PT88133B - Processo para a preparacao de polipeptideos por expressao em kluyveromyces - Google Patents

Description

, ' A Presente-invenção réfere-se a métodos para a preparação e para a utilização de Kluyveromyces para a produção de polipeptídeos de interesse que de preferência, são segregados para o meio de crescimento. A presente invenção é exemplificada por sequências úteis para a produção de quimosina e dos seus precursores, do acti vador de plasminogénio de tecido (t-PA) e de albumina de soro humano (HSA), em Kluyveromyces.

Antecedentes da invenção

As brilhantes promessas de produção de peptideos em micororganismos têm sido ofuscadas por vários factores. Em muitos casos em que o peptideo tem

sido produzido e retido, no citoplasma, resultaram corpos de inclusão necessitando de desnaturação e renaturação daj proteína, frequentemente só com êxito parcial ou mínimo.j Noutros casos o peptídeo tem sido submetido a degradação j substancial de maneira que não só os rendimentos são baixos como também são obtidos misturas complicadas, as quais são difíceis de separar. Como uma solução potencial para estas dificuldades, a possibilidade de secreção do peg tídeo desejado para o meio nutriente tem vindo a ser investigada. A secreção tem encontrado um êxito limitado, uma vez que nem todas as proteínas se têm revelado capazes de secreção no hospedeiro que foi empregue. Mesmo quando segregado, o processamento do peptídeo pode resultar num produto que difere da composição e/ou da conforma ção do peptídeo desejado. Existe, por conseguinte, um substancial interesse na capacidade de desenvolver sistemas para a produção eficiente e económica de peptídeos ac tivos sob condições que permitam o uso de peptídeos numa larga variedade de meios, quer in vitro quer in vivo.

LITERATURA RELEVANTE pedido de patente Europeia (EPAi 0096430 descreve uma estirpe de Kluyveromyces como hospe·^ deirò para clonagem e expressão de geties estranhos. No entanto não se faz qualquer menção à capacidade de secreção de proteínas para o meio de cultura. ' \

A sequência guia de ámiloglucosidades para Aspergilus é descrita em Boyle et al., EMBO J. (1984) 3.:1581-1585 e em Innis et al. , Science (1985) 228;21-26. Os promotores de Lactase são descritos por Bruenig et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:2327-2341.

O uso de peptídeos de sinal associados com factor de tipo de acasalamento e das enzimas invertase e fosfatase ácida para dirigir a secreção de proteinas heterólogas em Saccharomyces encontra-se descrito em EP-A-0123544 e por Smith et al., Science (1985) 229:1219.

A produção de preproquimosina, proquimosina e quimosina em Saccharomyces foi estudado por Mellor et al. , Gene (1983) 24.: 1-14. Çuando a proquij mosina é produzida intracelularmente em Saccharomyces, sój uma baixa percentagem da proquimosina obtida é activável.f Ver Moir et al. , em Developments in Industrial Biology j (1985) 26:75-85; Mellor et al., Gene (1983) 24:1-14; Kingsman et al. em Biotechnology and Gnetic Engineering Reviews Vol. 3 (1985) 376-418. A proquimosina agregada produzida por Saccharomyces necessitou métodos complicados de desnaturação e de renaturaçào para tornar a proqui mosina solúvel. Ver WO 83/04418 e EP-A-0114506.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

São proporcionados sistemas de produção de peptídeos compreendendo estirpes hospedeiras de Kluyveromyces, blocos integrados de expressão que incluem regiões de início de e de terminação de transcrição eficientes para utilização em Kluyveromyces e um gene, contendo opcionalmente uma sequência de sinal para a secreção sob a regulação de transcrição e de tradução das regiões de regulação. Os blocos integrados são introduzidos dentro da estirpe hospedeira de Kluyveromyces sob condições nas quais os transformantes resultados mantêm de forma estável _sos blocos integrados de'· expressão. Podem utilizar-se ADN de ocorrência natural'e genes sintét£ cos para a^produção de peptídeos de interesse.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama do plasmideo pGBTe418;

A Figura 2 é um diagrama do plasmideo pGB901;

A Figura 3 é uma descrição do oligonucleótido sintetizado para a sequência de sinal, adaptada a partir da sequência de sinal da amiloglucosidade;

A Figura 4 é uma descrição de uma sequência de sinal sintética ;

A Figura 5 é uma análise por mancha imunológica apresentando a secreção de proquimosina por K. lactis;

A Figura 6 é a sequência da inserção BamHI integral de pDMlOOPC compreendendo o peptídeo de fusão do factor =< de S. cerevisiae e regiões de regulação de trascrição;

A Figura 7 é um mapa de restrição do plasmídeo pK3lO5;

A Figura 8 mostra a estratégia utilizada para se projecta rem as sondas de oligonucleótidos utilizadas para se iden tificar o ADN do factor cR de K. lactis;

A Figura 9 representa a sequência completa do fragmento de ADN que códifica o factor o< de K. lactis;

A Figura 10 é uma descrição do plasmídeo utilizado para a expressão da fusão da sequência de sinal do factor e\ e do gene estrutural de proquimosina;

A Figura 11 mostra as sequências em volta das ligações nas fusões de factor o</proquimosinas;

A Figura 12 representa a sequência da inserção BamHI/SalI de pAB3O9;

A Figura 13 representa as sequências dos iniciadores para mutagénese de ADN guia do factor de K. lactis;

A Figura 14 é um diagrama do plasmídeo pUCG418;

A Figura 15 é um diagrama do plasmídeo pGBtPAl;

A Figura 16 mostra a secreção de t-PA humano por K. lactife;

por análise em gel de poliacrilamida SDS sobreposto com umar camada de gel de agarose de plaêminogénio/fibrina;

A Figura 17 é um \diagrama do plasmídeo pGBtPA2;

A Figura 18 é um diagrama do plasmídeo pGBlíSA3;

A Figura 19 mostra a secreção de ASH por K, lactis por análise em gel de poliacrilamida a 10%.

DESCRIÇÃO DE FORMAS ESPECIFICAS DE REALIZAÇÃO

De acordo com o objectivo da pre sente invenção, são proporcionados blocos integrados de expressão que permitem a produção eficiente e económica de polipeptídeos por células de levedura de Kluyveromyces Os blocos integrados de expressão possuem sequências regu ladoras de transcrição e de tradução, funcionais numa cé4 lula hospedeira de Kluyveromyces e um quadro de leitura livre que codifica para um peptídeo de interesse sob o controle de transcrição e de tradução das regiões de reguj lação. 0 quadro de leitura livre pode também incluir I uma sequência guia reconhecida pelo hospedeiro Kluyveromy ces que proporciona a secreção do polipeptídeo para o meio de cultura. As células de Kluyveromyces utilizadas podem ser estirpes de laboratório ou industriais.

Os blocos integrados de expressãç incluirão na direcção 5'-3' da transcrição uma região de regulação de inicio de transcrição e de tradução, um quadro de leitura livre que codifica para um peptídeo de interesse, de preferência possuindo uma sequência de sinal para a secreção reconhecida pelo Kluyveromyces e uma região de terminação de tradução. O bloco integrado de expressão conterá ainda uma região de regulação de terminação de transcrição. As regiões de regulação de início e de terminação são funcionais em Kluyveromyces e propor cionam uma expressão eficiente do peptídeo de interesse sem efeitos indesejáveis na viabilidade e na.proliferação do hospedeiro Kluyveromyces.

A região de regulação de início, de -tradução e de transcrição poderá^ser homóloga ou heteróloga em relação ao Kluyveromyces. Revestem-se de particular interesse as regiões de início de t'ranscr ição de genes que estejam presentes em Kluyveromyces ou em outras espécies de leveduras, tais como Saccharomyces, por exemplo, cerevisiae, Schizosaccharomyces, Candida, etc., ou outros fungos, por exemplo, fungos filamentosos tais como Aspergiilus, Neurospora, Penicillium, etc. As regiões de regulação de início de transcrição podem ser obtidas por exemplo a partir de genes na via metabólica glicolíti co, tais como de-hidrogenase de álcool, de-hidrogenase de gliceraldeído-3-fosfatase, fosfoglucoisomerase, fosfoglicerato-quinase, etc., ou genes reguláveis, tais como fosfatase ácida, lactase, glucoamilase, etc..

Pode ser preferida qualquer uma de várias sequências reguladoras conforme a situação particular, dependendo se se deseja uma transcrição constitutiva ou induzida, a eficiência particular do promotor em conjunto com o quadro de leitura livre de interesse, a capacidade para juntar um promotor forte com uma região de regulação de um promotor diferente que permita uma transcrição inductível, a facilidade de construção e outros factores. Estas regiões reguladoras têm amplos pre cedentes na literatura. Ver, por exemplo, ΞΡ-Α-Ο164566 que aqui se dá por reproduzido.

A secreção de proteínas heterólogas em microrganismos geneticamente modificados é, em geral, conseguida por um de dois métodos. No primeiro a sequência guia é homóloga em relação à proteína; no segun do a sequência guia é homóloga em reláção ao organismo hospedeiro. Outras alternativas de interesse particular na presente invenção para secreção de proteínas heterólogas em Kluyveromyces incluem o uso de uma sequência guia heteróloga em relação tanto a Kluyveromyces como ao peptídeo de interesse ou uma sequência guia sintética especi ficamente projectada. O ADN que codifica para a sequência guia anterior pode ser obtido por isolamento ou por , via sintética. Deste modo, o quadro de leitura livre incluirá normalmente um gene de tipo selvagem ou mutado, onde a sequência de sinal está normalmente''associada com a parte restante da sequência de codificação, um quadro de leitura livre híbrido ou quimérico, em que a sequência de sinal não está normalmente associada com a porção restante do quadro de leitura livre, ou uma sequência sintética, em que a sequência de sinal é a parte restante do quadro de leitura livre são sintetizados para proporcionar codões preferidos, zonas de restricção convinientes, novas sequências de ácidos aminados, etc., ou combinações destes elementos. As sequências de sinal que podem ser utilizadas podem ser obtidas a partir de genes tais como gene do factor o< , da invertase, da amiloglucosidade,

sequências de sinal nativas ou de tipo selvagem presentes em genes estruturais e reconhecidos por Kluyveromyces , Saccharomyces, outros fungos, por exemplo Neurospora, As-j pergillus e outros eucariontes. I

Reveste-se de particular interesse o uso de uma sequência de sinal que proporciona para a secreção do peptídeo de interesse para o meio nutriente, evitando-se o seu confinamento ao espaço periplasmático. Na maior parte das situações, a sequência de sinal será a extremidade 5' terminal do quadro de leitura livre. No entanto, em algumas situações poderá ser dese jável possuir a sequência de sinal no interior do quadro de leitura livre. Para a utilização de sequências de sinal internas para secreção, ver a patente Norte-America na U.S. n⁵. 4 338 397 e Perara e Lingappa, J. Cell Biology (1985) 101;2292-2301. Os genes nos quais o quadro de leitura livre de interesse pode ser inserido incluem genes constitutivos de alto grau de expressão, por exemplo genes que codificam para enzimas da via glicolítica, ou genes reguláveis de-alto grau de expressão, tais como os genes la lactase, da amiloglucosidase ou semelhantes.

Verificou-se que para uma expressão de genes óptima as sequências d‘e’'nucleótidos que cer cam o codão de início de tradução ATG são importantes em células de levedura e em células animais. ' Por exemplo, M. Kozak, Hicrobiol. Revs. (1983) 47:1-45 tem vindo a estudar extensivamente o efeito destas regiões na expressãc de insulina em células COS. De forma semelhante, encon tram-se com mais frequência nucleótidos específicos nas proteínas de levedura de alto grau de expressão do que outros, indicando o importante efeito destes nucleótidos do nível de expressão destes genes.

