JPH07120431A - γ−ポリグルタミン酸の定量法 - Google Patents
γ−ポリグルタミン酸の定量法Info
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- JPH07120431A JPH07120431A JP4029891A JP2989192A JPH07120431A JP H07120431 A JPH07120431 A JP H07120431A JP 4029891 A JP4029891 A JP 4029891A JP 2989192 A JP2989192 A JP 2989192A JP H07120431 A JPH07120431 A JP H07120431A
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- Japan
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- pga
- gel
- gamma
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- electrophoresis
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 納豆の品質上の目安の基になり、又、カルシ
ュム腸管吸収剤として開発されつつあるγーポリグルタ
ミン酸（γ−ＰＧＡ）を簡便、迅速、且つ容易に定量
し、分子量まで測定すること。 【構成】 γ−ＰＧＡを含む試料を、特別の処理を施す
なくポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ゲル平板
又はゲルデスクを、先ずクマシーブリリアントブルー色
素で染色し、更に脱染色後、メチレンブルー、サフラニ
ンＯ等の塩基性色素で染色し、更に脱染色後デンシトメ
トリーを行なう事によるγ−ＰＧＡの定量法。本法は分
子量マーカーも同時に泳動することによって分子量測定
可能である。
ュム腸管吸収剤として開発されつつあるγーポリグルタ
ミン酸（γ−ＰＧＡ）を簡便、迅速、且つ容易に定量
し、分子量まで測定すること。 【構成】 γ−ＰＧＡを含む試料を、特別の処理を施す
なくポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ゲル平板
又はゲルデスクを、先ずクマシーブリリアントブルー色
素で染色し、更に脱染色後、メチレンブルー、サフラニ
ンＯ等の塩基性色素で染色し、更に脱染色後デンシトメ
トリーを行なう事によるγ−ＰＧＡの定量法。本法は分
子量マーカーも同時に泳動することによって分子量測定
可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はγ−ＰＧＡを定量する方
法に関するものである。
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】γ−ＰＧＡは微生物によって生産される
ことは良く知られている。例えば、γ−ＰＧＡは、納豆
の粘りのもとであり、その品質を計る目安になってい
る。また、ある種の枯草菌によって生産されたγ−ＰＧ
Ａはカルシュム腸管吸収剤として用途開発がなされつつ
ある。しかしながら、γ−ＰＧＡを簡便、迅速、且つ容
易に定量する方法がないので、そのような定量法が切に
望まれていた。
ことは良く知られている。例えば、γ−ＰＧＡは、納豆
の粘りのもとであり、その品質を計る目安になってい
る。また、ある種の枯草菌によって生産されたγ−ＰＧ
Ａはカルシュム腸管吸収剤として用途開発がなされつつ
ある。しかしながら、γ−ＰＧＡを簡便、迅速、且つ容
易に定量する方法がないので、そのような定量法が切に
望まれていた。
【０００３】従来、γ−ＰＧＡの定量法として、γ−Ｐ
ＧＡを含む試料から、硫酸銅やエタノールを用いて沈澱
させ、その沈殿物の重量測定およびＫｉｊｅｒｄｅｒ法
による総窒素の測定を行なうもの（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉ
ｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４５巻、４１５ペ
ージ、１９４２年； 藤井久雄，農化，３７巻、４０７
ページ、１９６３年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸
量を測定する方法（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｗｒｉｇｔ，
Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６
０巻、８９ページ、１９５０年）及び、塩基性色素との
定量的な結合を利用した比色法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃ
ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０
７巻、５９３ページ、１９５４年）が知られている。
ＧＡを含む試料から、硫酸銅やエタノールを用いて沈澱
させ、その沈殿物の重量測定およびＫｉｊｅｒｄｅｒ法
による総窒素の測定を行なうもの（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉ
ｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４５巻、４１５ペ
ージ、１９４２年； 藤井久雄，農化，３７巻、４０７
ページ、１９６３年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸
量を測定する方法（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｗｒｉｇｔ，
Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６
０巻、８９ページ、１９５０年）及び、塩基性色素との
定量的な結合を利用した比色法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃ
ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０
７巻、５９３ページ、１９５４年）が知られている。
【０００４】一方分子量の測定は、超遠心分離による方
法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２０７巻、５９３ページ、１９５４
年）と、ゲルクロマトグラフィーによる方法（特開平１
−１７４３９７）が知られている。
法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２０７巻、５９３ページ、１９５４
年）と、ゲルクロマトグラフィーによる方法（特開平１
−１７４３９７）が知られている。
【０００５】上記の、従来のγ−ポリグルタミン酸の定
量法では、いずれにおいても、簡便、迅速、且つ容易に
定量し、且つ分子量分布まで知ることはできない。
量法では、いずれにおいても、簡便、迅速、且つ容易に
定量し、且つ分子量分布まで知ることはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、γ−ＰＧＡ
を含む試料から特に精製する事無く簡便、迅速、且つ容
易に定量し、同時に分子量分布についても測定する方法
を提供する事を目的とする。
を含む試料から特に精製する事無く簡便、迅速、且つ容
易に定量し、同時に分子量分布についても測定する方法
を提供する事を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（ＰＡＧＥ）は、タンパク質などの高分子を
分子量別に分離する方法として、生化学の分野で広く用
いられている分析手法である。泳動された蛋白質の検出
にはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ
Ｒ）が最もよく用いられる。γ−ポリグルタミン酸は、
グルタミン酸がγ−位のカルボキシル基とα−位のアミ
ノ基の間の脱水縮合により重合した構造をもつ一種のポ
リペプタイドである。しかしＣＢＢＲでは染色する事が
全くできない。
電気泳動法（ＰＡＧＥ）は、タンパク質などの高分子を
分子量別に分離する方法として、生化学の分野で広く用
いられている分析手法である。泳動された蛋白質の検出
にはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ
Ｒ）が最もよく用いられる。γ−ポリグルタミン酸は、
グルタミン酸がγ−位のカルボキシル基とα−位のアミ
ノ基の間の脱水縮合により重合した構造をもつ一種のポ
リペプタイドである。しかしＣＢＢＲでは染色する事が
全くできない。
【０００８】そこで、発明者らは、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により泳動されたγ−ＰＧ
