CN110301182B - 种子引发剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种种子引发剂的制备方法，将N‑椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ‑氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂；枯草芽孢杆菌发酵物经以下过程制备所得：将枯草芽孢杆菌种子液接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中培养，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物。本发明制备方法促进枯草芽孢杆菌代谢出更多的γ‑聚谷氨酸和新物质，提高N‑椰油酰基复合氨基酸的产率；能提高种子引发剂的稳定性和缓释性及保质期，获得的种子引发剂能提高种子萌发能力和种子出芽率，显著提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性及赖氨酸的累积，提高所获得的水稻的营养价值。

Description

种子引发剂的制备方法
技术领域
本发明属于种子处理技术领域，具体涉及种子引发剂的制备方法。
背景技术
对植物来说常用的温度指标有个，即最适温度、最低温度、最高温度、受害温度和致死温度。前三个温度简称为三基点温度。温度逆境是指对植物生命活动不利的温度环境条件，超过了植物本身的三基点温度。它对植物的伤害可以分为直接伤害和间接伤害，直接伤害是短时间内产生对植物生命结构蛋白质和核酸的不可逆的伤害，如高温烫伤和冰冻等，间接伤害是长时间的作用，造成代谢紊乱，形成永久性伤害。低温伤害可以分为冻害和冷害，冻害指的是冰点以下的低温使植物体内结冰，而冷害指的是冰点以上的低温对植物造成的伤害。无论哪种伤害都影响植物的正常生长，比如倒春寒，在我国北方发生比较普遍，有时温度甚至可以达到0℃以下，对农业生产，尤其是小麦和水稻，造成很大的损失。低温冷害是也是造成世界范围内作物产量下降的原因之一。在早春月份的时候，水稻幼苗易受冷害，引起水稻僵苗，表现为叶色暗绿，叶片有渍状病斑，从而造成生长缓慢，严重的还会引起死苗烂秧。另外，在晚春出现的低温和寒潮也会出现僵苗。提高植物耐温度逆境的方法有三大种，第一种培育耐温度逆境的品种，但这种方法周期长，或是难以直接应用于生产。第二种加强栽培管理，这种方法虽然能一定程度的提高水稻的耐温度逆境，但工作量很大。第三种化学调控如种子引发等，在种子萌发时使用，操作简单方便。
在植物的整个生命周期中，种子的活力和萌发情况是影响最终作物产量的重要阶段。种子的储存和萌发过程对环境很敏感，不适应的储存条件和萌发环境，都可能影响植物的正常发育。因此，重要的经济作物都会用不同的处理来防治种子在储存过程或萌发过程被虫子，细菌或鸟类的破坏。在生产上，已经被广泛推广的处理技术是种子包衣。于此同时，关于种子引发的研究和利用在国内外发展快速。因此，研究提高植物抵抗低温、高温能力，具有重要的意义。例如授权公告号CN 105557690 B的发明专利公开了一种低氧逆境下的水稻种子引发剂及其使用方法，属于水稻种植技术领域。该低氧逆境下的水稻种子引发剂包括种子引发剂和种子胁迫缓冲剂，每升种子引发剂含有以下组分：PEG80-120g、水杨酸0.1-0.6mg和茉莉酸0.1-0.5mg，每升种子胁迫缓冲剂含有以下组分：葡萄糖20-30g、蔗糖20-30g、a-酮戊二酸10-20g、延胡索酸10-20g、L-谷氨酰胺10-20g、抗坏血酸10-20g和柠檬酸25-35g。本发明利用种子引发提高胁迫抗性的基础上，针对无氧胁迫下种子萌发可能存在的限制因子，通过配置不同的引发剂与浸种剂，从而提高种子萌发能力，提高种子出芽率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进枯草芽孢杆菌代谢出更多的γ-聚谷氨酸和新物质，提高N-椰油酰基复合氨基酸的产率；能提高种子引发剂的稳定性和缓释性及保质期的种子引发剂的制备方法，获得的种子引发剂能提高种子萌发能力和种子出芽率，显著提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性及赖氨酸的累积，提高所获得的水稻的营养价值。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
种子引发剂的制备方法，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂；
其中，枯草芽孢杆菌发酵物经以下过程制备所得：
将枯草芽孢杆菌种子液接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中培养，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物。
