KR102483189B1 - 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제조하는 방법에 관한 것으로, 가교 반응시 조건을 최적화함으로써 빠른 시간 안에 점탄성이 우수한 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 얻을 수 있으며, 이렇게 제조된 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔은 수술 후 조직 유착방지제 등 창상피복재, 인공보형물, 안면 필러와 같이 조직수복용생체재료를 포함하는 의료기기 분야에 폭넓게 사용이 가능하다.

Description

가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조방법{The manufacturing Method of cross-linked poly-γ-glutamic acid hydrogel}

본 발명은 가교된 폴리감마글루탐산 하이드로겔 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폴리감마글루탐산을 용해, 가교, 정제/탈염, 멸균 공정으로 제조한 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

폴리감마글루탐산(Poly-γAcid, γ은 글루탐산의 γ카르복실기와 글루탐산의 α-아미노기가 아미드(amide) 결합된 음이온성 친수성의 아미노산 고분자(γ폴리펩타이드)로서, 콩 발표식품의 점액성의 성분으로 한국의 청국장, 일본의 낫또, 네팔의 키네마 등에서 분리된 바실러스 속 (Bacillus subtilis) 균으로부터 생산된다. 또한 폴리감마글루탐산은 식용 가능한 미생물 발효를 통해 얻어진 끈적한 점조성의 천연 고분자물질로서 생분해성의 높은 수화능과 생물학적 안전성이 매우 우수한 생체적합성 물질이다. 그런 이유로 폴리감마글루탐산은 식품으로 섭취가 가능하고 최근 면역 활성 효능이 알려지면서 화장품 및 의약품 분야까지 활용 가능한 영역이 넓어지고 있다.

폴리감마글루탐산은 높은 수화능을 가지는 장점에도 불구하고 수화된 하이드로겔은 점탄성이 낮아 생체 내에서 형태를 유지해야 되는 의료기기 분야에는 그 응용의 한계가 있었고 근래에 가교에 의한 방법으로 이를 해결하고자 하는 시도들이 있었으며, 그 대표적인 예는 다음과 같다.

일본특허 공개공보 제1999-276572호에는 폴리감마글루탐산염의 음이온 카르복실기에 키토산 등의 제4급 아민염이 수소결합된 폴리감마글루탐산염 복합체를 수술용 봉합사, 창상 피복재, 유착방지제, 지혈제 등으로 이용한 예를 개시하고 있다.

일본특허 공개공보 제1999-343339호에는 폴리감마글루탐산에 디에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(Diethylenegylcol diglycidyl ether)와 같은 폴리에폭시 화합물을 가교제로 사용하여 가교 반응시키고, 이를 유착방지제로 적용한 것이 국제 공개특허공보 제2007/132785호에 개시되어 있다. 하지만 의료현장에서 겔화(in situ gelation)시켜 사용해야 되는 원리로 이를 현장에 적용하기에는 불가능하다.

또한 일본특허 공개공보 제2002-128899호에는 폴리감마글루탐산의 카르복실기와 친핵체와의 반응을 촉진시키기 위해서 수용성 카르보디이미드(carbodiimide)를 사용한 예가 개시되어 있다. 또한 폴리감마글루탐산과 푸룩토오스, 라이신, 키토산 등을 수용성 카르보디이미드 3-(3-dimethyl aminopropyl)-1-ethylcarbodiimide (EDC)를 사용하여 이중 가교화합물로서 제조한 예가 개시되어 있다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0000040호에서는 폴리감마글루탐산에 염을 첨가하여 용해시킨 다음, 감마선 조사를 통해 가교를 진행하는 방법을 제시하고 있으나 감마선과 같은 방사선은 일반적인 연구실에서는 사용이 금지되어 있으므로 접근성이 낮을 뿐만 아니라 실제 제품화 하기 위해서는 대량 생산이 필요한데, 감마선 조사는 이에 적합하지 않다. 또한, 감마선을 통해 주요 물질이 부수적인 반응을 일으켜 예상하지 못한 부산물이 발생될 가능성이 존재한다.

일본특허 공개공보 제1999-276572호 일본특허 공개공보 제1999-343339호 국제 공개특허공보 제2007/132785호 일본특허 공개공보 제2002-128899호 대한민국 공개특허 제10-2010-0000040호

이에, 본 발명자들은 가교제를 사용한 가교 반응 중 가교체 형성에 영향을 미치는 주된 요소를 연구한 결과, 가교 반응 전 용매의 pH, 가교 반응시의 온도 등에 따라 가교체 점/탄성, 가교체 형성까지의 시간이 변화되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 가교 반응 전 산성 용매에서 폴리감마글루탐산을 용해한 후 고온에서 가교 반응을 진행하는 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법을 해결과제로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제공하는 것을 구제적인 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기와 같은 수단을 개시한다.

