JPS6119489A - 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−遺伝子 - Google Patents

組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−遺伝子

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JPS6119489A
JPS6119489A JP59243529A JP24352984A JPS6119489A JP S6119489 A JPS6119489 A JP S6119489A JP 59243529 A JP59243529 A JP 59243529A JP 24352984 A JP24352984 A JP 24352984A JP S6119489 A JPS6119489 A JP S6119489A
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JP
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tpa
plasminogen activator
tissue plasminogen
dna
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JP59243529A
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ベルント　メイハツク
アルベルト　ヒネン
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Ciba Geigy AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 泣五塁念！ この発明は、組換ＤＮＡ技法を用いる、酵母におけるフ
ィブリン分解物質の製造、並びにこの製造のための手段
及び方法に関する。さらに詳しくは、この発明は、組織
プラスミノーゲンアクチベーターの発現を行う７″ηモ
ーター系に機能的に連結された、組織デラスミノーグン
アクチペーターをコードするＤＮＡ配列を含有する酵母
ノ・イブリドベクター；前記プラスミドにより形質転換
された酵母細胞、又は染色体に組込まれた組織プラスミ
ノーゲンアクチベーター遺伝子を含有する酵母細胞；新
規な組織グラスミノーグンアクチペーター；並びに、前
記ハイブリｒベクター、前記酵母細胞及び前記組織プラ
スミノーゲンアクチベーターの製造方法に関する。
装置９１月 凝血は発展した世界におけるヒトの疾患及び死亡の主要
な原因である。凝血は酵素ズロンビンの作用のもとに可
溶性前駆体であるフィブリノ−ダンから生成したフィブ
リンから成る。一連の酵素及びその他の物質により、凝
血は通常では血液の流失ｙ防止する必要がある時及び場
所においてのみ形成されることが保証される。
哺乳動物の血漿は凝血中のフィブリンを溶解することか
できる酵素系を含有する。フィブリン分解系の１成分は
、酵素類の一群、すなわち、グラスミノーダン（プラス
ミノの不備性グロ酵素形）を蛋白質分解性酵素プラスミ
ノに転換するプラスミノーゲンアクチベーター類である
。次に、プラスミノが凝血のフィブリンネットワークを
破壊して可溶性生成物を形成する。身体の血栓溶解能が
、　　　　　　′例えば血栓塞栓症又は手術後合併症を
有する患者において形成された血管内血栓を除去するの
に十分°でない場合、外的に投与される血栓溶解剤を使
用することが不可欠である。
２種類のヒトデラスミノ−ダン活性化物質が、血栓溶解
療法のだめに商業的に入手できる。すなわち、ヒト尿又
は培養された腎細胞から分離されるセリンプロテアーゼ
であるウロキナーゼと、ストレプトコッカスから得られ
る細菌性蛋白質であるストレノトキナーゼである。い゛
ずれの酵素もフィブリンに対する特異的な親和性を有し
ないので、これらの物質による血栓溶解にはグラスミノ
ーダンの全身的な活性化が伴い、この活性化は凝固性蛋
白質の無差別的消化俗を起じさせることができ、そして
治療中の内出血の危険を有意に増加せしめる。さらに１
ストリプトキナーゼはヒトにとって外来性蛋白質であり
、そしてそれ故にその作用を遮断する中和抗体の産生を
刺激し、そして有害でありそして潜在的には致命的であ
るアレルギー反応を導く。
組織グラスミノーダンアクチペーター〔以後、ｒＴＰＡ
ｊ（ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉ
ｖ＆ｔｏｒ）と称する〕と称するプラスミノ−ｒンアク
チペーターの他の１群がほとんどのヒト組織に存在する
ことが知られている。異る組織由来のＴＰＡはその分子
的性質については相互に異るが、免疫的には類似すると
考えられる。これらは、゛その化学的及び免疫的性質に
関して（フィシリンの存在下で非常に増強されたフィブ
リン分解作用を有する点において、そしてそれらがフィ
ブリンに対する高い親和性を有する点において、ウロキ
ナーゼと異る（　（１）　、　（２）　）。ＴＰＡはフ
ィブリンに対して高い険が有意に低下する。
ＴＰＡは２つの分子形、すなわち活性な２鎖形（ＴＰＡ
と称する）、及び不活性な１鎖形〔前駆体ＴＰＡ　、又
はｒ　ｐｒｏ’　−ＴＰＡ　Ｊと称する（例えば（２）
、（３）、（４）を参照のこと）〕として存在する。
ｐｒｏ　−ＴＰＡは、好ましくはフィブリンの存在下で
、触媒量のプラスミノと共にインキュベートすることに
より活性ＴＰＡに転換することができる。すな゛　わち
、ゾラスミンがそれ自体の合成の引金を引く。
ヒ）　ＴＰＡの分離源には、例えば種々のヒト組織の抽
出物（これらは商業的開発のためには入手できない）、
及び種々の程度にＴＰＡを放出することが示されている
種々のヒト腫瘍細胞が含まれる〔（５）、（６）〕。
最近出願された特許出願（ＥＰ　４１７６６、発明者り
、Ｃｏｌ　ｆｅｎ　、　Ｄ、Ｃ，Ｒｉ　ｊｋｅｎ及びＯ
，Ｍａｔｓｕｏ）には１７２．０００の分子量を有し、
そして培養されたヒト黒色腫（ｍｅ　１　ａｎｏｍａ　
）セルライン（Ｂｏｗｅｓ　）から分離されたＴＰＡが
開示されている。
しかしながら、形質転換された癌性セルライン（黒色腫
細胞のごとき）の使用は、それから分離されたＴＰＡの
医薬とじての使用を制限する。さらに、これらの細胞に
より盆泌される蛋白質の安価で且つ有利な製造の前提条
件となる大きな規模において哺乳動物細胞を増殖せしめ
ることは困難であることが証明されている。哺乳動物細
胞の世代時間は微生物のそれに比べて相当長く、従って
、十分に高い細胞濃度を得るために延長された発酵時間
が要求される。また、哺乳動物細胞の培養によって得ら
れる細胞濃度は、微生物の大規模生産において一般に到
達する細胞濃度に比べて相当に低い。その上、細胞株の
改良を行うことが微生物に比較して困難である。
従って、工業微生物学の十分に開発された技法と最近開
発された組換ＤＮＡ技法とを用いて微生物によりＴＰＡ
を製造することが有利なことが明らかである。
極く最近、ヒト黒色腫セルライン由来のヒト組織型プラ
スミノーゲンアクチベーターのｃＤＮＡがクローニング
され、そしてｘ−ｔｌＪｈ７≧−ｓｔ、９（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｅｈａ　ｃｏｌｉにおいて発現された〔（７）、（
８）〕。１つのケースにおいて（７）、発現されたポリ
ペプチドは真正のヒ）　ＴＰＡに特徴的なフィブリン分
解性を有することが示されている。
しかしながら、Ｅ・コリ由来の蛋白質標品には爽雑エン
ドトキシンがしばしば見出される。これ　　　　　　　
、！らは、高価な精製段階により有用な医薬製品から除
去しなければならない。
すべての真核生物は遺伝情報を発現する機構を有するか
ら、真核生物遺伝子の発現は、Ｅ・コリにおいてよシも
真核生物宿主において一層効率的に行われるであろう。
使用に適する真核生物の内酵母が最も取扱いやすい。酵
母の分泌経路は一層高等な動物細胞のそれに類似してお
り、そして酵母細胞は、シグナル配列（蛋白質の非荷電
Ｎ−末端部分、通常は分泌輸送中に切断される）を切断
することによって蛋白質をプロセシングすることができ
ることが知られている（９）。さらに、真核性宿主の分
泌経路に入り、そして通過する蛋白質は、細胞質中で合
成された蛋白質に比べて高い程度の三次元構造を形成す
るようである。Ｅ二重ｌのどとき原核生物は高次構造を
有する大形蛋白質を有しないように見えることは興味あ
ることである。グリコシル化系が分泌系に関連する。グ
リコシル化蛋白質を導く基本的段階はすべての真核生物
において類似しておシ、そして酵母細胞は、旦二一ミ」
−のような原核細胞と異シダリコシル化された蛋白質を
生産することができる（酵母のグリコシル化経路におけ
る幾つかの最終段階は哺乳動物細胞におけるそれと異り
、そして酵母においては変形されなければならないであ
ろうが）。
酵母は微生物であるから、酵母細胞を培養するのは容易
である。培養液の容積当シから得られる゛細胞量は、且
二三工に比べて酵母の方が相当に高い。さらに、酵母の
発酵的挙動はよく理解されておシ、そして大規模発酵の
だめの条件はすでに確立されている。その上、酵母細胞
はエンドトキシンを含有しない。
魚男ｏａｅ髭 細胞培養技法により、又は宿主生物としてＥ・コリな用
いる組換ＤＮＡ技法により組織プラスミノーダンアクチ
ペーターを製造するための幾つかの方法が知られている
。微生物が容易に取扱われそして培養されるという利点
と、真核生物の利点を合せ持つ酵母によるＴＰＡの製造
は今まで記載されていない。従って、このような方法を
提供するのがこの発明の目的である。この発明の目的は
さらに、挿入されたＴＰＡコード配列を効率的に発現す
ることができる酵母ベクター系を提供することである。
と この発明は、酵母ゾロモーター、及び該プロモーターに
より制御されるＴＰＡコード領域を含んで成る酵母ハイ
ブリドベクターーに関する。
この発明の酵母ハイブリドベクターーの部分であるＴＰ
Ａ　ＤＮＡ　Ｆｉ特にヒトのＤＮＡであシ、そしてＴＰ
Ａを生産することができる任意のヒト細胞から得られる
。このような細胞は癌性又は非癌性であり、そして好ま
しくは樹立されたセルラインから得られる。
適当な細胞の例には、黒色腫細胞、例えばＢｏｗｅｓ細
胞又はＭａｉｍｓ細胞、線維肉腫細胞、表皮癌細胞、膀
胱癌細胞、副腎肺細胞、脂肪肉腫細胞、Ｈｅ１ｇ細胞、
線維芽細胞、リンパ球、角質細胞又は乳房上皮細胞、又
は胎性腎細胞が含まれる。この発明の好ましい態様にお
いては、ヒーラ細胞が使用される。ＴＰＡ　ＤＮＡは染
色体ＤＮＡ又はｃ　ＤＮＡである。染色体ＴＰＡ　ＤＮ
ＡはＴＰＡ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリーから分
離することができ、そしてＴＰＡ　ｃＤＮＡは公知の方
法を用いてｍＲＮＡ経路を介して調製することができる
。さらに、同一の又は変化した蛋白質分解性及び／又は
ｐｒｏ　−ＴＰＡから活性ＴＰＡへの転換中の活性化挙
動を示すＴＰＡコード配列の断片又は遺伝子の変異体を
使用することもできる。これらの遺伝子産物の幾つかは
新規な好ましい性質を示すであろう。
この発明の酵母ゾロモーターは酵母、特にｉユカロミセ
ス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｇｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　）のｒツムＤＮＡに由来する。好まし
くは、高発現酵母遺伝子のゾロモーターをＴＰＡの発現
のために使用する。すなわち、〕恩遺伝子、Ｎ辺土もし
くはＡＤＨＩｔ遺伝子、酸性ホスファターゼ（匹四もし
くはｇ遺伝子、又はイソチトクロームＣ遺伝子のゾロモ
ーター、あるいは解糖系酵素をコードする遺伝子のプロ
モーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロダナーゼ（ＧＡＰＤＨ）　、３
−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ（Ｊ）　、ヘキソキ
ナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラク
トキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナ
ーゼ、トリホスフェートイソメ２−ゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ及びグルコキナーゼの遺伝子のプロモー
ター、あるいはａ、−ファクター又はα−ファクターを
コードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーターを
使用することができる。この発明の好ましいベクターは
転写制御を伴うゾロモーターを含有する。このタイプの
ゾロモーター、例えばＰＨＯ５遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺
伝子のゾロモーターは増殖条件の変化によりターンオン
又はターンオフすることができる。例えば、ＰＨＯ５プ
ロモニターは、培地中の無機燐酸塩の濃度を上昇又は低
下せしめるだけで実験者の意のままに抑制（ｒｅｐｒｅ
ｓｓ　）又は−抑制解除（ｄｅｒｅ、ｐｒｅｓｓ　）さ
れ得る。すなわち、プロモーターを酵母の指数増殖期中
抑制し、そして最高細胞濃度における前期定常期中にの
み抑制解除してＰＨＯ５プロモーターにより制御された
遺伝子の発現を可能にすることができる。この性質が高
レベルの転写と相まつＣＰＨＯ５プロモーターを仁の発
明において好ましいプロモーターとしている。
この発明のハイブリドベクターーにおいて、酵母プロモ
ーターは、ＴＰＡの効率的な発現を保証するように、Ｔ
ＰＡコード領域に機能的（ｏｐｅｒａｂｌｅ）に連結さ
れる。この発明の１つの好ましい態様においては、酵母
プロモーターは、連結部に挿入された翻訳開始シグナル
（ＡＴＧ　）を有する成熟ＴＰＡのコード領域に直接連
結する。酵母プロモーターなＴＰＡコヨド領域に連結す
るだめの好ましい領域は大（ｍａｊｏｒ　）　ｍＲＮＡ
出発部と該プロモニターに天然に付着している遺伝子の
ＡＴＧとの間である。
以下余白 この発明の他の好ましい態様においては、構成物中にシ
グナル配列を導入する。適当なシグナル配列は、使用す
るゾロ阜−ターに天然に連結されているシグナル配列、
特にＰＨＯ５シグナル配列、又はＴＰＡシグナル配列で
ある。他のシグナル配列、例えば酵母′インベルターゼ
又はα−ファクター遺伝子のシグナル配列を使用するこ
ともできる。これに代えて、使用するプロモーターに天
然に連結されている遺伝子のシグナル配列の部分とＴＰ
Ａシグナル配列の部分との連結によって融合シグナル配
列を構成することもできる。シグナル配列と成熟ＴＰＡ
アミノ酸配列配列間の正確な切断を回前γする組合わせ
が好ましい０追加の配列、例えば特異的なプロセシング
シグナルを担持し又は担持しないプロ−配列又はスペー
サー配列を構成物中に導入して前駆体分子の正確なプロ
セシングを促進することができる。この方法に代えて、
生体内又は生体外で適切な成熟を可能にする内部プロセ
シングシグナルを含有する融合蛋白質を生成せしめるこ
ともできる。好ましくは、プロセシングシグナルはゴル
ジ膜中に存在する酵母エンド波ブチダーゼにより認識さ
れるＬｙｓ−Ａｒｇ　残基金含有する。
ＴＰＡ遺伝子の発現の後、遺伝子産物は分泌経路に入り
、そして４リゾラズム空間に輸送すれる。
さらに細胞壁を通しての培地中への分泌を達成すること
ができねば、収量の相当々増加が可能となるはずである
。さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単
純化することが可能である。
さらに、成熟コード配列の前に翻訳開始シグナルとして
のＡＴＧ　’ｉ必要としないので、Ｎ−末端に追加のメ
チオニンを有しないＴＰＡ　’ｅ回収することができる
。グリコシル化は分泌経路と関連するので、生産された
ＴＰＡはグリコシル化さｊ、ていると予想される。グリ
コシル化ＴＰＡ　’ｉ非グリコシル化ＴＰＡより有利々
ものとする幾つかの特徴が存在する。
すなわち、グリコシル化ＴＰＡは非グリコシル化ＴＰＡ
よりもさらに密接に哺乳動物細胞からの真正のＴＰＡに
類似する。さらに、ＴＰＡのごとき蛋白質の三次構造は
おそらくある程度グリコシル残基の存在に依存する。Ｔ
ＰＡ分子中に存在する炭水化物残基が化学的安定性及び
薬理学的活性に好ｔ　Ｌ、い影響を有することが予想さ
れる。
酵母プロモーター及びＴＰＡコード領域とは別に、この
発明のハイブリドベクターーは、プロモーターの機能、
す々わちＴＰＡコード領域の発現にとっては非本質的で
あり又は重要でないが、例えば、該ハイブリドベクター
ーにより形質転換された酵母細胞の増殖において重要な
機能を果す追加のＤＮＡ配列を含有する。追加のＤＮＡ
配列は原核細胞及び／又は真核細胞から誘導することが
できそして染色体ＤＮＡ配列及び／又は染色体外ＤＮＡ
配列を含有することができる。例えば、追加のＤＮＡ配
列はグラスミドＤＮＡ、例えば細菌性もしくは真核性グ
ラスミドＤＮＡ、ウィルス性ＤＮＡ及び／又は染色体Ｄ
ＮＡ　。
例えば細菌、酵母もしくは高等真核動物の染色体ＤＮＡ
から得る（又はこれらから成る）ことができる。好まし
いハイプリドペ茗ターは細菌グラスミド、４１）Ｋｇ、
コリプラスミドｐＢＲ３２２又、は関連グラスミド、バ
クテリオファージλ、酵母２μプラスミド、及び／又轢
酵母染色体り？ＪＡ←杓に由来する追加のＤＮＡ配列を
含有する。
好ましくは、追加のＤＮＡ配列は酵母複製開始点及び酵
母用の遺伝的選択マーカーを担持する。酵母複製開始点
、例えば染色体自律複製セグメントＣ，ａｒｓ　ａｕｔ
ｏｎｏｍｏｕｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｓｅｇ
ｍｅｎｔ）を含有するハイブリドベクターーは、形質転
換後に酵母細胞中で染色体外に保持され、そして有糸分
裂の際に自律的に複製される。酵母２μグラスミドＤＮ
Ａに相同な配列を含有するハイブリドベクターーも同様
に使用することができる。これらのハイブリドベクター
ーは、すでに細胞内に存在する２μプラスミド中に組み
換えにより組込まれ、又は自律的に複製するであろう。
２μ配列は高頻度形質転換プラスミドのために特に適当
であり、そして高コピー数をもたらす。
さらに、この発明のハイブリドベクターーは、宿主酵母
染色体中に存在する遺伝子の部分としてのＤＮＡ配列（
例えば、ｎ熟臣遺伝子、又はＴＰＡコード領域に連結さ
れるそのプロモーター）を含有することができる。相同
な配列（これは約２０〜１００デオキシヌクにオチドの
範囲に及ぶべきである）Ｋより、全ベクター又はその線
状断片は組換により宿主クロモシームに安定に導入され
ることができる。すなわち、増殖中、子孫細胞は選択圧
が存在しない場合でも導入された遺伝物質を保持するで
あろう。例えば、酵母染色体遺伝子中に天然に存在する
配列′、例えばＴＰＡ遺伝子の５′−末端における酵母
染色体遺伝子のプロモーター領域、及び３′−末端にお
ける該遺伝子の３′−フランキング領域を両端に有する
該ＴＰＡ遺伝子は、前記染色体遺伝子の座に安定に組み
込まれ得る。この発明の１つの好ましい態様においては
、ＰＨＯ５プロモーター、ＴＰＡコード領域及びＰ）Ｉ
Ｏ５３’−フランク興域を含有する線状ＤＮＡセグメン
トが、ＴＰＡ遺伝子を対応する酵母染色体、すなわち酵
母染色体■のμ埠座に組み込むために使用される。
酵母用の選択遺伝子マーカーについては、マー。
カーの表現型発現に基いて形質転換休め選択を促進する
任意のマーカー遺伝子を使用することができる。酵母用
の適当なマーカーは特に１抗生物質耐性を発現するも−
の、又は栄養要求性酵母変異株の場合には、宿主の障害
を補完する遺伝子である。
例えば、対応する遺伝子は抗生物質シクロヘキシミドに
対する耐性を付与し、又は栄養要求変異株に原栄養性を
もたらす。例えばＵＲＡ３、ＩＥＵ３、里旦又は１計１
遺伝子である。また、マーカーとして、形質転換される
べき宿主がマーカーにより発現される生成物について栄
養要求であることをもたらす自律複製セグメントと関連
する構造遺伝子を使用することができる。
有利には、この発明のハイブリドベクターー中に存在す
る追加のＤＮＡ配列はさらに、細菌宿主、特にＥ、コリ
のための複製開始点及び遺伝的選択マーカーを含有する
。Ｅ、コリ複製開始点及びＥ、コリマーカーを酵母ハイ
ブリドベクターー中に使用することに関して有用な特徴
が存在する。まず、Ｅ、コリにおける増殖及び複製によ
り大量の　　　　　　　。
ハイブリドベクターーＤＮＡを得ることができ、そして
第２に、Ｅ、コリに基礎を置くクローニング・技法のす
べてを用いてハイブリドベクターーの造成を便利に行う
ことができる。Ｅ、コリプラスミド、例えばｐＢＲ３２
２等は、Ｅ、コリ複製開始点、及び抗生物質、例えばテ
トラサイクリン及びアンピシリンに対する耐性をもたら
すＥ、コリ遺伝マーカーを含有し、そして酵母ハイブリ
ドベクターーの部分として有利に使用される。
好ましくは、この発明のハイブリドベクターーは、転写
停止及びポリアデニル化のための適当なシグナルを含有
する酵母遺伝子の３′−フランキング配列をも含有する
。適当な３′−フランキング配列は例えば、使用するプ
ロモーターに天然に連結されている酵母遺伝子のそれ、
特にＰＩ（０５遺伝子のフランキング配列である。
例えば、酵母及び細菌宿主のための複製開始点及び遺伝
的マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列（上記を参照の
こと）を以後「ベクターＤＮＡ　Ｊと称する。このもの
は酵母プロモーター及びＴＰＡコード領域と一緒になっ
てこの発明のハイブリドベクターーを構成する。
好ましい態様において、この発明は酵母宿主株中での複
製及び表現凰選択が可能力ハイブリドベクターーに関し
、このベクターは酵母プロモーター及び組織プラスミノ
−ｒンアクチペーターをコードするＤＮＡ配列を含んで
成り、該ＤＮＡ配列は、形質転換された酵母菌株中で組
織プラスミノーダンアクチペーターを生産するために発
現されるように、転写開始シグナル及び転写停止シグナ
ル、並びに翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナルと共
に、前記ハイブリドベクターー中に前記プロモーターの
制御のもとＫおかれる。
ハイブリドベクターーは公知の方法により、例えばベク
ターＤＮＡ中に酵母プロモーター及び該プロモーターに
より制御されるコード領域を導入することによって調製
される。
便利には、少くとも１個の制限部位、好ましくは２個又
はそれよシ多くの制限部位余有するマツピングされた線
状又は好ましくは環状ベクターＤＮＡ　、例えば細菌プ
ラスミドＤＮＡ又はこ増、に類するもの（上記を参照の
こと）を使用することができる。
有利には、ベクターＤＮＡはすでに酵母及び／又は細菌
宿主のための複製開始点及び遺伝子マーカーを含有する
。ベクターＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて切断する。制限酵素処理されたＤＮＡを酵母プロモ
ーターを含有するＤＮＡ断片、及びＴＰＡ　’ｉコード
するＤＮＡ断片に連結する。プロモーター及びＴＰＡコ
ード領域の連結前又はその後Ｋ（＄るいは同時に）、酵
母又は細菌宿主のための複製開始点及び／又はマーカー
を導入することができる。すべての場合に、制限酵素処
理及びアニーリング条件は、ベクターＤＮＡ及びプロモ
ーターの本質的な機能の妨害が生じないように選択する
。バイブリドプロモーターは逐次的に、又は注目のすべ
ての配列を含有する２個のＤＮＡセグメントを連結する
ことにより造成することができる。
ＤＮＡセグメントを試験管内で連結するために種種の技
法を使用することができる。ある稲の制限エンドヌクレ
アーゼにより形成された平滑末端（完全な塩基対を有す
るＤＮＡデュゾレックス）はＴ　４　ＤＮＡ　！７ガー
ゼにより直接連結することがアきる。さらに一般的には
、ＤＮＫセグメントは、その。
単鎖接着末端により連結し、そしてＤＮＡ　ＩＪガーゼ
、例えばＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼにより共有結合的
に閉じる。このような単鎖「接着末端」は、不ぞ゛ろい
末端（ＤＮＡデープレックスの２本の鎖が、数個のヌク
レオチドの距離をおいて異る位置において切断される）
を形成する他の種類のエキソヌクレアーゼでＤＮＡを切
断することにより形成することができる。単鎖はまた、
ターミナルトランスフ；ラーゼを用いて平滑末端又は接
着末端にヌクレオチドを付加することにより（［ホモポ
リマーテーリング」）、あるいは単に平滑末端ＤＮＡ断
片の一方の鎖を、適当なエキソヌクレアーゼ、例えばλ
−エキンヌクレアーゼにより切シ取る（　ｃｈｅｗｉｎ
ｇｂａｃｋ　）ことにより形成することができる。接着
末端を形成するための他の方法は、平滑末端ＤＮＡセグ
メントに接着末端形成エンドヌクレアーゼの認識部位を
含有する化学合成リンカ−ＤＮＡ　ｔ一連結し、そして
得られ７’ｃＤＮＡｔ対応するエンドヌクレアーゼによ
り消化することから成る。
効率的に握現されるためには、転写機能（酵母Ａアモー
ター）及び劉訳機能（リテゾーム結合部位）を含有す多
配列に関してＴＰＡ遺伝子が適切に配置されなければな
らない。第一に、プロモーター配列を含有するＤＮＡセ
グメントとＴＰＡコート領域との連結が適切な方向に行
われなければならな゛い。２つの方向付が可能であれば
、常用の制限分析により正しい方向付けを決定する。誤
って方向付けられたＴＰＡ遺伝子挿入部を含有するハイ