上述枯草芽孢杆菌发酵物的制备方法能够提升组蛋白的乙酰化水平，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了枯草芽孢杆菌的多功能性相关基因表达，提高代谢物的得率，且枯草芽孢杆菌发酵物中含有大量的低分子量的γ-聚谷氨酸(10-1200KD)，具有高度的吸水保水功能，能够螯合多种矿物离子，提高种子的抗氧化酶活性，降低细胞膜脂质过氧化程度，提高水稻的耐冷性，能够促进后续的种子发芽及幼苗的生长发育，为壮苗和丰产奠定基础；同时能够激活枯草芽孢杆菌中沉默基因的表达，代谢出新物质，此类物质的存在使得含有草芽孢杆菌发酵物的种子引发剂在处理种子时，能够显著增强水稻种子中SOD、POD、CAT和脱氢酶的活性，为种子萌发提供物质基础，种子呼吸代谢加强，提高种子活力，从而提高种子萌发能力和种子出芽率，同时能够显著提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性，此外，经该含有草芽孢杆菌发酵物的种子引发剂处理所获得的水稻幼苗能够抑制赖氨酸降解关键酶基因表达，降低赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氨酶的含量，同时过表达合成赖氨酸降解关键酶基因表达，提高天冬氨酸激酶和二氨吡啶二羧酸合酶的含量，促进赖氨酸在水稻苗中的累积，不仅提高了水稻胁迫响应相关途径的活性，而且提高所获得的水稻的营养价值。
优选地，发酵培养基含有80-120g/L糖蜜、20-50g/L大豆水解液、0.05-0.10g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、4-7g/L酵母膏、1-3g/L曲古菌素A、8-12g/L柠檬酸钠、5-10g/L谷氨酸、2-4g/L缬氨酸、5-10g/L硫酸铵、0.2-0.5g/L MgSO4、10-20g/L KH2PO4。该培养基为枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸提供了充足的营养物质，不仅促进了枯草芽孢杆菌的多功能性相关基因表达，提高低分子量γ-聚谷氨酸的产量，还能能够激活枯草芽孢杆菌中沉默基因的表达，代谢出新物质。
优选地，γ-聚谷氨酸的产量高于45.7g/L。
优选地，N-椰油酰基复合氨基酸经以下过程制备所得：
1)将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液；
2)将复合氨基酸溶液用含有乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为11-13，同时缓慢滴加椰子油酰氯和所述混合溶液，反应结束后调节pH为1-3，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸。椰子油酰氯在水中，尤其是碱性溶液中极不稳定，很溶解水解生成椰子油酸和盐酸，而混合溶液中乙醇钠的存在能够抑制反应后期椰子油酰氯的水解生成椰子油酸和盐酸，使得椰子油酰氯与氨基酸反应，提高反应程度和N-椰油酰基复合氨基酸的产率，获得的N-椰油酰基复合氨基酸能够和种子引发剂中其他物质发挥协同作用，不仅能够抑制种子中微生物的生长和繁殖，解决种子引发过程中微生物繁殖对种子所造成的腐烂问题；而且能够调控种子细胞吸水的程度和状态，能使种子的吸水趋于稳定和同步化，还能提高维生素E在水中的溶解度并使其加速溶解，从而使种子对它的吸收有所提高，最终提高种子的萌发率和整齐率，从而达到提高发芽率的目的；此外还能提高种子引发剂的稳定性和缓释性，延长种子引发剂的保质期。
更优选地，S2步骤用混合溶液浓度为23-29％，混合溶液中乙醇钠和氢氧化钠的重量比为1:35-55。上述混合溶液中乙醇钠和氢氧化钠的合理重量比使得N-椰油酰基复合氨基酸的产率达到最高，产率在95.57％以上。
更优选地，S2步骤中氨基酸水溶液的浓度为12-18％，反应温度为30-40℃，时间为1-3h。
更优选地，S2步骤中氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.2-0.3。
优选地，引发剂中各成分的重量份为：N-椰油酰基复合氨基酸8-17份、枯草芽孢杆菌发酵物40-70份、维生素E 5-10份、氯化斓2-5份、水杨酸5-15份和γ-氨基丁酸1-3份。
本发明还公开一种上述种子引发剂的制备方法制得的种子引发剂。