Ａを検出するために、種々、鋭意検討した結果、泳動さ
れたγ−ＰＧＡがポリアクリルアミドゲル電気泳動平板
上又はデスクゲルで塩基性色素により、よく染色される
ことを発見した。本発明はこの発見を基に完成されたも
のである。
ゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により泳動されたγ−ＰＧ
Ａを検出するために、種々、鋭意検討した結果、泳動さ
れたγ−ＰＧＡがポリアクリルアミドゲル電気泳動平板
上又はデスクゲルで塩基性色素により、よく染色される
ことを発見した。本発明はこの発見を基に完成されたも
のである。
【０００９】すなわち、本発明は、γ−ＰＧＡを含有す
る試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動し、
次にポリアクリルアミドゲル平板又はゲルデスクを塩基
性色素でγ−ＰＧＡを染色し、次にγ−ＰＧＡのバンド
以外の部分を脱染色した後、γ−ＰＧＡの染色バンドの
濃さをデンシトメーターで測定することによるγ−ＰＧ
Ａの定量法である。
る試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動し、
次にポリアクリルアミドゲル平板又はゲルデスクを塩基
性色素でγ−ＰＧＡを染色し、次にγ−ＰＧＡのバンド
以外の部分を脱染色した後、γ−ＰＧＡの染色バンドの
濃さをデンシトメーターで測定することによるγ−ＰＧ
Ａの定量法である。
【００１０】本発明を更に詳しく述べる。本発明におい
ては、γ−ＰＧＡ定量のための特別な試料調製は必要な
い。γ−ＰＧＡを含有するものであれば何でもよい。勿
論、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、通常
なされる試料調製を施してもかまわない。即ち、ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を添加しての煮沸処理、ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）添加しての煮沸処理などを
施してもよい。
ては、γ−ＰＧＡ定量のための特別な試料調製は必要な
い。γ−ＰＧＡを含有するものであれば何でもよい。勿
論、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、通常
なされる試料調製を施してもかまわない。即ち、ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を添加しての煮沸処理、ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）添加しての煮沸処理などを
施してもよい。
【００１１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡ
ＧＥ）は実験室で通常行なわれているＬａｅｍｍｌｉ
法、Ｄａｖｉｓ法のどちらでもよく、またＳＤＳ添加ゲ
ルを用いて良い。ゲルはデスク法、平板法のどちらを採
用しても良い。また、泳動のための装置、泳動条件も実
験室で通常おこなわれているものでよい。ポリアクリル
アミドゲルのゲル濃度は３％から１０％、好ましくは４
％から７％位のものを用いるとよい。勿論初発濃度この
様なものにして、グラジェント濃度のゲル平板又はゲル
デスクを作成して使用してもよい。
ＧＥ）は実験室で通常行なわれているＬａｅｍｍｌｉ
法、Ｄａｖｉｓ法のどちらでもよく、またＳＤＳ添加ゲ
ルを用いて良い。ゲルはデスク法、平板法のどちらを採
用しても良い。また、泳動のための装置、泳動条件も実
験室で通常おこなわれているものでよい。ポリアクリル
アミドゲルのゲル濃度は３％から１０％、好ましくは４
％から７％位のものを用いるとよい。勿論初発濃度この
様なものにして、グラジェント濃度のゲル平板又はゲル
デスクを作成して使用してもよい。
【００１２】又、市販のゲル平板（例えば、「ＳＤＳ−
ＰＡＧプレート４／２０」、８４（Ｗ）×７０（Ｈ）×
１．０ｍｍ、１２ウェル（１ウェルの幅は約４ｍｍ）、
第一化学薬品株式会社製）を使用してもかまわない。
ＰＡＧプレート４／２０」、８４（Ｗ）×７０（Ｈ）×
１．０ｍｍ、１２ウェル（１ウェルの幅は約４ｍｍ）、
第一化学薬品株式会社製）を使用してもかまわない。
【００１３】泳動のための電流、電圧、泳動時間など
も、通常の実験書（生化学実験講座１−タンパク質の化
学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人出版）に書いてあ
