CN1179037C - 生产高分子量聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种 - Google Patents

生产高分子量聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌Chungkookjang变种 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗盐的枯草芽孢杆菌chungkookjang变种，保藏号KCTC0697BP，其分离自“chungkookjang”，一种传统的韩国发酵大豆酱，还涉及它的聚-γ-谷氨酸(poly-gamma-glutamic acid)(或聚-γ-谷氨酸(poly-gamma-glutamate)，γ-PGA)，一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的高分子量聚合物。枯草芽孢杆菌chungkookjang变种产生比其它源自普通的芽孢杆菌属种各菌株的细胞外γ-PGA的分子量高的γ-PGA。因此，由枯草芽孢杆菌chungkookjang变种产生的该γ-PGA可被用来开发高增值的产品，如化妆品，吸收剂，和可生物降解的塑料材料。

Description

生产高分子量聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌chungkookjang变种
技术领域
本发明涉及抗盐的枯草芽孢杆菌chungkookjang变种，保藏号为KCTC0697BP，其源自“chungkookjang”，一种传统的韩国发酵大豆食品，还涉及产自所述菌株的聚-γ-谷氨酸(poly-gamma-glutamic acid)(或聚-γ-谷氨酸(poly-gamma-glutamate)，在下文中称为γ-PGA)，其为一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的聚合物。特别地，本发明涉及一种新的枯草芽孢杆菌菌株和产自所述枯草芽孢杆菌菌株的γ-PGA，该菌株可从一种酶复合体产生一种细胞外的γ-PGA，该酶复合体由(1)D-氨基酸转氨酶EC 2.6.1.21，在下文中称为“D-AAT”，其将D-氨基酸的氨基基团转移到酮酸中，(2)谷氨酸消旋酶EC 5.1.1.3，在下文中称为“GluRA”，和丙氨酸消旋酶，在下文中称为“AlaRA”，它们催化自丙氨酸和谷氨酸的异构体的形成，和(3)γ-PGA合成酶构成。
如同图1所说明的，很多酶参与该γ-PGA的合成。
背景技术
γ-PGA是一种由χ-谷氨酰基结合的D，L-谷氨酸组成的粘的聚合物，其产自从传统的发酵大豆食品，如来自韩国的“chungkookjang”，来自日本的“纳豆(natto)”，和来自尼泊尔的“kinema”中分离的芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)菌株。产自这种杆菌属种菌株的γ-PGA是一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的聚合物(分子量：100～2,000kDa)，其可用作为吸收剂，吸湿剂，化妆品原料，和用于通过合成酯衍生物来制造自然地可降解的塑料。
近来，很多研究已集中在γ-PGA的生产和应用上，尤其在发达国家。迄今，研究人员已积极地尝试开发代替不可降解的聚合物的材料和生产通过酯反应获得的抗热塑料，可溶纤维，和膜等。另外，伴随着使用桥式粘合剂的水凝胶的开发和工业化，也已进行了由γ-辐照导致的γ-PGA的物理变化的研究。例如，已完全地报道了γ-PGA的组合物，影响γ-PGA生产的锰离子的作用，用于通过超声波破碎降解的可溶解的聚合物和通过酯衍生物的合成获得的低可溶解的塑料的用途(生物科学.生物技术.生物化学.，(Biosci.Biotechnol.Biochem.)，60(8)：1239-1242，1996)，和在枯草芽孢杆菌中生产γ-PGA，和钙溶解剂作为健康食品来治疗骨质疏松症(日本公开专利号Hei.6-32742)。而且，也已公开了基于减少水系统中磷酸盐含量来减少水污染(欧洲专利号838160)，通过辐照高速制备凝胶，卫生产品，包括用具有吸水特性的可生物降解的吸附树脂制备的尿布，食品，在园艺业中的应用(日本公开专利号Hei.10-251402)，和它的实际用途(日本公开专利号Hei.7-300522，日本公开专利号Hei.6-322358)。而且，已报道了通过溶解，沉淀和干燥，使用γ-PGA作为固化的可生物降解的纤维或薄膜和薄膜形成剂的用途(日本公开专利号Hei.7-138364，和日本公开专利号Hei.5-117388)，适合于药物载体的聚合物(日本公开专利号Hei.6-92870，日本公开专利号Hei.6-256220)。