本发明还公开一种促进水稻种子萌发的方法，利用上述种子引发剂在播种前对水稻种子进行表面处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明种子引发剂的制备方法能够促进了枯草芽孢杆菌的多功能性相关基因表达，提高代谢物的得率，且枯草芽孢杆菌发酵物中含有大量的低分子量的γ-聚谷氨酸，同时能够激活枯草芽孢杆菌中沉默基因的表达，代谢出新物质；本发明种子引发剂的制备方法能够抑制反应后期椰子油酰氯的水解生成椰子油酸和盐酸，使得椰子油酰氯与氨基酸反应，提高反应程度和N-椰油酰基复合氨基酸的产率，产率在95.57％以上；本发明制备方法能提高种子引发剂的稳定性和缓释性，延长种子引发剂的保质期，获得的种子引发剂能提高种子萌发能力和种子出芽率，显著提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性，此外，经该种子引发剂处理所获得的水稻幼苗能够抑制赖氨酸降解关键酶基因表达和过表达合成赖氨酸降解关键酶基因表达，促进赖氨酸在水稻苗中的累积，不仅提高了水稻胁迫响应相关途径的活性，而且提高所获得的水稻的营养价值。
本发明采用了上述技术方案提供种子引发剂的制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为本发明试验例1中γ-聚谷氨酸的产量；
图2为本发明试验例2中N-椰油酰基复合氨基酸的产率；
图3为本发明试验例4中水稻稻米中游离赖基酸的含量；
图4为本发明试验例4中水稻稻米中总赖基酸的含量。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施方式的种子引发剂的制备方法进行具体说明。
本发明的一些实施方式提供了一种种子引发剂的制备方法，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂；
其中，枯草芽孢杆菌发酵物经以下过程制备所得：
将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为5-10％(V/V)接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中，在30-40℃、200-300r/min下恒温振荡培养20-30h，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物。
上述枯草芽孢杆菌发酵物的制备方法能够提升组蛋白的乙酰化水平，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了枯草芽孢杆菌的多功能性相关基因表达，提高代谢物的得率，且枯草芽孢杆菌发酵物中含有大量的低分子量的γ-聚谷氨酸(10-1200KD)，具有高度的吸水保水功能，能够螯合多种矿物离子，提高种子的抗氧化酶活性，降低细胞膜脂质过氧化程度，提高水稻的耐冷性，能够促进后续的种子发芽及幼苗的生长发育，为壮苗和丰产奠定基础；同时能够激活枯草芽孢杆菌中沉默基因的表达，代谢出新物质，此类物质的存在使得含有草芽孢杆菌发酵物的种子引发剂在处理种子时，能够显著增强水稻种子中SOD、POD、CAT和脱氢酶的活性，为种子萌发提供物质基础，种子呼吸代谢加强，提高种子活力，从而提高种子萌发能力和种子出芽率，同时能够显著提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性，此外，经该含有草芽孢杆菌发酵物的种子引发剂处理所获得的水稻幼苗能够抑制赖氨酸降解关键酶基因表达，降低赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氨酶的含量，同时过表达合成赖氨酸降解关键酶基因表达，提高天冬氨酸激酶和二氨吡啶二羧酸合酶的含量，促进赖氨酸在水稻苗中的累积，不仅提高了水稻胁迫响应相关途径的活性，而且提高所获得的水稻的营养价值。
根据一些实施方式中，发酵培养基含有80-120g/L糖蜜、20-50g/L大豆水解液、0.05-0.10g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、4-7g/L酵母膏、1-3g/L曲古菌素A、8-12g/L柠檬酸钠、5-10g/L谷氨酸、2-4g/L缬氨酸、5-10g/L硫酸铵、0.2-0.5g/L MgSO4、10-20g/L KH2PO4。该培养基为枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸提供了充足的营养物质，不仅促进了枯草芽孢杆菌的多功能性相关基因表达，提高低分子量γ-聚谷氨酸的产量，还能能够激活枯草芽孢杆菌中沉默基因的表达，代谢出新物质。
上述γ-聚谷氨酸的产量高于45.7g/L。
根据一些实施方式中，N-椰油酰基复合氨基酸经以下过程制备所得：
1)将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液；
