CN1059236C - 脆壁克鲁维酵母的高效转化系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的脆壁克鲁维酵母基因-26SrRNA基因片断序列；利用该序列构建的重组多核苷酸载体；可被该载体转化的脆壁克鲁维酵母受体菌株以及脆壁克鲁维酵母完整细胞的高效转化方法。以上内容构成脆壁克鲁维酵母的高效转化系统，它可以利用缺陷基因功能补偿作为转化子筛选的手段，因而具有操作简便、费用低廉、转化率高的优点。作为本发明的例子是用于在脆壁克鲁维酵母的典型菌株或其ura3^-突变菌株中高效获得稳定的抗氨基葡糖苷G418或尿嘧啶合成基因功能补偿的转化菌株。

Description

脆壁克鲁维酵母的高效转化系统

本发明属生物基因工程技术领域，涉及一种利用新的脆壁克鲁维酵母基因构建的重组多核苷酸载体和可用于该载体转化的脆壁克鲁维酵母受体菌株，以及脆壁克鲁维酵母高效的转化方法。

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyecs fragilis)是食品工业中一种重要的生产菌株，它传统地应用于生产乙醇、乳糖酶和单细胞蛋白等产品。近年的研究发现，这种酵母菌具有生长迅速、生物量大、营养要求简单和蛋白分泌能力强的生理特点。因此它具有被发展成为一种能大量表达异源蛋白的基因工程生产菌株的潜在价值。

要把脆壁克鲁维酵母发展成一个生产异源蛋白的基因工程生产菌株，首先必须建立脆壁克鲁维酵母的转化系统。一个转化系统最基本的组成要素包括：1.合适的受体菌株；2.适合于这个菌株的重组载体；3.便于分离筛选转化子的选择标记；4.将该载体引入受体细胞的有效方法。

虽然在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyecs lactis)的某些菌株中(Bianchi，M.M.et al Current Genetics 1987，12：185-192)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyecs marxianus)的某些菌株中(Iborra，F.Current Genetics 1993，24：181-183)已建立了高效的转化系统，但到目前为止尚未发现有人报道在脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyecs fragilis CBS 397)中建立起高效的转化系统(通过光盘检索1966-1996年间的Medline)。

Das，S等人在J.Bacteriology(1984)158：1165-1167中叙述了脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyecs fragilis C 21)的转化方法。但是他们使用的载体是pGL2，采取的是原生质体转化法，得到的转化效率非常低(20个转化子/每10微克质粒DNA)。Chen，X.J.等人在Current Genetics(1989)16：95-98中报道了用pKD1衍生质粒转化多种酵母菌株的研究，其中包括对脆壁克鲁维酵母K.fragilis CBS 397，K.fragilis ATCC 36907和Saccharomycesfragilis ATCC 12424的转化尝试。结果在上述三个菌株中都没得到转化子。

以往人们未能在脆壁克鲁维酵母建立起高效转化系统的主要原因有以下几方面：1.没有合适的受体菌株；2.缺乏理想的载体；3.缺少有效的选择标记；4.没有适合于脆壁克鲁维酵母的高效转化方法。这些都是建立脆壁克鲁酵母高效转化系统的难点所在。国际上长期以来在脆壁克鲁维酵母中未能建立起高效的转化系统，严重限制了它在遗传工程中的应用价值。

本发明的目的在于建立一种能够解决上述难点的脆壁克鲁维酵母高效转化系统。

发明者应用现代分子遗传学的理论和方法针对上述难点开展研究，最终很好地解决了这些问题，并创立了脆壁克鲁维酵母的高效转化系统。其中包括：

(1).构建了合适的脆壁克鲁维酵母营养缺陷型受体菌株K.fragilis HKY0039；

(2).利用脆壁克鲁维酵母的26S rRNA基因片断构建了脆壁克鲁维酵母整合型载体pPru16(X1)和pGEr-11；

(3).建立了利用上述载体对脆壁克鲁维酵母典型菌株和基因突变菌株的高效转化方法。

具体地说，本发明提出的脆壁克鲁维酵母高效转化系统包括适合于高效转化的脆壁克鲁维酵母受体菌株、用于该菌株的重组多核苷酸载体以及将该载体引入脆壁克鲁维酵母受体菌株的高效方法。其中：

(1).所述的受体菌株为脆壁克鲁维酵母的典型菌株Kluyveromyecs fragilis CBS 397和其突变菌株Kluyveromyecsfragilis HKY0039(CCTCC编号为No.M97003)。