ブリドベクターーは、適当な制限エンドヌクレオチドに
より遺伝子挿入部を切シ出し、そして該遺伝子とハイブ
リドベクターー断片と金再連結することによって再方向
付けする。ある場合には、それぞれが末端に異る制限部
位を有す・る２つのＤＮＡセグメントを連結するととＫ
よって正しくない方向付けが回避される。さらに１ハイ
グリドベクターの造成は、正しい転写開始及び停止が可
能なように行わなければならない。後の点について社、
転写は、酵母染色体ＤＮＡ又は酵母２μプラスミド自来
のＤＮＡ配列において終わるのが好ましい。好ましくは
、酵母遺伝子、例えばＰＨＯ５又は１聞１の転写停止シ
グナルを含有するＤＮＡ配列中で終る。“第二に、適切
なリーディングフレームが確立されなければならない。
一般に１プロモーター領域及びＴＰＡコード領域のヌク
レオチド配列は連結に先立って知られ、又祉正しいリー
ディングフレームを確立する上で問題が無いように容易
に決定するこ　。
とができる〔例えば（１０）　）。
成熟ＴＰＡを直接発現せしめるのが望ましい場合、場合
によってはプロモーターに続きそして／又は場合によっ
ては成熟ＴＰＡコード領域に先行するジグ１ル配列又は
その部分を、例えばエキソヌクレアーゼ、例えばＢａ１
３１で消化することにより線去しなければならない。酵
素プロモーター’ｉ　ＴＰＡコード配列に直接連結する
ための好ましい領域は、大ｍＲＮＡの出発部と酵７母プ
ロモーターに天然に連結されている遺伝子コード領域の
ＡＴＧとの間である。この領域での連結のために、“Ｔ
ＰＡコード配列配列状翻訳開始めに自らのＡＴＧを有す
べきであシ、あるいは追加の合成オリがヌクレオチドを
そなえなけわばなら々い。酵母プロモーターはまた接続
分子としての合成オリゴヌクレオチドによりＴＰＡコー
ド配列に連結することもできる。すなわち、プロモータ
ー領域は、可能であれば、あらかじめ定めらねた数の塩
基対が欠けるようにその３′−末端の近傍で制限酵素切
断される。有利には、ＴＰＡコード配列をその５′−末
端近くで切断する。そして、接続オリゴヌクレオチドを
介して酵母プロモーターとＴＰＡコード配列とを連結す
る場合に、ＡＴＧ翻訳開始シグナル及びＴＰＡコード配
列を含む失われた塩基対が修復され、そしてＴＰＡコー
ド配列がプロモーターに対して適切なリーディングフレ
ーム内に４るように、合成オリゴヌクレオチドを構成す
ることができる。
、　中間生成物、例えば１又は複数の本質的機能をなお
欠いているベクター、及びこの発明の最終ハイブリドベ
クターーは、前記の目的（例えば、それぞれ中間生成物
及びバイブリドグラスミーの大量調製）のために、細菌
宿主、特にＥ、コリに形質転換される場合がある。細菌
ベクター、例えばＥ、コリノラスミドｐＢＲ３２２、及
び細菌複製開始点及び遺伝子マーカーを含有するその断
片はこの理由のために最も好ましいベクターである。こ
のような細菌ベクターを使用する場合、酵母ハイブリド
ベクターーを調製するための最終段階は、好ましくはさ
らに、酵母用の遺伝マーカー及び複製開始点の導入を含
む。
この発明の他観点は、組織グラスミノーダンアクチペー
ターを生産することができる形質転換された酵母細胞の
製造方法に関し、この方法は、１項に記載した任意のハ
イブリドベクターーにより酵母を形質転換すること、又
は組織ノラスミノーダンアクチベーターの遺伝子を酵母
染色体に組み込むことを含む。
（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｉ）属、及び＠縁属Ｃ（１１）ｔ
−参照のこと〕の種、特に、サッカロミセス・セレビシ
ェーの菌株が含まれる。
ハイブリドベクターーによる酵母の形質転換は、それ自
体公知の方法により、例えばＨｉ　ｎｎ等（１２）Ｋよ
り記載された方法に従って行うことができる。
この方法は、次の３段階に分けることができる。
（１）酵母細胞壁の除去。
（２）　　ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール）及びＣ
ａ”イオンの存在下での形質転換用ＤＮＡによる「裸の
」酵母細胞（スフェロプラスト）の処理。
（３ン　　細胞壁の再生及び寒天固層中での形質転換さ
れた細胞の選択。
好ましい方法： （１）グルコシダーゼの種々の標品、例えばカタツムリ
の腸液〔例えばグルスラーゼ（Ｇｌｕｇｕｌａｓｅ）（
商標）又はヘリカーゼ（Ｉ（ｅｌｉｃａｓ＠）　（商標
）〕又は微生物から得られる酵素混合物〔例えばケモリ
アーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｉｅ）　（商標）〕を用いて酵
素的に、浸透圧が調整された溶液（例えば１Ｍソルビト
ール）中で、酵母細胞壁を除去する。
（２）酵母スフェロプラストをＰＥＧの存在下で凝集せ
しめ、そして細胞質膜の部分融合を訪導する。
「融合様」状態の発生が重要であり、そして形質転換さ
れた多くの酵母細胞が形質転換の過程で二倍体又は二倍
体にさえなる。形質転換体を濃縮するために融合したス
フェロプラストの選択を可能にする方法を用いることが
できる。すなわち、形質転換された細胞を、あらかじめ
選択された融合生成物中から容易に選択することができ
る。
（３）細胞壁を有しない酵母細胞は分裂しないから、細
胞壁を再生１−なげればならない。この再生は、スフェ
ロプラストを寒天に埋め込むことにより便利に行うこと
ができる。例えば溶融した寒天（約５０℃）をスフェロ
プラストと混合する。溶液を酵母増殖温度（約３０℃）
に冷却した後、固層を得る。この寒天層は必須の巨大分
子がスフェロプラストから急速に拡散しそして失われる
のを防止し、そしてそれによって細胞壁の再生を促進す
るためのものである。しかしながら、細胞−の再生は（
効率は低いがンスンエロノ゛２ストをあらかじめ形成し
た寒天層の表面上にグレートすることによっても行うこ
とができる。
、好ましくは、再生寒天の調製は、再生と形質転換され
た細胞の選択が同時に可能なように行う。
アミノ酸生合成経路の酵素をコードするための酵母遺伝
子が選択マーカーとして一般に使用される（１章を参照
のこと）ので、再生は好ましくは酵母最小培地寒天中で
行う。非常に高い再生効率が要求される場合、次の２段
階法が好ましい。すなわち（１）豊富な複合培地中での
細胞壁の再生、及び（２）細胞層を選択寒天グレート上
にレプリカすることによる形質転換細胞の選択である。
ハイブリドベクターーがマーカー遺伝子を含有しない場
合、形質転換された細胞は他の方法によって固定するこ
とができる。このような方法処は、例えばハイブリドベ
クターーの配列に相同なラベルＤＮＡ断片を用いるｉｎ
　５ｉｔｕ　　バイブリド形成〔例えばＨｉｎｎｅｎ等
（１２）に従う〕、導入された遺伝子の産物抗体が利用
できればｉｎ　５ｉｔｕ免疫測定、又は形質転換ｆ−）
スミドによりコードされる生成物を測定する他のスクリ
ーニング法が含まれる。
上記の方法に代えて、どの発明のノ〜イゾリドベクター
及び酵母のための遺伝マーカーを含有する第２のベクタ
ーを用いて同時形質転換（ｃｏｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ）を行うことができる。２つの異るベクターが
共通のＤＮＡ配列（これはベクター上に存在する細菌性
配列でもよい）を有する場合、組換が生じ、選択可能な
融合ハイノリド分子を導く。
酵母はまた、酵母染色体上の配列に相同な配列を両端に
有する、ＴＰＡ遺伝子含有線状ＤＮＡセグメント、及び
酵母のための選択マーカーを含有するベクターを用いて
同時形質転換することができる。
同時形質転換は、直接選択することができないＤＮＡを
取り込んだ酵母細胞の濃縮を可能にする。
コンビテン）Ｍ胞は任意のタイプのＤＮＡを取り込むの
で、選択ベクターにより形質転換された細胞の多くがさ
らに追加のＤＮＡ　（：例えば、ＴＰＡを他のフランキ
ング配列（５０）と共に含有する線状セグメント〕を担
持するであろう。十分に長い相同配列（例えば、長さが
約２０〜２００デオキシヌクレオチド）によｊＤ、ＴＰ
Ａ遺伝子は宿主の染色体に安定に組込まれるであろう。
％に１線状ＤＮＡセグメントはＴＰＡ遺伝子を制御する
ＰＨＯ５プロモーター及びＰ）１０５ターミネータ−配
列を含有する・この構成は、ＰＨＯ５遺伝子の染色体部
位、すガわち酵母染色体■へのＴＰＡ遺伝子の安定な組
み込みを導くであろう。
酵母プロモーター、該プロモーターにより制御される組
織プラスミノーゲンアクチベーターの遺伝子、及び酵母
遺伝学の転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列を含ん
で成る線状ＤＮＡセグメントもまたこの発明の対象であ
る。
この発明のバイブリドグラスミドを含有する得られた酵
母菌株は、公知の方法を用いる変異及び選択により、Ｔ
ＰＡ生産について改良することができる。変異は、例え
ばＵＶ照射、又は適当な薬剤を用いて行うことができる
。
この発明はまた、酵母プロモーター及び該プロモーター
によＱ制御されるＴＰＡコード領域を含んで成るハイブ
リドベクターーにより形質転換された酵母宿主、並び忙
酵母染色体に安定に組み込まれそして染色体酵母プロモ
ーターの制御のもとにある組織シラスミノ−ｒンアクチ
ペーターの遺伝子を有する酵母宿主、並びにこれらの変
異株から成る群から選ばれた形質転換された酵母宿主に
関する。
この発明の酵母におけるＴＰＡ遺伝子の発現の一次生成
物は、ＴＰＡの１鎖前駆体（ｐｒｏ−ＴＰＡ）である。
しかしながら、もしプロテアーゼが酵母宿主細胞中、ペ
リプラズム空間中、又は培養液中に存在すれば、−次的
に発現されたｐｒｏ−ＴＰＡは少々くとも部分的には２
鎖ＴＰＡに転換されるであろう。
従って実際に分離された生成物はＴＰＡ、　ｐｒｏ−Ｔ
ＰＡ又はこれらの混合物から成るであろう。この発明の
ハイブリドベクターー中でシグナル配列がＴＰＡコード
配列に先行するなら、分泌は少なくとも部分的にはグリ
コシル化と関連する。従って、得られ九生成物はまたグ
リコシル化蛋白質及び非グリコ　　　　　゛シル化蛋白
質を含有するであろう。
この発明はさらに、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、プロ−組織プラスミノーダンアクチペーター又はこ
れらの混合物（ここで、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター及びプロ−組織ソラスミノーダンアクチベーター
はグリコシル化形もしくは非グリコシル化形、又はこれ
らの形の混合物として存在する）の製造方法であって、
酵母プロモーター及び該プロモーターにより制御される
組織プラスミノーダンアクチペーターコード領域を含ん
で成るハイブリドベクターーにより形質転換された酵母
菌株、もしくは酵母染色体に安定に組込まれておシそし
て染色体性酵母プロモーターの制御下にある組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの遺伝子を有する酵母菌株、
又はこのような酵母菌株の変異株を適当な栄養条件下で
培養し、そして前記蛋白質を分離し、そして精製し、そ
して所望により得られた組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター及びプロ−組織プラスミノーダンアクチペーター
の混合物金側々の成分に分離し、そして〜プロ−組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターを含有し々い組織プラス
ミノーダンアクチペーターを製造するために生成したプ
ロ−組織プラスミノーダンアクチペーターを組織プラス
ミノーゲンアクチベーターに転換し、そして所望により
混合物として得らねた非グリコシル化生成物からグリコ
シル化形を分離し、そして、グリコシル化蛋白質を含有
しない非グリコシル化蛋白質を製造するために、得られ
た蛋白質においてグリコシル残基を除去する各段階を含
んで成る方法に関する。
ａ、形質転換された酵母細胞の培養 この発明の形質転換された酵母菌株は、資化性の炭素源
、窒素源及び無機塩を含有する液体培地中で培養する。
種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトー
ス、マンニトールもしくはラクトース、又は酢酸塩を挙
げることができ、これらは単独で、又は適当な混合物と
して使用することができる。適当な窒素源には例えばア
ミノ酸、例えはカザミノ酸、ペプチド、及び蛋白質及び
その分解生成物、例えばペプトン、トリプトン、又は肉
エキス、さらに酵母エキス、マルトエキス、コーンステ
イーシリカ−１並びにアンモニウム塩、例えば塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムが含
まれ、これらは単独で又は適当な混合物として使用する
ことができる。使用されル無機塩には、例えばナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、
塩化物、燐酸塩及び炭酸塩が含まれる。さらに、栄養培
地はさらに増殖促進物質が含まれる。増殖促進物質には
例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は各
アミノ酸が含まれる。
自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラスミドＤＮＡ
ｔ−含有するプラスミドにより形質転換された酵母細胞
は、種々の程度において、導入されたバイブリドプラス
ミドを喪失する傾向がある（　（１３）’を参照のこと
〕。こ゛のため、このような酵母は、選択的条件、例え
ば増殖のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現
を必要゛とする条件下で増殖させなければならない。現
在知られているほとんどの選択マーカーは、アミノ酸又
はプリンの生合成の酵素をコードする遺伝子である。こ
のためには、対応するアミノ酸又はプリン塩基を欠く合
成最少培地を使用する必要がある。しかしながら、適当
な殺生物剤に対する耐性をもたらす幾つかの遺伝子〔例
えば、シクロへキシミド、アミノ−グリコシドＧ４１８
　（１４，）、重金属等に対する耐性をもたらす遺伝子
〕を同様に用いることができる。抗生物質耐性遺伝子を
含有するベクターに−より形質転換された酵母細胞は、
対応する抗生物質を含有する複合培地中に増殖せしめ、
これにより一層速い増殖速度及び一層高い細胞濃度が得
られる。
クロモシームに組み込まれたＤＮＡにより形質転換され
た酵母細胞は選択的増殖条件を必要としない。これらの
形質転換細胞は選択圧なくして増殖するのに十分に安定
である。上記の理由により、これらの細胞は複合培地で
増殖せしめるのが好ましい。
構成的プロモーター（例えばＰＨＯ３又はＡＤＨＩ）を
有するバイブリドプラスミドを含有する酵母細胞は、該
プロモーターに結合したＴＰＡ遺伝子を、誘導を必要°
としないで発現する。しかしながら、ＴＰＡ遺伝子が制
御されたプロモーター（例えばＧＡＰＤＨ％込迅、又は
に匹臣）の制御のもとにある場合には、増殖培地の組成
は、最高レベルのｍＲＮＡ転写が得られるように調整し
なければならない。すなわち、眉熟ユプロモーターを使
用する場合には、増殖培地は、このプロモーターの抑制
解除のために低濃度の無機燐酸イオンを含有し々ければ
なら力い０ 培養は、常法を用いて行う。培養条件、例えば温度、培
地の−及び発酵時間は、最高レベルのＴＰＡが生産され
るように選択する。選択された酵母菌株は、好ましくは
好気的条件下で、液中培養として、振とり又は攪拌しな
がら、約ｉ５℃〜３゛５℃、好ましくは約３０℃におい
て、４〜８の−において、例えばおよそｐＨ７において
、そして約４〜２０一時間にわたって、好ましくは蛋白
質の収量が最高に達するまで増殖せしめる。
ｂ１発現されたＴＰＡの分離及び精製 形質転換された酵母細胞が十分な細胞濃度に増殖した後
、発現された蛋白質の回収の第一段階は、蛋白質を細胞
内から遊離せしめることから成る。
はとんどの方法において、細胞壁をグルコシダーゼ（２
項を参照のこと）を用いて酵素的に消化することによっ
てまず除去する。次に、得られたスフェロプラストを洗
剤、例えばトリトンＣＴｒｉｔｏｎ　）により処理する
。この方法に代えて、機械的力、例えば剪断力（例えば
Ｘ−プレス、フレンチプレス）、又はガラスピーズとの
振とうも細胞全破壊するために適当である。得られた蛋
白質混合物を、常法、例えばポリエチレンアミンで処理
することによるほとんどの非蛋白質性物質の除去、硫酸
アンモニウムもしくはトリクロロ酢酸によって溶液を飽
和することＫよる蛋白質の沈澱、グル電気法。
動、透析、クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、サイズ分画クロマトグラフィー、）Ｉ
ＰＬＣもしく忙逆相ＨＰＬＣ、適当なセファデックス（
５ｓｐｈａｄｅｘ　）　（商標）カラム上での分子サイ
ズ画分、又はこれらに類する方法により、ＴＰＡについ
て濃縮する。前精製生成物の最終精製は、例えばアフィ
ニティークロマトグラフィー、例えば抗体アフィニティ
ークロリトグラフィー、特に公知の方法により不溶性マ
トリクス上に固定されたモノクローナル抗−ＴＰＡ抗体
を用いるモノクローナル抗体アフィニティークロマトグ
ラフィー等により行う。
培養液からＴＰＡ’ｉ分離するための他の好ましい方法
は、不溶性マトリクス、例えばデキストラン［：　Ｑ５
）ｒ参照のこと〕上に共有結合的に固定された可溶性フ
ィブリン断片の特異的親和性を有する支持体、又は特に
ＤＩ−３セフアロース（商標）カラム上にＴＰＡを選択
的に吸着せしめることから成る。ＤＩ−３ハ豆科植物玉
１２冒した二うｊ−ＬＺご−（Ｅｒ　ｔｈｒｉｎａ　ｌ
ａｔｉｓｓｉｍａ）　（１６）の種子に含まれているト
リプシン阻害物質である。ＤＥ−３もまたＴＰＡ活性を
阻害することができることが見出されている。精製され
たＤＩ−３阻害剤を、標準的方法を用いて不溶性マトリ
クス、例えばＢｒＣＮにより活性化されたセファロース
（商標）Ｋ結合せしめる。ＴＰＡは阻害剤マドＩｊクス
に吸着され、そしてチャオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ）を含有する緩衝液により溶出さ
れ得るであろう。
との発明の好ましい態様においては、培養液を、場合に
よっては上記の１ｘは複数の精製段階を通した後、室温
において、ＤＥ−３阻害剤が結合されているＢｒＣＮ活
性化セファロースからなるカラムに通す。カラムを洗浄
した後、緩衝液、例えば約５．５〜６．０の−を有し、
そしてチャオトロピック剤、例えばＫＳＣＮ　ｅ約１．
４〜約２．０モル、好ましくは１．６モルの濃度で含有
する燐酸緩衝化塩溶液によりカラムを処理することによ
って、吸着された組織プラスミノーダンアクチペーター
を溶出する。この方法に代えて、遊離剤としてペン委ア
ミジン又はアルギニン番選択することもできる。有利に
は、洗剤、特に非イオン性洗剤、例えばトリトンＸ−１
００（商標）又はトクィーン８０（高検）を、精製段階
において使用するすべての緩衝液に加え、これによって
組織プラスミノーク゛９ンアクチベーターが容器の表面
に吸着されるのを防止し、そして安定性を改良する。洗
剤は、最終濃度が０．０１〜０１％になるように加える
ことができる。
組織プラスミノ−ダンアクチペーターが、酵母細胞によ
りイリプラスム空間に分泌される場合には、次のような
単純化された方法を用いることができる。細胞の溶解を
行うことなく、酵素的に細胞壁を除去することにより、
又は化学物質、例えばチオール試薬又はＥＤＴＡで処理
することにより蛋白質を回収する。これらの薬剤は、細
胞壁に損傷を与えて、生産されたＴＰＡの放出を可能に
する。
ＴＰＡが培地に分泌される場合には、ＴＰＡを培地から
直接回収することができる。
染色体に組み込まれたＴＰＡ遺伝子を担持する酵母細胞
の培養、並びに発現されたＴＰＡの分離及び精製は、上
記の方法と同様処して行う。
ｐｒｏ−ＴＰＡを実質上含有しないＴＰＡ　ｉ製造する
ためには、例えばゾラスミンの作用により、又はｐｒｏ
−ＴＰＡ　Ｋ対して同等の効果を有する酵素の作用によ
り、ｐｒｏ−ＴＰＡを酵素的にＴＰＡに転換する。
実質上ＴＰＡを含有しないｐｒｏ−ＴＰＡを製造するた
めＫは、好ましくは、存在しそしてｐｒｏ−ＴＰＡをＴ
ＰＡに転換する（部１分的に）ことができる痕跡１：の
プロテアーゼを阻害するために、プロテア−４１Ｊ、例
えばアプロチニン〔トラシロール（Ｔｒａｓｙｌ、ｏｌ
　）　（商標）〕、又は塩基性膵臓トリグシン阻害剤を
精製工程に加える。そして、最終精製は、選択的親和剤
、例えばＤＥ−３を含有するカラム上でのクロマトグラ
フィーにより、ＴＰＡのみを選択的に結合しそしてｐｒ
ｏ−ＴＰＡを結合しなイＩＩ　香剤、例えばジインプロ
ピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ　）　又ハ二トロフ
ェニルグアニジノペンゾエートの存在下で行う。これら
の試薬は、ＴＰＡがアフィニティーカラムに吸着される
のを防止する。この結果、ＴＰＡはＤＥ−３カラムを通
過し、他方ｐｒｏ−ＴＰＡはカラムに吸着されるであろ
う。
これを上記のようにして溶出することができる。
グリコシル化蛋白質及び非グリコシル化蛋白質の混合物
は、例えばコンカナバリン−Ａセファロースカラム上で
のクロマトグラフィーにより分離することができる。非
グリコシル化生成物はカラムを通過し、他方グリコシル
化生成物は選択的に吸着されるであろう。これは、常用
手段により、例えばチャオトロビック剤、例えばＫＳ　
ＣＮと組合わせてα−メチルマンノシドを用いて溶出す
ることができる。
グリコシル残基を酵素的に、例えばエンドグルコシダー
ゼＨの作用により除去することができる。
この方法により、非グリコシル化生成物を実質上純粋な
形で製造することが可能である。
この発明に従って得られるＴＰＡ及びｐｒｏ−ＴＰＡは
価値ある薬理学的性質を有する。すなわち、これらの蛋
白質は、血栓症、又はプラスミノーゲン活性化の機作を
介して局所的フィブリン分解活性又は蛋白質分解活性を
生じさせることが望まれる他の状態、例えば動脈硬化症
、心筋梗塞も７．シ＜は脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓
症、手術後血栓症、血栓性静脈炎、及び糖尿病性血管症
状の予防又は治療のために、ヒトにおいて、公知のプラ
スミノ＝Ｐンアクチベーターと同様に使用することがで
きる。
この発明はさらに、酵母特異的グリコシル化、さらに具
体的にはサツカロミセス属、特にサッカー―−■−−■
■−■―■■■■−■■■■■−曜一■Ｗ■騨−―−−
−−−ｉロミセス・セレビシェ−に特異的なグリコシル
化ヲ有するＴＰＡ、　ｐｒｏ−ＴＰＡ及びこれらの混合
物に関する。
この発明はさらに１この発明の方法に従って製造される
すべての場合のＴＰＡ、　ｐｒｏ−ＴＰＡ及びこれらの
混合物に関する。
この発明はさらに、この発明の方法に従って得られるＴ
ＰＡ、　　ｐｒｏ−ＴＰＡ及びこれらの混合物に関する
。
この発明は特に１例に記載したハイブリドベクターー、
形質転換された酵母菌株及びこれらの製造６方法、並び
にＴＰＡ、　ｐｒｏ−ＴＰＡ又はこれらの混合物に関す
る。
医薬 この発明に従って得られる新規な蛋白質、特にＴＰＡ及
びｐｒｏ−ＴＰＡは価値ある薬理学的性質を有する。す
なわち、ＴＰＡ及びｐｒｏ−ＴＰＡは、血栓症、又はシ
ラスミノ−ダンの活性化の機作を介して局所的フィブリ
ン分解活性又は蛋白質分解活性を生じさせることが望ま
れる他の状態、例えば動脈硬化症、心筋梗塞もしくは脳
梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓症、手術後血栓症、血栓性
静脈炎、及び糖尿病性血管症状の予防又は治療のために
、ヒトにおいて、公知のグラスミノーダンアクチペータ
ーと同様に使用することができる。
この発明はまた、医療的に有効な量の活性成分（特に、
ＴＰＡ、　　ｐｒｏ−ＴＰＡ又はこれらの混合物）を、
有機又は無機の固体又は液体の、非経口的投与、すなわ
ち筋肉内投与、皮下投与又は腹腔内投与に適し、そして
活性成分と不都合な反応を行わない医薬として許容され
る担体と共に含有する医薬に関する。
特に、注入溶液、好ましくは水溶液又は水性懸濁液が適
当であシ、これらは使用前に調製することができ、例え
ば活性成分を単独で、又は担体、例エバマンニトール、
ラクトース、グルコース、アルジミン等と共に含有する
凍結乾燥↓剤から調製することがてきる。この医薬は無
菌化することができ、そして所望により、賦形剤例えば
防腐剤、安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝剤及び／又は浸
透圧調整剤と混合することができる。無菌化は、小ポア
ーサイズ（０，４５μｍ又はこれより小さい直径）のフ
ィルターを通して無菌濾過により達成することができ、
その後に所望により調製物凍結乾燥することができる・
貯蔵中の無菌性を助けるため抗生物質を加えることもで
きる。
この発明の医薬は単位投与形、例えば投与当たシ］〜２
０００■の医薬として許容される担体及び単位投与当た
シ約１〜２０ｒｎ９、好ましくは約３〜１５ダの活性成
分（ＴＰＡ、、　ｐｒｏ−ＴＰＡ又はこれらの混合物）
を含有するアンプルとして調合される。
疾患のタイプ、並びＶｃＢ者の年令及び状態に依存して
、体重的７０ｋｇの患者の治療のために投与される日用
量は２４時間当り３〜１．５ＴＮ９、好ましくは５〜１
０■の範囲である。
この発明けさらに、この発明の生理活性蛋白質を医薬と
して許容される担体と混合することを特徴とする医薬の
製造方法に関する。この新規な蛋白質の、ヒトの体の予
