CN105778894B - 一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测微量γ‑球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，属于荧光生物传感器领域。该荧光试剂由TABD‑Py‑PF6和良溶剂组成。将(1Z,3Z)‑1,4‑二(4‑甲氧羰基)苯基‑1,4‑二溴‑1,3‑丁二烯溶解于良溶剂中，加入4‑吡啶苯硼酸、催化剂和碱性盐，反应得到TABD‑Py；将TABD‑Py溶于溶剂中，先加入碘甲烷合成碘盐，再加入六氟磷酸钾，反应得到TABD‑Py‑PF6。将TABD‑Py‑PF6溶解于良溶剂中得到荧光试剂；该荧光试剂不需要金属离子的参与，对γ‑球蛋白具有特异性的“点亮”型荧光响应，对γ‑球蛋白的检测灵敏度高且非常快捷，具有高度选择性；它具有良好可视化的检出信号，根据实际需要可以完全脱离高精仪器，在很大程度上满足当今对于血清中γ‑球蛋白的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，具体涉及一种用于溶液荧光检测血清中微量γ-球蛋白的实时“点亮”型荧光试剂及制备方法，属于荧光生物传感器领域。
背景技术
球蛋白是一种常见的蛋白，基本存在于所有的动物体中，其球蛋白的正常值是20-35g/L,其中γ-球蛋白的正常值为8.3-23g/L。球蛋白具有免疫作用，因此也有人称球蛋白为免疫球蛋白。蛋白的动态变化可以反映肝脏功能状态，血清蛋白经电泳后分为白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ-球蛋白五条区带，γ-球蛋白主要由免疫球蛋白组成，除免疫球蛋白外，绝大部分的血清蛋白质由肝脏合成。伴有肝功能损害的疾病(乙型肝炎及其后果如肝硬化、失代偿肝病和肝细胞癌)往往引起血清白蛋白浓度及构成比降低，而由肝外合成的球蛋白尤其是γ-球蛋白浓度及构成比增高，α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白浓度及构成比走向不稳定。
γ-球蛋白作为反映免疫功能的指标之一，当其增多时往往预示着肝病的发生。例如慢性肝炎，肝硬化，甚至走向肝纤维化的局面。综上，对血清中γ-球蛋白含量的特异性定量检测具有重要的临床应用。
以往对于γ-球蛋白的检测主要有以下几个方法：免疫扩散法、电泳法、盐析法和免疫比浊法。电泳法利用带电粒子的定向迁移现象来检测，但操作相对繁琐，整个过程易受到电场强度、电渗现象等诸多因素影响；免疫扩散法分为单扩散法和双扩散法，利用在抗原、抗体孔之间形成的沉淀线进行估算，并与相应的标准品浓度对照，这种方法敏感度不高，只有当比例适量时才会出现白色沉淀，检测时间长，而且只能进行粗略定量；盐析法利用蛋白质在不同盐溶液中溶解度不同而产生沉淀的原理，后续还需要层析除盐，操作步骤多；免疫比浊法利用抗原与抗体间结合形成复合物，在光的照射下形成的透射光或散射光作为计算单位。这种方法简便、可自动化，但是要求结合后形成的复合物数量足够多、颗粒足够大，否则对光通路影响不大，而且成本较高，检测时间长。
近年来，酶联免疫吸附法常用于临床中，其方法简便，商品化试剂盒，重复性好、变异系数小，但其易受多方面因素的干扰；一种形式的干扰来自代谢物，如果它们可能再免疫测定中具有交叉反应性；另一种干扰来自抗体的形成。
目前，化学方法检测γ-球蛋白往往采用金属与球蛋白的配位作用使荧光猝灭的原理，例如利用纳米金检测γ-球蛋白时，发生猝灭的原因是γ-球蛋白与纳米金形成化学键改变了色氨酸周围的极性环境，改变了氨基酸的二级结构；这种方法简单易实现，但是采用贵金属，而且对血清白蛋白等均有猝灭作用，不具备特异性。2001年，唐本忠课题组报道了“聚集诱导发光(AIE)”现象，由于其独特的“点亮”效果，AIE分子被应用于检测一些生物分子，如DNA，RNA与蛋白质等，目前未见到“点亮”型的AIE分子应用于γ-球蛋白的检测。
(Bechmann,L.P.；Jochum,C.；Kocabayoglu,P.Journal of Hepatology,2010,53,4,639-647；Ogunkeye,A.L.；Roluga,S.Pathophysiology,2006,42,13,91-93；Ju,H.Y.；Jang,J.Y.；Jeong,S.；Won,T.C.Clinical and Molecular Hepatology,2012,18,213-218；Xu,X.；Liu,C.L.FrontMed,2012,6,421-427；Du,Z.Q.；Li,B.；Wei,Y.Q.Hepatobiliary&Pancreatic Diseases International,2011,10,265-269；Azizi,G.；Abolhassani,H.；Asgardoon,M.H.