KR102403670B1

KR102403670B1 - 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법

Info

Publication number: KR102403670B1
Application number: KR1020210150413A
Authority: KR
Inventors: 최동환; 김진혁; 정현철; 김경민; 이성진; 이승훈
Original assignee: 주식회사 현대바이오랜드
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2022-05-30

Abstract

본 발명은 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 폴리감마그루탐산을 고농도로 생산가능한 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주가 높은 염농도에서도 배양이 가능하고, 상기 균주를 용암해수에서서 배양할 때, 용암해수 내의 미네랄이 폴리감마글루탐산에 결합하는 것을 본 발명을 통해 확인한다.

Description

용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법 {Method for purifying poly-gamma-glutamic acid}

본 발명은 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것이다. 상기 폴리감마글루탐산은 용암해수 배지 내에서 바실러스 균주가 배양되어 생산된 것으로서, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da이고, 용암해수에 포함되어 있는 Se, Fe, Cu, Mo, Mg, Ca와 같은 미네랄이 포함되어 있다.

폴리감마글루탐산은 D,L-글루탐산이 감마-글루타밀(r-glutamyl) 결합된 중합체인 점액성 물질로서, 볏짚을 이용한 한국의 전통 콩발효 식품인 청국장, 일본의 전통 콩 발효 식품인 낫또, 네팔의 전통 콩 발효 식품인 키네마 등에서 분리된 바실러스 속 균주로부터 생산된다. 바실러스 속 균주로부터 생산되는 PGA는 식용, 수용성, 음이온성 및 생분해성을 가지는 고분자물질로 흡습제, 보습제 및 화장품의 원료, 에스테르 유도체의 합성에 의한 자연 분해성 플라스틱의 제조를 위한 소재 물질로 이용이 가능하다. 폴리감마글루탐산의 중요한 기능으로 칼슘흡수 증진에 효과가 있는 소재로 주목받고 있으며, 기전은 아직 확실히 밝혀져 있지 않으나 폴리감마글루탐산과 칼슘을 함께 보충했을 경우, 칼슘흡수 증진 및 골대사에 긍적적으로 기여하는 것이 검증되어 있다.

신체에 필요한 영양소의 결핍이 피부에 이상을 초래한다는 것은 예전부터 잘 알려져 왔으며, 노인 인구의 증가와 의학 발달로 인한 만성 소모성 질환자가 늘어나면서 흡수 장애 및 체내 소모량 증가에 의한, 이차적인 영양소 결핍 질환의 발생이 늘어나고 있다. 체내의 미네랄(무기질)은 생체를 구성하는 원소 중 탄소, 수소, 산소 등의 원소를 제외한 생물체의 무기적 구성요소를 말하며, 인체 구조의 구성 성분으로서의 역할과 아울러 체내의 다양한 생리적인 기능에 필수 요소로서 역할을 하고 있다. 인체에서 발견되는 미네랄은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 아연, 인, 철분, 망간, 구리, 크롬, 셀레늄, boron, 코발트, molybdenum, 황 등의 15가지 영양 원소와 니켈, 요오드 등의 기타 원소로 이루어져 있다. 이중 흔히 접할 수 있는 미네랄 결핍증으로, 아연결핍증, 철 결핍증, 구리 결핍증, 셀레늄 결핍증, 망간결핍증이 있으며, 이중 철 결핍증과 구리결핍증은 모발에 손상을 주고, 염전모, 결절성 열모증, 염주모 등 증상이 있으며, 탈모를 유발한다.

본 발명에서 사용되는 용암해수란 바닷물이 현무암충과 사니질층에 자연 여과되어 육지 안으로 흘러들어 오랜기간 제주도의 화산지형 하에서 숙성되어진 물로서 제주도만이 보유한 독특한 수자원이며, 제주에서는 1980년대부터 용암해수의 저온성, 청정성 등의 특성이 있어서 용암해수를 넙치 양식장의 사육수로 활발히 사용하여 왔으며, 5-6년 전부터는 미용 등의 측면에서 사우나 등의 용수로 사용되고 있고 크게 각광을 받고 있다. 그러나 1980년부터 최근까지 이러한 용암해수의 활용방안에 대한 연구는 주로 용암해수의 염분농도가 높기 때문에 농업용수 및 음용수로의 사용이 제한되는 점을 개선하기위해 해수침투의 방지측면에서 진행되어왔고 양식장 사육수 및 사우나 용수 외에 특별한 활용방안에 대한 연구는 없는 실정이었다.