る条件で行なってよい。
も、通常の実験書（生化学実験講座１−タンパク質の化
学Ｉ、日本生化学会編、東京化学同人出版）に書いてあ
る条件で行なってよい。
【００１４】泳動装置より、ポリアクリルアミドゲル平
板又はゲルデスクを取外し、通常の蛋白質染色に使用す
るＣＢＢＲ溶液で染色する。この操作でγ−ＰＧＡ以外
の蛋白質を紫に染色する。
板又はゲルデスクを取外し、通常の蛋白質染色に使用す
るＣＢＢＲ溶液で染色する。この操作でγ−ＰＧＡ以外
の蛋白質を紫に染色する。
【００１５】更に、この平板又はゲルデスクを塩基性色
素で染色する。塩基性色素としてはクリスタルバイオレ
ット、アニリンブルー、サフラニンＯ、メチレンブル
ー、メチルバイオレット、トルイジンブルー、ヘマトキ
シリン、アルシアンブルー、アクリジンオレンジ等が用
いる事ができる。
素で染色する。塩基性色素としてはクリスタルバイオレ
ット、アニリンブルー、サフラニンＯ、メチレンブル
ー、メチルバイオレット、トルイジンブルー、ヘマトキ
シリン、アルシアンブルー、アクリジンオレンジ等が用
いる事ができる。
【００１６】そのなかでも、好ましいものは、サフラニ
ンＯ，メチレンブルー、トルイジンブルー、アルシアン
ブルーである。しかし、これらは１例に過ぎないので、
この他の、γ−ＰＧＡを染色可能な塩基性色素であれば
何を用いてもかまわない。
ンＯ，メチレンブルー、トルイジンブルー、アルシアン
ブルーである。しかし、これらは１例に過ぎないので、
この他の、γ−ＰＧＡを染色可能な塩基性色素であれば
何を用いてもかまわない。
【００１７】以下はゲル平板による電気泳動法の場合に
ついて述べるが、ゲルデスク法の電気泳動についても大
体同様である。
ついて述べるが、ゲルデスク法の電気泳動についても大
体同様である。
【００１８】０．１％から１％の、好ましくは０．５％
の塩基性色素溶液（０〜１０％酢酸、最良は３％）にゲ
ル平板を浸しγ−ＰＧＡを染色する。染色時間は、１ｍ
ｍ厚のゲルの場合、室温、１〜３０分で、最良は５分位
である。
の塩基性色素溶液（０〜１０％酢酸、最良は３％）にゲ
ル平板を浸しγ−ＰＧＡを染色する。染色時間は、１ｍ
ｍ厚のゲルの場合、室温、１〜３０分で、最良は５分位
である。
【００１９】次に染色されたγ−ＰＧＡの成分のバンド
を鮮明にするため、ゲル平板を洗浄する。即ち、ゲル平
板を蒸留水、又は、０．０１％から１０％（好ましくは
約３％）酢酸溶液に１０分間浸す。更に新しい蒸留水、
または酢酸溶液に取替えて同時間浸す。この操作を染色
されたバンドが鮮明になるまで繰返す。酢酸溶液で洗浄
した場合は、最後に蒸留水で洗浄することが必要であ
る。そうでないと鮮明なバンドがぼける。
を鮮明にするため、ゲル平板を洗浄する。即ち、ゲル平
板を蒸留水、又は、０．０１％から１０％（好ましくは
約３％）酢酸溶液に１０分間浸す。更に新しい蒸留水、
または酢酸溶液に取替えて同時間浸す。この操作を染色
されたバンドが鮮明になるまで繰返す。酢酸溶液で洗浄
した場合は、最後に蒸留水で洗浄することが必要であ
る。そうでないと鮮明なバンドがぼける。
【００２０】この操作は１ｍｍ厚、８４ ｘ ７０ ｍ
ｍのゲル平板の場合、蒸留水の場合、室温、５０ｍｌ
で，１０分、３〜１０回、最良５回。３％酢酸の場合、
５０ｍｌで、１〜５回、最良３回である。
ｍのゲル平板の場合、蒸留水の場合、室温、５０ｍｌ
で，１０分、３〜１０回、最良５回。３％酢酸の場合、
５０ｍｌで、１〜５回、最良３回である。
【００２１】この様な操作により、ポリアクリルアミド
ゲル平板上の泳動されたγ−ＰＧＡは、塩基性色素とし
てメチレンブルーの場合には青緑色に、サフラニンの場
合は赤橙色に、アルシアンブルーの場合は青緑色に、ト
ルイジンブルー場合は青紫色に各々染る。なお、γ−Ｐ
ＧＡを含む被検体に蛋白質が混入していた場合は、上記
「００１４」の欄に記載したように、前以てＣＢＢＲで
紫色に染色してあるので、これらの塩基性色素で染色さ
れることはない。また色調の相違から蛋白質とγ−ＰＧ
Ａは明瞭に区別することが可能である。
ゲル平板上の泳動されたγ−ＰＧＡは、塩基性色素とし
てメチレンブルーの場合には青緑色に、サフラニンの場
合は赤橙色に、アルシアンブルーの場合は青緑色に、ト
ルイジンブルー場合は青紫色に各々染る。なお、γ−Ｐ
ＧＡを含む被検体に蛋白質が混入していた場合は、上記
「００１４」の欄に記載したように、前以てＣＢＢＲで
紫色に染色してあるので、これらの塩基性色素で染色さ
れることはない。また色調の相違から蛋白質とγ−ＰＧ
Ａは明瞭に区別することが可能である。
