at dyrke i store mængder og har et 20 højt udviklet genetisk system.

Udtrykket gær anvendes ofte blot som betegnelse for Saccharomyces cerevisiae eller bagerigær, hvilket er en af de mest almindelige og velkendte arter. Man vil forstå, at udtrykket gær som anvendt i den foreliggende 25 beskrivelse med krav, skal angive alle arter og ikke er begrænset til arten Saccharomyces cerevisiae.

Det er for nylig blevet angivet, at celler af Saccharomyces cerevisiae kan transformeres med plasmider (A. Hlnnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 30 1929). Det er lykkedes i denne gær at klone og bringe til ekspression de bakterielle gener for resistens mod ampicillin, chloramphenicol og kanamycin, men også eukaryotiske gener, som f.eks. lactasegenet og de heterologe gener for ovalbumin, leukocyt-interferon D såvel som et 35 Drosophila-gen (se redegørelse i C. P. Hollenberg, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96 (1982) 119-144).

Hidtil er kun en enkelt anden gærart blevet under 4 DK 173699 B1 søgt som vært for gær-ekspressionsvektorer. Leucin-ge.net 1 Saccharomyces cerevisiae er med held blevet klonet oj bragt til udtryk i Schizosaccharomyces pombe (D. Beach og P. Nurse, Nature 290 (1981) 140-142).

5 Gær-vektorer, der er beskrevet som givende heldig transformation, er baserede henholdsvis på det naturlige 2 μιη (2 micron) plasmid, som forekommer i mange stammer af S. cerevisiae (se eksempelvis J. D. Beggs, Nature 275 (1978), 104-109), og på de autonomt replikerende sekven- 10 ser (ARS), der hidrører fra kromosomalt gær-DNA (se eksempelvis K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USi 76 (1979), 1035 -1039). Vektorer for Saccharomyces ce:te-vislae, der kan anvendes til transformationsformål, et også beskrevet af C. P. Hollenberg, Current Topics in 15 Microbiology and Immunology, 96 (1982) 119-144.

Transformationen af ikke godt karakteriserede gær-arter eller industrielle gærarter er alvorligt hæmmet af manglen på viden om transformationsbetingelser og egnede vektorer. Yderligere er auxotrofe markeringer ofte ikke 20 tilgængelige eller er uønskede, således at en direkte selektion ved hjælp af auxotrof komplementation er udelukket .

Resumé af opfindelsen.

25 Det tilsigtes ved den foreliggende opfindelse ut tilvejebringe et gær-vektorsystem, som er i stand til ekspression af en indsat, for polypeptid kodende sekvens .

Det tilsigtes yderligere ved opfindelsen at t:i L-30 vejebringe hidtil ukendte, genetisk manipulerede gærstammer af slægten Lkuyveromyces, som er i stand til at danne polypeptider i kultur for masseproduktion.

Endvidere tilsigtes det ved opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte, genetisk manipulerede gærstam-35 mer af slægten Kluyveromyces, der er i stand til at danne chymosin og dets precursor-former i kultur for masseproduktion .

Yderligere tilsigtes det ved opfindelsen at til- 5 DK 173699 B1 vejebringe hidtil ukendte, genetisk manipulerede gærstammer af slægten Kluyveromyces, der er i stand til at danne lactase i kultur for masseproduktion.

Det tilsigtes også ved opfindelsen at tilveje-5 bringe fremgangsmåder til fremstilling af polypeptider, og navnlig enzymer, med Kluyveromyces som produktionsorganisme, opnået ved rekombinant-DNA-teknik.

Endelig tilsigtes det også ved opfindelsen at tilvejebringe særlige modificerede Kluyveromyces-celler 10 til anvendelse i produktionen af polypeptider, som udviser visse enzymatiske aktiviteter.

Disse og andre formål vil blive beskrevet mere detailleret i den efterfølgende beskrivelse.

15 Beskrivelse af opfindelsen.

Gærarter af slægten Kluyveromyces, og navnlig arterne K. lactis og K. fragilis, er bioteknologisk vigtige og har kommerciel interesse. Eksempelvis anvendes Kluyveromyces lactis og Kluyveromyces fragilis til kom-20 merciel produktion af enzymet lactase (Ø-galactosidase). Kluyveromyces-organismer er omtalt på GRAS-listen.

I modsætning til de fleste af de bakteriearter, som er undersøgt i transformationsforsøg, besidder gærceller en cellevæg, som er uigennemtrængelig for plasmi-25 der. Et sædvanligt forberedende trin i gær-transformation er derfor fjernelsen af cellevæggen, hvorved der opnås protoplaster, som er i stand til at optage plasmider. Cellevæg-lytiske enzymer, som med fordel kan anvendes, udvælges fra gruppen af 3-1,3-glucanaser. Et egnet ek-30 sempel er helicase, et urent enzympræparat hidrørende fra fordøjelseskanalen i sneglen Helis pomatia. Et andet egnet repræsentativt eksempel er zymolyase.

Det er velkendt, at cellevæggen ved efterfølgende inkubation under passende betingelser kan regenereres.

35 Imidlertid regenererer kun en brøkdel af protoplasterne, og for Kluyveromyces lactis' vedkommende har denne proces vist sig at være endog tyve gange mindre effektiv end for Saccharomyces cerevisiae under lignende betin- 6 DK 17 3699 B1 gelser.

Selvom transformation af gærarter under anvende.'.-se af protoplaster er beskrevet af adskillige forfattere, viser det sig at nogle gærarter, og navnlig vildtype-5 gærarter og Kluyveromyces-arter er meget vanskelige at regenerere. Hollenberg har beskrevet {Current Topics Ln Microbiology and Immunology, 96 (1982) 119-144), hvorledes regenereringen af protoplaster af Saccharomyces cerevisiae også kan finde sted, såfremt den sædvanlige-;: 10 osmotiske stabilisator sorbitol erstattes med 0,6 M k&~ liumchlorid. Det har nu overraskende vist sig, at ved at anvende denne fremgangsmåde på Kluyveromyces protoplaster forøges brøkdelen af regenererede gærceller tiL det tre-til femdobbelte.

15 Fornylig er der af Ito et al (J. Bacteriol. 15*5 (1983) 163-168) angivet en fremgangsmåde, ved hvilken hele celler anvendes i stedet for protoplaster, hvorved man undgår regenereringstrinnet. Denne fremgangsmåde har vist sig at være effektiv for S. cerevisiae med vis-20 se typer af plasmider.

Det har nu vist sig, at denne fremgangsmåde er overraskende effektiv for Kluyveromyces, navnlig når c er anvendes plasmider indeholdende KARS-sekvenser (som v;i 1 blive beskrevet i det følgende).

25 Sagkyndige på det her omhandlede område vil for stå, at tilgængeligheden af en egnet vektor er af afgørende betydning. På forhånd er det usikkert, om en speciel vært/vektor-kombination vil fungere med held som transformationssystem. Eksempelvis er det kendt fra T..

30 Erhart og C. P. Hollenberg, Current Genetics 3 (1981), side 83-89, at plasmid pMP8l kan transformerestil Saccharomyces cerevisiae YT6-2-IL (cir°), men ikke t,i.’. Kluyveromyces lactis. D. Beach og P. Nurse har i Nature 290 (1981), side 1 40-142 angivet, at plasmid pJDB219 har 35 et højt kopital i Saccharomyces cerevisiae, men transformerer Schizosaccharomyces pombe med den meget lave frekvens på kun 2 transformanter pr. microgram DNA.

Hidtil har man overhovedet ikke kendt vektorer DK 173699 B1 7 for Kluyveromyces.

Som følge af omfattende forskning og forsøg er der blevet fundet hidtil ukendte vektorer, som er i stand til at transformere værtsorganismen Kluyveromyces, 5 og som desuden er i stand til at replikere autonomt i den transformerede celle.

De hidtil ukendte vektorer, som er særligt egnede for Kluyveromyces,og fortrinsvis for K. laetis og K. fragilis, kan deles i to kategorier alt efter de i vek-10 torerne indeholdte DNA-sekvenser, som kontrollerer replikat ions- og opretholdelsesfunktionen i eksempelvis Kluyveromycesarter, nemlig: 1. vektorer indeholdende autonomt replikerende se kvenser (ARS), og 15 2. vektorer, som ikke indeholder autonomt replike rende sekvenser, men som indeholder homologt Kluyveromyces NDA, der virker som position for rekombination med værts-kromosomet.

Egnede og foretrukne ARS-vektorer er vektorer, 20 som hidrører fra Kluyveromyces, og som også betegnes som KARS-vektorer, Disse vektorer af KARS-typen anvendes fortrinsvis på grund af deres høje transformationsfrekvens . Vektorer af den anden kategori transformerer sædvanligvis med lav frekvens, men de opretholdes meget 25 stabilt i værtscellerne.

Foretrukne vektorer af den første kategori er eksempelvis KARS-vektorer hidrørende fra K. lactis, blandt hvilke pKARS12 og pKARS2 er de mest foretrukne. pKARS12 og pKARS2 er hybrid-plasmider bestående af et K.

30 lactis-DNA-fragment indeholdende henholdsvis KARS12- og KARS2-sekvensen, som er indsat i det kendte S. cerevi-siae-plasmid YRp7.

En foretrukken vektor af den anden kategori er eksempelvis pL4, et hybrid-plasmid sammensat af det ARS1-35 bærende plasmid YRp7 og et K. lactis Xhol-DNA-fragment, som bærer LAC4-genet.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af gæren Kluyveromyces, hvilken frem- DK 173699 B1 8 gangsmåde er ejendommelig ved, at man {1) transformerer Kluyveromyces gærceller med en vektor, der i 5— 3' -transkriptionsretningen omfatter; 5 (a) en i Kluyveromyces funktionsdygtig promoter-reguleringsregion, (b) en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid under regulering af nævnte promoterregulerings-region, 10 (c) en transkriptionsterminator, og knyttet dertil (d) en selektionsmarkør, og (e) et i Kluyveromyces funktionsdygtigt repli-kationsbegyndelsessted, og 15 (2) propagerer de opnåede transformerede celler i et vækstvedligeholdende medium.