(2).所述的重组多核苷酸载体为带有脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因片断序列的pPru16(X1)(CCTCC No.M97005)和pGEr-11(CCTCCNo.M97004)之任一种。

(3).所述的转化方法是利用上述重组多核苷酸载体转化脆壁克鲁维酵母典型菌株Kluyveromyecs fragilis CBS 397或其突变菌株Kluyveromyecs fragilis HKY0039(CCTCC编号为No.M97003)并得到转化菌株的方法。

下面对本发明内容进一步作具体说明

1.构建了合适的营养缺陷型受体菌株K.fragilis HKY0039

以往人们在进行脆壁克鲁维酵母细胞的转化研究时，由于没有现成的营养缺陷型受体菌株可供利用，所以不得不用带有抗生素抗性基因(如抗G418的基因Tn903)的载体去转化脆壁克鲁维酵母的野生型菌株。因为G418(Geneticin)是一种氨基糖苷类抗生素，不同的菌株对它的天然抗性有很大差异。当用量不足时，许多非转化菌落也混杂于转化子中间；而当用量过多时，由于其药物的毒性作用，许多真正的转化子也难以生长，导致转化频率偏低。所以在转化子的筛选中使用并不方便。此外，G418价格昂贵，而且需依赖进口，实非一般单位长期使用所能承受。

根据前人的研究，一定浓度的5-氟乳清酸(5-fluorooroticacid，5-FOA)能抑制野生型酵母菌的生长，而不影响某些尿嘧啶合成基因突变(如：ura3，ura5)酵母菌株的生长(Boeke，J.D.et al.，Mol.Gen.Genet.1984，197：345-346)。本发明利用酵母菌的这个生理特点，对脆壁克鲁维酵母的典型菌株(Kluyveromyecsfragilis CBS 397)进行了突变改造，得到了它的突变菌株K.fragilis HKY0039(CCTCC No.M97003)。这个突变菌株的遗传特点是带有嘧啶合成代谢途径中ura3基因功能缺陷的表型。它的乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶(orotidine-5’-P decarboxylase，4.1.1.23)是没有功能的。因此它在没有尿嘧啶(uracil)的合成培养基中不能生长。这就首次在脆壁克鲁维酵母中建立了一个营养缺陷型受体菌株。利用它可以非常简便、有效地在合成培养基上筛选转化细胞。因为只要通过转化方法把带有正常URA3基因的载体引人该营养缺陷型受体细胞，就能依靠基因功能补偿的作用使被转化细胞获得在无尿嘧啶的合成培养基上生长的能力。所以，本发明构建的K.fragilis HKY0039菌株是至今第一个可以在合成培养基上通过基因功能补偿作用进行转化子筛选的脆壁克鲁维酵母受体菌株。它的建立为创建脆壁克鲁维酵母的高效转化系统奠定了有利的基础。

K.fragilis HKY0039突变菌株的构建与鉴定方法如下：

1).突变菌株的构建

将YEPD培养基中培养20小时的脆壁克鲁维酵母(K.fragilisCBS 397)细胞用无菌NS溶液洗涤。然后悬浮于NS溶液，置于一块无菌培养皿中。在无菌室内打开培养皿盖子，用230nM波长的紫外线灯照射。取被照射过的菌液，转接入YEPD培养基内，于30℃摇床培养12-14小时。细胞经NS溶液洗涤后，均匀涂布在SDUF选择培养基，置于28-30℃恒温培养箱内培养7-10天。凡能在SDUF选择培养基上生长的菌落就是发生了尿嘧啶合成基因突变的细胞。

2).突变菌株的鉴定

对得到的突变菌株必须作进一步检验，以排除杂菌污染的可能。这些检验包括：细胞显微形态的观察，细胞生长谱的验证和回复突变率的测定等。此外，由于有两种尿嘧啶合成基因的突变(ura3和ura5)都可产生这种表型，而我们需要的只是ura3基因突变菌株，所以还需用带URA3基因的载体去转化已得到的这些突变菌株。只有能经该载体转化得到转化子的菌株，才是真正的ura3基因突变菌株。本突变菌株鉴定所用的转化载体pPrul6(X1)和转化方法都是本发明的组成部分(下详)。