【００２２】次に染色されたバンドの濃さをデンシトメ
ーターで測定する。
ーターで測定する。
【００２３】この場合、デンシトメーターとしては、ア
トーＡＣＤ−２５ＤＸコンピューティングデンシトメー
ター（アトー株式会社製）を使用する。
トーＡＣＤ−２５ＤＸコンピューティングデンシトメー
ター（アトー株式会社製）を使用する。
【００２４】その他の機種として、コンテスモデル８０
０ファイバーオプティックスキャナー（Ｋｏｎｔｅｓ
ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｇｒｏ
ｕｐ製）、Ｈｏｅｆｅｒ ＧＳ３００ デュアルスピー
ドスキャンニングデンシトメーター（Ｈｏｅｆｅｒ Ｃ
ｏ．製，株式会社シー・エス・アイ・ジャパンより購
入）、バイオラッドモデル１６５０II デンシトメータ
ー（日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社より購
入）、バイオラッド モデル６２０ ビデオデンシトメ
ーター（日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社より
購入）を使用できる。
０ファイバーオプティックスキャナー（Ｋｏｎｔｅｓ
ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｇｒｏ
ｕｐ製）、Ｈｏｅｆｅｒ ＧＳ３００ デュアルスピー
ドスキャンニングデンシトメーター（Ｈｏｅｆｅｒ Ｃ
ｏ．製，株式会社シー・エス・アイ・ジャパンより購
入）、バイオラッドモデル１６５０II デンシトメータ
ー（日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社より購
入）、バイオラッド モデル６２０ ビデオデンシトメ
ーター（日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社より
購入）を使用できる。
【００２５】このデンシトメトリーの場合、測定波長は
可視光であれば概ね利用できるが、好ましくは染色に利
用した色素とγ−ＰＧＡの複合体の最大吸収波長（サフ
ラニンＯ：４６０ｎｍ，メチレンブルー：５８０ｎｍ，
トルイジンブルー：５６０ｎｍ、アルシアンブルー：６
００ｎｍ ）±１００ｎｍで行なうのが良い。
可視光であれば概ね利用できるが、好ましくは染色に利
用した色素とγ−ＰＧＡの複合体の最大吸収波長（サフ
ラニンＯ：４６０ｎｍ，メチレンブルー：５８０ｎｍ，
トルイジンブルー：５６０ｎｍ、アルシアンブルー：６
００ｎｍ ）±１００ｎｍで行なうのが良い。
【００２６】この様にして、簡便、迅速、且つ容易にＣ
ＢＢＲ（紫色）と塩基性色素の色調の違いから、タンパ
クとγ−ＰＧＡを区別できる。塩基性色素陽性のγ−Ｐ
ＧＡのバンドの移動度から分子量の測定、染色バンドの
濃さはデンシトメーターによる濃度測定で定量を行なう
ことにより、世界はじめてγ−ＰＧＡの分子量測定、分
離定量を可能にした。
ＢＢＲ（紫色）と塩基性色素の色調の違いから、タンパ
クとγ−ＰＧＡを区別できる。塩基性色素陽性のγ−Ｐ
ＧＡのバンドの移動度から分子量の測定、染色バンドの
濃さはデンシトメーターによる濃度測定で定量を行なう
ことにより、世界はじめてγ−ＰＧＡの分子量測定、分
離定量を可能にした。
【００２７】
【発明の効果】従来の分析法では、分析終了まで２ない
し５日の日数を要していたのに、本発明では２ないし５
時間で終了する上に、分子量分布まで測定可能になった
ことは極めて大きな効果である。
し５日の日数を要していたのに、本発明では２ないし５
時間で終了する上に、分子量分布まで測定可能になった
ことは極めて大きな効果である。
【００２８】
実施例１ 市販納豆より藤井らの方法（藤井久雄，農化，３７巻、
４０７ページ、１９６３年）に従い、γ−ＰＧＡの精製
標品を得た。
４０７ページ、１９６３年）に従い、γ−ＰＧＡの精製
標品を得た。
【００２９】即ち、市販納豆に水を加え、攪拌後、ガー
ゼで固形物を分離する。更に粘稠液から遠心分離により
菌体を除き、透明液を得た。これを２倍容の９４％エタ
ノールに攪拌しながら注入する。粘塊を蒸留水に再溶解
し、蒸留水に対する透析により低分子を除く。溶液のｐ
Ｈを苛性ソーダで７．５に調節後、再び、２倍容のエタ
ノールに注入し、粘塊を得た。このエタノール沈殿操作
と蒸留水に対する再溶解、蒸留水に対しての透析の操作
を更に２回繰返した。最終的に蒸留水に透析した液を、
凍結乾燥し、白色粉末を得た。
ゼで固形物を分離する。更に粘稠液から遠心分離により
