CN101503716B - 玉米原料枯草芽孢杆菌发酵制取聚γ-谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是以玉米原料枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Polyγ-glumatic acidγ-PGA)的方法。其特点是：以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Polyγ-glumatic acidγ-PGA)的方法，筛选得到一株枯草芽孢杆菌HCUL-B-115(Bacillus subtilis HCUL-B-115)，保藏在中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No：2283。一株枯草芽孢杆菌HCUL-B-115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液为基本原料经液态深层发酵产生γ-PGA。本发明的优点是：该菌株(Bacillus subtilis HCUL-B-115)能够利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化液为原料液态发酵产生γ-PGA，原料价格低廉，成本降低，易进行工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及的是以玉米原料枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法。
背景技术
聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸，由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成的高分子聚合物。
在每一个重复单元的α碳原子，还有一个游离的羧基，因此γ-PGA的分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键。γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在100～1000kD，没有典型的肽链结构，也不是一种环状多肽，基本骨架呈直链纤维状。
γ-PGA分子中有大量游离的亲水性羧基，它具有很多优良特性：(1)可在分子内部或分子之间形成氢键，水溶性好；(2)对金属离子的吸附性强；(3)优良的生物降解性。主链上存在大量肽键，也带来很多优良特性：(1)在体内环境下受酶的生物作用，会降解生成无毒的短肽、小分子或氨基酸单体。在医药行业上开发出的手术线和手术粘合剂就是利用这点性质。(2)在自然环境中，会受到某些微生物的作用而降解，可食无毒。利用这点可生产可降解的塑料。其他性质：良好的生物相容性；无自身抗原性；抗冻特性；絮凝特性；高分子量，平均分子量为100-1000kDa，化学合成一般达不到这么高的分子量，且合成成本要很高。在生理功能方面可防止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解等；γ-PGA在放射线照射下会增加分子间的结合，提高吸水性能，由此可开发出一种强吸水性很强的生物树脂。这种树脂有良好的粘弹性，并在一定范围内具有耐酸、碱、盐，耐高渗透压，抗冻融等优良特性。γ-PGA强酸高温彻底酸水解后测得γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在D:L＝60:40。γ-PGA水溶液的流变性能溶液是非牛顿剪切变稀的假塑性流体(Yang，G.，et al.，2002)，其粘度随温度的升高而呈现下降。这些优良的理化性质决定这种材料在多行业有着广泛的发展前景。
目前通过微生物得到的聚合氨基酸主要包括三种：聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumaticacid γ-PGA)、聚赖氨酸(E-poly lysine E-PL)与藻青素(cyanophycin)。γ-PGA具有 水溶性好，对人体无害以及良好的生物可降解等优点这类由生物合成的可降解型功能材料受到人们的关注，因此具有良好的开发价值和广阔前景。目前日本、美国等一些发达国家对它制备和应用的研究十分活跃，并取得了较大的进展。
从1937年Ivnovics首次发现了γ-PGA到1942年Bovarnick等人发现有些芽孢杆菌属细菌能通过发酵培养积累γ-PGA，直至现今各国重点研究生产γ-PGA的各种菌种，这些菌种有着共性也有着个性，共性就是生产γ-PGA的菌主要是芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株，包括各种(纳豆)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)(Goto A，1992.Ashiuchi M，2002.Kubota H，1993)地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(Birrer G A.1993，Shih I L.2002)。个性就是这些菌种发酵条件各异，培养基组成和发酵条件都有很大差异，如对谷氨酸的依赖性可将现有的产γ-PGA菌种分为谷氨酸依赖型和谷氨酸非依赖型；pH、通氧的不同对γ-PGA产量都有影响。如谷氨酸依赖性，最高产量为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)58.3g/L，地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis Zγ-50最高产量为24.128，谷氨酸依赖型的菌株生产所得的γ-PGA产量较非谷氨酸依赖型的产量明显偏高，这些不仅说明了谷氨酸具有促进γ-PGA有关酶活性而且可能作为前提物参入到了γ-PGA的合成。
