JP6371810B2 - ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法 - Google Patents
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Description
高分子量のPGAが示す性質に関して、例えば、非特許文献1には、分子量が100,000のPGAと比較し、分子量が2,000,000を超えるような高分子量のPGAは、抗腫瘍活性が高いことが記載されている。また、非特許文献2には、分子量が500,000及びより高分子量の2,000,000のPGAが、高い脂質代謝制御活性を有することが記載されている。
例えば、特許文献1や非特許文献3には、耐塩性を有するバチルス・サブティリス・チョングッチャン株が、1,000,000程度のPGAを生産することが記載されている。そして、このバチルス・サブティリス・チョングッチャン株は、塩化ナトリウム濃度が10%(w/v)を超える条件下では、生産されるPGAの分子量が10,000〜200,000程度まで低分子化することが記載されている。
また、特許文献2には、塩化ナトリウムが含まれる醤油麹、醤油醸造物などを含有する培地で、納豆菌株を培養し、PGAを生産することが記載されている。特許文献2に記載されたバチルス・サブティリス株は、培地に含まれる塩化ナトリウム濃度が上昇するとPGA生産能が低下すると非特許文献4に記載されている。
培地の粘度を低減する方法として、培地に含まれる塩化ナトリウムなどの塩を高濃度で含有させる方法が挙げられる。しかし、前述のように、バチルス属細菌やその近縁種において培地に含まれる塩化ナトリウムの濃度が上昇すると、生産されるPGAは一般的に低分子量化、あるいは生産性が低下する。
よって、バチルス属細菌やその近縁種において、高塩濃度条件下で分子量が300,000を超えるようなPGAの生産も、これまで困難であった。
また本発明は、高塩濃度耐性と、高塩濃度条件下での高分子量のPGA生産能を有する枯草菌を提供することを課題とする。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
さらに本発明は、受託番号NITE BP−02276、受託番号NITE BP−02277、受託番号NITE BP−02278、受託番号NITE BP−02279、受託番号NITE BP−02280、又は受託番号NITE BP−02281で特定される枯草菌に関する。
よって、本発明の枯草菌を培養することで、高分子量のPGAを生産することができる。さらに、本発明の枯草菌を高塩濃度条件下で培養することで、PGAの生産プロセスに対して負荷をかけることなく、PGAを効率よく生産することができる。
本発明の枯草菌を適当な条件下で培養することで、高分子量のPGAを生産することができる。特に、本発明の枯草菌を高塩濃度条件下で培養することで、PGAの生産プロセスに対して負荷をかけることなく、高分子量のPGAを生産することができる。
また、得られたPGAを低分子化することで所望の分子量に調整することもできる。例えば、本発明の枯草菌を適切な条件下で培養することで、高分子量のPGAを生産させ、これを酸性条件下で加熱処理、あるいはPGA分解酵素を用いた処理などによって得られたPGAを低分子量化し、PGAの分子量を所望の範囲に調整することができる。ここで、本明細書に記載する「分子量」は、「重量平均分子量」と同義である。また、塩濃度の表記「%(w/v)」又は「M」、培地成分濃度の表記「%(w/v)」又は「(g/L)」、及びPGA濃度の表記「(g/L)」はいずれも、室温における濃度である。
以下、本発明について詳細に説明する。
後述の実施例でも示すように、PGA生産能を有する公知の納豆菌は、高塩濃度に対する耐性を有さず、塩化ナトリウム濃度12%(w/v)以上のLB培地では増殖することはできない。これに対して本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性を有し、塩化ナトリウム濃度12%(w/v)以上のLB培地においても、増殖することができる。本発明の枯草菌が増殖できる塩化ナトリウム濃度の上限値は、TSB培地を用いた条件において16〜17%(w/v)(2.74〜2.91M相当)、LB培地を用いた条件において15%(w/v)(2.57M相当)である。
ここで、「塩化ナトリウム濃度12%(w/v)以上に調整したLB培地において増殖可能」とは、接種した細胞数が、塩化ナトリウム濃度12%(w/v)以上の条件において、培養により増加することを意味する。尚、本明細書において「増殖」は、培養前後の培養液の吸光度(OD600)を測定し、吸光度の増大により相対的に算出できる。
尚、「高塩濃度条件下で分子量が300,000以上のPGAの生産能を有する」とは、具体的には、塩化ナトリウムを10%(w/v)含有し、増殖に必要な栄養源、ミネラルを含有する培地を用いて培養したとき、分子量が300,000以上のPGAを少なくとも0.1g/L/3日以上、好ましくは0.5g/L/3日以上、より好ましくは1.0g/L/3日以上、より好ましくは5.0g/L/3日以上生産することを意味する。また、使用する培地には、PGAの基質となるグルタミン酸は含有しても、含有しなくともよい。さらに、グルタミン酸ナトリウム・1水和物を8%(w/v)(1.37M相当)含有する培地で培養した場合では10g/L以上、グルタミン酸を含有しない場合では0.3g/L以上、のPGAが生産できることが好ましい。
ここで、配列番号7で示される塩基配列は、枯草菌KSM−FFA610株が有する16S rRNA遺伝子の塩基配列である。また、配列番号8で示される塩基配列は、枯草菌KSM−FFB553株が有する16S rRNA遺伝子の塩基配列である。
ここで本発明において、塩基配列の同一性は、公開されたデータベースNCBI(National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.gov/)のメニュー”Nucleotide”内の”BLAST”のなかにある”Basic BLAST”を用い算出できる。あるいは、Genetyx-Win(遺伝子情報処理ソフトウェア、ゼネティックス製)のホモロジー解析プログラムを用いて、Unit size(k-tuple)を6として解析を行うことにより塩基配列の相同性を算出することもできる。