Para uma expressão genética óptima de genes exógenos será importante modificar as sequências nucleotídicas que cercam o codão de início ATG. Istc

pode ser feito por mutagénese dirigida para um local ou por fusão do gene exógeno em quadro para um gene de Kluyveromyces endógeno, de preferência um gene de alta expres são tal como o gene de lactase.

Normalmente, será desejável que o guia de sinal seja cindido do peptideo de interesse durante o processo de secreção e não após o processo de secreção, apesar de qualquer destes procedimentos poder ser utilizado. Normalmente, o sinal de processamento utiliza do será o sinal de processamento de ocorrência natural com a sequência de sinal ou um sinal de processamento modifica do a partir do sinal de ocorrência natural, o qual é ainda eficaz para proporcionar um sinal peptídico dando como resultado a cisão hidrolltica do peptideo de sinal e o pre» cessamento do peptideo de sinal a partir do peptideo de interesse. Foram sequenciados e definidos diversos sinais de processamento, tais como o factor (ver, por exemplo Patente U.S. ns. 4 546 082, que aqui se dá como reproduzida), amiloglucosidase, °<-amilase, etc.. Em alguns casos poderão ser utilizadas outras sequências reconhecidas por peptidase que podem requerer uma cisão subse quente para isolamento do peptideo desejado. Estas sequ ências incluem peptídeos dibásicos, por exemplo, KR, (D)^-K, e EA, os quais são cindidos por -enteroquinase de boi KEX2, e uma peptidase de membrana de levedura, respectivamente. \

O peptideo de interesse pode . ser nativo do hospedeiro ou heterólogo, sendo derivado de fontes procarióticas ou eucarióticas, podendo as fontes eucarióticas envolver fungos, protistas, vertebrados, não -vertebrados e semelhantes. Os produtos peptídicos podem incluir enzimas, tais como lactase, tx-amilase, amilo glucosidase, quimosina, etc., peptídeos de mamíferos, tais como hormonas, interleuquinas, citoquinas, cachexina e fa ctores de crescimento, por exemplo derivados de plaquetas, da epiderme e do esqueleto, etc., hormonas de crescimento,

hormonas estimuladoras do folículo, interferões (<X, e Y), factores sanguíneos, tais como o factor V, VI, VII, VIII (vW ou c),, I?:, X, XI ou XII, o activador de plasminogénio (de tecido ou urinário), albumina de soro, por exemplo, albumina de soro humano (ASH), factor de crescimento de colónias (por exemplo GM), eritropoietina, taumatina, insulina, etc..

Estes genes estruturais podem ser obtidos de várias maneiras. Guando a sequência de ácidos aminados é conhecida, o gene estrutural pode ser sintetizado no todo ou em parte, particularmente quando é de sejável proporcionar codões preferidos de levedura. Assim todo ou só uma porção do quadro de leitura livre pode ser sintetizado utilizando codões preferidos por Kluyveromyces . Os codões preferidos podem ser determinados pelos codões que são encontrados nas proteínas produzidas em maior quantidade pelo hospedeiro Kluyveromyces, por ex emplo em enzimas glicolíticas. Os métodos para a síntese de sequências e para as juntar estão já bem estabeleci das na literatura. -Quando uma porção do quadro de leitu ra livre é sintetizada e uma porção é derivada de fontes naturais, a porção sintetizada pode servir de ponte entre duas porções de ocorrência natural ou pode proporcionar , uma- extremidade terminal 3' ou terminal 5'. Em particular quando a sequência de sinal e o quadro de leitura livre que codificam para o peptídeo são derivados de genes diferentes ••serão utilizados normalmente adaptadores sinté ticos.

Noutros casos podem ser utilizados adaptadores de ligação quando os vários fragmentos podem ser inseridos em zonas de restricção diferentes ou substi tuídos por uma sequência no adaptador.

Na maioria das ocasiões, alguns ou todos os quadros de leitura livres serão de origem natural. Os métodos para identificar as sequências de intere;

sse têm encontrado exemplificações extensivas na literatu ra, se bem que em sittnações individuais possam ser encontrados diferentes graus de dificuldade. Diversas técnicas envolvem o uso de sondas onde pelo menos uma parte das sequências de ácidos aminados de ocorrência natural é conhecida, podendo ser realizadas buscas em bancos genómicos ou de ADNc para sequências complementares. Em alternativa, pode ser detectada a transcrição diferencial quando o gene de interesse pode ser induzido ou quando as células sao do mesmo hospedeiro mas de diferenciação dife rente por comparação do ARN mensageiro produzido. Outra técnicas foram também exemplificadas.

A região de terminação pode ser derivada da região 3' do gene do qual foi obtida a região de inicio ou de um gene diferente. Um grande número de regiões de terminação têm vindo a ser consideradas como satisfatórias numa variedade de hospedeiros dos mesmos ou de diferentes géneros e espécies. A região de terminação é normalmente seleccionada mais por questões de convi niência do que por causa de qualquer propriedade particular. De preferência a região de terminação será derivada de um gene de levedura, em particular de Saccharomyces ou de Kluyveromyces.

\ No desenvolvimento dos blocos integrados de expressão, os diversos fragmentos contendo as regiões' e o quadro de leitura livre podem,ser submetidos a diferentes condições de processamento, tais como li gação, restrição, ressecçSo, mutagénese in vitro, reparação por iniciador, uso de ligadores e de adaptadores, etc Assim, podem ser realizadas no ADN que é utilizado nas regiões de regulação e/ou nos quadros de leitura livre transições, transversões, inserções, supressões e outras alterações de nucleótidos.

tegrado de expressão,

Durante a construção do bloco in os diversos fragmentos do ADN serãc

normalmente cionados num vector de clonagem apropriado, o que permite a expansão do ADN, a modificação do ADN ou a manipulação por adição ou eliminação das sequências, adagj tadoras, etc.. Normalmente, os vectores serão capazes ! de replicação, num número de cópias pelo menos relativamente alto em S. coli. Vários vectores são facilmente obteníveis para clonagem, incluindo vectores tais como pBR322, pACYCl84, pUC7-ly, M13, Charon 4A e semelhantes.

Os vectores de clonagem são carac terizados por possuírem um sistema de replicação eficiente funcional em E. coli. Da mesmaforma, o vector de cio nagem terá pelo menos um local de restrição singular, nor malmente uma multiplicidade de locais de restricção singu lares e pode também incluir locais de restricção múltiplos, em particular dois locais de restricção da mesma espécie para substituição. Além disso, o vector de clonagem terá um ou mais marcadores que possibilitam a selecção de transformantes. Os marcadores permitirão normalmente a resistência a agentes citoxicos tais como antibióticos, metais pesados, toxinas e outros, complementaçSo de um hospedeiro auxotrópico ou imunidade a um fago. Através de restricção apropriada do vector e do bloco integrado e, conforme apropriado, de modificação das extremidades atra vés' de corte ou de preenchimento dag extremidades desalinhadas, para se obterem extremidades alinhadas através da adição de adaptadores ou através da adição de caudas podem ser proporcionadas extremidades complementares para ligação e reunião do vector ao bloco integrado de expressão ou seu componente.

Após cada manipulação do ADN no desenvolvimento do bloco integrado, o plasmídeo será clonado, isolado e, se necessário, o componente do bloco integrado particular analisado bem como a sua sequência, pa ra garantir que foi obtida a sequência apropriada. Em dependência da natureza da manipulação, a sequência desejada pode ser cindida do plasmídeo e introduzida num vec11

tor diferente ou o plasmídeo pode ser restringido e o co ponente do bloco integrado de expressão pode ser manipul do de forma apropriada.

Sm alguns casos será utilizado umj vector lançadeira quando o vector é capaz de replicação em deferentes hospedeiros necessitando diferentes sistemas de reprodução. Esta circunstância pode ou não exigir a existência de marcadores adicionais que sejam funcionais em ambos os hospedeiros. Quando estes marcadores são necessários, estes podem ser incluídos no vector, podendo o plasmídeo que contém o bloco integrado, os dois sistemas de reprodução e o(s) marcador(es) ser transferido de um hospedeiro para outro, conforme se pretender.

Na presente situação, o segundo sistema de replicação seria um sistema de replicação funcional em Kluyveromyces. Os sistemas de replicação que podem ser utilizados podem ser derivados de plasmídeos, por exemplo de pKDl de Kluyveromyces drosophilarum, de vírus ou do cromossoma de Kluyveromyces ou de outras espécies, em particular de espécies associadas 'a Kluyveromyces, tais como de Saccharomyces. Assim, o sistema de replicação inclui o sistefna de replicação de um plasmídeo de 2 micrómetros que ocorre em Saccharomyces e um gene de sequência de replica çãó autónoma (ARS) por exemplo quando utilizado em conjunto com uma sequência centrómera ou semelhante. Se se pretender, podem ser proporcionadas regiões de homologia para estimular a integração do bloco integrado de expressão dentro do genoma do hospedeiro do Kluyveromyces.

Reveste-se de interesse particular nas construcções a que se refere o objectivo da presentr invenção a sequência derivada de cromossomas de ADN de Kluyveromyces referidos como KARS, os quais proporcic nam uma alta frequência de transformação. O gene KARS pode ser obtido através de busca de um banco de fragmente para uma eficiência de transforDeste modo, podem ser obtidos fre- 12 de ADN de Kluyveromyces mação intensificada.

gmentos que contêm sequências de KARS, fragmentos estes que ainda podem ser modificados por restricção, ressecção ou reparação de iniciadores para proporcionar um fragmen: to de aproximadamente 200 pb e de não mais do que cerca de 5000 pb, mais normalmente de cerca de 200 pb a 2000 pbl

I que proporcione uma eficiência de transformação intensifij cada. A presença do gene KARS pode proporcionar a trans formação de espécies auxotrópicas de K. lactis em espécies prototróficas a uma frequência de pelo menos cerca de 10 por micrograma de ADN, normalmente a uma frequên4 cia de 10 por micrograma de ADN ou superior.

modo de transformação de E. co li com as diversas construcções de ADN (plasmídeos e vírus) para clonagem não é crucial para a presente invenção, Pode utilizar-se conjugação, transducção, transfecção ou transformação, por exemplo transformação mediada por cloreto ou por fosfato de cálcio. Por contraste, para leve duras, que a maior parte da técnica anterior baseia-se na transformação de protoplasmas empregando combinações de iões de cálcio e polietileno glicol de cerca de 2000 a 8000 Daltons, normalmente de 4000 para 7000 Daltons.

Um método alternativo de transformação envolve o crescimento de K-lúyveromyces num meio nutriente normal.de levedura até uma densidade OD,,^ de 510

2b, de preferência de 4 a lo. As célulàs de Kluyveromyces são' então recolhidas, lavadas e pré-tratadas com iões caotrópicos, particularmente iões dos metais alcalinos lítio, césio ou rubídio, particularmente sob a forma de cloreto ou de sulfato, mais particularmente com sais de lítio a concentrações de cerca de 2 mM a 1 M de preferência cerca de 0,1 M. Após incubação das células com o(s) ião(ões) caotrópicos, adicionou-se o ADN e a incubação foi prolongada durante um curto período de tempo a uma temperatura moderada, geralmente de cerca de 20°C a 35°C durante 5 a 60 min. Em seguida adicionou-se o poli etileno-glicol, de preferência a uma concentração de cer- 13 -

ca de 25 a 50 % podendo todo o meio ser diluído por adiçSo de um igual volume de um concentrado de polietileno-glicol a fim de se obter a concentração final pretendida. O polietileno glicol será de cerca de 2000 a 8000 Daltons, de preferência de cerca de 4000 a 7000 Daltons.