其间，韩国也进行了包括有效生产γ-PGA(韩国专利申请号1997-3404；韩国专利申请号1997-67605)和改善它的物理特性的研究。同时，Pacific公司从枯草芽孢杆菌纳豆菌株中生产γ-PGA，并将它作为化妆品和其它实际应用的一种原料。
发明公开
本发明人已从“chungkookjang”，一种传统的韩国发酵大豆酱中分离了一种抗盐菌株，枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(Bacillus subtilis var.chungkookjan)，并证实从所述的枯草芽孢杆菌菌株可产生高水平的γ-PGA，一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的聚合物，从而成功地完成本发明。
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌chungkookjang变种菌株，其产生一种抗盐的，高分子量γ-PGA。
本发明的另一个目的是提供一种其中以所述枯草芽孢杆菌菌株作为宿主细胞高比率地制备一种有用的重组蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供一种其中以所述枯草芽孢杆菌菌株作为宿主细胞制备一种高分子量γ-PGA的方法。
本发明的另一个目的是提供一种产自所述枯草芽孢杆菌菌株的高分子量γ-PGA。优选地，本发明提供一种分子量超过2,000kDa的γ-PGA。
本发明的另一个目的是提供包含从所述枯草芽孢杆菌菌株制备的所述高分子量γ-PGA的化妆品，食品添加剂，饮料和药物组合物。
本发明涉及分离自韩国传统的发酵大豆食品chungkookjang的抗盐枯草芽孢杆菌chungkookjang变种，保藏号为KCTC 0697BP，和产自所述枯草芽孢杆菌菌株，并作为一种细胞外聚合物分泌的γ-PGA。
确切地，本发明提供了一种产自枯草芽孢杆菌chungkookjang变种的γ-PGA。为支持它的工业用途，分离了大规模生产γ-PGA的枯草芽孢杆菌chungkookjang变种菌株，检测了包含产自该枯草芽孢杆菌菌株的γ-PGA的D-和L-谷氨酸的组成，并研究了在包含L-谷氨酸的培养基中γ-PGA的生产力，从而建立了工业用途所需的基础。
为获得生产可提供上述各种功能和应用的可生物降解的聚合物的微生物，本发明的发明人收集了在韩国各地区生产和销售的chungkookjang，然后筛选和分离那些具有极好的γ-PGA产率的菌株。结果，鉴定了芽孢杆菌属菌株“枯草芽孢杆菌chungkookjang”，其显示了比纯化自纳豆，一种传统的日本发酵大豆食品的枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336a和地衣芽孢杆菌9945a更高的γ-PGA生产力。
该芽孢杆菌属种菌株获自称为chungkookjang的韩国大豆酱，其已被食用很久，并且因而被证实为安全。照此，如果以适当的量适当地使用，则产自这种芽孢杆菌属菌株的具有高分子量的γ-PGA可安全地加到食品，饮料，健康食品，化妆品和药品等中。
在下文中，本发明将被更具体地介绍。
芽孢杆菌属种菌株的分离和鉴定
使用下列步骤分离和鉴定本发明的细菌菌株，“枯草芽孢杆菌chungkookjang”，其高产率地产生一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的γ-PGA并抗盐。
为分离高γ-PGA生产菌株，从韩国各地区获得了使用稻草发酵的20个“chungkookjang”样品。将每个样品单独地悬浮在蒸馏水中，并在60℃水浴中加热20分钟。接着，将少量的该加热的悬浮溶液涂到包含1.5％L-谷氨酸的琼脂平板(GS)上以产生γ-PGA，并在培养箱中37℃培养3天，以纯化高粘的细菌菌落。使用同样的培养基经几代培养被分离的菌株两次，然后，从产生γ-PGA的粘菌落中选择最活跃增殖的菌株。基于在包含2％琼脂的LB琼脂平板上形成乳白色菌落鉴定该获得的高γ-PGA生产菌株，然后通过连续稀释方法在37℃培养20小时以纯化该多产的菌株。