(1)表1に記載の菌学的性質を示し、且つ配列番号7で示される塩基配列、配列番号7で示される塩基配列との同一性が好ましくは99.75%以上、より好ましくは99.85%以上、より好ましくは99.90%以上の塩基配列、又は配列番号7で示される塩基配列において好ましくは1〜3個、より好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる16S rRNA遺伝子を有する枯草菌。
(2)表1に記載の菌学的性質を示し、且つ配列番号8で示される塩基配列、配列番号8で示される塩基配列との同一性が好ましくは99.75%以上、より好ましくは99.85%以上、より好ましくは99.90%以上の塩基配列、又は配列番号8で示される塩基配列において好ましくは1〜3個、より好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる16S rRNA遺伝子を有する枯草菌。
また、枯草菌KSM−FFA631株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02277として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB406株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02278として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB425株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02279として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB540株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02280として寄託された。
さらに、枯草菌KSM−FFB553株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02281として寄託された。
尚、本発明の枯草菌はいずれも野生型の微生物であり、枯草菌に分類され、納豆菌の特徴であるPGA生産能を有する。
具体的には、市販の食品試料、あるいは土壌などの環境試料を生理食塩水に懸濁し、これを寒天培地に塗沫して静置培養に供することで、寒天培地上に出現する微生物を取得することができる。尚、医薬品又は食品用PGAにおいては、その分離源を食品試料とすることが好ましい。微生物の純化は、寒天培地上の微生物を新たな寒天培地に画線塗沫する、あるいは、生理食塩水などの適当な希釈液を用いて、上記の懸濁試料を希釈した後に、寒天培地上に塗沫することで、単一コロニーを出現させるといった方法が挙げられる。
枯草菌を効率よく取得する方法としては、枯草菌が芽胞菌であることから上記試料を予め熱処理する方法、糖など栄養源の資化性の差異を利用する方法、コロニー周囲の粘性物質の生産を確認する方法などが挙げられる。また、高塩濃度耐性を有する微生物の取得方法としては、予め高濃度の塩を含有する寒天培地にて微生物を単離する方法、高濃度の塩を含有する液体培地にて良好な生育を示す微生物を選抜する方法などが挙げられる。
またさらに、グルタミン酸をPGA生産に必要としない微生物を取得する方法としては、グルタミン酸非添加の寒天培地において、粘調なコロニーを形成する微生物を取得する方法、グルタミン酸非添加の液体培地を用いた培養において、培養液中に高分子量のPGAを生産する微生物を取得する方法、などが挙げられる。
前述したように、本発明の枯草菌は、従来の納豆菌と比較して、高濃度塩に対する耐性を有する。そのため、本発明の枯草菌を用いてPGAを生産するために、通常よりも塩濃度の高い培地を使用することができる。
一般に、高分子の電解質は水溶液中では高分子のイオンとなり対イオンとの解離が起こる。この解離により強い静電場が生じるため、この静電気力により周辺に対イオンが凝集する。その結果、対イオン活量の顕著な低下が生じるとされる。また、高分子イオン一本鎖の形態はおもに静電的な相互作用によって支配され、塩濃度の増加により顕著な収縮が生じることが想定される(川口正剛,高分子,53巻,p.716−718,2004年)。これ故に、高分子電解質であるPGAの水溶液中の挙動においても、培地中の塩濃度を上昇させることにより水溶液の粘度を低減することができる。また、粘性が高く、流動性が低い液体では、溶存する酸素分子の移動効率が低下するため、好気性微生物の生育に必要な酸素供給能を確保するには、より多くの通気撹拌を行なう必要が生じる。また、このような多くの通気撹拌を伴う発酵槽を用いた培養系においては、培養液の粘度が高い場合には発泡が生じ、培養が困難になることが想定される。またさらに、流動性が低い液体試料は、製造工程における移送効率が悪く、なかでも、遠心分離による菌体除去、精密ろ過、あるいは限外ろ過といった膜処理における透過性が著しく低下すると想定される。よって、本発明のPGAの生産方法によれば、水溶液中で高粘性を発現する高分子電解質であるPGAの製造プロセスにおける負荷を低減できる。
培地としては、グリセリン、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、キシロース、マンノース、ガラクトース、デンプンなどの糖類を、PGAを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。また、クエン酸、酢酸などの各種有機酸又はその塩、並びにグルタミン酸又はその塩などを、PGAを生産するための炭素源として含む培地を使用することができる。
本発明のPGAの生産方法において、PGAを生産するための炭素源としては、前記炭素源のうち1種を用いてもよいし、2種以上を組合せて用いてもよい。