γ-PGA的应用领域γ-PGA由前所提及的优良的理化性质可广泛用做环保领域如生物絮凝剂、重金属吸附剂，食品工业如增稠剂，农业领域如保湿剂，医药工业如药物载体、医用生物粘合剂等等，一般认为它对人类和环境无毒害，甚至可食用。γ-PGA及其衍生物潜在应用价值极大可发展出许多特殊用途是一种有极大开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。
1.γ-PGA在食品工业上的应用γ-PGA在食品中可用于新型的食品添加剂、抗冻剂、矿质吸收促进剂、除涩剂、稳定剂等。
γ-PGA作为新型的食品添加剂γ-PGA分子上含有大量亲水基团，因而具有良好的吸水保湿性能可应用于淀粉类食品。日本将它用于淀粉类食品(糕点、面条)中，可防止老化、增强质地、维持食品外形和延长货架期；γ-PGA可以增加面包、蛋糕的弹性，使面包、蛋糕的颗粒更加细致，γ-PGA还可以增强面条的韧性，防止面条中的固体物质溶解在沸水中。
γ-PGA作为抗冻剂频繁冷冻和融化生物细胞、生物活性物质和食品等会加速其退化和腐败，而加入γ-PGA可以避免这种状况(Sung M.H.，et al.2005)。γ-PGA具有好的抗冻性能，γ-PGA的抗冻性和可食用性使γ-PGA可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷藏冻藏，而且γ-PGA比通常的低分子量防冻剂(如糖类无机盐和蛋白质等)味淡，食品中即使加入了大量的γ-PGA对口感影响也不大。
γ-PGA作为矿质吸收促进剂γ-PGA还可以作为矿质吸收促进剂，在含高矿物质的食品中加入了γ-PGA或其降解产物可以促进小肠对矿物质的吸收。与酪蛋白磷酸肽相比，γ-PGA具有优良的水溶性，效果更佳。而且γ-PGA可以掩盖高浓度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题，尤其适用于补钙和补铁的保健品。
γ-PGA作为除涩剂γ-PGA可作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂(董惠均，2005)， 研究发现，γ-PGA可以消除或减少诸如氨基酸、多肽、奎宁、咖啡因、矿物质引起的酸味，是高钠调味剂的替代品，可为糖尿病患者和高血压患者所用，作为健康饮食的一个组分。
γ-PGA作为稳定剂可用作冰淇淋的稳定剂；果汁饮料的增稠剂等((Shih and van，2001)。
2.γ-PGA在农业领域的应用γ-PGA与其他单体经过聚合能够得到一种高倍吸水性树脂((Superabsorbent polymer，SAP)，吸水能力急剧增强目前报道的最高可达5300倍(张新民等，2004)。这种高吸水性树脂无毒、无味、无色透明，具有高吸水性和保水性。将这种高吸水性树脂应用在荒山、秃岭、沙漠治理等方面可发挥积极作用，我国科研人员采用γ-PGA吸水树脂种子做发芽实验取得了良好的效果。另外，在肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等使用时，加入适量的γ-PGA盐可以延长这些药物在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、下雨而被冲刷掉。
3.γ-PGA在环保领域的应用
γ-PGA用于生物修复全世界工业的高速发展的同时，也带来了对环境的严重污染，目前被污染的土壤、水和空气的净化修复是我们迫切解决的难题。利用γ-PGA与这些污染物之间的黏附浓缩作用机制可对被污染的环境进行修复。如利用γ-PGA吸水与土壤结合，能提高土壤吸湿能力、通风性、保肥性能，在大规模改造荒山、沙漠方面能发挥积极作用。γ-PGA能吸收农药和化肥，防止流失并缓慢释放，改善作物栽培条件、提高肥料的利用率。
γ-PGA作为生物絮凝剂治理水污染生产上已经开发了的用于废水处理、工业下游处理的许多絮凝剂如铝盐、聚丙烯酸、活性炭材料，这些材料既经济又有效，应用最为广泛，但是大多数不能被生物降解，长期使用也会对环境造成二次污染。利用γ-PGA的电负性和粘结性对水中的污染物进行处理不仅可以应用于废水处理、饮用水的纯化及深海水的加工，而且也可以用于食品和发酵工业的下游工程操作。此外还可以作为重金属和放射性核物质的吸附剂。
4.γ-PGA在工业领域的应用利用γ-PGA聚合成高分子材料此类聚合物性质类似于塑料，可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等，具有适合的强度、透明度和较好弹性。γ-PGA用苯乙烯改性后，可得到高抗碱性的纤维树脂。若通过改性再聚合，可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料。利用γ-PGA合成的材料相对于现有的材料优点在于可降解，无毒，对环境没有危害是一种绿色的高分子塑料。
5.γ-PGA在医药领域的应用γ-PGA聚合的高分子材料可用于药品的包装膜，可降解手术线等。近年来国外还有人研究得出γ-PGA还能够增强前列腺素EI的作用。还建立了用谷氨酞聚合物作为基因治疗的载体。由交联胶原蛋白和γ-PGA制备的一种新型生物粘合剂表现出比外科手术粘合剂及纤维胶更高的软组织粘合和止血作用，并且能够在体内降解而不会引起任何炎症反应(Otani，etal，1998)。
工业化发酵制取γ-PGA存在的问题γ-PGA发酵有几个因素同其他发酵不同导致发酵成本高：1原料成本：在发酵中一般加入碳源葡萄糖、柠檬酸、甘油、谷氨酸、蛋白胨 或者是酵母膏这些原料用量较大，产物的得率相对发酵的其他产物较低。无疑原料成本占生产成本的很大比重；2生产成本：γ-PGA为高分子聚合物，发酵液随着发酵时间的增长，粘度不断加大，溶氧就成为发酵中难以解决的难题，采取的一些措施如果通入纯氧相比通过空气成本必定加大，采用特殊的发酵罐如提高高径比，发酵罐的特殊性增加了固定成本，同时搅拌动力消耗也较大，这些因素同其他发酵产品相比无疑加大了成本。后期发酵产物提取也是一个比较难且需要好成本较高的难题，如发酵液粘度高，发酵液中的菌体不易除去，提取γ-PGA时一般采取有机溶剂提取，有机溶剂与发酵液的体积比一般在3：1，乙醇的消耗占很大的比例，这部分成本这无疑增加了聚谷氨酸工业化生产的难度。因此，筛选利用廉价原料的优良菌种，供氧条件不苛刻，优化发酵条件，对γ-PGA的工业化生产具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法。以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法，筛选得到一株枯草芽孢杆菌HCUL-B-115(Bacillus subtilis HCUL-B-115)，保藏在邮政编码：100101，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No：2283，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；保藏时间：2007年12月06日。