A incubação será feita durante um tempo relativamente cur to, geralmente de cerca de 5 a 60 min. á desejável que o meio de incubação seja submetido a um tratamento de ca lor a partir de cerca de 1 a 10 min a cerca de 35°c a 45°c, de preferência a cerca de 42°c.

para selecção, pode utilizar-se qualquer marcador útil, apesar de o número de marcadores úteis com Kluyveromyces ser menor que o número de marca dores utilizado para Saccharomyces,, á desejável que a resistência à canamicina e ao aminoglicósido G418 sejam de interesse, bem como a complementação de um gene na vie. metabólica do triptofano, particularmente TRPl, ou na vie. metabólica da lactose, particularmente LAC4 .

Se bem que seja altamente desejável e conveniente um marcador para selecção, têm sido des critos outros procedimentos para selecção de células transformadas. Ver por exemplo G. Reipen et al., Cur-_i rent Genetics (1982) _5;189-193. Al/ém do uso de uma enzima indicadora /tal como Ç>-lactamase, as células transformadas podem ser seleccionadas pelos produtos específ_i cos que produzem. No caso da quimosina, por exemplo, pc de ser determinada a síntese do produto por um método imr nológico ou enzimático.

vector utilizado pode ser capaz de manutenção extracromossómica em Kluyveromyces ou re sultar numa integração no gene de Kluyveromyces. Verifi cou-se que o sistema de replicação de plasmídeos de 2 micrómetros de Saccharomyces proporciona a manutenção extracromossómica em Kluyveromyces. Por outro lado, pode-se utilizar uma combinação de um centrómero, como seja c

CΕΝ3 de Kluyveromyces e de uma sequência de alta frequên cia de transformação, como seja a sequência ARS ou KARS. Se se proporciona uma manutenção selectiva, como seja a complementação ou resistência a um antibiótico ao qual a levedura Kluyveromyces é susceptível, as sequências do tipo de ARS serão normalmente suficientes para a manutenção extracromossómica.

Para uma fermentação em grande es cala mesmo uma pequena perda da estabilidade dos plasmídeos afectará de modo importante o rendimento final da proteína desejada. A fim de aumentar a estabilidade das moléculas recombinantes nas células hospedeiras, por exem pio em Kluyveromyces, pode utilizar-se a integração das moléculas recombinantes no cromossoma do hospedeiro.

Guando se pretende a integração, normalmente é desejável ter uma sequência homóloga de uma sequência do cromossoma do hospedeiro de modo a que possa ocorrer uma recombinação homóloga. Deverá entender-se que também ocorre integração aleatória, de tal modo que a sequência homóloga é óptima. guando se utiliza uma se quência homóloga, esta terá pelo menos 200 pb e poderá ter 1000 pb ou mais. Além disso, quando ocorre uma inte gração, é possível desejar ter uma amplificação do gene estrutural. A amplificação foi conseguida proporcionando um gene em série com o gene estrutural pretendido, o qual possibilita a vantagem duma selecção do hospedeiro num meio selectivo. Deste modo, verificou-se que os genes que expressam a redutase de di-hidrofolato, as metalo tioneínas, a quinase de timidina, etc., são úteis em vários hospedeiros para proporcionar a amplificação, propor cionando o gene protecção para a toxina, como seja o meto trexato, para metais pesados, como seja o cobre ou o mercúrio, e semelhantes.

De entre os vectores de interesse que proporcionam uma replicação estável podem referir-se

os vectores KARS proveniente de K. lactis, por exemplo pKARS12 e pKARS2, cujos plasfflídeos contêm um fragmento de

ADN de K. lactis contendo a sequência KARS12 ou KARS2 no plasmídeo YR 7 de S. cerevisiae. Um vector utilizado P — para integração é, por exemplo, o vector pL4, um plasmídeo híbrido de ARSl contendo o plasmídeo YR 7 e o fragmento P de ADN Xhol de K. lactis contendo o gene LAC4 . Ver ΞΡ-A 0096430.

De entre os plasmídeos de interes se particular podem referir-se o sistema de replicação do plasmídeo de 2 micrometros, o gene LAC4, o gene de resistência à canamicina Tn60l e Tn5, que também confere resis tência áo antibiótico G418 em Kluyveromyces (Jimenez e Davis, Nature (1980) 287;869-871). Este plasmídeo promo ve a replicação autónoma em Kluyveromyces e pode ser sele ccionado por meio da resistência a G418 em placas de rege neração contendo glucose, sorbitol e 0,2 ^ug/ml de G41tí, evitando elevadas concentrações de KCl que interferem com a sensibilidade de Kluyveromyces a G418. 0s plasmídeos preferidos incluem o’'gene LAC4, particularmente de K. lac tis, o gene Kan , que confere resistência contra o antibi Ótico G418 de Tn5, ou semelhantes.

Os vectores'e as construções refe ridos são introduzidos num hospedeiro apropriado para se conseguir a clonagem e a expressão dos genes estruturais pretendidos. Após a transformação, aparecerão normalmen te colónias em meio de regeneração dentro de cerca de 5 a 6 dias. Quando se utiliza um antibiótico para a selecção, as colónias devem ser escrutinadas para assegurar a ausência de mutações espontâneas para uma estirpe resistente. Por utilização dos plasmídeos e dos métodos da presente invenção, verificou-se que cerca de 5 % de colónias resistentes contêm a construção plasmidica que proporciona pelo menos cerca de 4 transformantes por pg de ADN plasmidico. Quando a selecção se baseou na presença do gene LAC4 usando placas que contêm lactose como única

fonte de carbono e KCl 0,6 M como estabilizador osmótico, verificou-se que todas as colónias sobreviventes eram transformantes e não revertantes espontâneos. Foram oh tidos cerca de 20 transformantes após cerca de 4 a 5 dias| de incubação a uma temperatura moderada, por exemplo a 30°C.

í

Para organismo hospedeiro a leve dura Kluyveromyces é especialmente adequada para a produ çao de proteínas heterólogas, por exemplo para a produção e para a extracção da enzima quimosina e dos respectivos precursores preproquimosina, pseudoquimosina e proquimosi na, de albumina de soro humano (ASH), de activador de plasminogénio de tecido (t-PA) e de taumatina e das suas formas precursoras. Se bem que outros organismos como a levedura Saccharomyces produzam proquimosina em quanti dades razoáveis, a proquimosina produzida não pode ser extraída sob uma forma activa ou activável. Nós verificámos de modo surpreendente que uma quantidade superior a 90 % da quantidade total de proquimosina produzida por Kluyveromyces pode-ser extraída sob uma forma activa por meio de técnicas normais muito simples.

Pode utilizar-se qualquer das muitas espécies de Kluyveromyces. —- 'Podem ser'ut ilizadas tanto estirpes laboratoriais como industriais. Por estirpes industriais entendem-se estirpes de\ Kluyveromyces de organismos que podem ser isolados a partir de fontes naturais ou podem ser obtidos de colecçãoes ou de outras fontes ou então podem ser obtidas por modificação, por exemplo por mutação destas estirpes. As estirpes industriais são caracterizadas por serem resistentes à permuta, genética, sendo prototróficas ou tornadas prototróficas por um único gene que é introduzido numa estirpe hospedei ra e são normalmente seleccionadas para a produção melhorada de peptídeos. De entre as espécies de Kluyveromyces que podem ser utilizadas podem referir-se K. lactis, K_± fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, K. marxia

nus, etc.. Deverá ainda notar-se que os organismos Kluy veromyces fazem parte da lista GRAS (Generally Recognized As Safe = Geralmente Reconhecida como Seguros). O uso destes organismos para a produção de produtos para se rem utilizados in vivo ou parz serem ingeridos não neces sitará normalmente de exame e de aprovação governamental especial.

Tanto as estirpes de Kluyveromyces do tipo selvagem como as estirpes mutantes, particularmente de Kluyveromyces lactis ou de Kluyveromyces fra gilis, podem ser utilizadas como hospedeiras. As estir pes hospedeiras de interesse particular incluem as estirpes K. lactis SDll lac4 trpl e K. lactis SD69 lac4 e a estirpe de tipo selvagem CBS 2360 (ver EP-A-OO96430).

Para manter a pressão selectiva nos transformantes para manutenção dos plasmídeos podem ser utilizados meios selectivos como seja um meio de base de azoto de levedura, 2 % de lactose em vez de glucose pa ra K. lactis SD69 lac4 (PTY75-LAC4) e para K. lactis SD69 lac4 (pL4) e um meio de base de azoto de levedura (Difco) mais 2 % deglucose para K. lactis SDll lac4 trpl (pKARSl2). para os transformantes referidos, ver EP-A-0096430. De modo semelhante, as .estirpes que contém plasmídeos que conferem resistência a antibióticos, por exemplo a G418, podem ser cultivadas num meio contendo o referido antibiótico.

Quando se utilizam os plasmídeos híbridos para a produção em grande escala da proteína pre tendida, será geralmente útil eliminar pelo menos substan cialmente todas as sequências de ADN bacteriano dos plasmídeos híbridos.

Dependendo da natureza do gene es trutural de interesse, o produto de expressão pode manter -se no citoplasma da célula hospedeira ou pode ser segre- 18 -

~Ί)|νΐΓ· gado. Verificou-se que são solúveis não apenas as proteínas que se mantém na célula mas também as que sao segregadas. Quando o produto de expressão se mantém na c lula hospedeira, é geralmente desejável ter uma região d início de transcrição inductível de modo que, até que o | transformante tenha atingido uma alta densidade, ocorra j uma reduzida expressão do produto pretendido ou não ocorra qualquer expressão. Após um período de tempo suficiente para se formar a expressão do produto, as células pc dem ser isoladas por métodos normais, por exemplo por cer trifugação, podendo em seguida ser lisadas e o produto de interesse pode ser isolado. De acordo com a natureza e com a utilização do produto, o lisado pode ser submetido a vários métodos de purificação, como sejam cromatografie, electroforese, extracção por solventes, cristalização ou outros. O grau de pureza pode variar desde cerca de 50% até 90% ou mais elevado, até à pureza essencial.

Quando o produto é segregado, podem utilizar-se tanto regiões de início de transcrição constitutivas como não constitutivas, em dependência do processo de fermentação usado para a produção da proteí-na ou do polipeptídeo de interesse. 0 produto da expres sao pode ser segregado para o meio de cultura e pode ser produzido numa base contínua, separando-se parcialmente o meio e extraindo-se o produto pretendido, por exemplo por cromatograf ia 'de afinidade ou por outfo método adeqúe, do, sendo-o meio exausto desprezado ou recirculado após restabelecimento dos componentes essenciais.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionadas na presente memória descritiva indicam o nível de especialização dos especialistas na téc nica a quem a presente invenção diz respeito. Todas as publicações e pedidos de patentes se dão aqui como repro duzidos por referência como se cada publicação e cada pe dido de patente em particular fosse específica e individualmente indicado como sendo dado como reproduzido por

referência

Os exemplos que se seguem sao apresentados para ilustração e não limitam de qualquer modo o âmbito da presente invenção.

