KR20010078440A - 고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주바실러스 서브틸리스 청국장 - Google Patents

고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주바실러스 서브틸리스 청국장 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국의 전통 콩발효식품인 "청국장"으로부터 분리된 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang, KCTC 0697BP) 및 전기 균주로부터 생산되는 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산에 관한 것이다.
본 발명의 '바실러스 서브틸리스 청국장'은 통상의 폴리-감마-글루탐산 생산균주인 바실러스 속 균주보다 고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 고농도로 생산하여 그 생산성을 향상시켰으므로, 전기 균주로부터 생산되는 폴리-감마-글루탐산은 고부가가치의 화장품 소재, 흡습제, 생분해성 플라스틱 용재 등의 제품개발에 유용하게 활용될 것이다.

Description

고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장{Bacillus subtilis var. chungkookjang Producing High Molecular Weight Poly-gamma-glutamic Acid}
본 발명은 한국의 전통 콩발효식품인 "청국장"으로부터 분리된 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang, KCTC 0697BP) 및 전기 균주로부터 생산되는 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 ① D-아미노산의 아미노기를 케토산에 전이시키는 효소인 D-아미노산 아미노전이효소(D-amino acid aminotransferase: EC 2.6.1.21)(이하, D-AAT로 약칭함), ② 알라닌 및 글루탐산의 이성질체 형성을 촉매하는 효소인 글루탐산 라세미화효소(Glutamate racemase: EC 5.1.1.3: 이하 GluRA로 약칭함)와 알라닌 라세미화효소(Alanine racemase:이하 AlaRA로 약칭함), 및 ③ 폴리-감마-글루탐산 합성효소(Poly-γ-glutamate synthase) 등의 세포내 효소복합체에 의해 세포외 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 신균주 및 전기 균주에 의해 생산되는 폴리-감마-글루탐산에 관한 것이다.
폴리-감마-글루탐산은 D, L-글루탐산이 감마-글루타밀(γ-glutamyl) 결합된 중합체인 점액성 물질로서, 볏짚을 이용한 한국의 전통 콩발효식품인 "청국장", 일본의 전통 콩발효식품인 "낫또", 네팔의 전통 콩발효식품인 "키네마" 등에서 분리된 바실러스 속 균주로부터 생산된다. 전기 바실러스 속 균주로부터 생산되는 폴리-감마-글루탐산은 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질(분자량:100,000 ~ 2,000,000)로 흡습제, 보습제 및 화장품의 원료, 에스테르 유도체의 합성에 의한 자연분해성 플라스틱의 제조를 위한 소재 물질로 이용이 가능하다.
최근, 폴리-감마-글루탐산의 생산과 이용에 관하여 난분해성 중합체의 대체상품 소재, 에스테르화 반응에 의한 내열성 플라스틱의 개발과 수용성 섬유 및 막생산 등에 관심을 둔 연구가 선진공업국을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 또한, 폴리-감마-글루탐산에 감마선 조사시 야기되는 물성변화 연구 및 가교결합제에 의한 수화겔(hydrogel)의 개발 및 산업화 연구가 추진되고 있다. 예를 들면, 폴리-감마-글루탐산의 조성, 폴리-감마-글루탐산 생산에 미치는 망간 이온의 영향, 초음파 분해에 의한 수용성 중합체로의 이용에 대한 연구 및 에스테르 유도체의 합성에 의한 저 수용성 플라스틱의 개발에 관한 연구(참조:Biosci. Biotechnol. Biochem., 60(8):1239-1242, 1996)와 바실러스 서브틸리스에 의한 폴리-감마-글루탐산 생산 및 칼슘 용해제로서의 골다공증 치료효과를 가진 건강식품으로의 활용(참조: 일본특허공개 平6-32742호) 등이 보고되고 있다. 이외에, 수계의 인 함량을 감소시켜 수질오염을 감소시키는 효과(참조: 유럽특허 제838160호)와, 방사선 조사에 의한 고 겔화성, 흡수성을 가진 생분해성 흡착성 수지를 제조하여 기저귀 등의 위생용품, 식품, 원예산업에의 응용(참조: 일본특허공개 平10-251402호) 및 활용(참조: 일본특허공개 平7-300522호, 일본특허공개 平6-322358호) 등에 관한 보고가 있다. 또한, 폴리-감마-글루탐산의 용해, 침전 및 건조에 의한 고형화 생분해성 섬유나 필름 및 필름형성제로서의 이용(참조: 일본특허공개 平7-138364호, 일본특허공개 平5-117388호), 약물담체용 폴리머(참조: 일본특허공개 平6-92870호, 일본특허공개 平6-256220호) 등에 대한 보고도 있다.