防的及び治療的処置のための使用もまたこの発明の対象
である。
次に、例によりこの発明を具体的に説明する。
但し、こねによりこの発明の範囲を限定するものでは々
い。
実験の部 この明細書中の例において次の略号を用いる。
ＢＳＡ　　：ウシ血清アルブミン ＤＴＴ＋１．４−ジチオスレイトール（１，４−ジメル
カプト−２，３−ブタンジオ ール） ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　：　ドデシル硫酸ナトリウムＴＮＥ　　：　
１００　ｍＭ　ＮａＣＬ、　　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＡ（ｐＨ７，５）、及びｌ　ｍＭＥＤＴＡを含有す
る溶液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ：　）リス−（ヒドロキシメチル）−
ア辷ノエタン、ＨＣｌにてｐＨ調整 ＴＥ　　：　１０　ｍＭ　Ｔｒｊｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，
５’）及び１　ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液 ＭＯＰＳ　：　３−モルホリンープロノｊンー１−スル
ホン酸 株からの３０μｇの全高分子量酵母ＤＮＡ　（１７）を
、３７℃にて３０分間、２５０　ａｌｌのＥｃｏＲＩメ
チレーション緩衝液中２ユニットのｇｃｏＲＩメチラー
ゼによυ、供給者の推めに従ってインキュベートｊる。
ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、５００μ１０２５ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ８，５，２ｍＭ　ＮａＣＬ
２　（ＥｃｏＲ［”緩衝液）　（１８）中に再懸濁し、
そしてＤＮＡ断片のサイズ分布が３０〜５０　ｋｂの範
囲の最高値を有する’！　ｆ　ＥｃｏＲＩ　（ペーリン
ガー）により消化する（λＤＮＡのＸｈｏｌ消化により
適当な３３　ｋｂ及び１３　ｋｂのマーカーが得られる
）。ＥｃｏＲｌ”条件下で消化した酵母ＤＮＡを、シュ
ークロースグラジェント（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・Ｔ（Ｃ
ｚ　、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中シー−りｏ−
ｘ５〜１０’１６　）上”’ｒ３８，００．Ｏｒｐｍ　
Ｋて６時間、５Ｗ４０ローター中でサイズ画分゛する６
０．４ｍｌずつの３０画分をグラジェントの上部から集
める。画分１６が３０〜４０ｋｂのサイズのＤＮＡ断片
を含有する。この両分のＤＮＡ　（３μｇ）をエタノー
ルで沈澱せしめ、そして１色℃にて１６時間全容１５μ
ｌにおいて、ＥｅｏＲｒにより線状化したコスミドベク
ターｐＹｃｌ　（１９）’ｌμｇに連結する。連結は３
００ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼにューイングランド
ビオラブス）により、供給者により記載された緩衝系を
用いて行なう。ＤＮＡを試験管内でバクテリオファージ
λ（２０）にＡツケージし、そして集められたファージ
を用いてＥ、コリＨＢＩＯＩ　株（ｒＫ−＋　！！に−
＋　１ｅｕ−＋　ニー１　ｒｅｃＡ−）をトランスデユ
ースする。トランスダクションの効率は、ｐＹｃ　１ベ
クタ一μｇ当たシ約５０００個のアンピシリン耐性コロ
ニーである。３０００個のａｍｐ　Ｒコロニーを拾い上
げ、そして、それぞれ、ミクロタイター皿のウェル中、
１００μｌ／１１のアンピシリンを含むＬＢ培地〔１０
ｇのバクトートリゾトン（ディフコ）、５ｇのバクトイ
−ストエキストラクト（ディフコ）、１０ｇのＮ＆Ｃｔ
）中で増殖せしめる。
例２．制御された酸性ホスファターゼ遺伝子ＰＨＯ５の
分離 遺伝子ライブラリーのレプリカｅ１００μ９７ｍ１のア
ンピシリ／を含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ培地＋１
５９／ｌの寒天）上で増殖せしめる。５００コロニーか
らの細胞材料をプレートから洗い取シ、そしてプールす
る。各プールから、次の方法によりＤＮＡを分離する。
細胞を遠心分離（ツル°パル、ＧＳＡローター、６００
０　ｒｐｍにて１０分間、４℃）により集菌し、１００
１１Ｌ１１７）ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｊ、
　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。
ｐＨ８，０）に再懸濁し、そして上記の条件下で再度遠
心分離する。細胞ペレットｆ：３１１ＬｔのＴ＠ｕｅ　
（５’ＯｍＭ　Ｔｒｉｇ−ＨＣｊ　、　ｐＨ７，５，２
５（Ｗ／Ｖ　）　％シュークロース〕中に再懸濁し、そ
して８８−３４ポリプロピレンツルパルチユーブに移す
。次のすべての段階を氷上で行う。０．３ｄのリゾチー
ム溶液（１０号礪、ウオーシントンから購入、１１，０
００ユニツト／■）を加え、５分間後に１．２ｄのＥＤ
ＴＡ（５００ｍＭ　、　ｐＨ８，０’）、そしてさらに
５分間後に４．８−の洗剤〔０，１チのトリトンＸ−１
００（メルク）、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐｌ（８，０３を加える。５分間
後、溶解物をあらかじめ冷却した５Ｓ−３４０一ター中
４℃にて４０分間遠心分離する。上清液を注意深く取り
出し、そして固体ＣｍＣＬを加える（８．７１Ｌｌの上
清液に８．３ｇのＣａＣＬ　）。エチジウムプロミド（
シグマ）を加えた後（最終濃度１■／−上清液）、溶液
ｔ−１３，５―のクイックシールポリアロマ−チューブ
（ベックマン）に移し、そしてペックマンＴ１５０ロー
ター中で４０．００　Ｏｒｐｍにて４０硝間遠心分離す
る。
長波ＵＶ（３６６ｎｍ）により２つの螢光バンドを観察
することができる。低いバンドは、スーパーコイルプラ
スミドＤＮＡ　ｆｔ含有し、これを、２−の注射器（１
８Ｇ針）で側部からチューブに穴をあけることにより集
める。同容量のイソプロパツール（ＣｓＣ１で飽和した
もの）で５回抽出すること虻よりエチジウムプロミド除
去し、そして生成物を３０１Ｌｌのコレツクスチューブ
に移す。２．５容量のＴＥを加え、そしてＤＮＡをエタ
ノールにより沈澱せしめる。次に溶液を１２〜１５時間
−２０℃に保持する・沈澱したＤＮＡを、ツルパルＨＢ
−４０−ター中で、１２．００　’Ｏｒｐｍ、　０℃に
て３０分間遠心分離することにより集め、そして２００
μｌのＴＥに再溶解する。１００−の培養物から５０〜
１００μｇのバイブリドプラスミドＤＮＡを回収する。
これらのプールからのプラスミドＤＮＡを使用してＳ、
セレビシェ−ＡＨ２１６株（ａ　＋　ｈｉｓ　３　＋ｌ
ｅｕ　２　、　ｆ連ｌ＋　ｒシ匝）を、Ｈｉｎｎ等（１
２）により記載された方法により形質転換する。酵母形
質転換体を、低Ｐｉ−最少培地Ｃ２０９／ｌｊのグルコ
ースを補給したアミノ酸を含まない［ディフコ酵母最少
培地、ディフコの処方（ディフコマニュアル、ディフコ
ラ？ラドリーズ、デトロイト、米国）による組成から調
製するが、１９／ｌのＫＨ２ＰＯ４の°代シＫＯ，０３
ジノのＫＨ２ＰＯ４及びＩＩ／！のＫＣｌを使用する〕
上にレノリカし、そして染色寒天〔１０゜ｍＭ酢酸緩衝
液、ＰＪ（４，２，２１％Ｊ　／ＭＩ　Ｆａ−ｓ　ｔ　
Ｂ　ｌ　ｕ　ｅＢＳａｌｔ　　（セルパ）及び０．２　
ｔｎｐ／ＷＬ／！α−ナフチルホスフェート（セルパ）
中エチのディフコ寒天〕を重層することにより、酸性ホ
スファターゼ活性について染色する。機能的亘埠）遺伝
子を有するコロニーは低Ｐｉ−培地における遺伝子の抑
制解除により赤に染色する。遺伝子ライブラリーの反復
サブシー祠２１）により、抑制解除され得暮酸性ホスフ
ァターゼ活性を示す３個の独立クローンを得る。
これらのクローンの１つ（ｐＧ７　）　ｆさらに分析す
る。バイブリドプラスミドは４２ｋｂのサイズを有する
。ｐＧ７のＥｃｏＲＩ断片及びＢａｍＨＩ断片をそれぞ
れｐＢＲ３２２／ＨＩＳ３　（１３）及びｐＪＤＢ　２
０７　ｒ２２）にサブクローニングする。制限酵素消化
は供給者にューイングランドビオラブス）によりｍ奨さ
れた方法により得る◎そして連結は、２０μノ中１５０
ユニツトのＴ４ＤＮＡＩｊガーゼにューイングランドビ
オラプス）及び２０μＩ／Ｎの個々の消化されたプラス
ミドを用いて行うにューイングランドビオラブスにより
示唆された条件）。８ｋｂＥｅｏＲＩ断片の部分である
５、　１ｋｂ、　ＢａｍＨＩ断片を、酵母ベクターｐＪ
ＤＢ　２０７中にサブクローニングし、そして酵母ＡＨ
２１６株の形質転換の後、このバイブリドプラスミド（
ｐＪＤＢ　２０７７ＰＩ匹狙、旦匹促。
第１図参照のこと）は抑制解除（低Ｐｉ）条件下で高い
ホスファターゼ活性を生じさせ（ＰＨＯ５遺伝子）、そ
して通常の酵母最少培地中で低レベルの活性を生じさせ
る（μ’１０３遺伝子の発現）。
以下余白 例３．　　ＰＨＯ５遺伝子及びＰＨＯ３遺伝子の位置決
定定のために、Ｓａｕ　ａＡ制限部位及びユニークＰｓ
　ｔ１部位のパターンを用いる。制限エンドヌクレアー
−Ｗ　Ｓａｕ　３Ａ　にューイングランドビオラブス）
ニよるＢａｍＨ１断片の消化により６個の断片（Ａ−Ｆ
、第２図）が生ずる。部分８ａｕ’　３Ａ消化物を自律
複製酵母ベクターｐＪＤＢ２０７のＢａｍ　Ｈ１部位に
サブクローニングすることによりＳａｕ　３Ａ断片の異
る組合わせを有するプラスミドを誘く。次に、これらの
プラスミドを用いてｐｈｏ３　、　ｐｈｏ５変異酵母Ｓ
、セレビシェ−ＡＨ２１６を形質転換する。形質転換体
を低Ｐｉ−最小培地又は正常最小培地上に増殖させた後
、酸性ホスファターゼ活性について点検する。少なくと
もＳａｕ　３Ａ断片Ａ及びＢを含有するクローン（第２
図、煮１−４）は、完全な５．１　ｋｂＢａｍ　）（ｉ
断片と同じレベルの酸性ホスファターゼ（例２に記載し
たように、酸性ホスファターゼ染色寒天を重層した後に
定量的に評価する）を発現する。発現は、培地中の無機
燐酸塩の濃度により正常に制御される。Ｓａｕ　３Ａ断
片Ａのみを有するクローン（第２図、４５　、６　）は
低レベルの酸性ホスファターゼを発現し、これは培地中
の無機燐酸塩濃度に影響されない。このことは、Ｓａｕ
　３Ａ断片Ａにより担持された情報が構成的酸性ホスフ
ァターゼ（Ｐｆ（０３）の発現のために十分であること
を示している。Ｓａｕ　３Ａ断片Ｂ（ｉ２図、Ａ７）の
みは抑制条件又は抑制解除条件のいずれにおいても１つ
たく発現を導かない。しかしながら、ＢａｍＨ１部位及
びＰｓｔＩ部位間の完全配列（第２図、Ａｌ　Ｏ）を有
するサブクローンは酸性ホスファターゼの制御された合
成を示すが構成的合成を示さない。従って、このサブク
ローンは酵母ＰＨＯ５遺伝子（１３）を含有するに違い
ない。
ＰＨＯ５遺伝子の正確な位置は、Ｍａｘａｍ及びＧ１１
ｂｅｒｔの方法（１０）を用いるＤＮＡ配列決定により
決定する。６２３ｂｐのＲａｍ　ＨＩ−８ａｌｌ　制限
断片を、上記の消化及び連結条件（すべての酵素はニュ
ーイングランドビオラゲスから”入手）を用いながら、
３７５位から６５０位（ｐＢＲ３２２の番号）に伸びる
Ｒａｍ　Ｈｌ−８ａ目断片と置き換えて、シラ゛スミド
ｐＢＲ３２２にクローニングする（第１図参照のこと）
。
Ｒａｍ　Ｈｌ−８ａｌｌ　ＤＮＡ挿入部のＤＮＡ断片を
、ｇａｍＨＩ（−５４１）、Ｓａｕ　３Ａ　（−２００
）及びＳａｌ　ｌ（＋８２）（第３ａ図の番号）におい
て５′末端において非対称的にラベルする。６２３ｂｐ
ＢａｍＨＩ−８ａＪＩ　ＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配
列を第３ａ図に示す。この図から、挿入部がＰＨＯ５ｆ
ロモーター領域、及びＰ［（０５ホスフアイーゼ蛋白質
コード領域の部分を含有することが明らかである。
ｂ６　　立並遺伝子 ＰＨＯ３遺伝子の正確な位置を、ニューイングランドビ
オラプスにより発表されたマニュアルｒ　Ｍ１３　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　
ｓｙｓｔｅｍＪＫ従ってＤＮＡ配列分析することにより
決定する。
４１５ｂｐ（５’）Ｐｓｔｌ−Ｒｉａｌ（３つ断片を、
ユニークＰｓｔｌ及びＳｍａ　夏　制限部位を用いて、
ベクターＭ１３　ｍｏ　８及びＭ１３　ｍｐ　９（２３
）中に丈！クローニングする。４１６　ｂｐＰｓｔｌ−
Ｒａａｌ　ＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配列を第３ｂ図
に示す。この図から、この挿入部がＰ）（０３プロモー
ター領域、及びＰＨＯ３酸性ホスフアタ一ゼ蛋白質コー
ド配列の部分を含有することが明らかである。
除去 ３μｇのｐＢＲ３２２を、制限エンドヌクレアーゼＢａ
１ｌ（ＢＲＬ　）及びＰＶυ■（ビオラプス）を用いて
、供給者の推奨に従って完全消化する。ｐＢＲ３２２の
Ｂ　ａ　１１／ＰｖＵ■二重消化により、３７３８　ｂ
ｐ及び６２２　ｂｐ　の２つの制限断片が生ずる。この
２つの断片を、ＴＨＥ（９０ｍＭＴｒｉｍ・Ｈｃｔ、ｐ
Ｈ８，３、２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　。
９０　ｍＭ硼酸）中１％低融アガロースゲル上で分離ス
ル。ＤＮＡバンドをエチジウムプロミドで染色し、セし
て３６６ｎｍの長波長′Ｕｖ光のもとて可視化する。
３７３８ｂｐ断片を含有するアガロース片をグルか　　
　　　　。
ら切シ取り、６５モにて液化し、５０：　ＯｍＭＮａＣ
ｔに調整し、そして６５℃にて２０分間インキ−ベート
する。ｌ容量のフェノール（１０ｍＭ　Ｔｒｉｍ・ＨＣ
ｔ、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　Ｅ’ＤＴＡ　、　５００　
ｍＭ　ＮａＣｔで平衡ｆｌｌＳシたもの）を加える。水
相をフェノールにより２回、そしてクロロホルムにより
１回再抽出する。−ＤＮＡを２，５容積の冷純アルコー
ルにより沈澱せしめ、そして遠心分離により集める。Ｄ
ＮＡペレットを冷８（ｌエタノールで洗浄し、そして真
空乾燥する。ＤＮＡを０．１５ηの濃度でＴＥＫ再懸濁
する。
分離された３　７３８　ｂｐ　ＤＮＡ断片はＢａ１１及
びＰｖＪ二重消化から生ずる２つの平滑末端を有する。
ＤＮＡを、平滑末端連結により環化する。０．６μＩの
ＤＮＡを室温にて一夜、３０ｔｔｌＪの６０　ｍＭＴｒ
ｉｓ・ＨＣＬ、ｐＨ７，５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１
０ｍＭ　ＤＴＴ、　４　ｍＭＡＴＰ及び９００ＵのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）溶液中でインキュベート
する。連結混合物のアリコート５μ４を、Ｍａｎｄｅｌ
等（２４）の方法に上り調製したカルシウム処理形質転
換コンピテントＥ、コリ）（８１０１細胞５０μｌに加
える。混合物を氷上に５分間保持し、次に３７℃にて２
分間、そして室温にて１０分間櫨き、その後１００μｍ
７ｍｔの７ンビシリンを含有するＬＢ寒天プレートに上
にグレートする。６個のａｍｐＲコロニーを拾い上げ、
そしてそれぞれを１００μｇ廓の７ンピシリンを含有す
るＬＢ（着火を含有しないｆｌか上記と同じ）中で増殖
せしめる。プラスミドＤＮＡを、例２に記載した方法に
より細胞から調製する。Ｈａｅｌ［［（ビオラプスから
購入、供給者により示唆された消化条件を用いる）、Ｐ
ｖｕＩＩ及びＢａ１Ｉｌによるプラスミドの制限消化物
を、ＴＨＥ緩衝液中１，５％７ガロースグル上で分析す
る。新しく形成てれた連結断片の制限パターン・及び予
想ちれる大きさから、このプラスミドが同一であり、そ
してＢａ１Ｉ−Ｐｖυ■断片を除きｐＢＲ３２２のすべ
てを含有することが示される。これらのプラスミドはＢ
ａ１Ｉ制限部位を喪失しており、そしてｐＢＲ３２２Δ
Ｂａ１ｌと称する。
ング ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５，ＰＨＯ３（第１図参照）は
、制御された酵母酸性ホスファターゼ遺伝子及び構成的
酵母酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５及びＰＨＯ３
）を有する酵母５．　Ｉ　Ｒａｍ　Ｈ１挿入部を含有す
る、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５５９５Ｂ２０７／Ｐ）Ｉ
Ｏ５，ＰＨＯ３、及びグラスミドｐ　ＢＨ３２２ΔＢａ
１ｌ　を、制限エンドヌクレアーぜＢａｍ　Ｈｌにより
消化する。完全消化の後、酵素を６５℃にて２分間不活
性化する。両ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして
それぞれ０．２　箒セの濃度になるように１０　＋ｎＭ
　Ｔｒｉ　ｓ　−１１ＣＬ、　ｐｔ（８，０に再懸濁す
る。それぞれ０．５μｓの２種類のＲａｍ　Ｈ１消化Ｄ
ＮＡを一緒にし、そして３００ＵのＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを含有する連結緩衝液２０μｌ中でにューイングラン
ドビオラブスにより示唆されるようにして）１５℃にて
２０分間連結する。連結混合物の５μノのアリコートを
、５０μｌのカルシウム処理Ｅ、コリ細胞に加え、そし
て例４ａに記載されている方法により形質転換を行う。
形質転換されたＥ、コリ細胞を、アンピシリン及びテト
ラサイクリンに対するそれらの耐性について試験する。
８個のｌＬｍｐＢｎ　ｔｓｔ’コロニーを分離し、そし
て１００μｇ、／ｍｌのアンピシリンを含有する１００
μｌのＬＢ培地中で増殖せしめる。細胞からグラスミド
ＤＮＡ分離する（例２を参照のこと）。Ｂａｍ　Ｈｌを
用いる制限消化により、４種のグラスミドが３．７ｋｂ
ベクタ一断片（ｐＢＲ３２２Δａａ１１）のほかに５、
１　ｋｂ挿入部を含有することが示される。５ａｌｌに
ューイングランドビオラブス）を用いる制限消化により
、挿入された５、　１　ｋｂ断片の方向付けが決定され
る。２個のグラスミドが第４図に示すよう建方向付けら
れた挿入部を有する。その内の１（第５図） ａ）　　７°ラスミドｐ３０中のｇｃｏ　Ｒ１制限部位
の除去 ５μｓのｐ　３０　ＤＮＡ　（例４参照のこと）を、制
限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１（ベーリンが−）に
より完全消化する。生成した接着末端を満たす（ｆｉｌ
ｌ　ｉｎ）ために、Ｅｅｏ　ＲＩで消化された１ｐｇの
ｐ３０を、５０１１１の５０　ｍＭ　Ｎ５Ｃ１，１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、　ｐＨ７，５１１０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．　１ｍＭ　ＤＴＴ。
０、２５　ｍＭ　ｄＡＴＰ及び０．２５　ｍＭ　ｄＴＴ
Ｐ溶液中で、ＩＵのＤＮＡポリメラーゼ（ｋｌａｎｏｗ
大断片、ＢＲＬ）と共に３７０にて３０分間インキュベ
ートする。エタノール沈澱から回収したＤＮＡを常法に
従って連結し、そしてこれを用いて、例４に記載したよ
うにしてコンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞を形質転
換する。Ｅｃｏ　Ｒ１消化に耐性の′クローンをｐ　３
０　（Ｆ、ｃｏ　ＲＩＲ）と称する。
ｂ）　　０．３７　ｋｂ　Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｓｔｌ　Ｐ
ＨＯ５転写停止断片の分離 ＰＨＯ５転写部はＳ１ヌクレアーゼマツピング（２５）
により地図が作成されている。転写停止用シグナルはＰ
ｉ（０５遺伝子の０．３７　ｋｂ　Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｇ
ｔｌ断片中に位置することが示されている。５ａｕ３Ａ
−ＰｓｔＩ断片のヌクレオチド配列を第６図に示す。
５μｙのｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５、ＰＨＯ３ＤＮＡ　
（例２を参照のこと）を制限エンドヌクレアーゼＳａｕ
　３Ａ　及ヒＰｓｔ！　により完全消化する。制限断片
をＴＢｇ緩衝液中１．５チ低融アガロースダル上で分離
する。
０．３７　ｋｂ　Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｓｔｌ　　断片をエ
チノウムブａミド染色により位置決定し、そしてこのＤ
ＮＡ断片を含有するできるだけ小さいグルブロックを切
り取る。
ｅ）　　Ｍｌ　３　ｍｐ　９へのＳａｕ　３Ａ−Ｐｓｔ
ｌ断片のクローニング Ｍ１３ｒｎｐ９　ファージ１）ＮＡは、一群のユニーク
制限部位を有する有用なりローニングベクターである（
２３）。５４のＭｌ　３　ｍｐ　９　ＤＮＡを制限エン
ドヌクレアーゼＲａｍ　ＦＩＩ及びＰａｔｒ　を用いて
完全消化する。大７．１ｋｂ断片を、０．８％低融アが
ロースケ゛ル上で、非常に小さい（８ｂｐ）断片から分
離する。
大ＤＮＡ断片を含有するグルブロックをグルから切り取
る、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５５９５Ｂ２０７／ＰＩ（
０５、Ｐｉ（０３の０．３７　ｋｂＳａｕ　３Ａ−Ｐｓ
ｔｌ断片（例５ｂを参照のこと）及びＭ１３ｍｐ９０７
．２−ｋｂ　　Ｂａｍ　Ｈｌ−Ｐｓｔｌ　Ｉｆｒ片を６
５℃にて液化し、およそ等モル蓄ずつ混合し、そしてＲ
２０で稀釈してアがロース濃度を０．３％に低下せしめ
る。６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐｔ１７．５　、１
０　ｍＭｌｖ！ｇＣＬ２．１０　ｍＭ、ＤＴＴ、　１　
ｍＭ　ＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮＡりが−ゼ（ビオ
ラプス）を含有する溶液２００１ｔｌ中で連結を行う。
ニューイングランドビオラシスてより発表されたマニュ
アル「Ｍ１３ｃｌｏｎｊｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　５ｅｑ
ｕ＠ｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍＪに従って、Ｅ、コリＪ
ＭＩＯＩ（Ｃａ　）株のコンピテント細胞のトランスグ
クションを行う。多数の白色ノラークからのファージを
増殖せしめ、そして制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ１及びＰｓ　ｔ
ｌ　を用いる切断によりこれらのＤＮＡ挿入部のサイズ
について分析する。
Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｓｔｌ　ＰＨＯ５転写停転写停止音有
するＭ１３ｍｐ９由来クローンを分離し、そしてＭ１３
ｍｐ　９／ＰＨＯ５（８ａｕ　３Ａ−Ｐａｔｈ）と称す
る。
ｄ）　　ｐ３０（ＥｃｏＲＪＲ）　ヘのＰＩ（０５転写
停止断片のクローニング ファージＭ１３ｍｐ９（Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨＯ５（Ｓａ
ｕａＡ−ＰｓｔＩ）Ｅ中にクローニングされているもと
のＰｆ（０５転写停止断片をＨａ４１ｉ１−山ｎｄｆｆ
ｌ断片として、Ｂａ１ｌ及びＨｉｎｄｌ［［で切断され
たグラスミドｐ３０（ＩｃｏＲＩ　）に再クローニング
する。Ｍ１３ｍｐ９／ＰＨＯ５（ＳａｕａＡ−Ｐａｔｈ
）ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨａｅＩ［［及びＨ
ｉｎｄｌｌ［Ｋより完全消化する。生成する２つのＤＮ
Ａ断片を、ＴＨＥ緩衝液中１．５％垂垂直低融アガロー
スシル中分離する。グルから切り取ったｒルブロック中
の０３９ｋｂ断片を分離する。ｐ３０（ｇｃｏＲＩ　）
ＤＮＡをＢａ１ｌ及びＩ（ｊｎｄｌｌｌにより消化する
。大３．９８ｋｂ断片をＴａｇ緩衝液中０．８％低融ア
がロースダル上で分離し、そしてＤＮＡ断片を含有する
ｒルブロックを切り取ることにより分離する。
０、３９　ｋｂ　ＨａｓｌＵ−）（ｉｎｄｎｌ　ＰＩ（
０５転写停止断片を有するｒシブ０フり、及びｐ３０（
ＥｃｏＲ）　）の３．９８る。連結及びコンピテントＥ
、コリｆ（ＢＩＯＩ細胞の形質転換は例４に記載されて
いるようにして行う。
形質転換された細胞のＤＮＡを分析し、そしてｐ３１と
称する（第５図を参照のこと）。
発現グラスミドｐ３１は、Ｐｌ（０５のシグナル配列の
部分を伴うＰＨＯ５プロモーター領域、及びそれに隣接
するＰｆ（０５転写停止シグナルを有するＤＮＡ断片を
含有する。このベクター中で発現されるべき外来性コー
ド配列は、ブロモ−ターと転写停止配列との間に便利に
挿入することができる。
発現グラスミドｐ３１は、ｍＲＮＡ出発部位を含むＰＨ
Ｏ５ｙ°ロモーター配列、酸性ホスファターゼの翻訳開
始コド７　ＡＴＧ及び酸性ホスファターゼシグナル配列
の部分をコードする４０個の追加のヌクレオチドを含有
する。この造成においては、シグナル配列のためのヌク
レオチド及びＡＴＧをＢａ１３１消化により除去する。
ＰＨＯ５〕ａモーターと成熟ＴＰＡコード配列との連絡
を可能にするためにＥｃｏ　Ｒ１リンカ−を導入する。
ａ）　　Ｂａ１ｌ切断ノラスミドｐ３０のＢａ１３１消
化２０μＩのｐ３０ＤＮＡ　（例４ｂを参照のこと）を
制限エンドヌクレアーゼＢａ１ｌで消化し、３．７ｋｂ
及び５．１ｋｂの２断片を生成せしめる。フェノール／
クロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈澱
