CN103267666A - 一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，属于生物技术领域一种电泳染色方法，可使电泳胶上的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时显色。其特征在于采取如下步骤：（1）制备蛋白质和γ-聚谷氨酸电泳样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，（2）将电泳后的胶进行固定和考马斯亮蓝R250染色液初染并脱色，（3）将初染后的胶放入亚甲基蓝染液进行复染并脱色，直至蛋白质和γ-聚谷氨酸条带清晰。本发明与现有技术相比，解决了在电泳胶上的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的问题，并可根据标染色后的γ-聚谷氨酸的条带位置和条带数判断其分子量和纯度，操作方便快捷。

Description

一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法

技术领域

本发明提供一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，属于生物技术领域一种电泳凝胶染色方法，可使同一块胶上的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时显色。 

背景技术

γ-PGA是微生物产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，是某些细菌荚膜的主要组分。1937年，Ivnoavics在Bacillus anthracsi的荚膜中首次发现γ-PGA。γ-PGA由D型谷氨酸(D-Glu)和L型谷氨酸(L-Glu) 通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的高分子聚合物。γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，基本骨架呈直链纤维状。一般而言，由芽孢杆菌发酵产生的γ-PGA的平均分子量(Mw)在100-1000kD之间。γ-PGA的结构与蛋白质相似，但是与蛋白质相比较，存在以下不同之处：（1）蛋白质的组成成分较为复杂，由20多种氨基酸组成，而γ-PGA仅仅包括谷氨酸一种单体；(2)蛋白质的生物合成是以DNA为模板，通过转录、翻译等过程形成的，γ-PGA的生物合成主要通过其特定的合成酶系催化反应得到，无需以DNA为模板的转录翻译过程；(3)蛋白质具备特定的生物学功能，不同蛋白质的功能各异，而γ-PGA没有特定的生物学功能，其功能较为广泛；（4）蛋白质具有特定的分子量，γ-PGA的分子量较为分散，其范围从l00KD到1000KD不等。 

γ-PGA具有很好的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、生物降解性、吸水性等特性，这些特性使γ-PGA具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和粘结等许多功能。是一种具有良好生物相容性、生物可降解性和较强的亲和性的新型高分子材料，具有广阔的应用前景和经济价值。主要应用在：（1）医药领域，可以延长、改善、控制药物释放，作为抗癌药物载体、肝细胞及外用药物载体和靶向给药系统，作为可生物降解的粘合剂、止血剂等；（2）农业领域，作为土壤植物的保水剂、农药和肥料的缓释剂等；（3）食品领域，维持食品外形和延长货架期、食品冷藏防冻剂、苦味掩盖剂和除涩剂、矿质吸收促进剂等；（4）化妆品领域，皮肤润滑剂、头发定型剂、保湿因子等；（5）环保领域，作为吸附金属和放射性物质、絮凝剂等。 

有关γ-PGA的定量分析，以前的报道通常是采用冻干后称重的方法。分子量特别大的γ-PGA (>1000 000KD)，可测定十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )条带染色后的光密度确定浓度或采用凝胶渗透色谱(GPC)和折射监测器测定。Kanno和Takamatsu建立了一种使用溴化十六烷基三甲基胺显色法定量测定枯草芽孢杆菌γ-PGA的简单分光光度法。另外，也有采用将发酵液离心除菌后，取上清液按常规方法酸水解，然后用氨基酸分析仪或高效液相色谱等方法测定水解前后谷氨酸的含量，两者之差即为聚谷氨酸的量。另外核磁共振仪或傅里叶红外光谱仪等也有应用。 

在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质等生物大分子能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了原有的电荷差别，使生物大分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带的电荷无关，在一定条件下，分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。  

发明内容

一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法。其特征在于采取如下步骤：（1）制备蛋白质和γ-聚谷氨酸电泳样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，（2）将电泳后的胶进行固定和考马斯亮蓝R250染色液初染并脱色，直至蛋白质条带清晰，（3）将初染后的胶放入亚甲基蓝染液进行复染并脱色，直至蛋白质和γ-聚谷氨酸条带清晰。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（1）中，将分离纯化后的蛋白样品和γ-聚谷氨酸样品用蒸馏水制成适当浓度的水溶液，加入等量2x凝胶加样缓冲液，沸水浴5 min，即为电泳样品。根据蛋白和γ-聚谷氨酸样品特点选择电泳胶浓度和电泳条件进行电泳。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（2）中，胶板用固定液固定0.5-3 h，加入考马斯亮蓝R250染色液，根据胶的厚度，在水平摇床上染色约1-5 h，将胶板取出用脱色液脱色至条带清晰。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤步骤（3）中，将初染脱色后的胶放入亚甲基蓝染色液中染色1-3 h，再放入3%乙酸脱色液或蒸馏水中脱色至条带清晰。 