一株枯草芽孢杆菌HCUL-B115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液为基本原料经液态深层发酵产生γ-PGA。
斜面培养基上的种子接入液体种子培养基中，在20-42℃、100-250r/min摇床培养12-24小时；
1)斜面种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L，pH值6.5-7.4；
2)液体种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L(或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0-100.0g/L)，麸酸1.0-100.0g/L，NaCl0.1-8.0g/L，pH6.5～7.4。
产生γ-PGA的液态发酵培养基中含有玉米原料和麸酸，发酵培养基：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L(或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0-100.0g/L、)，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，KH2PO400.1-15.0g/L，MgSO40.1-10.0g/L，pH6.5～7.4。在20-42℃、100-250r/min摇床培养12-96小时。
γ-PGA的提取，采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法，干燥采用-10～-80℃冷冻干燥法。本发明的优点是：该菌株(Bacillus subtilis HCUL-B115)能够利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化液为原料液态发酵产生γ-PGA，原料价格低廉，成本降低，易进行工业化生产。
附图说明
图1是酸水解HPLC测定γ-PGA的组成；图2是硅胶薄层层析测定γ-PGA的组成；图3是SDS-PAGE凝胶电泳定测γ-PGA的分子量；图4是标准γ-PGA红外扫描光谱；图5是HCUL-B115菌株产γ-PGA红外扫描光谱。
Bacillus subtilis HCUL-B-115 16srDNA序列测定结果附表1。
具体实施方式：
所述菌株为HCUL-B-115，是从中国传统食品豆豉、豆酱、日本纳豆中采集样品，经分离纯化，反复筛选诱变获得一种枯草芽孢杆菌HCUL-B-115(Bacillus subtilisHCUL-B-115)，保藏在邮政编码：100101，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No：2283，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；保藏时间：2007年12月06日。
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌种的特征是：该菌种细胞形态为杆状、革兰氏染色阳性、细胞直径小于1μm、能形成芽孢、芽孢不膨大、芽孢呈短杆状、不形成伴孢晶体、接触酶阳性、氧化酶阳性、好氧生长、VP试验阳性、VP＜pH6、VP＞pH7均呈阴性，甲基红试验阴性、能够利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸、利用葡萄糖不产气、能利用柠檬酸盐、能还原硝酸盐、50℃温度下能生长、在pH5.7和7％NaCl培养基中能够生长、能水解淀粉和干酪素。
Bacillus subtilis HCUL-B-115 16srDNA序列测定结果附表1。
该菌种能够利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米水解液为基本原料经液态深层发酵产生γ-PGA。
本发明是这样实现的：一种以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法。以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物γ-聚谷氨酸(Poly γ-glumatic acid γ-PGA)的方法，筛选得到一株枯草芽孢杆菌HCUL-B-115(Bacillus subtilis HCUL-B-115)，保藏在邮政编码：100101，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No：2283，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；保藏时间：2007年12月06日。
一株枯草芽孢杆菌HCUL-B-115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液为基本原料经液态深层发酵产生γ-PGA。
斜面培养基上的种子接入液体种子培养基中，在20-42℃、100-250r/min摇床培养12-24小时；
1)斜面种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L，pH值6.5-7.4；