培地中のグルタミン酸又はその塩の濃度は適宜設定することができる。例えば、培地中のグルタミン酸又はその塩の濃度(グルタミン酸換算)は、好ましくは0.005g/L以上が好ましく、0.05g/L以上がより好ましく、0.1g/L以上がより好ましく、0.5g/L以上がより好ましい。またその上限値は、培地中でのグルタミン酸やその他の培地成分の析出を回避する観点から、600g/L以下が好ましく、500g/L以下がより好ましく、400g/L以下がより好ましく、300g/L以下がより好ましい。
グルタミン酸は、バイオマスを原料とする発酵法により生産することができ、食品素材、又は飼料として利用されている。このようなグルタミン酸を原料に使用せず、有用な高分子素材であるPGAを効率良く生産できる微生物は、食糧との競合を避けるといった視点、あるいは工業的な生産コストの視点からも有益であると考えられる。
従って、グルタミン酸を含まず、グルタミン酸以外の安価な窒素源、及び炭素源を含む培地で本発明の枯草菌を培養し、PGAを生産することは、食糧生産と競合せず、生産コストの観点から好ましい。
例えば、1価の金属塩の場合は、0.01M以上が好ましく、0.1M以上がより好ましく、0.5M以上がより好ましく、1.0M以上がより好ましい。また、その上限値は、細胞増殖、あるいはPGA生産を阻害しない濃度が好ましく、具体的には2.5M以下がより好ましく、2.0M以下がより好ましく、1.75M以下がより好ましい。
また例えば、2価の金属塩の場合は、0.01M以上が好ましく、0.1M以上がより好ましく、0.5M以上がより好ましく、1.0M以上がより好ましい。また、その上限値は、細胞増殖、あるいはPGA生産を阻害しない濃度が好ましく、具体的には2.0M以下が好ましく、1.75M以下がより好ましく、1.5M以下がより好ましい。
尚、使用する培地、及び培養後の培養液の粘度は、培地中の塩濃度を調整することで、所望の範囲にすることができる。尚、本発明において培地の粘度の測定方法は、非ニュートン性液体の粘性測定に適したB型粘度計により行なうことができる。
また、培養時間は、種菌接種後、0.5日以上、好ましくは1日以上、より好ましくは3日以上である。培養方法に特に制限はないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
また、培養液からPGAを分離する方法についても特に制限はなく、生産された物質を単離、回収する際に用いられる通常の方法で行うことができる。例えば、アセトン、メタール、あるいはエタノールなどの有機溶媒沈殿、ゲルろ過カラム、あるいはイオン交換カラムによるクロマト分画、さらに、PGAの等電点付近にpHを調整する酸沈殿による分離、電気透析法などにより、目的のPGAを単離、回収することができる。
本発明の枯草菌を、納豆菌標準株ではPGAの生産性が低下するような塩化ナトリウム濃度7.3%(w/v)(1.25M相当)の条件で培養した場合、PGAの基質となるグルタミン酸ナトリウム・1水和物を8%(w/v)含有する条件においては、培地1L当たり10g/3日以上の生産量が望ましい。
また、納豆菌標準株では生育が困難となるような塩化ナトリウム濃度10.2%(w/v)(1.75M相当)にて培養した場合、PGAの基質となるグルタミン酸ナトリウム・1水和物を8%(w/v)含有する条件では、培地1L当たり0.5g/3日以上の生産量が望ましい。またさらに、納豆菌標準株ではPGAの生産が望めないような塩化ナトリウム濃度7.3%(w/v)の条件で、且つPGAの基質となるグルタミン酸が存在しない条件にて本発明の枯草菌を培養した場合、培地1L当たり0.1g/3日間以上の生産量が望ましい。
本発明の枯草菌を、塩化ナトリウム濃度が10%(w/v)以上の条件にて培養した場合に生産されるPGAの分子量は、300,000以上、好ましくは500,000以上、より好ましくは1,000,000以上、より好ましくは2,000,000以上、より好ましくは5,000,000以上、より好ましくは10,000,000以上である。またその上限値は、50,000,000、好ましくは40,000,000、より好ましくは35,000,000である。
特に、本発明の枯草菌は納豆菌に分類される。そして、本発明の枯草菌が生産するPGAは、他の微生物が生産するPGAと比較して高分子量である。よって、本発明の枯草菌が生産するPGAは、抗腫瘍活性や脂質代謝制御活性を有する化粧品、医薬品、食品などの用途に、好適に使用することができる。
<3>塩化ナトリウム濃度が10%(w/v)の条件下で培養したとき、前記枯草菌が生産するPGAの分子量が300,000以上、好ましくは500,000以上、より好ましくは1,000,000以上、より好ましくは2,000,000以上、より好ましくは5,000,000以上、より好ましくは10,000,000以上、であり、好ましくは50,000,000以下、である、前記<1>又は<2>項記載の方法。
<4>塩化ナトリウム濃度10%(w/v)以上の条件下で培養したとき、前記枯草菌はPGAを少なくとも0.1g/L/3日以上、好ましくは0.5g/L/3日以上、より好ましくは1.0g/L/3日以上、より好ましくは5.0g/L/3日以上、生産する、前記<1>〜<3>のいずれか1記載の方法。
<5>前記枯草菌が、配列番号7若しくは8で示される塩基配列、配列番号7若しくは8で示される塩基配列との同一性が好ましくは99.75%以上、より好ましくは99.85%以上、より好ましくは99.90%以上の塩基配列、又は配列番号7若しくは8で示される塩基配列において好ましくは1〜3個、より好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる16S rRNA遺伝子を有する、前記<1>〜<4>のいずれか1記載の方法。
<6>前記枯草菌が、前記表1に記載の菌学的性質を示す、前記<1>〜<5>のいずれか1記載の方法。
<8>グルタミン酸又はその塩を含有する培地で前記枯草菌を培養する、前記<1>〜<7>のいずれか1記載の方法。
<9>前記培地におけるグルタミン酸又はその塩の濃度が、0.005g/L以上、好ましくは0.05g/L以上、より好ましくは0.1g/L以上、より好ましくは0.5g/L以上であり、600g/L以下、好ましくは500g/L以下、より好ましくは400g/L以下、より好ましくは300g/L以下、である、前記<8>記載の方法。