せしめる。ＤＮＡ挿入部−１０ｍＭ　Ｔｒｉｍ　ｐｌ（
８，０に・０．５μｇ・肩の濃度で再懸濁する。９μｓ
のＢａ１ｌ切断ｐ　３０ＤＮＡを２Ｕのエキソヌクレア
ーゼＢａ１３１（ｓａＬ）により、１００μＪの２０ｍ
１ＶｉＴｒｉｓ　ｐＨ８，０。
１９９　ｍＭ　ＮａＣ１，１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　１
２ｍＭＣａＣｔ２及び１　ｍＭ　ｇＤＴＡ　の溶液中で
消化する。３０Ｃにてインキュベートしながら１５秒、
３０秒、４５秒及び６０秒後に２μｇずつのＤＮＡを取
り出し、そしてすぐに５０μｌのフェノール及び６０μ
ｌのＴＨＥと混合する。フェノール／クロロホルムで抽
出シ、そしてエタノールで沈澱せしめた後、ＤＮＡを１
０−のＴｒ１８ｐＨ８，０に１００ｔｔｆｉ１ｍｌの濃
度で再懸濁スル。Ｂａ１１３によるエキソヌクレアーゼ
切断の程度を分析するため、各時点でのＤＮＡ　０．５
μ９をエンドヌクレアーゼＲａｍ　Ｈｌで消化し、そし
て７．ｒｉｓ−ボレート緩衝液Ｐｌ（ｓ−３中１．５チ
アがロースダル上で分析する。４５秒後の断片の各末端
から平均’ｙｏｂｐが除去される。さらに実験するため
に４５秒時点でのＤＮＡを使用する。
ｂ）　　Ｂａｌ　３１処理ＤＮＡへのＥｃｏ　Ｒ１リン
カ−の付加 ２人２６０ユニツトのＥｃｏ　Ｒ１リンカ−（５’−Ｇ
ＧＡＡＴＴＣＣ−３’、、　　ＢＲＩ、）を２５０μノ
の１０　ｍＭ　ＴｒｉｓＰＨ８、１ｍＭ　ＥＤＴ４　溶
液に再Ｍ濁する。２ｐｉのＥａｏ　Ｒ１リンカ−を７ｚ
ｔｔｌの６０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＨ７，５。
１０ｒｒＭＭｇＣ１２，１５ｍＭＤＤＴ　、　１０／ｊ
ＭＡＴＰ及び３３ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
ヘ−リンが−）の溶液中でキナーゼ処理する。３７℃に
て１時間置いた後、室温に放冷し、そして−２０℃にて
貯蔵する。
アニールした二重鎖Ｅｃｏ　Ｒ１！Ｊンカーをその平滑
末端によりＢａ１３１処理ＤＮＡ断片に連結する。
０．５μｇのＢａ１３１処理ＤＮＡ　（例６ａを参照の
こと）を、室温にて１６時間、５０倍過剰のキナーゼ処
理Ｅｃｏ　ＲＩ　リンカ−と共に、２０ｘｌの６０　ｍ
ＭＴｒｉｍ　ｐＨ７，５、１０ｍＭＭｇｅｔ２．　１０
ｍＭ　ＤＴＴ。
４　ｍＭ　ＡＴＰ及び６００ＵのＴ４ＤＮＡすが一ゼ（
ビオラプス）の溶液中でインキュベートする。Ｔ４ＤＮ
Ａ　リｉｆ−ゼを不活性化（６５℃にて１０分間）した
後、過剰のｇｃｏ　Ｒ１！ｊンカーを５０μノの容量中
５００のＥｃｏ　Ｒ１（ペーりンが−）により切断スル
。ＤＮＡ　ラフエノール／クロロホルムにより抽出し、
エタノールで沈澱せしめ、そして１０ｍＭのＴｒｉｓ、
　１　ｍＦｉ！　ＥＤＴＡ溶液に再懸濁する。
制限エンドヌクレアーゼＩｉ：ｃｏ　ＲＩは両Ｂａ１ｌ
断片（３，７ｋｂｌび５．１ｋｂ）の末端に付加された
Ｅｅｏ　Ｒ１リンカ−６のみならず５．１ｋｂ断片中の
内部Ｅｅｏ　Ｒ１部位をも切断し、３．９ｋｂ及び１．
２ｋｂ断片を生じさせる。３．７ｋｂ断片及び３．９ｋ
ｂ断片を、９０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＬ　ｐＨ８，３
、、９０ｍＭ１．１１Ｍ酸及び２，５ｍＭ　ＥＤＴＡの
溶液中０．８％低融アがロースグル（シグマ）上で、１
．２ｋｂ断片から分離する。ＤＮＡ−Ｊンドをエチジウ
ムプロミドで染色し、そして３６６ｎｍの長波長ＵＶ光
のもとで可視化する。３．７ｋｂ及び３．９　ｋｂの２
種類の大ＤＮＡ断片は分離しない。これらは１つのｒル
ブロックとしてグルから切り出し、そして例４．１Ｌに
記載したようにして抽、出する。
Ｅｃｏ　ＲＩ接着末端において終る線状断片を連結によ
り環化する。約０．２５μｙの断片を１００μｌの６０
ｍＭ　Ｔｒｌｓ　ｐ＆（７，５、１０ｍＭ　ＭｇＣ６２
，１０ｒｒＬＭＤＤＴ、　　１　ｍＭＡＴＰ及び６００
ＵのＴ４ＤＮＡりが−ゼの溶液中１５℃にて４時間連結
する。
連結混合物の１０μｌのアリコートをｌＯＯμｌのカル
シウム処理形質転換コンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ細
胞に加える（例４ａを参照のこと）。
３５個の形質転換されたａｍｐ　Ｒコロニーを、１００
μｇ、４ｎｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で別
別に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｇ等
（２６）の方法により調製し、そしてＥＣａ　Ｒ１／Ｂ
ａｍＨに重油化により分析する。
個々のＤＮＡ分子のＢａ１３１消化の程度に依存して、
３５個のクローンのほとんどが、！ブロモ−ター領域中
でのＦ、ｃｏ　Ｒ１！Ｊンカーの付加の位置を相互に異
にする。ヌクレオチド配列分析のため、プラスミドＤＮ
ＡをＥａｏ　Ｒ１で消化する。
フェノール／クロロホルムで抽出した後、制限処理され
たＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。
ＤＮＡを脱燐酸化し、そして５′−末端をラベルする。
ラベルされたＤＮＡ断片を第二〇制限エンドヌクレアー
ゼＢａｍ　Ｈ（で切断する。生成物を８．０チ低融アが
ロースダル上で分離する。０．５〜０．６　ｋｂ）５’
゛ラベルＥｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍ　Ｈ１断片を、例４ａに
記載したようにして低融アがロースから分離する。
Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−に隣接するヌクレオチド配列を決
定するため（、で、種々のＤＮＡ断片を化学的に分解し
、そして生成物をＭａｘａｍ及びＧｉ’１ｂｅｒｔ（１
０）により記載されるようにしてポリアクリルアミドダ
ル電気泳動により分離する。
種々のクローン、及びＰＨＯ５配列の゛対応する最終ヌ
クレオチド（次にＥｃｏ　Ｒ１！Ｊンカーが存在する）
の位置を第１表に示す（さらに、第８図を参照のこと）
。
以下余白 第１表 ｐＥ　　　　　　　　　＋２５ ｐＧ　　　　　　　　　＋１６ ｐｅ　　　　　　　　　＋１．５ Ｐｄ　　　　　　　　　　　＋１２ ｐｙ　　　　　　　　　−４ ｐＲ−１０ ｐＰ　　　　　　　　　−１６’ ｐＶ　　　　　　　　　−１８、 Ｌ−２１ ｐＮ　　　　　　　　　−２２ ｐｃ　　　　　　　　　−２４ ｐＨ−，２７ ｐｓ　　　　　　　　　−２８ ｐｋ　　　　　　　　　−，２９ ｐｌ　　　　　　　　　−３８ ｐＭ　　　　　　　　　−５０ ｐｏ　　　　　　　　　−５３ ｐＦ’　　　　　　　　　−５９ ｐｍ　　　　　　　　　−６７ ｐＫ　　　　　　　　　−７３ ｐｉ　　　　　　　　　−８１ ｐｈ　　　　　　　　　−１３７ ｄ）月煕頃Ｒｆロモーターを含有する０、５３ｋｂプ、
ラスミドｐＲは５３４　ｂｐ　ＢａｒｎＨＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片上ＫＰＨＯ５Ｒプロモーターを含有する。第３ａ
図の番号に従えば、この断片はヌクレオチド−５４１（
ＢａｍＨ１部位）からヌクレオチド−１０までのμ（０
５ｆロモーター配列を力・々−する。ヌクレオチド−１
０に連結されたＥｃｏＲＩリンカ−（例６ｂを参照のこ
と）はＥｃｏＲＩ切断後に２個のＧ残基をもたらす。
プラスミドｐＲを制限エンドヌクレ７−セこＢａｍＨＩ
及びＦ：ＪｃｏＲＩにより消化する。０．５３　ｋｂＢ
ａｍＨｌ−ＢｃｏＲ１断片を０．８％低融アガロースゲ
ル上で分離し、そして例４ａに記載したようにして単離
する。
ヌクレオチド配列を第９図に示す。
同様にしてプラスミドｐｙを消化し、そして甜隻河Ｙプ
ロモーターを含有する０、５３　ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈｌ−
ＥｃｏＲｌ　断片を分離する。ヌクレオチド配列を第１
０図に示す。
以下余白 ｅ）新構成物のＳａｌ　１−ＥｅｏＲＩ断片によるプラ
ス５μｇのプラスミドｐ３１（例５ｄ参照のこと）を制
限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩにより消化する。
制限酵素処理されたＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、
そして５０μノの１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｐＨ７，
８，５０ｍＭ　ＮａＣ２％　５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２の溶
液中に再懸濁する。
ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより完全消化する。制限断片をＴ
ｒｉｍ−ｙｌ＃レート−ＢＤＴＡ緩衝液ｐＨ８，３中０
．８チ低融アガロースダル上で分離する。３．５　ｋｂ
　ＤＮＡ断片を、ＤＮＡバンドを含有する／Ｊ％グルブ
ロックとして−分離する。
５μｇずつのクローンｐＲ及びｐＹ　（第１表及び第８
図を参照のこと）を上記と同様にして５ａｉｌ及びＥｃ
ｏＲＩにより消化する。０．８　ｋｂ　ＤＮＡ断片を低
融アガロースグルの小ブロックとして分離する。
ベクターｐ３１の３．５ｋｂＳａ目−ＥｃｏＲＩ断片０
．６７μｇを、プラスミドｐＲ又はｐｙの０．８　ｋｂ
　Ｓａｌ　ｌ−Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片０．３４μｇのそ
れぞれに連結する。ＤＮＡ断片を含有する適尚なグルブ
ロックを混合し、そして６５℃にて溶融する。液化した
グルを３倍に稀釈する。全容２４０　ｔＮＪの６１３　
ｒｒｕＭ　Ｔｒｉｓｐ）（７，５゜１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
２．１０　ｍＭＤＴＴ　、　１　ｍＭＡＴＰ及び７４０
Ｕ）Ｔ４ＤＮＡ　　Ｉ）ｉｆ−４”（ヒ第５）ｙ、　）
中で、１５℃にて・−夜連結を行う。各連結混合物の２
μノのアリコートを１００μノのカルシウム処理形質転
換コンビテントＥ、コリＩ（Ｂ１．０１細胞（例４ａを
参照のこと）に加える。
８個の形質転換されたａｍｐＲコロニーのそれぞれを、
１００μｍ１／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ暗培
養中別々に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを制限分析
により分析する。各群のコロニーは同一である。
１個ずつのクローンをそれぞれｐ３１Ｒ又はｐ３１Ｙと
称し、さらに使用する（第７図）。
例７．　　ＴＰＡ遺伝子の調製 ａ、　　ｍＲＮＡの調製 ファルコン（ＦａＩｃｏｎ）細胞培養フラスコ（１７５
ｃｒｎ２）に、２５−の５チのウシ胎児血清を補充した
ドウブレコ変形イーグル培地（ＤＭＥ　）中１０×１０
６個のＨｅｌａ細胞の一次液”種物を接種する。コンフ
ルエンスに達するまで培地を３日に１回取り替える。
コンフルエント単層培養物をＰＢＳ　（燐酸緩衝化塩溶
液：１１中８０ｐＮａＣＡ、２．９ＫＣ１，１４，４９
Ｎａ２ＨＰＯ４，及び２　ｇＩＧＩ、ＰＯ４）で２回洗
浄し、そして次に１００ｎＶｍｔのＴＰＡを補充したＤ
ＭＥ中で１６時間保持する。（２７）Ｋ記載されている
ように、細胞単層に細胞溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ　ｂｕ
ｆｆｅｒ）を直接適用することにより全ＲＮＡを抽出す
る。ナガミネ等の方法（２８）に従って全ＲＮＡからポ
ＩＪ　（Ａ）−濃縮配列を分離する。
シュークロースグラジェント遠心分離を、ＳＷ〜４１０
−ターを装着したベックマン超遠心分離機中で行う。２
００μノのＨ２０中１００μｌのポリ（Ａ）ＲＮＡを、
０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｐ１４７．４　、０．１
　’％　ＳＤＳ　。
０、　ＯＩ　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．０４　Ｍ　ＮａＣ
４９１５〜３０％シュークロースグラジェントを通して
、、　　３０，０００ｒｐｍにて１２時間１８℃にて遠
心分離する。グラジェントを底部から３６個の画分に分
け、そして０．２ＭへのＮａＣ４及び２．５゛容量のエ
タノールを加えることによ５　ＲＮＡを沈澱せしめる。
−２０℃にて一夜インキーペートした後、遠心分離によ
りＲＮＡを回収し、そして２０μｊの水に溶解する。
ステー・ゾロの卵母細胞を視覚的観察により選択し、変
形パース（Ｂａｒｔｈ）培地に保持し、そして本質上（
２９）に記載されているよ、うにして、シュークロース
グラソエント画分からのｍＲＮＡを注射する。
注射された卵母細胞によるプラスミノーゲンアクチベー
ターの分泌が、ナがミネ等（２８）に記載されている放
射カゼイン分解（ｒａｄｉａｌ　ｃａｓｅｉｎｏｌｙｓ
ｉｓ）により証明される。２１〜２３８画分を注射され
た卵母細胞において最大のＴＰＡ分泌が見られる。
ｂ、　　ｃＤＮＡ合成及び分子クローニングＴＰＡ　ｍ
ＲＮＡについて濃縮したＨｅｌａポリ（Ａ）　ＲＮＡを
ｃＤＮＡにコピーする。８４の５０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　
５−Ｈｃｔ。
ＰＨ８，３、７５ｒｒＭＫＣＬ　、　８ｍＭＭｇｅｔ２
．１　（Ｖ／’１１’）％エタノール、　０．２　ｍＭ
　ＥＰＴＡ　、　２５μｇ肩オリゴｄＴ１２−４ｌｌ　
”０．５ｍＭずつのｄＮＴＰ及び１２／ｊｃｉの〔α　
ｐ〕ｄＣＴＰに−−イングランドニュークレア）を使用
する。
溶液を０℃に冷却し、そして３ｍＭピロ燐酸ナトリウム
、１ｍＭＤＴＴ及び１４４Ｕの逆転写酵素（ライフサイ
エンス社）を加える。３９℃にて６０分装いた後、さら
に３２Ｕの逆転写酵素を加える。
１００分間のインキュベートの後、ＳＤＳを０．２％に
、ＥＤＴＡ　を１５ｍＭに加えることにより反応を止め
る。ｃＤＮＡへの〔α３２ｐ　：］　ａｃＴｐの導入を
、反応混合物のアリコートをトリクロロ酢酸で沈澱せし
めることによって測定する。８μｙのＲＮＡから１１５
μＩのｃＤＮＡが合成される（１４．４％のコピー）。
クロロホルム−インアミルアルコール（２４：ＩＶ／Ｖ
）で２回抽出した後、セファデックスＧ５０のカラム４
−（５Ｘ０．５ｃｒｎ）上、２００　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　
ｓ　・ＨＣｔｐＨ９、１００ｒｒｄＶｉＮａｃＬ　、　
ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で遠心分離することにより、水相
を脱塩する。２０℃にて１２時。問直いた後、ＨＣｌを
０．３Ｎとなるように加え、そして３容量のエタノール
を加えることによυ核酸を沈澱せしめる。２００ｍＭＮ
　’　（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ′−
エタン−２−スルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）、　ｐｉ−１５
，９、３０ｍＭＫＣｔ、　１０ｍＭＤＴＴ　、　１０　
ｍＭＭｇｃｔ２．０．５　ｍＭずつのｄＡＴＰ　、　ｄ
ＣＴＰ　。
ｄＴＴＰ及びｃＤＮＡ　４当り２５ＵのＫｌｅｎｏｗ断
片を含有する２００μｌの溶液中で第２鎖の合成を行う
。
２５℃にて２時間インキュベートした後、ＳＤＳを０．
１チまで加えることにより反応を停止し、そして溶液を
セファデックス０５０のカラム４−上、３０、ｍＭ酢酸
ナトリウム、　ｐＨ４，５、０，２Ｍ　ＮａＣ４，３ｒ
ｎＮＩＺｎ（’ｔ２１　ｏ、　１　％　ＳＤＳ中で遠心
分離することにより脱塩する。２．５　Ｕ／ｍｇのヌク
レアーゼ８１　ヲｙｆ？イドゾリウム、両分に加え、そ
して溶液を３７℃にて３０分間インキ−ベートする。溶
液をフェノール−クロロホルム−インアミルアルコール
（２４：２４：ＩＶ／Ｖ）で抽出し、そして水相中の核
酸を、０．３ＭのＮａＣ６及び３容量のエタノールによ
り沈澱せしめる。第１鎖に導入された〔α　ｐ）ｄｃ’
ｒｐの７６チがＳ１消化の後トリクロロ酢酸により沈澱
し得る状態で残る。そして、アルカリ性アガロースゲル
上での分析（３０）により二重鎖ｃＤＮＡのサイズが５
００〜３０００　ｂｐの範囲にあることが示される。ｄ
ｅｃＤＮＡを、５〜２０％のシ二一クロースグラジェン
ト上、１０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ７，４。
１００　ｍＭＮａｃｔ、　１　ｍＭＥＤＴＡ　、　０．
１％ＳＤＳ中でサイズ画分する。１２℃にて、５Ｗ４１
０−ター中３９Ｋにて１０時間遠心分離した後、最大サ
イズのｃＤＮＡを含有する画分（全サンプルの４３％）
をプールし、そして０．３ＭのＮａＣｔ、　５１１９／
ｍｌのＢＳＡ及び３容量のエタノールを加えることによ
って沈澱を行う。２５　ｎｇのサイズ画分したｃ　ＤＮ
Ａに、４５０Ｖ−のターミナルトランスフェラーゼ、０
．１Ｍカコジル酸カリウム、Ｐｌ″＋７．５，２ＩＴＩ
ＭＣｏＣｔ２，１ｉＤＴＡ。
０．１蔵ＤＴＴ及び５μＭ〔α”ｐ　）　ｄＣＴＰ　（
２０μＣｉ）を含有する反応溶液８５μｌ中で、（３１
）に記載されているようにしてｄＣにより尾部形成（ｔ
ａｉｌｉｎｇ）する。３０℃にて３分間の後、ＥＤＴＡ
を１０ｍＭに、ｇＤｓ　ヲ０．２　（ｗ／Ｖ）　％に、
及びｔ　ＲＮＡを１００１ｔ９／ｍｌに添加することに
より反応を停止する。溶液をクロロホルム−イソアミル
アルコールで２回抽出し、そしてセファデックスＧ５０
のカラム５Ｗｄ！、上、２０　ｍＭＴｒｌｓ−Ｈｃｔ、
ｐＨ９、１００ｍＭＮａｃｔ、　１ｍＭＥＤＴＡ中で脱
塩する。？イドゾリウム画分をプールし、そして０．３
ＭのＮａＣｔ、　２５μｇ肩のｔＲＮＡ及び３容量のエ
タノールを加えて核酸を沈澱せしめる。２０ｎ、ｊ９の
尾部形成（ｔａｉｌ）　したｄｓｃＤＮＡを、Ｐ＋ｔ１
部位（３２）にｄ９により尾部形成した６　０　ｎｇの
ｐＢＲ３２２に、２０　ｔｉｌｌの０．４Ｍ　ＮａＣＬ
、　１０　ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　・ＨＣＬ、　ｐＨ７，５
、１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液中で、６５℃にて１０分間、
４５℃にて２時間、２２℃にて２時間アニールし、そし
て次に徐々に４℃に冷却し一夜おく。アニールしたｃＤ
ＮＡを０℃にてコンピテント旦夕１７　ＨＢ　１０１／
ＬＭＩ　Ｏ３５（３３）の懸濁液１００μノと混合する
。
０℃にて１５分間及び３７℃にて５分間インキエベート
した後、細菌懸濁液に１．９−のＬＢを加え、そして３
７℃にて２時間インキーペーションを継続する。細胞を
、１０μＩ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ寒
天プレート上にプレートする。１００形質転換体／ｎＪ
ベクターが、１３％の再アニールベクターのパックグラ
ウンド頻度を伴って得られる。分離されたコロニーから
５４００の形質転換体をつまようじで取シ上げ、２００
μｌのＬＢ及び１０μ９７ｍｅのテトラサイクリンを収
容する９６ウエルミクロタイタープレート中に入れ、３
７℃にて一夜増殖せしめ、そしてグリセリンを５　（Ｖ
／Ｖ　）　’Ｉ）になるように加えた後−８０℃にて凍
結貯蔵する。
ｃ　、　　ＴＰＡ　ＤＮＡ配列のスクリーニングヒト組
織プラスミノーダンテクチペーターｃＤＮＡ（３４）の
配列： ｄ５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡ＾
Ｇ−３′　　及びｄ　５’−ＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＴ
ＣＡＧＧＣＣＧＣＡＧ−３’を有する２種類の合成オリ
ゴヌクレオチドをトリニスチル法変法（３５）により合
成し、逆相ＨＰＬＣ。
及び調製用ポリアクリルアミド電気泳動により精製する
。オリゴヌクレオチドを、Ｔ４キナーゼを用いて５′末
端において〔α”Ｐ　）　ＡＴＰによ”シ、１ｘ１０６
ｃｐｍ　（ｆエレンコツ）７９モルの比活性１１ｃ　ラ
ベルする（１０）。
ミクロタイタープレートを解凍し、形質転裸体培養物を
６×８の配列で８２ｍｍのミリポアＨＡＴＦニトロセル
ロースフィルターに移し、１０μｍ／／ｄのテトラサイ
クリンを含有するＬＢ寒天プレート上で１８時間増殖せ
しめ、そしてプラスミドを１０μｍ１／ｌｎｔのテトラ
サイクリン及び１０μ９肩のクロラムフェニコールを含
有、するＬＢ寒天プレート上で１２時時間幅する。各フ
ィルターを、１０％　８Ｄ８で飽和したワットマン３Ｍ
紙上に３分間；０、５Ｍ　ＮａＯＨ、１，５Ｍ　ＮａＣ
ｔで飽和したものに５分間；　０．５Ｍ　Ｔｒｉ８・Ｈ
ＣＬ　、　ｐｉ（８、１，５Ｍ　ＮａＣ１を飽和したも
のに５分間；そじて２Ｘ　５ＳＰＥ　（５ＳＰＥ　：　
０．１５ＭＮａＣＬ、　１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ
７，４、１ｍＭＥＤＴＡ）を飽和したものに５分間のせ
ることにより、ＤＮＡをフィルーーに固定する（４２）
。
フィルターを空気乾燥し、そして真空中８０℃にて２時
間加熱処理（ｂａｋｅ）する。加熱処理されたフ４）し
９　−　　Ｅ　　　５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐ）１
７．５゜１０　ｍＭＥＤＴＡ　、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔ、
　ｌ　％　８ＤＳを含む溶液中で洗浄して付着した細菌
片を除去する。Ｗａｌｌｉｃｅ等により記載された方法
（１９８１）により、ヌクレオチドの長さ、Ｇ＋Ｃ含量
、及び８ｕｇｇａ等（４５）及びＳｍ１ｔｈ（４６）に
より決定されているＴｍの実験的関係を用いてバイブリ
ド形成及び洗浄を行う。
フィルターを、１．６ａｇ／フィルターの９００ｍＭＮ
ａＣｔ、　６０　ｍＭＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７，４、７
，２ｍＭ　ｇＤＴＡ（６Ｘ　５ＳＰＥ　）　、　０．１
　（ｗ／Ｖ）ＳずツノＢＳＡＳ／リピニルピロリドン、
フィコール４００（５Ｘ　　ポンハート溶液）、２００
　ｐｇ／＊　ｔｉｍａ及’ｕ　０．１　（Ｗ／Ｖ）　％
ＳＤ８の溶液中で前バイブリド形成（２時間）及びバイ
ブリド形成（１２時間）する。０．３ｐモ〜匂の両５２
ｐ−ラベルオリゴヌクレオチドの混合物を前ハイブリ針
形酸溶液に加える。バイブリド形成に続き、フィルター
を、６ＸＳＳＣ（Ｓａｃ　：　０．１５　ｍＭ’ｐｉ＠
（：ｌ　、　ｌ　５　ｍＭクエン酸三ナトリウム）中４
℃にて３×１０分２間、及び６０℃にて３×１０分間バ
イブリド形成する。乾燥したフィルターをデーポン強化
スクリーンを用いてコダックＸＢＳＸ線フィルムに一７
０℃にて３６時間暴露する。陽性のバイブリド形成シグ
ナルを生じさせるミクロタイターウェルを同定し、そし
てこれらの培養物からの単一コロニーを、上記のようＫ
して、２枚ずつフィルターを各プロ−ブに別々にバイブ
リド形成し、そしてバイブリド形成のために６３℃の温
度を用い、そしてフィルターを洗浄することにより再ス
クリーニングする。両方のプローグに陽性のシグナルを
示すコロニーをマスターフィルターから拾い上げ、そし
て１０μＶｍｔのテトラサイクリンを含有するＬＢ中３
７℃にて一夜増殖せしめる。これらのコロニーの１つを
ｐＷ３４９Ｆと称する。アルカリ溶解法変法（３６）を
用い次にＣ５ＣＬ平衡遠心分離を行うことによりプラス
ミド標品を得る。
グラスミドｐＷ３４９ＦのＤＮＡを、制限エンドヌクレ
アーゼＰａｔｌ及びＢｇｌＩ［で消化することにより分
析する。制限断片は予想されるサイズを有する。従って
、プラスミドｐＷ３４９Ｆ（７，１ｋｂ）はヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターの完全な構造遺伝子を含
有すると結論される。
ｄ　、　　ＴＰＡ　ｅＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（第
１１図を参照のとと） ＭａｘａｍＡび。１ｌｂｅｒｔ（ｉり方よ（□Ｏ）＆び
Ｓａｕｇｅ、。　　　　　　　　　゛方法（５３）の組
合わせを使用することによって、ＴＰＡ　ｅ　ＤＮＡク
ローンを配列決定する。第１１−１〜ｊｌ−４図に結果
を示す。この配列データーをＰｅｎｎｋａｃ等（７）に
より発表された配列データーと比較した場合、ヌクレオ
チド１１３位に存在する１個の変化のみが観察され、Ｔ
ＰＡのグレー配列のアミノ酸のサイレント位置（ＣＴＧ
→ＣＴＡ　）に変化が生ずる。
Ｐ）ＩＯ５プロモーター及びＰＨＯ５シグナル配列を成
熟ＴＰＡのコード配列にフレームが整合するように連結
する。さらに、ｐｕｏｓ転写停止シグナルを構成物中に
含める。
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１及びＳａｌ　Ｉ　（
イずれもビオラプス製）を用いて供給者に゛よって示さ
れた条件下で２μｇのｐ　ＢＲ３２２／　ＰＨＯ５Ｂａ
ｍ−Ｓａ　１（第１図）を切断することにより、匹四プ
ロモーターを含む６２３　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−８ａｌ　
ｌ断片（例３ｍ。
第３ａ図）を得る。単鎖ファーノベクターＭ１３ｍｐ９