Hensigtsmæssige udførelsesformer for ovennævnte fremgangsmåde ifølge opfindelsen er angivet i krav 2-1< .

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fren- 20 stilling af et polypeptid i Kluyveromyces, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker Kluyveromy-ces-celler opnået ved ovennævnte fremgangsmåde ifølge opfindelsen, herunder ved en vilkårlig af de nævnte udførelsesformer .

25 Opfindelsen angår også anvendelsen af Kluyveromy ces som vært for transformation og ekspression af fremmede gener.

Opfindelsen angår desuden en transformeret Kluy-veromyces-celle, der er ejendommelig ved, at den inde- 30 holder et rekombinant-DNA,som omfatter: (a) et strukturelt gen, der koder for chymosin eller én af dets precursorformer eller β-galacto-sidase, 35 (b) en autonomt replikerende sekvens hidrørende fra Kluyveromyces (KARS), (c) en gærregulon og (d) en selektionsmarkør, DK 173699 B1 9 idet nævnte Kluyveromyces er i. stand til at ekspritnere chymosinet eller dets precursorform eller β-galactosi-dasen, som rekombinant-DNA'et koder for.

Opfindelsen angår desuden en transformeret Kluyve-5 romyces*-celle, der er ejendommelig ved, at den indeholder et rekombinant-DNA, som omfatter: (a) et strukturelt gen, der koder for chymosin eller én af dets precursorformer eller β-galacto-sidase, 10 (b) en 2-mikron-plasmidreplikationssekvens hid rørende fra Saccharomyces, (c) en gærregulon og (d) en selektionsmarkør, idet nævnte Kluyveromyces er i stand til at eksprimere 15 chymosinet eller dets precursorform eller β-galactosi-dasen, som rekombinant-DNA'et koder for.

Opfindelsen angår desuden en transformeret Kluyve-romyces-celle, der er ejendommelig ved, at den indeholder et rekombinant-DNA, som omfatter: 20 {a) et strukturelt gen, der koder for chymosin eller én af dets precursorformer eller β-galacto-sidase, (b) en sekvens, der er homolog med en genomisk Kluyveromyces-sekvens, 25 (c) en gærregulon og (d) en selektionsmarkør, idet nævnte Kluyveromyces er i stand til at eksprimere chymosinet eller dets precursorform eller β-galactosida-sen, som rekombinant-DNA'et koder for.

20 Specielle transformere Kluyveromyces-celler, som falder under de ovennævnte, er angivet i krav 20-22.

Opfindelsen angår ydermere en Kluyveromyces-eks-pressionsvektor, som er ejendommelig ved, at den i 5'-3T-transkriptionsretningen omfatter: 25 (a) en i Kluyveromyces funktionsdygtig promoter-, reguleringsregion, (b) en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid under regulering af nævnte promoterregulerings-region, DK 173699 B1 10 (c) en transkriptionsterminator, og knyttet dertil (d) en selektionsmarkør og (e) et i Kluyveromyces funktionsdygtigt replika·· 5 tionsbegyndelsessted.

Specielle Kluyveromyces-ekspress ionsvektorer, som falder under den ovennævnte, er angivet i krav 24-27.

Endelig angår opfindelsen et plasmid pPTY75-LAC4 som indeholdt i E. coli DG75 med deponeringsaccession!i-10 nummeret CBS 351.82, et plasmid pL4 som indeholdt i E. coli DG75 med deponeringsaccessionsnummeret CBS 352.8]:, og et plasmid pKARS12 som indeholdt i E. coli JA221 m<-d deponeringsaccessionsnummeret CBS 353.82.

Alle de nævnte deponeringsaccessionsnumre ved-15 rører deponeringer foretaget i overensstemmelse med Budapest-traktaten.

Med henblik på transformation i Kluyveromyces han eksempelvis følgende gener med fordel anvendes som se·· lekterbare markeringer på vektorerne: 20 1. tryptophangenet (TRP1) opnået fra S. cerevisiae, 2. lactasegeent (LAC4) opnået fra K. lactis, og p 3. Kan -genet, som koder for resistens mod antibio-tiket G418, der er beslægtet med gentamycin, hvilket gen er opnået fra E. coli.

25 På vektorerne er der passende restriktions-pos L- tioner, som muliggør yderligere genkloning.

Stabiliteten af de transformerede plasmider ka i forøges betydeligt, såfremt en centromer region (CEN) fra K. lactis- eller S. cerevisiae-kromosomet indsættes 30 i vektoren.

Escherichia coli er også en passende vært, navnlig til kloning og opbevaring. I dette tilfælde er at-picillin-resistens-genet (Amp ) også en egnet, selektar-bar markering på vektoren. Fortrinsvis formeres og op-35 lagres plasmiderne i E. coli-celler, navnlig celler af stammerne DG75 og JA221. De transformerede stammer dyrkes selektivt på L-substrat indeholdende: DK 173699 B1 11 kanaraycin (20 μς/ιηΐ) til E. coli DG75 (PTY75- LAC4) , og ainpicillin (100 ug/ml) til E. coli DG75 (pL4) og E. coli JA221 (pKARS!2).

Disse transformerede stammer er i henhold til re-5 gel 28, jvf. 28a, i den Europæiske Patentkonvention blevet deponeret den 19. maj 1982 i Centraal Bureau of Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Holland, under numrene henholdsvis CBS 351.82 (=LMD 82.18), CBS352.82 (=LMD 82.19) og CBS 353.82 (=LMD 82.20).

10 Plasmiderne kan isoleres fra cellerne, f.eks. ved hjælp af den af L. Katz et al. i J. Bacteriol 114 (1973), side 577 angivne metode.

Gær-værtsorganismens protoplaster transformeres ved hjælp af de føromtalte vektorer i et sædvanligt in-15 kubationsmedium indeholdende Tris, calciumchlorid og polyethylenglycol med en molekylvægt i området fra 2000 til 6000, men fortrinsvis på 4000.

Prokaryotiske transformanter kan let detekteres ved hjælp af velkendte foranstaltninger til primær se- 20 lektion. Selvom den ønskede egenskab ikke giver sig til kende i transformantens phænotype, indeholder vektoren sædvanligvis et eller flere gener, som indeholder kode for primært selekterbare egenskaber, som f.eks. antibiotikum-resistens, eller gener, der indeholder kode for 25 essentielle vækstfaktorer. I sidstnævnte tilfælde må den tilsvarende auxotrofe mutant af værten være tilgængelig. Selvom mange auxotrofe prokaryoter er tilgængelige, er antallet af auxotrofe industrielle gærarter begrænset. Mutation af et gen fra en produktionsstamme 30 påvirker ofte ugunstigt vigtige vækst- og produktions-egenskaber hos denne stamme.

Transformations-fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, ved hvilken der anvendes hele celler i stedet for protoplaster til transformation af 35 Kluyveromycesarter, kan hensigtsmæssigt gennemføres på følgende måde: DK 173699 B1 12

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes Kluyveromyces-celler i et standard-gærsubstrat, og cellerne høstes ved ODg^nm mellem 1 og 25. Optimale resultater opnås ved ODg^nm mellem 4 og 10.

5 Kluyveromyces-cellerne vaskes og forbehandles med visse typer chaotropiskeioner, f.eks. Li+, Cs+ og Rb+. Der anvendes hensigtsmæssigt LiCl og Li^SO^ ved slutkoncentrationer fra ca. 20mM til ca. 0,2M, fortrinsvis på ca. 0,1M.

10 Kluyveromyces-cellerne inkuberes med disse mono- valente ioner ved 30°C i ca. 5-120 minutter, sædvanligvis omkring 60 minutter, efterfulgt af en inkubation med DNA. Transformationen kan forøges, såfremt der derefter tilsættes polyethylenglycol. Sædvanligvis anven-15 des der et lige så stort rumfang 70%'s polyethylenglycol 7000. Kluyveromyces-transformationen kan yderligere forøges ved at udsætte cellerne for en varmebehandling. Eksempelvis opnås der ved en behandling i ca. 5 minutter ved ca. 42°C en forøgelse til omkring det tyvedobbelte.

20 Anvendelsen af denne fremgangsmåde ifølge opfin delsen vil blive nærmere forklaret i eksemplerne med Kluyveromyces lactis SD11 , Kluyveromyces fragilis le»: 24 og Kluyveromyces fragilis C21 som værtsorganismer.

I modsætning til, hvad der er tilfældet hos prc-25 karyoter, er anvendelsen af markeringer for antibiotikum-resistens i gær langt fra let. Kun et lille antal antibiotika er virksomme mod gær. Desuden hidrører r<=-sistensfaktorerne overvejende fra bakterier, og det er langt fra nogen selvfølge, at de kan bringes til eks-30 pression i gærceller og anvendes som selektiv markering.

Kanamycin og aminoglycosidet G418, der er beslægtet med gentamycin, har vist sig at være giftig for celler af vildtype-gærstammer.

Yderligere er det kendt fra Hollenberg, Extrachronoso-35 mal DNA, ICN-UCLA Symp. (1979) 15:325-338, Acad. Press,

New York, at det transponerbare resistenselement Tn601, (som forekommer på bakterieplasmidet pCRl), indeholder et gen, som giver transformanter af Saccharomyces cerevi;iae DK 173699 B1 13 resistens overfor kanamycin. A. Jimenez og J. Davis,

Nature 287 (1980) 869-871, har senere vist, at genet for i kanamycinresistens også giver S. cerevisiae-transforman-ter resistens overfor antibiotikum G418, som er en stærk 5 inhibitor af gærvækst.

Plasmidet PTY75-LAC4, som er et hybrid-plasmid sammensat af plasmidet pCR1, det 2 μπι store plasmid fra S. cerevisiae og Sal I-fragmentet fra plasmid pK16, der bærer K. lactis LAC4-genet, og som også udgør et træk 10 ved den foreliggende opfindelse, indeholder det samme resistensgen. Det har nu vist sig, at dette gen bringes til udtryk også i Kluyveromyces lactis og gør det muligt for stammen at inaktivere G418, som optages fra vækstmediet og således tilvejebringer et redskab for primær se-15 lektion af Kluyveromyces lactis-transformanter.