<10>グルタミン酸の非存在下で前記枯草菌を培養する、前記<1>〜<7>のいずれか1記載の方法。
<11>塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、及び硫酸マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の塩、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の塩、を含有する培地で前記枯草菌を培養する、前記<1>〜<10>のいずれか1記載の方法。
<12>前記培地における前記塩の濃度が0.01M以上2.5M以下であり、好ましくは、1価の金属塩の場合は、0.1M以上、より好ましくは0.5M以上、より好ましくは1.0M以上、また、好ましくは2.0M以下、より好ましくは1.75M以下であり、2価の金属塩の場合は、0.1M以上、より好ましくは0.5M以上、より好ましくは1.0M以上、また、好ましくは2.0M以下、より好ましくは1.75M以下、より好ましくは1.5M以下である、前記<11>記載の方法。
<13>前記枯草菌の培養期間が、0.5日以上、好ましくは1日以上、より好ましくは3日以上である、前記<1>〜<12>のいずれか1記載の方法。
<15>前記PGAの分子量が300,000以上、好ましくは500,000以上、より好ましくは1,000,000以上、より好ましくは2,000,000以上、より好ましくは5,000,000以上、より好ましくは10,000,000以上、また、50,000,000以下、好ましくは40,000,000以下、より好ましくは35,000,000以下である、前記<14>記載の方法。
<18>塩化ナトリウム濃度が10%(w/v)の条件下で培養したとき、300,000以上、好ましくは500,000以上、より好ましくは1,000,000以上、より好ましくは2,000,000以上、より好ましくは5,000,000以上、より好ましくは10,000,000以上、また、好ましくは50,000,000以下のPGAを生産する、前記<16>又は<17>記載の枯草菌。
<19>塩化ナトリウム濃度10%(w/v)以上の条件下で培養したとき、PGAを少なくとも0.1g/L/3日以上、好ましくは0.5g/L/3日以上、より好ましくは1.0g/L/3日以上、より好ましくは5.0g/L/3日以上生産する、前記<16>〜<18>のいずれか1記載の枯草菌。
<20>配列番号7若しくは8で示される塩基配列、配列番号7若しくは8で示される塩基配列との同一性が好ましくは99.75%以上、より好ましくは99.85%以上、最も好ましくは99.90%以上の塩基配列、又は配列番号7若しくは8で示される塩基配列において好ましくは1〜3個、より好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、からなる16S rRNA遺伝子を有する、前記<16>〜<19>のいずれか1記載の枯草菌。
<21>前記表1に記載の菌学的性質を示す、前記<16>〜<20>のいずれか1記載の枯草菌。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表2に示す。
市販の漬物、味噌、発酵調味料、あるいは納豆などの食品試料約5gを15mL容コニカルチューブ(製品コード352096、BD(ベクトンディッキンソン) Falcon製)に無菌的に採取し、この試料に対して2倍重量の1%(w/v)塩化ナトリウム水溶液(滅菌処理済)を加えた。これらをタッチミキサー(MT-31型、ヤマト科学製)の振動面に押し当て、均一に混ざるよう懸濁し、試料を80℃にて10分間の加熱処理に供した。続いて、これら試料を1%(w/v)塩化ナトリウム水溶液(滅菌処理済)にて適宜段階的に希釈し、それぞれを表3〜6に示す微生物検出用培地(LB寒天培地、塩化ナトリウムを終濃度10%に調整したLB寒天培地(LB+10%NaCl培地)、変法GAM寒天培地(商品名:「ニッスイ」、日水製薬製)、及びM+Yex寒天培地)へ塗沫した。
これら寒天培地を30℃にて2〜5日間の静置培養に供し、寒天培地上での微生物の増殖及び形態を観察した。続いて、これら各寒天培地に出現した単一コロニーを複数選抜し、増殖が確認できたものと同種の寒天培地にて画線塗沫を行ない、出現させた単一コロニーを純化株とした。さらに、この純化株を同種の寒天培地にて増殖させ、得られた菌体を20%(w/v)グリセロールを含有するLB液体培地へ懸濁し、−80℃にて凍結保存した。
試験例1で取得した菌株(−80℃凍結保存試料)を滅菌済み白金耳(製品コード254410、Nunc製)にてLB寒天培地に画線塗沫した。これらを30℃にて1日間の静置培養に供し、各菌株の生育を目視にて確認した。
次に、LB寒天培地上に生育した各菌株を予め滅菌した爪楊枝を用いてM+Yex寒天培地に接種し、これを30℃にて1日間の静置培養に供し、目視にて各菌株の生育確認を行なった。
本試験例では、資化判定プレート上での生育を目視にて観察し、生育の指標であるコロニー形成がM/グルコース資化判定プレートでは有り、且つM/タガトース資化判定プレートにおいてはコロニー形成がない菌株を枯草菌候補株として選抜した。
試験例1で調製したグリセロール保存試料を、1mM TE緩衝液(pH8.0)にて30倍に希釈したものを鋳型とし、表2に示すプライマー27f及びプライマー1525rを使用してPCRを行い、16S rRNA遺伝子領域約1.5kbのDNA断片を増幅した。DNAポリメラーゼは、TaKaRa LA Taq(タカラバイオ製)を用いた。95℃で5分間、鋳型DNAを変性させた後、95℃で1分間、55℃で30秒間、72℃で2分間を1サイクルとして30サイクル行い、さらに72℃で2分間恒温した。
尚、シークエンス解析試料の調製には、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライド バイオシステムズ製)を用い、添付プロトコールに従い試料調製を行った。解析前の試料精製には、Montage SEQ kit(MILLIPORE製)を使用した。続いて、調製したシークエンス試料はDNAシークエンサー(商品名:ABI 3100 Genetic Analyzer、アプライドバイオシステムズ製)を用いて配列解析を行い、塩基配列を決定した。