（２３）の複製型（ＲＦ）２μｇを同じ酵素で消化する
。両ＤＮＡ標品を、例５に記載したようにして０．６％
軟寒天グルに負荷する。ｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ
−８ａｌ　由来の６２３ｂｐ断片及びＭ１３ｍｐ９由来
の７．２　ｋｂバンドを例５Ｃに記載したようにして抽
出する。１５０’　ｎ９の６２３　ｂｐ断片及び１５０
　ｎ９の７．２　ｋｂ　Ｍ　１３　ｍｐ９．ＤＮＡ断片
を、２００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）を用
いて１５℃にて４時間、６０　ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｔ、
　ｐＨ７，５、１０ｍＭＭｇＣＬ２．１０　ｍＭ　ＤＴ
Ｔ及び１ｍＭＡＴＰ中で連結する。
Ｍｅｉｓｉｇ（２３）により記載されているようにして
Ｅ、＝ｒ　９　ＪＭｌ　０１株を形質転換し、そして１
２個の白色ゾラークを拾い上げ、そしてＲＦプラスミド
の制限分析（３８）により分析する。分析したクローン
のすべてが、Ｍ　１３ｍｐ　９のＢａｍ−８ｍ１部位に
挿入された６２３ｂｐ断片を含有する。１つの分離体を
選択し、そしてＭ　１３　ｍｐ９／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｓ
ａｌと称する（第１２図参照のこと）。
以下余白 ｂ）　　ｐｕｏｇシグナル配列へのＴＰＡ蛋白質コード
配列の連結 ２μｇのプラスミドＩ）Ｗ３４９Ｆ（例７を参照のこト
）ヲＢｇｌｎエンドヌクレアーゼにューイングランドビ
オラブス）を用いて供給者によって示された条件下で消
化する。ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして６　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＬ　、　ｐＨ７，５、５０ｍＭＮ
ａＣｌ　、　６　’ｍＭＭｇＣ！２中に再懸濁する。Ｄ
ＮＡの３′窪み末端を旦、＋　ＩＪ　ＤＮＡポリメラー
ゼのＫｌｅｎｏｗ断片を用いて満たす。この反応は、全
容５０μｌ中２Ｕの酵素を用いて８０μＭのｄＡＴＰ　
、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの存在下、３
７℃にて３０分間行う。インキーペー°ジョンをフェノ
ール抽出によって停止し、そしてＤＮＡをエタノールに
より沈澱せしめる。
２μｇのＲＦプラスミドＭ　１３　ｍｐ　９７　ＰＨＯ
５Ｂａｍ　−８ａｌを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎｌ
（バイオラプス）により供給者の丞相に従って消化する
。ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして１０μノの
２００ｍＭＮａＣＡ　、　１　ｍＭＺｎｓＯ４及び６０
ｍＭ酢酸ナトリウム２４．６の溶液中に再懸濁する。Ｉ
Ｕ（７）Ｓエキソヌフレアーゼを加え、そして混合物を
３７℃にて６０分間インキュベートする。フェノール抽
出により反応を停止し、Ｄ′ＮＡをエタノールで沈澱せ
しめ、そして５０μｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐ
Ｈ７，５。
１ｒＩＩＭＭｇＣ２２・の溶液に再懸濁する。ＩＯＵの
ウシ腸アルカリホスファターゼ（ペーリンガー）を加え
、そして混合物を３７℃にて６０分間、次に６５℃にて
６０分間インキュベートする。ＤＮＡをＤＥ５２（ワッ
トマン）イオン交換クロマトグラフィー（例９Ａａを参
照のこと）により精製し、そして次にエタノールによ）
再沈澱せしめる。
Ｂｇｌｌｌで消化しＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで
処理したプラスミドｐＷ３４９Ｆ（上記）１．５μｇを
、Ｋｐｎｌで切断しＳ１消化しそしてホスファターゼ処
理したＭｌ　３ｍｐ９／ＰＨＯ５Ｂａｍ−８ａｔ　Ｏ，
５ｔｔ９に、１０１ｔｌ（Ｄ容量ニオイテ、９００　Ｕ
）Ｔ４　ＤＮＡＩＪ　カーゼを用いて上記の緩衝液中で
連結する。但し、４ｍＭのＡＴＰを使用し、そしてイン
キーペーションは室温にて１８時間行う。旦己専ＪＭＩ
ＯＩ細胞を形質転換し、６個の白色グラークを選択し、
そして単鎖ファージ鋳型を（３８）に記載されているよ
うにして調製する。２．　Ｏｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ断片と
Ｍ１３ｍｐ９ベクターとの間の連結部のＤＮＡ配列決定
を、ジデオキシチェインターミネーション法（３９）を
用いて行う。次のオリゴデオキシヌクレオチドゾライマ
ーを使用する。
５’　ＡＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣ３’７ｉ
　Ｉ）　ｆデオキシヌクレオチドはホスホトリエステル
法（４０，’４１）により合成する。このものはＰＨＯ
５ゾ四モーター内でバイブリド形成し、そして４３ユＤ
ＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片による目的のＤＮ
Ａ連結点にわたる延長を可能にする。次のＤＮＡ配列配
置（月熟臣蛋白質コード配列のＡＴＧから出発する）： μ匹曵蛋白質コード配列 −−−−−−−−ＴＰＡ　　蛋白質コード配列を有する
１つの正しい分離体を得る。
この構成物をＭ　１３　ｍｐ　９／ＰＨＯ５−ＴＰＡ　
（第１２図）と称する。
１０μ９のｐ３１ＲｆｙスミドＤＮＡ　（第７図参照の
こと）を制限酵素ＳｍＩＬｌで消化し、ＤＮＡをフェノ
ールで抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。
ＤＮＡを１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐｆｉ
８．０　、中にｏ、ｓ　ｒｒｖ’ｍｔ。
の濃度に再懸濁する。Ｓｍａ　Ｉで、切断したＤＮＡ１
０μｓを２ＵのエンドヌクレアーゼＢａｌ　３１（ＢＲ
Ｌ）により１．１００μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ　＋ｐＨ
８，０、１００ｍＭＮａｃ／Ｓ　、　１２ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１２ｍＭ　ＣａＣｌ２及び１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶
液中で消化する。
３μｇずつのＤＮＡのアリコートを、３０℃にてインキ
ュベート中９０秒、１２０秒及び１５０秒後に取り出し
、そしてすぐに５０μｌのフェノール及び６０μｌのＴ
ＮＢと混合する。フェノール／クロロホルムで抽出し、
そしてエタノールで沈澱せしめた後、ＤＮＡを１０　ｍ
Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｚ　、　ｐＨ８，０中に１０
０μｐ嘗の濃度に再懸濁する。Ｂａ１３１のエキンヌ。
フレアーゼ消化物を分析するために、各時点のＤＮＡの
０，７μＩのアリコートをＨｉｎｄＩ［ｌで消化し、そ
してアガロースダル電気泳動により分析する。さらに分
析するために９０秒時点のＤＮＡを、使用する。
２．２μｇのプラスミドＤＮＡを３７℃にて１時間、２
．８ＵのＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（ポリ被ラ
ーゼ■の大断片、ＢＲＬ　）を用いて、３５μｌの６０
ｍＭＴｒｉ　５−ＨＣｔ、　ＰＨ７，５、１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣ４２及び０．１ｍＭｄＮＴＰの溶液中でインキ−ベ
ートする。
３１１９のＸｈｏ　Ｉリンカ−（５’　−ＣＣＴＣＧＡ
ＧＧ　−３’　　。
コラゼラティプリザーテ）を５０μｌの６　ｍＭ　Ｔ　
ｒ　ｉ　ｓ・ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５、１０’ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．４　ｍＭ　ＤＴＴ　、０．５ｍＭＡＴＰ及び
３５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ペーリンガー
）の溶液中で３７℃にて３０分間キナーゼ処理する。
０．６７μｇのキナーゼ処理Ｘｈｏ　Ｉリンカ−及び０
．４μｇのプラスミドｐ３１ＲのＢａ１３１処理平滑末
端ＤＮＡを、室温にて、２５　Ｉｌｌの６０ｍＭＴｒｉ
ｓ、ｐＨ７、５、１０ｍＭＭｇＣ４３，５ｍＭＤＴＴ　
、　３．５ｍＭＡＴＰ及び４５０ＵのＴ　４　ＤＮＡ　
ＩＪガーゼの溶液中で一夜連結する。１０　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、　０．３　Ｍ酢酸ナトリウム。
ｐＨ６，０，及び０．５４容量のイングロノ４ノールの
存在下イソプロパツ−ルによる沈澱によって、連結され
たＤＮＡを過剰のリンカ−から分離する。室温にて３５
分間インキュベートした後、遠心分離によｐ　ＤＩ；Ｊ
Ａを沈澱せしめる。ベレットを空気乾燥し、そして１７
ｔｔｌｌの６ｍＭＴｒｉｓ　、ｐＨ７，９、１５０ｍＭ
ＮａＣＬ　、　６　ｍＭ　ＭｇＣ４２及び６ｍＭメルカ
プトエタノールの溶液中に再懸濁する。ＤＮＡに連結さ
れたＸｈｏ　Ｉリンカ−をＸｈｏＩにより切断し、ＤＮ
Ａを前記のようにしてイソプロパツールにより沈澱せし
め、そして連結により再環化する。５０μｌの６０　ｍ
ＭＴｒｉｓ・ＨＣｔ、　ｐＨ’７．５　、１０ｍＭＭｇ
ｅｔ２．１０ｍＭＤＴＴ　、　１ｍＭＡＴＰ及び６００
ＵのＴ　４　ＤＮＡリガーゼの溶液中で、１５℃にて６
時間連結反応を行った後、１０μｌずつの連結混合物を
１００μｌのカルシウム処理形質、り 転換コンピテント見：ｚ９　ＨＢＩＯＩ、ＩＢ胞（例４
ａを参照のこと）に加える。
２４個のａｍ　ｐ　Ｒコｏ＝−を、１００ｍＱ／ｌのア
ンピシリンを含有するＬＢ培地中で別々に増殖せしめる
。プラスミ）”　ＤＮＡ　Ｃｐ　３１Ｒ（Ｘｈｏ　Ｉ　
）　〕’に分離Ｌ、そしてＨａｅｌＩｌ消化により分析
する。２個のプラスミドを選択し、そしてターミネータ
−断片中のＸｈｏ１部位に、隣接するヌクレオチド配列
をＭａｘａｍ及びＧ１１ｋ＋ｅｒｔの方法（１０）によ
り決定する。この配列を第１５図に示す。
Ｍ　１３　ｍｐ　９／ＰＨＯ５−ＴＰＡのＲＦプラスミ
ドの調製を前記のようにして行う。２μｇのこのＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ　（ビオラプス）
及びＳａｔ　ｌ　（ビオラプス）で消化し、そして２．
６　ｋｂ断片を低融アガロースダル上での電気泳動（例
５Ｃを参照のこと）により分離する。同様に、月匹曵タ
ーミネータ−を含有するプラスミドｐ３１　Ｒ（Ｘｈｏ
ｌ）の１３４　ｂｐ　Ｈｉ　ｎｄ　ｎｌ−Ｘｈｏ　Ｉ断
片１００ｎ、ｌｉ’を調製する。さらに、１μｙＯｆレ
スミドｐＪＤＢ２０７（２２）をＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄｌｎにより消化し、そして６．５ｋｂの断片を低融ア
ガロースダル上での電気泳動により分離する。
０．５μｇずつのこれら３種類の断片を、２０μｌの６
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ７，５、１０ｒｒＭＭｇ
Ｃ１、１０ｍＭＤＴＴ　、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び２０
０ＵのＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（ビオラプス）の溶液中
で、１５℃にて一夜連結する。例４ａに記載したように
して旦夕ＩＪ）（ＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン
耐性コロニーを選択する。４個のコロニーを拾い上げ、
プラスミドＤＮＡを分離しく例２に記載した方法を用い
る）、そしてＤＮＡを、ランドマークとしてＢａｍＨＩ
、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢ’ｓ　ｔ　Ｅ　ｎ　の制限部位
を用いて分析する。すべての分離体が正しいことが見出
される。
プラスミドの１つをｌ）　ＪＯＢ　２０７／μ匹四−Ｔ
ＰＡ　（ＩＡ）と称する。
ｅ）　　ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔの造成（
第１４図）Ｍ　１３　ｍｐ　９　／Ｆ’１Ｆ（０５−Ｔ
ＰＡの二重鎖ＤＮＡ　１０１１ｆ！をＳａｌ　ｌにより
消化する。フェノール抽出及びエタノール沈澱の後、Ｄ
ＮＡを１０　ｍＭ　Ｔｒ　１．ｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ
８，０中にｏ、５ｍｙ−の濃度に再懸濁する。本質上例
８ｃに記載したのと同様にしてＢａｌ　３１消化を行い
、そしてＸｈｏｌリンカ−を付加する。Ｌヱ支ＪＭＩ　
０１株に形質転換した後、ＲＦＤＮＡを分離し、そして
Ｘｈｏ　Ｉリンカ−の位置をジデオキシ配列決定−法（
３９）により、オリゴデオキシヌクレオチドゾライマー
５’　−ＧＡＡＣＧＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧ　−
３’　を用いて決定する。
異る位置にＸｈｏｌｌＪンカーを含有するＭ１３誘導体
を次のように命名する。
Ｍｌ　３ｍｐ　９／ＰＨＯ５−ＴＰＡ　（Ｘｈｏ　Ｉ−
１）Ｍｌ　３ｍｐ　９／ＰＨＯ５−ＴＰＡ　（Ｘｈｏ　
ｌ−１−２）　３ｍｐ９／ＰＨＯ５−ＴＰＡ　（Ｘｈｏ
ｌ−３）Ｍｌ　３ｍｐ９／ＰＨＯ５−ＴＰＡ　（Ｘｈｏ
ｌ−４）次に、Ｘｈｏｌリンカ−の位置１〜４を示す。
以下余白 上記４種類のＭ１３誘導体［Ｍｌ３　ｍｐ　９／ＰＨＯ
５−ＴＰＡ（Ｘｈｏｌ−１〜４）　］のそれぞれからの
ＲＦ　ＤＮＡ　２　μＮをＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌで消
化し、そして２．５ｋｂ断片を低融アガロースゲル電気
泳動により分離する（例５ｃを参照のこと）。同様にし
て、２μＩのｐ３１Ｒ（Ｘｈｏｌ）をＸｈｏｌ及びＨｉ
ｎｄＩＩで消化し、そしてｘ３４ｂｐ断片を分離する。
２μｇの酵母グラスミドｐ　ＪＤＢ　２０７をＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄｌｌで消化し、そして上記のようにして
６．５　ｋｂ　ＤＮＡ断片を分離する。
３断片を１５℃にて１５時間連結し、そしてＥ、ｒｌＪ
ＨＢｌｏｌをアンピシリン耐性に形質転換する。
１２個ずつのコロニーからグラスミドＤＮＡを分離し、
そしてＨｌｎｄ　ｍ５Ｘｈｏ　Ｉ及びＢａｍＨ［制限エ
ンドヌクレアーゼを用いる制限分析により構成を確認す
る。４つのクローニング実験からの分離体を取シ上げ、
そして次のように命名する。
ｐＪＤＢ２０７／厘−ＴＰＭｌ１　　　′ｐＪＤＢ２０
７／理匝−ＴＰＡΔ２　−ＰＪＤＢ２０７／ｎ匹臣−Ｔ
ＰＡΔ３ ｐ　ＪＤＢ２０７／に巴設旦−’ｒＰＡΔ４例９０、グ
ラスミドｐ３１ＲＬ／ＴＰＡ（１２−２）の造成（第１
６図） 月杯臣プロモーターと成熟ＴＰＡのコード配列との連結
を合成オリゴヌクレオチドにより行う。
μ（０５プロモーターの３′末端にこのオリゴヌクレオ
チドリンカーを含有するプラスミドを、成熟ＴＰＡのコ
ード配列をクローニングするためのアクセプターＤＮＡ
として使用する。
Ａ、アクセゾターゾラスミドｐ３１ＲＬの調製（第１６
図） ３μｇのプラスミドｐ３１ＲＤＮＡ（例６ｅを参照のこ
ト）を６Ｕの制限エンドヌクレアーゼＥｅｏ’Ｒ１によ
り、供給者（ペーリンガー）により推奨される条件下で
、３７℃にて６０分間消化する。完全消化の後、サンゾ
ルを６５℃にて１０分間加熱することにより酵素を不活
性化する。０．０５容量のＩＭＴｒｉｓ　−ＨＣｌ、　
、　ｐＨｓ、ｏ及び２Ｕのウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ（ベーリンガー）を加える。混金物を３７℃にて６
０分間インキュベートし、そして６５℃にて１時間加熱
することによりホスファターゼを熱不活性化する。ＤＮ
ＡをＤｇ５２　（ワットマン）イオン交換クロマトグラ
フィーにより精製する。ＤＮＡは低塩濃度緩衝液（１０
０ｍＭ　ＮａＣｔ。
１０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　、　ｐＨｓ、ｏ　、　１
　ｍＭＥＤＴＡ　）中でＤ′Ｅ５２（シリコン処理さレ
タノやスツールピペット中に充填された１００μｌのベ
ッドポリクム）上に吸着され、そして高塩濃度緩衝液（
１，５Ｍ　ＮａＣｔ　。
１０ｍＭＴｒｉｓ　・Ｈｅｔ、　１ｍＭＥＤＴＡ）によ
υ溶出される。溶出されたＤＮＡをエタノールで沈澱せ
しめ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨｓ
、ｏの溶液中に０．１５１−の濃度に再懸濁する。
実勢 次の式： ％式％ で表わされるオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル
法〔イタクラ等（４０）、ｄｅＲｏｏｉｊ等（４１））
により合成する。オリゴデオキレヌクレオチドの配列は
自己−相捕的である。アニーリングにより２４塩基対の
二重鎖ＤＮＡ　１．１ンカーが生ずる。５μｇの合成オ
リゴ８デオキシヌクレオチドをその５′末端において、
７．５μＣｉの〔γ−３２ｐ）−ＡＴＰ　（５０００Ｃ
４−ｍモル−１、アマ−ジャム）を用いて５０　μｌｌ
の６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＨＣＬ　、　ｐＨ７，５。
１０　ｍＭ　ＮａＣｔ２．４　ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．
５　ｒｒＭ　ＡＴＰ及び３５ＵのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ペーリンガー）の溶液中で、３７℃にて３０
分間燐酸化する。混合物をさらに５分間７５℃にてイン
キエベートし、そして室温に放冷し、そして−２０℃に
て貯蔵する。
２．５μＩの放射性燐酸化アニール化リンカ−ＤＮＡを
５０μｌの６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐｌ（７，５、
３，５ｍＭＡＴＰ。
５　ｍＭ　ＤＴＴ及び２０００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ビオラプス）の溶液中で６℃にて一夜自己連結（ｓｅ
ｌｆ−１ｉｇａｔｌｏｎ）する。生成したリンカ−ＤＮ
Ａのマルチマーを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩに
より、６０　ｔｔｌの１００ｍＭＴｒｉｓ４（Ｃ７，ｐ
Ｈ７，５、１０ｒｒＩＭＭｇＣｔ２，５０ｒｒＩＭＮａ
Ｃｔ及び５５ＵのＥｃｏ　ＲＩ（ペーリンガー）の溶液
中で３７℃にて６０分間消化する。サンプルを液体窒素
中で凍結することにより反応を停止する。
０．５μｇの燐酸化ＥｃｏＲ１切断リンカ−ＤＮＡを、
ＥｃｏＲＩ及びアルカリ性ホスファターゼで消化したｐ
３１　Ｒに、１０μｌの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、
　ｐＨ７，５＋１０　ｍＭ　ＮａＣｔ２．１　ｍＭ　Ａ
ＴＰ　、　５．　ｍＭ　ＤＴＴ及び３００ＵのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ビオラプス）の溶液中で１５℃にて３時間
連結する。連結混合物の４μｌのアリコートを１００μ
ｌのカルシウム処理形質転換コンビテン）　Ｅ、＝ｒｌ
Ｊ　ＨＢＩＯＩ細胞に加える（例４ａを参照のこと）。
４個の形質転換された！ＬｍｐＲコロニーを別々に１０
０μ麹のアンピシリンを含有するＬＢ培地に増殖せしめ
る。グラスミドＤＮＡをＨｏ１ｍ６ｇ等（２６）の方法
により調製し、そしてＫｐｎ　Ｅ及びＳｍａ　ｉ／Ｂａ
ｍ　Ｈ１消化により分析する。制限エンドヌクレアーゼ
Ｋｐｎｌによって切断され、Ｓｍａ　ｌ／Ｂａｎ　）（
に重油化の後に予想された制限断片を示す１つのクロー
ンを、その後の造成のために選択し、そしてｐ３１　Ｒ
Ｌと称する。
プラスミドｐ３１Ｒは、プラスミドｐ３１Ｙ、又は例６
ｃに記載したプラスミドｐ３１Ｐ　、　ｐ３１　Ｖ　。
ｐ３１　Ｌ　、　ｐ３１　Ｎ　、　ｐ３１　Ｃ、ｐ３１
　Ｈ、ｐ３１　Ｓ　、　ｐ３１　ｋ　。
ｐ３１１のいずれかによって置き換えることができる。
形質転換及びａｍｐＲコロニーの分析は上記のようにし
て行う。予想される制限断片を有する１つのクローンを
選択し、そしてｐ３１ＹＬと称する。
Ｂ、　　ｆラスミドル３１ＲＬへのＴＰＡ　ＤＮＡの挿
入（第１６図） ａ）Ｎｃｏｌによるプラスミドｐ３１ＲＩ、の消化５μ
ｇのｐ３１ＲＬＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＮｅｏ
　１を用いて、供給者（ビオラプス）により推奨される
条件下で消化する。完全消化の後、フェノール／クロロ
ホルムにより溶液を脱蛋白し、そしてエタノール沈澱に
よりＤＮＡを濃縮する。ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ　−
ＨＣｌ、　、ｐＨ８溶液に０．２５　ｍＶ−の濃度で再
溶解する。
Ｎｃｏ　Ｉにより切断されたｐ３１　ＲＬ　ＤＮＡ　５
μｇを１００　ｔｔｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ
、　ｐＨ７，５、１０ｍＭＭｇＣｌ２．　Ｑ、４μＭ　
ｄＡＴＰ　、　３０μＣｉ’［α−３２Ｐ〕−ａＡＴｐ
　。
０．１　ｍＭ　ｄＴＴＰ　、　０．１　ｍＭ　ｄＣＴＰ
　、　０．１　ｍＭ　ｄＧＴＰ　及び８ＵのＫｌ　ｅｎ
、ｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（大断片、ＢＲＩ、）の溶
液中でインキ−ベートする。室温にて１５分分間−た後
、非ラベルｄＡＴＰの濃度を０．１ｍＭに上昇せしめる
。インキュベーションを室温にてさらに４５分間継続す
る。反応をフェノール／クロロホルム抽出により停止す
る。ＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮し、そして１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ、ｐＨ８の溶液に０．２５ｍ９／
−の濃度で再溶解する。
反応ａ）及びｂ）の代シに、ｃ）及びｄ）に記載するよ
うに、ｐ３１ＲＬＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＫｐ
ｎｌ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼにょシ処理することも
できる。
ｃ）Ｋｐｎｌによるプラスミドｐ３１ＲＬの消化１０μ
ｇのｐ３１　ＲＬ　ＤＮＡを供給者（ビオラプス）によ
り推奨されるようにして完全消化する。混合物をフェノ
ール／クロロホルムで抽出スる。ＤＮＡをエタノールで
沈澱せしめ、そして１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣＬ、　ｐＨ
８、０，１ｍＶ　ＥＤＴＡの溶液中に０．４　ｍｇ７ｍ
ｔの濃度で再溶解する。
ｄ）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとＫｐｎ　Ｉ切断ｐ３１Ｒ
ＬＤＮＡとの反応 Ｋｐｎｌにより切断された９μ、９のｐ３１ＲＬを３７
℃にて２．５分間、ＩＯＵのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（
４２）と共に１００μ７の３３　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸
、ｐＨ７，９゜６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マ
グネシウム及び０．５　ｍＭ　ＤＴＴの溶液中でインキ
−ベートする〔刈取り（ｔｒｉｍｍｊｎｇ）段階〕。刈
取られたＤＮＡ鎖の再合成を２００μｌの増加した容積
中で、３３ｍＭＴｒｉｓ−酢酸、　ｐＨ７，９、６６ｍ
Ｍ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、　０．５
ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．４μＭ　ｄＡＴＰ　、　３０μ
Ｃｉ〔α−３２Ｐ）　−ｄＡＴＰ　、　０．１　ｍＭ　
ｄＴＴＰ　、　０．１　ｍＭ　ｄＣＴＰ及び０．１　ｍ
Ｍ　ｄＧＴＰの存在下で行う。３７℃にて１８分聞装い
た後、非ラベルｄＡＴＰの濃度を０．１＋ｎＭに上昇せ
しめ、そしてさらに３５分間３７℃にてインキュベーシ
ョンを続ける工反応をフェノール／クロロホルム抽出に
より４止する。ＤＮＡをエタノ　　　　　　　１−ルに
より沈澱せしめ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＬ
。
Ｐ）（８の溶液中に０．４　＊／ｄの濃度で再溶解する
。
ｅ）線状ＤＮＡ　、ｆリメラーゼ処理ｐ３１ＲＬシラス
ミＮｃｏｌ及びに１ｅｎｏｗＤＮＡポリメラーセテ処理
すれたｐ３’ｌ　ＲＬ　ＤＮＡ　（例９Ｂｂ）４．５μ