용암해수에는 일반 해수나 심층수, 삼다수보다 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 칼륨 등의 필수 미네랄뿐만 아니라 일반 유용 미네랄 성분들(철, 망간, 아연, 구리, 몰리브덴, 셀레늄 등)이 더 많이 함유되어 있다. 그 중에서도 인슐린분비를 안정시키거나 당뇨병, 고지혈증 등의 개선효과가 있다고 알려진 바나듐, 혈액순환 촉진, 면역력 증강, 항암작용을 갖는 게르마늄, 지방의 산화작용억제, 심장과 간을 유지하는 상승효과, 라디칼 소거능력, 항암, 불임, 노화 및 콜레스테롤 수치 개선효과가 있는 셀레늄의 함유는 해양심층수에서도 보고된 적이 없는 용암해수만의 특징이다. 게다가 이들 미네랄은 이온화된 상태에 있으며, 이온화된 미네랄은 인체나 타 동물에 대해 소화흡수가 용이하다. 또한, 용암해수는 대장균, 질산성질소, 인산염인, 페놀류 등이 검출되지 않은 청정한 지하수 자원이며, 비소, 수은, 카드늄 등 유해성분이 검출되지 않거나 납이 극히 미량이 검출되기 때문에 산업화 적용에 장애요인이 없는 청정 원료이다.

특히, 용암해수에 포함된 마그네슘, 칼슘 미네랄은 사람에게 필수 영양소로 사용되고 있다. 그러나 용암해수를 그 자체로 바실러스 배양을 위한 용수로 적용하는 경우 용암해수 내 고농도 염류에 의해 바실러스의 생장이 저해를 받는 경우가 있어, 이를 극복하기 위해 생산균주의 내염성을 개량하여 사용하였다.

이에 본 발명에서는 우리 몸에 유익한 미네랄이 함유되어 식용섭취 가능한 용암해수를 사용하여 미네랄 농도가 높은배지에서 폴리감마글루탐산을 생산하여, 미네랄 함량이 높은 폴리감마글루탐산을 제조하였다.

국제공개특허 제2020-204615호 (발명의 명칭 : 용암해수 유래 천연 미네랄 코팅 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 이용한 용암해수 유래 천연 미네랄 코팅 프로바이오틱스, 출원인 : 주식회사 현대바이오랜드) 대한민국 공개특허 제10-2001-0078440호 (발명의 명칭 : 고분자량의 폴리-감마-글루탐산을 생산하는 내염성 균주 바실러스 서브틸리스 청국장, 출원인 : 주식회사 바이오리더스)

본 발명의 목적은 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법을 제공하는 데에 있다. 상기 폴리감마글루탐산은 용암해수 배지 내에서 바실러스 균주가 배양되어 생산된 것으로서, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da이고, 용암해수에 포함되어 있는 Se, Fe, Cu, Mo, Mg, Ca와 같은 미네랄이 포함되어 있다.

본 발명은 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것이다. 더 자세하게는 용암해수가 포함된 물을 배양용수로 이용하는 배지에서 바실러스 서브틸리스 균주를 배양하여, 상기 균주가 폴리감마글루탐산을 생성할 때 용암해수 내에 포함되어 있는 미네랄이 결합된 고품질의 용암해수 폴리감마글루탐산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은, 보다 바람직하게는,

(제1단계) 바실러스 서브틸리스 균주를 용암해수가 10~95%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용한 배지에 접종하고 배양하여 용암해수의 미네랄이 결합된 폴리감마글루탐산이 생산된 배양액을 얻는 단계;

(제2단계) 상기 배양액에서 바실러스 서브틸리스 균주의 균체를 제거하고 한외여과하여 정제된 용액만을 수득하는 제조하는 단계; 및,

(제3단계) 상기 제2단계에서 수득한 정제 용액에 에탄올을 처리하여 침전물을 얻고, 상기 침전물을 건조하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 제1단계의 배지는 바실러스 서브틸리스 균주의 배양이 가능한 모든 배지일 수 있으나, 더 바람직하게는, 구성성분으로 L-글루탐산, 포도당, 황산암모늄, 소이펩톤, 효모추출물, 구연산이 포함되고, 상기 구성 성분을 용암해수가 10~95%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 바실러스 서브틸리스 배양용 배지일 수 있다.