发现通过上述步骤分离的本发明的枯草芽孢杆菌chungkookjang菌株具有下列形态学和生物学特征。
在LB琼脂平板上培养时，本发明的芽孢杆菌属种菌株形成乳白色的细菌菌落。该菌株为在有氧条件下，温度高于37℃时生长良好，而温度高于55℃时被延缓的革兰氏阳性细菌。另外，本发明的该菌株是抗盐的，甚至可以在9.0％氯化钠浓度中生长，这个浓度高于枯草芽孢杆菌菌株的通常抗盐浓度。另外，也将该菌株的16S rDNA核苷酸序列与那些常规的芽孢杆菌属种菌株的16S rDNA的核苷酸序列进行了比较。结果，证实本发明的该芽孢杆菌属种菌株的16S rDNA核苷酸序列显示出与枯草芽孢杆菌非常高的同源性(99.0％)。
本发明的该菌株不包含任何质粒，这是与其它常规的用以生产γ-PGA的芽孢杆菌属种菌株不同。因此，本菌株可被有效地用来作为一种对通过基因操作制得的重组蛋白的高表达系统来讲合适的宿主。由于本发明分离的该菌株也是一种可食用的和安全的微生物，它可用来作为表达疫苗(例如，猪腹泻病毒的抗原)的宿主细胞和作为治疗和预防腹泻的饲料添加剂。照此，本菌株可被用于开发口服疫苗。
另外，本发明分离的该菌株在硝酸盐的还原电位中具有负值，不易于形成孢子，并且不易被诱导，甚至连锰离子也不易诱导它。因此，基于实验数据，本菌株被分类为枯草芽孢杆菌，并命名为枯草芽孢杆菌chungkookjang变种。为了方便，它也被表示为芽孢杆菌属种BS-4，并于1999年11月18日保藏在位于韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(the Korean Collection for Type Cultures)(KCTC；52，Oun-dong，Yusong-Gu，大田)，国际保藏机构，并指定为保藏号KCTC0697 BP。
γ-PGA分析和酶活性测定
定量产自上述菌株的γ-PGA，并如下鉴定聚合物中D，L-谷氨酸的组成。
培养“枯草芽孢杆菌chungkookjang”并离心。分离包含该γ-PGA的上清液，随后将高浓度的盐酸加入上清液中，高温下水解该混合物。使用立体定向的HPLC柱分离D，L-谷氨酸。为获得标准曲线，使用同样的步骤检验纯化的γ-PGA样品。分析通过该柱的物质，并相对于D，L-谷氨酸的标准曲线定量，然后，向最初的培养基中加入对于L-谷氨酸的校正值，并计算分离量。最后，评估该纯化的γ-PGA的含量。
为测量直接参与可生物降解的γ-PGA生产的细胞内酶的活性，如D-AAT，GluRA，和AlaRA，将本发明的该菌株接种到5ml的LB肉汤中，37℃培养10个小时，收集并在超声发生器中裂解。然后，利用离心收集该酶的粗提物。通过D-丙氨酸和α-酮-谷氨酸与上述获得的该酶粗提物在0.1MTris缓冲液(Tris-HCl，pH8.5)中反应测量D-AAT的活性。接着，检测在得到的产物中产自酶促反应的丙酮酸的量以定量活性。另外，通过在50mM的Tris缓冲液(Tris-HCl，pH8.5)中该粗酶提物与D-谷氨酸，α-酮-谷氨酸和PLP反应计算GluRA的活性，然后，使用HPLC柱定量产自该酶促反应的L-谷氨酸。其后，通过作为底物的D-丙氨酸与丙氨酸脱氢酶反应并通过检测340nm的吸光度定量获得的丙酮酸来测量AlaRA的活性。
附图简述
从下列附图可以更清楚地理解本发明的上述和其它目的，特征和优点，其中；
图1描述细胞壁和γ-PGA成分的生物合成途径，该途径涉及各种酶。
图2表示枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)和枯草芽孢杆菌纳豆的氯化钠抗性比较。
图3是描述枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)和其它比较菌株中质粒存在的凝胶电泳图。
图4显示枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)的系谱。