í

PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Construção de plasmídeos de expressão de quimosina conten do uma sequência longa de promotor de lactase

A. Construção do plasmídeo pUCla56

Isolou-se ADN cromossómico a partir de Kluyveromyces lactis estirpe CBS 2360 (Das e Ηο£ lenberg, Current Genetics (1982) £:123-128), cortou-se com Xhol e fraccionou-se de acordo com as dimensões num gradiente de sucrose. As fracçoes contendo o gene da lactase foram detectadas com um sonda LAC4 do plasmídeo pKlò após o ADN ser'-depositado num filtro de nitrocelulose (ver EP-A-CO9643O, Exemplo 16.C2). 0 ADN contendo o gene de LAC4 foi clonado no local SalI do plasmídeo' PPA153-215 (Andreoli, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:372-38C) dando origem ao plasmídeo pPA31. -Subclonou-se um fragmento Xbai de pPA31 contendo o gene da lactase no local Xbal de pUCl9 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: :103-119)/ obtendo-se o plasmídeo pUCla56.

B. Introdução do gene de resistência a G418 no terminador do gene da lactase fragmento do terminador contendo a marca de resistência a G418 foi obtido a partir do plasmídeo pGBTeG418. Depositou-se no Centraal Bureau voor Schimmelcultures E. coli contendo pGBTeG418 sob o número CBS 184.87 em 26 de Fevereiro de 1987. O plasmídeo pGBTeG418 (ver Figura 1) é constituído pelo plasmídec

ΡΡΑ153-215, conforme descrito anteriormente, e por um fra gmento de 5,6 Kb constituído pelo fragmento BamHI terminador de lactase de K. lactis de 3,7 Kb (Breuning et al., Nucl. Acid. Res. (1984) 12.:2 3 2 7-2 341) e pelo gene Tn^ (Reiss et al. , EMBO J. (1984 ) 3.:3317) que confere resis- !

tência a G418 sob o comando do promotor de de-hidrogenase de álcool I (ADH) de levedura, semelhante ao descrito por Bennetzen e Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257:3018-3025,

C. Construção do piasmídeo pGB900 contendo o gene de resistência a G418 e ADN que codifica para proquimosina

Ligou-se em pUCl9 cortado com SalI e Xbal o fragmento HindIII-Xbal do piasmídeo pGBTeG418 contendo o gene de resistência a G418 (ver Exemplo 1B) e o fragmento SalI-HindIII contendo o gene de proquimosina de pGBl23 (ver EP-A-OO96430). Deste modo obteve-se o piasmídeo pGB900.

D. Construção do piasmídeo pGB90l (ver Figura 2)

Construiu-se o piasmídeo pGB90l poi: ligação dos seguintes quatro fragmentos:

(1) um fragmento Xbai-HaelI de 3,6' Kb contendo o propotor de lactase para cerca da posição -90 do codão \de início de lactase ATG isolado a partia? de pUCla56, ' ' (2) um fragmento Haell-Sall esten dendo-se desde o local Hael anterior até ao local sall ligado à posição -26 numa experiência semelhante com Bal31, conforme descrito no Exemplo 16.C2 de EP-A-OO96430. No entanto, nesta experiência usou-se apenas um adaptador Sall. Este fragmento tem a seguinte sequência;

5' TTAAC ACTTGAAATT TAGGAAAGAG CAGAATTTGG CAAAAAAAAT AAAAAAAAAA TAAACACG 3' CGCGAATTG TGAACTTTAA ATCCTTTCTC í GTCTTAAACC GTTTTTTTTA TTTTTTTTTT ATTTGTGCAG CT 5' (3) o fragmento Sall-xbal de 5,1 Kb contendo o gene de proquimosina e o gene de resistênI cia a G41B de pGB9OO (ver Exemplo IC), (4) pUCl9 cortado com Xbal.

Durante a construção do plasmideo, a sequência CG do local Hael foi eliminada inadvertidamente, criando deste modo um local HindIII nesta posição.

No plasmideo pGB9Ol está presente ADN que codifica para a proquimosina. Esta sequência pq de ser facilmente convertida em plasmídeos com ADN de pre quimosina, peeudoquimosina ou quimosina por meio da utili zação de fragmentos Sall-BglII de pGB 131, 122 ou 124, respectivamente (ver EP-A-OO9643O).

Exemplo 2

Secreção de proquimosina a partir de transformantes de

Kluyveromyces lactis

A fim de dirigir a síntese de proquimosína em Kluyveromyces, usou-se o plasmideo pGB9Ol para transformar as estirpes SDll e CBS 2360 de K. lactis com result-ados semelhantes. A transformação foi levada a cabo essencialmente conforme descrito nos Exemplos 4 e 14 de EP-A-OO9643O usando o ADN plasmídico intacto ou ADl· plasmídico cortado com endonucleases de restrição. No último caso, usaram-se endonucleoses de restrição que cor tam na região do promotor, por exemplo, Sacll, Ndel,

SnaBI ou Spel, ou na região do terminador, por exemplo, EcoRV , ou tanto na região do promotor como na do termine dor.

Cultivou-se K« lactis estirpe CBS 2360 em 100 ml de meio YEPD (1 % de extracto de levedura, 2 % de peptona, 2 % de glucose) contendo 2,5 ml de uma solução de base de azoto a 6,7 % (Ditco) até uma DO.. , 610 de cerca de 7. Separaram-se as células por centrifugação a partir de 10 ml da cultura, lavou-se com tampão TE (Tris.HCl 10 mM a pH 7,5, EDTA 0,1 mM) e ressuspendeu-se em 1 ml de tampão TE. Adicionou-se um volume igual de acetato de lítio 0,2 M e incubou-se a mistura durante 1 h a 30°C num banho com agitação. ' ortou-se o plasmídeo pGB90l (15 yug) no local Saci singular no promotor de lac tase, precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se em 15 £il de tampão TE. Este preparado de ADN foi adicionado a 100 de células pré-incubadas e prolongou-se a incubação durante 30 minutos. Em seguida adicionou-se um volume igual de PEG 4000 a 70% e incubou-se a mistura durante 1 h à mesma temperatura, submetendo-a em seguida a um choque térmico durante 5 minutos a 42°c. Em seguida adicionou-se 1 ml de meio YEPD e incubaram-se as células durante 1,5 horas num banho maria com agitação a 30°C.

Por fim, recolheram-se as células por centrifugação, ressuspendeu-se em 300 yul de YEPD, espalharam-se em placas de agar contendo 15 ml de agar de YEPD com 300 ^ug/ml de G418 e cobriram-se (1 h antes de usar) com uma camada de.

-ml de agar de YEPD sem G418. Cultivaram-se as colónias durante 3 dias a 30°C. Transformòu-se K. lactis estirpe SDll de um modo semelhante com a diferença de que a concentração inicial de G418 nas placas de selecção foi reduzida para 150 ^ug/ml. Numa das experiências fizeram -se crescer transformantes de CBS 2360 a 30°C em meio YEP contendo 2 % de galactose. Após 60 horas, separaram-se as células e o meio por centrifugação. As células foram desintegradas por tratamento com esferas de vidro. 0 meio de cultura e o extracto celular foram tratados a pH 2 antes de analisados para quantificação da actividade de quimosina (ver Foltman, Methods in Enzymology (1970) 19: :421-426).

Separaram-se as células das cultu ras por centrifugação, acidificaram-se os sobrenadantes resultantes até pH 2 por adição de I^SO^ 1 M e incubaram-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Neutralizaram-se as soluções até pH 6 por adição de Tris base 2 M. Adicionou-se um volume de 50 pl de uma diluição apropri ada a uma suspensão de leite em pó magro a 12 % em CaCl^ e incubou-se a 37°C até formação de um coágulo. Define-se uma unidade de actividade de quimosina como a quantidade de quimosina activa necessária para produzir um coágulo em 10 min. nas condições referidas. O sobrenadante continha actividade de coagulação de leite devida â produ ção e à secreção de proquimosina por transformantes de K. lactis ' se bem que não tenha sido adicionada qualquer sequência de sinal para a secreção da proteína à proquimosi na. Cerca de 30 a 60 % da proquimosina total produzida foi encontrada no meio conforme determinado por meio da análise de coagulação do leite anteriormente descrita. Foram obtidos resultados semelhantes quando se usou a estirpe SD11 de K. lactis.

Exemplo 3

Proteínas de fusão lactase-quimosina permitindo produção melhorada de quimosina

Foram obtidos variantes de pGB901 contendo uma fusão entre as proteínas lactáse e quimosina (Quadro lj^por utilização de vários fragmentos SnaBI-Sall (a partir de uma experiência com Bal31 semelhante à descrita no Exemplo 16.de EP-A-OO9643O usando apenas um único adaptador SalI). Os ácidos aminados adicionais pro porcionados pelo ADN de lactase e pelas sequências dos adaptadores podem ser eliminados, juntamente com a pro-sequência da proquimosina, por tratamento com ácido. Obser vou-se que uma fusão contendo 4 ácidos aminados da sequên cia de codificação de lactase (pGB9O2) tinha como resulta do uma produção melhorada de quimosina.

QUADRO 1

Sequência nucleotídica na junção entre o promotor de lactase e a proquimosina em pGB9Ol e pGB9O2

PGB901 promotor de lactase proquimosina

PGB9O2

...,TAAACACGTCGACGAATTC l

Sall EcoRI

ATG

CTGAG lactase proquimos ine

->

ATG

CGTCGACGAATTCATGGCTGAG

Sall EcoRI

A síntese da proteína inicia-se no codão ATG enquadrado.

Exemplo 4

Expressão de proquimosina por transformantes de Kluyveromyces

O local Sall do poliadaptador de pGB9O2 (ver Exemplo 3) foi eliminado por razões de con veniência. o vector pGB9O2 foi digerido parcialmente com Sall e em seguida incubado durante um curto período com Bal31 (Boebringer). Isolaram-se fragmentos lineares a partir de um gel de agarose, ligaram-se e usaram-se para transformar E. coli. Obteve-se um plasmídeo correcto, pGB9O3. Por meio de análise de restrição verificou-se

A fim de construir um plasmídeo contendo e expressando a proquimosina, digeriu-se o piasmídeo pGB9O3 com as endonucleases de restrição SalI e

BglII. Isolou-se o fragmento de ADN de 11 Kb a partir de um gel de agarose por electroeluiçao. De modo análogo, digeriu-se o plasmídeo pGBl24 contendo o gene da preproquimosina (ver ΞΡ-Α-ΟΟ96430, Exemplo 16) e isolou-se o fragmento Sall-BglII de 0,3 Kb contendo a parte N-ter minai do gene da preproquimosina.

Misturaram-se os fragmentos de ADN de 11 Kb e de 0,3 Kb, ligaram-se com ligase de ADN e usaram-se para transformar E» coli. Isolou-se o plasmídeo pGB904 que continha o gene de preproquimosina fundido a uma pequena parte do gene da lactase (Quadro 2).

QUADRO 2

Sequência nucleotídica na junção entre o promotor de lactase e a preproquimosina em pGB9O4 pGB9O4 lactase preproquimosina

ATG

TCTTGCCT¹

CGTCGACGAATTCATG

Sall EcoRI

A síntese da proteína inicia-se no codão ATG enquadrado.

Transformaram-se células de K. lactis CBS 2360 com pGB9O4 que tinha sido linearizado com SacII. Seleccionaram-se transformantes, cultivaram-se e analisaram-se para quantificar a actividade de qui- 26 -

mosina conforme descrito no Exemplo 2. No Quadro 3 seguinte é feita uma comparação entre a secreção de proqui-í mosina a partir de células K. lactis CBS 2360 transforma'

-das com pGB9O2 (ver Exemplo 3) e com pGB9O4. A produção) de (pro)quimosina é expressa em unidades arbitrárias por i ml de células a uma DC,_lr. de 200.

610 !