보다 더 바람직하게는 상기 제1단계의 배지는 총 부피 1L 기준, L-글루탐산 1~5%(w/v), 포도당 1~5%(w/v), 황산암모늄 0.5~2%(w/v), 소이펩톤 0.01~0.1%(w/v), 효모추출물 0.1~0.5%(w/v) 및 구연산 0.1~2%(w/v)가 되도록 각 성분을 용암해수가 10~95%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 바실러스 서브틸리스 배양용 배지일 수 있다.

상기 배지의 멸균은 95~123℃, 0.12~0.30MPa에서 30~200분간 수행하는 것이 좋다.

상기 제1단계와 제2단계를 통해 바실러스 서브틸리스 균주가 폴리감마글루탐산을 생성할 때, 배지에 포함되어 있는 용암해수 내의 미네랄들이 결합하게 된다.

이 후 바실러스 서브틸리스 균주의 배양액을 여과 및 한외여과를 함으로써, 제균 및 불순물, 결합되지 않은 미네랄들이 제거되고, 용암해수의 미네랄이 결합된 폴리감마글루탐산만이 남게 되고, 이를 본 발명에서 '용암해수 폴리감마글루탐산'이라 한다.

본 발명에서 한외여과하지 않고, 바실러스 서브틸리스 균주의 배양액을 그대로 에탄올로 침지하기도 하였으나, 폴리감마글루탐산 내의 미네랄 총량이 특별히 증가하거나 하지도 않았고, 폴리감마글루탐산의 순도가 높지 않고, 이를 조미료로 사용하기에도 좋지 않은 이취나 이미 등이 발생하기도 하였다.

이 때, 한외여과를 하지 않은 상태에서 에탄올 침지하였어도 폴리감마글루탐산 침전물 내의 미네랄 총량이 달라지지 않았다는 것은, 배양액에 단순 혼합 상태로 포함되어 있던 미네랄은 폴리감마글루탐산과 함께 침전되지 않고 배양액 내에 그대로 존재하다가 제거된 것임을 설명한다.

즉, 이를 통해, 폴리글루탐산이 용암해수의 용이한 미네랄 회수에 기여하는 성분임을 입증한다.

상기 제3단계에서 에탄올 침전하여 용암해수 미네랄이 결합된 폴리감마글루탐산을 얻는 것는 것이며, 건조는 동결건조, 진공건조 또는 분무건조를 통해 수행가능하다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 용암해수 폴리감마글루탐산을 제공한다.

본 발명의 폴리감마글루탐산에는 배지 내의 용암해수에 포함된 미네랄이 거의 대부분 결합된 상태이다. 바람직하게는 셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g가 포함될 수 있다.

본 발명은 상기 용암해수 폴리감마글루탐산을 함유하는 식품, 건강기능식품, 화장품을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 용암해수 폴리감마글루탐산 제조용 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주(Bacillus subtilis HDB8039 strain, 수탁번호 KCCM13052P)에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 폴리감마글루탐산을 고농도로 생산하는 것으로 확인된 균주 중에서, 염농도가 높은 배지에서 계대배양하여 내염성이 있는 것으로 확인된 균주이다. 상기 염농도가 높은 배지는 바실러스 서브틸리스 균주의 배양이 가능한 모든 배지에 소금을 일부 더 첨가한 것으로서, 바람직하게는, 배지의 구성성분으로 소이펩톤, 효모추출물, 소금이 포함되어 있는 것일 수 있으며 상기 구성성분 중 소금은 3~10%(w/v)가 포함될 수 있다.

이를 위한 과정은 다음과 같을 수 있다. 보다 자세하게, 본 발명에서 내염성이 있는 폴리감마글루탐산 생산용 바실러스 서브틸리스를 선발하기 위한 방법은 다음의 a~d 단계들을 포함하여 수행하였다.

(a단계) 바실러스 서브틸리스가 초기 생존 가능한 염농도를 결정하는 단계;

(b단계) 바실러스 서브틸리스가 초기 생존 가능한 염농도의 평판배지에서 계대하여 적응 하는 단계; 및

(c단계) 생존 가능한 염농도의 평판배지보다 0.5%(w/v) 에서 시작하여 5%(w/v) 이상의 염농도의 평판배지로 계대하여 최대 염농도를 결정하는 단계;

(d단계) 바실러스 서브틸리스가 생존 가능한 최대 염농도의 평판배지에서 계대하여 적응 하는 단계.