Selvom plasmid PTY75-LAC4 ikke indeholder nogen autonomt replikerende sekvens fra Kluyveromyces, viste det sig overraskende, at plasmider indeholdende 2 μιη-plasmidet fra S. cerevisiae, som f.eks. PTY75-LAC4, re-20 plikerer autonomt i Kluyveromyces-arter.

Selektion af G418-resistente gærceller, der var transformeret med PTY75-LAC4, gennemførtes på regenerationsplader indeholdende glucose, sorbitol og 0,2 mg/ml G418. KC1 er ikke velegnet her, fordi Kluyveromyces 25 lactis-celler på grund af høj saltkoncentration er ufølsomme for G418, selv i koncentrationer op til 0,8 mg pr. ml.

Resistente kolonier viser sig i løbet af 5 - 6 dage efter transformation med PTY75-LAC4. Reelle trans-30 formanter kan skelnes fra kolonier, der er blevet resistente ved spontan mutation, ved undersøgelse af tilstedeværelsen af PTY75-LAC4-DNA ved hjælp af koloni-hy-bridisering med mærket pCR1-DNA eller, for så vidt en K. lactis lac4-mutant anvendes som vært-stamme, ved un-35 dersøgelse af deres evne til at vokse på minimalt substrat (gæ^nitrogen-basis, Difco) med lactose som eneste carbonkilde. Gennemsnitlig fandtes 5% af de resistente DK 173699 B1 14 kolonier at indeholde PTY75-LAC4-DNA eller at være Lac: + .

Ved hjælp af denne selektionsmetode opnåedes ca. 4 transformanter pr. microgram plasmid DNA.

Ved direkte selektion i K. lactis SD69 lac4 fo:c 5 tilstedeværelsen af LAC4-genet under anvendelse af pi,: -der indeholdende lactose som eneste carbonkilde og Ο,ΐ M KC1 som osmotisk stabilisator, opnåedes 20 Lac+-transformanter efter 4 til 5 dages inkubation ved 30°C. På kon-trolplader uden DNA viste der sig ingen Lac+-kolonier i 10 løbet af dette tidsrum. Lac+-kolonierne fra den direkte selektion påvistes at være transformanter og ikke spon-

R

tane revertanter, fordi tilstedeva^relsen af Kan -markeringen på G418-plader kunne påvises som beskrevet ovenfor.

15 Når der anvendes plasmid pL4 (jvf. eksempel 3) eller plasmider af KARS-typen, har man også mulighed for at selektere for tilstedeværelse af tryptophan-proto-trofi i transformanterne. I sammenligning med plasmii PTY75-LAC4 bevirkede anvendelsen af plasmid pL4 en væ-20 sentlig forøgelse i transformationseffektiviteten; der fandtes 30 transformanter pr. microgram DNA. Plasmider 3 4 af KARS-typen med 10 - 10 transformanter pr. microgram DNA viste sig imidlertid at være langt overlegne.

Plasmidet PTY75-LAC4 og KARS-holdige plasmider 25 viste sig at. forekomme autonomt replikerende i transformerede celler. Dette påvistes ved hjælp af DNA-ana-lyse. Ikke-digesterede minilysater af transformanter analyseredes i overensstemmelse med Southern's filter- 32 papirmetode ved hybridisering med P-mærket pCRl, den 30 bakterielle komponent af plasmid PTY75-LAC4, eller med mærket pBR322, den bakterielle del af pKARS-piasmiderne.

Sammenlignende elektroforese af et minilysat af en ikke-transformeret Kluyveromyces lactis trp1 lac4-mutant og af rensede plasmidpræparater viser, at kun i 35 trans formanterne forekommer der hybridiseringsbånd m<;d elektroforetiske mobiliteter svarende til supersnoed«; DK 173699 B1 15 og åbne cirkulære former for det til transformation benyttede plasmid.

Tilstedeværelse af plasmidet i transformerede celler bekræftedes yderligere ved transformering af E.coli 5 med DNA-præparatet fra gær-transformanterne og isolering af de samme plasmider fra de dannede E.coli-transfor-manter.

Fremgangsmåden,ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes på værts-stammer af arten Kluyveromyces 10 lactis såvel som på stammer af arten Kluyveromyces fragilis. Begge arter er risikofri organismer og er opført på GRAS-listen.

Særligt anvendelige værtsorganismer er mutanterne Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1 og SD69 lac4 , som er 15 opnået ud fra vildtypen CBS 2360, og som i henhold til regel 28, jvf. 28a, i den Europæiske Patentkonvention er deponeret den 19. maj 1982 i Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Holland, under henholdsvis nr. CBS 8092 og CBS 8093. Begge de 20 nævnte deponeringer er foretaget i overensstemmelse med Budapest-traktaten.

Sædvanligvis forbliver transformerende plasmider i værtscellen som separate enheder, der er i stand til autonom replikation og ekspression. Det skal imidlertid 25 her påpeges, at gener, efter at de er blevet indført på plasmider (med eller uden replikations-sekvenser) bagefter også kan blive integreret i cellens kromosomale DNA.

Denne såkaldte integrative transformation viste sig 30 at være indtrådt i stabile K.lactis SD11 trp1 Lac+- transformanter efter transformation med plasmid pL4. I dette tilfælde forekommer der intet frit plasmid-DNA i transformanterne.

Integration af LAC4-genet kan påvises ved hjælp 35 af Southern’s filterpapir-DNA-analyse af den totale mængde celle-DNA, der digesteres ved hjælp af restriktionsenzymer, idet pL4-plasmidet fungerer som et mærket hybridiserings-undersøgelsesmiddel.

DK 173699 B1 16

Til opnåelse af plasmiderne i gær-transformanter-ne kan der eksempelvis anvendes følgende selektive substrater: Gær-nitrogengrundsubstrat (DIFCO) plus 2% lac tose i stedet for glucose til K. laetis SD69 lac4 (PTY75-5 LAC4) og til K: lactis SD69 lac4 (pL4), og gær-nitrogem-grundsubstrat (DIFCO) plus 2% glucose til K. lactis SD11 trpl lac4 (pKARS12).

Der er blevet fremstillet hybrid-plasmider indeholdende KARS1 2--LAC4- og KARS 1 2-2 |im DNA-LAC4-sekvens(= r.

10 Når de hidtil ukendte mikroorganismer ifølge op — findelsen anvendes til produktion i stor målestok, er det hensigtsmæssigt at fjerne alle bakterielle DNA-se-kvenser fra vektor-plasmiderne.

Genet kan forblive på autonomt replikerende pi.; s-15 mider,efter at de er indført i cellen, eller de kan integreres i værtscellens kromosomale DNA.

Opfindelsen kan anvendes til kloning og ekspression af både prokaryotiske og eukaryotiske gener i Kli.y-veromyces som værtsorganisme, fortrinsvis under anven· 20 delse af en plasmid-vektor af en af de før beskrevne typer. Egnede prokaryotiske gener til anvendelse ifølge opfindelsen er eksempelvis gener for lactase, a-amylase, amyloglueosidase og β-lactamase. Egnede eukaryotiske gener til anvendelse ifølge opfindelsen er eksempelvis; 25 gener for lactase, chymosin, invertase og interferon.

Til indsættelse af generne, der koder for disse produkter, er egnede restriktionspositioner tilgængelige på vektorerne som beskrevet i det foregående.

Ifølge opfindelsen kan der anvendes prokaryotiske 30 og eukaryotiske gener, både homologe og heterologe. Opfindelsen kan med fordel anvendes til produktion af k.2-miske stoffer :L større målestok, navnlig polypeptider.

Ved en foretrukken udførelses form for opfindelsen fre τι-stilles chymosin, et enzym til løbning af mælk.

35 Valget af vektoren og reguIonerne til kloning og ekspression af gener i Kluyveromyces kan selvsagt variere med det i det specielle tilfælde anvendte gen.

Også valget af en speciel Kluyveromyces-stamme DK 173699 B1 17 som værtsorganisme og de optimale procesbetingelser kan variere med blandt andet det gen og den vektor, der skal udvælges. De optimale selektions- og procesbetingelser kan fastlægges ved hjælp af rutineforsøg. Disse varia-5 tioner er alle indbefattet i den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af en detailleret beskrivelse af eksempler på kloning og ekspression af: a. et homologt gen, Ø-galactosidase (lactase)-genet 10 i K. lactis, Ό b. et prokaryotisk, heterologt gen, Kan , i K lactis og K. fragilis, c. et eukaryotisk, heterologt gen, TRP1, i K. lactis, 15 d. et eukaryotisk, heterologt gen, LEU2, i K. fragilis , e. et eukaryotisk, heterologt gen, der koder for preprochymosin og dets modningsformer, i K. lactis, og 20 f. et eukaryotisk, heterologt gen, der koder for preprothaumatin og dets modningsformer og modificerede former, i K. lactis.

I de efterfølgende udførelseseksempler forklares visse udførelsesformer for den foreliggende opfindelse.

25

Eksempel 1

Rekombinant-plasmid PTY7 5-LAC4.

0,5 μ9 af plasmidet pK!6, der er beskrevet af R.f Dickson, (Gene 10 (1980) 347-356), og 0,5 μg af plasmidet 30 PTY75, der er beskrevet af C. P. Hollenberg et al. (Gene 1 (1976) 33-47, digesteredes med restriktionsenzymet Sal I. De to digesterede produkter blandedes, og efter inaktivering af restriktionsenzymet inkuberedes opløsningen med T4-ligase, hvorved der opnåedes en opløsning 35 med rekombinant-DNA.

Denne ligerede blanding anvendtes til transformering til E. coli-stamme DG75 (hsdSl leu-6 ara-14 galK2 xyl-5 mt-1 rpsL20 thi-1 supE44- -lacAZ 39) i overens- 18 DK 1 i 3699 B1 stemmelse med R. C. Dickson et al., Cell 15 (1978), side 123-130, hvilket resulterede i kanamycin-resistens (Kan ). Kan -kolonier selekteredes yderligere på supplerede miniraalsubstrat-plader, indeholdende lactose som 5 eneste carbonkilde, med henblik på dannelse af lac+-ko-lonier. Plasmidet PTY75-LAC4 isoleredes fra en af de selekterede Kan ' lac -transformanter under anvendelse af den af L. Katz et al., J. Bacteriol. 114 (1973), s .de 577-591 beskrevne fremgangsmåde.