）ｉｌ、又はＫｐｎ、Ｉ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼと
共にインキ−ベートされたＰ３１　ＲＬＤＮＡ　（例９
Ｂｄ）４μｙを、制限エンドヌクレアーゼＳｍａ　ｌに
より完全消化する。反応をフェノール／クロロホルム抽
出により停止する。ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、
そして１００μｅの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　、
　ｐＨ８，０の溶液に再溶解する。
ｆ）ｔａｋｂ大ＤＮＡ断片の脱燐酸化及び分離１．４Ｕ
のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー）を
各ＤＮＡサンプルに加える。これらを３７℃にて１時間
インキ瓢ベートし、そして次に６５℃にてインキュベー
トして酵素を不活性化する。混合轡の塩濃度を１５０　
ｍＭ　ＮａＣ１に調整し、そしてＤＮＡを例９Ａａに記
載したようにしてＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィ
ーにより精製する。
ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして４５μ！の１
０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　、　ｐＨ８に再溶解す
る。
大４．３　ｋｂ　ＤＮＡ断片を、調製用０．８％アガロ
ースゲル上Ｔｒｉｓ−ポレート−ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８
，３中で分離し、ＤＮＡを含有する小グルブロックを切
り取る。
各グルブロックからのＤＮＡを、１．５艷の５倍稀釈Ｔ
ｒｉｓ−ｇレートーＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８，５を充填
した透析バッグ中で電気溶出する。閉じだバッグをＴｒ
ｉｍ　−ｇレート−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８，３中に浸
漬する。１００ｍＡで３０分装いた後、電流の極性を４
５秒間逆にして透析膜からのＤＮＡをはねつける。
透析バッグ中のグルブロックを包囲している緩衝液を回
収し１５０　ｍＭ　ＮａＣｔに調整し、そし−（ＤＥ５
２（ワットマン）イオン交換カラムに通す。
ＤＮＡを高塩濃度緩衝液（１，５Ｍ　ＮａＣｔ、　１０
ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ　、　ＰＨ８，０及び１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）で溶出し、エタノールで沈澱せしめ、そし
て１０ｍＭＴｒｉｇ　、　ｐＨｓ、。
の溶液中に０．２　ｍｙ／ｍｔｔの濃度で再溶解する。
このＤＮＡ断片をｐ３１ＲＬΔと称する。
反応ａ）〜ｆ）を、ｐ３１ＲＬの代りにプラスミドル３
１ＹＬ別いて行い、ｐ３１ＹＬΔＤＮＡ断片を得るどと
ができる。
ｇ）プラスミドｐＷ３４９ＦのＢａｌ　ｌ消化プラ、ス
ミドｐＷ３４９Ｆは、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位にク
ローニングされたヒト組織プラスミノーダンアクチペー
ターの構造遺伝子を含有する（例７ｃを参照のこと）。
グラスミドＤＮＡを調製するために、グラスミドｐＷ３
４９Ｆで形質転換された見１１ＨＢ　１０１の１つのコ
ロニーを１０１１ｖ／／ｌのテトラサイクリンを含有す
るＬＢ培地１００ｍ７！に接種する。培養物を３７℃、
２００ｒｐｍにて一夜振とうする。例２に記載した方法
によりブラスミドの調製を行う。
１０μｇのｐＷ３４９　ＦプラスミドＤＮＡをＩＯＵの
制限騨素Ｂａｌ　１（ＢＲＬ）により、２００　ａｌｌ
の６ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣＬ　、　ｐＨ７，５、６ｍＭＮ
ａＣ２，６ｍＭＭｇＣＬ２．６ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール及び０．１〜匂のラン血清アルゾミンの溶液中で
、３７℃にて２時間消化する。
完全消化の後、フェノール／クロロホルム抽出により溶
液を脱蛋白する。ＤＮＡをエタノ−ルで沈澱せしめ、そ
して１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ８，０の溶
液中に０．２〜−の濃度で再懸濁する。
Ｂａ１ｌ切断ＤＮＡの平滑末端へのＸｈｏ　Ｉリンカ−
の連結は、後の造成のための便利なりローニング部位を
得るために任意段階である。
ｈ）Ｂａｌｌ切断ｐＷ３４９Ｆ　ＤＮＡのＢｇｌ　ｎに
よる消些− ４μＩのＢａｌ　Ｉ切断ｐＷ３４９Ｆ　ＤＮＡを供給者
（ビオラプス）によって推奨される方法により制限エン
ドヌクレアーゼＢｇｌ　ｕにより消化する。完全消′化
の後、蛋白質をフェノール／クロロホルムにより抽出す
る。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめ、そして０．
２〜−の濃度で水に再溶解する。
反応 Ｂａｌ　ｒ及びＢｇｌｌｌで切断されだ４ｔｔ９のｐＷ
３４９ＦＤＮＡを１００　μｌｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉ
８・ＨＣｔ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣ１’２．σ
、　１　ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　０．１　ｍＭ　ｄＣＴＰ
及び８ＵのＫ　ｌ　ｅ　ｎ　ｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ
Ｑ溶液中で室温にて３０分間インキ−ベートする。ＥＤ
ＴＡを最終濃度が１０ｍＭになるように添加することに
より反応を゛　停止する。蛋白質をフェノール／クロロ
ホルムにより抽出する。ＤＮＡをエタノールで沈澱せし
め、そして０．２−の濃度で水に再懸濁する。
ヌクレアーゼＳ１によりさらに切断するため、５０ｔｔ
ｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウム、　ｐＨ４，６、２００ｍ
ＭＮａＣｔ、　１　ｒｎｌＶＩ　Ｚｎ　Ｓｏ及び１．５
Ｕの８１ヌクレアーゼ（シグマ）の溶液中で３７℃にて
３０分間インキエペートスル。フェノール／クロロホル
ム抽出の後、エタノールによｆｉ　ＤＮＡを沈澱せしめ
、そして４５　ａｌｌの１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−
ＨＣｔ　、　ｐ）１８、ｏの溶液に再懸濁する。
ｋ）’　１．８６　ｋｂ　Ｂｇｌ　ｌｌ−Ｂａ１　Ｉ制
限断片の分離Ｋ　１　ｅ　ｎ　ｏｗ　ＤＮＡポリメラー
ゼ及びヌクレアーゼＳ。
により上記のようにして平滑末端に転換されたＢｇｌ　
ｌ制限部位を有する１、８６　ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ　−
Ｂａｌ　ｌＤＮＡ断片を、調製用０．８チアガロースグ
ル上Ｔｒｉｓ−＆レー　）　ＥＤＴＡ　、　ｐｉ−１８
，３中で分離する。例９Ｂｆに記載したようにして電気
溶出によりｒルブロックからＤＮＡを回収する。
以下余白 １）適当なアクセプターＤＮＡへの１．８６　ｋｂ　Ｄ
ＮＡ０．３μｇの１．８６ｋｂ平滑末端ｐＮＡ断片（例
９　Ｂｋを参照のこと）を０．６μｙのｐ３１ＲＬΔ（
例９　Ｂｆを参照のこと）に連結する。反応は、１０μ
ノの６０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　、　ｐＨ７，５、１
０ｍＭＭｇｅｔ２．５　ｍＭＤＴＴ　、　３．５　ｍＭ
　ＡＴＰ及び４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ビオラプ
ス）の溶液中で１５℃にて２０時間行う。
連結混合物の３μｌ又は６μノのアリコートを１００μ
ノのカルシウム処理形質転換コンピテント４タユＨＢ　
１０１細胞に加える（例４ａを参照のこと）。
４８個の形質転換されたａｍｐＲコロニーをそれぞれ別
々に、１００μ９７ｄのアンピシリンを含有するＬＢ培
地に増殖せしめる。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｇ等
（２６）の方法に従って調製し、そしてＥｅｏＲ１消化
により分析する。１２個のクローンが正しい方向にクロ
ーニングされた１、　８６　ｋｂ　ＤＮＡ断片を有する
。これらのクローンを、理亜プロモーターとＴＰＡ構造
遺伝子との間の連結部のＤＮＡを配列決定することによ
りさらに分析する。
ＰＨＯ５プロモーターのｍＲＮＡ出発部位の近くにバイ
ブリド形成しそして下流連結領域の配列決定を可能にす
る合成オリゴヌクレオチドを使用する〇二重鎖プラスミ
ドＤＮＡの変性及び合成オリ＝＋”ヌクレオチドのバイ
ブリド形成のためにＭ１３逆プライム条件（４３）を用
いる。ＤＮＡの配列決蝋を（３９）に記載されているよ
うにして行う。
２個のクローンが次のような正しい連結配列を有する。
以下余白 例１０．高コピー数酵母ベクターｐ　ＪＤＢ　２０７へ
の遺】 を参照のこと　　　　　　　　　　　　　　　　ｉ例９
に記載した構成物は、そのシグナル配列を伴わないＰＨ
Ｏ５プロモーター、ＴＰＡコード領域及びタンデム配列
のＰＨＯ５転写停止シグナルをｐＢＲ・３２２由来ベク
ターに挿入された状態で含有する。　　　１酵母での発
現のために、全挿入部を、ロイシン栄養要求コロニーに
ついて選択可能にする酵母ペク　　　２ターｐ　ＪＤＢ
　２０７　（２２）にサブクローニングする。　　　　
】２μＩのｐ３１ＲＬ／ＴＰＡ（１２−２）ＤＮＡを制
限エンド　　　ｆヌクレアーゼＳａｔ　Ｉ及びＨｉｎｄ
ｕｌにより消化する。　　−制限断片を調製用０．’８
’ｆｉ低融アガロースゲル上で　　　（分離し、そして
小２．８　ｋｂ断片をグルから切り取る。
５４のｐ　ＪＤＢ　２０７　ＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ　
Ｉ及びＨｌｎｄ　ＩＩＩ　で消化する。大６．２ｋｂ断
片を調製用０．８−低融アガロースグルから分離する。
このＤＮＡ断片を含有するｒルブロックを６５℃におい
て液化し、そして水で稀釈してアガロース濃度を約０．
３チに低下せしめる。
プラスミドｐ　３１　ＲＬ／ＴＰＡ　（１２−２）の２
．８ｋｂＳａｌ　ｌ−Ｈ１ｎｄｎｌ断片をｐＪＤＢ２０
７の６．２　ｋｂ　Ｈ４ｎｄ　（［１−Ｓａｌ　Ｉ上片
の当モル量と混合する。連結を、１００μｌ中′ｃ１５
℃にて４時間行う。１０μｌの各連結混合物上用いて、
例４ａに記載したようにしてコンビテ／）　Ｅ、ニア　
９　）［Ｂ１０１細胞を形質転換する。各実験かしの複
数のａｍｐＲコロニーを別々に、１００μＶ／ｎｌのｒ
ンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖せしめ５゜プラ
スミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ［
Ｉ及びＳａｌ　Ｉで切断することによって挿入部のサイ
ズについて分析する。正しい挿入部を有する１個のクロ
ーンをｐＪＤＢ２０７Ｒ／μ匹曵−ＴＰＡ７１２−２５
と称する。
以下余白 、例１１？、カロぽセス・セレビシェ−〇ＲＦ１８の形
質転換 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ｊ基臣−ＴＰＡ（ＩＡ）、
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ１、ｐＪＤＢ２０
７／ＰＩ（０５−ＴＰＡΔ２、ｐＪＤＢ２０７恒−ＴＰ
や、ｐＪＤＢ２０７／ヱ匹星−ＴＰＡΔ４及びｐＪＤＢ
２０７Ｖ旦−ＴＰＡ　（１２−２）をサツカロミセス・
セレビシェニＧＲＦ１８株（α、ｈｉｇ３−１１、ｈｉ
ｇ３−１５、ｌｅｕ　２−３．１ｅｕ２−１１２ｓｃａ
ｎ”　）に、Ｈ４ｎｎｅｎ等により記載された形質転換
法（１２）を用いて形質転換する０１μｙずつのプラス
ミドＤＮＡを１００μｌのスフェロプラスト懸濁液に加
え、そして混合物をポリエチレンｆＩＪコールによυ処
理する。スフェロプラストを１ＣＩＩＡＩの再生用寒天
と混合し、そしてロイシンを含有しない酵母最少培地グ
レート上にプレートする。３０℃にて３日間インキュベ
ートした後約２００の形質転換された細胞が得られる。
各酵母形質転換からの単一酵母コロニーを拾い上げる。
異るコロニーを次の様に称する。
サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ　１８　／ｐＪＤ
Ｂ２０７／服並−ＴＰＡ（ＩＡ）サッカロミセス・セレ
ビシェーＧＲＦ　１８／ｐＪＤＢ２０７／輩ｙ狙−ＴＰ
ＡΔ１ サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７乃男四−ＴＰＡ４２ す、カロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／、明朗−ＴＰＡΔ３ サッカロミセス・セレビシェー（ｄＬＦ１８／ｐＪＤＢ
２０７／至−ＴＰＡΔ４ サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７ＶニーＴＰＡ（１２−２）酵母細胞を、１００ＷＬ
ｌのエルレンマイヤー７７スコ中１０ｍ１の酵母最少培
地中で、３０℃にて振とうしながら、約２〜３　Ｘ　１
０７細胞／ゴの濃度に達するまで２４時間増殖せしめる
。細胞を２０ｍ１の低Ｐ１最少培地で１回洗浄する。３
ｍｌの再懸濁細胞を用いて、１０００−のエルシンマイ
ヤーフラスコ中３００４の低ｐｉ最少培地及び３００ｒ
Ｌｌの通常最少培地のそれぞれに接種する。３０℃、１
６０ｒｐｍにてインキュベートする。Ｔｏｈ−ｅ等（４
４）により記載された方法により全細胞中の酸性ホスフ
ァターゼ活性の出現を測定することによりヱＨＯ５プロ
モーターの誘導を追跡する。細胞は約１〜２×１０細胞
／ｄに増殖する（２６〜３０時間の誘導）。
例１２．酵母細胞抽出物の調製及びＴＰＡ活性の測定 細胞濃度１〜２×１０個／ｄにおける低ＰＩ培地３５Ｗ
Ｌｌからの細胞をツルパル８８３４０−ター中で１０分
間遠心分離することにより集菌する。細胞を、培地の塩
成分を含有する緩衝液（すなわちアミノ酸、グルコース
、ビタミン及び微量要ｉを含有しない）中で洗浄する。
細胞を室温にて５分間３０００　ｒｐｍで遠心分離する
。沈澱した細胞を全容４ｄの冷６６ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液声７．４及び０．１　（Ｖ／Ｖ）％トリト／Ｘ−
１００中に再懸濁する。細胞懸濁液を３０Ｒ１のコレツ
クスチューブに移し、８ｇのガラスピーズ（直径０．４
　ｍ　）を加え、そしてこの懸濁液を？ルテックスミキ
サー（Ｖ、ｏｒｔ＠ｘ　Ｍ％、、ｒ）（サイエンティフ
ィック・インスツルメンツ社、米国）上で全速で４分間
振とうし、そして水浴中で冷却する。この方法により９
０チよシ多くの細胞が破壊される。細胞片及びガラスピ
ーズを、ツルパルＨＢ　−４０−ター中で８００　Ｏｒ
ｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離することによって沈澱
せしめる。上清液をエッペンドルスチーーゾに移し、液
体窒素中で凍結し、そして−６０℃にて貯蔵する。
ＴＰＡ活性を、わずかに変更を加えたＲλｎｂｙの方法
（４９）に従って測定する。基質としてＤ−Ｖａ　１−
Ｌ＠ｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ（Ｋａｂｉ　Ｓ−２２５１）を
使用する。４０５ｎｍにおける吸収を非特異的切断に関
して修正し、そしてウロキナーゼ標準と比較する。結果
を第２表に示す。
以下余白 第２表 種々の組換プラスミドにより形質転換された旦５セレビ
シェーＧＲＦ１８株におけるＴＰＡ活性この造成は、合
成オリゴヌクレオチドを用いてＰＨＯ５シグナル配列と
成熟ＴＰＡのコード配列との間の正しい連結を確立する
。便宜上、プラスミド・ｐ　ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−
ＴＰＡΔ２（例８ｅを参照のこと）の該当する領域をグ
ラスミドｐ３１（例５を参照のこと）にサブクローニン
グスル。
ａ）プラスミドｐ３１〆ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２の分離２
４ずツノシラｙ、ミ）’ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−Ｔ
ＰＡΔ２、及びｐ３ｔ（例８ｅ、及び例５を参照のこと
）を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩｌ及びＳａ
ｌ　Ｉにより消化する。完全消化の後、ＤＮＡ断片を０
６％低融アガロースｒル上Ｔｒｉｓ−Ｍレート−ＥＤＴ
Ａ、　ｐＨ８，３中で分離する、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
Ｏ５５９５Ｂ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２の２．６　
ｋｂＨｉｎｄＩ［ｌ−８ａｌｌ断片、及びｐ３１の３．
１　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［ｌ−８ａｉｌ断片をグルから切
り取る。グルブロックを６５℃にて液化し、そして水で
稀釈してアガロース濃度を０．３チに低下せしめる。等
モル量の両断片を混合し、そして１００μ！中で１５℃
にて４時間連結する。１０μ）の連結混合物を用いてコ
ンピテントＥ、コＩＪＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する。
幾つかのａｒｒＩｐＲ□　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１コロニ
ーを分析する。
正しい挿入部を有する単一コロニーをｐ３１／：凪ｙ巧
−ＴＰＡΔ２と称する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７．／ぬ隻５−ＴＰＡΔ１丸ｐ
ＪＤＢ２０７／μ犯針ＴＰＡΔ３、及びｐＪＤＢ２０７
乃萱星−ＴＰＡΔ４（例８ｅを参照のこと）を用いて同
様の造成を行う。
得られたグラスミドをｐ３１／旦−ＴＰＡΔ１、ｐ３１
／ヱ壓弘−ＴＰＡ、４３、及びｐ３１イヱ話四−ＴＰＡ
Δ４と称する。
ｂ）プラスミドル３１４凹臣−ＴＰＡＩ　８の造成（第
１８図） ３０μｇのプラスミドｐ３１／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２　
を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌで消化する。線状化
されりＤＮＡ　ラフエノール／クロロホルムで抽出処理
し、エタールで沈澱せしめ、そして１０ｍＭＴｒｉｓ−
ｍｃｔ　、　ｐＨ８Ｏ溶液に、０．５１ｖ／ｍＡ！の濃
度に再溶解する（ｐ３１〆ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２−Ｘｈ
ｏ　Ｉ　）。
５ｔｓ９のＸｈｏ−切断ＤＮＡ　ｔｌ−Ｂａ　Ｉ　Ｉに
よりさらに消化する。完全消化の後、ＤＮＡをフェノー
ル／クロロホルムで１回抽出し、２．５容量のエタノー
ルで沈澱せしめ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉ　ｍ　−Ｈ
ＣＬ　、　ｐＨ８に再懸濁する。大３．９　ｋｂＸｈｏ
　ｌ−Ｂａ１　Ｉ　断片を小グルブロックとしてグルか
ら切シ取る。ＤＮＡ　（４１８図参照）を、例９Ｂｆに
記載したようにして電気溶出及びＤＩ５２イオン交換ク
ロマトグラフイーによりグルから回収する。ＤＮＡをエ
タノール沈澱により濃縮し、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉ
　８−ＨＣｔ、　ｐＨ８の溶液に０．２　ｍｙ／ｙｎｌ
の濃度に再溶解する。
２０　μｍ１０　ｐ３１／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２・Ｘｈ
ｏＩ（上記）を、制限エンドヌクレアーゼＰＩＩｔ　１
　（０，７５Ｕ／μｇＤＮＡ　）により、２００ｔｔｌ
の１　’ＯｍＭＴｒｉｓ・Ｈｃｔ。
ｐＨ７，５，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０　ｍＭ　ＮａＣ
６，６ｍＭメルカゾトエタノール及び０．０１■／ＷＬ
ｔのエチジウムプロミドの溶液中で、３７℃にて４５分
間部分消化する。フェノール／クロロホルムで抽出する
ことにより反応を停止する。ＤＮＡをエタノールにより
沈澱せしめ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣＬ　、
　ｐＨ８中に再溶解する。制限断片を１．２％アガロー
スダル上Ｔｒｉｓ−＆レート−ＥＤＴＡ　、ｐＨ８，３
中で分離する。成熟ＴＰＡのコード領域のほとんどを含
有する１、６　ｋｂ　Ｘｈｏｌ−Ｐａ口口片片断片Ｂ、
第１８図を参照のこと）を、上記のようにして電気溶出
によりグルブロックから回収する。ＤＮＡをエタノ−〉
で沈澱せしめ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−Ｈ
Ｏ２ｓ　Ｐ）（８の溶液に４０μ９７ｍ１の濃度で再溶
解する。
次の式： ％式％ で表わされる合成リンカ−により、立並シグナル配列と
成熟ＴＰＡのコード配列との間の正しい連結を樽る。
リンカ−の５′−末端の８個のヌクレオチド（５′−Ｃ
ＣＡＡＴＧＣＡ・）はＢａ１１部位から終点までのヱＨ
Ｏ５シグナル配列の部分を示し、そして１９ヌクレオチ
ドはコード領域の５′−末端から第１のＰａｔ　１部位
までの成熟ＴＰＡの配列を補完する（第１９図を参照の
こと）。オリゴデオキシヌクレオチドＣ及びＤはホスホ
トリエステル法により合成する。これらは、別λにそれ
らの５′末端において燐酸化し、等量ずつ混合し、そし
て例９Ａｂに記載したようにしてアニールする。
６０μ、！ｉ’　（４、ｐモル）の燐酸化されアニルさ
れたリンカ−ＤＮＡを、０．４ｕｇ　（０，４ｐ　モル
）の１．６　ｋｂＸｈｏｌ−ＰｓｔＴ断片（断片Ｂ１上
記）に、１５μｌの６０　ｍＶ　５　ｍＭ　ＤＴＴ及び
６００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼの溶液中で、１５℃にて
１６時則連結する。リガーゼを８５℃にて１０分間不活
性化する。１０ｍＭＥＤＴＡ　、　　３００ｍＭ酢酸ナ
トリヴム、ｐＨ６，０及び０．５４容量のイングロパノ
ールの存在下でＤＮＡを沈澱せしめることにより過剰の
リンカ−を除去する。Ｂａ１ｌ及びＸｈｏＩで消化する
ことにより複数リンカ−ＤＮＡ及びＤＮＡ断片が分解さ
れる。Ｐｓｔ　１部位へのリンカ−の付加のため、１．
６　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ　■断片がＸｈｏ　Ｉ
　−Ｂａｌ　Ｉ断片に転換される。
この１．６　ｋｂ　Ｘｈｏ　ｌ−Ｂａ１　ｌ　ＤＮＡ断
片０．４　ｔｔ９及び３、９　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｂ
ａｌ　Ｉ断片（断片Ａ、上記）’１４を、１０μｌの６
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ７，５，１０μＭＭ
ｇＣ１２，３，５ｍＭ　ＡＴＰ　、　５　ｍＭ　ＤＴＴ
及び４００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼの溶液中、室温に
て１６時間連結する。連結混合物の３μ杉及び７μｌの
アリコートを１００μｌのカルシウム処理形質転換コン
ピテントＥ、コリＨＢ　１０１細胞（例４ａを参照のこ
と）に加える。１０個の形質転換されたａｍｐ　Ｒコロ
ニーを別々に、１００μ９７ｍ１のアンピシリンを含有
するＬＢ培地中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡをＨ
ｏｌｍｅｓ等（２６）の方法に従って調製する。リンカ
−領域にわたって配列決定することによυクローンを分
析する。
ＰＨＯ５シグナル配列と成熟ＴＰＡのコード領域との間
の正しいフレーム内連結を示す１つのクローン（第１９
図を参照のこと）をｐ３１／ＰＨＯ５−ＴＰＡ１８と称
する。
プラスミ）”ｐ３１　／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ２を、ｐ３
１／旦−ＴＰＡΔ１、ｐ３１／ニーＴＰＡΔ３又はｐ３
１／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ４で置き換えることができる。
この造成は前記のようにして行う。特に、プラスミドｐ
３１／ＰＨ四−ＴＰＡΔ３から誘導された１つのクロー
ンをｐ３１乃萱互−ＴＰＡ４２と称する。
ＰＨＯ５７’ロモーターヲクレプロ−ＴＰＡ　ｔ−コー
ドするＤＮＡ配列に連結する。ブレプロ領域の３５アミ
ノ酸のためのヌクレオチド配列に成熟ＴＰＡのコード配
列が続く。
ａ）　　ＴＰＡシグナル配列を含有するＴＰＡコード領
３０μｇのノラ□スミドｐＶＩ／３４　ｇ　Ｂ’を制限