经过上述所有步骤的鉴定结果表明，我们成功地构建了脆壁克鲁维酵母的ura3基因突变菌株K.fragilis HKY0039。

脆壁克鲁维酵母ura3基因突变菌株K.fragilis HKY0039的特征如下：

1.在显微镜下，YEPE培养基中生长的细胞形态以椭圆形为主，间或有少量卵园形和园筒形细胞。细胞以出芽方式增殖，生长旺盛的细胞通常有1-2个或更多的芽体。

2.在YEPD固体培养基上生长的菌落形态为白色或乳白色园形突起，表面光滑。

3.能以乳糖为唯一碳源生长。在以乳糖为唯一碳源的固体培养基上培养时间长的菌落中心突起，边缘略有扇形沟槽。

4.不能在缺尿嘧啶的酵母基本培养基上生长。

5.能在含0.005％尿嘧啶和0.1％ 5-氟乳清酸的酵母基本培养基上生长。

6.该菌ura3基因的回复突变频率为10^-8。所用培养基及试剂成分：YEPD培养基：2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，

           1％酵母抽提物(yeast extract)

   NS溶液：0.85％氯化钠(NaCl)SDF选择培养基：0.7％酵母基础氮源(yeast nitrogen base w/o

           amino acids)，2％葡萄糖(glucose)，0.005％尿嘧

           啶(uracil)，0.1％5-氟乳清酸(5-FOA)

2.构建了脆壁克鲁维酵母整合型载体pPru16(X1)和pGEr-11

以往人们在进行脆壁克鲁维酵母细胞的转化研究时使用的载体主要是游离型的穿梭质粒载体。它主要由DNA复制系统，选择标记和一些用于克隆的限制性核酸内切酶位点构成。它一般含有大肠杆菌和酵母菌这两种不同的DNA复制系统，因而能在这两种不同的宿主中复制。其中，酵母的复制系统可来源于酵母染色体或酵母天然质粒的自我复制序列(Autonomours Replicating Sequences，ARS)。而选择标记则必须与被转化菌株的基因型相匹配。如果没有现成的营养缺陷型受体菌株可供利用，就不得不用抗生素抗性基因作为选择标记。例如，Das，S等人使用的载体pGL2就是借用来源于乳酸克鲁维酵母染色体的ARS。而Chen，X.J.等人使用的pKD1衍生质粒则利用了果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)天然质粒pKD1的DNA复制系统。这两种复制系统在实际使用中都表现出较强的宿主专一性。即，在不同的酵母宿主中它们的DNA复制效率有明显的差异。这也是前人在转化脆壁克鲁维酵母时，或是转化频率极低，或是根本得不到转化子的重要原因之一。此外，他们都是利用G418抗性基因作为选择标记，这也增加了转化子筛选的难度。

本发明在构建用于转化脆壁克鲁维酵母的新型载体时，采取了不同与前人的技术路线。这主要体现在以下两个方面：

1).采用脆壁克鲁维酵母的rRNA基因片段序列作为介导载体与受体细胞基因组DNA之间进行整合的靶序列    酵母的rRNA基因在每个细胞的基因组中大约有150-200份拷贝。因此，利用rRNA基因片段构建成的整合载体就能利用它所携带的rRNA基因片段与受体细胞基因组内的rRNA基因之间发生同源重组，从而介导该载体有效地整合到受体细胞染色体上并随染色体DNA同步复制。这种类型的整合载体以往曾在酿酒酵母(Lopes，T.S.et al.，Gene 1989，79：199-206)和乳酸克鲁维酵母的转化中报道过(Ronald，J.M.et al.，CurrentGenetics 1992，21：365-370)，但至今未在脆壁克鲁维酵母转化中报道过。其原因之一，是因为至今没有其他人克隆到脆壁克鲁维酵母的rRNA基因；其原因之二，是因为至今没有其他人建立起高效的脆壁克鲁维酵母转化方法。众所周知，整合转化频率要比一般转化频率低得多，没有高效的转化方法是很难得到整合型转化子的。我们利用现代分子生物学的DNA重组技术克隆到了脆壁克鲁维酵母的26SrRNA基因片段，测定了它的核苷酸序列(见附图1)，并首次成功地用它构建了脆壁克鲁维酵母的整合型载体pPru16(X1)和pGEr-11。

