KR102017741B1

KR102017741B1 - 비타민 c 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102017741B1
Application number: KR1020170164128A
Authority: KR
Inventors: 권순익; 구현철
Original assignee: 주식회사 리엔젠
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-09-03
Also published as: KR20190064856A

Abstract

본 발명은 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히알루론산을 포함한 진피 충전제가 갖는 체내 지속시간이 떨어지는 문제를 해결할 수 있도록 수분흡수성과 생체적합성이 우수한 가교된 폴리감마 글루탐산 겔에 항산화 작용을 하는 물질인 비타민 C 유도체를 고정화시켜 기존 진피 충전제 보다 월등히 향상된 지속시간을 유지할 수 있도록 개량된 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 및 그 제조방법{Polygammaglutamate-based dermis filler composition with immobilized vitamin C derivatives and method for producing the same}

피부노화는 시간의 흐름에 따른 생리적 노화(chronological aging) 과정과, 외재적 요인에 의한 노화(extrinsic aging) 과정으로 나누어진다(Claude, S., et al., Free radical Biol. & Med., 26:174, 1999).

이러한 피부노화에 영향을 미치는 외부인자로는 바람, 온도, 습도, 담배연기, 공해, 자외선 등이 있으며, 특히 자외선에 의한 노화를 광노화라고 한다.

이때, 자외선은 파장에 따라 자외선 A(UVA, 320∼400 nm), 자외선 B(UVB, 290∼320 nm), 자외선 C(UVC, 200∼290 nm)로 나누어지고(Fisher,g.J., New Engl. J. Med., 337:1419, 1997), 이중 자외선 B가 광노화의 주요 요인으로 보고되었다 (Kang, S.,et al., Arch. Dermatol., 133:1208, 1997).

알려진 바와 같이, 진피층은 대다수의 타입 Ⅰ콜라겐(type Ⅰ collagen)과 약간의 타입 Ⅲ 콜라겐, 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등으로 구성되어 있는데(Bailly, C., J. Invest. Dermatol., 94:47, 1990), 피부가 만성적 일광손상을 입은 경우, 진피의 상부쪽 교원질에 비정상적인 엘라스토틱 물질(elastotic material)이 침착되고 (Yaar, M., et al., J. Invisting. Dermatol. Symp. Proc., 3:47, 1998), 프로테오글리칸(proteoglycan)이 증가되어 진피의 주 단백질인 콜라겐이 현저히 감소된다(Li, J.J., et al., Cancer Research, 56:483, 1996).

이 경우, 콜라겐은 피부 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지며, 주된 기능은 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등이 있으며, 특히 피부에 강도와 장력을 부여하여 외부 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다.

이와 같이 진피층의 90%를 차지하고 있는 콜라겐의 감소는 피부의 노화와 매우 밀접한 관계를 가진다고 보고되어 있다(Huang, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5826, 1997).

그리고, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성은 감소되고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성되며, 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

이를 해결하기 위해 진피 충전제가 개시된 바 있다.

대표적인 진피 충전제로는 히알루론산을 응용한 예를 들 수 있다.

하지만, 히알루론산은 체내에 존재하는 히알루론산 분해효소에 의해 쉽게 분해되기 때문에 체내 반감기가 대략 2-48시간 밖에 되지 않아 지속성이 현저히 떨어지는 단점이 있다.

이에, 히알루론산을 가교시킨 후 항산화물질인 아스코르부산 2글루코사이드(AA2G) 혹은 비타젠(Vitagen)을 첨가하여 지속성을 늘리고 있으나, 여전히 존재하는 히알루론산 분해효소 때문에 지속성을 현저히 늘릴 수는 없어 근본적인 해결책은 되지 못하고 있다.

