CN102925377A

CN102925377A - 一种地衣芽孢杆菌、筛选方法及用途

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Publication number: CN102925377A
Application number: CN201110386162XA
Authority: CN
Inventors: 张庆华; 郭婧; 王娟; 封永辉; 张永华; 范斌
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2031-11-28
Also published as: CN102925377B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，本发明提供了一种地衣芽胞杆菌，其能分泌多种酶类，促进动物酶活性并提高动物的免疫力，减少病原菌侵害；此外还能降解养殖水体中的氨氮、残余饵料蛋白质和淀粉，净化养殖水体。本发明还提供了一种地衣芽胞杆菌的筛选方法及其降解氨氮的用途。本发明的地衣芽胞杆菌保存号为CCTCC No.M2011325。

Description

一种地衣芽孢杆菌、筛选方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及微生物技术领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌。

背景技术

近年来随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，对水产品的安全和品质提出了新的更高要求。但是由于水产养殖集约化、高密度饲养模式的大规模应用，使得养殖水体中有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物的浓度增加，不但导致水质恶化，而且直接毒害养殖动物，引起病害的频繁发生，水产品品质也在不断下降，造成养殖水体生态遭到严重破坏。针对水产养殖中出现的这些问题，微生态制剂的调控技术已经成为解决养殖水域污染病害问题的有效手段之一。相对于传统的物理和化学方法而言，微生态技术具有成本低、收效大、无二次污染等优点，是当前环境治理尤其是水环境污染治理的研究热点。

具有高效除氮能力的细菌既有自养型细菌(硝化细菌、光合细菌等)，也有恶臭假单胞菌、芽孢杆菌等异养型细菌。目前芽孢杆菌是水产养殖中应用最多的微生物之一。一方面由于芽孢杆菌在分离和培养方面对营养和环境条件均有较低要求，具有生长速率快、溶解氧要求浓度低、能忍受酸性的环境等优点；另一方面芽孢杆菌有利于提高养殖生物的消化机能，促进其对营养物质的吸收，降解水体中的有机碎屑，减少氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质，起到优化养殖环境，促进水环境生态良性循环等功效。

发明内容

本发明所要解决的第一方面的技术问题在于，提供一种地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformi)，其能分泌多种酶类，促进动物酶活性并提高动物的免疫力，减少病原菌侵害；此外还能降解养殖水体中的氨氮、残余饵料蛋白质和淀粉，净化养殖水体。

本发明所要解决的第二方面的技术问题在于，提供一种地衣芽胞杆菌的筛选方法。

本发明所要解决的第三方面的技术问题在于，提供一种地衣芽胞杆菌的应用。

为了解决上述问题本发明的第一方面的技术方案是这样的：一种地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformi)，其特征在于，该地衣芽胞杆菌为X3914，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No.M2011325。

所述地衣芽胞杆菌为X3914，于2011年9月21日在武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC No.M2011325。芽孢杆菌种属，细胞排列呈杆状、单生，0.8μm×(1.5～3.5)μm、革兰氏染色阳性，有芽孢，具有运动性，异养型细菌，在肉汁培养基上菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱褶。

为了解决上述问题本发明的第二方面的技术方案是这样的：一种地衣芽胞杆菌的筛选方法，包括如下步骤：

(1)健康大黄鱼体表消毒后，取出肠道加入灭菌生理盐水混合研磨，稀释后分别涂布于营养琼脂培养基和TCBS培养基；

(2)将上述两种培养基平板置于25℃～30℃恒温培养箱中培养1～2d，分别观察平板上的菌落特征，挑选出不同特征的菌落，用琼脂培养基斜面保藏；

(3)将步骤(2)中的斜面培养的菌落用营养肉汤培养基扩大培养，再利用筛选培养基对菌株进行液体培养；

(4)最后用奈氏试剂检验培养液中NH⁴⁺的产生情况，以巨大芽孢杆菌1.459(购自CGMCC)作对照，如呈现黄色，说明此种细菌可将有机氮转化为NH⁴⁺，即可判断菌株具有氨氮降解功能。以此筛选出降解氨氮能力较强的菌株，编号为X3914，即为保存号为CCTCCM2011325的菌株。