각 단계에 대해 설명하자면,

a단계;는 용암해수를 그 자체로 바실러스 서브틸리스 균주 배양을 위한 용수로 적용하는 경우 용암해수 내 고농도 염류에 의해 바실러스의 생장이 저해를 받는 경우가 있어, 본 발명에서 바실러스 서브틸리스 균주 중 내염성이 높은 균주를 선발하기 위한 초기 단계이다. 이 과정은 소이펩톤, 효모추출물이 기본으로 포함된 배지에 염농도를 달리하여, 균주가 생존 가능한 염농도의 구간을 설정하는 단계이다.

b단계;는 상기 a단계에서 결정된 염농도 구간의 최고 농도에서 바실러스 서브틸리스 균주를 상기 염농도 구간에서 최고농도의 평판배지를 이용하여 계대를 진행하는 단계이다. 계대를 지속하여 최고농도의 염농도에 적응하면 내염성이 증가하게 된다.

c단계;는 상기 b단계에서 적응한 바실러스 서브틸리스 균주의 내염성을 더 높이기 위해, 상기 a단계에서 결정된 염농도 보다 0.5%(w/v) 높은 염농도의 평판배지로 계대하고, 단계적으로 1 내지 5%(w/v) 높은 염농도의 평판배지로 계대하여 바실러스 서브틸리스 균주가 생존하는 최대 염농도를 결정하였다.

d 단계;는 상기 c 단계에서 결정된 최대 염농도에서 바실러스 서브틸리스 균주의 계대를 진행하는 단계이다. 계대를 지속하여 최고농도의 염농도에 적응하면 가장 우수한 내염성을 가진 바실러스 서브틸리스 균주가 된다.

이를 통해 용암해수에서 배양가능한 균주를 선발할 수 있고, 특히, 폴리감마글루탐산 생산능이 높은 균주를 이용하여 이와 같은 선발 테스트를 할 경우, 용암해수에서 배양이 가능가능한 균주의 선발이 가능해진다.

본 발명의 '균주'에는 이의 생균체, 사균체, 배양물, 균체를 포함하는 배양액, 균체를 제거한 배양액, 배양액의 농축물, 균체나 배양액으로부터 분리된 대사체가 포함될 수 있다.

본 발명의 균주는 일반적인 유지 및 배양을 위해서는, 통상적으로 사용하는 tryptic soy agar (TSA)에 고체배양 또는 tryptic soy broth(TSB)에 액체 배양하여 계대배양할 수 있으며, 액체배양시, 100~200rpm, 30~40℃ 조건으로 60~72시간 동안 배양할 수도 있다.

본 발명에서 제조한 상기 폴리감마글루탐산은 다양한 조성물, 약학조성물, 식품조성물, 화장료 등의 첨가제로 이용가능하다.

본 발명은 용암해수의 미네랄을 함유한 폴리감마글루탐산의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 폴리감마그루탐산을 고농도로 생산가능한 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주가 높은 염농도에서도 배양이 가능하고, 상기 균주를 용암해수에서서 배양할 때, 용암해수 내의 미네랄이 폴리감마글루탐산에 결합하는 것을 본 발명을 통해 확인한다. 이로써, 별도의 기기장치를 이용한 미네랄 회수방법을 이용하지 않고도 한외여과 및 침전법을 활용한 정제방법만으로도 보다 용이하게 고품질의 폴리감마글루탐산을 얻을 수 있게 되었다.

도 1은 청국장에서 분리한 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주(수탁번호 KCCM13052P)의 16s rRNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.
도 2는 낫또에서 분리한 바실러스 서브틸리스 균주의 16s rRNA 염기서열(서열번호 2)를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

실시예 1. 고염도에서 생존 가능한 폴리감마글루탐산 생산균주의 선발 과정

폴리감마 글루탐산 생산용 균주를 분리하기 위한 청국장 시료 1 g을 멸균된 식염수 10 mL에 넣고 현탁한 후 연속희석하고 BCP (bremocresol purple) 고체배지에 도말하였다. 37℃, 24시간 배양 후 모양에 따라 콜로니를 선별하고 BCP 고체배지에 연속 계대하여 순수 분리하였다.