10

Eksempel 2

Rekombinant-pKARS-plasmider.

5 kg af plasmidet YRp7 (Struhl et al., Proc. Niti. Acad. Sci., 76 (1979) side 1035-39) digesteredes med 15 restriktionsenzymet Sal I. 14 pg DNA fra vildstammen K. lactis CBS 2360 digesteredes med enzymet Xho I. Fragmenterne af plasmidet og K. lactis-DNA blandedes i et molært forhold på 1:3. Efter inaktivering af restriktionsenzymerne bragtes opløsningen til en DNA-koncentra-20 tion på 25 ug/ml og inkuberedes med T4-ligase under standardbetingelser (Boehringer).

Ved transformation af E. coli DG75 med den ligarede blanding under sædvanlige betingelser opnåedes en

5 R

blanding af 4,5 x 10 Amp -transformanter, af hvilke 9 x 3 25 10 indeholdt K. lactis-indsatsdeie, som det kan udisdes af deres følsomhed overfor tetracyclin. Procentmængcen af tetracyclin-følsomme celler kan forøges til 85% v<:d cycloserin-behandling, se F. Bolivar og K. Backman,

Methods in Enzymology 68 (1979), side 245-267. I ovitr-30 ensstemmelse med den af Katz et al. (se eksempel 1) angivne metode isoleredes 14 forskellige plasmider, det betegnes som pKARS 1-14. Alle var i stand til at transformere K. lactis SD11 lac4 trp1-stammen til Trp+-phæno- 3 4 typen med en frekvens på 10 - 10 pr. microgram DNA, 35 Plasmidet pKARS12 viste den højeste transformationsfsekvens på 3 x 104 pr. microgram DNA, men plasmidet pKARS2 viste sig at være mere hensigtsmæssig i den videre behandling.

DK 173699 B1 19

De opnåede rekombinant-plasmider kunne også overføres til E. coli JA221 (Atrp E5, leu B6, lac y, rec A, hsdM+, hsdR ).

5 Eksempel 3

Rekombinant-plasmid pL4.

En blanding af YRp7 og K. lactis DNA-fragmenter fremstilledes som beskrevet i eksempel 2. E. coli DG75-stammen transformeredes med den ligerede blanding og ud-lø spredtes derefter på plade af M9 minimal agar, hvilket substrat indeholdt lactose som eneste carbonkilde, og hvortil der var sat leucin. Lac+-kolonier viste sig efter 8 dage ved 30°C. Plasmid pL4 isoleredes fra en af disse lac+-kolonier under anvendelse af den af Katz et 15 al (se eksempel 1) angivne fremgangsmåde.

Eksempel 4

R

Kluyveromyces lactis SD69 lac4 transformeret til G418 lac4+ med plasmidet PTY75-LAC4.

20 Celler af Kluyveromyces lactis-mutanten SD69 lac4 suspenderedes i et dyrkningsmedium (ph 6,8) indeholdende 1% gærekstrakt, 2% pepton og 2% glucose. Dyrkningen 7 fortsattes, indtil eksponentialfasen (3-5 · 10 celler pr. ml) var nået.

25 Gærcellerne samledes ved centrifugering, vaskedes med vand og resuspenderedes i en opløsning (pH 8,0) indeholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM EDTA og 0,2 M frisk mer-captoethanol.

Efter inkubation i 10 minutter ved 30°C fracen-30 trifugeredes cellerne, vaskedes to gange med en 1,2 M sorbitolopløsning og resuspenderedes i 20 ml af en opløsning (pH 5,8) indeholdende 1,2 M sorbitol, 10 mM EDTA, 0,1 M natriumcitrat og 10 mg helicase.

Protoplaster dannedes, og efter 15-20 minutters 35 forløb fracentrifugeredes disse, vaskedes tre gange med 1,2 M sorbitol og resuspenderedes til en koncentration på ca. 5 · 10^ celler pr. ml i 0,1 ml af en opløsning indeholdende 10 mM CaC^ og 1,2 M sorbitol.

DK 173699 B1 20 10 ug pTY75-LAC4 tilsattes, og blandingen inkuberedes i 15 minutter ved 25°C. Derefter tilsattes 0,5 til af en opløsning (pH 7,5) indeholdende 10 mM Tris, 10 m^

CaCl2 og 20% (vægt/volumen) polyethylen-glycol 4.000, 5 hvorefter der fulgte 20 minutters inkubation.

Protoplasterne udfældedes ved centrifugering og resuspenderedes derpå til en koncentration på omkring 1 0 5 · 10 protoplaster pr. ml i en opløsning (pH 6,8) indeholdende 7 mM CaCl2, 1,2 M sorbitol, 0,5 mg/ml gær-10 ekstrakt, 1 mg/ral pepton og 2 mg/ml glucose.

Efter inkubation i 60 minutter ved 30°C fracentrifugeredes protoplasterne, vaskedes med 0,6 M KCl-o^-løsning og resuspenderedes i 0,6 M KCl-opløsning.

For at blive i stand til at udvælge de G418-reii- g 15 stente transforraanter udspredtes 1 ‘10 protoplaster i et overliggende lag af 3%'s agar på plader af 2% mini:nal agar indeholdende 2% glucose, 1,2 M sorbitol og 0,2 mg/ml af antibiotiket G418. Med henblik på samtidig udvælgel-

I O

se af Lac -transformanter, spredtes 5 · 10 protoplaster 20 i et overliggende 3%'s agarlag på plader af 2%'s minimal agar, DIFCO gær-nitrogen-grundsubstrat, indeholdende 2% lactose som eneste carbonkilde og 0,6 M KC1 i stedet ::or 1,2 M sorbitol.

Kolonier viste sig i løbet af 4 - 5 dage. På nor- 25 bitolplader uden G418 var protoplast-regenerering sædvanligvis 0,2 - 0,5%, medens procentmængden på plader med 0,6 M KC1. og glucose som carbonkilde steg til 0,5 -1,5%.

Når G418 anvendtes til selektion, opnåedes en 30 transformant pr. 107 regenererede protoplaster. Ved uam-tidig selektion på lactoseplader opnåedes 10 transfor·- 7 manter pr. 10 regenererede protoplaster eller 20 transformanter pr. microgram plasmid DNA.

Tilstedeværelsen af PTY75-LA.C4 i gærcellerne kun- 35 ne påvises ved hjælp af Southern's hybridiseringsmetode 32 med P-mærket pCRl.

DNA-præparater fremstilledes i overensstemmelse DK 173699 B1 21 med Struhl et al- (Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979) side 1035-1039).

Eksempel 5 5 Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1 transformeret til Trp+ med plasmidet pKARS 12.

Celler af stammen K. lactis SD11 lac4 trp1 transformeredes som beskrevet i eksempel 4 med 10 PKARS12 DNA. Transformanter udvalgtes på plader med 2% 10 minimal agar indeholdende 2% glucose og 0/6 M KC1. Pr. microgram pKARS12-DNA opnåedes 3,4 x 104 Trp+-transfor-manter.

Eksempel 6 15 Kluyveromyces lactis SD69 lac4 transformeret til Lac+ med plasmidet pL4.

K. lactis-stammen SD69 lac4 transformeredes med plasmidet pL4 under anvendelse af den samme metode, som er beskrevet for PTY75-LAC4 i eksempel 4. Transforman-20 terne selekteredes på plader af gær-nitrogen-grundsubstrat (DIFCO) indeholdende 2% lactose. Transformationsfrekvensen var 20 transformanter pr. microgram plasmid-DNA

25 Eksempler 7 - 13

Kluyveromyces lactis SD69 lac4 transformeret til Trp+ med plasmider af KARS-typen.

Analogt med den i eksempel 5 beskrevne fremgangsmåde udførtes transformationsforsøg med andre plasmider 30 af KARS-typen. Resultaterne af forsøgene er opført i den efterfølgende tabel.

DK 173699 B1 22

Tabel

Eks. Starnne Genotype Plasmid Transforrranter Størrelse pr. microgram af KARS-DNA fragment#] · 5 (kb) 4. SD69 lac4 PTY75-LAC4 20 7. SD11 lac4 trpl pKARSl 1.5xl03 2..24 8. SD11 lac4 trpl pKARS2 5xl03 1-74 10 9. SD11 lac4 trpl pKARS7 103 2.: 10. : SD11 lac4 trpl pKARS8 5xl03 l.t'5 11. SD11 lac4 trpl pKARSlO 2.4xl04 3.] 5 5. SD11 lac4 trpl pKARS12 3.4xl04 5.0 12. SD11 lac4 trpl pKARS13 1.5xl04 2.0 15 13. SD11 lac4 trpl pKARS14 1.8xl04_2..^

Molekylvægtene af pKARS-plasmider bestemtes eft<:r digestering med endonucleaserne Eco RI og Hind III/ under anvendelse af 0,8% agarosegel og de sædvanlige mol;— 2 0 ky1vægtsmarker inger.

Eksempel 14

Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trpl transformeret til Trp+ med plasmider indeholdende KARS-2-sekvensen under 25 anvendelse af en. transformations-procedure med hele cel-ler.

Plasmid pEK2-7 anvendtes til transformering af :c. lactis SD 11. Dette plasmid består af det velkendte plasmid YRp7, hvori et 1,2 kb fragment indeholdende de i 30 fra KARS-2 hidrørende autonomt replikerende sekvens er blevet klonet (fig. 2). K. lactis SD11 dyrkedes natten over ved 30°C i 1% gærekstrakt, 2% pepton og 2% glucose (pH 5,3) . Cellerne høstedes ved en ODg-jo nra 4-8 ved hjælp af centrifugering ved 1000x g i fem minutter. Cel-35 lerne vaskedes med TE-puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDT\, pH 8,0), og den opnåede pellet resuspenderedes i TE-pu. E- DK 173699 B1 23

Q

fer til en koncentration på 2 x 10 celler pr. ml. Denne suspension fortyndedes med ét rumfang 0,2 M LiCl og omry stedes ved 30 °C i 60 minutter.