A.脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因的克隆方法：

制备脆壁克鲁维酵母典型菌株K.fragilis CBS 397的基因组总DNA，经DNA限制性内切酶EcoR I酶切后，先用琼脂糖凝胶电泳分离，再印渍转移到硝酸纤维素膜上，以放射性同位素α-³²P dATP标记的酿酒酵母26S rRNA基因片段作为探针进行分子杂交。根据杂交信号确定脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因在胶上的位置，割胶回收该区域的DNA并与克隆载体连接，转化大肠杆菌。用酿酒酵母26S rRNA基因片段作为探针杂交筛选阳性克隆转化子，并对该克隆进行DNA抽提、纯化和DNA序列测定。将测定结果与酿酒酵母26S rRNA基因序列进行同源性比较。结果表明我们成功地克隆到了脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因中一个3.9kb的EcoR I片段。

B.脆壁克鲁维酵母整合型载体pPru16(X1)的构建：将脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因3.9kb EcoR I片段用DNA限制性内切酶BamH I和Bgl II同时酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离并回收约1.2kb rDNA片段，与已经BamH I酶切并去磷酸化的载体pPU连接(pPU是我们以pUC19质粒为基本框架构建的含有酿酒酵母URA3基因的质粒载体)构建成脆壁克鲁维酵母整合型载体pPru16(X1)(CCTCC No.M97005)，其结构见附图2。该载体适合于转化脆壁克鲁维酵母ura3基因突变菌株，它具有以下特征：

1.该载体为5.5kb的双链环状DNA。

2.带有脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因片段作为酵母整合转化时介导载体与受体细胞染色体DNA之间同源重组的靶序列。

3.带有酿酒酵母的URA3基因，作为酵母转化时的选择标记。

4.带有氨卞青霉素抗性基因，作为大肠杆菌转化时的选择标记。

5.带有大肠杆菌质粒ColE 1的复制起始区，使该载体能在大肠杆菌中高拷贝地扩增。

6.带有多个可用于分子克隆操作的DNA限制性内切酶单切位点，如：Bam HI，EcoR I，Sac I，Sma I，Sal I和Sph I等。

7.用Xba I将该载体切成线性后再转化酵母，可大幅度提高转化频率。

C.脆壁克鲁维酵母整合型载体pGEr-11的构建：

将脆壁克鲁维酵母26S rDNA基因3.9kb EcoR I片段用DNA限制性内切酶BamH I和Bgl II同时酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离并回收约1.2kb rDNA片段，与已经BamH I酶切并去磷酸化的载体pGE连接(pGE是我们以pUC19质粒为基本框架构建的含有G418抗性基因的质粒载体)构建成脆壁克鲁维酵母整合型载体pGEr-11(CCTCCNo.M97004)，其结构见附图3。该载体适合于转化脆壁克鲁维酵母野生型菌株，它具有以下特征：

1.该载体为4.9kb的双链环状DNA。

2.带有脆壁克鲁维酵母26S rRNA基因片段作为酵母整合转化时介导载体与受体细胞染色体DNA之间同源重组的靶序列。

3.带有G418抗性基因，作为酵母转化时的选择标记。

4.带有氨卞青霉素抗性基因，作为大肠杆菌转化时的选择标记。

5.带有大肠杆菌质粒ColE 1的复制起始区，使该载体能在大肠杆菌中高拷贝地扩增。

6.带有多个可用于分子克隆操作的DNA限制性内切酶单切位点，如：Bam HI，EcoR I，Sac I，Sma I，Sal I和Sph I等。

7.用Nco I将该载体切成线性后再转化酵母，可大幅度提高转化频率。

2).采用酿酒酵母的URA3基因作为选择标记    酿酒酵母的URA3基因已被证明能在多种宿主的ura3基因缺陷株中产生功能补偿作用，因此许多酵母转化系统的载体都采用它作为选择标记。用URA3基因作为选择标记的优点在于：(1).便于转化    酿酒酵母的URA3基因很小，只有1.1kb。因此不会象某些选择标记那样过于增大载体规模以致影响到细胞对载体DNA的摄入效率。(2).便于筛选    带URA3基因的载体被引入ura3基因缺陷细胞后，便通过功能补偿作用使受体细胞获得在无尿嘧啶合成培养基上生长的能力。因此凡是转化之后能在该培养基上生长的受体细胞就是真正的转化子。不会发生在使用抗性选择标记时经常出现的由于抗生素加入量过多或过少而引起转化结果含糊不清的状况。(3).便于使用    利用URA3基因作为转化的选择标记，其选择培养基的配制非常简便。只需在蒸馏水中加入适量的酵母基本氮源和碳源即成。无须其他任何价格昂贵的添加物。尽管用URA3基因作为选择标记有诸多优点，然而至今没有其他人报道在脆壁克鲁维酵母转化系统中用它作为构建载体的选择标记。原因在于要利用URA3基因作为载体的选择标记，必须具备一个不可缺少的前提条件。即必须先要有ura3基因缺陷的受体菌株可资利用。本发明通过对脆壁克鲁维酵母典型菌株K.fragilis CBS 397进行改造得到了ura3基因功能缺陷的脆壁克鲁维酵母突变菌株K.fragilis HKY0039，这为在脆壁克鲁维酵母转化系统中利用URA3基因作为选择标记提供了重要的前提条件，为创建脆壁克鲁维酵母的高效转化系统奠定了有利的基础。