국제공개특허 WO 2015/125117(2015.08.27), 'DERMOCOSMETIC FILLER AND USES THEREOF FOR AESTHETIC PURPOSES' 대한민국 공개특허 제10-2014-0072008호(2014.06.12.), '항산화제를 포함하는 피부 충전제 조성물'

본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 제반 문제점들을 감안하여 이를 해결하고자 창출된 것으로, 히알루론산을 포함한 진피 충전제가 갖는 체내 지속시간이 떨어지는 문제를 해결할 수 있도록 수분흡수성과 생체적합성이 우수한 가교된 폴리감마 글루탐산 겔에 항산화 작용을 하는 물질인 비타민 C 유도체를 고정화시켜 기존 진피 충전제 보다 월등히 향상된 지속시간을 유지할 수 있도록 개량된 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 및 그 제조방법을 제공함에 그 주된 목적이 있다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 수단으로, 폴리감마 글루탐산(poly-gamma-glutamic acid:PGA)과, 가교제 및 비타민 C 유도체를 포함하며,

상기 가교제는 BDDE(1,4-butanediol diglycidyl ether)이고, 상기 비타민 C 유도체는 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)이며;

상기 폴리감마 글루탐산과 BDDE가 반응하여 하기 구조식과 같이,

상기 BDDE의 양쪽으로 PGA가 가교되어 PGA-BDDE를 형성하고, PGA와 반응하지 않은 BDDE의 반대편 에폭시 그룹은 3-O-에틸 아스코빌이터와 반응하여 PGA-비타민 C 하이드로겔(Hydrogel)을 형성하도록 반응하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물을 제공한다.

이때, 상기 조성물은 폴리감마 글루탐산과, 글루탐산 단위체 1mol 당 상기 BDDE 0.01mol-1mol, 상기 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether) 0.001 mmol-1mol의 비율로 포함하는 것에도 그 특징이 있다.

또한, 본 발명은 비이커에 pH 5.5의 포스페이트 솔벤트(Phosphate Solvent) 50㎖와 PGA 1mol을 넣고, 메커니컬 스터러(Mechanical Stirrer)를 이용하여 3시간 동안 교반하여 완전히 용해시키는 제1단계;

완전히 용해된 PGA 솔루션에 마이크로파이펫을 이용하여 BDDE 0.01mol-1mol을 첨가한 후 1시간 동안 추가로 교반하는 제2단계;

교반이 완료되면 25℃의 인큐베이터에 4시간 동안 보관하는 제3단계;

제3단계 후, 3-O-에틸 아스코빌이터를 0.001mmol-1mol 첨가하고, 메커니컬 스터러를 이용하여 다시 30분간 교반하는 제4단계;

교반이 완료되면 다시 25℃의 인큐베이터에 20시간 동안 보관하여 PGA 하이드로겔을 만드는 제5단계;

제5단계를 거쳐 제조된 PGA 하이드로겔을 투석막에 담아 pH 7의 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액에서 300시간 동안 투석하는 제6단계; 및

투석이 완료되면 냉장보관하는 제7단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 제조방법도 제공한다.

본 발명에 따르면, 히알루론산을 포함한 진피 충전제가 갖는 체내 지속시간이 떨어지는 문제를 해결할 수 있도록 수분흡수성과 생체적합성이 우수한 가교된 폴리감마 글루탐산 겔에 항산화 작용을 하는 물질인 비타민 C 유도체를 고정화시켜 기존 진피 충전제 보다 월등히 향상된 지속시간을 유지하는 효과를 얻을 수 있다.

이하에서는, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명 설명에 앞서, 이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

또한, 본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물은 폴리감마 글루탐산(poly-gamma-glutamic acid:PGA)을 포함한다.

상기 폴리감마 글루탐산(PGA)은 D,L-글루탐산이 감마-글루타밀(γ-glutamyl)과 결합된 중합체로서 미생물에 의해 생산되는 점액성 물질이다.

즉, 발효식품 미생물인 Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis 등의 균주에 의해 생성이 되며, 각 균주에 따라 만들어지는 폴리 감마 글루탐산의 분자량과 특성에 차이가 있어 다양한 분야에 응용 되고 있다.