한편, 한국에서는 폴리-감마-글루탐산의 효율적 생산(참조: 대한민국 특허출원 제1997-3404호, 대한민국 특허출원 제1997-67605호)과 물성 개선 등과 같은 기초 연구와 함께, 주식회사 태평양에 의해 바실러스 낫또 균주가 생산한 폴리-감마-글루탐산을 화장품의 원료물질로 이용하고자 하는 응용연구가 진행되고 있다.
본 발명자들은 한국의 전통 콩발효식품인 청국장으로부터 분리한 내염성 균주 '바실러스 서브틸리스 청국장'이 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산을 고농도로 생산함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 균주로부터 생산된 고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 제공하는 것이다.
도 1은 세포내의 각종 효소에 의한 세포벽 및 폴리-감마-글루탐산의 구성성분 합성기작을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 '바실러스 서브틸리스 청국장'의 폴리-감마-글루탐산 생합성 경로를 가설적으로 나타낸 그림이다(1: 글루타민:2-옥소글루타레이트 아미노전이효소; 2: 글루타민 합성효소; 3: L-글루탐산:피루브산 아미노전이효소; 4: 알라닌 라세미화효소; 5: D-아미노산 아미노전이효소; 6: 폴리-감마-글루탐산 합성효소; TCA: 트리카르복실산회로).
도 3은 각 0.3mg의 균체로부터 생산된 폴리-감마-글루탐산의 농도구배 SDS-PAGE 젤 전기영동 사진이다(M: 표준 단백질 마커; 1: 바실러스 서브틸리스 168; 2: 바실러스 서브틸리스 IFO 3336a; 3: 본 발명의 균주).
도 4는 본 발명 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Strain BS4)의 계통도이다.
본 발명은 볏짚을 이용한 한국의 전통 콩발효식품인 청국장으로부터 분리된,내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang, KCTC 0697BP) 및 그로부터 생산되는 세포외 분비성 중합체인 폴리-감마-글루탐산에 관한 것이다.
본 발명은, '바실러스 서브틸리스 청국장'으로부터 생산된 폴리-감마-글루탐산 및 이들의 산업적 이용성을 뒷받침할 수 있는 다량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 '바실러스 서브틸리스 청국장'의 분리와 이들이 생산하는 폴리-감마-글루탐산을 구성하는 D, L-글루탐산의 조성비 조사 및 L-글루탐산 함유 배지에서의 폴리-감마-글루탐산의 생산성을 조사하고, 산업화 이용성에 필요한 기초자료를 제공한다.
본 발명자들은 상기와 같은 다양한 기능과 응용성을 가지고 있는 생분해성 중합체를 생산하는 미생물을 얻기 위하여, 대한민국 각지에서 생산, 시판되고 있는 콩발효식품인 청국장을 수집하여 폴리-감마-글루탐산 생산성이 우수한 균주를 탐색ㆍ분리하였다. 그 결과, 일본의 전통 콩발효식품인 낫또에서 분리된 바실러스 서브틸리스 낫또(Bacillus subtilis nattoIFO 3336a)와 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis9945a) 보다 폴리-감마-글루탐산 생산성이 우수한 바실러스 균주, '바실러스 서브틸리스 청국장'을 수득하였다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
균주의 분리 및 동정
식용, 수용성, 음이온성 및 생분해성의 폴리-감마-글루탐산을 높은 수율로 생산하며, 내염성을 지닌 본 발명의 신규 균주인 '바실러스 서브틸리스 청국장'의 분리 및 동정은 다음과 같다.