2)将复合氨基酸溶液用含有乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为11-13，同时缓慢滴加椰子油酰氯和所述混合溶液，反应结束后调节pH为1-3，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸。椰子油酰氯在水中，尤其是碱性溶液中极不稳定，很溶解水解生成椰子油酸和盐酸，而混合溶液中乙醇钠的存在能够抑制反应后期椰子油酰氯的水解生成椰子油酸和盐酸，使得椰子油酰氯与氨基酸反应，提高反应程度和N-椰油酰基复合氨基酸的产率，获得的N-椰油酰基复合氨基酸能够和种子引发剂中其他物质发挥协同作用，不仅能够抑制种子中微生物的生长和繁殖，解决种子引发过程中微生物繁殖对种子所造成的腐烂问题；而且能够调控种子细胞吸水的程度和状态，能使种子的吸水趋于稳定和同步化，还能提高维生素E在水中的溶解度并使其加速溶解，从而使种子对它的吸收有所提高，最终提高种子的萌发率和整齐率，从而达到提高发芽率的目的；此外还能提高种子引发剂的稳定性和缓释性，延长种子引发剂的保质期。
上述S2步骤用混合溶液浓度为23-29％，混合溶液中乙醇钠和氢氧化钠的重量比为1:35-55。上述混合溶液中乙醇钠和氢氧化钠的合理重量比使得N-椰油酰基复合氨基酸的产率达到最高，产率在95.57％以上。
其中，S2步骤中氨基酸水溶液的浓度为12-18％，反应温度为30-40℃，时间为1-3h；氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.2-0.3。
上述引发剂中各成分的重量份为：N-椰油酰基复合氨基酸8-17份、枯草芽孢杆菌发酵物40-70份、维生素E 5-10份、氯化斓2-5份、水杨酸5-15份和γ-氨基丁酸1-3份。
其中，维生素E是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，能保护机体细胞免受自由基的毒害，抑制脂质过氧化及形成自由基；采用氯化斓处理能够提高水稻的抗冷性，在冷胁迫时，氯化斓作为细胞膜通道的抑制剂，阻止胞外钙离子流入胞液中；水杨酸具有生热效应，作为植物防御信号分子，水杨酸在植物初级抗性反应中起重要作用，可诱导植物体内热应激蛋白的合成和使植物保持较高的和酶活性，增强植物的抗氧化胁迫能力；γ-氨基丁酸是一种天然存在的功能性氨基酸，生理作用十分广泛，在哺乳动物的脑、骨髓中存在，是一种重要的抑制性神经传导物质，在蔬菜、水果中都含有γ-氨基丁酸，但含量稀少，在粮食作物种子中主要存在于种子胚中，可以说种子能否发芽与胚中γ-氨基丁酸的含量密切相关。
本发明的一些实施方式还提供了一种上述种子引发剂的制备方法制得的种子引发剂。
本发明的一些实施方式还提供了一种促进水稻种子萌发的方法，利用上述种子引发剂在播种前对水稻种子进行表面处理。
上述对水稻种子进行表面处理具体包括：
1)将种子引发剂用1000-2000倍水稀释得种子引发剂溶液；
2)将水稻种子放入盛放有水稻种子引发剂的容器中，并用无孔保鲜膜封住容器，在室温下进行浸种3-5h；
3)括将引发后的所述玉米种子利用清水冲洗后，放于阴凉无阳光直晒的地方风干45-50h或者23-27℃烘箱中恒温烘干20-28h。
通过浸泡的过程可以使得种子引发剂能够充分与水稻种子进行表面接触，并且在种子表皮的渗透作用下，种子引发剂中的有效成分能够充分进入水稻种子中进行作用。当然，在其他实施方式中，也可以通过在水稻种子表面进行喷施种子引发剂等方式来进行表面作用。
下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
实施例1：
种子引发剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为5％(V/V)接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中，在30℃、200r/min下恒温振荡培养20h，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物，其中发酵培养基含有80g/L糖蜜、20g/L大豆水解液、0.05g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、4g/L酵母膏、1g/L曲古菌素A、8g/L柠檬酸钠、5g/L谷氨酸、2g/L缬氨酸、5g/L硫酸铵、0.2g/L MgSO4、10g/L KH2PO4；
2)将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液，浓缩氨基酸水溶液的浓度为12％，然后用浓度为23％、含有重量比为1:35的乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为11，同时缓慢滴加椰子油酰氯和上述混合溶液，其中氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.2，在温度为30℃下反应1h，反应结束后调节pH为1，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸；