예컨대, 폴리감마 글루탐산(PGA)은 볏짚을 이용한 한국의 전통 콩발효식품인 청국장, 일본의 전통 콩발효식품인 낫또, 네팔의 전통 콩발효식품인 키네마 등에서 분리된 바실러스 속 균주로부터 생산되며, 바실러스 속 균주로부터 생산되는 폴리감마 글루탐산(PGA)은 식용, 수용성, 음이온성 및 생분해성 고분자물질로 흡습제, 보습제 및 화장품의 원료물질로 이용이 가능하고, 최근에는 폴리감마 글루탐산(PGA)을 이용한 난분해성 중합체의 대체상품 소재, 에스테르화 반응에 의한 내열성 플라스틱의 개발과 수용성 섬유 및 막생산 등에 관한 연구가 선진국을 중심으로 활발히 진행되고 있다.

특히, 생분해성, 생물학적 안전성이 히알루론산 보다 뛰어나고, 무엇보다도 수분흡수성(자체 무게의 5000배 이상)과 면역 증강성이 우수하다.

그런데, 이러한 폴리감마 글루탐산은 생체 내에서 형태가 유지되지 않기 때문에 의료기기 등의 응용에는 한계가 있어 가교된 폴리감마 글루탐산을 활용해야 한다.

이러한 이유로 본 발명에서도 폴리감마 글루탐산을 가교시켜 사용해야 하며, 가교제로는 BDDE(1,4-butanediol diglycidyl ether)가 사용된다.

또한, 본 발명에서는 상기 폴리감마 글루탐산이 가교제인 상기 BDDE와 가교된 PGA-BDDE 가교물에 항산화물질인 비타민 C 유도체를 반응시켜 PGA-비타민 C 하이드로겔을 형성함으로써 항산화 효과도 함께 발현되게 하면서 폴리감마 글루탐산이 오랫동안 형태를 유지하면서 쉽게 분해되지 않도록 하여 기존 히알루론산 진피 충전제가 해결하지 못한 지속성을 충분히 유지할 수 있도록 한다.

즉,

폴리감마 글루탐산은 BDDE와 반응하여 다음 [화학식 1]과 같이 가교된다.

가교제로 사용되는 BDDE의 에폭시 그룹(Epoxygrop)은 폴리감마 글루탐산(PGA)의 카르복실 그룹(Carboxylgroup)과 반응하여 PGA-BDDE를 형성하게 되며, BDDE의 양쪽으로 PGA와 가교된다.

이 상태에서, 비타민 C 유도체가 투입되면 BDDE의 한 쪽 에폭시 그룹이 PGA와 반응 후 PGA와 반응하지 않은 BDDE의 반대편 에폭시 그룹은 비타민 C 유도체와 반응하여 PGA-비타민 C 하이드로겔(Hydrogel)을 형성하게 된다.

이와 같은 하이드로겔은 말캉말캉한 겔 타입으로서, 유효성분이 급속히 분해되거나 증발하지 않도록 하여 약효를 오랫동안 유지시키는 특성이 있어 본 발명이 목적하는 바를 달성할 수 있게 된다.

이때, 상기 비타민 C 유도체는 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)이다.

상기 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)는 아스코르빈산(Ascorbic acid, 비타민 C)의 가장 안정한 유도체로서, 아스코르빈산과 동일한 방법으로 인간의 몸에서 대사되는 우수한 미백, 항산화, 주름 개선 및 항염증제로 활용되고 있다.

즉, 비타민 C 유도체인 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)는 티로시나아제의 기작을 억제하고 멜라닌 생성을 저해하여 피부를 밝게 하며, 환원력이 있어 강한 항산화활성 기능이 있고, 피부 세포와 콜라겐 형성과 합성에 반응하여 피부 재생에 기여하며, 피부 표면에서 세로토닌 부종의 발생을 억제하는 강력한 항염증 특성도 갖는 물질로 알려져 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물은 폴리감마 글루탐산을 주성분으로 하고, 가교제로 BDDE를 사용하며, 비타민 C 유도체로 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)를 사용한다.