2)液体种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L (或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0-100.0g/L)，麸酸1.0-100.0g/L，NaCl0.1-8.0g/L，pH6.5～7.4。产生γ-PGA的液态发酵培养基中含有玉米原料和麸酸，发酵培养基：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L(或玉米糊精2.0-100.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0-100.0g/L、)，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，KH2PO400.1-15.0g/L，MgSO40.1-10.0g/L，pH6.5～7.4。在20-42℃、100-250r/min摇床培养12-96小时。
γ-PGA的提取，采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法，干燥采用-10～-80℃冷冻干燥法。
一、菌种的分离筛选：
1样品处理称取分离材料2.0g于灭菌带玻璃珠的50mL小三角瓶中，加无菌水10mL，用棉塞封口，震荡后置于80-85℃恒温水浴箱中保温10-30min。取上述处理过的样品1mL接种到装有80mL基础培养基250mL三角瓶中于30-37℃，摇床富集培养10-24h。
2菌种分离纯化
(1)分离取上述富集培养液1mL，采用10倍梯度稀释方法涂布于装有选择性培养基的平板上，30-39℃恒温培养24-36h观察菌落情况并记录，选择直径大的单菌落，经多次划线分离直至得到纯菌落，作为初筛菌株。
(2)复筛从初筛的菌株中选择菌落较大，有粘液且有明显拉丝的菌株作为复筛的初发菌株，将其接种到新鲜液体种子培养基中，30-39℃摇床培养24-36h后，按2％-10％
(V/V)的接种量分别接种到装有50mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶中，30-39℃下100-250r/min振荡培养24-72小时。培养结束测动力黏度，挑选发酵液黏度比较大的菌株作为复筛菌株，反复进行3-5次，选育出优良菌株。
3菌种的诱变及选育将保存的菌种转接在斜面培养基上30-39℃培养24-48h。取一环菌苔接种于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在100-250r/min振荡培养，30-39℃培养12-16h，使其处于对数生长期。然后取10mL培养液离心收集菌体，再用生理盐水洗涤菌体2-3次，用10mL生理盐水调整菌浓度，制成细胞浓度为108个/mL的菌悬液。取4mL菌液于75mm的培养皿中(带磁棒)，置于紫外诱变箱的磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，打开皿盖，在黑暗中15-30W紫外灯下10-30cm诱变处理5-15min，取处理液接种于选择培养基中。30-39℃选择培养24-48小时，挑取单菌落接斜面备用。
然后，将斜面培养的菌种接种于液体培养基中，培养结束测动力黏度，挑选发酵液黏度比较大、γ-PGA含量高的菌株作为复筛菌株，反复进行3-5次，选育出优良菌株，即得到HCUL-B-115菌株。然后将HCUL-B-115菌株在斜面培养基上连续传代10次，对HCUL-B-115菌株进行遗传稳定性测定，每次传代后在发酵培养基上测其黏度和γ-PGA含量。
二、液态发酵产生γ-PGA
1种子培养将斜面培养基上的单菌落挑至液体种子培养基中，在20-42℃、100-250r/min 摇床培养12-24小时。
斜面种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L，pH值6.5-7.4。液体种子培养基配方一：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，NaCl0.1-8.0g/L，pH6.5～7.4。
液体种子培养基配方二：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米糊精2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，pH6.5～7.4。
液体种子培养基配方三：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米糖化液(还原糖含量)2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，pH6.5～7.4。
2液态发酵产生γ-PGA 将培养成熟的液体种子按1-15％接种量接入发酵培养基中，在20-42℃、100-250r/min摇床培养12-96小时。
发酵培养基配方一：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，KH2PO400.1-15.0g/L，MgSO40.1-10.0g/L，pH6.5～7.4。
发酵培养基配方二：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米糊精2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，KH2PO400.1-15.0g/L，MgSO40.1-10.0g/L，pH6.5～7.4。
发酵培养基配方三：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米糖化液(还原糖含量)2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，KH2PO400.1-15.0g/L，MgSO40.1-10.0g/L，pH6.5～7.4。
玉米糖化液是这样制取的：称取100-300g玉米粉，加入300-900mL水，用NaOH调整至pH7.6，加热至100℃，再加5-50uα-淀粉酶/g原料，搅拌10-40min。冷却至50-65℃，用HCl调pH5.0-5.5，加入糖化酶50-350u/g原料，保温5-24h，过滤，即得玉米糖化液，备用。
三、γ-PGA的提取