优选地，所述的步骤(1)中，取出肠道称重后按1∶10～1∶15(W/V)的比例加入灭菌生理盐水混合，用用灭菌匀浆器研磨。

优选地，所述的步骤(2)的平板培养温度为28℃。

为了解决上述问题本发明的第三方面的技术方案是这样的：一种地衣芽胞杆菌用于降解氨氮。

优选地，所述的地衣芽胞杆菌用于降解蛋白质和/或淀粉。

优选地，所述的地衣芽胞杆菌降解蛋白质和淀粉的条件为，温度为10℃～40℃，pH为4.0～9.0，盐度为0.5％～3％，氨氮初始浓度为50mg/L～200mg/L。

优选地，所述的地衣芽胞杆菌降解蛋白质和淀粉的条件，温度为30℃，pH为7.盐度为2％，氨氮初始浓度为100mg/L。

优选地，所述的地衣芽胞杆菌保存号为CCTCCM2011325。

说明：营养琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min。

TCBS配方：多价蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸出粉5g，硫代硫酸钠10g，柠檬酸铁1g，牛胆粉5g，胆酸钠3g，蔗糖20g，柠檬酸钠10g，溴麝香草酚蓝0.04g，麝香草酚蓝0.04g，琼脂14g。

筛选培养基：葡萄糖5.0g，(NH4)2SO4 0.25g，NaC1 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，水1000ml，pH 7.2，其中氨氮含量约为50mg/L。

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)，于2009年10月-12月随机挑选自浙江省宁波市象山海水网箱养殖场，取样时测定水温27℃，海水盐度26.8‰。

有益效果，本发明的地衣芽胞杆菌优点：

1、该株地衣芽胞杆菌是从大黄鱼肠道中筛选出来的，对海水鱼及海水环境如高盐度、高压等有一定的耐受性，用于净化大黄鱼养殖水体或其他海水养殖水体较其他来源菌株有更好的适应性；

2、该地衣芽胞杆菌的生长与氨氮降解是同步进行的，与其他生长率落后于氨氮浓度降低的相比，其具有更高的氨氮吸附效率，具有更大的降解效率。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 地衣芽胞杆菌的筛选：

首先用75％的酒精对健康大黄鱼体表消毒；无菌条件下解剖，取出肠道，75％酒精棉球擦拭肠管外壁，无菌生理盐水反复冲洗。制备肠道总菌悬液时(包括肠壁和肠内容物)，先用无菌棉线分别结扎前肠、中肠及后肠部位各取约0.5cm长的组织混合在一起作为样品，称重后按1∶10(w/v)的比例加入灭菌生理盐水混合，用灭菌匀浆器充分研磨均匀，研磨的样品设为10-1，再用灭菌生理盐水对10-1样品进行倍比稀释至10-6，各稀释度样品均置于漩涡混合仪上振荡均匀。分别取各稀释度样品0.1mL涂布于2种选择性培养基平板置28℃培养1～2d，分别观察平板上的菌落特征，挑选出不同特征的菌落，如根据菌落大小、颜色、透明度、表面光泽度、边缘形态等，斜面保藏。

将斜面保藏菌种，用营养肉汤培养基扩大培养。利用氨化细菌液体培养基对菌株进行液体培养，并用奈氏试剂检验培养液中NH⁴⁺的产生情况，以巨大芽孢杆菌1.459(购自CGMCC)作对照，如呈现黄色，说明此种细菌可将有机氮转化为NH⁴⁺，即可判断菌株具有氨氮降解功能。以此筛选出降解氨氮能力较强的菌株，编号为X3914。

实施例2

2.1菌种的确认

采用常规生理生化反应与分子16S rRNA技术对从大黄鱼肠道中筛选出来的菌株X3914进行鉴定。测定X3914的16S rRNA共有1511个有效碱基，根据地衣芽胞杆菌在Genebank中的16S rRNA进行分子鉴定；再结合生理生化反应X3914为革兰氏阳性，杆状，有芽孢，氧化酶与过氧化氢酶均为阳性，且具运动性，进一步采用法国生物梅里埃细菌鉴定仪(参照《常见细菌鉴定手册》)，最终确定X3914为地衣芽胞杆菌。

(1)VITEK-32细菌鉴定仪对菌株X3914的鉴定报告

2.2菌种16S rRNA测序结果

测序引物：

27f(对应于E.coli的8-27位碱基)：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，见Seq.No.1；1492r(对应于E.coli的1492-1514位碱基)：5’-tacggctaccttgttacgactt-3’，见Seq.No.2。

测序结果(共1511bp)：见Seq.No.3.