；Shaghaghi,S.；Negahdari,B.；Mohammadi,J.；Rezaei,N.；Aghamohammadi,A.Expert Review of Clinical Pharmacology,2015,9,91-102；Ankita,S.；Kalyan,S.G.；Bhanu,P.S.；Arvind,K.G.Methods And Applications inFluorescence,2015,3,025002；Sekar,G.；Kandiyil,S.T.；Sivakumar,A.；Mukherjee,A.；Chandrasekaran,N.Journal of Photochemistry and Photobiology.B,2015,153,222-232；Joshi P,C.S.；Dey,S.；Shanker,V.；Ansari,Z.A.；Singh,S.P.；Chakrabarti,P.Journal of Colloid Interface Science,2011,355,402–410；Naveenraj,S.；Anandan,S.；Kathiravan,A.；Renganathan,R.；Ashokkumar,M.Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis,2010,53,804-813；Hong,Y.N.；Lam,J.W.Y.；Tang,B.Z.ChemicalSociety Review,2011,40,5361–5388；Huang,J.；Li,Z.Chemical Communications,2011,47,12385–12387；Mei,J.；Leung,N.L.；Kwok,R.T.K.；Lam,J.W.Y.；Tang,B.Z.ChemicalReview,2015,115,11718-11940).
发明内容
针对现有化学试剂对γ-球蛋白的检测往往需要金属离子参与，而且特异性不高，在定量检测γ-球蛋白时需要进行预先分离等问题，本发明的目的之一在于提供一种简单易行检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂不需要金属离子的参与，对γ-球蛋白具有特异性的“点亮”型荧光响应，对γ-球蛋白的检测灵敏度高且非常快捷，并具有高度选择性；目的之二在于提供一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述制备方法简单，操作方便。
本发明的目的由以下技术方案实现：
一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂由TABD-Py-PF6和良溶剂1组成；
其中，所述TABD-Py-PF6为4-((1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯-4-(吡啶-4-)基-1,3-丁二烯基)-1-甲基吡啶六氟磷酸盐的简称，其结构式如下：
所述良溶剂1为去离子水、磷酸盐缓冲液和无血清培养液中的一种；所述TABD-Py-PF6的浓度为10-3～10-5mol/L。
一种如本发明所述检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)将(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碱性盐溶解于甲苯和甲醇的混合溶剂中，在无水无氧条件下，于70～80℃搅拌反应18～30h，提纯，得到(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二(4-吡啶)基-1,3-丁二烯，简称TABD-Py；
(2)将TABD-Py溶解于溶剂中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液中加入碘甲烷，于30～40℃下反应8～16h，加入沉淀剂，过滤，得到固体a；
(3)将固体a溶解于丙酮溶剂中，加入饱和六氟磷酸钾水溶液，在搅拌下，于10～30℃反应0.5～2h，提纯，干燥，得到TABD-Py-PF6；
(4)将TABD-Py-PF6溶解于良溶剂1中，混合均匀，得到本发明所述检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂；
其中，步骤(1)所述(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碱性盐的质量比优选1:0.60～0.7:0.1～0.2:1.5～2；
步骤(1)所述甲苯与甲醇的体积比优选2～4:1；所述碱性盐优选碳酸钾；
步骤(1)所述提纯优选采用柱层析分离。
步骤(2)所述TABD-Py与碘甲烷的质量比优选1:0.8～1；所述溶剂优选二氯甲烷；