配列の相同性検索は、公開データベースNCBI(National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.gov/)のメニュー”Nucleotide”内の”BLAST”のなかにある”Basic BLAST”を用い、BLASTプログラムから”nucleotide blast”を選択した。検索対象のデータベースに”Reference genomic sequences(refseq_genomics)、選択プログラムに”Highly similar sequences(megablast)”を指定し相同性検索を行った。
試験例2及び3にて枯草菌と推定した凍結保存試料より、滅菌済み白金耳(製品コード254410、Nunc製)にて凍結菌体を採取し、これを5mLのLB液体培地へ接種し、30℃にて24時間の振盪培養に供した。これを種培養液として、30mLのグルタミン酸非添加PGA生産用培地[培地組成:7.5%グルコース、1.8%塩化アンモニウム、0.5%酵母エキス、0.035%硫酸マグネシウム・7水和物、0.005%硫酸マンガン・4−5水和物、100mM3-モルホリノプロパンスルホン酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid、水酸化カリウムにてpH7.0に調整、同仁化学研究所製)]に1%(v/v)接種し、この培地を37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、培養液の上清に含まれるPGAを下記測定例1に示す方法にて定量した。その結果、培養液上清中にPGAに由来するUV210nmの吸収を有する高分子物質の溶出画分が検出された菌株を、グルタミン酸非添加条件でPGAが生産可能な枯草菌候補株として選抜した。
試験例2及び3にて枯草菌と推定し、さらに、試験例4においてPGA生産枯草菌候補株して選抜した株の凍結保存試料と、試験例1と同様の手順にて調製した独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した公知の納豆菌標準株(NBRC 16449株、NBRC 3336株、NBRC 3936株)の凍結保存試料を、1×103〜1×104cell/mLとなるようにLB+10%NaCl液体培地に接種し、37℃で24時間の振盪培養に供した。この振盪培養の後、培養液試料を1%(w/v)塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈し、分光光度計(商品名:U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製)を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度600nm(OD600)を測定した。
その結果、納豆菌標準株では吸光度の増加が認められなかった。本試験条件において、吸光度の増加が認められた菌株6株を、高塩濃度耐性と高塩濃度条件下での高分子量のPGA生産能を有する枯草菌株として選抜した。
標準株としての納豆菌NBRC 3336株と、枯草菌候補株を試験例4と同様の条件にて、LB液体培地を用いて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムの終濃度を10%(w/v)、12%(w/v)、13%(w/v)、14%(w/v)、15%(w/v)、及び16%(w/v)としたLB培地を調製し、これに初発の吸光度が0.05となるように前記の種培養液を接種し、37℃にて2日間の振盪培養に供した。この振盪培養において経時的に培養液を採取し、培養液試料を塩化ナトリウム水溶液(使用培地と同濃度の塩化ナトリウム水溶液)にて適宜希釈し、分光光度計(U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製)を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度600nm(OD600)を測定した。
高塩濃度耐性を有する枯草菌候補株を、LB+10%NaCl液体培地を用いて試験例5と同様の条件にて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムの終濃度を10%(w/v)、12%(w/v)、14%(w/v)、15%(w/v)、16%(w/v)、17%(w/v)、18%(w/v)、19%(w/v)、又は20%(w/v)としたTSB培地(Trypticase Soy broth、Becton, and Dickinson Company製)に、上記種培養液を初発吸光度が0.1となるように接種し、37℃にて2日間の振盪培養に供した。振盪培養を行った後、培養開始2日目に培養液試料を採取し、10%(w/v)塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈し、分光光度計(U-2900型、日立ハイテクノロジーズ製)を用いて、増殖の指標となる培養液の吸光度600nm(OD600)を測定した。
本試験例では、培養2日目の培養液の吸光度が、種培養接種時の2倍以上となった塩濃度条件までを菌株の生育限界濃度と判定した。
高塩濃度耐性を有する枯草菌候補株を、LB+10%NaCl液体培地を用いて試験例5と同様の条件にて種培養を調製した。
次に、塩化ナトリウムを無添加、終濃度1%(w/v)、2(w/v)、3(w/v)、4(w/v)、5(w/v)、6(w/v)、7%(w/v)、8%(w/v)、及び10%(w/v)としたTSB培地を調製し、これを96ウェル丸底マイクロプレート(型番3870-096、IWAKI製)に各ウェル200μL分注した。これに、上記種培養液を各ウェルの初発吸光度が0.05となるように接種し、バイオマイクロプレートリーダー(HiTS-S2型、サイニクス製)を用い、37℃にて24時間の振盪培養に供した。