发酵结束后，取100-1000mL发酵液，加入蒸馏水200-2000mL，8000-20000rpm高速离心10-30min，弃去沉淀。再取离心液100-1000mL，量取甲醇、乙醇混合液(甲醇∶乙醇＝1∶3)250-2500mL，倒入离心液中，静置10-30min，出现沉淀，轻轻倒去上清液，沉淀进行-10～-80℃冷冻干燥，即得γ-PGA粉末。
四、γ-PGA的鉴定
1.γ-PGA组成的鉴定取样品0.5g放入水解管中，加入10mL 6mol/L HCl，抽真空，110℃水解24h，冷却后移至100mL容量瓶中，定容，经0.45μm微孔滤膜过滤后取滤液用高压液相色谱测定谷氨酸和薄板层析分析氨基酸组成。其结果是图1所示的酸水解HPLC测定γ-PGA的组成。
薄板层析鉴定氨基酸组成用硅胶G制备薄层层析用硅胶板，110℃活化5min后，在硅胶板上点样，选用正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1展开剂溶液，上行法展开后，以0.25％茚三铜 显色，于干燥箱中加热60℃烘干15min。其结果是图2所示的图硅胶薄层层析测定γ-PGA的组成。
通过酸水解HPLC测定γ-PGA的组成，可见，此聚合物的水解产物只含有一种氨基酸，与标准谷氨酸的出峰时间相同，推断此水解物为谷氨酸。同时对照硅胶薄层层析图2，水解物只显示一个斑点，也说明此水解物只有一种氨基酸组成，并且其迁移率与标准L-谷氨酸相同，因此，更进一步证明该聚合物是由谷氨酸一种氨基酸组成，可以认为是谷氨酸的同聚物。
2.γ-PGA分子量的测定
凝胶电泳法测定分子量：采用分离胶5-15％，堆积胶1-10％，电泳条件为操作电压50-100V，稳压1-3h，标准蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，γ-PGA用阿利新兰8GX复染。根据样品和标准蛋白的SDS-PAGE，测定其相对迁移率(Rm)，然后用标准蛋白的Rm值和对应的分子量的对数值作标准曲线，由此估算样品的分子量。其结果是图3所示的SDS-PAGE凝胶电泳定测γ-PGA的分子量
采用SDS-PAGE变性电泳检测到HCUL-B-115菌株产生的γ-PGA的分子量在600～700kD之间，分子量均一。图中1号泳道为高分子量标准蛋白质，2号为γ-PGA样品。
3.标准γ-PGA与HCUL-B-115菌株产γ-PGA红外扫描光谱分析
取样品0.2mg，在60℃下真空干燥，与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由红外光谱鉴定，其结果是图4所示的图4标准γ-PGA红外扫描光谱。图5是HCUL-B-115菌株产γ-PGA红外扫描光谱，通过红外扫描图谱解析，结合标准谱图对照可知该聚合物为γ-PGA聚酰胺类化合物无疑。
实例1：
1种子培养配制斜面种子培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠3.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.4，121℃灭菌20min，冷却至室温，接种，35℃恒温培养24小时。
将斜面培养基上的种子接种至液体种子培养基中，液体种子培养基配方：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，玉米淀粉20.0g/L，麸酸20.0g/L，NaCl 3.0g/L，pH7.4。121℃灭菌20min，冷却至室温，接种，在35℃、200r/min摇床培养24小时。
2液体发酵将培养成熟的液体种子按8％接种量接入发酵培养基中，发酵培养基配方：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，麸酸50.0g/L，氯化钠3.0g/L，KH2PO401.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.4。121℃灭菌20min，冷却至室温，接种，在35℃、200r/min摇床培养72小时。
3γ-PGA的提取发酵结束后，取100mL发酵液，加入蒸馏水200mL，10000rpm高速离心10min，弃去沉淀。按上清液体积的2.5倍量取甲醇、乙醇混合液(甲醇∶乙醇＝1∶3)，倒入离心液中，静置30min，出现沉淀，轻轻倒去上清液，沉淀进行-40℃冷冻干燥，得到γ-PGA产品。
实例2：
1种子培养同实例1。
2液体发酵将培养成熟的液体种子按8％接种量接入发酵培养基中，发酵培养基配方：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，玉米糊精50.0g/L，麸酸50.0g/L，氯化钠3.0g/L，KH2PO401.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.4。121℃灭菌20min，冷却至室温，接种，在35℃、200r/min摇床培养72小时。
3γ-PGA的提取同实例一。
实例3：
1种子培养同实例1。
2液体发酵将培养成熟的液体种子按8％接种量接入发酵培养基中，发酵培养基配方：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，玉米糖化液(还原糖含量)50.0g/L，麸酸50.0g/L，氯化钠2.0g/L，KH2PO401.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.4。121℃灭菌20min，冷却至室温，接种，在35℃、200r/min摇床培养72小时。
玉米糖化液的制取：称取100g玉米粉，加入300mL水，用NaOH调整至pH7.6，加热至100℃，再加10uα-淀粉酶/g原料，搅拌15min。冷却至62℃，用HCl调pH5.0，加入糖化酶120u/g原料，保温10h，过滤，即得玉米糖化液，调节pH7.4，备用。
3γ-PGA的提取 同实例一。
附表1 枯草芽孢杆菌HCUL-B115(Bacillus subtilis HCUL-B115)16srDNA序列测定结果：
GCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGA
CGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG
GGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGG
CTACCACTTACAGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCAC
CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTT
AGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAA
GCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCG
GAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCC
GGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAG
TGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGA
AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG
GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC
CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA
GACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGA
TAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG
TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGC
ATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG
ACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAAC
AAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGAT
CGCAGTACTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT
GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT
GTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCC
Claims (4)
1.一种以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌发酵制取聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于：以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌液态发酵制取高分子聚合物聚γ-谷氨酸(Poly γ-glumatic acid，γ-PGA)的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌HCUL-B-115(Bacillus subtilis HCUL-B-115)，保藏在中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No：2283，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
2.根据权利要求1所述的以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌发酵制取聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌HCUL-B-115能利用玉米、玉米淀粉、玉米糊精、玉米糖化水解液为基本原料经液态深层发酵产生γ-PGA；其中，玉米糖化水解液的制备方法为：称取100-300g玉米粉，加入300-900mL水，用NaOH调整至pH7.6，加热至100℃，再加5-50μα-淀粉酶/g原料，搅拌10-40min，冷却至50-65℃，用HCl调整至pH5.0-5.5，加入糖化酶50-350μ/g原料，保温5-24h，过滤，即得玉米糖化液。
3.根据权利要求2所述的以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌发酵制取聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于：将斜面培养基上的枯草芽孢杆菌HCUL-B-115的单菌接入液体种子培养基中，在20-42℃、100-250rpm摇床培养12-24小时；其中，
1)所述斜面种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，氯化钠1.0-8.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L，pH值6.5-7.4；
2)所述液体种子培养基配方：蛋白胨1.0-25.0g/L，牛肉膏1.0-30.0g/L，玉米淀粉2.0-100.0g/L或玉米糊精2.0-100.0g/L或玉米糖化液还原糖含量2.0-100.0g/L，麸酸1.0-100.0g/L，NaC10.1-8.0g/L，pH6.5～7.4。
4.根据权利要求1、2或3所述的以玉米为基本原料用枯草芽孢杆菌发酵制取聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于：γ-PGA的提取，采取甲醇、乙醇或甲醇-乙醇混合液沉淀法，干燥采用-10～-80℃冷冻干燥法。
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