步骤(2)所述的沉淀剂优选正己烷；
步骤(3)所述丙酮的添加量为使固体a充分溶解，所述饱和六氟磷酸钾水溶液与丙酮的体积优选为1:1；所述纯化优选采用萃取或减压蒸馏。
一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂应用于溶液荧光检测微量γ-球蛋白。
有益效果
(1)本发明所述荧光试剂对于γ-球蛋白有特异性的荧光响应，TABD-Py-PF6在良溶剂1中处于分散状态，荧光信号较弱；加入γ-球蛋白后，TABD-Py-PF6与γ-球蛋白发生氢键作用和静电作用，使其分子内旋转受限，非辐射能量转移受到抑制，荧光试剂的荧光信号显著增强。
(2)本发明所述荧光试剂对γ-球蛋白检测具有较高的灵敏度，当γ-球蛋白浓度为15μg/mL时，荧光试剂有明显的信号增强；使用该方法的最低检出限为5.38μg/mL，在5.38-300μg/mL范围内呈线性相关，R2＝0.99887；且随着γ-球蛋白的加入立即发生荧光信号的变化，响应速度在10s以内。
(3)本发明所述荧光试剂对γ-球蛋白的检测具有高度选择性、特异性，对于血清中其他组分，包括血清白蛋白、纤维蛋白原、胆固醇、葡萄糖、尿素等均无明显响应。
(4)本发明所述荧光试剂对于γ-球蛋白的检测非常快捷，荧光试剂的荧光强度几乎在加入γ-球蛋白的同时就显著增强，具有实时“点亮”效果；
(5)本发明所述荧光试剂的制备方法简单；在检测时操作方便，血清中的其他主要成分都不影响荧光试剂的检出效果，可以直接检测血清中的血清γ-球蛋白，而不需要预先分离。
附图说明
图1为实施例1中向TABD-Py-PF6荧光试剂中加入不同血清组分的荧光谱图，从左到右依次是血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、葡萄糖、尿素、胆固醇；(I-I0)/I0表示TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率；
图2为实施例1中向TABD-Py-PF6荧光试剂中在不同γ-球蛋白浓度下的荧光谱；
图3为实施例1中TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率随γ-球蛋白浓度变化的曲线及其拟合直线；
图4为实施例1中分别向TABD-Py-PF6荧光试剂中加入血清白蛋白与γ-球蛋白混合溶液的荧光谱；
图5为实施例1中分别向TABD-Py-PF6荧光试剂中加入γ-球蛋白，此时混有不同比例血清白蛋白和纤维蛋白的荧光谱(模拟真实血液中的比例值)；
图6为实施例1中向TABD-Py-PF6荧光试剂中加入γ-球蛋白，此时混有不同浓度的葡萄糖(模拟真实血糖变化)；
图7为实施例1中向TABD-Py-PF6荧光试剂加入血清主要成分的混合成分荧光谱图，从左到右依次是A血清白蛋白，B血清白蛋白、纤维蛋白原，C血清白蛋白、纤维蛋白原、γ-球蛋白，D血清白蛋白、纤维蛋白原、γ-球蛋白、葡萄糖，E血清白蛋白、纤维蛋白原、γ-球蛋白、葡萄糖、尿素，F血清白蛋白、纤维蛋白原、γ-球蛋白、葡萄糖、尿素、胆固醇。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。
以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。
表1
以下实施例中所述荧光分光光度计的激发波长为370nm；所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液。
实施例1
一种检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)TABD-Py-PF6的制备
取(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯100mg，4-吡啶硼酸63.7mg，四(三苯基膦)钯11.9mg，碳酸钾168.9mg，加入至250mL的双口烧瓶中，抽真空、充氮气三次，之后注入120mL甲苯/甲醇体积比为3:1的混合溶剂；在氮气保护条件下，加热至77℃反应24h，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液为洗脱机，采用柱层析分离得到黄色固体粉末，其中，二氯甲烷和甲醇体积比为20:1。通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体粉末为TABD-Py，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):3.89(s,6H),6.83(s,2H),7.18-7.28(m,8H),7.95-7.97(d,4H),8.75-8.77(d,4H).