QUADRO 3

Secreção de proquimosina por células de K. lactis transformadas com pGB9O2 e pGB9O4

PGB9O2 pGB9O4

Transformante Sobrenadante Sólido Sobrenadante sólido

1	3,2	<0,4	22,4	1,7
2	1,3	<0,4	33,3	3,0
3	7,1	1,4	28,0	2,3
4	4,4	0,66	53,8	5,8

Exemplo 5

Secreção de proquimosina por Klyveromyces usando sequências guia heterólogas

A. -Síntese química de uma sequência--guia de amiloglucosidase e construção de um plasmídeo contendo a referida sequência guia V

Foi publicada por Innis

Science (1985) 228;21-26 uma sequência guia de sidade (AG) de Aspergillus awamori. Com base cia proteica derivaram-se oliginucleótidicos a mitir a inserção da sequência guia em frente do proquimosina (ver Figura 3).

et al., amilogluco na sequênfim de per gene de

Os oliginucleotídicos foram sinte tizados com um sintetizador de ADN da Applied Biosystems. Os oliginucleotídicos foram purificados por electroforese

num gel de poliacrilamida desnaturante e em seguida foram electroeluídos do gel.

O plasmídeo pGB9O3 (ver Exemplo J 4) foi cortado no local Sall singular. Os oligonucleótidos foram hibridados a 65°C, 50°C e 37°C durante uma hora em cada caso em 2xSSC. Os oligonucleótidos não tinham fosfato na extremidade 5' a fim de evitar a formação de multímetros. 0 ADN foi ligado no local Sall usando ligase de polinucleótido T4. A mistura de ligação foi trar formada em E♦ coli HBlOl. Cultivaram-se 24 colónias e isolou-se o ADN plasmídico. Verificou-se por análise por enzimas de restrição que um dos plasmídeos, pGByGb, tinha a orientação correcta dos oligonucleótidos. 0 plasmídeo pGB9O5 foi usado para transformar K. lactis CBS 2360. Analisou-se a produção de (pro)quimosina de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. No Quadro 4 apresentam-se os resultados da produção de (pro)quimosina em unidades arbitrárias/ml a uma DO, de 200.

QUADRO 4

Secreção de proquimosina por células de K. lactis transformadas com pGB9O2 e pGB9O5

PGB9O2 \ pGB9O5

Transformante Sobrenadante sólido Sobrenadante Sólido l_o 3,2 < O

2. 1,3 Z. O

3. 7,1 1

4. 4,4 0

4	60,6	Z 0,4
4	56,4	Z 0,4
4	56,7	0,4
66	57,6	0,4

B_o Síntese química de uma nova sequência guia sintética na construção de um plasmídeo contendo a nova sequêncic.

guia sintética

Preparou-se uma sequência guia sintética com uma sequência diferente de qualquer sequência guia conhecida. Por meio do uso desta sequência j guia, toda a proquimosina sintetizada foi segregada por J Kluyveromyces conforme se apresenta seguidamente. !

Esta sequência guia sintética foi projectada usando ácidos aminados de ocorrência frequente desde a posição -6 até 5 posição +2 do local de corte de sequência de sinal (Vón Heyne, Eur. J. Biochem. (1983) 133 :17-21) . Empregaram-se frequentemente codoês de ocorrência em leveduras e incorporaram-se nucleótidos extra em frente da sequência ATG a fim de abrir espaço para a supressão de 2b nucleótidos em pGB9O2. Os oligo nucleótidos usados e a sequência guia resultante são apre sentados na Figura 5.

O ADN da sequência guia sintética foi sintetizado usando um sintetizador de ADN da Applied Biosystems. Os oligonucleótidos resultantes foram feitos passar num gel de poliacrilamida de 40 cm de comprimento com 1 mm de espessura contendo tampão TBE (Tris 50 'mM, borato 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3) e ureia Ί M até a marca de Azul de Bromofenol ter migrado 2/3 do comprimen to' do gel. O ADN foi visualizado/' eluido a partir do gel e precipitado com etanol.

' Também se preparou um derivado de pGB90l com uma supressão em volta do local sall resu tante do poliadaptador de pUCl9. Este derivado foi pre parado por substituição do fragmento SnaBI-BglII de pGB9O3 pelo fragmento correspondente de pGB90l. O pias mídeo resultante foi cortado no local Sall singular. Hibridaram-se os oligonucleótidos a 65°c, 50°C e 37°c du rante uma hora em cada caso em 2xSSC. Ligou-se o ADN no local Sall usando ligase de polinucleótido T4. 0 plasmldeo foi em seguida usado para transformar E, coli

HBlOl

Das colónias obtidas, cultivaram-se 24 e isolou-se o ADN plasmídico. Verificou-se que um dos plasmídeos, pGB9O6, tinha os oligonucleótidos na posição correctai por digestão com enzimas de restrição. Constatou-se que a estirpe K. lactis CBS 2360 transformada com pGB9O6 segregava mais do que 95% da proquimosina produzida.

C. Análise da proteína quimosina produzida por K. lactis transformado com pGB9O5

Cultivaram-se transformantes de K. lactis CBS 2360 durante 3 dias a 30°C e colheram-se amostras dos sobrenadantes das culturas. Submeteram-se as amostras da proteína a electroforese num gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (Nature (1970) 2 2 7:680-685). Depositaram-se as proteínas num filtro de nitrocelulose de acordo com o método de Towbin et al., (proc. Natl. Acad. Sci> USA (1979) 76 : 4 3 50-4 3 54 ) . A proteína quimosina foi detectada por incubação do filtro com um anti-soro policlonal contra quimosina (Chr. Kansen), seguida por anticorposanti-coelho de asno acoplados a uma peroxidase (Amersham) e por fim com 0,6 mg/ml de 4-cloronaftol e 0,015 % de perôxido de hidrogénio numa solução tampão (Tris.HCl 50 mM a pH 7,5, 0,9 % de NaCl) contendo 40'% de metanol. A proquimosina excretada pela sequência de sinal AG é cortada correctamente ^:após tratamento a pH 2, conforme se demonstra por esta análise (Figura 5) Foram obtidos resultados semelhantes com transformantes de K. lactis CBS 2 3 60 (pGB906) .

Exemplo 6

Construção de plasmídeos contendo a sequência do factor de Saccharomyces cerevisiae para secreção eficiente

A. Plasmídeos de expressão do factor o( de Saccharomyces

1. Construção de plasmídeos

pDHlQO-PC; O material de partida foi o plasmídeo pGBl63 (ver ΣΡ-Α-ΟΟ96430, Exemplo 16. Cl). O plasmídeo pGBl63 foi digerido com BamHI e ligado a um adaptador Xbal-BamHI de guia do factor cx -proqui mosina. Tratou-se em seguida a mistura resultante com

PstI e isolou-se um fragmento de 96 pb que codifica para o local de processamento do pro-factor e para a região N-terminal da proquimosina. Isolou-se um fragmento de 1900 pb que codifica para a proquimosina bovina a partir do plasmídeo pJSlll após digestão com Pst I e Sall.

O plasmídeo pJSlll é um derivado do plasmídeo pBR322 contendo o gene da proquimosina de pGBl63 sob a regulação do promotor ADH-2 e o terminador de 3-fosfato de gliceraldeí do (GAPDH). O fragmento PstI a SalI de 1900 pb que foi removido continha o gene da proquimosina e o terminador de GAPDH. 0 promotor do gene 49 de GAPDH de levedura e o terminador de transcrição são essencialmente conforme descrito por Travis, J. Biol. Chem. (1985) 260:4384-4389.

Digeriu-se com Xbal e Sall o plasmídeo pDMlOO, contendo uma fusão do promotor de GAPDH o guia do factor <X de S♦ cerevisiae e um gene sintético para o -interferão flanquado por locais Xbal e Sall e pelo terminador do factor «k , tratou-se com fosfatase alc-alina e em seguida ligou-se aos -ffagmentos de 96 e de 1900 pb descritos anteriormente. O guia e o terminador do factor cA são essencialmente conforme dêscrito por Bra ke, Proc . Natl. Acad. Sei. USA (1984) 81:4462-4646. O plasmídeo resultante pDMlOO-PC foi isolado e continha uma fusão do promotor de GAPDH, o guia do factor e o gene da proquimosina. A sequência completa da inserção de BamHI é apresentada na Figura 6.

A fim de possibilitar a selecção dos transformantes de levedura, construiram-se dois plasmídeos, pKSlOO e pAB300.

pKSlOO: O plasmídeo pKSlOO foi construído por inserção em' pDMlOO-PC de um fragmento HindIII de 1170 pb de YEp24 contendo o gene URA3 de S. cerevisiae .

I pAB300: 0 plasmídeo pAB300 foi construído por inserção em pDMlOO-PC de um fragmento HindIII-Sall de 3500 pb de pGB90l contendo a região 3' do ge ne LAC4 de K. lactis e o marcador de resistência a G418.

A inserção BamI de GAPDH/factor o( /- proquimosina em pDMlOO-PC é ilustrada na Figura 6.

2. Transformação de K. lactis e de S. cerevisiae

Digeriu-se o plasmídeo pKSlOO no local BglII da região de codificação da proquimosina e usou-se este plasmídeo para transformar a estirpe K. lactis KRN2O1-6. Esta estirpe é derivada da estirpe 2UV21 (a lac4 trpl ura3 / Kil°_/ ) na qual o gene lac4 foi subs tituído pela fusão promotor de LAC4-gene da proquimosina de pGB90l. Deste modo, a integração de pKSlOO está dirigida para a região de codificação da proquimosina integrada. O plasmídeo pKSlOO foi também usado para transformar a estirpe S. cerevisiae ABllO (of ura3 leu2 his4 pep4-3 / cir°_7), neste caso dirigindo-se pára o local Sacil na região 3' do gene \de GAPDH. . ' \

' Os transformantes resultantes foram cultivados até à saturação em meio YEPD líquido e analisaram-se os sobreriadantes da cultura e os lisados célula res a fim de quantificar a actividade de quimosina após activação a pH 2. Conforme se pode verificar por meio dos resultados resumidos no Quadro 5 seguidamente, os trans formantes de K. lactis segregavam proquimosina de forma eficiente para o meio, enquanto que os transformantes de cerevisiae segregavam apenas uma pequena fracção da proquimosina produzida.

QUADRO 5

Produção de proguimosina em transformantes de

K. lactis e de S. cerevisiae

Estirpe	Actividade de quimosina (unidades relativas/ml de cult.} Extracto Sobrenadante
AB110	<0,2 5	<1,0
AB11O:PkslOO	15, 5	2,3
KRN2O1-6	<0,25	<1,0
KRN2O1-6	12,0	3 3 3,0

i

O plasmideo pAB300 foi usado para transformar a estirpe K. lactis 2UV21 para lhe conferir resistência a G41tí, dirigindo a integração para o local EcoRV na região 3' do gene LAC3. Verificou-se que estes transformantes segregavam também de modo eficiente proquimosina para o meio de cultura, conforme se mostra no Quadro 6 seguidamente.

QUADRO 6

Secreção de proguimosina por fusões factor <á/proquimosina

Estirpe hospedeira

Plasmideo de transformação

Actividade de quimosina segregada (unidades relativas/ml de cultura

2UV21	-	<2
KRN2O1-6	-	<2
KRN2O1-6	pKSlOO	3 85
2UV21	pKSlOO	294

- 33 H AHJiSJSiaiaea!