특히, 본 발명은 비타민 C 유도체를 고정화시켜 진피 충전제의 기능 지속성을 유지하고, 항산화활성을 높일 수 있도록 주성분인 폴리감마 글루탐산과, 글루탐산 단위체 1mol 당 상기 BDDE를 0.01mol-1mol, 상기 비타민 C 유도체로 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)를 0.001mmol-1mol의 비율로 포함시키도록 구성된다.

이때, 글루탐산 단위체를 기준으로 하는 이유는 폴리감마 글루탐산은 글루탐산 단위체가 수백 - 수만 이상이 모여 이루어진 것이므로 전체 PGA의 양을 계산하기 위해서는 분자량을 정확히 알아야 하는데, 워낙 많다 보니 분자량을 정확히 알 수 없으므로 분자량을 알 수 있는 글루탐산 단위체를 기준으로 삼는 것이다.

아울러, 상기 BDDE를 상기와 같은 비율로 포함시키는 이유는 0.01mol 미만으로 포함되면 낮은 가교도로 인하여 진피 충전제의 충분한 지속시간을 유지하지 못할 뿐만 아니라, 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)와의 결합이 충분하지 않아 고정되는 양이 적어지므로 항산화 활성을 크게 기대할 수 없고; 1mol을 초과하게 되면 가교도가 급격히 높아져 충전제의 진피 주입이 어렵고 이물감을 주기 때문에 상기 범위로 한정되어야 한다.

또한, 상기 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)를 상기와 같은 비율로 포함시키는 이유는 0.001mmol 미만으로 포함되면 함량이 너무 작아 항산화 활성을 기대하기 어렵고, 1mol을 초과하게 되면 PGA와 BDDE와의 반응을 방해하여 충전제 형성을 어렵게 하므로 상기 범위로 한정되어야 한다.

이에 더하여, 본 발명에서는 상기 글루탐산 단위체 1mol을 기준으로 판테올(Panthenol)을 0.001mmol-0.005mmol, 베타-카로틴(β-carotene)을 0.001mmol-0.005 mmol 더 포함할 수 있다.

이 경우, 상기 판테올은 판토텐산의 알코올 유도체로서 세포분열을 촉진하여 피부 재생을 유도하며, 피부에 흡수시 산화되어 판토텐산으로 전환되면서 피부 상태를 개선하는데 기여하게 된다.

또한, 상기 베타-카로틴은 레티놀의 전구체 성분으로서, 항산화활성을 강화시키고 주름을 개선하는데 기여하게 된다.

덧붙여, 상기 3-O-에틸 아스코빌이터 대신 이와 대등한 관계에 있는 또다른 비타민 C 유도체인 아스코르빌팔미테이트(Ascorbyl palmitate), 마그네슘 아스코르빌포스페이트(Magnesium ascorbyl phosphate), 아스코르빌 글루코사이드(Ascorbylglucoside)를 사용할 수도 있다.

이러한 조성물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 비이커에 pH 5.5의 포스페이트 솔벤트(Phosphate Solvent) 50㎖와 PGA 1mol을 넣고, 메커니컬 스터러(Mechanical Stirrer)를 이용하여 3시간 동안 교반하여 완전히 용해시키는 제1단계가 수행된다.

그런 다음, 완전히 용해된 PGA 솔루션에 마이크로파이펫을 이용하여 BDDE 0.01mol - 1mol을 첨가한 후 1시간 동안 추가로 교반하는 제2단계가 수행된다.

이어, 교반이 완료되면 25℃의 인큐베이터에 4시간 동안 보관하는 제3단계가 수행된다.

이것은 미반응을 없애고 가교 안정화를 이루기 위함이다.

이후, 3-O-에틸 아스코빌이터를 0.001 mmol - 1mol 첨가하고, 메커니컬 스터러를 이용하여 다시 30분간 교반하는 제4단계가 수행된다.

그리고, 교반이 완료되면 다시 25℃의 인큐베이터에 20시간 동안 보관하여 PGA 하이드로겔을 만드는 제5단계가 수행된다.