대한민국 내에서 생산되었으며, 볏짚을 이용한 전통 콩발효식품인 청국장 20 종류의 시료로부터 폴리-감마-글루탐산 고생산성을 갖는 균주를 분리하기 위하여, 각각의 청국장 시료를 증류수에 현탁시킨 다음, 60℃의 항온수조에서 20분간 열처리한다. 전기 열처리된 현탁액 소량을 1.5%의 L-글루탐산을 함유하는 폴리-감마-글루탐산 생산 한천 평판배지(GS)에 도말한 다음, 37℃ 항온기에서 3일간 배양하여 높은 점성을 나타내는 균의 집락을 순수 분리한다. 이들 분리균을 대상으로 상기와 같은 동일배지를 이용하여 2번 반복하여 계대 배양한 다음, 폴리-감마-글루탐산의 생산으로 인해 고점성을 나타내는 균집락 중 균체성장이 가장 활발한 균주를 분리한다. 전기 분리한 폴리-감마-글루탐산 고생산성 균주는 2% 한천을 함유하는 LB 평판배지에서 유백색의 균집락을 형성하는데, 이를 연속 희석법에 의해 37℃에서 20시간 배양하여 균체의 성장이 가장 활발한 균주를 분리한다.
상기의 방법에 의해 분리된 본 발명 균주의 형태학적 및 생리학적 특성은 다음과 같다.
본 발명 균주는 LB 한천 평판배지에서 배양하였을 때, 유백색의 균집락을 형성하며, 37℃ 이상의 호기적 조건에서 균체의 성장이 활발한 그람양성균으로서 55℃ 이상의 배양온도에서는 균체 성장이 둔화되는 특성이 있다. 또한, 본 발명 균주는 일반적인 바실러스 서브틸리스가 지니는 식염 내성 농도보다 높은 9.0%의 식염(NaCl) 농도에서도 생육이 가능한 내염성 균주이며, 본 발명 분리 균주의 16S rDNA 염기서열을 종래 바실러스 속 균주의 16S rDNA 염기서열과 비교분석한 결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 매우 높은 16S rDNA 염기서열의 상동성(99.0%)을 나타내었다.
그러나, 상기와 같은 높은 상동성에도 불구하고, 본 발명의 신규한 분리균주인 '바실러스 서브틸리스 청국장'은 종래 폴리-감마-글루탐산 생산에 이용되는 통상적인 바실러스 속 균주와는 달리 플라스미드를 함유하지 않아 유전자 조작을 통한 재조합 단백질의 고발현 시스템에 적합한 균주로도 이용될 수 있을 것이다. 또한, 바실러스 속 균주와는 달리 본 발명의 분리균주는 질산염 환원력이 음성이며, 포자형성이 쉽게 일어나지 않고, 망간이온에 의해서도 쉽게 유도되지 않는 특성을 가진다. 전기한 결과로부터 본 발명의 균주를 바실러스 서브틸리스로 분류하여 '바실러스 서브틸리스 청국장'(Bacillus subtilisvar.chungkookjang)으로 명명하고, 편의상 전기 균주의 명칭을 '바실러스 속 BS-4'(Bacillussp. BS-4)로 하여 1999년 11월 18일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 KCTC 0697BP의 수탁번호로 기탁하였다.
폴리-감마-글루탐산의 분석 및 관여효소의 활성측정
전기 균주에 의해 생산되는 폴리-감마-글루탐산의 정량과 중합체의 D, L-글루탐산 조성의 확인은 하기와 같이 실시한다.