图5显示描述产自枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)的γ-PGA浓度与产自其它比较菌株的γ-PGA浓度比较的浓度梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图6描述产自枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)的γ-PGA的假设的生物合成途径。
图7显示基于凝胶渗透层析，产自枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)的γ-PGA。
实施发明的最佳方式
在下列优选实施方案中举例说明本发明实际的和目前优选的实施方案。
然而，可以理解的是，基于本发明的公开内容，本领域的技术人员可以在本发明的范围内进行修正和改进。
<优选的实施方案1>生产γ-PGA的细菌菌株的分离和鉴定
1.微生物的分离
从韩国各地区收集使用稻草作为介质发酵的传统发酵大豆酱“chunjkookjang”，并作为实验样品使用。将少量的每个样品加入到灭菌的蒸馏水中，悬浮，并在60℃水浴中加热20分钟以便让内生孢子形成。接着，将悬浮的溶液涂到含2％琼脂(1.5％L-谷氨酸，5.0％蔗糖，0.27％KH2PO4，0.42％Na2HPO4，0.05％NaCl，0.05％MgSO4，和0.05％生物素)的GS培养基平板上，在37℃培养箱中培养3天。培养过后，分离那些由于产生γ-PGA而形成粘细菌菌落的菌株。
基于该培养肉汤可能已混合包括γ-PGA的粘聚合物的考虑，使用连续稀释方法将该分离的细菌涂到不产生聚合物的普通培养基，如LB上。其后，选择性纯化显示最活跃的细胞生长的细菌菌株作为γ-PGA生产菌株。在不产生粘聚合物的普通培养基中检验该菌株以阐明它的形态学和生物学特性。
为研究由参与来自如上述获得的生产γ-PGA的细菌菌株的聚合物的生产的各种酶所组成的酶复合体的活性，将该分离的细菌接种到5ml的LB肉汤中并培养10个小时。接着，离心该培养基以回收细菌菌体，并用超声发生器超声处理以获得粗提物。其后，该获得的提取物用来测量与产生γ-PGA有关的D-ATT，GluRA，和AlaRA的酶活性。
2.微生物的形态学和生化特征
(1)微生物的生长特征和形态学
通过上述步骤分离的该活性菌株高产率地产生一种可食用的，可溶解的，可生物降解的，和阴离子型的γ-PGA，并在作为γ-PGA生产培养基的GS琼脂平板上形成非常粘的菌落，而在不产生粘聚合物的LB琼脂平板上形成乳白色的细菌菌落。还发现该菌株的菌落具有锯齿状的边界。关于影响细菌生长的温度，该菌株在30℃-55℃范围内生长良好，然而其在温度高于60℃不增殖。
使用LB培养肉汤，用显微镜观察该细菌生长。结果，外观被鉴别为革兰氏阳性，短杆形，并与比较的枯草芽孢杆菌菌株(未描述)的相似。精确地，该菌株是革兰氏阳性，并且大小在约0.7～0.8×2.0～3.0μm范围内。相反，另一个比较菌株，地衣芽孢杆菌，在对数生长期具有薄蜗形和线状，与本发明分离的该菌株不同。
(2)氯化钠抗性
将本发明的菌株和枯草芽孢杆菌纳豆菌株在包含各种浓度NaCl的LB肉汤中培养24小时，然后，通过检测660nm吸光度测定该细菌生长(参见图2)。如图2说明，就该浓度范围(12％)来说，该细菌菌株(本发明)的存活率是枯草芽孢杆菌纳豆的大约2倍。换句话说，证实本发明的该菌株是抗氯化钠的。
(3)菌株中质粒的特征
本发明的菌株，枯草芽孢杆菌168，和枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336都被用来阐明它们是否包括任何质粒(参见图3)。在图3中，泳道M表示1kb序列梯；泳道A，枯草芽孢杆菌168；泳道B，本发明的该菌株；和泳道C，枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336。
如图3中说明，发现本发明的该菌株不含任何质粒，即使它可以产生γ-PGA，这是与枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336菌株不同的。有趣地，这个结果也显示出与不产生γ-PGA的枯草芽孢杆菌168相同的特征。
因此，正如所证明的，由于本菌株不含任何质粒，它可以被有效地用作对通过基因操作制得的重组蛋白的高表达系统(分泌或产生)来讲合适的宿主。
(4)孢子形成的特征