バイオマイクロプレートリーダーは、150rpmにて振盪を行ない、干渉フィルターにより600nmの吸光度(OD600)を30分間隔で経時的に測定した。得られた吸光度の値より、単位時間当たりの吸光度の増加を算出し、これを菌体増殖速度(ΔOD600/hr)として、培養試験中の最大の菌体増殖速度を求めた。
本試験例では、菌体増殖速度(ΔOD600/hr)が、最大値から(最大値−0.2)までの塩濃度を生育至適塩濃度と判定した。
試験例1〜8に示す方法にて取得した、高塩濃度耐性を有し、PGAを生産する枯草菌株(枯草菌KSM−FFA610株、枯草菌KSM−FFA631株、枯草菌KSM−FFB406株、枯草菌KSM−FFB425株、枯草菌KSM−FFB540株、枯草菌KSM−FFB553株)の生育特性を、表9〜13に示す。
表9に示すように、高濃度の塩化ナトリウムを含有するLB液体培地で培養した場合、対照とする納豆菌標準株では、吸光度が検出限界以下となり増殖が認められなかった。これに対し、試験例2〜4で選抜した枯草菌株において、試験例5に示す試験条件において吸光度(OD600)が0.5(1×107 cell/mL相当)を超える菌株を見出した。
以上の結果から、本発明の枯草菌株は、納豆菌標準株では増殖できない塩濃度において増殖可能な高塩濃度耐性株であることが確認された。
また、塩化ナトリウム終濃度13%(w/v)の条件において、対照とする納豆菌標準株は菌体増殖が認められないのに対し、本発明の枯草菌株は吸光度が0.5を超える数値を示した。
以上の結果より、本発明の枯草菌候補株は、納豆菌標準株と比べて、高い塩濃度耐性を有する株であることが確認された。
さらに、本発明の枯草菌株は、塩化ナトリウム終濃度が14%(w/v)の条件において、吸光度が0.5を超える数値を示した。
以上の結果より、本発明の枯草菌候補株は、納豆菌標準株と比べて、高い塩濃度耐性を有する株であることが確認された。
表12に示すように、TSB培地を用いた高塩濃生育試験において、本発明の枯草菌株は、培養2日目における吸光度が、KSM−FFA631株及びKSM−FFB406株は塩化ナトリウム終濃度16%(w/v)、KSM−FFB425株、KSM−FFB540株及びKSM−FFB553株は17%(w/v)、KSM−FFA610株は18%(w/v)の条件において、種培養接種時の2倍以上の値であった。
以上の結果より、本発明の枯草菌株は、TSB培地を用いた生育限界塩濃度の確認試験において、塩化ナトリウムの生育限界濃度が16〜18%(w/v)であることが確認された。
表13に示すように、本発明の枯草菌株はTSB培地を用いた生育至適塩濃度の試験において、塩化ナトリウム濃度が無添加〜終濃度6%(w/v)(室温)までの添加条件において、菌体増殖速度(ΔOD600/hr)が0.3〜0.5の値であった。
以上の結果より、本発明の枯草菌株のTSB培地を用いた選抜した枯草菌の生育至適塩濃度の確認試験において、塩化ナトリウムの生育至適濃度は、枯草菌KSM−FFA610株では0〜5%(w/v)、枯草菌KSM−FFA631株では0〜4%(w/v)、枯草菌KSM−FFB406株では0〜5%(w/v)、枯草菌KSM−FFB425株では0〜4%(w/v)、枯草菌KSM−FFB540株では0〜5%(w/v)、枯草菌KSM−FFB553株では0〜5%(w/v)であることが確認された。
前記枯草菌株(枯草菌KSM−FFA610株、枯草菌KSM−FFA631株、枯草菌KSM−FFB406株、枯草菌KSM−FFB425株、枯草菌KSM−FFB540株、枯草菌KSM−FFB553株)の菌学的性質を検討した。その結果を表14に示す。
さらに、前記枯草菌株について、下記測定例4より、16S rRNA遺伝子の塩基配列解析に基づく菌種同定を行った。その結果を表15に示す。
従って、前記枯草菌株は、菌学的な性質と併せ、16S rRNA遺伝子の塩基配列の解析結果より、枯草菌であると判断した。
また、枯草菌KSM−FFA631株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02277として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB406株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02278として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB425株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02279として寄託された。
また、枯草菌KSM−FFB540株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02280として寄託された。
さらに、枯草菌KSM−FFB553株は、2016年6月2日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に受託番号NITE BP−02281として寄託された。
公知の納豆菌標準株(NBRC 3336株、及びNBRC 16449株)を対照として、本発明の枯草菌株(KSM−FFA610株、KSM−FFA631株、KSM−FFB406株、KSM−FFB425株、KSM−FFB540株、及びKSM−FFB553株)を用いて、高塩濃度条件でのPGA生産性を評価した。
試験例1に示した上記菌株の凍結保存試料、及び同様の手順にて調製した納豆菌標準株の凍結保存試料を用い、試験例4と同様の培養条件にてLB液体培地を用い、30℃にて24時間の振盪培養に供した。これを種培養液として、30mLのPGA生産性評価培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、1.25%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、並びに7.3%塩化ナトリウム(1.25M相当)又は10.2%塩化ナトリウム(1.75M相当)]に1%(v/v)接種した。この培地を37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液の上清に含まれるPGAを定量した。その結果を表16に示す。