'바실러스 서브틸리스 청국장'을 배양시킨 다음, 배지를 원심분리하여 폴리-감마-글루탐산이 함유된 상등액을 분리하고, 여기에 고농도 염산을 가하여 고온에서 가수분해시킨 후 광학활성 HPLC 컬럼을 이용하여 D, L-글루탐산을 분리한다. 표준곡선을 구하기 위하여, 정제한 폴리-감마-글루탐산 시료도 동일한 방법으로 분석한다. 컬럼을 통과한 물질을 D, L-글루탐산 표준곡선에 준하여 정성 및 정량한 다음, 초기 배지에 가한 유리 L-글루탐산에 대한 보정치를 계산하여 순수하게 생산된 폴리-감마-글루탐산의 함량을 계산한다.
또한, 생분해성 폴리-감마-글루탐산의 생산에 직접 관여하는 세포내 효소 D-AAT, GluRA 및 AlaRA 활성의 측정을 위하여, 본 발명 균주를 5㎖의 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 10시간 동안 배양시킨 다음, 균체를 회수하여 초음파 파쇄기로 균체를 파쇄한 후, 원심분리하여 조효소액을 얻는다. D-AAT의 활성정량은 0.1M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 중에서 D-알라닌 및 α-케토글루탐산과 상기 얻어진 조효소액을 반응시켜 효소 반응에 의해 생성된 반응 산물인 피루브산의 양을 측정함으로써 그 활성을 정량할 수 있으며, GluRA는 50mM 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 중에서 조효소액을 D-글루탐산, α-케토글루탐산 및 PLP와 반응시킨 후 효소반응에 의해 생성된 L-글루탐산을 광학활성 HPLC 컬럼으로 분석하여 그 활성을 정량할 수 있다. AlaRA는 D-알라닌을 기질로하여 알라닌 탈수소효소에 의해 생성된 피루브산을 340nm에서 흡광도 측정하여, 그 활성을 정량할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상을 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 미생물의 분리 및 동정
(1) 미생물의 분리
볏짚을 매체로하여 전통적인 콩발효법에 의해 생산된 전통 콩발효식품인 청국장을 전국 각지에서 입수하여, 시료로 사용하였다. 각 시료를 멸균 증류수에 소량 가하여 현탁시킨 다음, 60℃ 항온수조에서 20분간 열처리하여 바실러스 균이 가지는 내생포자 형성화 과정을 거친 후, 현탁액을 2% 한천을 함유하는 GS 평판배지(1.5% L-글루탐산, 5.0% 설탕, 0.27% KH2PO4, 0.42% Na2HPO4, 0.05% NaCl, 0.05% MgSO4및 0.05% 바이오틴)에 도말하고, 37℃ 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 폴리-감마-글루탐산 생산에 의해 나타나는 점액성 균집락을 형성하는 균체를 분리하였다.
분리균은 점액성 고분자 폴리-감마-글루탐산 생산에 의해 혼합 배양될 가능성을 고려하여, 중합체를 생산하지 않는 일반배지인 LB 배지상에서 연속희석법에 준해 도말한 후, 균체 성장이 가장 왕성한 균만을 순수분리하여 폴리-감마-글루탐산 생산균주로 선정하였으며, 전기 균주의 형태학적 및 생화학적 특성은 점액성의 중합체 생산이 없는 일반배지를 이용하여 규명하였다.
본 발명에 의해 얻어진 폴리-감마-글루탐산 생산균주의 중합체 생산에 관여하는 효소복합체의 구성효소 활성을 조사하기 위하여, 분리된 균주를 5㎖의 LB 액체배지에 접종하고 10시간 동안 배양하였다. 전기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 초음파 파쇄기로 균체를 파쇄하여 조효소액을 얻은 후, 이를 폴리-감마-글루탐산 생산에 관여하는 D-AAT, GluRA 및 AlaRA 효소활성 측정에 사용하였다.