3.建立了利用前述载体对脆壁克鲁维酵母典型菌株和突变菌株的高效转化方法

对于酵母与真菌类低等真核生物细胞的转化，目前国际上常用的有三种方法。即原生质体转化法、电击转化法和完整细胞转化法。这三种方法各有利弊。原生质体法的优点是转化频率较高，不需要特殊的仪器设备。缺点是操作步骤繁琐，通常需要4-5个小时，并且影响转化成败的因素很多，技术要领也较难掌握。其中酶解细胞壁的处理是关键，酶处理过度或不足都会严重影响转化结果。整个细胞转化操作过程必须在低温和等渗透压的条件下进行。另外，转化子的生长也很缓慢，通常需5-7天才能观察到结果。电击转化法的优点是简便省时，操作过程通常只需2小时左右，只要所选定的条件得当，一般可以达到很高的转化频率。此法的不足之处，一是需要配备特定的仪器设备。二是对细胞预处理和电冲击的条件控制要求很严格，而这些因素在不同细胞的转化条件中各不相同，较难掌握，常常导致转化的失败。完整细胞转化法是一种最简便有效的酵母细胞转化方法。它既不需要对细胞进行酶解处理，也不需要特定的仪器设备。整个转化过程通常只需2小时即可完成。转化子的生长也较快，一般只需2-3天就能观察到结果。不足之处是它的转化频率往往不如前面两种方法的高。而且，不同的酵母细胞对转化条件的要求也各不相同。处理不好易造成转化失败。以上三种方法在乳酸克鲁维酵母转化中的应用都已有报道(Bianchi et al.，1987，Curr.Genet.12，185-192；Meilhoc，E.，et al.，1990，Bio/Teohnology 8，223-227.Sanchez etal.，1993，Appl.Environ.Microbiol.59，2087-2092.Menart & Bolotin-Fukuhara in“Genetics，Biochemistry，and Molecular Biology of Non-Conventional Yeasts”editedby K.Wolf(Springer Verlag)p.30)。然而，以往人们在进行脆壁克鲁维酵母细胞的转化时，都是采用原生质体转化法(Das，S.etal.，J.Bacteriology 1984，158：1165-1167.Chen，X.J.etal.，Current Genetics 1989，16：95-98)，结果转化频率很低或没有转化子。这除了有上面已经分析过的受体细胞和载体两方面的原因以外，没有掌握脆壁克鲁维酵母细胞转化的最佳条件也是一个很重要的原因。

本发明在深入研究分析了各种不同酵母转化方法的利弊后，根据脆壁克鲁维酵母的特点对以往的酵母完整细胞转化法加以改进。创立了利用前述载体对脆壁克鲁维酵母的高效转化方法。其操作过程主要分为四个步骤：

1).脆壁克鲁维酵母受体菌的培养

2).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备

3).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化

4).脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选

下面分别对这些步骤中影响脆壁克鲁维酵母转化效率的主要因素和具体操作进行说明：

1).脆壁克鲁维酵母受体菌的培养

脆壁克鲁维酵母受体菌的培养是制备高质量感受态细胞的前提。用于转化的细胞处于何种生长状态，对于转化效率有重要影响。通常情况下，细胞接种于培养基后，其生长过程先后经历了延迟期、对数期、稳定期和衰亡期这样几个阶段。因为在不同的生长阶段中，细胞代谢和分裂的状态不同，细胞壁的结构组份也有不同的变化。因此，并非任何生长阶段的细胞都是最适于进行转化的。只有处在某一特定生长期的细胞才适合于制备感受态细胞。细胞生长周期中的这一转化最适时态是依被转化物种和所用转化方法的不同而异的。例如，有的菌适合于在对数期制备感受态细胞，而有的菌适合于在稳定期等等，各不相同。对于每一种菌都需要通过周密的研究才能找到其转化的最适生长时态。我们的研究结果发现，脆壁克鲁维酵母细胞转化的最适生长时态是在稳定期。当细胞培养至OD₆₀₀ 5-6(每毫升约5×10⁷细胞)时制备感受态细胞的效果最佳。