B. Construção das fusões promotor LAC4/guia do factor <x/proquimosina

A fim de produzir esta fusão, foram construídos dois intermediários. Digeriu-se parcial;

, i mente o plasmídeo pDMlOO-PC com Pst I, ligou-se a um adag tador SalI-PstI que codifica para uma porção do guia do factor o< e 29 pb da região 5’ do gene LAC4 e em seguida digeriu-se com HindIII. Isolou-se um fragmento de 1500 pb a partir desta mistura e em seguida clonou-se em pUCl8 digerido com HindIII e Sall a fim de se obter o plasmídeo pKSlO2.

Ligou-se um operador lac e Ξ. co li no local Sall em posição 5' imediatamente a seguir à sequência de codificação do guia do factor ®< no plasmídeo pKSlO2 a fim de preparar o plasmídeo pKSlO3. Procedeu-se deste modo porque a fusão promotor de LAC4/guia do factor of/proquimosina pode ser tóxica para E. coli.

'' Isolou-se um fragmento Sall-SglII de 490 pb de pKSlO3 e ligou-se a pJDl5R digerido por Sall ^BglII. 0 plasmídeo pJDl5R é derivado de pGB90l por supressão do local sall no poliadaptador pUCl9 por preenchi, mento a fim de se obter pJDl5 e em-séguida reclonagem do fragmento Xbal de 8800 pb na orientação oposta. Isolou -se o plasmídeo pKSlO5 a partir desta reacção. Estes plasmídeos' estão ilustrados na Figura 7.

Usou-se em seguida o plasmídeo pKSlO5 para transformar a estirpe K. lactis CBS 2360 a fim de conferir resistência a G418, usando o local SacII na região 5' de LAC4 como local visado para a transformação por integração. A produção de quimosina é expressa em unidades por ml de células a uma D0,_1n de 200, ver o J_ O

Quadro 7 apresentado seguidamente.

QUADRO 7

Secreção de proquimosina por células de K._lactis transformadas com pKSSlO5*

Transformante	Sobrenadante	Sólido
1	111	3,3
2	147	4,5
3	124	3,7
4	125	3,0
* Actividade de	quimosina em unidades relativas/ml de cul-
tura.
Exemplo 7
Construção de p	lasmídeos contendo a	sequência do factor o<

de Kluyveromyces lactis para secreção eficiente

A. Isolamento e utilização da sequência de sinal do factor cX de K» lactis

Levaram-se a efeito análises biológicas dos sobrenadantes de culturas conforme descrito (Juílius et al. , Cell (1983) 32;839) usando para estirpe de ensaio a estirpe S. cerevisiae Mat a sst2-3 RC687. Cul tivou-se a estirpe K, lactis CBS 141 (<*) num meio constituído por 0,5 % de glucose, 0,17 % de base de azoto de levedura sem sulfato de amónio (Difco) e 0,002 % de sulfato de amónio. Depois de separação das células por centrifugação, adicionou-se ácido acético ao sobrenadante da cultura até uma concentração de 0,1 Me passou-se o sobrenadante através de uma coluna de BioRex 70 (Biorad). Lavou -se uma coluna com ácido acético O,1 M e em seguida eluiu-se o factor com etanol a 80 %/HCl 10 mM_o Evaporou-se o eluído até â secura e em seguida dissolveu-se em ácido trifluoroacêtico a 0,1 % (TFA)/20 % de acetonitrilo e

aplicou-se a uma coluna de guarda de HPLC de fase inversa Lavou-se a coluna por fases com soluções contendo 0,1 % de TFA e 20 %, 40 %, 60 % e 80 % de acetonitrilo. A fra| cção de 60 %, contendo a actividade do factor °<, foi em seguida aplicada a uma coluna analítica de HPLC-18 e foi eluída com um gradiente de acetonitrilo de 20 % a 80 % em 0,1 % de TFA. Reuniram-se as fracções e analisaram-se para quantificação da actividade do factor °< . As fracções contendo o factor foram secas e submetidas a análise de sequência de ácidos aminados.

B. Selecção por hibridação de bancos de plasmídeos

Marcaram-se conjuntos de oligonucleótidos usando Y 32p_/-ATP e quinase de polinucleáti_ dos T4. Estas sondas oligonucleátidas foram usadas para sondar manchas de Southern ou colónias de bactérias a 42° C na seguinte solução de hibridação: 4xSSC, KF^PO^ 50 mM a pH 7,1 % de sarcosil, 10 % de sulfato de dextrano, 200 /ig/ml de ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons e desnaturação. Lavaram-se os filtros em 2xSSC com 0;l % de SDS a 4 2°C.

Procedeu-se a escrutínio com estas sondas por inoculação de transf-ormantes da estirpe E. coli HBlOl d.e um banco de plasmídeos no vector pJSlO9 contendo inserções resultantes de uma digestão limitada com Sau3AI do ADN genómico da estirpe K. lactis SDll ( a trpl lac4) fraccionado em função da dimensão a fim de purificar fragmentos de dimensão 5000 pb a uma densida de de 500 a 2000 colónias por placa de 80 mm com agar L contendo 100 ^tg/ml de ampicilina. Transferiu-se o ADN das colónias para filtros de nitrocelulose e hibridaram-se estes filtros conforme descrito anteriormente. Retiraram-se partes sobre estas placas originais correspondentes a regiões de sinais de hibridação sobre os filtros e em seguida reinocularam-se noutras placas e analisaram -se de novo por hibridação a fim de isolar colónias sim36

pies com plasmídeos contendo as sequências de hibridação. ι As colónias positivas foram analisadas novamente por análise de mancha de Southern de ADN purificado a partir de pequenas culturas.

Digeriram-se plasmídeos purificados a partir de colónias de hibridação positivas com uma varie dade de enzimas de restrição e analisaram-se os fragmentos resultantes por análise de mancha de Southern usando as mesmas sondas de hibridação a fim de identificar fragmentos de restrição de dimensão adequada para análise de sequência de ADN. Os rragmentos assim identificados foram identificados por electroforese em gel de agarose e foram cionados em vectores apropriados MP18 e MP19. Levou-se entSo a efeito uma análise de sequência de ADN.

C. Isolamento do factor cx de Kluyveromyces

Os primeiros 10 ácidos aminados do factor de K. lactis apresentam uma homologia precisa ao de S. cerevisiae -com 6 resíduos idênticos. Esta sequência é apresentada em seguida;

Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln

Esta sequência proteica foi usada, para projectar um conjunto de oligonucleótidos deduzidos a fim de Eerem complementares do gene estrutural para o gene estrutural correspondente, conforme se apresenta na Figura 8. ' Sintetizaram-se oligonucleótidos incluindo tn dos os codões possíveis para um segmento do peptideo do factor cx sob a forma de dois conjuntos de 96 e 48 molécu las diferentes.

Foi introduzida uma marcação radio activa nestes dois conjuntos usando Y-/~~32p 7-ATP e quinase de polinucleótido T4 e usou-se cada um destes conjun tos para sondar uma mancha de Southern de misturas da digestão de ADN de K. lactis. O conjunto n⁹. 2 deu uma

hibridação forte com um único fragmento e uma hibridação muito mais fraca com um segundo fragmento em várias misturas de digestão diferentes. Deste modo, o conjunto nú mero 2 foi escolhido para escrutinar os bancos de plasmídeos do ADN genómico de K. lactis.

A utilização destas sondas para escrutinar os bancos de plasmídeos deu como resultado o isolamento de vários clones de hibridação. Por análise de sequência de um estes clones, ©( fkltíb, verificou-se que este clone codifica para um peptídeo relacionado com o factor que apresenta uma semelhança muito acentuada com o precursor do peptídeo do factor de S. cerevisiae 0 segmento que apresenta hibridação foi localizado num fragmento PstΙ-EcoRI de cerca de 100C pb. A sequência deste fragmento é apresentada na Figura 9. O precursor de K. lactis contém apenas 2 locais para a adição de cadeias de hidratos ligadas em N. Além disso, os espaçadores das restrições de K. lactis são mais compridos do que os das repetições de S. cerevisiae e apresentam uma sequência mais variada com o padrão X-Ala/Pro em vez das sequências Glu/Ala-Pro que se encontram em S. cerevisiae♦ Uma comparação das sequências de ADN apresenta um forte grau de homologia na região de codificação.

D. Construção dos plasmídeos :

\

Construiram-se uma série de plasmídeos (apresentados na Figura 10) a fim de proporcionar uma fusão do guia do factor cK de K. lactis à proquimosi na expressa sob a regulação de transcrição de um promotor forte.

pAB3O7; Modificou-se um fragmento SspI-EcoRI de 673 pb de °<fkl8b (Figura 9) por preenchimento das extremidades desalinhadas EcoRI por enzima de Klenow e adição de adaptadores BglII às extremidades ali nhadas. Inseriu-se em seguida este fragmento num local do

BglII unindo as regiões do promotor e do terminador gene da de-hidrogenase de gliceraldeido-3-fosfato de S. cerevisiae (GAFDH). Este conjunto integrado foi clonado num fragmento BamHI em pUCl8, dando como resultado em pAB3O7.

pAB3O9: Foi em seguida levada a efeito a fusão de sequências que codificam para o guia ©< e para a proquimosina bovina. Em primeiro lugar digeriu -se pAB3O7 com Ncol e as extremidades coesivas foram tornadas alinhadas por tratamento com nuclease de Phaseolus aureus (raung bean). O produto resultante foi em segui da digerido com Sall. Ligou-se ao produto digerido um fragmento EcoRI-SalI de 2000 pb contendo sequências que codificam para a proquimosina e a região terminal de trans T criçao de S. cerevisiae. Este fragmento foi derivado | do plasmídeo pJSlll a que foi adicionado um adaptador Xbal -BamHI à extremidade 5' de um fragmento contendo ADNc de proquimosina fundido à região de terminação de transcrição GAPDH de S. cerevisiae. Esta mistura de ligação foi usai da para transformar a-estirpe Ξ. coli HBlOl e isolou-se um transformante contendo o plasmídeo pAB3O9. As sequências adjacentes da junção desta fusão são apresentadas na Figura 11 e a sequência da inserção BamHI-SalI completa de pÁB3O9 é apresentada na Figura 12-. '* pAB312; A fim de sé obter a transformação de estirpes de K. lactis _z inseriu-se um fragmento HindIII de 3560 pb derivado de pGB9Cl em pAB3O9 dando origem ao plasmídeo pAB312. 0 fragmento HindIII contém a região 3¹ do gene LAC4 de K. lactis e uma fusão do promotor ADHl de S_o cerevisiae para o gene bacteriano de resistência estrutural a G418.

pAB313 e pAB314: Isolou-se um fragmento SacI-HindIII de 1900 pb de pAB3O9 e clonou-se em MP19 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103). Pre parou-se ADN fágico de cadeia simples e utilizou-se como

gos M13 MPl9/o(kll.5 e MP19A12.2 foram preparados usando!

o Iniciador kl e o Iniciador *2, respectivamente.

Preparou-se ADN RF de dupla ca- ! deia a partir destes fagos e isolaram-se fragmentos Sacl-StuI de 1100 pb a partir de cada fago. Estes fragmentos foram ligados a um fragmento SacI-StuI de 7100 pb de pAB312. Os plasmídeos resultantes pAB313 e pAB314 foram isolados com as alterações de sequência que se ilustram na Figura 13.

E. Transformação de Kluyveromyces

Digeriu-se o plasmídeo pAB312 com EcoRV (a fim de dirigir a integração para a região LAC4 do genoma de K. lactis) e em seguida utilizou-se para transformar a estirpe K. lactis 2UV21 (a^ ura3 trpl / Kil°_/) para conferir resistência a G418. Utilizaram-se os plasmídeos pAB313 e pAB314 para transformar a estirpe 2UV21 a fim de conferir resistência a G418. Fizeram-se crescer culturas de transformantes 2UV21;:pAB312, 2UV21::pAB313 e 2UV21::pAB314 e analisaram-se os sobrenadantes das culturas para quantificar a actividade de quimosina como anteriormente.