(2) 미생물의 동정
상기 단계에서 분리된 식용, 수용성, 생분해성, 음이온성 폴리-감마-글루탐산 고생산 활성 균주는 폴리-감마-글루탐산 생산배지인 GS 한천 평판배지에서는 높은 점액성을 나타내는 균의 집락을 형성하였으나, 점액성 중합체를 생산하지 않는 LB 한천 평판배지에서는 유백색의 균 집락을 형성하였고, 균체의 가장자리는 톱니모양을 가진 균의 외형을 나타내었다. 균체 성장에 미치는 온도영향에서는 30℃ 이상 55℃ 이하의 범위에서 성장이 양호하였으며, 60℃ 이상에서는 균체 성장이 확인되지 않았다.
LB 액체배지를 이용한 균체 성장의 대수기에서 현미경 관찰한 결과, 그람양성의 짧은 막대모양의 외형으로서 비교균주인 바실러스 서브틸리스와 유사하였다. 한편, 또 다른 비교균주인 바실러스 리체니포미스는 대수기의 균체 외형이 가는 와형의 실모양을 나타내어, 본 발명의 분리균주와는 상이한 균체 외형을 나타내었다.
탄소원의 이용에서는 글리세린, 글루코오스, 슈크로스, 녹말 등의 탄소원 이용성에서 강한 양성 반응을 나타내었으며, 혐기배양에서는 비교균주와 동일한 양성반응을 나타내었다.
본 발명에 따라 선별된 미생물의 상세한 형태학적 및 생화학적 특성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명에서 얻어진 분리균주의 보다 정확한 동정을 위하여, 16S rDNA의 유전자 염기서열 분석을 실시하였다.
먼저, N-말단 프라이머(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 C-말단 프라이머(5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')를 사용하여 16S rDNA 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 플라스미드 pT7Blue에 클로닝하여 전체 염기서열을 결정하였다. 선별된 미생물의 16S rDNA 염기서열을 종래 보고된 여러 미생물의 16S rDNA 염기배열과 상동성을 비교한 결과, 바실러스 서브틸리스와 99.0% 상동성을 나타내었다(도 4).
그러나, 상기와 같은 높은 상동성에도 불구하고, 본 발명의 분리균주는 종래 폴리-감마-글루탐산 생산에 이용되는 통상적인 바실러스 속 균주와는 달리 플라스미드를 함유하지 않아 유전자 조작을 통한 재조합 단백질의 고발현 시스템에 적합한 균주로도 이용될 수 있을 것이다. 또한, 바실러스 속 균주와는 달리 본 발명의 분리균주는 질산염 환원력이 음성이며, 포자형성이 쉽게 일어나지 않고, 망간이온에 의해서도 쉽게 유도되지 않는 특성을 가진다.
실시예 2: 폴리-감마-글루탐산의 생산
본 발명의 분리균주를 폴리-감마-글루탐산 생산배지에 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양한 다음, 2N 황산용액을 가하여 pH가 3.0이 되도록 조절함으로써 폴리-감마-글루탐산 함유 시료액을 수득하였다. 전기 시료액을 4℃에서 10시간 동안 정치시켜 발효액 내의 다당류를 제거하고, 여기에 에탄올을 전기 발효액의 2배 부피가 되게 가하여 충분히 혼합하였다. 혼합액을 4℃에서 10시간 동안 정치시킨 후, 원심분리하여 폴리-감마-글루탐산 침전물을 얻었다. 전기 침전물에 증류수를 가하여 용해시키고, 단백질 분해효소를 100㎍/㎖가 되도록 가하여 37℃ 항온기에서 6시간 동안 정치 반응시켜 폴리-감마-글루탐산 시료에 존재하는 세포외성 단백질을 분해시켰다. 이것을 충분한 양의 증류수에서 투석하여 유리된 글루탐산을 제거한후 농축하여 순수한 폴리-감마-글루탐산을 얻고, 이들 정제된 폴리-감마-글루탐산을 산가수분해하여 생성된 D, L-글루탐산의 조성과 생산량을 측정하였다.