분리된 균주는 1ℓ 당 1.5% 펩톤(w/v), 0.5% 소이빈 펩톤(w/v), 0.5% 염화 나트륨(w/v), 1.5% 한천(w/v)가 되도록 물에 용해하여 121~123℃에서 60분간 멸균한 것을 이용하여 배양하였다.

우선 분리된 균주 중 폴리감마글루탐산 생산능이 높은 것들을 선발하였다. 이 후, 용암해수 배양을 적용하기 위해 본 발명에서 분리한 균주들이 생존 가능한 염농도 구간을 결정하기 위한 배지로 소이펩톤 1%(w/v), 효모추출물 0.5%(w/v), agar 1.5%(w/v)를 기본으로 하여, sodium chloride를 1, 3, 5, 7%(w/v)를 각각 물에 첨가하여 부피가 총 100%(v)가 되도록 용해 후, 0.15Mpa, 121℃에서 30분간 가압 멸균하였다. 멸균된 배지를 평판에 부어 굳힌 후 배지로 사용하였으며, 폴리감마글루탐산 생산균주를 각 염농도의 배지에 접종하였으며, 5% 염농도의 배지에서 생존한 콜로니를 계대 하여 적응을 완료하였다. 이후, 5.5% 염농도에서 시작하여 10% 염농도 배지까지 단계적으로 계대하여 가장 높은 염내성을 가진 균주를 최종 확보하였다.

이렇게 최종 선발된 균주의 생리학적 특성을 확인하였을 때, 25~50℃에서 배양가능하고, 최적 생육온도는 25~37℃였다. 생육가능한 pH는 6.0~7.5이고, 최적 생육 pH는 6.0~6.5인 것으로 나타났다. 최적 생육시간은 18 시간이며 최소 4시간, 최대 2일 동안 배양 가능하였다.

최종 선발된 균주의 형태학적 특성을 확인하기 위해, LB 한천 평판배지에서 37℃ 조건에서 1일간 배양했을 때, 세포의 형태는 간균(연쇄상)이며, 운동성은 없는 것으로 확인되었다. 균주의 포자형성능은 확인되지 않으며, 통성 호기성 균주로서 그람(Gram) 양성의 균주이고, 균주균락의 형태는 반투명 회색빛을 띠는 원형의 매끄러운 균락을 짓는 것이 확인된다.

다음으로는 선발된 균주의 유전자 동정을 위해, 16S rRNA 유전자 서열비교를 통한 계통유전학적 분석(phylogenetic analysis)을 수행하였다. 블라스트 유사성 조사 프로그램(Blast similarity search program: National Institute ofBiotechnology Information)을 이용하여 본 발명의 균주의 16S rRNA (서열번호 1, 도 1)와 표준 바실러스 서브틸리스 균주의 16S rRNA의 염기서열을 비교하였다. 그 결과, 두 균주 간에 높은 상동성을 나타내었다. 또한 GenBank에 등록된 동일 계열의 균주들(Strains)의 16S rRNA 유전자 서열들과 함께 각각 다중 서열 정렬을 진행한 후, 계통수(phylogenetic tree)에서의 위치를 판별하였고, 계통수 상에서도 16S rRNA 유전자가 바실러스 서브틸리스에 가장 가까운 위치에 배치되었다. 상기와 같이 본 발명의 균주를 분자생물학적으로 동정한 결과를 이용하여 바실러스 서브틸리스로서 서열번호 1(도 1)의 16s rRNA를 갖는 바실러스 서브틸리스 HDB8039라 명명하고, 2021년 9월 29일에 기탁하여 바실러스 서브틸리스 HDB8039라 명명하고 수탁번호 KCCM13052P로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM, http://www.kccm.or.kr/)에 기탁하였다.

실시예 2. 용암해수를 이용한 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 배양

다음으로는 선발된 균주에 용암해수 배양방법을 적용하였다.

이를 위해서, 용암해수 폴리감마글루탐산을 생산하기 위한 기본배지로 포도당 3%(w/v), L-글루탐산 3%(w/v), 황산암모늄 1%(w/v), 구연산 0.5%(w/v), 일인산칼륨 0.27%(w/v), 이인산나트륨 0.17%(w/v), 소이펩톤 0.1%(w/v), 효모추출물 0.25%(w/v), 염화나트륨 0.05%(w/v), 황산마그네슘 0.7%(w/v)에 용암해수 수용액을 첨가한 부피가 총 100%(v)가 되도록 발효조에 가하여 용해 후 0.15MPa, 121℃에서 30분간 가압멸균하였다. 이 때 용암해수 수용액 내의 용암해수는 농도별로 테스트하였다. 이 후 멸균된 배지에 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 종배양액^*을 발효조의 멸균배지에 접종하고 150 rpm, 37℃ 조건으로 48시간 동안 배양하였다.