菌体を除き、透明液を得た。これを２倍容の９４％エタ
ノールに攪拌しながら注入する。粘塊を蒸留水に再溶解
し、蒸留水に対する透析により低分子を除く。溶液のｐ
Ｈを苛性ソーダで７．５に調節後、再び、２倍容のエタ
ノールに注入し、粘塊を得た。このエタノール沈殿操作
と蒸留水に対する再溶解、蒸留水に対しての透析の操作
を更に２回繰返した。最終的に蒸留水に透析した液を、
凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【００３０】これを用いて各種の濃度（０〜１０ｍｇ／
ｍｌ）の溶液を調製した。
ｍｌ）の溶液を調製した。
【００３１】電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ法のＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動において、アクリルアミド
濃度４〜２０％のグラジェントゲル（商品名：ＳＤＳ−
ＰＡＧプレート４／２０）（１ｍｍ厚のスラブ型ゲル、
１２ウエル、第一化学薬品製）を用いた。
ポリアクリルアミド電気泳動において、アクリルアミド
濃度４〜２０％のグラジェントゲル（商品名：ＳＤＳ−
ＰＡＧプレート４／２０）（１ｍｍ厚のスラブ型ゲル、
１２ウエル、第一化学薬品製）を用いた。
【００３２】上記試料５μｌを等量のサンプル処理バッ
ファー（０．２５Ｍトリスヒドロキシアミノメタン、２
％ドデシル硫酸ナトリウム、３０％グリセロール、１０
％β−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）と混合し、
１００℃で２分間処理後全量を電気泳動に供した。また
同時に分子量マーカーも同様に泳動した。
ファー（０．２５Ｍトリスヒドロキシアミノメタン、２
％ドデシル硫酸ナトリウム、３０％グリセロール、１０
％β−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）と混合し、
１００℃で２分間処理後全量を電気泳動に供した。また
同時に分子量マーカーも同様に泳動した。
【００３３】泳動バッファーの組成は０．０２５Ｍトリ
スヒドロキシアミノメタン、０．１９２Ｍグリシン、
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ８．４とした。泳動条件は室温、
６０ｍＡ（０．７１ｍＡ／ｍｍ2 一定電流で１時間と
した。電源はバイオラッド モデル３，０００Ｘｉ（日
本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）を使用し
た。泳動槽は第一化学薬品株式会社製の「カセット電気
泳動槽第一」を使用した。
スヒドロキシアミノメタン、０．１９２Ｍグリシン、
０．１％ＳＤＳ，ｐＨ８．４とした。泳動条件は室温、
６０ｍＡ（０．７１ｍＡ／ｍｍ2 一定電流で１時間と
した。電源はバイオラッド モデル３，０００Ｘｉ（日
本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）を使用し
た。泳動槽は第一化学薬品株式会社製の「カセット電気
泳動槽第一」を使用した。
【００３４】泳動終了後、常法に従いＣＢＢＲによる染
色と脱染色を行なった。即ちゲル平板を染色液（０．１
％ＣＢＢＲ，６０％エタノール、１０％酢酸）に浸漬
し、室温で３０分、穏やかに振盪した。次に、ゲル平板
を脱色液（１０％エタノール、７．５％酢酸）中に移
し、室温で、穏やかに振盪した。ゲルの色と脱色液の色
が平衡に達したら、脱色液を交換し振盪を続けた。この
脱色の操作を、ゲルのバックグラウントが完全に無色に
なるまで繰り返した。
色と脱染色を行なった。即ちゲル平板を染色液（０．１
％ＣＢＢＲ，６０％エタノール、１０％酢酸）に浸漬
し、室温で３０分、穏やかに振盪した。次に、ゲル平板
を脱色液（１０％エタノール、７．５％酢酸）中に移
し、室温で、穏やかに振盪した。ゲルの色と脱色液の色
が平衡に達したら、脱色液を交換し振盪を続けた。この
脱色の操作を、ゲルのバックグラウントが完全に無色に
なるまで繰り返した。
【００３５】脱色したゲル平板を更に０．５％メチレン
ブルー、３ ％酢酸溶液に室温で５分程度浸漬した。こ
のゲル平板を蒸留水５０ｍｌの中に移し，室温で、穏や
かに約１０分間振盪した。この蒸留水によるゲル平板の
洗浄（脱色）操作を５回繰り返した。その結果、きれい
な青緑色の染色像が得られた。
ブルー、３ ％酢酸溶液に室温で５分程度浸漬した。こ
のゲル平板を蒸留水５０ｍｌの中に移し，室温で、穏や
かに約１０分間振盪した。この蒸留水によるゲル平板の