본 발명의 균주와 비교균주가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 생산성은 표 2에 나타낸 바와 같이, 액체배지에서 본 발명의 분리균주는 16g/L의 생산성을 보인 반면, 낫또에서 분리된 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a과 바실러스 리체니포미스 ATCC 9945a에서는 각각 10g/L와 9g/L의 폴리-감마-글루탐산 생산성을 나타내었다. 고체배지에서 폴리-감마-글루탐산의 생산성을 비교하기 위하여, 2% 한천을 포함하는 폴리-감마-글루탐산 생산배지가 포함된 평판배지에 균을 접종하여, 37℃에서 3일간 배양한 다음, 상기의 정제방법에 동일하게 폴리-감마-글루탐산을 정제하여 본 발명 분리균주와 비교균주의 생산성의 차이를 조사하였다. 실험결과, 본 발명의 분리균주는 12㎎/평판배지, 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a는 8㎎/평판배지, 바실러스 리체니포미스 ATCC 9945a는 6㎎/평판배지의 생산성을 나타내어, 본 발명 분리균주가 비교균주에 비하여 2배 이상의 생산성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 도 3의 젤사진에서 보여지는 바와 같이 각 0.3 mg의 균체당 생산된 폴리-감마-글루탐산의 양을 비교한 결과, 본 발명의 분리균주가 기존의 폴리-감마-글루탐산 생산균주인 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a 보다 월등히 많은 양의 폴리-감마-글루탐산을 생산함을 확인할 수 있다.
실시예 3 : 폴리-감마-글루탐산의 D, L-글루탐산의 입체 특이성 조사
본 발명의 분리균주가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 생산량과 폴리-감마-글루탐산의 구성성분인 D, L-글루탐산의 조성을 조사하였다.
본 발명의 분리균주가 생산하는 고분자량의 폴리-감마-글루탐산의 단량체인 D, L-글루탐산의 구성비를 조사하고자, GS 생산배지가 함유된 500㎖의 삼각 플라스크를 이용하여 150rpm, 37℃ 항온기에서 72시간 동안 배양한 다음, 상기의 정제방법과 동일하게 정제하여 얻은 순수한 폴리-감마-글루탐산 시료에 6N 염산을 가하여 탈기시킨 후, 105℃에서 10시간 동안 가수분해하였다.
상기 가수분해 산물의 아미노산 조성 분석은 5% 메탄올을 함유하는 50mM 인산완충액(pH 7.0)과 메탄올을 이용한 유기용매 농도 기울기를 이용하여 HPLC 컬럼(RexchromeS5-100-ODS, Regis Chem사, 4.6mm×25cm×5m, 미국)으로 분석하였다. 입체 이성질체의 분리는o-프탈디알데히드(OPA)를 이용하여 D, L-글루탐산의 아미노 말단부위를 유도체화 시킨 후, 형광측정기(fluorescence detector)를 이용하여 452nm(소광)와 342nm(발광)에서 D, L-글루탐산의 표준곡선에 준해 폴리-감마-글루탐산의 구성 성분인 D, L-글루탐산을 정량하였다.
생산된 폴리-감마-글루탐산을 구성하는 단량체인 D, L-글루탐산의 함량을 조사한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명 분리균주가 생산하는 폴리-감마-글루탐산에서는 D/L-글루탐산의 비율은 약 40/60이었고, 비교균주인 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a와 바실러스 리체니포미스 ATCC 9945a에서는 D/L-글루탐산의 비율이 50/50으로 분리균과는 다른 단량체 구성비를 보였다.