이렇게 하여 제조된 PGA 하이드로겔을 투석막에 담아 pH 7의 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액에서 300시간 동안 투석하는 제6단계가 수행된다.

이때, 투석액은 24시간마다 교환해 주어야 한다.

마지막으로, 투석이 완료되면 냉장보관하는 제7단계를 거친다.

이렇게 함으로써, 본 발명에 따른 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물을 제조할 수 있게 된다.

물론, 판테올과 베타-카로틴을 더 포함하고자 할 경우에는 상기 제4단계에서 3-O-에틸 아스코빌이터와 함께 첨가하면 된다.

이하, 실시예에 대하여 설명한다.

[실시예 1]

300㎖ 비이커에 PGA 10g을 넣고, pH 5.5의 phosphate solvent 50㎖을 넣어 3시간동안 mechanical stirrer를 이용하여 교반하였다. 그런 다음, 완전 용해된 PGA solution에 마이크로파이펫을 이용하여 BDDE 0.625㎖를 첨가하여 1시간 동안 추가로 교반한 후 25 ℃의 인큐베이터에서 4시간 동안 보관하였다. 이어, PGA와 BDDE가 반응하여 가교가 이루어진 후에 14㎎의 3-O-ethyl ascorbyl ether를 첨가하고 mechanical stirrer를 이용하여 30분간 교반한 후 20시간 동안 25 ℃의 인큐베이터에서 보관하였다. 이후, 제조된 PGA 하이드로겔을 투석막에 담아 pH 7의 PBS 용액에서 300 시간 동안 투석하였으며, 투석이 끝난 후 냉장 보관하였다.

이때, 투석액은 24시간마다 교환하였다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일하게 진행하되, 판테올(Panthenol) 0.003mmol, 베타-카로틴(β-carotene)을 0.003mmol 더 포함하였다.

[비교예 1]

실시예 1과 동일하게 진행하되, PGA를 가교시키지 않고 단독으로 사용하였다.

[비교예 2]

실시예 1과 동일하게 진행하되, PGA를 가교시킨 후 비타민 C 유도체와 하이드로겔화시키지 않고 PGA 단독으로 하이드로겔화시켰다.

이와 같은 실시예와 비교예에서, 투입되는 함량이 본 발명이 제시한 몰비에 합당하는지를 다음과 같이 확인하였으며, 모두 본 발명 범주에 속하였다.

즉, PGA 10g은 0.068mol에 해당하는데, 이의 산출근거는 다음과 같다.

PGA 1mol = 147.13g이므로 10g의 PGA는 (10g×1mol)/147.13g = 0.068mol이 된다.

마찬가지의 방법으로, BDDE 0.625㎖는 BDDE 1mol = 202.25g, 밀도 = 1.1g/ml이므로 이를 질량으로 환산하면 0.625 ml×1.1g/ml = 0.687g이 되며, 이를 다시 몰로 환산하면 (0.687g×1mol)/202.25g = 0.0034mol이 된다.

동일한 방법으로, 3-O-ethyl ascorbyl ether 14㎎은 3-O-ethyl ascorbyl ether 1mol = 204.18g이므로 (0.0014g×1mol)/204.18g = 0.000007mol이 된다.

그런데, 기준은 글루탐산 단위체 1mol이므로 상기 PGA 0.068mol을 1mol로 보고, BDDE와 3-O-ethyl ascorbyl ether를 각각 환산하게 되면 BDDE는 0.05mol, 3-O-ethyl ascorbyl ether는 0.0001mol이 되어 본 발명의 몰비 범위를 모두 만족시키고 있음을 확인할 수 있다.

아울러, 체내 지속성 여부를 확인하기 위해 실시예 1,2 및 비교예 1,2에 대해 Residence Stability를 확인하였다.

이를 위해, 실시예 1,2 및 비교예 1,2의 시료 1㎖씩을 각각 웰 플레이트(Wel Plate)에 넣고 37℃로 중탕한 다음 PBS(pH 7.4) 솔루션 1㎖를 37℃가 되도록 준비한 후, 실시예 1,2 및 비교예 1,2의 시료를 천천히 부어 잠기게 하였다.