2).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备

脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备是决定转化成败的重要因素之一。这一步骤主要是利用某些化学试剂在一定温度条件下作用于受体细胞，使细胞壁结构发生一定程度的细微变化，因而处于一种易于吸附和摄取DNA的感受状态。在目前通用的各类转化方法中，常用的主要试剂是某些碱性阳离子(如钙、锂、铯等)的盐溶液。这些盐溶液的种类和浓度也是影响转化效率的重要因素。因此，必须依据被转化细胞的物种品系不同，通过一系列实验研究找到对该菌转化最适合的试剂进行处理。例如，目前对大肠杆菌转化常用的条件是以0.1M氯化钙溶液在冰浴作用。Ito，H.等用于转化酿酒酵母完整细胞的方法(Ito，H.et al.，Journal of Bacteriology 1983，153：163-168)和Das，D.等用于转化脆壁克鲁维酵母完整细胞的方法(Das，S.et al.，Journal of Bacteriology 1984，158：1165-1167)中都是使用0.2M氯化锂与70％聚乙二醇4000在30℃作用。

本发明根据脆壁克鲁维酵母的特点，采取在冰浴条件下先用1.2M山梨醇、二硫苏糖醇和氯化镁等试剂处理，再用0.1-0.4M醋酸锂与40-70％聚乙二醇4000进行处理的步骤。山梨醇溶液的作用是使细胞处于高渗透压环境下。二硫苏糖醇能修饰酵母细胞壁上的甘露糖蛋白复合物，改变其完整性，使胞壁产生微孔，利于高分子量的DNA穿透，具有保护载体DNA分子，减少其被核酸酶降解和促进细胞吸收DNA的作用。

3).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化

酵母的转化是通过感受态细胞对载体DNA的摄入实现的。在这一过程中，作用于细胞的温度和时间是影响转化成败的重要因素。本发明根据脆壁克鲁维酵母的生理特点，先使细胞在冰浴作用30-60分钟，然后再加入载体DNA在40-45℃作用20-60分钟可达到最佳转化效果。

4).脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选

转化细胞的筛选方法对转化效率有直接的影响。而筛选方法是取决于被转化细胞的遗传背景和所用转化载体的选择标记的。目前在酵母细胞转化中，对于野生型菌株的转化通常必须用抗菌素进行筛选。转化子细胞由于摄入了带有抗性基因的载体DNA，因而能在含有一定浓度抗菌素的选择培养基上生长。常用于酵母转化子筛选的抗菌素有G418和放线菌酮等。但因抗菌素对细胞的生理影响较大，因此转化效率往往较低。对有基因功能缺陷的酵母突变菌株(如his3，lys2，trp1等)，则可以通过基因功能补偿的方法进行筛选。例如，通过转化将带有正常基因(如HIS3，LYS2，TRP1等)的载体导入相应的酵母突变细胞，就能使被转化细胞获得载体上正常基因功能的补偿。由于这种方法对于细胞的正常功能没有影响，因而转化效率通常较高。本发明构建的两种脆壁克鲁维酵母整合型载体pGEr-11和pPru16(X1)分别带有G418抗性基因和酵母URA3基因这样两种选择标记，因而可用于具有不同遗传背景的脆壁克鲁维酵母菌株的转化。

本发明的转化方法中所用培养基和化学试剂的成分如下：

1.受体菌培养使用YEPD液体培养基：2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeast extract)。

2.脆壁克鲁维酵母ura3基因突变菌株(K.fragilis HKY0039)转化筛选使用SD固体培养基：0.7％酵母基础氮源(yeast nitrogenbase w/o amino acids)，2％葡萄糖(glucose)，1.5％琼脂(agar)。

3.脆壁克鲁维酵母的典型菌株(K.fagilis CBS 397)转化筛选使用含G418的YEPD固体培养基：2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeast extract)，1.5％琼脂(agar).抗菌素G418的使用详见“脆壁克鲁维酵母完整细胞转化方法”。