(1) 폴리-감마-글루탐산 생산에 관여하는 효소활성의 정량
본 발명 분리균주의 폴리-감마-글루탐산 생산에 관여하는 효소활성을 측정하기 위하여, 점액성 중합체를 생산하지 않는 LB 액체배지를 이용하여 37℃ 항온기에서 균체를 배양한 후 원심분리하고, 이를 전술한 방법에 의해 조효소액을 조제한 다음, 조효소액에 존재하는 효소활성을 측정하였다.
D-AAT의 활성은 0.1M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 중에서 D-알라닌 및 α-케토글루탐산과 조효소액을 반응시켜 효소 반응에 의해 생성된 반응 산물인 피루브산의 양을 측정함으로써 정량하였고(참조: Berntsson S,Anal. Chem., 27:1659-1660, 1955), GluRA의 활성은 50mM 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 중에서 조효소액을 D-글루탐산, α-케토글루탐산 및 PLP와 반응시킨 후, 효소반응에 의해 생성된 L-글루탐산을 광학활성 HPLC 컬럼으로 분석하여 정량하였다. 알라닌 라세미화효소 활성측정(참조:Biochemistry, 25:3261-3267, 1986)은 D-알라닌을 기질로하여 생성된 L-알라닌에 알라닌 탈수소효소를 반응시켜 생성된 피루브산을 흡광도 측정하여 정량하였다. 단백질 함량은 브레드포드 방법(참조: Bradford, M.,Anal. Biochem., 72:248-254, 1976)으로 측정하였다.
본 발명의 분리균주를 삼각 플라스크에서 배양한 후 생산되는 폴리-감마-글루탐산의 양, 분자량 및 D, L-글루탐산 비율과 효소(D-AAT, GluRA, AlaRA)의 활성 측정 결과는 표 2와 3에 나타내었다. 본 발명 분리균주가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 특성과 비교를 위하여, 일본의 낫또에서 분리된 폴리-감마-글루탐산 생산균주로 알려진 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리체니포미스의 폴리-감마-글루탐산 생산량과 효소활성도를 비교하여 표시하였다.
이상의 효소활성을 비교하여 검토한 결과, 본 발명의 분리균주는 AlaRA, GluRA 활성을 이용하여 세포성장과 폴리-감마-글루탐산의 생산에 필요한 D-Ala와 D-Glu를 합성하며, 바실러스 서브틸리스 낫또 및 바실러스 리체니포미스 보다 3배 정도 높은 D-AAT의 활성을 이용하여 D-Ala으로부터 D-Glu를 대량으로 합성하여 폴리-감마-글루탐산의 생산에 직접적으로 이용하는 경로를 가지는 것으로 예상되며, 바실러스 서브틸리스 낫또 및 바실러스 리체니포미스는 표 2, 3 및 도 1에서 보는 바와 같이, 높은 GluRA 활성을 이용하여 세포성장과 폴리-감마-글루탐산의 합성에 필요한 글루탐산을 합성하는 경로를 가지는 것으로 예상되어, 본 발명의 분리균주는 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a 및 바실러스 리체니포미스 ATCC 9945a와는 서로 상이한 아미노산 합성경로를 가지는 것으로 사료된다(도 2).
즉, 바실러스 서블틸리스 낫또 균주의 경우, 폴리-감마-글루탐산의 합성에 이용되는 D-글루탐산이 세포내의 글루탐산 라세미화 효소의 작용으로 인해 L-글루탐산이 D-글루탐산으로 전환되어 만들어지는 반면, 본 발명의 분리균주에서는 D-글루탐산이 알라닌 라세미화효소와 D-아미노산 아미노전이효소의 작용에 의해 L-글루탐산으로부터 생성된다.