3)按重量份取N-椰油酰基复合氨基酸8份、枯草芽孢杆菌发酵物40份、维生素E 5份、氯化斓2份、水杨酸5份和γ-氨基丁酸1份，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂。
实施例2：
种子引发剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为7％(V/V)接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中，在35℃、250r/min下恒温振荡培养24h，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物，其中发酵培养基含有100g/L糖蜜、35g/L大豆水解液、0.08g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、5g/L酵母膏、2g/L曲古菌素A、10g/L柠檬酸钠、7g/L谷氨酸、3g/L缬氨酸、8g/L硫酸铵、0.4g/L MgSO4、15g/L KH2PO4；
2)将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液，浓缩氨基酸水溶液的浓度为15％，然后用浓度为25％、含有重量比为1:40的乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为12，同时缓慢滴加椰子油酰氯和上述混合溶液，其中氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.25，在温度为35℃下反应2h，反应结束后调节pH为2，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸；
3)按重量份取N-椰油酰基复合氨基酸12份、枯草芽孢杆菌发酵物52份、维生素E 7份、氯化斓4份、水杨酸12份和γ-氨基丁酸2份，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂。
实施例3：
种子引发剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为10％(V/V)接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中，在40℃、300r/min下恒温振荡培养30h，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物，其中发酵培养基含有120g/L糖蜜、50g/L大豆水解液、0.10g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、7g/L酵母膏、3g/L曲古菌素A、12g/L柠檬酸钠、10g/L谷氨酸、4g/L缬氨酸、10g/L硫酸铵、0.5g/L MgSO4、20g/L KH2PO4；
2)将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液，浓缩氨基酸水溶液的浓度为18％，然后用浓度为29％、含有重量比为1:55的乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为13，同时缓慢滴加椰子油酰氯和上述混合溶液，其中氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.3，在温度为40℃下反应3h，反应结束后调节pH为3，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸；
3)按重量份取N-椰油酰基复合氨基酸17份、枯草芽孢杆菌发酵物70份、维生素E10份、氯化斓5份、水杨酸15份和γ-氨基丁酸3份，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化斓、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂。
对比例1：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例枯草芽孢杆菌发酵培养基中不含有亚甲基水杨酸杆菌肽。
对比例2：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例枯草芽孢杆菌发酵培养基中不含有曲古菌素A。