洗浄（脱色）操作を５回繰り返した。その結果、きれい
な青緑色の染色像が得られた。
【００３６】分子量マーカーとの比較の結果、γ−ＰＧ
Ａの分子量は３０万付近であった。
Ａの分子量は３０万付近であった。
【００３７】このゲルをガラス板（ＡＣＤ−２５ＤＸ付
属のサンプルキャリァー）、アトーＡＣＤ−２５ＤＸコ
ンピューテイングデンシトメーター（アトー株式会社
製）に装着し、ゲルのレーンごとに高分子側から低分子
側へスキャンし、波長５７５ｎｍの透過光の強度を測定
した。
属のサンプルキャリァー）、アトーＡＣＤ−２５ＤＸコ
ンピューテイングデンシトメーター（アトー株式会社
製）に装着し、ゲルのレーンごとに高分子側から低分子
側へスキャンし、波長５７５ｎｍの透過光の強度を測定
した。
【００３８】チャート上のγ−ＰＧＡのバンドに相当す
る部分の面積を、試料のγ−ＰＧＡ濃度に対してプロッ
トすると、図１の如くに、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直
線性が認められた。
る部分の面積を、試料のγ−ＰＧＡ濃度に対してプロッ
トすると、図１の如くに、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直
線性が認められた。
【００３９】実施例２ 実施例１において、メチレンブルーの替りにサフラニン
Ｏを用い，塩基性色素染色時の脱色液を１０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．９８）とする以外は全く同様にし
て、赤橙色のゲル染色像を得た。４７５ｎｍの波長を用
いる以外は実施例１と同様なデンシトメトリーを行なっ
た結果、図１の如くに、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線
性が認められた。
Ｏを用い，塩基性色素染色時の脱色液を１０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．９８）とする以外は全く同様にし
て、赤橙色のゲル染色像を得た。４７５ｎｍの波長を用
いる以外は実施例１と同様なデンシトメトリーを行なっ
た結果、図１の如くに、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線
性が認められた。
【００４０】実施例３ 実施１において、メチレンブルーの替りにトルイジンブ
ルーを用いる以外は全く同様にして、青紫色のゲル染色
像を得た。５５０ｎｍの波長を用いる以外は実施例１と
同様なデンシトメトリーを行なった結果、図１の如く
に、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線性が認められた。
ルーを用いる以外は全く同様にして、青紫色のゲル染色
像を得た。５５０ｎｍの波長を用いる以外は実施例１と
同様なデンシトメトリーを行なった結果、図１の如く
に、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線性が認められた。
【００４１】実施例４ 実施１において、メチレンブルーの替りにアルシアンブ
ルーを用いる以外は全く同様にして、青緑色のゲル染色
像を得た。６００ｎｍの波長を用いる以外は実施例１と
同様なデンシトメトリーを行なった結果、図１の如く
に、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線性が認められた。
ルーを用いる以外は全く同様にして、青緑色のゲル染色
像を得た。６００ｎｍの波長を用いる以外は実施例１と
同様なデンシトメトリーを行なった結果、図１の如く
に、５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲で直線性が認められた。
【００４２】実施例５ 大豆の熱水抽出液５０ｍｌを１５０ｍｌ容量の三角フラ
スコに分注し、１２１℃、１５分殺菌し、培地とした。
この培地に市販の納豆から分離したγ−ＰＧＡ生産性の
納豆菌株ＭＲ−１を接種し、３７℃、２４時間、往復振
盪（１２０ｒｐｍ）培養した。得られた培養液を遠心分
離することにより菌体を除き、上澄液４５ｍｌを得た。
スコに分注し、１２１℃、１５分殺菌し、培地とした。
この培地に市販の納豆から分離したγ−ＰＧＡ生産性の
納豆菌株ＭＲ−１を接種し、３７℃、２４時間、往復振
盪（１２０ｒｐｍ）培養した。得られた培養液を遠心分
離することにより菌体を除き、上澄液４５ｍｌを得た。
【００４３】この上澄液５μｌを「００３２」の欄に記