13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):166.48,150.24,146.69,144.41,142.92,129.92,129.84,127.47,52.19.
FTIR：1700cm-1为羰基特征峰，1286cm-1为甲基特征峰，1600cm-1为吡啶环特征峰，1400cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.For C30H24N2O4,476.5；found,476.
(2)TABD-Py-I的制备
将100mg的TABD-Py-PF6溶于20mL二氯甲烷中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液中加入90mg碘甲烷，40℃反应12h后，加入10mL正己烷，过滤，得到黄色固体TABD-Py-I；
(3)TABD-Py-PF6的制备
将50mg的TABD-Py-I溶于10mL丙酮中，加入10mL饱和六氟磷酸钾水溶液，25℃下反应30min后，用二氯甲烷萃取后减压蒸馏，得到黄色固体；
通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体为TABD-Py-PF6，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm):3.85(s,6H),4.40(s,3H),6.88(d,2H),7.26-7.37(m,6H),7.91-7.92(d,4H),8.10-8.12(d,2H),8.75(s,2H),9.05-9.07(d,2H).
13C-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm)：166.21,154.66,150.62,146.36,146.11,145.55,130.33,130.03,128.46,128.29,126.58,125.57,52.73,48.06.
FTIR：1725cm-1为羰基特征峰，1280cm-1为甲基特征峰，1603cm-1为吡啶环特征峰，1437cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.for C31H27N2O4 +,491.6；found,491.2.
(4)TABD-Py-PF6荧光试剂的制备
将6.32mg TABD-Py-PF6溶于10mL PBS缓冲液中，配制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL PBS缓冲液，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL PBS缓冲液，振荡均匀，得到TABD-Py-PF6荧光试剂，浓度为10-5mol/L。
实施例2
一种检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)TABD-Py-PF6的制备
取(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯100mg，4-吡啶硼酸60mg，四(三苯基膦)钯10mg，碳酸钾150mg，加入至250mL的双口烧瓶中，抽真空、充氮气三次，之后注入120mL甲苯/甲醇体积比为2:1的混合溶剂；在氮气保护条件下，加热至70℃反应18h，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液为洗脱机，采用柱层析分离得到黄色固体粉末，其中，二氯甲烷和甲醇体积比为20:1。通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体粉末为TABD-Py，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):3.89(s,6H),6.83(s,2H),7.18-7.28(m,8H),7.95-7.97(d,4H),8.75-8.77(d,4H).
13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):166.48,150.24,146.69,144.41,142.92,129.92,129.84,127.47,52.19.
FTIR：1700cm-1为羰基特征峰，1286cm-1为甲基特征峰，1600cm-1为吡啶环特征峰，1400cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.For C30H24N2O4,476.5；found,476.
(2)TABD-Py-I的制备
将100mg的TABD-Py-PF6溶于20mL二氯甲烷中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液中加入80mg碘甲烷，于30℃反应8h后，加入10mL正己烷，过滤，得到黄色固体TABD-Py-I；
(3)TABD-Py-PF6的制备
将50mg的TABD-Py-I溶于10mL丙酮中，加入10mL饱和六氟磷酸钾水溶液，在搅拌下，于10℃下反应30min，用二氯甲烷萃取后减压蒸馏，得到黄色固体；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体为TABD-Py-PF6，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm):3.85(s,6H),4.40(s,3H),6.88(d,2H),7.26-7.37(m,6H),7.91-7.92(d,4H),8.10-8.12(d,2H),8.75(s,2H),9.05-9.07(d,2H).