对比例3：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例枯草芽孢杆菌发酵培养基中不含有亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A。
对比例4：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例制备N-椰油酰基复合氨基酸用混合溶液中不含乙醇钠。
对比例5：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例制备N-椰油酰基复合氨基酸用混合溶液中不含氢氧化钠。
对比例6：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例种子引发剂不含枯草芽孢杆菌发酵物。
对比例7：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例种子引发剂用γ-聚谷氨酸替换枯草芽孢杆菌发酵物。
对比例8：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例种子引发剂不含N-椰油酰基复合氨基酸。
对比例9：
本对比例与实施例2的技术方案的区别在于：本对比例种子引发剂不含维生素E。
试验例1：
γ-聚谷氨酸的产量：取1L实施例2、对比例1、对比例2和对比例3获得的发酵液，以6000r/min的转速，离心30min，将上清液值调节为2.0，再加入上清液4.5体积倍的预冷后的乙醇，搅拌均匀后在4℃下静置15h，然后以6000r/min的转速，将混合液离心10min，收集沉淀并进行真空冷冻干燥得到粗品。将粗品溶解于少量蒸馏水中然后用蒸馏水反复透析24h，将透析后的液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品。然后计算γ-聚谷氨酸的产量，结果如图1所示。由图1可知，实施例2的γ-聚谷氨酸的产量最高，达到47.2g/L，说明上述枯草芽孢杆菌发酵物的制备方法能够提升组蛋白的乙酰化水平，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了枯草芽孢杆菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的得率。
试验例2：
N-椰油酰基复合氨基酸的产率：以体系椰油酰氯酰化修饰前后游离氨基氮含量变化占椰油酰氯酰化修饰前体系游离氨基氮含量的百分比为产物产率。测定体系游离氨基氮含量采用甲醛滴定分析方法进行。计算实施例2、对比例4和对比例5的N-椰油酰基复合氨基酸的产率，结果如图2所示。由图2可知，实施例2的N-椰油酰基复合氨基酸的产率最高，达到96.01g/L，这表明混合溶液中乙醇钠的存在能够抑制反应后期椰子油酰氯的水解生成椰子油酸和盐酸，使得椰子油酰氯与氨基酸反应，提高反应程度和N-椰油酰基复合氨基酸的产率。
试验例3：
水稻种子萌发的试验，利用实施例2、对比例6-9种子引发剂在播种前对水稻种子进行表面处理。对水稻种子进行表面处理具体包括：
1)将种子引发剂用1000-2000倍水稀释得种子引发剂溶液；
2)将水稻种子放入盛放有水稻种子引发剂的容器中，并用无孔保鲜膜封住容器，在室温下进行浸种3-5h；
3)括将引发后的所述玉米种子利用清水冲洗后，放于阴凉无阳光直晒的地方风干45-50h或者23-27℃烘箱中恒温烘干20-28h，然后播种，分别进行低温胁迫，干旱胁迫和高盐胁迫，然后计算水稻种子发芽率和幼苗成活率，结果如表1所示。
表1水稻种子发芽率和幼苗成活率
Figure BDA0002076513640000101
由表1可知，实施例2的发芽率及在低温胁迫、干旱胁迫和高盐胁迫下幼苗成活率均高于对比例，这表明本发明制备方法获得的种子引发剂能提高种子萌发能力和种子出芽率，显著提高所获得水稻苗对低温胁迫、干旱胁迫和高盐胁迫的耐性。对比实施例2和对比例6、对比例7的结果可知，本发明制得的枯草芽孢杆菌发酵物中存在新的物质，能够提高所获得水稻苗对干旱胁迫和高盐胁迫的耐性；对比对比实施例2和对比例8、对比例9的结果可知，N-椰油酰基复合氨基酸和维生素E的共同存在，能提高种子的萌发率和整齐率。
试验例4：
利用实施例2、对比例6-9种子引发剂在播种前对水稻种子进行表面处理，得到成熟的水稻稻米后测定其中赖氨酸含量。