将本菌株接种到含2mMCoSO4的LB肉汤中，37℃培养4天，然后通过染色孢子来观察(未描述)。结果，证实关于孢子形成，与以相似的方式产生γ-PGA的枯草芽孢杆菌纳豆相比，本发明分离的该细菌菌株具有低得多的活性。
(5)其它生化特征
使用API50CHB和API20E试剂盒研究本菌株以揭示它的生化特性。
因此，基于硝酸盐的还原活性和不产生吲哚，将枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(本发明)鉴定为革兰氏阳性。同样，它降解明胶和淀粉并产生β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，和氧化酶。另外，它可产生脲酶，并在有氧和厌氧条件下均可生长。而且，发现它利用甘油，半乳糖，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，和淀粉。
表1准确地描述了按照本发明选择的该微生物的形态学和生化特性。
(6)核苷酸序列分析
为更精确地鉴定在本发明中获得的该菌株，分析它的16S rDNA基因以确定它的核苷酸序列。
另外，使用SEQ NO.1的N-末端引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和SEQ NO.2的C-末端引物  (5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)利用PCR扩增16S rDNA基因，然后将获得的基因克隆到质粒载体pT7Blue中以获得总核苷酸序列。然后，将选择的微生物的16S rDNA核苷酸序列与先前报道的各种微生物的16S rDNA核苷酸序列进行比较，以观察它们的同源性。结果，证实本菌株与枯草芽孢杆菌具有99.0％的同源性，并定位于同一个谱系，如图4说明。
(7)分离菌株的鉴定
如上描述，尽管它的高同源性，但是未发现本发明分离的该芽孢杆菌属种菌株包含任何质粒，这与常规的产生γ-PGA的芽孢杆菌属种菌株完全不同。这种特征表示对于通过基因操作制得的重组蛋白的高表达系统来讲，该分离的菌株可以被有效地用作一个合适的宿主。另外，不同于典型的芽孢杆菌属种菌株，发现该分离的菌株对于硝酸盐的还原力(reduction power)是阴性的，不易于形成孢子，并不易被锰离子诱导。
如同在优选的实施方案部分中所描述的，该菌株本身和由这种菌株产生的γ-PGA的特征有助于将该菌株分类为一种新的枯草芽孢杆菌种。本发明的芽孢杆菌属种菌株被命名为枯草芽孢杆菌chungkookjang变种，并且为了方便，当它于1999年11月18日被保藏在位于韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的国际保藏机构韩国典型培养物保藏中心(KCTC；52，Oun-dong，Yusong-Gu，Taejon)时，它也被表示为芽孢杆菌属种BS-4，并指定为保藏号KCTC 0697 BP。
<表1>
特征 本发明的枯草芽孢杆菌菌株
革兰氏染色 阳性
形态和大小 杆状0.7～0.8×2.0～3.0μm
孢子形成 弱(非良好形成)
抗性孢子形成(resistant spore formation) 柱形，位于细胞中心
生长温度 30-55℃
在pH5.7生长 阳性
10％NaCl中生长 阳性
有氧条件下生长 阳性
厌氧条件下生长 阳性
运动 阳性
伏-波实验 阳性
硝酸盐还原作用 阴性
吲哚形成 阴性
氧化酶产生 阳性
过氧化氢酶产生 阳性
脲酶产生 阳性
β-半乳糖苷酶产生 阳性
明胶酶产生 阳性
β-葡糖苷酶产生 阳性
色氨酸酶产生 阴性
淀粉降解 阳性
酪蛋白降解 阳性
利用柠檬酸 阳性
从葡萄糖产酸 阳性
从甘油产酸 阳性
从半乳糖产酸 阳性
从葡萄糖产酸 阳性
从蔗糖产酸 阳性
从麦芽糖产酸 阳性
<优选的实施方案2>γ-PGA的生产
将本发明的菌株接种到用来生产γ-PGA的培养基肉汤中，并在37℃培养72小时。接着，加入2N的硫酸溶液，pH调至3.0，然后，收集含γ-PGA的实验样品。将上述样品置于4℃10小时，并去除发酵溶液中的多糖。在这点上，加入乙醇至2倍体积，然后混合。将该混合溶液置于4℃10小时，并离心以获得该γ-PGA沉淀。然后将该沉淀与蒸馏水混合，溶解，再与达到100μg/ml的蛋白酶反应，并在37℃培养箱中放置6小时，以分解γ-PGA样品中的细胞外蛋白。接着，获得的溶液用足够量的蒸馏水透析，并去除分离的谷氨酸。其后，浓缩残留的混合物以收集纯的γ-PGA，其随后用酸水解。最后，测定D，L-谷氨酸的组成和产率。