*종배양액: 해당 균주를 소이펩톤 1%(w/v), 효모추출물 0.5%(w/v), 염화나트륨 0.5%(w/v)를 용해한 배지를 멸균하여 접종 후 37℃에서 24시간 배양한 것, 이하 종배양액이라 함은 이를 말함.

실시예 3. 용암해수 폴리감마글루탐산 정제

실시예 2에서 배양된 배양액을 황산을 이용하여 pH 2.7로 적정하여 필터프레스 여과 후 한외여과기(cut off: 20 kDa)를 통과시켜 배지성분, 불순물, 폴리감마글루탐산 외 단백질을 모두 제거하여 정제된 용암해수 폴리감마글루탐산 용액을 회수하였다.

실시예 4. 용암해수 폴리감마글루탐산 분말 제조방법

실시예 3에서 정제된 용암해수 폴리감마글루탐산에 액량 대비 3배수의 식용 에탄올을 가하여, 에탄올 침전하였다. 침전물을 건조하여 용암해수 폴리감마글루탐산 분말을 회수하였다.

비교예 1. 기본 폴리감마글루탐산 제조

포도당 3%(w/v), L-글루탐산 3%(w/v), 황산암모늄 1%(w/v), 구연산 0.5%(w/v), 일인산칼륨 0.27%(w/v), 이인산나트륨 0.17%(w/v), 소이펩톤 0.1%(w/v), 효모추출물 0.25%(w/v), 염화나트륨 0.05%(w/v), 황산마그네슘 0.7%(w/v)에 상수를 첨가한 부피가 총 100%(v)가 되도록 발효조에 가하여 용해 후 0.15MPa, 121℃에서 30분간 가압멸균하였다. 여기에 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 종배양액을 발효조의 멸균배지에 접종하고 150 rpm, 37℃ 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양된 배양액을 황산을 이용하여 pH 2.7로 적정하여 필터프레스 여과 후 한외여과기(cut off: 20 kDa)를 통과시켜 배지성분, 불순물, 폴리감마글루탐산 외 단백질을 모두 제거하여 정제된 폴리감마글루탐산 용액을 회수하였으며, 정제된 용액에 액량 대비 3배수의 주정을 가하여, 주정침전 시켜 건조하여 폴리감마글루탐산 분말을 회수하였다.

비교예 2. 용암해수를 이용한 타 바실러스 서브틸리스 균주의 폴리감마글루탐산 배양

포도당 3%(w/v), L-글루탐산 3%(w/v), 황산암모늄 1%(w/v), 구연산 0.5%(w/v), 일인산칼륨 0.27%(w/v), 이인산나트륨 0.17%(w/v), 소이펩톤 0.1%(w/v), 효모추출물 0.25%(w/v), 염화나트륨 0.05%(w/v), 황산마그네슘 0.7%(w/v)에 용암해수 수용액을 첨가한 부피가 총 100%(v)가 되도록 발효조에 가하여 용해 후 0.15MPa, 121℃에서 30분간 가압멸균하였다. 이 때 용암해수 수용액 내의 용암해수는 농도별로 테스트하였다. 이 후 멸균된 배지에 낫토토에서 분리한 바실러스 서브틸리스 (서열번호 2, 도 2)의 종배양액을 발효조의 멸균배지에 접종하고 150 rpm, 37℃ 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양된 배양액을 황산을 이용하여 pH 2.7로 적정하여 필터프레스 여과 후 한외여과기(cut off: 20 kDa)를 통과시켜 배지성분, 불순물, 폴리감마글루탐산 외 단백질을 모두 제거하여 정제된 폴리감마글루탐산 용액을 회수하였으며, 정제된 용액에 액량 대비 3배수의 에탄올을 가하여, 침전시켜 건조하여 분말을 회수하였다.