그런 다음, 만들어진 각 샘플을 37℃에서 인큐베이터에 보관하고, 매 24시간 마다 PBS 솔루션을 제거하여 각 샘플들의 무게를 측정하고 다시 PBS 솔루션 1㎖를 천천히 부어 처음 1㎖의 샘플과 비교하여 감소 혹은 증가한 값을 측정하였다.

이때, Residence Stability는 다음 [식 1]과 같이 산출하였다.

[식 1]

산출 결과, 가교되지 않은 비교예 1은 5일째 50%가 분해되었고, 9일째 완전히 분해되었다. 그리고, PGA 단독으로 하이드로겔화된 비교예 2는 9일째 50%가 분해되었고 17일째 완전히 분해되었다. 반면, 비타민 C 유도체와 하이드로겔화 된 실시예 1,2는 30일이 지나도 분해되지 않았다.

이를 통해, 본 발명에 따른 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제가 생체적합성을 유지한 채 장기간 분해되지 않고 지속성을 유지하는 것으로 확인되었다.

뿐만 아니라, 항산화 시험(Antioxidant activity test)을 위해 ABTS antioxidant assay kit의 protocol을 참고하여 실험을 준비하였다. 실험 과정은 ABTS solution을 assay buffer와 잘 섞어 7개의 농도(300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.357, 4.688 uM)를 가진 튜브로 만든 다음, 실시예 1,2 및 비교예 1,2의 각 시료 10㎕를 assay plate에 넣고 myoglobin working solution 20㎕를 첨가하였다. 그런 다음, ABTS solution 100㎕를 각 well에 첨가하여 상온에서 plate 쉐이커를 이용하여 5분간 교반한 후, stop solution 50㎕를 첨가하여 405nm의 파장에서 ELISA를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

이때, 흡광도는 낮을수록 항산화 반응이 잘 일어난 것을 의미한다.

시험결과, 아래 그래프와 같이 확인되었다.

즉, 본 발명에 따른 실시예1,2가 비교예 1,2에 비해 현저히 낮은 흡광도를 나타내었다.

이를 통해, 본 발명에 따른 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물의 항산화 특성도 매우 우수한 것으로 확인되었다.

Claims

폴리감마 글루탐산(poly-gamma-glutamic acid:PGA), 가교제 및 비타민 C 유도체를 포함하며, 상기 가교제는 BDDE(1,4-butanediol diglycidyl ether)이고, 상기 비타민 C 유도체는 3-O-에틸 아스코빌이터(3-O-ethyl ascorbyl ether)인 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물을 제조하는 방법으로서,
비이커에 pH 5.5의 포스페이트 솔벤트(Phosphate Solvent) 50㎖와 PGA 1mol을 넣고, 메커니컬 스터러(Mechanical Stirrer)를 이용하여 3시간 동안 교반하여 완전히 용해시키는 제1단계;
완전히 용해된 PGA 솔루션에 마이크로파이펫을 이용하여 BDDE 0.01mol-1mol을 첨가한 후 1시간 동안 추가로 교반하는 제2단계;
교반이 완료되면 25℃의 인큐베이터에 4시간 동안 보관하는 제3단계;
제3단계 후, 3-O-에틸 아스코빌이터를 0.001mmol-1mol, 판테올 및 베타-카로틴을 첨가하고, 메커니컬 스터러를 이용하여 다시 30분간 교반하는 제4단계;
교반이 완료되면 다시 25℃의 인큐베이터에 20시간 동안 보관하여 PGA 하이드로겔을 만드는 제5단계;
제5단계를 거쳐 제조된 PGA 하이드로겔을 투석막에 담아 pH 7의 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액에서 300시간 동안 투석하는 제6단계; 및
투석이 완료되면 냉장보관하는 제7단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 유도체를 고정화한 폴리감마 글루탐산계 진피 충전제 조성물 제조방법.
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