4. 1.2M山梨醇溶液：21.8g山梨醇(sorbitol)溶于87ml无菌双重蒸馏水。

5. 1M二硫苏糖醇溶液：154.3mg二硫苏糖醇(dithiothreitol)，溶解于1ml无菌双重蒸馏水，经0.2μm微孔泸膜过泸除菌。

6.TM溶液：2.5mM三羟基氨基甲烷(Tris)pH8.0，2mM氯化镁(MgCl₂)。

7.LAP溶液：40％聚乙二醇4000(polyethylenglycol 4000)，0.2M醋酸锂(LiAc)。

8.变性小牛胸腺DNA：10mg小牛胸腺DNA溶解于1ml无菌双重蒸馏水，经超声波变性处理。

9.用于转化的载体DNA纯度应为电泳纯，浓度应为每微升0.2-0.5μg之间，每次转化用量范围以0.2-1μg之间为宜，过多或过少都会影响转化效果。

以上所有培养基和试剂(除1M二硫苏糖醇溶液)都应经过15磅，20分钟湿热灭菌处理。实施例一脆壁克鲁维酵母突变菌株Kluyveromyecs fragilis HKY0039的转化：(一).脆壁克鲁维酵母受体菌的培养

1.接种脆壁克鲁维酵母突变菌株Kluyveromyecs fragilisHKY0039于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培养基中，30-37℃摇床培养至OD₆₀₀ 5-6，细胞数约5×10⁷/每毫升。

2.取1.5毫升培养物在台式离心机于15,000rpm离心，弃去上清液。

3.用无菌蒸馏水洗涤细胞两次。(二).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备

1.细胞悬浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫苏糖醇溶液，混合均匀。置于冰浴10分钟以上。

2.反应物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

3.细胞悬浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羟基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化镁)，在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

4.细胞悬浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分钟。

5.反应物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

6.细胞悬浮于50微升1M二硫苏糖醇溶液，混合均匀后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸锂，40％聚乙二醇4000)，混合均匀。(三).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化

1.每个转化反应管中依次加入100微升感受态细胞，50微克变性小牛胸腺DNA，1微克转化载体DNApPru16(X1)。混合均匀后置于42℃，30分钟。

2.转化物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

3.用无菌蒸馏水洗涤细胞一次，然后将细胞悬浮于100微升无菌蒸馏水。(四).脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选

1.把转化细胞均匀涂布于酵母固体选择培养基(0.7％酵母基础氮

  源，2％葡萄糖，1.5％琼脂)上。

2.置30℃恒温培养箱中，三天后即可观察结果。实施例二脆壁克鲁维酵母典型菌株Kluyveromyecs fragilis CBS 397的转化：(一).脆壁克鲁维酵母受体菌的培养

1.接种脆壁克鲁维酵母典型菌株Kluyveromyecs fragilis CBS397于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培养基中，30-37℃摇床培养至OD₆₀₀ 5-6，细胞数约5×10⁷/每毫升。

2.取1.5毫升培养物在台式离心机于15,000rpm离心，弃去上清液。

3.用无菌蒸馏水洗涤细胞两次。(二).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备

1.细胞悬浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫苏糖醇溶液，混合均匀。置于冰浴10分钟以上。

2.反应物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

3.细胞悬浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羟基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化镁)，在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

4.细胞悬浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分钟。

5.反应物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

6.细胞悬浮于50微升1M二硫苏糖醇溶液，混合均匀后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸锂，40％聚乙二醇4000)，混合均匀。(三).脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化

1.每个转化反应管中依次加入100微升感受态细胞，50微克变性小牛胸腺DNA，1微克转化载体DNApGEr-1。混合均匀后置于42℃，30分钟。

2.转化物在台式离心机于5,000rpm离心5分钟，弃去上清液。

3.用无菌蒸馏水洗涤细胞一次，然后将细胞悬浮于100微升无菌蒸馏水。(四).脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选

1.把转化细胞均匀涂布在预先制备的酵母YEPD固体培养基底层平板上，再在其上覆盖一层(约10ml，45℃保温)YEPD固体培养基。待凝固后，置30℃恒温培养箱中培养12-24小时。然后在上层培养基表面均匀涂布一定量的G418溶液，使整块转化平板的终浓度达到每毫升200微克。