비교예 3. 염농도(10%)가 높은 배지(소금물 배지)에서 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 폴리감마글루탐산 배양

포도당 3%(w/v), L-글루탐산 3%(w/v), 황산암모늄 1%(w/v), 구연산 0.5%(w/v), 일인산칼륨 0.27%(w/v), 이인산나트륨 0.17%(w/v), 소이펩톤 0.1%(w/v), 효모추출물 0.25%(w/v), 염화나트륨 10%(w/v), 황산마그네슘 0.7%(w/v)에 용암해수 수용액을 첨가한 부피가 총 100%(v)가 되도록 발효조에 가하여 용해 후 0.15MPa, 121℃에서 30분간 가압멸균하였다. 이 후 멸균된 배지에 바실러스 서브틸리스 HDB8039의 종배양액을 발효조의 멸균배지에 접종하고 150 rpm, 37℃ 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 배양된 배양액을 황산을 이용하여 pH 2.7로 적정하여 필터프레스 여과 후 한외여과기(cut off: 20 kDa)를 통과시켜 배지성분, 불순물, 폴리감마글루탐산 외 단백질을 모두 제거하여 정제된 폴리감마글루탐산 용액을 회수하였으며, 정제된 용액에 액량 대비 3배수의 에탄올을 가하여, 주정침전 시켜 건조하여 분말을 회수하였다.

실험예 1. 용암해수 폴리감마글루탐산과 기본 폴리감마글루탐산의 미네랄 함량 비교

실시예 4와 비교예 1의 폴리감마글루탐산 분말의 미네랄 함량을 측정하여 표1에 나타내었다.

미네랄	비교예 1 (용암해수 0%)	비교예 3 소금물 배지(염농도 10w%)	실시예 4
미네랄	비교예 1 (용암해수 0%)	비교예 3 소금물 배지(염농도 10w%)	용암해수 10(v/v)% 배지	용암해수 30(v/v)% 배지	용암해수 50(v/v)% 배지	용암해수 95(v/v)% 배지
셀레늄(㎍/100g)	7.89	5.23	11.19	35.58	68.78	69.92
철(mg/100g)	0.45	0.32	0.99	1.74	2.90	5.85
구리(mg/100g)	0.03	0.02	0.05	0.06	0.07	0.08
몰리브덴(㎍/100g)	1.89	1.55	2.48	2.57	4.49	11.06
마그네슘(mg/100g)	1619.70	1468.20	1772.87	1928.17	2135.31	2332.9
칼슘(mg/100g)	118.10	88.42	152.06	272.09	543.23	556.45

표 1에서와 같이 일반 배지나 소금이 첨가된 배지에서는 미네랄 함량이 크게 달라지지 않았으나, 용암해수 10~95(v/v)% 수용액을 바실러스 배지의 배양용수 대신 사용한 경우에는 미네랄이 전체적으로 증가되는 것을 알 수 있다. 다만, 10 v/v)% 미만 농도의 용암해수가 포함된 경우에는 물을 배양용수와 사용한 경우와 거의 차이가 나지 않았다(표 1에는 미기재함).

이 결과를 토대로 본 발명의 방법을 통해 얻을 수 있는 폴리감마글루탐산에는 용암해수에 있는 미네랄이 대부분 포함되는 것을 확인하였다. 또한 이러한 것이 소금 농도에 의존하는 것이 아닌 용암해수 자체의 풍부한 미네랄이 일으키는 효과임을 알 수 있다.

그리고, 실험의 재현을 위해, 실시예 4의 시료를 반복 실험한 바, 셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g가 포함된 용암해수 폴리감마글루탐산이 제조됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주와 타 바실러스 서브틸리스의 생산성 비교

실시예 2의 배양액과 비교예 2의 제조공정 중에서 한외여과 전의 배양액을 통해 용암해수 폴리감마글루탐산 생산성을 비교하였다.

도 2와 도3에서 나타난 것과 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 배양액에서 낫토로부터 분리한 타 바실러스 서브틸리스의 배양액보다 17배 높은 점도가 측정되었으며, 또한 타 바실러스 서브틸리스에 비해 용암해수에서 생육도 좋은 것을 확인할 수 있다.

균주	폴리감마글루탐산 생산량(g/L)
바실러스 서브틸리스 HDB8039	9.0
낫토로부터 분리한 타 바실러스 서브틸리스	2.6

표 2에 따르면, 본 발명의 균주가 타 바실러스 서브틸리스의 생산량보다 약 5배 높은것으로 나타났다.