表2表示本菌株和比较菌株的γ-PGA产率。在培养肉汤中，本发明的该菌株产生16g/L，而分离自纳豆的枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336a和地衣芽孢杆菌ATCC9945a仅分别产生10g/L和9g/L。为比较在固体培养基中γ-PGA的产率，用包含2％琼脂的培养基来制备培养平板，然后，接种该细菌，37℃培养3天，如上述同样的步骤纯化γ-PGA，并在本菌株和比较菌株之间比较产率的不同。结果，本发明的菌株每培养平板产生12mg，枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336a每培养平板产生8mg，地衣芽孢杆菌ATCC9945a每培养平板产生6mg。因此，证实本菌株的生产力是比较菌株的2倍。另外，如图5中凝胶图所描述的，还比较了每0.3mg细菌重量产生的γ-PGA数量。从而，验证了本菌株比常规的γ-PGA生产菌株，枯草芽孢杆菌纳豆IFO 3336a产生多得多的量的γ-PGA。
<优选实施方案3>γ-PGA和D，L-谷氨酸的立体专一性检验
计算了本发明的菌株产生的γ-PGA的产率，并研究了γ-PGA中D-，L-谷氨酸的组成。
为测量D-，L-谷氨酸的比率，即高分子量γ-PGA中的单体组成，用500ml含GS培养基的三角瓶在37℃培养箱中150rpm培养该分离的菌株72小时。然后，向通过如上描述的同样步骤纯化的γ-PGA样品中加入6N的盐酸，脱气，并在105℃水解10小时。
为分析上述水解产物中氨基酸的组成，利用一种浓度梯度的有机溶剂，如包含5％甲醇的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和甲醇，以运行HPLC柱(RexchromeS5-100-ODS，Regis Chem.Inc.，4.6mm×25cm×5m，美国)。接着，为分离立体异构体，使用邻苯二醛(o-pthaldialdehyde)(OPA)将D，L-谷氨酸的氨基末端变成衍生物，然后，基于D，L-谷氨酸标准曲线，使用荧光检测器在452nm(猝灭)和342nm(发光)定量该γ-PGA中的D，L-谷氨酸。
表2说明了D，L-谷氨酸含量的结果，上述产生的γ-PGA的单体组成。详细地，产自本发明该菌株的γ-PGA中的D/L-谷氨酸比率约为40/60，而对于比较菌株，枯草芽孢杆菌纳豆IFO 3336a和地衣芽孢杆菌ATCC 9945a两者来讲，该D/L-谷氨酸比率均为50/50。照此，发现本菌株具有一种独特的单体组成。
(1)产生γ-PGA过程中酶活性的定量
为测量参与本菌株中γ-PGA产生的酶的活性，使用不产生粘聚合物的LB肉汤在37℃培养箱中培养该菌株，并离心。然后，制备一种粗酶提取物通过上面描述的步骤计算酶活性。
通过在0.1M Tris缓冲液(Tris-HCl，pH8.5)中D-丙氨酸，α-酮-谷氨酸和该粗酶提取物反应测量D-AAT活性(Berntsson S，Anal.Chem.，27：1659-1660，1955)。然后，通过在50mM Tris缓冲液(Tris-HCl，pH8.5)中该粗酶提取物，D-谷氨酸，α-酮-谷氨酸和PLP反应计算GluRA活性，然后，使用HPLC柱定量产自该酶反应的L-谷氨酸。其后，通过产自D-丙氨酸的L-丙氨酸作为底物和丙氨酸脱氢酶反应，并通过检测吸光度定量获得的丙酮酸，测量丙氨酸消旋酶活性(生物化学(Biochemistry)，25：3261-3267，1986)。利用Bradford方法计算该蛋白含量(Bradford，M.，Anal.Biochem.，72：248-254，1976)。
表2和表3显示了将本菌株在三角瓶中培养后，γ-PGA的体积和分子量，D，L-谷氨酸比率，和D-AAT，GluRA和AlaRA的酶活性。为比较该γ-PGA特性，使用分离自日本纳豆和已知产生γ-PGA的枯草芽孢杆菌，和地衣芽孢杆菌来分析γ-PGA的产率和酶活性。