以上の結果より、本発明の枯草菌は、高塩濃度耐性を有する枯草菌であると判断した。
本発明の枯草菌株 KSM−FFB553株を用いて、1価の金属塩が高濃度の条件にてPGA生産性を評価した。
試験例4と同様の方法により種培養液を調製し、これを30mLのPGA生産性評価培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、1.25%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、並びに塩化ナトリウムを10.2%(1.75M相当)又は塩化カリウム11.2%(1.5M相当)]に、1%(v/v)接種した。これらを37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液上清に含まれるPGAを定量した。その結果を表17に示す。
本発明の枯草菌株 KSM−FFB553株を用いて、2価の金属塩が高濃度の条件にてPGA生産性を評価した。
試験例4と同様の方法により種培養液を調製し、これを30mLのPGA生産性評価培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、1.25%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、並びに10.2%塩化マグネシウム・6水和物(0.5M相当)又は7.4%塩化カルシウム・2水和物(0.5M相当)]に、1%(v/v)接種した。これらを37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液の上清に含まれるPGAを定量した。その結果を表18に示す。
本発明の枯草菌株(KSM−FFA610株、KSM−FFA631株、KSM−FFB406株、KSM−FFB425株、KSM−FFB540株、及びKSM−FFB553株)が生産するPGAの分子量を測定した。
試験例5と同様の方法により種培養液を調製し、これを30mLの生産性評価培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、1.25%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、10.2%塩化ナトリウム(1.75M相当)]に、1%(v/v)接種した。この培地を37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液の上清に含まれるPGAの分子量を測定した。その結果を表19に示す。
実施例1に示す本発明の枯草菌株KSM−FFB553株を用いて、1価又は2価の金属塩が高濃度の条件にて生産するPGAの分子量を評価した。
試験例4と同様の方法により種培養液を調製し、これを30mLのPGA生産性評価培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、1.25%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、並びに11.2%塩化カリウム(1.5M相当)、10.2%塩化マグネシウム・6水和物(0.5M相当)若しくは7.4%塩化カルシウム・2水和物(0.5M相当)]に、1%(v/v)接種した。これを37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液の上清に含まれるPGAの分子量を測定した。その結果を表20に示す。
本発明の枯草菌株(KSM−FFA610株、KSM−FFA631株、KSM−FFB406株、KSM−FFB425株、KSM−FFB540株、及びKSM−FFB553株)を用いて、高塩濃度、且つグルタミン酸非添加の条件でPGA生産性を評価した。
試験例5と同様の方法により種培養液を調製し、これを30mLのPGA生産性評価培地[培地組成:8.0%グリセロール、0.5%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム、7.3%塩化ナトリウム(1.25M相当)]に、1%(v/v)接種した。この培地を37℃にて72時間の振盪培養に供した。
培養終了後、下記測定例1記載の方法にて、培養液の上清に含まれるPGAを定量し、分子量を測定した。その結果を表21に示す。
PGAの定量、及び分子量の測定には、高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。
[HPLC装置構成]
送液ポンプ:L−6200型、日立製作所製
オートサンプラー:AS−4000型、日立製作所製
カラムオーブン:L−5020型、日立製作所製
UV検出計:L−4250型、日立製作所製
クロマトデータ解析装置:D−2500型、日立製作所
分析は、溶離液は0.1M硫酸ナトリウムとし、流速1.0mL/分、カラム温度50℃、溶出ピークは検出波長210nmにて測定を行った。また、サンプルの前処理には、0.1M硫酸ナトリウムにて適宜希釈した培養液上清試料を、0.45μmデュラポア膜(型番MULTI SCREEN MNHV45、MILLIPORE製)にてフィルターろ過を行った。
実施例4において得られた培養終了後の培養液試料を、14,800rpmにて30分間の遠心分離(himac CR21GIII型、日立工機製)に供し、菌体除去した上清試料を回収した。次に、これら上清試料1〜10mLをポリプロピレン製50mL容遠心チューブ(型番227 261、greiner bio-one製)に移し入れ、この上清試料量に対して2倍容のエタノールを加えて転倒混合したのち、−30℃にて一晩恒温放置した。その後、3,000rpmにて30分間の遠心分離(himac CF7D2型、日立工機製)に供し、沈殿画分を回収した。得られた沈澱画分を2mLの蒸留水に再度溶解し、再度、上記エタノール添加による沈殿画分を調製し、これを回収した。続いて、回収した試料を2mLの蒸留水に溶解し、これをスクリューキャップ付き試験管(型番ST−13M、日本電子理化硝子製)に0.5mL移し入れたのち、0.5mLの濃塩酸を加え攪拌後、窒素封入し、105〜110℃にて16時間加熱処理を行った。加熱処理後、窒素気流下で塩酸及び水分を留去し(約6時間)、得られた乾固物を加水分解試料とした。