일 양태에서, 폴리감마글루탐산을 용매에 용해하는 공정, 고온에서의 가교 공정, 정제 공정을 통해 제조하는 방법을 개시한다.

구체적으로, (1 공정) 폴리감마글루탐산을 산성 용매에 용해하는 단계;

(2 공정) 상기 용해가 끝난 혼합액에 가교제를 폴리감마글루탐산 대비 0.1 내지 0.25의 몰농도로 가하고, 고온에서 6시간 이상 정치(비교반)하여 가교 반응을 진행하는 단계;

(3 공정) 상기 가교가 완료된 폴리감마글루탐산을 완충용액 조건 하에서 300~350시간 동안 정제하는 단계; 및

(4 공정) 상기 정제가 끝난 액을 유리주사기에 충진하여, 121~125℃에서 10~20분간 멸균하고, 24시간 이상 실온에서 정치하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법을 개시한다.

상기 폴리감마글루탐산은 중량 평균 분자량이 100 내지 1000 kDa인 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 900 kDa일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 폴리감마글루탐산의 농도는 75~150mg/ml, 바람직하게는 100~130mg/ml로 용해시킬 수 있다.

상기 1 공정의 산성 용매의 pH는 4 이하이며, 0.1 ~ 3%의 염산 용액이 사용될 수 있다. 폴리감마글루탐산은 반응성이 강한 α-카르복실기가 노출되어 있는 음이온성의 고분자로 이러한 폴리감마글루탐산의 수용액상에서 구조는 이온화되어 있는 정도에 따라 다른 형상을 보인다. 또한, 이온화된 폴리감마글루탐산의 경우 불규칙코일(random coil) 구조를 가지며, 수용액의 pH에 따라 다른 구조를 가질 수 있기 때문에 가교 전 용해 시 pH에 따라 가교 양상이 상이해질 수 있다. 따라서 상기 1 공정에서 pH가 최종 가교 폴리감마글루탐산의 점탄성에 결정적인 영향을 미치는 요소로 작용할 수 있다. 또한, 용매의 산성 조건이 촉매 반응을 유도함으로써 폴리감마글루탐산의 α-카르복실기가 공유결합을 보다 빨리 형성할 수 있도록 한다.

상기 2 공정의 고온은 40~60℃이며, 바람직하게는 50℃이다. 60℃ 이상의 고온의 경우에는 점도가 오히려 감소하는 현상이 발생할 수 있으며, 상온(25℃)의 경우에는 5시간이 경과해도 점도가 형성되지 않는 문제가 발생한다.

상기 2 공정의 가교제는 상기 폴리감마글루탐산의 고분자 사슬간을 화학 결합에 의해 가교할 수 있는 물질로, 카르복실 그룹(Carboxylgroup)과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 갖는 다관능성 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용하는 가교제로는 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(Poly(ethylene glycol)diglycidyl ether, PEGDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(Ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 디비닐설폰(Divinyl sulfone, DVS), 폴리스티렌 설포네이트(Polystyrene sulfonate), 폴리(3, 4- 에틸렌 디옥시티오펜)(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene, PEDOT)이며, 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 가교제가 가지는 특정 치환기(에폭사이드기 또는 설폰기)가 폴리감마글루탐산의 α-카르복실기와 강력하게 반응함으로써 공유결합으로 연결된 가교 폴리감마글루탐산이 형성될 수 있다.

상기 3 공정은 투석막을 사용하거나 사용하지 않은 상태로 진행할 수 있으며, 1XDulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)(pH 7.4) 완충용액 조건 하에서 정제를 진행한다. 투석막을 사용하지 않을 경우 3일 이내가 적합하며, 1일차(수화율이 20~24%에 도달하는 시점)에 정제를 종료하는 것이 바람직하다.

상기 4 공정에서 멸균이 끝난 액은 24 시간 이상 실온에서 정치하여 최종 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제조한다.

다른 양태에서, 본 발명의 하이드로겔 제조방법에 따른 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제공할 수 있다.

상기 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔은 인공보형물, 유착방지제, 그리고 조직수복용 생체재료 등의 의료기기의 원재료로 사용이 가능하다.

보다 구체적으로, 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조 방법은 다음과 같다.

(제1 공정) 용해 단계

본 발명에서 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제조하기 위해서는 폴리감마글루탐산의 용해 과정이 필요하다. 먼저 0.1~3%의 묽은 염산용액을 용매로 하여

-PGA를 75~125mg/ml로 용해시킨다. 이때 용해 공정은 상온에서 약 2시간 동안 교반하여 진행한다.