실험예 3. 용암해수 폴리감마글루탐산 생산균주와 타 바실러스 서브틸리스가 생산한 폴리감마글루탐산의 순도 비교

실시예 4와 비교예 4의 각 용암해수 폴리감마글루탐산 순도를 확인하였다.

이를 위해 각 제조된 폴리감마글루탐산을 가수분해하고 초음파 추출한 글루탐산에 o-프탈알데히드를 결합하여, HPLC로 폴리감마글루탐산의 함량을 분석하고, 그 결과로 순도를 분석하였다.

시료	순도(mg/g)
바실러스 서브틸리스 HDB8039가 생산한 폴리감마글루탐산	864.4
낫토로부터 분리한 타 바실러스 서브틸리스가 생산한 폴리감마글루탐산	685.3

표 3에 따르면, 각 균주가 생산한 폴리감마글루탐산 순도의 차이가 있으며, 타 바실러스 서브틸리스가 생산한 배양액의 경우, 점도도 낮고, 정제 시 순도 또한 낮은 것으로 확인하였다. 이와 같이 폴리감마글루탐산 생성률이 낮은 것은 낫또 분리 균주에서는 폴리감마글루탐산보다는 다른 단백질이 더 생성되어, 한외여과와 에탄올 침전시 상기 단백질들이 포함되었기 때문인 것으로 설명될 수 있다.

<제제예 1. 식품 제조>

제제예 1-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 1-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 1-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 1-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 1-5. 야채주스 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 1-6. 과일주스 제조

본 발명의 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주로부터 얻은 용암해수 폴리감마글루탐산 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

[수탁기관]

기탁기관명 : 한국미생물보존센터

수탁번호 : KCCM13052P

수탁일자 : 20210929

<110> HYUNDAI BIOLAND Co.,Ltd. <120> Method for purifying poly-gamma-glutamic acid <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1478 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc 60 tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa 120 ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa 180 ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa 240 cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa 360 gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt 420 agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc 480 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 540 attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600 ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 660 gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720 tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780 gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag 840 ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 900 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 960 taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag 1020 tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080 acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc 1140 ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200 ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc 1260 ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc 1320 gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380 ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag 1440 ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtctaa 1478 <210> 2 <211> 1477 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 2 gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct 60 gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120 tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag 180 gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240 ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300 agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360 tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 420 gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480 cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 540 ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600 cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 720 ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780 tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc 840 taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960 accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt 1020 gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080 cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg 1140 gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200 tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc 1260 cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg 1320 ctagtaatcg cggatcagca tgccgcgggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380 ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag 1440 ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcta 1477

Claims

(제1단계) 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주(Bacillus subtilis HDB8039 strain, 수탁번호 KCCM13052P)를 용암해수가 10~95%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용한 배지에 접종하고 배양하여 용암해수의 미네랄이 결합된 폴리감마글루탐산이 생산된 배양액을 얻는 단계;
(제2단계) 상기 배양액에서 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주의 균체를 제거하고 한외여과하여 정제된 용액만을 수득하는 제조하는 단계; 및,
(제3단계) 상기 제2단계에서 수득한 정제 용액에 에탄올을 처리하여 침전물을 얻고, 상기 침전물을 건조하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하여, 셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g의 용암해수의 미네랄을 함유하고, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da인 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 제1단계의 배지는 L-글루탐산, 포도당, 황산암모늄, 소이펩톤, 효모추출물 및 구연산이 포함되고, 상기 구성 성분을 용암해수가 10~95%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 바실러스 서브틸리스 배양용 배지인 것을 특징으로 하여, 셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g의 용암해수의 미네랄을 함유하고, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da인 폴리감마글루탐산의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조한 것을 특징으로 하여, 셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g의 용암해수의 미네랄을 함유하고, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da인 폴리감마글루탐산.
삭제
셀레늄 10~80 ㎍/100g, 철 0.7~7.0mg/100g, 구리 0.04~0.10mg/100g, 몰리브덴 2.2~12.0 ㎍/100g, 마그네슘 1650.0~2500.0 mg/100g, 칼슘 130.0~700.0 mg/100g의 용암해수의 미네랄을 함유하고, 평균 분자량이 10만 내지 1,000만 Da인 폴리감마글루탐산 제조용 바실러스 서브틸리스 HDB8039 균주(Bacillus subtilis HDB8039 strain, 수탁번호 KCCM13052P).