实施例3该菌株对氨氮、残余饵料蛋白和淀粉的降解能力

用接种环挑取X3914菌株斜面培养物接种到活化培养基中，28℃摇床培养18-20h后，用0.85％无菌生理盐水离心洗涤3次，最后用生理盐水制成菌液。以筛选培养基作为模拟含氨氮废水，分别以温度、盐度、pH、氨氮初始浓度作为变量，确定X3914降解氨氮的最佳条件。在氨氮初始浓度≤100mg/L，温度为30℃，盐度在1.5％到2.0％之间，pH在7时，该地衣芽胞杆菌对氨氮的降解能力达到最高，24h内的氨氮降解率达到36.2％。

以大黄鱼养殖用水为基质，配制成pH值7.0、含1％大黄鱼饲料的养殖水体培养基，灭菌后接种5％的地衣芽孢杆菌X3914菌液，28℃静置培养，并每隔24h取上清测定蛋白质、淀粉含量。其中，蛋白氮的测定采用半微量凯氏定氮法，淀粉含量的测定采用碘显色法；48h内接种5％菌量的蛋白质和淀粉的降解率分别为35.2％和52.6％。

筛选培养基：葡萄糖5.0g，(NH4)2SO4 0.25g，NaCl 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，水1000ml，pH 7.2，其中氨氮含量约为50mg/L。

通过单因子实验，从温度10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃中确定X3914的最佳降解温度为30℃。

通过单因子实验，从盐度0.5％，1.0％，1.5％，2.0％，2.5％，2.6％，2.7％，3.0％，5.0％中确定X3914的最佳降解盐度为2.0％。

通过单因子实验，从pH为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0中确定X3914的最佳降解pH为7.0。

通过单因子实验，从氨氮初始浓度为10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L，300mg/L中确定X3914的最佳降解氨氮初始浓度为100mg/L。

蛋白质降解率(％)＝|培养后蛋白氮浓度-培养前蛋白氮浓度|/培养前蛋白氮浓度×100％

淀粉降解率(％)＝|培养后淀粉浓度-培养前淀粉浓度|/培养前淀粉浓度×100％

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformi)，其特征在于，该地衣芽胞杆菌为X3914，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNo.M2011325。

2.一种权利要求1的地衣芽胞杆菌的筛选方法，包括如下步骤：

(1)健康大黄鱼体表消毒后，取出肠道，加入灭菌生理盐水混合研磨，稀释后分别涂布于营养琼脂培养基和TCBS培养基；

(4)最后用奈氏试剂检验培养液中NH⁴⁺的产生情况，以巨大芽孢杆菌1.459作对照，如呈现黄色，说明此种细菌可将有机氮转化为NH⁴⁺，即可判断菌株具有氨氮降解功能，即为保存号为CCTCCM2011325的菌株。

3.如权利要求2所述的地衣芽胞杆菌筛选方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，取出肠道称重后按1∶10～1∶15W/V的比例加入灭菌生理盐水混合，用用灭菌匀浆器研磨。

4.如权利要求2所述的地衣芽胞杆菌筛选方法，其特征在于，所述的步骤(2)的平板培养温度为28℃。

5.一种权利要求1的地衣芽胞杆菌用途，所述地衣芽胞杆菌用于降解养殖水体中的氨氮。

6.如权利要求5所述的地衣芽胞杆菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞杆菌用于降解蛋白质和/或淀粉。

7.如权利要求6所述的地衣芽胞杆菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞杆菌降解蛋白质和淀粉的条件：温度为10℃～40℃，pH为4.0～9.0，盐度为0.5％～3％，氨氮初始浓度为50mg/L～200mg/L。

8.如权利要求6所述的地衣芽胞杆菌用途，其特征在于，所述的地衣芽胞杆菌降解蛋白质和淀粉的条件：温度为30℃，pH为7.盐度为2％，氨氮初始浓度为100mg/L。