13C-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm)：166.21,154.66,150.62,146.36,146.11,145.55,130.33,130.03,128.46,128.29,126.58,125.57,52.73,48.06.
FTIR：1725cm-1为羰基特征峰，1280cm-1为甲基特征峰，1603cm-1为吡啶环特征峰，1437cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.For C31H27N2O4 +,491.6；found,491.2.
(4)TABD-Py-PF6荧光试剂的制备
将6.32mg TABD-Py-PF6溶于10mL PBS缓冲液中，配制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mLPBS缓冲液，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL PBS缓冲液，振荡均匀，得到TABD-Py-PF6荧光试剂，浓度为10-5mol/L。
实施例3
一种检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)TABD-Py-PF6的制备
取(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯100mg，4-吡啶硼酸70mg，四(三苯基膦)钯20mg，碳酸钾200mg，加入至250mL的双口烧瓶中，抽真空、充氮气三次，之后注入120mL甲苯/甲醇体积比为4:1的混合溶剂；在氮气保护条件下，加热至80℃反应30h，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液为洗脱机，采用柱层析分离得到黄色固体粉末，其中，二氯甲烷和甲醇体积比为20:1。通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体粉末为TABD-Py，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):3.89(s,6H),6.83(s,2H),7.18-7.28(m,8H),7.95-7.97(d,4H),8.75-8.77(d,4H).
13C-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):166.48,150.24,146.69,144.41,142.92,129.92,129.84,127.47,52.19.
FTIR：1700cm-1为羰基特征峰，1286cm-1为甲基特征峰，1600cm-1为吡啶环特征峰，1400cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.for C30H24N2O4,476.5；found,476.
(2)TABD-Py-I的制备
将100mg的TABD-Py-PF6溶于20mL二氯甲烷中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液中加入100mg碘甲烷，于40℃反应16h后，加入10mL正己烷，过滤，得黄色固体TABD-Py-I；
(3)TABD-Py-PF6的制备
将50mg的TABD-Py-I溶于10mL丙酮中，加入10mL饱和六氟磷酸钾水溶液，在搅拌下，于30℃下反应2h，用二氯甲烷萃取后减压蒸馏，得到黄色固体；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述黄色固体为TABD-Py-PF6，其核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm):3.85(s,6H),4.40(s,3H),6.88(d,2H),7.26-7.37(m,6H),7.91-7.92(d,4H),8.10-8.12(d,2H),8.75(s,2H),9.05-9.07(d,2H).
13C-NMR(400MHz,C2D6SO)δ(ppm)：166.21,154.66,150.62,146.36,146.11,145.55,130.33,130.03,128.46,128.29,126.58,125.57,52.73,48.06.
FTIR：1725cm-1为羰基特征峰，1280cm-1为甲基特征峰，1603cm-1为吡啶环特征峰，1437cm-1为苯环特征峰。
MS(MALDI-TOF):calcd.For C31H27N2O4 +,491.6；found,491.2.