所述的一种凝胶电泳的蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于亚甲基蓝染色液的配方为1g亚甲基蓝溶于100ml双蒸水中溶解，加入6ml乙酸，用双蒸水定容至200ml，配成0.5%亚甲基蓝染液，室温保存。 

所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于用于染色的蛋白质和γ-聚谷氨酸先进行单向或双向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 

所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于可以根据染色结果判定样品中γ-聚谷氨酸的分子量和纯度。 

蛋白质染色常用的考马斯亮蓝染液不能使γ-聚谷氨酸着色，亚甲基蓝染色液能染出胶上的γ-聚谷氨酸但却不能使蛋白着色，银染法虽然能使二者同时着色，但存在对试剂要求比较严格、成本较高、易造成重金属银或甲醛污染、硝酸银长期存放还容易被氧化等问题，染色过程的操作也比较繁琐，容易产生较高的背景颜色等现象。本发明与现有技术相比，解决了电泳后凝胶上的蛋白质与γ-聚谷氨酸同时着色的问题，操作方便快捷。 

在分离纯化γ-聚谷氨酸过程中，常用的γ-聚谷氨酸分子量和纯度检测方法为液相色谱、质谱法等，操作繁琐，需要对样品进行纯化，无法及时快速检测。本发明的方法可随时取样，不必纯化γ-PGA，可以直接利用发酵液制成电泳样品，电泳后通过胶的复染结果，根据标准分子量蛋白条带、γ-聚谷氨酸的条带位置和条带数初步判断其分子量和纯度，也可以将染色结果通过凝胶成像系统的扫描和软件计算，快速简便的测定其相对分子量。 

附图说明

图1是实施例1从微生物发酵液中提取的γ-聚谷氨酸样品与低分子量标准蛋白先SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），再进行染色的结果。1、2、M三个泳道的样品分别是：1-2,γ-聚谷氨酸，M,低分子量标准蛋白。 

图1a 是电泳后的胶进行考马斯亮蓝R250染色，只有M泳道有条带，说明只染出了低分子量标准蛋白的条带，从上到下分别是 97.4KD、66.2 KD、43.0 KD、30.0 KD、20.1 KD、14.4 KD，但是泳道1和2的γ-聚谷氨酸均未染上色。 

图1b 是电泳后的胶进行本专利提供的复染方法先后用考马斯亮蓝R250和亚甲基蓝染色，泳道1和2的γ-聚谷氨酸以及泳道M的低分子量标准蛋白都被染色，并且可以看出γ-聚谷氨酸的分子量大于97.4KD，且泳道1样品中的γ-聚谷氨酸的含量大于泳道2样品。 

图1c是是电泳后的胶进行银染染色，泳道1和2的γ-聚谷氨酸和泳道M的低分子量标准蛋白标准都被染色，样品中混杂的少量蛋白也被染出条带。 

具体实施方式

实施例1  γ-聚谷氨酸样品和低分子量标准蛋白样品SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色、考马斯亮蓝与亚甲基蓝复染、银染染色的比较实验。 

（1）本实施例所用试剂的制备： 30%电泳胶母液：29.2 g丙烯酰胺，0.8 g 甲叉双丙烯酰胺，双蒸水定容到100ml，三层滤纸过滤后 4 ℃避光保存。 

1.5 M pH=8.8 Tris-HCl：Tris45.43 g加双蒸水至200ml， 6mol/L浓HCl调pH8.8后，定容至250ml。4 ℃保存。 

0.5 M pH6.8 Tris-HCl：Tris6.0g加双蒸水至80ml， 6mol/L HCl调pH6.8后，定容至100ml。4 ℃保存。 

10%SDS：10 g SDS加双蒸水50ml。60 ℃水浴助溶，定容至100ml，室温保存。 

10%AP：0.1gAPS加1ml双蒸水。4℃保存，一周内使用。 

5×Tris-Gly电极缓冲液：Tris7.5 g，Gly36 g，SDS2.5 g，双蒸水定容至500ml。60 ℃水浴助溶，室温保存。双蒸水稀释5倍使用。 

2×SDS-PAGE样品缓冲液（室温存放）：0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）2 ml，甘油2ml，20%（W/V）SDS 2ml，0.1%（W/V）溴酚蓝0.5ml，β-巯基乙醇1ml，双蒸水2.5ml。稀释两倍使用。 