\

Cultivaram-se alguns destes trans formantes, bem como uma estirpe não transformada para com paração, durante 36 horas em 1 ml de meio constituído por 1 % de extracto de levedura, 2 % de peptona, 2 % de gluco se, 0,71 % de base de azoto de levedura, 50 jug/ml de triptofano e 50 pg/ml de uracilo. Em seguida analisaram -se os sobrenadantes da cultura para quantificar a activi dade de quimosina após activação por ácido. Verificou-se que todos os transformantes segregavam quimosina, activável. Os resultados são apresentados no Quadro 8 seguinte .

Quadro 8

Secreção de proquimosina em Kluyveromyces

Est irpe	Hospe deiro	Plasmí deo	Actividade de quimosina | (unidades relativas/ml de cul-4 tura)
2UV21	2UV21		<2
KRN3O3-1	2UV21	pAB312	256
KRN3O4-4	2UV21	pAB313	175
KRN3O5-2	2UV21	pAB314	206

Verificou-se que cada um dos transformantes segregava uma única espécie relacionada conji quilosina, de acordo com análises de electroforese em qel de poliacrilamida SDS de sobrenadantes das culturas precipitadas por ácido tricloroacético. Veriticou-se que a proteína relacionada com proquimosina segregada por transformantes com pAB312 tinha um peso molecular ligeiramente meis elevado do que as segregadas por transformantes com pAB313 e pAB314, de acordo com determinações de mobilidade electroforética.

_s Purificaram-se as espécies maioritárias segregadas por KRN3O3-1 e KRN3O4-4'' por electrofo rese em gel de poliacrilamida SDS e submeteram-se a análise de sequência de ácidos aminados em fase gasosa. As sequência N-terminais destas espécies são apresentadas em seguida.

KRN-303-1

IO 15

Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-Kis-Met-Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile-Pifo

Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile

Estes resultados indicam que a espécie relacionada com a proquimosina segregada por KRN3O3 -1 não sofreu qualquer processamento da sequência espaçadora amino-terminal, enquanto que a espécie segregada por KRN3O4-4 possui a extremidade terminal da proquimosina autêntica madura.

Exemplo 8

Secreção de t-PA por Kluyveromyces lactis usando uma sequência de sinal de amiloglucosidase

A. Clonagem de ADNc de activador de plasminogénio de tipo de tecido

Obteve-se um ADNc de codificação para o activador de .plasminogénio de tipo de tecido (t-PA' de modo semelhante ao descrito por Pennica et al., (Nature (1983) 301: 214) . Por análise de sequência de ADN e por mapeamento de restrição confirmou-se a autenticidade do ADNc de t-PA. para estudos de ..expressão utilizou-se o fragmento BglII de 2,0 kb (ver pennica et al.) contendo quase integralmente a região de codificação para a pro teína madura e a região 3' não codificante.

B. Introdução do marcador de resistência a G418 em pUC!9

Inseriu-se um fragmento de ADN con tendo o gene Tn5 (Reiss et al. , EMBO J. (1984) .3 :3317) que confere resistência a G418 sob a direcção do promotor de de-hidrogenase I de álcool (ADHI) de S. cerevisiae se melhante ao descrito por Bennetzen e Hall, J. Biol. Chem. (1982) 257;3018, no local Smai de pUCl9 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33:103). O plasmídeo obtido, pUCG418,

é apresentado na Figura 14. Depositou-se E, coli contendo pUCG418 no Centraal Bureau voor Schimmelcultures em 4 de Dezembro de 1987 sob o número CBS 872.87.

C. Construção de pGBtPAl

Construiu-se o plasmideo pGBtPAl (ver também Figura 15 e Quadro 9) contendo os seguintes elementos:

(1) pUCG4l8 (ver acima) cortado com Xbal e Hindiii;

(2) o fragmento Xbal-Sall de pGB9Ol contendo o promotor de lactase;

(3) ADN sintético que codifica para a sequência de sinal de amiloglucosidase de Aspergillus awamori (Innis et al., Science (1985) 228; ;21). Escolheu-se a sequência à frente do codão de início a fim de eliminar o local Sall na extremidade do fragmento promotor de lactase, contendo ainda parte da região 5' não'codificante do gene de lactase;

(41 o fragmento BglII de 2,0 kb de ADNc de t-PA (ver acima);

(5) ADN sintético contendo parte da região 3' não codificante do gen‘é da lactase.

QUADRO 9

Repbesentação esquemática do plasmideo pGBtPAl

Xbal v

......pUCG418..........TCTAGA.....lactase promotor.....

.......GTCGATCATCGAGAACTGAAAGATATGTCTTGCCTTATGTCTTTCAGA

TCCCTACTAGCTCTATCCGGTCTAGTTTGTACTGGTCTAGCTAACGTTATCTCCAAGAG τι

Sall BglII BglII

V V V

AGTCGACAGATCT.........t-PA cADN......AGATCTGATATGAATTTATACT

TAGATAAGTATGTACTTAGATAAGTATGTACTTACAGGTATATTTCTATGAGATACTGA

HindIII v

TGTATACATGCATGATAATATTTAAAGCTT

A síntese proteica inicia-se no co dão ATG sublinhado.

D. Transformação de Kluyveromyces lactis e análise dos transformantes

Levou-se a efeito uma transformação da estirpe K. lactis CBS 2360 com pGBtPAl conforme descrito no Exemplo 2. Cultivaram-se os transformantes e a estirpe de comparação CBS 2360 em meio YEPD durante cerca de 64 horas a 30°C. Separaram-se as células do meio de cultura por centrifugação. Ressuspenderam-se as células numa solução de sal fisiológica a uma D0^^₀ ^e desintegraram-se por agitação com esferas de vidro durante 3 minutos num agitador de Vortex à velocidade máxima. Os resíduos celulares foram eliminados _por centrifugação.

Efectuou-se uma análise por lise de coágulo de acordo com Wallen et al. (Biochim. Biophys. Acta (1982) 719:318) em placas de microtitulação. Prepa rou-se uma solução contendo tampão de fosfato 15 mM (pH 7,3), 0,2 CU/ml de plasminogénio, 1,5 mg/ml de fibrinogénio e 0,04 % de gelatina. Em cada alvéolo de uma placa de microtitulação misturaram-se 10 jul de trombina (13,9 unidades NIH/ml), 25 yul de amostra e 65 pl da solução de plasminogénio/fibrinogénio. Seguiu-se a reacção por medi ção da DO^ ç-q a intervalos de 30 min. Usou-se t-PA de células de melanoma (Kabi Vitrum) a fim de se obter uma curva de calibração em cada placa de microtitulação.

O Quadro 10 apresenta o resultado de uma análise típica de 10 transformantes. Estes resul tados demonstram que se encontrou t-PA no maio de cultura de K. lactis transformado com pGBtPAl.

QUADRO 10

Análise de lise de coágulo das culturas de CBS 23 60 e de CBS 2360 transformado com pGBtPAl

Transformante actividade de t-PA no sobrenadante

1		40	fjg/i
2		6	/ug/1
3		4. 3	/ug/1
4		4.3	pg/i
5		25	pg/i
6		3	/ag/i
7		3	pg/l
8		4 3	/ug/1
9		3	/jg/1
10		< 3	/ug/1
CBS. 2 3 60	12)	< 3 .	/ug/1
CBS 2360	22)	< 3	/jg/i
CBS 2360	3 2)	< 3	/ug/1
CBS 2360	42)	< 3	/ug/1
CBS 2360	' 52)	< 3	pg/i

Sm alguns dos extractos celulares encontrou-se uma ligeira actividade de t-PA (<. 3 ^ig/1) .

A análise foi também levada a efeito em geis de SDS-poliacrilamida com uma camada superior de um gel de agarose de plasminogénio/fibrina de acordo com Granelli-Piperno e Reich (J. Exp. Med. (1978) 148:223

- 4b -

ra de CBS 2360 ou de CBS 2360, transformada com pGBtPAl í e ressuspendeu-se o precipitado em 20 jul de tampão de a- i mostra (Tris.HCl 62,5 mí: a pH 6,8, 2 % de dodecilsulfato ' de sódio, 10 % de glicerol, Azul de Bromofenol). Espalha ram-se as amostras sobre os geis sem fervura prévia. Os resultados (apresentados na Figura 16) demonstram a secre-;

í ção de t-PA humano por K. lactis. Para além disso, veri-j ficou-se que a maior parte do material segregado se encontrava glicosilado.

A secreção de t-PA foi também con firmada usando uma técnica de ELISA com um anticorpo monoclonal contra t-PA humano (ESP5 adquirido a Biopool) e por uma análise de actividade cromogénica (um ensaio comer ciai de Kabi Vitrum).

Exemplo 9

Secreção de t-PA por Kluyveromyces lactis usando a sequência de sinal da albumina de soro humano

A. Construção de pGBtPA2

Construiu-se por meio de um reduzido número de fases de clonagem o vector pGBtPA2 (ver Figura 17 e Quadro 11) contendo os seguintes elementos:

(1) pUCG41tí cortado com Xbal e HindlII;

(2) ·' o fragmento Xbal-Sall de pGB90l contendo o pro motor de lactase;

(3) ADN sintético que codifica para a região prepro da albumina de soro humano;

(4) o fragmento Bgll de 2,0 kb do ADNc de t-PA (ver Exemplo tí);

(5) ADN sintético contendo parte da região 3’ não codificante do gene da lactase.

QUADRO 11

Representação esquemática do plasmideo pGBtPA2

Xbal v

..........pUCG418..........TCTAGA. .......lactase promotor

.............GTCGACAAAAAATGAAGTGGGTTACCTTCATCTCCTTGTTGTTCTT

B21II v

GTTCTCCTCCGCTTACTCCAGAGGTGTTTTCAGAAGAGGTGCTAGATCT..........

EcoRV

BglII Xhol

V V V t - PA cDNA.....................AGATCTGATATCTCGAGAATTTATACTTA gataagtatgtacttacaggtatatttctatgagatactgatgtatacatgcatgataa

HindiII v

TATTTAAAGCTT.............

A síntese proteica inicia-se no codao sublinhado.

B. Transformação de K. lactis e análise dos transformantes

A transformação de CBS 2360 com pGBtPA2 foi levade a efeito conforme desdrito no Exemplo 4. Cultivaram-se os transformantes e a estirpe de çompa ração e trataram-se conforme descrito no exemplo anterior Os resultados da análise de lise de coágulo estão resumidos no Quadro 12.

- 47 QUADRO 12

Análise de lise de coágulo das culturas de CBS 23 60 e de CBS 2360 transformado com pGBtPA2 transformante actividade de t-PA no sobrenadant

1	25	pg/i
2	25	yug/l
3	<3	/ug/1
4	<3	A*g/i
5	6	pg/i
6	12	pg/i
7	<3	^g/i
8	43	pg/i
9	<3	^g/l
10	<3	fjg/i
CBS 2360 1-)	<3	^g/i
CBS 2360 22)	<3	pg/l
CBS 2360 35)	<3	fig/i
CBS 2360 42)	<3	/ug/1
CBS 2360 52)	<3	/ug/1

Em alguns dos extractos celulares encpntrou-se.uma ligeira actividade de t-PA ( < 3 ^ug/1).