(4)TABD-Py-PF6荧光试剂的制备
将6.32mg TABD-Py-PF6溶于10mL PBS缓冲液中，配制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL PBS缓冲液，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL PBS缓冲液，振荡均匀，得到TABD-Py-PF6荧光试剂，浓度为10-5mol/L。
以下实施例为实施例1中所述TABD-Py-PF6荧光试剂的应用实施例：
实施例4
TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的特异性识别试验：
分别向3mL实施例1中所述的TABD-Py-PF6荧光试剂中加入900μg的待测物质血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原，葡萄糖，胆固醇和尿素，用荧光分光光度计测量TABD-Py-PF6荧光试剂的初始荧光强度I0和加入待测物质后TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度I；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光谱图，如图1所示，可知，TABD-Py-PF6荧光试剂对对γ-球蛋白具有特异性点亮响应，而对其他蛋白质均无明显变化，即TABD-Py-PF6荧光试剂可以实现血清中对γ-球蛋白的特异性检出效果。
实施例5
TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的定量检测试验：
步骤一：γ-球蛋白浓度的定量检测标准曲线的获取
取900μg的γ-球蛋白，分次加入3mL实施例1所述的TABD-Py-PF6荧光试剂中，每次加入γ-球蛋白的量为90μg；用荧光分光光度计测量TABD-Py-PF6荧光试剂的初始荧光强度I0及每次加入γ-球蛋白后的荧光强度Ii；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光谱图，如图2所示，可知，随着γ-球蛋白浓度的增加，TABD-Py-PF6荧光试剂的发光强度逐渐增加；取各γ-球蛋白浓度对应的TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度最高的点，与γ-球蛋白浓度对应作图，得到图3；由图3可知，TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白最低检测限为5.38μg/mL；且TABD-Py-PF6荧光试剂的变化率(Ii-I0)/I0与γ-球蛋白浓度在30～300μg/mL范围内呈现线性关系，其线性方程表示为：Y＝0.01862X+0.09452，R2＝0.99887，其中，Y表示(Ii-I0)/I0，X表示γ-球蛋白浓度，R表示线性相关度；
所述线性方程Y＝0.01862X+0.09452即为γ-球蛋白浓度的定量检测标准曲线。
步骤二：γ-球蛋白浓度的定量检测标准曲线的获取的验证
(1)血清白蛋白对γ-球蛋白的检出干扰试验：
配制血清白蛋白与γ-球蛋白质量比为400:300的溶液A；取3mL的TABD-Py-PF6荧光试剂逐次加入溶液A，每次滴加6μL，保证每次加入γ-球蛋白的量为90μg，用荧光分光光度计测量TABD-Py-PF6荧光试剂的初始荧光强度I0和每次加入溶液A后TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度Ik；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率(Ik-I0)/I0随γ-球蛋白浓度的变化曲线，如图4所示，可知，血清白蛋白的加入对γ-球蛋白的波动荧光强度变化影响不大，即血清白蛋白不影响实施例5所述TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的定量检出效果。
(2)血清组分波动的检出试验
因为实际血液中，血清白蛋白与纤维原蛋白组分比例是存在一定波动，波动范围为：血清白蛋白：纤维蛋白原＝10.5～21:1，所以配置两种比例：A：血清白蛋白:γ-球蛋白：纤维蛋白原＝400:300:38(血清白蛋白：纤维蛋白原＝10.5:1)；B：血清白蛋白:γ-球蛋白：纤维蛋白原＝400:300:19(血清白蛋白：纤维蛋白原＝21:1)，以上各成分质量比均在人体血清正常范围内。
取3mL的TABD-Py-PF6荧光试剂分别逐次加入体系A、B，每次滴加6μL，保证每次加入γ-球蛋白的量为90μg，荧光试剂的初始荧光强度I0及每次加入γ-球蛋白后的荧光强度Il(激发波长为370nm)；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率(Il-I0)/I0，由图5可知，血清白蛋白与纤维原蛋白组分的波动荧光强度变化影响不大，即不影响TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的定量检出效果。
(3)血糖组分波动的检出试验
糖尿病中后期往往会引发肝炎，导致肝脏功能一步步衰竭，在实际测试中，需要面临血糖波动的情况，血糖波动范围为6.7-13.4，,所以配置两种比例：A：血清白蛋白:γ-球蛋白：纤维蛋白原:葡萄糖＝400:300:38:6.7；B：血清白蛋白:γ-球蛋白：纤维蛋白原:葡萄糖＝400:300:38:13.4，以上各成分质量比均在人体血清正常范围内。