Plasmid pEK2-7-DNA (10 ug) sattes til 0,1 ml Li-5 behandlede celler, og inkubationen fortsattes ved 30°C i 30 minutter. Der tilsattes ét rumfang 70%'s polyethylen-glycol 7000, og blandingen inkuberedes i yderligere 60 minutter ved 30°C. Blandingen underkastedes varmebehandling ved 42°C i 5 minutter, og cellerne vaskedes med 10 sterilt, demineraliseret vand. Cellerne udbredtes på plader af minimal agar indeholdende 2% glucose og 0,67% gær-nitrogen-grundsubstrat.

Der iagttoges transformanter efter 36-48 timer ved 30°C.

15

Eksempel 15

Kluyveromyces fragilis transformeret med plasmider indeholdende KARS-2-sekvensen.

Der anvendtes to typer af plasmider til transfor-20 mering af K. fragilis. Det første plasmid pGB 180 konstrueredes ved at klone 3,5 kb Bg1 Il-fragmentet fra plasmid pEK2-7 (fig. 2), indeholdende den autonomt repli-kerende KARS-2-sekvens fra K. lactis og TRP1-genet fra S. cerevisiae,i Barn H1-positionen i pJDB 207 (J. D.

25 Beggs, Alfred Benzon Symposium 16 (1981) 383). Ca. 36 K. fragilis leu-mutanter, opnået efter UV-behandling af K. fragilis, transformeredes med pGB ved hjælp af Li+-metoden som beskrevet i eksempel 14. Én mutant, K. fragilis leu 24, transformeredes til Leu+ med en frekvens 30 på ca. 10 transformanter pr. ug plasmid-DNA.

Det andet plasmid, pGL2, konstrueredes ved at klone 3,5 kb Bg1 Il-fragmentet fra pEK2-7 på den ovenfor beskrevne måde i Bam Hl-positionen i det velkendte plasmid PACYC177, der indeholder transposonen Tn601 , som medfø-35 rer resistens mod kanamycin og gentamycinderivatet G418.

K. fragilis-stammen C21 transformeredes med plasmid pGL2 ved hjælp af Li+-metoden som beskrevet i eksempel 14. De transformerede celler udspredtes på YNPD- DK 173699 B1 24 agarpladen indeholdende 50 μg G418 pr. ral. Transform,inter detekteredes efter inkubation ved 30°C i 48 timer, medens spontant resistente mutanter først detekteredes efter 6 dage. DNA udvalgtes fra K„ fragilis-transfor-5 manter og transformeredes til egnede E. coli DG 75-cel-ler. DNA udvundet fra kanamycinresistente E. coli-cel-ler viste tilstedeværelse af plasmid pGL2.

Disse forsøg viser, at K. fragilis-stammer kan transformeres med plasmider indeholdende KARS-sekvenser, 10 og at disse plasmider er autonomt replikerende i K. fragilis .

Eksempel 16

Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1, som eksprimerer 15 preprochymosin og dets forskellige modningsformer efter at være transformeret med plasmider indeholdende KARS-2-sekvensen, strukturgenerne, som koder for preprochymosin og dets forskellige modningsformer, og forskellige prc-motorer, der dirigerer syntesen af disse strukturgene:! .

20 Dette eksempel omfatter et antal trin, af hvilke de væsentligste er følgende: 1 2

Tilføjelse af Sal I-linkere foran de klonede strukturgener, som koder for preprochymosin, pio- 25 chymosin, pseudochymosin og chymosin.

2

Indførelse af et DNA-fragment i plasmider, som opnået ovenfor, indeholdende den autonomt repl:.-kerende KARS-2 sekvens fra K. lactis og TRP1-gi·-net fra s. cerevisiae.

30 3. Indførelse i ovenfor opnåede plasmider af for- dé forskellige modningsformer af preprochymosir . Udgangsmaterialer for ekspressionen af bovint preprochymosin og dets forskellige modningsformer i K, lactis var følgende klonede strukturgener: 35 - methionyl-pseudochymosin, beskrevet som pUR 1531 methionyl-chymosin , beskrevet som pUR 1522 - methionyl-prochymosin , beskrevet som pUR 1523 - methiony1-preprochymosin, beskrevet som pUR 1524.

DK 173699 B1 25

Konstruktionen og strukturen af disse plasmider er blevet beskrevet i enkeltheder i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 82201272.0, offentliggjort den 20. april 1983 under nr. 0077109. Generne isolere-5 des, og disse plasmider konstrueredes i overensstemmelse med den nævnte beskrivelse.

A. Indførelse af Sal I-linkere i plasmiderne pUR 1531, pUR 1522, pUR1523 og pUR 1524 (fig. 1).

10 Plasmiderne pUR 1531, pUR 1522, pUR 1523 og pUR 1524 indeholder en Eco R1 restriktionsposition lige foran ATG-initiationscodonen. Eftersom der findes en yderligere Eco R1 position i chymosingenet, tilsigtedes det at indføre et Sal I-linkermolekyle lige foran den 15 første Eco R1 position for at lette indføringen af forskellige promotorsekvenser, som dirigerer ekspressionen af de distale strukturgener.

Ca 50 ug DNA inkuberedes med 50 enheder endonuclease Eco R1 i nærværelse af 125 ug/ml ethidiumbromid i 10 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 6 mM 8-mercaptoethanol, 10 mM MgCl2 og 100 ug/ml bovint serumalbumin, pH 7,5, ved 37°C i 60 minutter. Under disse betingelser omdannedes plasmid DNA i overvejende grad til lineære og åbent cirkulære molekyler. DNA'et ekstraheredes med et rumfang phe-25 nol og et rumfang chloroform og fældedes med et rumfang propanol-2.

DNA1et opløstes i TE-puffer og digesteredes fuldstændigt med endonuclease Sal I. Et DNA-fragment på ca.

1800 bp isoleredes fra agarosegel ved elektroeluering.

30 Fragmenterne ekstraheredes med phenol og chloro form og udfældedes med propanol-2. Precipitaterne opløstes i TE-puffer.

De kohæsive ender udfyldtes ved hjælp af DNA-po-lymerase på følgende måde: 35 Til 15 μΐ indeholdende DNA-fragmentet på 1800 bp (ca. 1-2 ug) sattes 1 μΐ af en 2 mM opløsning af dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 6,5 μ.1 4x nick-puffer indeholdende 0,2 M Tris-HCl (ph 7,2), 40 mM MgSO^, 4 mM dithiothrei- DK 173699 B1 26 tol og 200 mg/ml bovint serumalbumin og 2,5 μΐ vand. Der tilsattes to enheder DNA-polymerase (Klenow-fragment), og blandingen inkuberedes ved 20°C i 30 minutter. Derj:å inaktiveredes DNA-polymerase ved opvarmning til 70°C i 5 5 minutter.

Til denne blanding sattes en phosphpryleret Sal I-linker (fremstillet som beskrevet af Maniatis et al, 3

Molecular Cloning, CSH), sammen med T4 DNA-ligase (10 enheder).

10 Efter inkubation ved 22eC i 4 timer inkuberedes blandingen ved 4°C i yderligere 16 timer. Derpå inkuberedes blandingen med endonucleaserne Sal I og Hind III og et DNA-fragment på ca. 1500 bp udvandtes fra en aga-rosegel ved elektroeluering.

15 Fragmenterne (A, B, C, D) rensedes ved ekstrak tion med phenol og chloroform og udfældedes med propa-nol-2. Disse fragmenter ligeredes til et 3,3 kb Hind III-Sal I/fragment (ca. 0,5 tg), hidrørende fra plasmid pPA153-209, indeholdende en temperaturfølsom replicon og 20 et ampicillinresistent gen (der koder for (3-lactamase) , og de udvandfces i renset tilstand fra agarosegel ved elektroeluering.

De ligerede molekyler transformeredes til E. coLi HB 101, og ampicillinresistente, tetracyclinfølsomme 25 kloner dyrkedes, og plasmid-DNA udvandtes. Digesterinj af plasmid-DNA med endonucleaserne Sal I, Eco R1 og Hind III bekræftede, at plasmiderne pGB'l 31 , pGBl22, pGB123 og pGB124 (fig. 1) var blevet opnået.

30 B. Indførelse af et KARS2- og TRPI-gen i henholdsvis plasmid pGB131, pGBl22, pGB123 og pGBl24.

Autonomt replikerende sekvenser, hidrørende fra og replikerende i Kluyveromyces, opnåedes som beskrevet i eksemplerne 2 og 7 - 15. Den autonomt replikerende se-35 kvens i plasmidet pKARS-2 er lokaliseret på et 1,24 kl: fragment, og dette fragment klones i det velkendte plas-mid YRp7, og der opnåedes et nyt plasmid pEK2-7 (fig.

2). Digestion af pEK2-7 med endonuclease Cla I resultere- DK 173699 B1 27 de i fragmenter med henholdsvis 3,5 og 5,5 kb. 3,5 kb fragmentet, som indeholder det fra S. cerevisiae hidrørende TRP1-gen og den fra K. lactis hidrørende KARS-2-sekvens (fig. 2), isoleredes fra en agarosegel ved hjælp 5 af elektroeluering og ligeredes til de CIA I-digesterede plasmider henholdsvis pGB131, pGB122, pGB123 og pGB124. Den resulterende blanding transformeredes til E. coli JA300 (trpC), og karakterisering af plasmid-DNA udvundet fra Trp+-transformanter bekræftede konstruktio-10 nen af henholdsvis plasmid pGB151, pGB152, pGBl53 og pGB154 (fig. 2).

C. Indførelse af forskellige promotorsekvenser i plas-miderne, som dirigerer syntesen af de forskellige 15 modningsformer af preprochymosin.

De Sal I-digesterede plasmider, som indeholder KARS-2-sekvensen, TRP1-genet og strukturgenet for preprochymosin eller dets forskellige modningsformer, er velegnede til optagelse af Sal I-tilknyttede promotorse-20 kvenser til dirigering af det distale strukturgens syntese i K.lactis-transformanter.