凝胶固定液（V/V）：40%无水乙醇，10%冰醋酸：50%双蒸水。 

考马斯亮蓝R250染色液： 0.2g考马斯亮蓝R250，84ml 95%乙醇，20ml冰乙酸，将考马斯亮蓝溶化后双蒸水定容至100ml，过滤备用。 

考马斯亮蓝脱色液：95%乙醇:冰醋酸:蒸馏水= 4.5:0.5:5(V:V:V)，室温保存。蒸馏水稀释5倍使用。 

亚甲基蓝染色液：称1g亚甲基蓝溶于100ml双蒸水中，加入6ml乙酸，用双蒸水定容至200ml，配成0.5%亚甲基蓝染液，室温保存。 

银染固定液：无水乙醇:乙酸:去离子水=4:1:5（V:V:V），配制200ml。 

银染敏化液：0.3g硫代硫酸钠，去离子水定容到150ml。 

银染染色液：0.6g硝酸银，100μL甲醛，去离子水定容150ml。 

银染显色液：4g碳酸钠，120μL甲醛，去离子水定容到150ml。 

银染终止液： 5%（V/V）乙酸，配制200ml。 

（2）电泳样品的制备：低分子量标准蛋白样品：购自生物试剂公司的低分子量标准蛋白样品加入蒸馏水和加样缓冲液沸水浴5min，蛋白浓度为0.6ug/ul，-20℃保存。 

γ-聚谷氨酸样品：通过乙醇沉淀分离纯化后的γ-聚谷氨酸加适量蒸馏水溶解，加入等量2x样品缓冲液，沸水浴5 min。 

（3）电泳  用三块胶分别进行SDS-PAGE，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%。胶的厚度为1mm，胶大小为8.3×7.3cm，每个上样孔加入制备好的样品10ul，浓缩胶80v，分离胶200v，恒压电泳1.5 h，当溴酚蓝前沿电泳到胶的底部时停止电泳，取出胶板进行固定、染色。 

（4）染色 电泳结束后的胶板进行染色，一块胶考马斯亮蓝染色，一块进行复染，一块胶进行银染染色。 

考马斯亮蓝染色：电泳后的胶固定30分钟后加入考马斯亮蓝R250染色液，水平摇床上染色约2 h，加入脱色液脱色至条带清晰。 

复染：胶板用固定液固定30分钟，加入考马斯亮蓝R250染色液，水平摇床上染色2 h，将胶板取出用蒸馏水冲洗后加入亚甲基蓝染色液中染色1 h，再放入3%乙酸脱色液中脱色至条带清晰。 

银染：电泳后的凝胶用银染固定液浸泡3 h固定，去离子水漂洗两次、每次5min；用敏化剂浸泡20min，去离子水漂洗2次、每次2 min，加入银染染液浸泡30 min；再用去离子水漂洗2次，准确控制时间，每次漂洗1min；加入显色液显色2-4 min，直至出现清晰条带，用去离子水漂洗30s，加入终止液10 min终止反应。 

[0043] 染色结果见图1，可以看出考马斯亮蓝染色只能染出蛋白条带，不能染出γ-聚谷氨酸（图1a）；复染和银染泳道1、2的γ-聚谷氨酸以及泳道M的低分子量标准蛋白都被染色(图1b,c)。虽然银染的的灵敏度更高，可以染出γ-聚谷氨酸样品中混杂的微量蛋白，但是相比之下复染法操作更简便、迅速。根据染色结果可以清楚地判断出样γ-聚谷氨酸品中γ-聚谷氨酸的分子量大于97.4KD，且相同上样量情况下泳道1样品中所含γ-聚谷氨酸的浓度大于泳道2样品（图1b）。  

Claims (7)

1.一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于采取如下步骤：（1）制备蛋白质和电泳样品，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，（2）将电泳后的胶进行固定、考马斯亮蓝R250染色液初染并脱色，（3）将初染后的胶放入亚甲基蓝染液进行复染并脱色，直至蛋白质和γ-聚谷氨酸条带清晰。

2.据权利要求1所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（1）中，将分离纯化后的蛋白样品和γ-聚谷氨酸样品用蒸馏水制成适当浓度的溶液，加入等量2x凝胶加样缓冲液，沸水浴5 min，即为电泳样品，根据蛋白和γ-聚谷氨酸样品特点选择电泳胶浓度和电泳条件进行电泳。

3.据权利要求1所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤（2）中，根据胶的厚度，胶板用固定液固定0.5-3 h，加入考马斯亮蓝R250染色液，在水平摇床上染色1-5 h，将胶板取出用脱色液脱色至条带清晰。

4.据权利要求1所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于步骤步骤（3）中，将初染脱色后的胶放入亚甲基蓝染色液中染色0.5-3 h，再放入3%乙酸脱色液或蒸馏水中脱色至条带清晰。

5.据权利要求4所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于亚甲基蓝染色液的配方为1g亚甲基蓝溶于100ml双蒸水中溶解，加入6ml乙酸，用双蒸水定容至200ml，配成0.5%亚甲基蓝染液，室温保存。

6.据权利要求1所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于用于染色的蛋白质和γ-聚谷氨酸先进行单向或双向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

7.据权利要求1所述的一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法，其特征在于可以根据染色结果判定样品中γ-聚谷氨酸的分子量和纯度。

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