載の処理を施し、実施例１に用いた電気泳動ゲル平板の
サンプル孔に注入し、実施例１と同様に電気泳動を行な
った。また同時に分子量マーカーも泳動した。
載の処理を施し、実施例１に用いた電気泳動ゲル平板の
サンプル孔に注入し、実施例１と同様に電気泳動を行な
った。また同時に分子量マーカーも泳動した。
【００４４】更に実施例１と同様の染色、脱染色を行な
った。
った。
【００４５】得られたゲル平板の染色像について実施例
１と同様なデンシトメトリーを行なった。実施例１で得
た検量直線に照し合せて、生産されたγ−ＰＧＡの量を
求めた。その結果、ＭＲ−１菌株によって生産されたγ
−ＰＧＡの生産量は２ｍｇ／ｍｌであった。なお、生産
されたγ−ＰＧＡの分子量は分子量マーカーより約３０
万と求まった。
１と同様なデンシトメトリーを行なった。実施例１で得
た検量直線に照し合せて、生産されたγ−ＰＧＡの量を
求めた。その結果、ＭＲ−１菌株によって生産されたγ
−ＰＧＡの生産量は２ｍｇ／ｍｌであった。なお、生産
されたγ−ＰＧＡの分子量は分子量マーカーより約３０
万と求まった。
【図１】本発明によるγ−ＰＧＡ測定法の検量線（サン
プル中のγ−ＰＧＡの濃度とデンシトメトリーのピーク
面積との関係）。
プル中のγ−ＰＧＡの濃度とデンシトメトリーのピーク
面積との関係）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯浅 克己 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 茂田井 宏 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と電
気泳動後のポリアクリルアミドゲルについての塩基性色
素による染色法を組合せる事による、γ−ポリグルタミ
ン酸（γ−ＰＧＡ）の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4029891A JPH07120431A (ja) | 1992-01-22 | 1992-01-22 | γ−ポリグルタミン酸の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4029891A JPH07120431A (ja) | 1992-01-22 | 1992-01-22 | γ−ポリグルタミン酸の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07120431A true JPH07120431A (ja) | 1995-05-12 |
Family
ID=12288597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4029891A Pending JPH07120431A (ja) | 1992-01-22 | 1992-01-22 | γ−ポリグルタミン酸の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07120431A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103267666A (zh) * | 2013-02-21 | 2013-08-28 | 山东理工大学 | 一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法 |
| CN110954531A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-03 | 东莞理工学院 | 一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法 |
-
1992
- 1992-01-22 JP JP4029891A patent/JPH07120431A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103267666A (zh) * | 2013-02-21 | 2013-08-28 | 山东理工大学 | 一种蛋白质和γ-聚谷氨酸同时着色的复染方法 |
| CN110954531A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-03 | 东莞理工学院 | 一种测定溶液中γ-PGA浓度的亚甲基蓝比色法 |
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