I de fleste tilfælde må disse promotorsekvenser forsynes med Sal I-linkere. Enhver promotorsekvens kan forsynes med en sådan Sal I-linker, og i de efterfølgen-25 de eksempler belyses dette ved hjælp af 1. isocytochrom c1-promotoren fra S. cerevisiae, og 2. lactase-promotoren fra K. lactis.

C1. Tilføjelse af Sal I-linkere til isocytochrom c1-30 promotoren fra S. cerevisiae og indførelse i plas mider (fig. 3).

Plasmid pYeCYCI, bestående af isocytochrom elgenet klonet i plasmid pBR322, anvendtes som udgangsmateriale (G. Faye et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 35 (1981), side 2258).

Fra nucleotidsekvensdata vides det, at en Eco RI-position forekommer i isocytochrom C1-genet ved nucleo-tid +8 (Ibid.).

DK 173699 B1 28

Plasmid pYeCYCI spaltedes med endonuclease Eco 2.1, ligeredes med T4 DNA-ligase og transformeredes til E. coli HB101, hvorved der opnåedes et plasmid pC15 indeholdende fragmentet med 1 930 bp, som bærer promotoren 5 og 8 nucleotider af isocytochrom c 1-genet.

Plasmid pd5 spaltedes med endonuclease Eco RI og inkuberedes med nuclease Bal 31 i kort tid til fjernelse af blot nogle få nucleotider.

De Bal 31 digesterede ender omdannedes til stumpe 10 ender med DNA-polymerase (Klenow-fragment) og en phospho-ryleret Eco RI-linker ligeredes to dette DNA. Efter in-kubering med endonuclease Eco R1, ligering og transformering til E. coli identificeredes en transformant pC15~ R12, hvori 12 nucleotider fra cytochrom c1-genet var 15 blevet fjernet. En Sal I-linker indførtes ved spaltning af plasmidet pd5-R12 med endonuclease Eco RI, udfyldning i de kohæsive ender med DNA-polymerase, ligering af en phosphoryleret Sal I-linker, inkubering med endonuclease Sal I og rekloning af det opnåede, 1070 bp store 20 fragment i de med Sal I digesterede plasmider henholdsvis pGB151, pGB152, pGB153 og pGB154, hvorved der opnåedes de isocytochrom d-promotoren indeholdende plasmider henholdsvis pGBl61, pGB162, pGB163 og pGBl64, der blev identificeret ved koloni-hybridisering med det 32 25 med p-mærkede, 1070 bp store fragment som undersøgelsesmiddel. Plasmid DNA fremstilledes ud fra de positive kloner, og den korrekte orientering af isocytochrom cl-promotoren bekræftedes ved tilstedeværelse af et 850 bp stort fragment efter digestering med endonuclease Sma I.

30 C2. Tilføjelse af Sal I-linkere til lactase-promotoren fra Kluyvaromyces lactis og indførelse i plasmider.

Udgangsmaterialet var plasmid pKl6, indeholdende lactasegenet fra K. lactis klonet i Eco Ri-positionen i 35 plasmid pBR322 (R.C. Dickson og J.S. Markin, Cell 15 (1978) , side 123).

Ved sekvenering af store dele af lactase-struk - DK 173699 B1 29 turgenet og dets promotor fastsloges tilstedeværelsen af en Cla I-position ved ca. 450 bp i lactase-strukturge- net.

Plasmid pK16 digesteredes med endonuclease Cla I, 5 og fragmentet indeholdende promotoren og ca. 450 bp af strukturgenet reklonedes i plasmid pBR322, digesteredes med endonucleaserne Cla I og Acc I (partielt). I et af plasmiderne, pGB182, blev den bibeholdte Cla I-position ved ca. 450 bp i lactase-strukturgenet åbnet ved inkuba-10 tion med endonuclease Cla I og trimmet ved inkubation med nuclease Bal 31. Bal 31-enderne gjordes stumpe ved inkubation med DNA-polymerase, og en phosphoryleret Eco RI-linker ligeredes to dette trimmede fragment.

Ved digestering med endonuclease Eco RI og re-15 kloning af det trimmede fragment opnåedes plasmid pGB 183, som havde bibeholdt lactase-promotoren, men manglede strukturgenet.

Sal i-linkere sattes til dette fragment som beskrevet i det foregående eksempel (16.C2). Den med Sal 20 I-linker forsynede lactase-promotor ligeredes til de med Sal I spaltede plasmider henholdsvis pGB 151, PGB152, pGBl53 og pGB154, hvorved der opnåedes plasmiderne henholdsvis pGBl71, pGB172, pGB173 og pGBl74.

De i dette eksempel 16 opnåede plasmider indfør-25 tes i Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1 ved Li -metoden som beskrevet i eksempel 14, idet der foretoges selektion for Trp+-transformanter.

Tilstedeværelsen af preprochymosin eller dets modningsformer i Kluyveromyces-ekstrakter påvistes ved 30 immunologisk ELISA-teknik og ved pletvis afsætning af portioner af ekstrakterne på nitrocellulose-filterpapir og analyse af filtrene som beskrevet af D. J. Kemp og A.

F. Cowman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) , side 4520-4524).

35 Celleekstrakter fremstilledes som følger: K. lac- tis-transformanter dyrkedes ved 30°C i omkring 16-24 timer i YNB-substrat indeholdende 2% dextrose.

DK 173699 B1 30

Celler høstedes ved ODg^nm i området fra 2,2 - 6,0 ved centrifugering ved 6000 pni i 10 minutter i en Sorvall G-S3 rotor. Den opnåede pellet resuspenderede:; i sterilt destilleret vand til en OD^qq på 600 og afkø -5 ledes på is.

0,5 ml af denne cellesuspension fortyndedes med 0,5 ml iskoldt vand og blandedes med 2 g Ballotini-per-ler (diameter 0,25 - 0,35 mm, Braun-Melsungen GMBH, Vesttyskland).

10 Cellerne blev itubrudt ved omrystning med maksi mal hastighed i 4 minutter på et Vortex-rysteapparat.

Ved fasekontrastmikroskopi konstateredes, at mere end 95% af cellerne var itubrudt. Cellerester fjernedes ved centrifugering i 1 minut i en Eppendorf-centrifuge.

15 Delmængder af ekstrakterne blev frosset i flydende nitrogen og oplagret ved -80°C.

1 - 5 μΐ delmængder af celleekstrakterne afsatles pletvist på nitrocellulose-membranfiltre. Filtrene tørredes, befugtedes med 192 mM glycin, 25 mM Tris, 20% 20 ethanol (pH 8,3) og inkuberedes i 60 minutter ved 22°C.

Derefter inkuberedes filtrene med preincubatiors-puffer (0,35 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2% bov:lnt serumalbumin) i 30 minutter. Filtrene vaskedes tre gange i 5 minutter med RlA-puffer (0,125 M NaCl, 10 mM 25 Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM PMSF, 1% Triton X100, 0,5% va tr ium-desoxycholat, 0,1% natrium-dodecylsulfat og 0,3« gelatine). Filtrene inkuberedes natten over ved 4°C i 1 ml RIA-puffer indeholdende 10 μΐ chymosin-antiserum<

Antiserum fjernedes ved vaskning med RIA-puffer (tre 125 30 gange) og inkuberedes med 1 nCi Ι-protein A i 1 ml RIA-puffer i 60 minutter ved 22 °C.

125 I-protein A fjernedes ved vaskning med RIA-puffer (5 gange).

Filtrene tørredes og autoradiograferedes natte i 35 over. Tilstedeværelsen af preprochymosin eller dets modningsformer i K. lactis-transformanter blev klart iagttaget.

DK 173699 B1 31

Tilstedeværelsen af chymosin-aktivitet i celleekstrakter fra K. lactis-transformanter bestemtes ved højtryks-væskekromatografi {HPLC) som beskrevet af A.C.

M. Hooydonk og C. Olieman, Netherl. Milk Dairy 36 5 (1982), side 153.

50 μΐ enzymopløsning eller ekstrakt sattes til 1 ml af en 10%’s opløsning af mælkepulver (Difco) i 10 mM CaCl2. Opløsningen inkuberedes i 15 minutter ved 31 °C. Reaktionen standsedes ved tilsætning af 2 ml 10 12%'s trichloreddikesyre (TCA). Næsten alle proteiner udfældes med TCA med undtagelse af glycomacropeptid (GMP), som er blevet spaltet fra k-casein ved chymosin-indvirkning.

Denaturerede proteiner pelleteredes ved centrifu-15 gering, og 1 ml af den klare supernatant neutraliseredes med 0,4 ml 1N NaOH.

Opløsningen centrifugeredes påny, og den dannede mængde GMP detekteredes ved hjælp af HPLC med overvågning af ekstinktionen ved 214 nm.

20 Ekstrakter fra K. lactis-transformanter indehol dende prochymosin inkuberedes først ved pH 2 i to timer og neutraliseredes derpå før udførelse af chymosinakti-vitetstesten. Chymosin fandtes først efter behandlingen ved pH 2.

25

Eksempel 17

Kluyveromyces SD11 lac4 trp1, som eksprimerer prepro-thaumatin og dets forskellige modningsformer efter at være transformeret med plasmid pURK 528-01, der indehol-30 der det for preprothaumatin kodende strukturgen, KARS2-sekvensen fra K. lactis, glyoeraldehyd-3-phosphat-dehy-drogenase-promotoren fra S. cerevisiae og TRP1-genet fra S. cerevisiae.

35 Dette eksempel omfatter et antal trin, hvoraf de væsentligste er følgende: 1. Isolering af kloner indeholdende glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-operonen i S-ceri-visiae.

DK 173699 B1 32

En pulje af DNA fra gæren S. cerevisiae fremstilledes i det hybride E. coli-gær-plasmid ρΠ (M. R.

Chevallier et al., Gene 11 (1980), side 11-19) ved en fremgangsmåde som den der beskrives af M. Carlson og 5 Botstein, Cell 28, (1982), side 145-154. Renset gær-DNA digesteredes partielt med restriktions-endonuclease S*.u 3A, og de opnåede DNA-fragmenter (med en gennemsnitslængde på 5 kb) ligeredes ved hjælp af T4 DNA-ligase den dephosphorylerede Barn Hi-position i pF1 1. Efter 10 transformation af CaCl2-behandlede E. coliceller med det ligerede materiale opnåedes der en pulje på ca. 30.000 ampicillinresistente kloner. Disse kloner screenedes ved hjælp af en koloni-hybridiseringsmetode [R.E. Thayer,

Anal. Biochem., 98 (1979), side 60-63) med en kemisk 32 15 syntetiseret og P-mærket oligomer med sekvensen 5'TACCAGGAGACCAACTT3'.