水稻稻米中游离氨基酸：每个系取25粒左右精米，用研鉢将其研磨成粉状，分成3份作技术性重复。粉状样品加入500μL的Na-STM缓冲液，涡旋10min。超声3min，再次涡旋5min，混合物室温16000rpm离也涡旋10min。上清液收集到新的1.5mL离心管，用0.45μm滤头过滤纯化，然后用Beckman 6300氨基酸分析仪测定游离氨基酸的含量。每个样品测三次重复，最后取平均值。总氨基酸：称取10mg干燥后的米粉放于2mL螺旋管中，加入1mL 6N Hcl(Sigma，USA)和10nmol/L的(+)-正亮氨酸(Sigma，USA)。震荡混匀后110℃酸解24h，冷却后65℃旋转蒸发干燥后溶解于1mL Na-STM缓冲液，按照游离氨基酸的方法过滤纯化后HPLC分析，每个样品测三次重复，最后取平均值。结果如图3和图4所示。从图3和图4中可以看书，实施例获得的水稻稻米中游离赖氨酸和总赖氨酸的含量均高于对比例6和对比例7，这表明，经含有本发明种子引发剂处理所获得的水稻幼苗能够抑制赖氨酸降解关键酶基因表达，降低赖氨酸酮戊二酸还原酶/酵母氨酸脱氨酶的含量，同时过表达合成赖氨酸降解关键酶基因表达，提高天冬氨酸激酶和二氨吡啶二羧酸合酶的含量，促进赖氨酸在水稻苗中的累积。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (12)

1.种子引发剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1，将枯草芽孢杆菌种子液接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素Ａ的发酵培养基中培养，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物；所述枯草芽孢杆菌发酵物中γ-聚谷氨酸的产量高于45.7g/L；
S2，将N-椰油酰基复合氨基酸、枯草芽孢杆菌发酵物、维生素E、氯化镧 、水杨酸、γ-氨基丁酸，加入调和釜中混合，制得种子引发剂。
2.根据权利要求1所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌发酵物经以下过程制备所得：将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为5-10％(V/V)接种到含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素A的发酵培养基中，在30-40℃、200-300r/min下恒温振荡培养20-30h，干燥，得枯草芽孢杆菌发酵物。
3.根据权利要求1所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基含有80-120g/L糖蜜、20-50g/L大豆水解液、0.05-0.10g/L亚甲基水杨酸杆菌肽、4-7g/L酵母膏、1-3g/L曲古菌素Ａ、8-12g/L柠檬酸钠、5-10g/L谷氨酸、2-4g/L缬氨酸、5-10g/L硫酸铵、0.2-0.5g/L MgSO4、10-20g/L KH2PO4。
4.根据权利要求1所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述N-椰油酰基复合氨基酸经以下过程制备所得：
1）将米糠蛋白酶解、离心、过滤得复合氨基酸溶液；
2）将所述复合氨基酸溶液用含有乙醇钠和氢氧化钠的混合溶液中和至pH为11-13，同时缓慢滴加椰子油酰氯和所述混合溶液，反应结束后调节pH为1-3，过滤，洗涤，干燥，得N-椰油酰基复合氨基酸。
5.根据权利要求4所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述混合溶液浓度为23-29%，混合溶液中乙醇钠和氢氧化钠的重量比为1:35-55。
6.根据权利要求4所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述复合氨基酸溶液的浓度为12-18%，反应温度为30-40℃，时间为1-3h。
7.根据权利要求4所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述氨基酸和椰子油酰氯的体积比为1:0.2-0.3。
8.根据权利要求1所述的种子引发剂的制备方法，其特征在于：所述引发剂中各成分的重量份为：N-椰油酰基复合氨基酸8-17份、枯草芽孢杆菌发酵物40-70份、维生素E 5-10份、氯化镧 2-5份、水杨酸5-15份和γ-氨基丁酸1-3份。
9.权利要求1-8任一项所述的种子引发剂的制备方法制得的种子引发剂。
10.权利要求1-8任一项所述的种子引发剂在提高水稻苗低温胁迫或干旱胁迫或高盐胁迫耐性中的用途。
11.一种促进水稻种子萌发的方法，其特征在于，利用权利要求9所述种子引发剂在播种前对水稻种子进行表面处理。
12.含有谷氨酸、亚甲基水杨酸杆菌肽和曲古菌素Ａ的发酵培养基在提高枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸的产量中用途。
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