2.置30℃恒温培养箱中，三天后即可观察结果。本发明的优点可以概括如下：

1.由于构建了适合脆壁克鲁维酵母高效转化的受体菌株HKY0039，

  因而可以在脆壁克鲁维酵母中利用缺陷基因功能补偿作为转化

  子筛选的手段。

2.克隆并利用了脆壁克鲁维酵母的26S rDNA基因片断作为介导

  载体与受体细胞基因组之间进行同源整合的靶序列，因而可得

  到拷贝数多、稳定性好的整合型转化子。

3.利用上述受体菌株和载体建立了适合于脆壁克鲁维酵母的高效

  转化方法。该方法具有操作简便，费用低廉，效果优良的特

  点。

使用本发明提供的高效转化系统可以使脆壁克鲁维酵母的转化频率大幅度超过前人的结果，具体可见下表。表1.本发明与前人方法对脆壁克鲁维酵母转化效率的比较

菌    株	载体	选择标记	转化方法	转化子数/x ug DNA
					K.fragilisATCC 36907	pCXJ-Kanl	G418	原生质体法	0/5ug ofplasmid DNA
S.fragilisATCC 12424	pCXJ-Kanl	G418	原生质体法	0/5ug ofplasmid DNA
					K.fragilisCBS 397	pCXJ-Kanl	G418	原生质体法	0/5ug ofplasmid DNA
K.fragilisC 21	pGL2	G418	完整细胞法	20/10ug ofplasmid DNA
					K.fragilisHKY0039	pGEr-11	G418	完整细胞法	5000/1ug ofplasmid DNA
K.fragilisHKY0039	pPru16(X1)	URA3	完整细胞法	5000/1ug ofplasmid DNA

图1为脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyecs fragilis CBS 397)26S核糖体RNA基因片断的脱氧核糖核酸(DNA)序列。图2为脆壁克鲁维酵母整合型载体pPru16(X1)结构图。图3为脆壁克鲁维酵母整合型载体pGEr-11结构图。

Claims (12)

1、一种适用于高效转化的脆壁克鲁维酵母菌株HKY0039，其保藏号为CCTCC M97003。

2、一种脆壁克鲁维酵母高效表达载体pPru16-X1，其包含于脆壁克鲁维酵母CCTCC M97005中。

3、一种脆壁克鲁维酵母高效表达载体pGEr-11，其包含于脆壁克鲁维酵母CCTCC M97004中。

4、一种适用于脆壁克鲁维酵母的高效转化方法，其特征在于利用载体pPru16-X1或pGEr-11转化脆壁克鲁维酵母典型菌株Kluyveromyecs fragilis CBS397或其突变菌株Kluyveromyecs fragilis HKY0039，并得到转化菌株。

5、根据权利要求2或3所述的脆壁克鲁维酵母高效表达载体，其特征在于带有脆壁克鲁维酵母中的26 S rRNA基因片断序列，该基因片断序列是利用分子克隆技术从脆壁克鲁维酵母基因组中克隆到的。

6、根据权利要求5所述的脆壁克鲁维酵母高效表达载体，其特征在于脆壁克鲁维酵母的26 S rRNA基因片断序列构成该重组多核苷酸载体的组成部分。

7、根据权利要求2或3所述的脆壁克鲁维酵母高效表达载体，其特征在于带有至少下述之一种选择标记：功能补偿基因URA3和抗G418的基因。

8、根据权利要求4所述的适用于脆壁克鲁维酵母的高效转化方法，其特征在于操作步骤如下：

(1)脆壁克鲁维酵母受体菌的培养；

(2)脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备；

(3)脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化；

(4)脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选。

9、根据权利要求8所述的适用于脆壁克鲁酵母的高效转化方法，其特征在于所述脆壁克鲁维酵母受体菌的培养，是将脆壁克鲁维酵母典型菌株或脆壁克鲁维酵母突变茵株HKY0039接种于YEPE培养基，培养至OD₆₀₀ 5-6，细胞数约5×10⁷/每毫升。

10、根据权利要求8所述的适用于脆壁克鲁酵母的高效转化方法，其特征在于所述脆壁克鲁维酵母感受态细胞的制备，是在冰浴条件下，先用1.2M的山梨醇、二硫苏糖醇和氯化镁等试剂处理，再用0.1-0.4M醋酸锂与40-70％聚乙二醇4000进行处理。

11、根据权利要求8所述的适用于脆壁克鲁酵母的高效转化方法，其特征在所述脆壁克鲁维酵母感受态细胞的转化，是先使细胞在冰浴作用30-60分钟，然后再加入载体DNA在40-45℃作用20-60分钟。

12、根据权利要求8所述的适用于脆壁克鲁酵母的高效转化方法，其特征在于所述脆壁克鲁维酵母转化细胞的筛选，是通过酵母URA3基因的功能补偿作用或抗G418基因的抗G418作用实现的。

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