Ifølge data, der er offentliggjort af J. P. HoL-land (J. Biol. Chem., 255 (1980), side 2596-2605) er denne oligomer komplementær med den DNA-sekvens i GAP IH-20 genet, som koder for aminosyrerne 306-310 (den sidste aminosyres "wobble base" blev udeladt fra oligomeren).

Ved anvendelse af de af R. B. Wallace et al., Nucleic Acid Res., 9 (1981), side 879-894, beskrevne hybridis 3- ringsbetingelser kunne der identificeres seks positive 25 transformanter. En af disse indeholdt plasmid pF1 1-33. Sidstnævnte plasmid indeholdt GAPDH-genet med dets pro-motor/regulerings-region og dets transcriptions-termine-ring/polyadenylerings-region. Den ca. 9 kb lange indsatsdel i pF1 1-33 er blevet karakteriseret ved restrik-30 tionsenzym-analyser (fig. 4) og partiel nucleotidse-kvensanalyse (fig. 5 og 6).

2. Isolering af GAPDH-promotor/reguleringsregionen cg dens indførelse i et for preprothaumatin kodende 35 plasmid.

På grundlag af restriktionsenzym-analysen og nucleotidsekvens-dataene for indsatsdelen i plasmid yF1 DK 173699 B1 33 1-33 isoleredes DNA-initierings/reguleringsregionen i GAPDH-genet som et 800 micleotider langt Dde I-fragment.

Til identifikation af dette promotorfragment digestere-des plasmid pF1 1-33 med Sal I, og de tre opnåede DNA-5 fragmenter underkastedes Southern's filterpapir-hybridi-seringstest med den kemisk synthetiserede oligomer (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), side 503-517)).

Et positivt hybridiserende, 4,3 kb langt restriktionsfragment isoleredes i præparativ skala ved elektro-10 eluering fra en 0,7%'s agarosegel og spaltedes derpå med Dde I. Af de dannede Dde I-fragmenter havde kun det største fragment en genkendelsesposition for Pvu II, en spaltningsposition beliggende indenfor GADPH-regulon-regionen (fig. 1). Det største Dde I-fragment isolere-15 des og inkuberedes med Klenow DNA-polymerase og fire dNTP'er (A. R. Davis et al., Gene 10 (1980), side 205 -218)) til frembringelse af et DNA-xnolekyle med stumpe ender. Efter ekstraktion af reaktionsblandingen med phenol/chloroform (50/50 vol/vol), passage af det vandi-20 ge lag gennem en Sephadex G50-søjle og ethanolfældning af det i porerumfanget tilstedeværende materiale, blev 32 DNA-fragmentet forsynet med den med P-mærkede Eco RI-linker 5'GGAATTCC3' ved inkubation med T4 DNA-ligase.

På grund af Klenow polymerase-reaktionen og den efterføl-25 gende ligering af Eco Rl-linkeren rekonstrueredes de oprindelige Dde l-positioner ved enden af regulon-fragmen-tet. Til inaktivering af ligasen opvarmedes reaktionsblandingen til 65°C i 10 minutter, hvorpå natriumchlorid tilsattes (slutkoncentration 50 mmol/1), og hele blan-30 dingen inkuberedes med Eco RI. Inkuberingen afsluttedes ved ekstraktion med phenol/chloroform, og DNA'et fældedes to gange med ethanol og resuspenderedes, hvorpå det ligeredes i et passende vektor-molekyle. Eftersom Dde I-regulon-fragmentet var forsynet med Eco RI-positioner, 35 kan det let indføres i Eco Ri-positionen i pUR 528 (EP-PA 54331) til dannelse af et plasmid, hvori gær-regulo-nen grænser op til strukturgenet, som koder for prepro-thaumatin. Sidstnævnte plasmid opnåedes ved spaltning DK 173699 B1 34 af pUR 528 med Eco RI, behandling af det lineariserede plasmidmolekyle med (kalvetarms-)phosphatase med henblik på forhindring af selv-ligering, og inkubering af hver af disse vektor-molekyler såvel som det rensede Dde I-5 promotorfragment med T4 DNA-ligase, Transformation af de forskellige ligeringsblandinger i CaC^-behandlede E. coli HB101-celler gav flere ampicillinresistente kolonier. Fra nogle af disse kolonier isoleredes plasmiΙΩΝΑ (H. C. Birnboim og J. Doly, Nucleic Acids Res. 7 10 (1979), side 1513-1523)) og inkuberedes med PvuII til undersøgelse af orienteringen af indsatsdelen.

I nomenklaturen angives plasmider indeholdende Eco RI (Dde I)-GAPDH-regulonfragmentet i den korrekte orientering (dvs. at transkription fra GAPDH-regulonei: 15 sker i retning af et efter denne beliggende strukturgen) ved tilføjelsen -01 til den oprindelige kode for plasni-det (eksempelvis ændres pUR 528 til pUR 528-01 , se fic .

7) .

For at lette manipuleringen af plasmider indeho1-20 dende Eco RI regulon-fragmentet blev en af de to Eco t.I-positioner ødelagt. To pg plasmid-DNA (f.eks. pUR 5! 8-01) digesteredes partielt med Eco RI og inkuberedes derpå med fem enheder Mungbønne-nuclease (opnået fra P. I.. Biochemicals Inc.) i et totalt rumfang på 200 μΐ i næ::-25 værelse af 0,05 mol/1 natriumacetat (pH 5,0), 0,05 mol/1 natriumchlorid og 0,001 mol/1 zinkchlorid i 30 minutt sr ved stuetemperatur til fjernelse af klæbrige ender.

Nucleasen inaktiveredes ved tilsætning af SDS til en slutkoncentration på 0,1% (D. Kowalski et al., Biocheni-30 stry 15 (1976), side 4457-4463), og DNA'et fældedes ved tilsætning af 2 rumfang ethanol (i dette tilfælde udelodes tilsætningen af 0,1 rumfang af 3 mol/1 NaAc). Derpå ligeredes lineariserede DNA-molekyler påny ved inkubation med T4 DNA-ligase og anvendtes til transformering af 35 CaCl2~behandlede E. coli-celler. Plasmid-DNA isolere·; fra ampicillinresistente kolonier testedes ved spaltn,ng med Eco RI og Mlu I for tilstedeva^relse af en enkelt Eco DK 173699 B1 35

Ri-position grænsende op til thaumatin-genet (jvf. fig.

7) .

Plasmider, som indeholder GAPDH promotor-fragmentet, men kun har en enkelt Eco RI genkendelsesposition, 5 der grænser op til ATG-initieringskodonen for et derefter beliggende strukturgen, betegnes som plasmider af -02-typen (som eksempel nævnes, at pUR 528-01 ændres til pUR 528-01, se fig. 7).

10 3. Rekonstitution af den oprindelige GAPDH promotor/ reguleringsregion i plasmider, som koder for prepro-thaumatin, ved indføring af et syntetisk DNA-fragment (fig. 8).

Som vist ved den i fig. 5 afbildede nucleotid-15 sekvens indeholder Eco RI (Dde I)-GAPDH-promotorfragmen-tet nucleotiderne -850 til -39 i den oprindelige GAPDH-promotor/reguleringsregion. Ikke indeholdt i dette promotor fragment er de 38 nucleotider, som ligger forud for ATG-initieringskodonen for det for GAPDH kodende gen.

20 Det nævnte, 38-nucleotider lange fragment indeholder PuCACACA-sekvensen, der findes i adskillige gærgener.

Nævnte PuCACACA-sekvens, der er beliggende ca. 20 bp før positionen for start af translationen (M. J. Dobson et al., Nucleic Acid Res., 10 (1982), side 2625-2637), til-25 vejebringer den nucleotidsekvens før ATG-kodonen, som er optimal for protein-initiering (M. Kozak, Nucleic Acids Res. 9 (1981), side 5233-5252). Desuden muliggør disse nucleotider dannelsen af en lille løkke-struktur, som kan være involveret i reguleringen af ekspressionen 30 af GAPDH-genet.

På grundlag af ovennævnte argumenter ansås indførelse af de 38 nucleotider imellem Dde I promotor-fragmentet og ATG-kodonen for et derefter beliggende strukturgen for nødvendig til forbedring af promotor-aktivi-35 tet såvel som translations-initiering.

Som skematisk vist i fig. 9 opnåedes det manglende DNA-fragment ved kemisk syntese af to partielt overlappende oligomere. Den i den overlappende del af de to DK 1711699 B1 36 oligonucleotider forekommende Sac i-position indførtes af to grunde: (i) for at muliggøre manipulation af nuc- leotidsekvensen umiddelbart før ATG-.kodonen, herunder konstruktionen af med poly A-hale forsynede gær-ekspres -5 sionsvektorer, og (ii) med henblik på at tilvejebringe en spaltningsposition for et enzym, der frembringer 31 · udragende ender, som let og reproducerbart kan fjernes ved inkubation med T4 DNA-polymerase i nærværelse af de fire dNTP'er. Ækvimolære mængder af de to rensede oli-10 gomere phosphoryleredes ved deres 5'-ender, hybridisere-des (J.J. Rossi et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), side 9226-9229) og omdannedes til et dobbeltstrenget DNA-mo-lekyle ved inkubation med Klenow DNA-polymerase og de fire dNTP’er under betingelser, som er blevet beskrevet 15 for syntese af dobbeltstrenget DNA (A. R. Davis et al..

Gene 10 (1980), side 205-218). Analyser af reaktionsprodukterne ved elektroforese gennem en 13%'s acrylamidgei efterfulgt af autoradiografi viste, at mere end 80% af de som udgangsmateriale anvendte enkeltstrengede oligo-20 nucleotider var blevet omdannet til dobbeltstrenget materiale. DNA'et isoleredes ved at lade reaktionsblandingen passere en Sephadex G50-søjle og ved ethanolfælc-ning af det i porerumfanget tilstedeværende materiale.