(제2 공정) 가교 반응 단계

제1 공정에서 용해가 끝난 혼합액에 가교제를 폴리감마글루탐산 대비 0.1 내지 0.25의 몰농도로 가하고, 40~60℃ 조건에서 6시간 이상 정치(비교반)하여 가교 반응을 진행한다.

(3 공정) 정제 (투석)

제2 공정에서 가교 반응이 끝나고 단단하게 굳은 가교 폴리감마글루탐산을 투석막에 넣거나 혹은 넣지 않은 상태로 1XDPBS(pH 7.4) 완충용액 조건 하에서 300~350시간 동안 정제(투석)를 진행한다. 완충용액은 매 8시간 이상이 되면 한 번씩 교체한다.

투석막을 사용하지 않을 경우에는 1XDPBS(pH 7.4) 완충용액 조건 하에서 3일 이내로 투석한다. 바람직하게는 1일차(수화율이 20~24%에 도달하는 시점)에 투석을 종료한다.

(4 공정) 멸균

제3 공정에서 정제가 끝난 액을 유리주사기에 충진하여, 121~125℃에서 10~20분간 멸균 진행하고 빠르게 식힌다. 멸균이 끝난 액은 24시간 이상 실온에 정치하여 최종 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조를 완료한다.

본 발명의 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔은 기존 폴리감마글루탐산 보다 매우 높은 점탄성으로 생체 내 일정기간 형태 유지를 위한 의료기기로도 사용이 가능하며 조직수복용생체재료로서 지속성을 가지고 있어 유착방지제, 인공보형물, 미용 필러 등 다방면의 의료분야에서 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법으로 제조된 하이드로겔과 기존 하이드로겔의 점탄성 측정 결과이다.
도 2는 다양한 가교제를 사용한 하이드로겔의 점탄성 측정 결과이다.
도 3은 본 발명의 제조방법으로 제조된 하이드로겔의 보관 안정성 측정 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산성 조건에서 가교 폴리감마글루탐산 구조체의 제조

폴리감마글루탐산(분자량 : 약 900kDa, 제품명 :

-glutamic acid, Lot No. : LB190202, 제조사 : lubon industry co., ltd.)을 125mg/ml의 농도로 1% HCl 용액에 2시간 교반하여 용해한 후, 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)를 1/6 몰농도로 넣어주고, 50℃에서 6시간 이상 정치하여 가교하였다.

비교예 1. 중성 조건에서 가교 폴리감마글루탐산 구조체의 제조

실시예 1과 동일하게 진행하되, 실시예 1에서 1% HCl 용액 대신 증류수를 사용하였다.

비교예 2. 염기성 조건에서 가교 폴리감마글루탐산 구조체의 제조

실시예 1과 동일하게 진행하되, 실시예 1에서 1% HCl 용액 대신 1% NaOH 용액을 사용하였다.

실험예 1. 용해 조건에 따른 가교 반응 속도

실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 가교 반응 속도를 측정하였으며, 그 결과는 아래 표 1과 같다. 산성 용매에서는 가교 반응이 약 5시간 내에 완료될 정도로 신속하게 이루어졌는데 반해, 중성 조건에서는 12시간이 경과하여도 가교 반응이 완전히 완료되지 못하였으며, 염기성 조건에서는 반응 자체가 진행되지 않았다.

가교 반응이 신속하게 진행될 수 있다는 것은 공정 시간의 축소를 의미한다. 이는 본 발명의 제조방법을 통해 제조 소요시간을 최소화 할 수 있고, 궁극적으로는 제조 원가를 절감할 수 있음을 의미하는데, 특히 대량 생산에 있어서 공정 시간의 축소는 매우 중요한 부분이라는 점에서 본 발명은 의미가 있다.

	실시예 1 (산성용매)	비교예 1 (중성용매)	비교예 2 (염기성용매)
용매 조성	1% HCl	증류수	1% NaOH
20% γ-PGA를 가한 용액의 pH	3-4	7-8	9-10
가교반응 결과	빠름(약 5시간)	느림(약 12시간)	반응 진행 안됨

실시예 2. 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조

폴리감마글루탐산(분자량 : 약 900kDa, 제품명 :

-glutamic acid, Lot No. : LB190202, 제조사 : lubon industry co., ltd.)을 125mg/ml의 농도로 1% HCl 용액에 2시간 교반하여 용해한 후, 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)를 1/6 몰농도로 넣어주고, 50℃에서 6시간 이상 정치하여 가교하였다. 이후 1XDPBS 조건 하에서 312시간 동안 정제를 진행하였다. 정제가 완료된 액을 유리주사기에 충진하여, 121℃에서 15분간 멸균하고 빠르게 식힌 후 24시간 이상 실온에 정치하여 최종 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제조하였다.