\

Exemplo 10

Secreção de albumina de soro humano por Kluyveromyces lac tis

A. Síntese e clonagem do ADNc de ASH

Preparou-se ADNc que codifica par albumina de soro humano de acordo com o método de Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. (1982) 2.: 161) usando ARNm prepa rada a partir de fígado humano. Clonou-se o ADNc num vector derivado de pBR322 e usou-se para transformar E.

coli₀ Levou-se a efeito uma selecção dos transformantes usando um oligodesoxirribonucleótido baseado na sequência do ADNc da ASH de Lawn et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:61C3). O clone de ADNc seleccionado foi parcialmente sequenciado e comparado com a sequência de Lawn et al.. Esta comparação revelou que os 5 primeiro nucleótidos da região de codificação da preproASH não estavam presentes mas que o local BstEII nos nucleótidos 9 a 15 da região de codificação se encontrava ainda no seu lugar. Utilizou-se este local BstEII e o local HindIII na região 3 ' não codificante (ver Lawn et al. referido anteriormente) para subclonagem em vectores de expressão.

B. Construção de pGBHSAl

Construiu-se por meio de um reduzido número de fases de clonagem o vector pGBHSAl contendo os seguintes elementos:

(1) pUCG4T8 (ver Exemplo 8) cortado com Xbal e Hind ui;

(2) o fragmento Xbal-Sall de pGB9Ol (ver Exemplo 1);

(3) ADN sintético (fragmento SalI-HindIII) contende parte da região 3' não codificante do gene da lactase.

A sequência deste fragmento é apresentada no Quadros_13;

\

QUADRO 13

Sequência do fragmento sall - HindIII de pGBHSAl

EcoRV

Sall Notl BglII Xhol v v v v v

TCGACGCGGCCGCAGATCTGATATCTCGAGAATTTATACTTAGATAAGTATGTACTTACA

GCGCCGGCGTCTAGACTATAGAGCTCTTAAATATGAATCTATTCATACATGAATGI

HindIII v

GGTATATTTCTATGAGATACTGATGTATACATGCATGATAATATTTAA

CCATATAAAGATACTCTATGACTACATATGTACGTACTATTATAAATTTCGA

EcoR V e inseriu-se ADN sintético: j

Sall BstEII StuI

V V V

TCGACAAAAATGAAGTGGGTAACCATCGATAGGCCTACTGGGCTCGAGATC

GTTTTTACTTCACCCATTGGTAGCTATCCGGATGACCCGAGCTCTAG

O codão ATG sublinhado indica o codão de início da construção de expressão definitiva (pGB HSA3, ver seguidamente).

plasmídeo resultante foi designa do por pG3HSA2.

D. Construção de pGBHSA3

Cortou-se o clone de ADNc da ASH com HindIII e preencheu-se a extremidade coesiva usando polimerase I de ADN de Klenow. Em seguida cortou-se o ADN com BstEII e purificou-se o fragmento BstEII-HindIII (preenchido) contendo a região de codificação da ASH quase completa. Digeriu-se o plasmídeo pGBHSA2_;com Xbal, preencheram-se as extremidades coesivas usando polimerase I \

de ADN de Klenow e levou-se a efeito uma digestão com BstEII. Inseriu-se o fragmento de codificação da ASH (BstEII-HindIII (preenchido)) no vector resultante. 0 plasmídeo resultante, pGBHSA3, é apresentado na Figura 18.

E. Transformação de Kluyveromyces lactis e análise dos transformantes

Levou-se a efeito a transformação da estirpe K. lactis 2360 com pGBHSA3 conforme descrito no Exemplo 2. Cultivaram-se os transformantes e a estir- 50 -

pe de comparação CBS 2360 em meio YEPD durante cerca de 64 horas a 30°C. Separaram-se as células do meio de cul tura por centrifugação. Colheram-se amostras de 30 /al dos sobrenadantes e analisaram-se por electroforese num gel de poliacrilamida a 10 % de acordo com Laemmli (nature 227, 680 (1970)). Os resultados apresentados na Figu ra 19 demonstra que a ASH é segregada para o meio de cultura por célula de K. lactis transformadas por pGBHSA3. Existe também uma indicação de que a secreção de outras proteínas é reduzida nas células produtoras de ASH.

Os resultados anteriores demonstram que é possível obter uma expressão eficiente e conveniente de genes exógenos em estirpes de Kluyveromyces. Para além disso, verifica-se que as estirpes de Kluyveromyces são particularmente úteis para proporcionar uma se ereção e o processamento de alta eficácia de uma grande variedade de proteínas, conforme ilustrado pelos resultados com proquimosina. Proporcionam-se construções e vec tores que permitem a introdução de um gene exógeno sob a regulação de promotores eficientes em Kluyveromyces e, se assim se pretender, ligam-se a sequências de sinal que possibilitam a translocação do gene exógeno, particularmente a secreção. Deste modo, proporciona-se um sistema dè fermentação para produção comercial de uma ampla va riedade de proteínas exógenas sob uma forma activa ou activável.

Os seguintes organismos foram depositados na American Type Culture Collection em 30 de Junho de 1987; 2UV21, Numero de acesso ATCC 2o855; KRN201. -6, Número de acesso ATCC 20854; HBlOl pAB3O7, Número de acesso ATCC 67454; HBlOl pAB312, Numero de acesso ATCC 67455.

tenha sido

Se bem que a presente invenção descrita com algum pormenor por meio de ilustração e de exemplos com a finalidade de clareza de compreensão, é óbvio que podem ser praticadas algumas alterações e modificações no âmbito das reivindicações em ane xo.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 19 Processo para a preparação de um polipeptídeo de interesse numa célula hospedeira Kluyvero myces caracterizado por compreender as fases de:

   - introdução na referida célula hospedeira de uma sequência de ADN que codifica para o re ferido polipeptídeo de interesse e

   - crescimento da referida célula hospedeira contendo a referida sequência de ADN num meio de cultura, sendo o referido polipeptídeo de interesse, ou uma parte deste, segregado para o meio de cultura.

   - 2á Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de ADN ser uma parte de uma construção de ADN que é introduzida na referida célula hospedeira e conter, na direcção da transcrição, uma região de regulação de inicio de transcrição funcional na referida célula hospedeira, de tal mo do que a referida sequência de ADN codifica para o referi do 'polipeptídeo, e uma região de regulação de terminação de transcrição funcional na referida célula hospedeira.

   ' - 33 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se ligar em concordância no quadro de leitura à extremidade 5' da referida sequência de ADN uma sequência de sinal hteróloga em relação à referida célula hospedeira ou ao referido polipeptídeo de interesse ou ao referido hospedeiro e ao referido polipeptídeo de interesse, sendo o referido poli peptídeo de interesse segregado pela referida célula hos53 pedeira

   - 43 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido po lipeptídeo de interesse ser uma enzima.

   - 53 Processo de acordo com a reivin dicação 4, caracterizado por a referida enzima ser quimosina ou um seu precursor.

   - 63 Processo de acordo com a reivin dicação 4, caracterizado por a referida enzima ser activa dor de plasminogénio de tecido (t-PA) ou formas mutantes deste.

   - 73 Processo de acordo com qualquer das- reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido po lipeptídeo de interesse ser albumina de soro humana (HSA)

   - 83 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a referida cé lula hospedeira ser uma estirpe industrial de Kluyveromyces .

   - 93 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a referida cé lula hospedeira ser K. lactis ou K. fragilis,

   - 10^a Processo de acordo com a reivindi. cação 2, caracterizado por a construção de ADN referida conter adicionalmente pelo menos um marcador de selecção ou um sistema de replicação para replicação autónoma da referida sequência de ADN ou uma sequência para aumento da eficiência da transformação.

   - llâ Processo de acordo com a reivind cação 10, caracterizado por o referido sistema de replic ção ser uma sequência que se replica autonomamente (ARS).

   - 125 Processo de acordo com a reivindi cação 11, caracterizado por a referida sequência que se replica autonomamente ser uma sequência que se replica au t.onomamente de Kluyveromyces (KARS) .

   - 13 5 , 1

   Processo de acordo _xcom a reivindi cação 10, caracterizado por o referido marcador de selecção ser a resistência a G418.

   - 14 5 Processo para a preparação de um polipeptídeo caracterizado por se transformar Kluyveromyces, se provocar a expressão dos genes estranhos e se pro vocar a secreção do polipeptídeo codificado pelo referido gene ou a secreção de parte do referido polipeptídeo.

   Processo para a preparação de uma célula hospedeira caracterizado por compreender as fases de se integrar um bloco integrado de expressão que contém na direcção da transcrição uma região de regulação de iní cio de transcrição funcional na referida célula hospedeira ligada em concordância de quadro de leitura com uma se quência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição funcional na referida célula hospedeira.

   - 16 3 Processo de acordo com a referida reivindicação 15, caracterizado por a referida sequência de sinal ser heteróloga em relação à referida célula hospedeira ou ao referido polipeptídeo de interesse ou ao referido hospedeiro e ao referido polipeptídeo de inreres se.

   - 173 Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida sequência de sinal ser a sequência de sinal do factor O<^! de Saccharomyces cerevisiae.

   - 183 Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida sequência de sinal ser a sequência de sinal da amiloglicosidase de Aspergillus awamori_o

   - 193 56

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 18 caracterizado por o teferido polipeptídeo de interesse ser quimosina ou um ser precur sor. t-PA ou HSA.

   - 20^ê Processo de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 19, caracterizado por conter em ligação ao referido bloco integrado de expressão pelo menos um marcador de selecção, um sistema de replicação para a replicação autónoma da referida sequência de ADN ou uma sequência de aumento da eficiência da transformação.

   - 2ia Processo de acordo com a reivindi cação 20, caracterizado por o referido sistema de replica ção ser uma sequência que se replica autonomamente (^RS).

   - - 22 3 ' Processo de acordo com a reivindi cação 21, caracterizado por a referida sequência que se replica autonomamente ser uma sequência que se replica autonomamente de\Kluyveromyces (KARS). ' ' - 23â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 20 a 22, caracterizado por o referido marcador de selecção ser a resistência a G418.

   - 243 Processo para a preparação de uma construção de ADN para utilização numa célula hospedeira de Kluyveromyces caracterizado por conter;

   - na direcção da transcrição, uma região de regulação de início de transcrição funcional na referida célula hospedeira, uma sequência de sinal funcio nal na referida célula hospedeira ligada em concordância de quadro de leitura com uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo de interesse e uma região de regu lação de terminação de transcrição funcional na referida célula hospedeira.

   - 253 processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida sequência de sinal ser heteróloga em relação à referida célula hospedeira ou se referido polipeptídeo'de interesse ou ao referido hospedeiro e ao referido polipeptídeo de interesse.

   - 26e Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2-4 ou 25, caracterizado por se integrar em ligação com o referido bloco integrado de expressão pelo menos um marcador de selecção, um sistema de replicação para a replicação autónoma da referida construção de ADN- ou uma sequência de aumento da -eficiência da transformação. X. ¹

   - 273 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 24 ou 26, caracterizado por a sequêncie. de ADN codificar para a sequência de sinal e o polipeptídeo de interesse estar fundida em concordância de quadro de leitura com um gene que se expressa em Kluyveromyces.

   - 283 58

   Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a referida sequência de ADN es tar fundida com uma segunda sequência de ADN que codifica para pelo menos quatro ácidos aminados da extremidade N-terminal do gene da lactase. j

   - 29® das reivindicações 24 a de ADN obtida ser um dos ou pGBHSA3.

   processo de 28, caracter plasmídeos acordo com qualquer izado por a construção pKSlG5, pGB9Ol, pGBTPA

   0.

   - 30® Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o polipeptídeo de interesse referido ou a parte deste ser isolado a partir do meio de cultura.