工／ドヌクレアーゼＢｇｌｌにより切断する。フェノー
ル／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡ
ヲＥｃｏＲ１及びＢ　ａｍＨＩによりさ゛らに消化する
。制限断片を１％アガロースゲル上Ｔｒｉｓ−ボレート
−ＥＤＴＡ　、　ＰＨ８，３中で分離する。０．９　ｋ
ｂ　Ｂｇ１１ＥｃｏＲ１断片をグル上で位置決定し、そ
して切υ取る。ＤＮＡを、例９Ｂｆに記載したようにし
て電気溶出する。
３．５μｇの０．９　ｋｂ　Ｂｇｌｌ−Ｅｃ（ＩＲ）断
片をＨｇａ　Ｉにより完全消化し３断片を生じさせる。
この混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そし
てＤＮＡ断片をエタノールで沈澱せしめる。Ｈｇａ　Ｉ
消化により形成された断片の接着末端を、６０ｍＭＴｒ
　ｉ　ｓ　・ＨＣｔ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ＋
、ｔ２．０．１　ｍＭＴＴＰ　ｓ　Ｏ，１ｒｎＭｄｃＴ
Ｐ及び０．１　ｙｎＭｄＧＴＰを含有するＫｌｅｎｏｗ
　ＤＮＡポリメラーゼ（ＩＵ／μｇＤＮＡ）との反応に
より満たす。２０℃にて６０分分間−た後、エタノール
沈澱により反応を停止する。平滑末端を有するＤＮＡ断
片番４０倍モル過剰量の燐酸化及びアニールされ九Ｅｅ
ｏＲＩリンカ−（ビオラプス）と混合する。５６μｌの
６０　ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ４Ｊ（７，’　５
．１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　３
．５　ｍ１ｉｊ、ＡＴＰ及び２０００ＵのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの溶液中で１５℃にて１６時間連結を行う。１０
　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐｉ　７．５．３００ｍＭ酢酸
ナトリウム、ｐＨ６，０、及び０．５４容量のイングロ
ノやノールの存在下でＤＮＡを沈澱せしめることにより
過剰のリンカ−分子を除去する。
ＤＮＡ断片の混合物をＥｃｏ　ＲＩで消化してマルチグ
ルリンカ−を除去し、そしてＮａｒｌで消化する。完全
消化の後、制限断片を１％アガロースゲル上Ｔｒｉｓ−
ボレー）　−ＥＤＴＡ、　ＰＨ８，３中で分離する。
４４６　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／　（Ｈｇａ　Ｉ）−Ｎａｒ
　Ｉ断片をグルから切シ取シ、そしてＤＮＡを電気溶出
により回収する（例９Ｂｆを参照のこと）。
２０図） １０　ｔＪ　（Ｄグア　スミトｐ３１〆ＰＨＯ５−ＴＰ
ＡΔ２を）１１ｎｄ　ｍ　テ消化する。フェノール／ク
ロロホルム抽出、及びエタノール沈澱の後、ＤＮＡを水
に０．１ｍｙ／ｒｒｔｌの濃度で再溶解し、そしてＮａ
ｒｌにより消化する。制限断片を、１％アガロ−スケ“
ル上Ｔｒｉｍ−ｉレート−ＥＤＴＡＸｐＨ８，３中で分
離する。
１．４　ｋｂ　Ｎａｒ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ断片を分離
し、そして電気溶出によりアガロースグルから回収する
（例９Ｂｆを参照のこと）。
こと） ５μｓのグラスミドｐ３１Ｒを制限エンドヌクレアーゼ
Ｈ１ｎｄｌｌｌ及びＥｃ　ｏ　Ｒ１で消化する。制限断
片を１チアガロース）ｙ’ル上Ｔｒｉｍ　−Ｎレー）　
−ＥＤＴＡ　。
ＰＨ８，３中で分離する。３．９　、ｋｂ　Ｈｉｎｄ　
ｍ　−ＥｃｏＲＩＤＮＡを分離し、そして電気溶出によ
りアガロースグルブロックから溶出する。
ｄ）断片の連結（第２１図） ０．３ｐモルの３．９　ｋｂ　Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｅｃｏ
ＲＩ断片、０．３ｐモルの１．４　ｋｂ　Ｎａｒ　Ｉ　
−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ断片及び０．６ｐモルの４　’４６
　ｂｐ　ＥｅｏＲＩ−Ｎａｒ　Ｉ断片を、１２μｌの６
０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉｓ　−ＨＯ２ｐＨ７，５，１０ｍＭ
ＭｇＣ１２，１ｍ１ｉｌｌ　ＡＴＰ　、　５　ｍＭ　Ｄ
ＴＴ及び４８０Ｕ（７）Ｔ４ＤＮＡリガーゼの溶液中、
１５℃にて６．５時間連結する。この連結混合物の５μ
！及び７μｌめアリコートを１００μｌのカルシウム処
理形質転換コｙ　ヒｆ　ン）　シミ」ＨＢＩＯＩ細胞に
加える（例４ａを参照のこと）。
２３個の形質転換されたａｍ　ｐ　ｊｔコロニーを別々
に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＩ、Ｂ培
地中で増殖せしめる。異るクローンのプラスミドＤＮＡ
をＰｓｔ　ｌによる制限処理にょシ分析する。制限断片
の予想のＡ？ターンを有する゛クローンの１つをＲ３１
Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡΔ２と称する。
プラスミドＲ３１力襄臣−ＴＰＡΔ２を、Ｒ３１ろ凹臣
−ＴＰＡΔ３、又は例１３ａに記載した他のクローンの
１つにより置き換えることができる。造成は前記の方法
により行う。グラスミドｐａｔ／ｐｕｏｉ−□ＴＰＡΔ
３由来のプラスミドの１つをＲ３１Ｒ／８８−ＴＰＡΔ
３と称する。
ＰＨＯ５シグナル配列に外来性ＤＮＡが連結される場合
はいつでも、シグナルペプチド切断部位の付近における
生ずるアミノ酸配列は真正なＰＨＯ５蛋白質のそれとは
異なる。アミノ酸配列の変化はシグナルペグチドによる
プロセシングの効率に影響を与えるであろう。従って、
次のＤＮＡ造成は、成熟酸性ホスファターゼのコード領
域内に延長したＰＨＯ５シグナル配列を用いる。シグナ
ル配、列後の異る距離において成熟ＴＰＡのコード領域
は、酵母ｘンド＜ｆチダーゼのためのプロセシング部位
金含有する合成リンカ−を介してのみフレーム内に連結
される。
２２図） ヱ四臣プロモーター、ヱ匹亘シグナル配列及び種々の長
さの成熟酸性ホスファターゼコード領域を含有するＤＮ
Ａ断片を分離する。Ｒａａ　ｌ制限部位は上流ＢａｍＨ
１部位から５９５．６３７＜８１１及び１３１２位に位
置する（４８）。ＰＨＯ５シグナル配列は５９２位に延
びるので、異るＲｓａ１部位は、成熟酸性ホスファター
ゼのコード配列のそれぞれ３．４５．２１９及び７２０
位に置換する。
Ｒｓａ　１部位を異にするＢａｍＨＩ　−Ｒｓａ　Ｉ断
片を合成オリゴデオキシヌクレオチドを介してＸｂａ）
部位にサブクローニングする０ ｐＪＤＢ２０７／ＰＩ（四−、ヱ匹岐（例２を参照のこ
と）のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＨｐａｌで切
断し、そしてＰＨＯ５遺伝子及び、恩匹夛遺伝子を含有
する得られた３、９ｋｂ断片を調製用グル電気泳動にょ
シ分離する。３．９　ｋｂ　ＢａｍＨＩ（（ｐａ　Ｉ断
片を、ＢａｍＨＩ及びＰｖｔ＋　ＩＩにより切断してお
いたベクター　ｐＢＲ３２２にサブクローニングする。
挿入部としてＰＨＯ５遺伝子及びＰＨＯ３遺伝子を有す
る得られたプラスミドを９２９と称する。
３０μｌのプラスミドｐ２９を制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化する。完全消化の後、
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエ
タノールで沈澱せしめる。ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒ　ｌ
　ｓ　−ＨＣｌ　％　ｌ［Ｊ（８，０の溶液中に０．５
　ｍ９７ｍ１の濃度で再溶解する。
ＰＨ８，０，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０　ｒｎＮＩ　Ｎ
ａＣ２％　　６　ｒｎ）ｌメルカゾトエタノール及び５
ｋｂ句のエチジーウムブロミドの溶液中で、３７℃にて
４５分間部分消化する。フェノール抽出により消化を停
止する。
ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、そして水に１ｍｙ／
ｍｌの濃度で再溶解する。
次の式： ％式％ で表わされるオリゴデオキシヌクレオチドをその５′末
端において燐酸化し、そして例９Ａｂに記載したように
して自己アニールする。燐酸化及びアニールしたすｙカ
ーＤＮＡ４　ｔ４（１４００２モル）を、１４μＪｉ’
（１４０ｐモル）の制限処理されたｐ２９ＤＮＡ（上記
）に、８０　ｐｉの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、　
ｐＨ７，５，１０ｒｒＭＩ　ＭｇＣ２２，３，５ｙｎＭ
　ＡＴＰ　、　　５昂ａｉｔＴＴ及び３２００ＵのＴ４
リガーゼの溶液中で、２０℃にて１６時間連結する。Ｔ
４リガーゼを６５℃にて１０分間不活性化する。１０　
ｍＭ　ＥＤＴＡ　１３００　ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
６，０、及び０．５４容量のイソプロノミノールの存在
下での沈澱により過剰のリンカ−を除去する。ＢａｍＨ
Ｉ及びＸｂａ　１（４Ｕ／μ、９ＤＮＡ）によるＤＮＡ
の消化がマルチプル構造を分解し、そしてＸｂａ）接着
末端に導く。平滑末端Ｒｓａ１部位におけるリンカ−の
付加、及びそれに続くリンカ−のＸｂａ　Ｉ切断のため
、ｐ２９Ｂａｍ　Ｈｌ　−Ｒａｄ　Ｉ制限断片のすべて
がＢａｍＨＩ−Ｘｂａ（断片に転換される。これらを、
１％低融アガロースダル上Ｔｒ１ｇ−＆レートー、ＥＤ
ＴＡ、、　ｐＨ８，３中で分離する。５９５ｂｐｓ　６
３７ｂｐｓ８１１　ｂｐ又は１３１２ｂｐの長さのＢａ
ｍＨＩ−Ｘｂａｉ断片を含有するグルブロックをグルか
ら切シ取る。
グラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｅｃｏ−Ｂａｍをプ
ラスミドｐＧＴ（例２）から誘導する。ｐＧ７を制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１及びＢａｍＨＩにより断片
する。得られたＤＮＡ　Ｉｆ片を調製用電気泳動により
分離する。
２、１　ｋｂ　ＥｅｏＲ１７ＢａｍＨＩ断片を分離する
。このものはＰＨＯ５ＢａｍＨ１部位の上流のフランキ
ング配列を代表する。２．１ｋｂ断片をベクターｐＢＲ
３２２の４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結
する。生ずるグラスミドをｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｅｅ
ｏ−Ｂａｍと称する。
プラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｅｃｏ−Ｂａｍは、
ｒＫ１８ａｍＨＩの上流の７ランキング配列を代表する
２、１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を含有する。
１５４のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで
消化する。
制限断片を０７６チ低融アガロースゲル上Ｔｒｉｓ−ボ
レー）　−ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，３中で分離する。４．
２５ｋｂＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ　Ｉ断片をグルから切シ
取る。
ＤＮＡ断片を含有するグルブロックを６５℃にて液化し
、そして水によりアガロース濃度を０．３％に下げる。
等皐ル量の６３７　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片
及び４．２５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｘｂａ　Ｉペクタ・
−断片を混合し、そして１２５　μｌｌの６０　ｍＭ　
Ｔｒｉｊ−ＨＣｔ、ｐＨ７．５．１０ｎＩＭＭｇＣ４２
，５ｍＭＤＴＴ　、　１　ｍＭＡＴＰ及び６００ＵのＴ
　４　ＤＮＡリガーゼの溶液中で、１５℃にて１６時間
連結する。
１０μｌの連結混合物を、例４＆に記載したように１０
０μｌの形質転換コンぎテン）　シ１ＪＨＢ　１０１細
胞に加える。５個のａｍｐ　”　＝ｒ口二一を別々に１
００μ９７ｍ１のアンピシリンを含有するＩ、Ｂ培地中
で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを、制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断することによ
り、挿入部のサイズについて分析する。正しい挿入部を
有する単一クローンをｐＢＲ３２２／ＰＨ（互Ｂａｍ−
Ｒｓａ６３７と称する。
６３７　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片を５９５　
ｂｐ、　８１１ｂｐ又は１３１２　ｂｐのサイズのＢａ
ｍＨＩ−Ｘｂａｌ　断片によυ置き換えることができる
。予想されたサイズの挿入部を有する単一コロニーを１
）ＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｒａｍ−Ｒｓａ　５９５、ｐＢ
Ｒ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ　−Ｒｓａ８１１及びｐＢＲ
３２２／ＰＨＯＢａｍ−Ｒｓａ　１３１２と称する。
ｂ）合成オリゴデオキシヌクレオチドの付加６３７　ｂ
ｐ　ＢａｍＨｌ−Ｘｂａ　Ｉ断片はＰＨＯ５プロモータ
ー、及び成熟酸性ホスファターゼのコード配列内に６．
３７位のＲ′ｓ＆１部位まで延びるＰＨＯ５シグナル配
列を含有する。ＤＮＡ断片を、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｇ１．ｙ−Ｖａｌ−８ｅｗ−Ｌｅｕ−Ａ＋＋ｐ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする合成オリゴデオキシヌクレ
オチドリンカーを介して成熟ＴＰＡのコード配列にフレ
ーム内に連結する。この配列はまた酵母αファクターの
コード配列の上流にも見出される。
５μ９のプラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒ
ｓａ６３７を制限エンドヌクレアーゼＸｂａｉ　で消化
する。完全消化の後、　ＤＮＡをフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノ−；で沈澱せしめる。
ＤＮＡヲ５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨｓ、ｏ
中に５０ｔ４／ｍｌの濃度に再溶、解し、そして１１Ｕ
のウシ腸アルカリホスファターゼ（ペーリンガー）によ
、Ｑ３７゛’Ｃにて１時間消化する。酵素を６５℃にて
１時間不活性化する。ＤＮＡをＤｇｓ　２　（ワットマ
ン）イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そし
て例９Ａａに記載した方法によジェタノール沈澱する。
次の式： ％式％ で表わされる２つの合成オリゴデオキシヌクレオチドを
、別々にそれらの５′末端において例９Ａｂに記載した
様にして燐酸化する。燐酸化されたオリゴデオキシヌク
レオチドを等モルずつ混合する。
混合物を７５℃にて１０分間加熱し、そして次に一徐々
に室温まで放冷し、そして−２０℃にて貯蔵する。この
リンカ−をリンカ−Ｃと称する。
１μｇ（１２０ｐモル）の燐酸化されアニールされたリ
ンカ−Ｃ及び５μｇ（１，５ｐモル）のＸｂａｌ消化さ
れ脱燐酸化されたｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒｓ
ａ６３７を、４０μ９の６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｔ
。
ｐＨ７，５，１０ｍＶ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ
　、　’　１　ｍＭＡＴＰ、１６００ＵのＴ　４　ＤＮ
Ａ　リガーゼの溶液中で、１５℃にて２０時間連結する
。ＤＮＡリガーゼを８５℃にて１０分間不活性化し、そ
して過剰のリンカ−をイングロノ９ノール沈澱により除
去する。
＋＋ｔマ龜也↓出Ｉｒｌ’％すζ船／ｍｌの濡彦ニ溶解
スル。マルチプルリンカ−を制限エンドヌクレアーゼＢ
ｇ１ｍによる消化により除去する。ＤＮＡをエタノール
で沈澱せしめ、再溶解し、そして次にＢａｍＨＩにより
さらに消化する。制限断片を０．６％低融アガロスダル
上Ｔｒｉ１１−＃レートーＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，３中
で分離する。６６２　ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　Ｉｔ
断片（６３７ｂｐＢａｍＨ７−Ｒ８ＪＩ　Ｉ断片に由来
する）の位置を決定し、そしてダルから切シ取る。
５１１ｊｊＦ）グラ−Ｘ　ミ）”　ｐ３１Ｒ／５Ｓ−Ｔ
ＰＡΔ２を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＢｇ
ｌｌにより消化する。
完全消イビの後、ＤＮＡをエタノールにょシ沈澱せしめ
、そして５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ８，０
、に７５μ籠の濃度で再懸濁する。ＤＮＡ断片を、ＩＵ
のウシ腸由来アルカリ性ホスファターゼ（ページング−
）ＫよＪ）６０μ／の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、
　ｐＨ８，０中で３７℃にて１時間消化することにより
、その５′末端を脱燐酸化する。ホスファターゼを°、
６５℃での１．５時間のインキュベートにょシネ活性能
する。ＤＮＡを、例９Ａａ　Ｋ記載したようにしてＤＥ
５２（ワットマン）イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製する。ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、１０　
ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｔ、　ｐＨ８，０の溶液に再溶解し
、そして０．６％低融アがロースダルに適用する。
５．２ｋｂの大ＢａｍＨＩ−ａｇｉｌ［断片をダルから
切り取る。
それぞれ、ｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡΔ２の５．２ｋｂＢ
ａｍＨＩ−Ｂｇ１１１断片０．１ｐモル、及びｐＢＲ３
２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒｓａ６３７の６６２　ｐｂ　
ＢａｍＨＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片０．２ｐモルを含有す
る２つの低融アがロースグル！ロックを混合し、６５℃
にて液化し、そしてアがロース濃度が０．３％に低下す
るように稀釈する。連結を、１５０μＪの６０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　　Ｉ）Ｈ７，５、１０ｍＭＭｇｅ
：１２．５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　１　ｍＭ　ＡＴＰ及び
８．ρＯＵのＴ４ＤＮＡ　　りが−ゼ（ビオラプス）の
溶液中、１５℃にて１６時間行う６１０μ！及び３０μ
！アリコートを１００μｌの例４ａに記載した形質転換
コンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞と混合する。
６個のａｍｐ　　形質転換コロニーを別々に、１００μ
ｇ／’Ｉｌｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に増殖
せしめる。グラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアー
ゼＢａｍＨＩＫよる切断によって、挿入部のサイズと方
向について分析する。正しい方向の挿入部を有する単一
コロニーをＰ３１／ＰＨＯ５６３７ｃｍＴｐＡと称する
（第２３図を参照のこと）。
さらに、！ラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒ
８ａ　６３７をｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒｓａ
５９５　、ｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒｓａ８１
１８及びｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｂａｍ−Ｒｓａ１３１
２で置き換える。上記と同じ方法に従りて、期待される
サイズ及び方向の挿入部を有する単一クローンを分離し
、そしてｐ３１／ＰＨＯ５５９５Ｃ−ＴＰＡ　。
ｐ３１／ＰＨＯ５８１１Ｃ−ＴＰＡ、及びｐ３１／Ｐｆ
（０５１３１２Ｃ−ＴＰＡと称する。
さらに、リンカ−Ｃを次の式： ％式％ で表わされるリンカ−Ｂで置き換える。リンカ−Ｃにつ
いて上記した方法によって、合成オリがデオキシヌクレ
オチドの燐酸化、アニール、及び対応するＤＮＡ断片へ
の連結を行う。得られたクローンを文字Ｂを付して表示
し、そしてｐ３１／ＰＨＯ５５９５Ｂ−ＴＰＡ、　Ｐ３
１／ＰＨＯ５６３７Ｂ−ＴＰＡ％　Ｐ３１／ＰＨＯ５６
３７８−ＴＰＡ　、　ｐ３１／ｐａｏｓ　８１１８−Ｔ
ＰＡ　及びＰ３１／ＰＨＯ５１３１２Ｂ−ＴＰＡと称す
る。これらの構成においてリンカ〜Ｂはアミノ酸配列Ｌ
ｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする。
さらに、リンカ−Ｃを次の配列： ５’−ＡＡＧＡＧＡＴＣＴＧＣ−３’ ３’−ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧ　−５’を有し、最終構
成（第２４図）においてＬｙｓ−Ａｒｇをコードするリ
ンカ−Ａで置き換える。
リンカ−ＣＫついて記載したのと同様にして合成オリプ
デオキシヌクレオチドの燐酸化及びア二二ルを行う。
リンカ−の付加のため、５μｙのＸｂａｌ切断ｐＢａ３
２２／ＰＩＩＯ５８μｍ−Ｒｓａ６３７を、２Ｕの＊ｌ
Ｖ７−−ｋ”Ｓ、により、５０μｌの３０ｍｔｄｄＦ、
酸ナトリクム、−４，６，２００ｍＭ　ＮａＣ１及び１
　呻ＬＺｎＳＯ４の溶液中で３７℃にて４０分間消化し
て平滑末端を生成せしめる。フェノール／クロロホルム
抽出の後、ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめ、そし
て水に０、２５　’％’／旬の濃度に再溶解する。０．
４μｇ（１２０ｐモル）の燐酸化されアニールされたリ
ンカ−Ａ及び５μｇ（１，５モル）のＸｂａｌ／８１切
断ｐＢＲ３２２／ＰＨＯ５Ｒａｍ−Ｒｓａ６３７を、３
．５　ｍＭ＋７）　ＡＴＰを使用するほかりンカーｑに
ついて記載したのと同様にして平滑末端連結する。その
後の造成を上記のようにして行う。得られたクローンを
文字Ａによって区別し、そしてｐ３１／ＰＨＯ５５９５
Ａ−ＴＰＡ、　ｐ３１／ＰＩ（０５６３７“Ａ−ＴＰＡ
、　ｐ３１／Ｐ）１０５８１１Ａ−ＴＰＡ及び９３１７
例１３〜１５に記載した構成物は、ＰＨＯ５遺伝子のコ
ード領域内への延長を伴う又は伴わないＰＨＯ５プロモ
ーター、グレグロ配列を伴う又は伴ｂないＴＰＡコード
領域、及びタンデム配置のＰＨＯ５転写停止シグナルを
含有し、すべてｐＢＲ３２２由来ベクターに挿入されて
いる。全べての配置を含有するＢａｍＨＩ−Ｈ１ｎｄｌ
ｎ断片を、例１０に同様な反応について記載したように
してｐＪＤＢ２０７の６．４ｋｂＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
Ｉ［［断片に連結する。コンピテントＥ、コリＨＢＩＯ
Ｉ　　細胞を形質転換し、そして各実験からの幾つかの
ａｍｐ　Ｒコロニーを別々に、１００μに勺のアンピシ
リンを含むＬＢ培地に増殖せしめる。！ラスミドＤＮＡ
を、制限エンドヌクレオチドＨｉｎｄｌ［［、ＢａｍＨ
ｌ及びＰｓｔｌで切断すること忙よって分析する。
グラスミドｐ３１／ＰＨＯ５−ＴＰＡ１８、ｐ３１／Ｐ
）１０５−−一響−−−−■■−−−嗜響■關−−鹸−
一一一一−−■■−−−−勝ＴＰＡ４２、ｐ３１Ｒ／５
Ｓ−ＴＰＡΔ２、ｐ　３１　Ｒ／’Ｓ　Ｓ　−ＴＰＡΔ
３、−ＴＰＡから出発して、正しい挿入部を有する次の
クローンを得る。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡ１８ｐＪＤＢ２０７
／ＰＨＯ５−ＴＰＡ４２ｐ、ｒＤＢｚｏ７Ｒ／ｐａｏ５
−ｓｓ−ＴｐＡΔ２ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨＯ５−８８
−ＴＰＡΔ３ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５５９５Ｃ−ＴＰ
ＡｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５６３７Ｃ−ＴＰＡｐＪＤＢ