Derpå phosphoryleredes DNA1et ved inkubation med poly-25 nucleotid-kinase og digesteredes jfléd Dde X. Til fjernelse af de i sidstnævnte reaktion fraspaltede nucleotide:: underkastedes reaktionsblandingen to fældninger med et)· a-nol.

Som vist i fig. 8 udførtes kloning af det dannede 30 syntetiske DNA-fragment ved samtidig ligering af dette fragment og et Bglll-Ddel GAPDH-promotorreguleringsfrag-ment i et vektormolekyle, hvorfra den foran ATG-initie-ringskodon liggende Eco Ri-positionen fjernedes ved die e-stion med Mungbønne-nuclease (jvf. E.). Bg1II-Ddel-pro-35 motor/reguleringsfragmentet opnåedes ved digestion af plasmidet pUR 528-02 med Ddel og Bglll. Ved adskillelse af de opnåede restriktionsfragmenter ved elektroforese gennem en 2%'s agarosegel og efterfølgende isolering af DK 173699 B1 37 fragmentet fra gelen opnåedes det rensede, 793 nucleoti-der lange promotor/reguleringsfragment. I plasmidet pUR 528-02 er den forud for ATG-kodonen beliggende nucleotid-sekvens 5'-GAATTC(T)ATG-3' (EP-PA 54330 og EP-PA 54331), 5 som er forskellig fra den gunstige nucleotidsekvens, der er angivet af M. Kozak (Nucleic Acids Res. 9 (1981), side 5233-5252). Eftersom formålet i det foreliggende tilfælde var at rekonstituere den oprindelige GAPDH promotor /regulerings/proteininitierings-region så nøjagtigt 10 som muligt, fjernedes Eco Ri-positionen med henblik på at ligere det syntetiske DNA-fragment til den opnåede stumpe ende. Fjernelse af Eco Ri-positionen opnåedes ved digestion af Eco Ri-spaltet pUR 528-02 DNA med Mung-bønne-nuclease.

15 Derefter digesteredes plasmid-DNA'et med Bglll og inkuberedes med phosphatase. Efter adskillelse af de to DNA-fragmenter ved elektroforese gennem en 0,7%'s aga-rosegel isoleredes det største fragment og anvendtes som vektor, hvori Bglll-Ddel promotor-fragmentet såvel som 20 det -Ddel-behandlede syntetiske DNA-fragment ligeredes.

Plasmider, hvori Ddel promotor/reguleringsfragmentet er indført sammen med det Sac I-genkendelsesposi-tion indeholdende syntetiske DNA-fragment angives ved tilføjelsen -03 (eksempelvis nævnes, at pUR 528-02 æn-25 dres til pUR 528-03).

4. Indførelse af KARS2-repliconen fra K. lactis og TRP1-genet fra S. cerevisiae i for preprothaumatin kodende plasmider.

KARS2-repliconen og TRP1-genet fjernedes fra pEK 30 2-7 ved digestering med Bgl II, efterfulgt af isolering af 3,5 kb fragmentet fra en 0,7%’s agarosegel. Dette rensede fragment indsattes i den dephosphorylerede Bgl

Il-spaltningsposition i pUR 528-03 ved inkubation med T4 DNA-ligase. Transformation af ligeringsblandingen til 35 E. coli gav plasmid pURK 528-03 (fig. 10). Transforman-ter frembragt ved indførelse af plasmid pURK 528-03 i K. lactis SD11-celler ved hjælp af Li+-metoden påvistes DK 113699 B1 38 at syntetisere thaumatin-lignende proteiner, der undersøgtes som beskrevet af L. Edens et al., Gene 18 (1982), side 1-12, se fig. 11).

Claims (30)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af gasren Kluyveromyces, kendetegnet ved, at man (1) transformerer Kluyveromyces gærceller med en vektor, der i 5r-3’ -transkriptionsretningen omfatter: 5 (a) en i Kluyveromyces funktionsdygtig promoter- reguleringsregion, (b) en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid under regulering af nævnte promoterregulerings-region, 10 (c) en transkriptionsterminator, og knyttet der til (d) en selektionsmarkør, og (e) et i Kluyveromyces funktionsdygtigt repli-kationsbegyndelsessted, og 15 (2) propagerer de opnåede transformerede celler i et vækstvedligeholdende medium.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at nævnte celler transformeres som proto-plaster.

3. Fremgangsmåde ifølge krav ^kendeteg net ved, at nævnte celler transformeres som hele celler.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at nævnte celler trans- 25 formeres med autonomt replikerende plasmider eller integrerende plasmider.

5 CBS 351.82.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at de autonomt replikerende plasmider er valgt blandt plasmider af KARS-typen og plasmider af 30 2-mikron-typen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegne t ved, at plasmidet af KARS-typen er pKARS2 eller pKARS12 med henholdsvis deponeringsaccessionsnumrene CBS 8157 eller CBS 353.8 2·

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at plasmidet af 2-mikron-typen er pPTY75-LAC4 DK 173699 B1 40 med deponeringsaccessionsnummeret CBS 351.82·

8. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at de integrerende plasmider indeholder Kluyveromyces-DNA.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendeteg net ved, at det integrerende plasmid er pL4 med depc -neringsaccessionsnummeret CBS 352.82·

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete <; -net ved, at Kluyveromyces-cellerne er K. lactis 10 eller K. fragilis.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete <: -net ved, at de transformerede gærceller inkuberes i et medium indeholdende kaliumchlorid.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kende- 15. e g n e t ved, at koncentrationen af kaliumchlorid er ca. 0,6 M.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k ende-tegnet ved, at den for et polypeptid kodende DNA-sekvens koder for chymosin eller én af dets precursor- 20 former eller 8-galactosidase.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Kluyveromyces-cellerne hidrører fta K. lactis SD11 lac4 trpl eller K. lactis SD69 lac4 med henholdsvis deponeringsaccessionsnumrene CBS 8092 elle.t

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i Kluyveromyces, kendetegnet ved, at man dyrker Kluyveromyces-celler opnået ifølge et vilkårligt af kravene 1-14.

16. Anvendelse af Kluyveromyces som vært for transformation og ekspression af fremmede gener.

17. Transformeret Kluyveromyces-celle, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant-DNA, som omfatter: 35 (a) et strukturelt gen, der koder for chymosin eller én af dets precursorformer eller 8-galact<: - sidase, DK 173699 B1 41 (b) en autonomt replikerende sekvens hidrørende fra Kluyveromyces (KARS), (c) en gærregulon og (d) en selektionsmarkør, 5 idet nævnte Kluyveromyces er i stand til at eksprimere chymosinet eller dets precursorform eller 8-galactosi-dasen, som rekombinant-DNA'et koder for.

18. Transformet Kluyveromyces-celle, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant-DNA, 10 som omfatter: (a) et strukturelt gen, der koder for chymosin eller én af dets precursorformer eller β-galacto-sidase, (b) en 2-mikron-plasmidreplikationssekvens hid- 15 rørende fra Saccharomyces, (c) en gærregulon og (d) en selektionsmarkør, idet nævnte Kluyveromyces er i stand til at eksprimere chymosinet eller dets precursorform eller β-galactosi- 20 dasen, som rekombinant-DNA'et koder for.

19. Transformeret Kluyveromyces-celle, kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant-DNA, som omfatter: (a) et strukturelt gen, der koder for chymosin 25 eller én af dets precursorformer eller β-galacto- sidase, (b) en sekvens, der er homolog med en genomisk Kluyveromyces-sekvens, (c) en gærregulon og 30 (d) en selektionsmarkør, idet nævnte Kluyveromyces er i stand til at eksprimere chymosinet eller dets precursorform eller β-galactosida-sen, som rekombinant-DNA'et koder for.

20. Transformeret Kluyveromyces-celler ifølge 35 krav 17, kendetegnet ved, at den er K. lactis SD17 lac4 trp1 (pKARS12), idet den oprindelige stamme har deponeringsaccessionsnummeret CBS 8092 og plasmidet CBS 353.82. DK 173699 B1 42

21. Transformeret Kluyveromyces-celle ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den er K. lactis SD69 lac4 (PTY75-LAC4), idet den oprindelige stamme har deponeringsaccessionsnummeret CBS 8093 og plasmidet

22. Transformeret Kluyveromyces-celle ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den er K. lactis SD69 lac4 (pL4), idet den oprindelige stamme har deponeringsaccessionsnummeret CBS 8093 og plasmidet CBS 10 352.82.

23. Kluyveromyces-ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den i 5'-3'-transkriptionsretningen omfatter: (a) en i Kluyveromyces funktionsdygtig promoter- 15 reguleringsregien, (b) en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid under regulering af nævnte promoterregulerings- region, (c) en transkriptionsterminator, og knyttet 20 dertil (d) en selektionsmarkør og (e) et i Kluyveromyces funktionsdygtigt replika- tionsbegyndelsessted.

24. Kluyveromyces-ekspressionsvektor ifølge krav 25 23, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter en sekvens, der er homolog med en genomisk Kluyveromyces-sekvens.

25. Kluyveromyces-ekspressionsvektor ifølge krav 23, kendetegnet ved, at replikationsbegyndel-- 30 sesstedet er 2-mikron-replikationsbegyndelsesstedet.

25 CBS 8093.

26. Kluyveromyces-ekspressionsvektor ifølge krav 23, kendetegnet ved, at replikationsbegyndel-sesstedet er KARS-sekvensen.

27. Kluyveromyces-ekspressionsvektor ifølge krav 35 23, kendetegnet ved, at polypeptidet er chy- mosin eller én af dets precursor former. DK 173699 B1 43

28. Plasmid pPTY75-LAC4 som indeholdt i E. coli DG75 med deponeringsaccessionsnummeret CBS 351.82

29. Plasmid pL4 som indeholdt i E. coli DG75 med deponeringsaccessionsnummeret CBS 352.82.

30. Plasmid pKARS12 som indeholdt i E. coli JA22T med deponeringsaccessionsnummeret CBS 353.82