结果，证实本发明分离的该菌株合成对于细胞增殖来讲是必需的D-丙氨酸和D-谷氨酸，并基于AlaRA和GluRA活性产生γ-PGA。另外，提议既然发现本菌株中D-AAT活性是枯草芽孢杆菌纳豆和地衣芽孢杆菌中D-AAT活性的3倍，由于可从D-丙氨酸获得高产的D-谷氨酸，这可以被用作一个生产γ-PGA的直接的途径。如同表2和3以及图1说明的，枯草芽孢杆菌纳豆和地衣芽孢杆菌看来似乎具有对于细胞增殖和通过高GluRA活性的γ-PGA合成来讲必需的合成途径，而本菌株指出了一种不同的合成氨基酸的途径(参见图6)。在图6中，线路1表示谷氨酰胺：2-酮戊二酸氨基转移酶；线路2，谷氨酸合成酶；线路3，L-谷氨酸：丙酮酸氨基转移酶；线路4，丙氨酸消旋酶；线路5，D-氨基酸氨基转移酶；线路6，γ-PGA合成酶；线路TCA，三羧酸循环。
这表示在枯草芽孢杆菌纳豆菌株中，通过细胞内的谷氨酸消旋酶，在γ-PGA合成中使用的D-谷氨酸产自L-谷氨酸。相反，在本发明分离的枯草芽孢杆菌菌株中，基于丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氨基转移酶的活性，D-谷氨酸产自L-谷氨酸。
<表2>
本发明菌株和比较菌株的生产力的比较
菌株 γ-PGA(g/L) D，L-谷氨酸(D/L比率)
本发明枯草芽孢杆菌chungkookjang变种 16  40/60
枯草芽孢杆菌纳豆(IFO3336a) 10  50/50
地衣芽孢杆菌(ATCC9945a) 9  50/50
<表3>
本发明菌株和比较菌株与产生γ-PGA有关的酶活性的比较
菌株             酶活性(单位/mg蛋白)
D-AAT  GluRA  AlaRA
本发明枯草芽孢杆菌chungkookjang变种 0.503  0.0109  0.153
枯草芽孢杆菌纳豆(IFO3336a) 0.165  0.0540  0.108
地衣芽孢杆菌(ATCC9945a) 0.187  0.0521  0.099
<优选实施方案4>γ-PGA分子量的比较
(1)利用凝胶电泳进行分子量的比较
进行浓度梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以比较产自枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(本发明)，枯草芽孢杆菌168，一种标准的芽孢杆菌属种菌株，和比较菌株枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336的γ-PGA的分子量。
按照优选实施方案2中描述的步骤纯化产自每种菌株的γ-PGA，并配制成约200μg/ml的溶液。然后，将80μl的该γ-PGA溶液与20μ15×缓冲液混合，并通过5-20％浓度梯度的SDS-PAGE分析。完成电泳后，使用Comassie试剂和亚甲蓝对标准蛋白和γ-PGA进行染色(参见图5)。在图5中，泳道M表示标准蛋白；泳道1，枯草芽孢杆菌168；泳道2，枯草芽孢杆菌纳豆IFO3336；和泳道3，本发明的该菌株。
如图5中所说明，发现枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)产生比枯草芽孢杆菌纳豆的高得多的分子量的γ-PGA，其产生的分子量约为1,000-2,000kDa。
(2)使用凝胶渗透层析(GPC)测定分子量
将本菌株在GS固体培养基上培养5天，并使用上述步骤纯化γ-PGA。然后，通过进行凝胶渗透层析分析分子量(Asahipak GS-620H positiveTosoh TSK gel)。
使用50mM由盐水和乙腈按4∶1的比率配制的溶剂以每分钟0.7ml的流速在25℃的柱炉内完成凝胶渗透层析。使用聚环氧乙烷作为标准物质，使用折光率检测器测量该γ-PGA的分子量。
图7描述了层析的实验结果。因此，确定本菌株产生平均分子量约13,000,000和分布(distribution)约8.0的γ-PGA。
因此，确定产自本菌株的γ-PGA具有比产自其它菌株的γ-PGA高得多的分子量，从而使得它在水凝胶的制备中可以有效地被利用。<优选实施方案5>枯草芽孢杆菌chungkookjang的γ-PGA中的降解检测
在本菌株中，通过应用GPC在培养期间跟踪该γ-PGA的分子量变化。
照此，将本菌株在GS固体培养基上培养。1，3，5天后，按照上述步骤纯化该γ-PGA。其后，通过应用GPC研究分子量和它的分布(参见图4)。
<表4>