실시예 3: 폴리-감마-글루탐산의 분자량의 비교
본 발명의 분리균주와 바실러스 속의 표준균주인 바실러스 서브틸리스 168 그리고, 비교균주인 바실러스 서브틸리스 낫또 IFO 3336a가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 분자량을 비교하기 위하여, 겔 여과 크로마토그래피(Asahipak GS-620H + Tosoh TSK gel)와 농도구배 SDS-PAGE를 실시하였다. 겔여과 크로마토그래피는 50mM 식염 : 아세토니트릴(4:1) 용액을 용매로 이용하여 25℃ 칼럼오븐에서 폴리에틸렌 옥사이드를 표준물질로 하여 분자량을 측정하였다. 이때, 칼럼의 유속은 분당 0.7㎖의 속도로 흘렸으며, 굴절지수 측정기를 이용하여 폴리-감마-글루탐산의 분자량을 측정하였다. 실험결과, 본 발명의 분리균주가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 분자량은 겔 여과 크로마토그래피 분석에 의해 분자량이 2,000kDa 이상으로 확인되었다. 또한, 도 3에서 보듯이, 본 발명의 분리균주는 바실러스 서브틸리스 낫또가 생산하는 폴리-감마-글루탐산의 분자량(약 1,000 ~ 2,000 KDa) 보다 휠씬 높은 분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 균주로부터 생산되는 폴리-감마-글루탐산은 수화젤 제조시 용이하므로, 유용하게 활용될 것이다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 식용, 수용성, 생분해성, 음이온성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 동정하고, 전기 균주가 종래 폴리-감마-글루탐산 생산균주와 다른 신규한 균주임을 확인하고, '바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang)'으로 명명하였으며, 편의상 전기 균주의 명칭을 '바실러스 속 BS-4'(Bacillussp. BS-4)로 하여 1999년 11월 18일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 수탁번호 KCTC 0697BP로 기탁하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국의 전통 콩발효식품인 "청국장"으로부터 분리된 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang, KCTC 0697BP) 및 전기 균주로부터 생산되는 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산을 제공한다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang)은 일반적인 바실러스 속 균주가 생산하는 세포외 폴리-감마-글루탐산 보다 분자량이 더 큰 폴리-감마-글루탐산을 생산하며, 그 생산량 또한 우수하므로, 본 발명의 균주에 의해 생산되는 폴리-감마-글루탐산은 유도체의 합성과 화학적 처리에 의해 고부가가치의 화장품 소재, 흡습제, 생분해성 플라스틱 용재 등의 제품개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 청국장으로부터 분리되어 식용 가능하며, 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리-감마-글루탐산을 생산하고, 호염성이며, 포자형성이 어려우며, 균주 자체에 플라스미드를 함유하고 있지 않는 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar.chungkookjang)(KCTC 0697BP).
  2. 제 1 항의 균주로부터 생산되는 고분자량의 폴리-감마-글루탐산.
  3. 제 2 항에 있어서,
    폴리-감마-글루탐산은 분자량이 2,000,000 Da 이상인 것을 특징으로 하는
    고분자량의 폴리-감마-글루탐산.
  4. 제 2 항의 폴리-감마-글루탐산을 제조함에 있어서,
    (ⅰ) 제 1 항의 바실러스 서브틸리스 청국장을 폴리-감마-글루탐산 생산용 배지에 접종하여 배양한 다음, 전기 배양액의 pH를 2 내지 4로 조절되도록 산을 가하여 폴리-감마-글루탐산 함유액을 수득하는 단계;
    (ⅱ) 전기 폴리-감마-글루탐산 함유액의 다당류를 제거하고, 용매추출하여 원심분리한 다음, 폴리-감마-글루탐산 침전물을 수득하는 단계;
    (ⅲ) 전기 침전물에 증류수를 가하여 용해시킨 다음, 단백질 분해효소를 처리하여 세포외성 단백질을 분해시키는 단계; 및,
    (ⅳ) 전기 분해액을 투석하여 유리 글루탐산을 제거한 다음, 농축하는 단계를 포함하는
    바실러스 서브틸리스 청국장으로부터 폴리-감마-글루탐산의 제조방법.
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