尚、PGA標品として市販PGA(分子量880,000、明治フードマテリア)、加水分解試料の対照として、L−Glutamic acid及びD−Glutamic acid(和光純薬工業社製)を使用した。
また、上記全自動アミノ酸分析装置による測定において、グルタミン酸以外のアミノ酸が検出されなかったことから、培養上清中の高分子物質はPGAと判定した。またさらに、上記選抜した本発明の高塩濃度耐性を有する枯草菌株の生産したPGAのD/L比は、公知の納豆菌標準株が生産するPGAのD/L比と同等と判断した。
前記菌株のうちKSM−FFB553株を用い、PGA調製用培地[培地組成:8.0%グルコース、8.0%グルタミン酸ナトリウム・1水和物、0.5%酵母エキス、1.0%硫酸アンモニウム、0.2%硫酸マグネシウム・7水和物、0.003%硫酸マンガン・4−5水和物、0.7%リン酸水素二カリウム、0.35%リン酸二水素カリウム]に、1%(v/v)にて調製した培養液試料より、酸沈殿による回収、次にエタノール沈殿による精製回収、および凍結乾燥によりPGA乾燥粉末を調製した。続いて、得られたPGA試料(Mw5,000k)を4%(w/w)、8%(w/w)となるように、蒸留水、及び1.25M塩化ナトリウム水溶液にて溶解した。これら約40mLをそれぞれガラス製スクリュー管(型番No.7、またはNo.8、マルエム製)、あるいはポリプロピレン製50mL容遠心チューブ(型番227 261、greiner bio-one製)に気泡が生じないよう移し入れ、B型粘度計(TVB−15型、東機産業製)を使用して、試料温度20〜25℃(室温)、測定時間60秒(オートストップモード)、ローター回転速度60rpm、M2ローターを用いて測定した。尚、上記測定条件における測定値が上限を超えた試料は、回転数を30rpm、あるいは、使用ローターをM3、M4に適宜変更して測定した。
測定の結果、PGA4%(w/w)の試料において、塩を添加しない試料の粘度がは380mPa・sであったのに対し、塩を添加した試料では60mPa・sであった。また、PGA8%(w/w)試料において、塩を添加しない試料は粘度が1,480mPa・sであったのに対し、塩を添加した試料では450mPa・sであった。
上記測定結果から、塩添加によるPGA試料の粘度低減効果を確認した。
16S rRNA遺伝子の塩基配列による菌種同定は以下の実験手順により行った。
試験例2と同様に、凍結保存菌体よりPCR用の鋳型試料を調製し、表2に示すプライマー27f及びプライマー1525rを使用してPCRを行い、16S rRNA遺伝子領域約1.5kbのDNA断片を増幅した。DNAポリメラーゼは、TaKaRa LA Taq(タカラバイオ製)を用いた。95℃で5分間、鋳型DNAを変性させた後、95℃で1分間、55℃で30秒間、72℃で2分間を1サイクルとして30サイクル行い、さらに72℃で2分間恒温した。
得られた16S rRNA遺伝子領域のDNA断片について、表2に示すプライマー27f、プライマーf2L(−)、プライマー926f、プライマーrE1L、プライマーr2L’、及びプライマー1525rをそれぞれシークエンス用プライマーとして用い、DNA塩基配列の解析を行った。尚、シークエンス解析試料の調製には、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライド バイオシステムズ製)を用い、添付プロトコールに従い試料調製を行った。解析前の試料精製には、Montage SEQ kit(MILLIPORE製)を使用した。
調製したシークエンス試料は、DNAシークエンサー(商品名:ABI 3100 Genetic Analyzer、アプライドバイオシステムズ製)を用いて配列解析を行い、塩基配列を決定した。
Claims (9)
- 受託番号NITE BP−02276、受託番号NITE BP−02277、受託番号NITE BP−02278、受託番号NITE BP−02279、受託番号NITE BP−02280、又は受託番号NITE BP−02281で特定される枯草菌(Bacillus subtilis)を培養してポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産する方法。
- 前記枯草菌が、塩化ナトリウム濃度12%(w/v)(2.05M相当、室温)以上に調整したLB培地において増殖可能な高塩濃度耐性を有し、塩化ナトリウム濃度10%(w/v)(1.71M、室温)の条件下で培養したとき、分子量が300,000以上のポリ−ガンマ−グルタミン酸生産能を有する、請求項1記載の方法。
- 塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の塩を含有する培地で前記枯草菌を培養する、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記培地における前記塩の濃度が、0.01M以上2.5M以下である、請求項4記載の方法。
- 前記ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分子量が300,000以上50,000,000以下である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 受託番号NITE BP−02276、受託番号NITE BP−02277、受託番号NITE BP−02278、受託番号NITE BP−02279、受託番号NITE BP−02280、又は受託番号NITE BP−02281で特定される枯草菌(Bacillus subtilis)。
- 塩化ナトリウム濃度12%(w/v)以上に調整したLB培地において増殖可能であり、塩化ナトリウム濃度10%(w/v)の条件下で培養したとき、分子量が300,000以上のポリ−ガンマ−グルタミン酸生産能を有する、請求項7記載の枯草菌。
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