培养期(天) 平均分子量(道尔顿) 分子量分布
1  1.204×104  7.9
3  1.197×104  7.8
5  1.311×104  8.0
如同表4中证明的，随着时间的流逝，该合成的γ-PGA(在本发明中)的平均分子量或它的分布没有变化。因此，确定枯草芽孢杆菌chungkookjang(本发明)的该γ-PGA没有经历或经历了最小限度的降解活性。
工业应用性
如上述证明和证实的，本发明涉及枯草芽孢杆菌chungkookjang变种，保藏号KCTC 0697 BP，其源自一种传统的韩国发酵的大豆食品“chungkookjang”，抗盐，并产生γ-PGA，其为一种可食用的，可溶解的，阴离子型的，和可生物降解的聚合物。
证实了枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(本发明)产生一种与源自通常的芽孢杆菌属种菌株的其它细胞外γ-PGA相比具有更高的分子量的γ-PGA，并且产率也非常优异。因此，通过合成和化学处理该γ-PGA的衍生物，来自本发明的枯草芽孢杆菌菌株的γ-PGA可有效地用于开发商品，如化妆品，吸收剂，和可生物降解的塑料物质等。
          涉及微生物或其它生物材料的保藏的说明
                  (PCT实施细则13bis)
A.被保藏微生物或其它生物材料在说明书中位置的说明第9页，第25行(原始公开文本)。
B.保藏的鉴定
保藏机构名称韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)
保藏机构的地址(包括邮递区号和国家)52，Oun-dong，Yusong-Gu，大田韩国
保藏日期2000年11月18日 保藏号KCTC 0697BP
                         序列表
<110>生物领袖公司
<120>生产高分子量聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌chungkookjang变种
<130>E01-009
<150>KR2001-1481
<151>2001-01-11
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡核苷酸引物
<400>1
agagtttgat cctggctcag                                              20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链寡核苷酸引物
<400>2
agaaaggagg tgatccagcc                                              20

Claims (9)

1.枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(Bacillus subtilis var.Chungkookjang)，该菌株产生作为一种可生物降解聚合物的γ-PGA，抗盐和硝酸盐还原力，几乎不形成孢子，该菌株本身不含任何质粒，并且分离自发酵大豆酱，chungkookjang，已以保藏号KCTC 0697 BP被保藏。
2.一种制备重组蛋白的方法，其使用权利要求1的所述的枯草芽孢杆菌菌株。
3.一种制备γ-PGA的方法，其使用权利要求1的所述的枯草芽孢杆菌菌株。
4.权利要求3的制备γ-PGA的方法，其由下列步骤组成
(1)培养权利要求1的所述枯草芽孢杆菌菌株并收集γ-PGA；
(2)从上述获得的所述γ-PGA溶液中去除多糖，用溶剂提取，离心，然后收集γ-PGA沉淀；
(3)溶解所述γ-PGA沉淀，用蛋白酶消化，并降解细胞外的蛋白；和
(4)透析，去除分离的谷氨酸，并浓缩。
5.γ-PGA，其是从权利要求1的所述枯草芽孢杆菌菌株中制备的，并具有超过2,000kDa的分子量。
6.包含权利要求5的所述γ-PGA作为活性成分的化妆品。
7.包含权利要求5的所述γ-PGA作为活性成分的食品添加剂。
8.包含权利要求5的所述γ-PGA作为活性成分的饮料。
9.包含权利要求5的所述γ-PGA作为活性成分的药用组合物。
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