取3mL的TABD-Py-PF6荧光试剂分别逐次加入体系A、B，每次滴加6μL，保证每次加入γ-球蛋白的量为90μg，荧光试剂的初始荧光强度I0及每次加入γ-球蛋白后的荧光强度Im(激发波长为370nm)；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率(Im-I0)/I0，由图6可知，血糖波动对荧光强度变化影响不大，即不影响TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的定量检出效果。
(4)血清组分的检出试验根据实施例1中方法得到TABD-Py-PF6荧光试剂。
将血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、胆固醇、葡萄糖和尿素按照不同的组分混合，得到体系A～E，其成分分别为：A为血清白蛋和纤维蛋白原的混合液，其中血清白蛋白和纤维蛋白原的质量比为400:38；B为血清白蛋白、γ-球蛋白和纤维蛋白原的混合液，其中血清白蛋白、γ-球蛋白和纤维蛋白原的质量比为400:300:38；C为血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原和葡萄糖的混合液，其中血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原和葡萄糖的质量比为400:300:38:6.7；D为血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、葡萄糖和尿素的混合液，其中血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、葡萄糖和尿素的质量比400:300:38:6.7:1；E为血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、葡萄糖、尿素和胆固醇的混合液，其中血清白蛋白、γ-球蛋白、纤维蛋白原、葡萄糖、尿素和胆固醇的质量比为400:300:38:6.7:1:4，以上各成分质量比均在人体血清正常范围内。
取3mL的TABD-Py-PF6荧光试剂分别逐次加入体系A、B、C、D、E，每次滴加6μL，保证每次加入γ-球蛋白的量为90μg，荧光试剂的初始荧光强度I0及每次加入γ-球蛋白后的荧光强度In(激发波长为370nm)；并根据测量结果绘制TABD-Py-PF6荧光试剂的荧光强度变化率(In-I0)/I0，由图7可知，血清中其他成分的存在造成的荧光波动不大，即不影响TABD-Py-PF6荧光试剂对γ-球蛋白的定量检出效果。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，其特征在于：所述荧光试剂由TABD-Py-PF6和良溶剂1组成；其中，所述TABD-Py-PF6的结构式如下：
所述良溶剂1为磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂，其特征在于：所述TABD-Py-PF6的浓度为10-3～10-5mol/L。
3.一种如权利要求1或2所述的检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)将(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碱性盐溶解于甲苯和甲醇的混合溶剂中，在无水无氧条件下，于70～80℃搅拌反应18～30h，提纯，得到(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二(4-吡啶)基-1,3-丁二烯，简称TABD-Py；
(2)将TABD-Py溶解于溶剂中，得到TABD-Py溶液；向TABD-Py溶液中加入碘甲烷，于30～40℃下反应8～16h，加入沉淀剂，过滤，得到固体a；
(3)将固体a溶解于丙酮中，加入饱和六氟磷酸钾水溶液，在搅拌下，于10～30℃反应0.5～2h，提纯，干燥，得到TABD-Py-PF6；
(4)将TABD-Py-PF6溶解于良溶剂1中，混合均匀，得到所述检测微量血清γ-球蛋白的荧光试剂。
4.根据权利要求3所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：
步骤(1)所述(1Z,3Z)-1,4-二(4-甲氧羰基)苯基-1,4-二溴-1,3-丁二烯、4-吡啶苯硼酸、四(三苯基膦)钯和碱性盐的质量比为1:0.60～0.7:0.1～0.2:1.5～2；所述甲苯与甲醇的体积比为2～4:1；
步骤(2)所述TABD-Py与碘甲烷的质量比为1:0.8～1；
步骤(3)所述丙酮和饱和六氟磷酸钾水溶液的体积比为1:1。
5.根据权利要求3所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述碱性盐为碳酸钾；步骤(2)所述溶剂为二氯甲烷；所述的沉淀剂为正己烷。
6.根据权利要求3所述的一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述提纯采用柱层析分离；步骤(3)所述提纯采用萃取或减压蒸馏。
7.一种如权利要求1或2所述的检测微量γ-球蛋白的荧光试剂的应用，其特征在于：所述荧光试剂应用于溶液荧光检测微量γ-球蛋白。
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