비교예 3. 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조

폴리감마글루탐산 1mol과 Phosphate solvent(pH 5.5) 50ml을 3시간동안 교반하여 완전히 용해하였다. 이 용액에 BDDE 1mol을 첨가하고 1시간동안 추가 교반한 후 25℃에 4시간동안 보관하였다. 교반기를 이용하여 30분간 교반하고, 25℃의 인큐베이터에 20시간동안 보관하여 최종 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔을 제조하였다.

실험예 2. 하이드로겔의 점탄성 측정

실시예 2 및 비교예 3에서 제조된 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 점탄성을 측정하였으며, 그 결과는 도 1과 같다. 구체적으로, 제조한 하이드로겔을 상온에 24시간 이상 정치하였다. 그리고 Anton Parr Rheometer의 상부 평행판에 500ul의 하이드로겔을 투입한 후 Measuring system : pp25, Gap size : 1.0mm, Temperature : 25℃, Shear rate : 0.1/s의 조건으로 점도 및 탄성을 측정하였다.

도 1의 결과로부터, 본 발명의 제조방법으로 제조된 하이드로겔의 점도 및 탄성이 약산성 조건에서 폴리감마글루탐산을 용해한 후 상온 조건에서 가교 반응을 진행한 비교예 3의 하이드로겔에 비하여 우수한 점탄성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. DVS(Divinylsulfone)를 사용한 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조

실시예 2와 동일하게 진행하되, 가교제로 BDDE 대신 DVS(Divinylsulfone)를 사용하여 실시예 3의 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 4. EGDGE(Ethyleneglycol diglycidyl ether)를 사용한 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조

실시예 2와 동일하게 진행하되, 가교제로 BDDE 대신 EGDGE(Ethyleneglycol diglycidyl ether)를 사용하여 실시예 4의 하이드로겔을 제조하였다.

실시예 5. PEDGE(Polyethyleneglycol diglycidyl ether)를 사용한 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔의 제조

실시예 2와 동일하게 진행하되, 가교제로 BDDE 대신 PEDGE(Polyethyleneglycol diglycidyl ether)를 사용하여 실시예 5의 하이드로겔을 제조하였다.

실험예 3. 다양한 가교제를 사용한 하이드로겔의 점탄성 측정

실험예 2와 동일한 방법으로 실시예 3 내지 5에서 제조된 하이드로겔의 점탄성을 측정하였으며, 그 결과는 표 2 및 도 2와 같다.

표 2 및 도 2의 결과로부터, 본 발명의 제조방법은 가교제의 종류에 상관없이 점탄성이 우수한 하이드로겔을 제공할 수 있다는 점을 확인하였다.

	점도 [Pa·s]	탄성 [Pa]
실시예 2(BDDE)	435.98	379.164
실시예 3(DVS)	457.32	315.73
실시예 4(EGDGE)	402.85	317.371
실시예 5(PEDGE)	415.74	321.087

실험예 4. 보관 안정성 평가

실시예 2의 하이드로겔을 제조 후 즉시, 1시간, 2시간, 5시간, 7시간, 10시간, 13시간, 17시간, 20시간의 시점에서 실험예 2와 동일한 방법으로 점도를 측정하였으며, 그 결과는 표 3 및 도 3과 같다.

도 3의 결과로부터, 본 발명의 하이드로겔은 장시간 보관 후에도 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다.

제조 후 시간 (day)	점도 (Pa·s)
0	435.98
1	438.45
2	439.54
5	435.46
7	448.64
10	430.48
13	426.87
17	430.74
20	438.65

본 발명의 제조방법에 의해 제조된 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔은 보습, 재생효과 등에 효과를 나타내거나 영양성분으로 작용하여 세포재생 의료분야, 화장품 분야에서 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. (1 공정) 폴리감마글루탐산을 pH가 4 이하인 산성 용매에 용해하는 단계;
   (2 공정) 상기 용해가 끝난 혼합액에 가교제를 폴리감마글루탐산 대비 0.1 내지 0.25의 몰농도로 가하고, 40~60℃에서 6시간 이상 정치(비교반)하여 가교 반응을 진행하는 단계;
   (3 공정) 상기 가교가 완료된 폴리감마글루탐산을 완충용액 조건 하에서 300~350시간 동안 정제하는 단계; 및
   (4 공정) 상기 정제가 끝난 액을 유리주사기에 충진하여, 121~125℃에서 10~20분간 멸균하고, 24시간 이상 실온에서 정치하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 2 공정에서 가교제가 4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE), 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(PEGDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDGE), 디비닐설폰(DVS), 폴리스티렌 설포네이트 및 폴리(3, 4- 에틸렌 디옥시티오펜)(PEDOT)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 3 공정에서 투석막을 사용하여 정제하는 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 3 공정에서 완충용액이 1XDulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)(pH 7.4)인 가교 폴리감마글루탐산 하이드로겔 제조방법.

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