２０７／ＰＨＯ５８１１Ｃ−ＴＰＡＰＪＤＢ２０７／Ｐ
Ｉ（０５１３１２Ｃ−ＴＰＡＰＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５
５９５Ｂ−ＴＰＡｐＪＤＢ２０７／Ｐ）ＩＯ５６３７Ｂ
−ＴＰＡＰＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５８１１８−ＴＰＡｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５１３１２８−ＴＰＡｐＪＤＢ２
０７／ＰＨＯ５５９５Ａ−ＴＰＡｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
Ｏ５６３７Ａ−ＴＰＡｐＪＤＢ２０７／Ｐ）ＩＯ５８１
１Ａ−ＴＰ入ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５１３１２Ａ−Ｔ
ＰＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　野これらのグ
ラスミドをそれぞれ、例１１に記載゛　ニーＧＲＦ１８
株に導入する。
サツカロミセスφセレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＩ（０５−ＴＰＡ１８サッカロミセス・セレビ
シェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡ
４２ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＩ（０５−８８−ＴＰＡΔ２
ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＩ（０５−ＳＳ′−ＴＰＡΔ３ｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５５９５Ｃ−ＴＰＡＰＪＤＢ２０
７／ＰＨＯ５６３７Ｃ−ＴＰＡサッカロミセス・セレビ
シェーＧＲＦ　１８　／’　　　ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ
Ｏ５８１１Ｃ−ＴＰＡサッカロミセス・セレビシェーＧ
ＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５１３１２Ｃ−ＴＰ
Ａ９゜゛　　サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８
／ｐＪＤＢ２０．７／ＰＨＯ５５９５Ｂ−ＴＰＡｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨＯ５６３７Ｂ−ＴＰＡサッカロミセス・
セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５８
１１８−ＴＰＡサッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１
８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５１３１２８−ＴＰＡサッ
カロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７
／ＰＨＯ５５９５Ａ−ＴＰＡサッカロミセス・セレビシ
ェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨＯ５６３７Ａ−
ＴＰＡテクカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨＯ５８１１Ａ−ＴＰＡサッカロミセス
・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤｇ２０７／ＰＨＯ５
１３１２Ａ−ＴＰＡ例１１及び１２に記載したようにし
て酵母細胞を増殖せしめ、集菌し、そして抽出する。細
胞抽出物中のＴＰＡ活性を例１２に記載した方法により
測定する。結果を第３図に示す。結果を第３表に示す・
　　゛ 以下余白 第３表 異るプラスミドにより形質転換されそして抑制解除条件
（低ｐｉ）上で培養された酵母す、カロＴＰＡ蛋白質コ
ード領域を、二の蛋白質コード領域の位置において酵母
染色体■に入れる。実験的には、これは同時形質転換に
より行う。
ヱユＪ」山辷監乙二ｊ止」ニー五二ＧＲＦｌＳ株を、Ｂ
ａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌ制限切断により線状化され
た２５μＩのプラスミドル３１／ニーＴＰＡ１３、及び
３４の酵母グラスミドＹｅｐ１３　（５１）により同時
形質転換する。２４個のと１　コロニーの内１個がＰｂ
ｏ２−であシそして同時に約３５　Ｕ／ｌ細胞培養物１
０Ｄ６ｏｏのＴＰＡを生産する。この形質転換体をロイ
シン含有培地（ＹＰＤ、　１０９／ＩＪバクト酵母エキ
ス、２０ｇ／／！バクトイプトン、２．０ｊ；！／ｌグ
ルコース）において１０世代増殖せしめることにより、
おそらくグラスミドＹｅｐ１３を喪失しているＬｅｕニ
セグレガント（Ｌｅｇｒｅｇａｎｔ）を１０〜２０％の
頻度で得る。Ｌｅｕニセグレガントから分離された全酵
母ＤＮＡのサザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）分析（５２）
によυ、染色体■のフランキング領域の変化を−わない
でヱ四１蛋白質コード配列がＴＰＡ蛋白質コード配列に
より置き換えられたこと、及びこの菌株がＹｅｐ１３グ
ラスミドＤＮＡを含有しないことが証明される。ＩＱの
菌株を選択し、そしてサッカロミセス・セレビシェーＧ
ＲＦ　１８　（ｐｈｏ５−ＴＰＡ　）と称する。
ｐＪＤＢ　２０７／尺鮫５−ＴＰＡ（ＩＡ）をさらに、
変異によ、ｊｌ）　ＴＰＡ生産について改良し、そして
低い酸性ホスファターゼ活性について選択する。
サッカロミセス・セレビシェーＨ２４３／ｐＪＤＢ２ｏ
７／旦−ＴＰＡ（１Ａ）、すなわちサッカロミセス・セ
レビシェーＧＲＦ　ｌ　８　／ｐＪＤＢ　２０７／力匹
旦−ＴＰＡ（ＩＡ）の温度感受性変異株を−ＵＶ照射（
ｏ、ｏｓμＷｃｒｎ−２，１５秒、９９，２％死滅）に
より得る。コロニーを、１．２Ｍソルビトールで浸透圧
的に安定化したＹＰＤ培地（ｌｏｇ／Ａ！パクト酵母エ
キス、２０１／ｌパクトペグトン、２０９／１１グルコ
ース、２０Ｉｉ／ｌバクドアｙ−＞上で増殖せしめ、そ
してソルビトールを含有しないＹＰＤ培埠上にレプリカ
グレートする。サッカロミセス・セレビシェーＨ２４３
を緩慢、増殖コロニーとして分離する。
サッカロミセス・セレビシェーＨ２４３／ｐＪＤＢ２０
７／：ユ曵５−ＴＰＡ（ＩＡ）の約１０５個の細胞をＹ
ＮＢ−寒天（６，８Ｉ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
　Ｂａ５ｅアミノ酸不含：　２０　ｆｌ／ｉｔグルコー
ス、２０９／ｌバクトアガー、２０１１ｆｌ／７２のヒ
スチジン補充）上にプレートし、そして直接にＵＶ射照
する（０．０８μＷσ、１２秒間）。死滅率９８％。生
存細胞から得られるコロニーを低Ｐｉ培地にレプリカプ
レートし、そして２目抜軟寒天重層法（４８）により酸
性ホスファターゼ活性について染色する。酸−１スレア
ターゼ陰性変異株を３．２　Ｘ　１０−’変異頻度で得
る。
最高のＴＰＡ力価を有する菌株を選択し、そしてサッカ
ロミセス・セレビシェーＨ４２３／ｐＪＤＢ２０７／ヱ
四１−ＴＰＡ（ＩＡ）を得る。
ｐＪＤＢ２０７ろ３臣−ＴＰＡ（１Ａ）により形質転換
された３種類の異る酵母菌株のＴＰＡ活性を第４表に示
す。
以下余白 第４図 菌株の抑制解除条件（低Ｐ＋）下でのＴＰＡ活性ｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡ（ＩＡ）は次のプラスミド
、すなわち宿主生物中での該グラスミドの保持を可能に
するロイシンマーカー、ヒトＴＰＡのための構造遺伝子
、及び限定された量の無機燐酸塩を有する培地（抑制解
除条件）中でＴＰＡ遺伝子を発現せしめる酸性ホス７ア
ターゼヱ［０５プロモーターを含有するプラスミドを担
持する。
菌株は、プラスミドの保持を保証するためにアミノ酸ロ
イシンを欠く限定培地により調製された寒天スラント上
に維持する。新しく接種したスラントを３０℃にて２４
時間培養する。１本のスラントの表面培養物を３祠の前
培養培地に再懸濁し、そしてこれを第−振とうフラスコ
前培養に移す。
５０（ｌｌのフラスコは１個のバッフルを有しゃそして
ｒｏｏｍｌＯ前培養物■を含有する。この培地はＬ−７
スハラギン２．０９７１．Ｌ−ヒスチジン０、０２１１
／１１グルコース１ｏ　Ｉ／Ｊ　Ｎ　ＫＨ２ＰＯ４１，
。
ｇ／ｌ、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ／ｌ、　Ｎａ
Ｃ６ｏ、１ｇ／１１゜Ｃａαｔ、・２Ｈ２００，１ｇ／
ｌ、ビタミン溶液５ｍＶＩｔ及び微量元素溶液５４／ｌ
の組成を有する。
この培地をＮａＯＨによ、９ｐＨ７，２に調整し、その
後殺菌する。グルコース、ビタミン及び微量元素を別々
に殺菌しそして培地に加える。ビタミン及び微量元素の
ストック溶液は次の組成（ｇ／ｌ）を有する。ビタミン
：ピオチンＯ１θ００２、Ｄ−ノ母ントテン酸カルシウ
ム０．０４　、ｉ［０，０００２、ニコチン酸０６０４
、ｐ−アミノ安息香酸０．０２、塩酸ピリドキシン０．
０４、リゲフラビン０．Ｑ２、塩酸チアミン０．０４、
及びイノシトール０．２（脱イオン水中）；微量元素：
硼酸０．０５、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，００４、ＫＩ
ｏ、０１、ＦｅＣｌ３”　６　Ｉ２００．０２、ＭｎＳ
Ｏ４’　４　Ｉ２００．０４、ＮａｚＭｏ０４−２　Ｉ
２００．０２、及びＺｎＳＯ４・７　）Ｉ２０　０．０
４　（脱イオン水中）。
第１前培養物を、５ｍ径、２５０　ｒｐｍの速度の回転
振とり機上、３０℃にて２４時間インキュベートする。
第１前培養フラスコが第２前培養フラスコのための接種
物を提供する。これらのフラスコには１（Ｖ／Ｖ）％の
レベルの接種物を加える。これらのフラスコはｌＯＱｍ
Ａ’の前培養培地■を収容し、そしてこの培地は、酵母
エキス（ディフコ）１０．０９／１−Ｌ−アスノぞラギ
ン６．６１１／１３．　ＫＨ２ＰＯ４１，ＯＮ／ｌ−、
Ｍｇ　ＳＯａ・７　Ｉ２０１．０１１／Ｉｓ　Ｌ−ヒス
チジン０、０２　ｊｉ／ｌ、及びＤ−グルコース（−水
和物）３３．０９／ｌの組成を有する。
脱イオン水を用いて調製される培地は約６．０のμ値を
有する。グルコースは別に殺菌する。培養条件は第１培
養の条件と同一とする。このようなフラ玉コ３本からの
培養物を一緒にして主生産発酵槽のための１　（Ｖ／Ｖ
　）％接種物を得る。
生産発酵槽は約４５／の全容積を有し、そして４板のバ
ッフル及び６枚羽根のディスクタービン攪拌機（直径１
１５＋ｍ）を収容する。攪拌速度を６０　Ｏｒｐｍ、加
圧０．３ｂａｒ、通気速度０．５Ｖ／Ｖ／％とする。こ
の発酵槽は次の組成（ｇ／ｌ　）を有する３０１の培地
を収容する。Ｌ−アスパラギン２．０、Ｌ−ヒスチジン
０．０２、ＫＨ２ＰＯ４０，０３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，５、ＮａＣ１Ｏ，ｌ　、　ＣａＣ４２’　２　Ｉ
２００．１、ＫＣｌ１．０１Ｄ−グルコース（−水和物
）２０．０゜ビタミン溶液５ｍｌ／ｌ、及び微量元素溶
液５　ｍｌ／ｉｔ。
培地は、殺菌前にＮａＯＨを用いてｐＨ７，２に調整す
る。グルコース、ビタミン及び微量元素は別々に殺菌し
、そして培地に加える。ビタミン及び微量元素のスト、
り溶液は前培養培地Ｉについて記載したのと同じ組成を
有する。
発酵温度は３０℃とする。μ値を５．０に下げ、ＮａＯ
Ｈを用いて調節する。約２０時間発酵を行っだ後ＴＰＡ
が最大収量に達する。光学濃度（２〜３ユニツトに達す
る）、及び酸性ホスファターゼ活性が、発酵の進行の有
用な指標となる。発酵ブロスを１０℃に冷去した後酵母
細胞を集菌する。
及び精製 ａ）細胞抽出 ３０１発酵（例１９）の培養液（ｐＨ４）を１０℃に冷
却し、そしてＡｌｆａ−Ｌａｖａｌ　ＢＲＰＸ−２０７
スラツジ除去用遠心分離機により遠心分離する。分離さ
れた細胞を２１の溶解緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２Ｐ０
４．８０ｒｒＬＭＫ２ＨＰＯ４，１５０ｍＭ　ＮａＣｔ
。
０．０１４トウイーン、１０ｍＭベンザミジン、及び１
０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に再懸濁する。溶液を５℃に冷
却し、そして供給速度１０ノ／時においてＤｙｎ。
Ｍｉｌｌ（商標）　（ＫＤＬ−Ｐｉｌｏｔ型）に通す。
装置に直径０．５〜０．７５箇のがラスピーズ５００ｄ
を入れ、そして３０００　ｒｐｍで運転する。懸濁細胞
の適用に先立って、ガラスピーズを、３０Ｗｒ９のＢＳ
Ａを含有する３００−の溶解緩衝液で洗浄する。破砕さ
れた細胞懸濁液を遠心分離しくンルペルローター６５３
．４０分間、９０００　ｒｐｍ　）、そしてベレットを
廃棄する。
ｂ）　　ＤＮＡ消化及び硫酸アンモニウム画分５■のＤ
ＮＡアーゼを２１の清浄にされた懸濁液に加え、そして
混合物を４℃にて３０分間攪拌する。次に、溶液を、（
ＮＨ４）２ＳＯ４に関して３５チ（Ｗ／ｌ飽和にし、そ
して４℃にて１時間攪拌する。溶液を上記のようにして
遠心分離し、そしてすべてのＴＰＡ活性を含有するベレ
ットを、１−のトウ・イーン及び０．１％のＳＤＳを含
有する緩衝液Ａ１１に再懸濁する。懸濁液を４℃にて１
時間攪拌する。
Ｃ）イムノアフィニテークロマトグラフィー５ＷＬｌの
ラビット抗−ＴＰＡ抗体（Ｅ、　Ｒｅ１ｃｈ博士、フリ
ードリッヒーミーセルーインスティテユート、　　　　
　　。
バーセルから供給されたもの）をリジンセフプロ−スカ
ラムに通し、血清からプラスミノーゲンを除去する。
カラムを、１００　ｒｎＮｉ　ＮａＣＬｓ　２．７　ｒ
ｎｋｌ　ＫＣＬ　１８、１　ｍＭ　Ｎ８２ＨＰＯ４、及
び１．５　ｒｙｔＭ　ＫＨ２ＰＯ４を含有するＰＢＳ、
　ｐＨ７，４，１〜２容量で洗浄する。流過液及び洗液
をプールする。固体（ＮＨ４）２Ｓ０４　を最終濃度５
０　（Ｗ／Ｖ　）％に添加することにより、プラスミノ
−ダンが除去された抗血清を沈澱せしめる。溶液を４℃
にて一装置き、そして次に遠心分離する（ツルパルＧＳ
Ａｏ−ター、１２０００ｒｐｍｓ２０分）。沈澱物を少
量のＰＢＳに溶解し、そして０．１−〇ＮａＮ３を含有
するＰＢＳに対して透析する。
この透析溶液からのＩｇＧをプロティンＡセファロース
カラム（５５）上で精製する。
■）抗−ＴＰＡ抗体カラムの調製 １３１号の精製抗−ＴＰＡ抗体を０．１　Ｍ　ＭＯＰＳ
、　ＰＨ７，０に対して透析する。抗体を、製造者の指
示に従って、活性化アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）１０
　（ビオラド）５−に結合せしめる。ダルマトリクスを
、１チトウイーン８０．０．１　％　ＳＤＳ　、　　０
．２　Ｍ　、ＮａＣｔ。
１０ｍＭベンザミジン及びＯ−１％　ＮａＮａを含有す
るＰＢＳにより平衝化する。このマトリクスを５１ｒＬ
ｌＯカラムに充填する。
硫酸アンモニウム画分のベレットを溶解したものを遠心
分離して粒状物を除去しくンルベルＧＳＡローター、３
０分、１２００Ｏｒｐｍ）、そして次に約１０プ／時の
流速で４℃においてアフィニティークロマトグラフィー
に適用する。全容が通過した後、カラムを、ｌＯカラム
容積のＰＢＳ　（０，０５％のトウィーン８０を含有）
で洗浄する。カラムを、０．１チのトウィーンを含むＯ
，１Ｍグリシン−ＨＣｔ。
−２：５溶液により溶出する。２Ｍの画分を取シ、そし
てＲ８ｎｂｙの方法（４９）に従ってＴＰＡ活性につい
て測定する。基質としてＤ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅ　ｕ　−
Ｌｙ　ｓ　−ｐＮＡ（Ｋａｈｉ　Ｓ−２２５１）を使用
する。最高の活性を有する両分をプールし、ＩＭＴｒｉ
ｇ　　を用いて中和し、そしてアミコン千床膜ＹＭＩＯ
を用いる限外濾過により濃縮する。とうして得られたＴ
ＰＡは約９０チの純度を有し、そして還元条件下でのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより証明されるように一鎖形（ｐｒｏ
−ＴＰＡ　）である。非還元条件下での見かけ分子量は
５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６０，０００テある（第２６図
Ａを参照のこと）。
第２６図Ａは酵母遺伝子生成物の５Ｄｓ７ｊ？リアクリ
ルアミドｒル電気泳動図であシ、そして第２６図Ｂは活
性ダル（カゼインプレート）上での酵素活性を示す。こ
の図中人において、レーン１及び４は標準蛋白質（サイ
ズマーカー）に関し、レーン２及び５は黒色腫ＴＰＡに
関し、レーン３及び６は酵母ＴＰＡに関する。レーン１
〜３は還元条件下での泳動図であシ、そしてレーン４〜
６は非還元条件下でのそれである。
サンプルを１２．５％グル上で泳動せしめ、そしてクマ
シーブリリアントブルーを用いて蛋白質を染色した。
第２６図中Ｂにおいて（活性グルについては例２３を参
照のこと）、レーン１′は黒色腫ＴＰＡに関し、レーン
２は酵母ＴＰＡに関す。カゼイン−寒天−プラスミノ−
ダン重層については文献５６を参照のこと。
ｌａｔｉｇｓ’ｉｍａ　）由来の精製ＤＥ−３阻害物質
２６■を、シアノケ°ンブロミドで活性化したセファロ
ース４θ（商標）（ファルマシア）５ｍＪに、製造者の
指示に従って結合せしめる。マトリクスを、０、４　Ｍ
　ＮａＣ４０，１％トリトンＸ−１００（商標）及び０
，０２％ナトリウムアジドを含有する燐酸緩衝化塩溶液
（ＰＢＳ　）、ｐＨ７，４により平衡化する。
次にこのマトリクスを５ｍ１Ｏカラムに充填する。
細胞抽出物を（例２０１Ｌを参照のこと）、ＮＩＬＣ４
に関して０．４ＭとしそしてトリトンＸ−１００に関し
て０．１チとし、そして０．４５μｍ膜（ミリボア）を
通して濾過する。次に、溶液を、４５ｍ１／時の流速、
室温にてＤＥ−３セファロースカラム（上記）゛に適用
し、そして流出液を廃棄する。全容量の細胞抽出液が通
過した後、０．４　Ｍ　ＮａＣ１，及び０．１チドリト
ンＸ−Ｚｏｏを含有する約５ＱｍＪのＰＢＳによりカラ
ムを洗浄し、そして２１ｒＬｌずつの両分を４℃にて集
める。各両分の蛋白質含量を２８’ＯｎｍにおけるＵＶ
吸収により測定する。吸着された蛋白質がシャープなピ
ークとして溶出することが認められる。最高ＵＶ吸収、
及び　　Ｉ−フィブリンアッセイ（４７）で測定した場
合の最高のフィブリン分解活性を含有する両分をプール
し、８ｄの溶液を得、これを−２０℃で貯蔵する。この
ものは、カラムに適用した全活性の約７０〜８０％を示
′低い活性を含有する両分を別にプールする。両プール
中の活性の全回収率は通常９０〜１００％である。
ラフ的精製 酵母細胞抽出物のクロマトグラフィーを例２１ｂに記載
したのと同様にして行う。但し、この方法において塩基
性膵臓トリノシン阻害剤（ＢＰＴＩ）を０、　Ｉ　ＫＩ
Ｕ／ｄで用いる。基質としてＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−ＡＭＣ３を用いる螢光測定法を用いて、精製さ
れた溶液中のＴＰＡ及びｐｒｏ−ＴＰＡ含量を測定する
。
９０％のＴＰＡがグロ酵素形であシ、そして１０％が活
性形である。すなわち、精製中のｐｒｏ−ＴＰＡのＴＰ
Ａへの転換がＢＰＴ）により阻害される。
例２２ＴＰＡからのｐ　ｒ　ｏ−ＴＰＡの分離例２１ｃ
に記載した様にして得られたＴＰＡ及びｐｒｏＴＰＡの
溶液を、０．１チドリトンＸ、−１００を含有する０、
　１　Ｍ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　・ＨＣｌによりｐＨ８，０に
調整し、そしてジインゾロビルフルオロホスフェートに
関して１ｍＭにする。３７℃にて４時間インキュベート
した後、混合物を５ｍｌのＤＥ−３セファロースカラム
（例２１ａを参照のこと）に通す。不可逆的に不活性化
されたＴＰＡを含有する溶出液を廃棄する。
例２１ｂに記載したようにして、カラムを、６カラム容
量のＰＢＳ　（０，４Ｍ　ＮａＣ１及び０．１％トリト
ンＸ−１００を含有する）で洗浄し、そして次に１、６
　Ｍ　ＫＳＣＮ　、　０．４　Ｍ　ＮａＣｔ及び０．１
％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳによって溶出す
る。最高のＵＶ吸収を示す両分をプールする。基質とし
てＣｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（３７）を
用いる螢光分析法においてアミド分解活性が検出されな
いので、このプールは実質上純粋な形でｐｒｏ−ＴＰＡ
を含有する。アミド分解活性及びフィブリン分解活性は
、ｐｒｏ−ＴＰＡを活性酵素に転換するゾラスミンプ処
理することにより再生することができる。
例１９により得られ、そしてＤＥ−３アフイニテイーク
ロマトグラフイー（例２１ｂを参照のこと）によ！Ｊｎ
Ｉ製された酵母ＴＰＡ遺伝子生成物は、フィシリンの非
存在下及び存在下でのチモダンゾラスミノーダンのグラ
スミンへの切断により示されるように酵素的に活性であ
る。酵素活性は、Ｒａｎｂｙ（４９）　（例１２参照の
こと）及びＶｅｒｈｅｆ’ｊｅｎ等（６０）により記載
された色測定により、カゼイングレート及びフィブリン
シレー）　（５６）　上テ、−ｔして　　ニーフィブリ
ノ−ダン固相測定（４７）により示される。カゼイング
レート上での酵素活性を第２６図Ｂ（例２０ｃＩ［Ｉを
参照のこと）に示す。
得られたＴＰＡの酵素活性は一般にフィブリ／により刺
激される。ＤＥ−３アフイニテイークロマトグラフイー
により部分的に精製されたＴＰＡは、放物線速度測定（
ｐａｒａｂｏｌｉｃ　ｒａｔｅ　ａａｓｄｙ　）（Ｒａ
ｎｂｙ　（４９））により測定される。３〜５分間にお
いて反応率ΔＥ対Δｔとして酵素活性を測定する場合、
最適濃度（約１００μｇ／ｍｌ　）のフィブリンによる
刺激は１０〜２０倍である。効果は、ＣＮＢｒ消化（５
７）により得られるフィブリン断片により１、又はバス
ロキソビン（ｂａｔｈｒＯＸＯｂｉｎ　）処理フィブリ
ノ−ダン（５８）により見ることができる。同じ条件下
でウロキナーゼを試験する場合、フィブリン断片による
その活性の刺激は生じない。
ｂ）　　フィブリンプレートへのＴＰＡの結合Ｒｉｊｋ
ｓｎ等（２）により記載されたフィブリン結合試験を適
用する場合、ＤＥ−３７フイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製されたＴＰＡはフィブリン凝固物によく結
合することが見出される。これに対して、クロキナーゼ
は有意にフィシリンに結合しない。−従゛りて、得られ
た酵母ＴＰＡ遺伝子生成物とウロキナーゼとの著しい相
違は、前記がフィブリンに吸着され、その結果グラスミ
ノーダンの活性化が顕著に増強されることである（５９
）。
例２４．酵母ＴＰＡ遺伝子生成物のグリコシル化状態 酵母により生産されたＴＰＡがグリコシル化され、てい
るか否かを見るため、コンカナバリン−Ａセファ゛ロー
ス（商標）カラム（２）に対するその挙動を分析する。
ＤＥ−３セファロースカラム上でのアフィニティークロ
マトグラフィーにより部分精製されたＴＰＡ画分（例２
１ｂを参照のこと）使用する。この画分は１１．５　Ｆ
Ｕ／ｄの活性を有し、これ゛は２．１μＥｌ／ＩＩＩの
ＴＰＡ蛋白質に相当する。
活性画分（３ｄ）を、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔ及び０．０１（
Ｖ／Ｖ）％トウィーン８０を含有する０、ｉ　ＭＴｒｌ
ｓ・ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５により平衡化されたコンカ
ナバリン−Ａセファロース力ラムニ適用する。
通過液中の蛋白質を１画分（約３ゴ）に集める。
カラムを６４の平衡化緩衝液で洗浄した後、マトリクス
に結合した蛋白質を、平衡化緩衝液に加えたα−メチル
マンノシド及びＫＳＣＮを用いて４段階で溶出する。こ
の４段階は、次の溶液０．５１ｎｌずつを用いて逐次的
に行う。
１、平衡化緩衝液中５０　ｍＭα−メチルマンノシド＋
０．２５　ＭＫＳＣＮ ２、平衡化緩衝液中１００ｍＭ　α−メチルマンノシド
＋０．５０　Ｍ　ＫＳＣＮ ３、平衡化緩衝液中２００ｍＭα−メチルマンノシド＋
Ｉ　Ｍ　ＫＳＣＮ ４、平衡化緩衝液中３００ｍＭ　α−メチルマンノシド
＋２　Ｍ　ＫＳＣＮ 段階２及び３において有意なＴＰＡ活性が回収されるが
、低濃度の塩及び糖（段階１）によっては活性は遊離さ
れない。
さらに、幾ちかのＴＰＡ活性が通過画分（上記°）中に
も見出される。
これらの結果は、ＴＰＡが酵母内でグリコシル化′され
ることを示している。しかしながら、活性はさらに流過
液中にも見出され、このことは酵母中で合成されたＴＰ
Ａのすべてが十分にグリコシル化されるわけではないこ
とを示しており、これは低Ｐｉ培地における過剰生産状
態によるであろう。
例２５．非経口的投与のための医療 例２０〜２２に記載したようにして得られたＴＰＡ及び
／又はｐｒｏ−ＴＰＡ含有溶液を、０．０１％のトウィ
ーン８０を含有する０、３Ｍ塩化ナトリウム溶液に対し
て透析し、そして−８０℃にて貯蔵する。投与に先立っ
て、濃度を７５μｇ〜の全ＴＰＡ（すなわちＴＰＡもし
くはｐｒｏ−ＴＰＣ又はＴＰＡ　＋ｐｒｏ−ＴＰＡ）及
び０．３　Ｍ　ＮａＣＬ　Ｋ調整する。この溶液を、０
．２２μｍのメンブランフィルタ−を通して濾過するこ
とにより無菌化する。この方法は、非経口投与、例えば
静脈内投与のためのＴＰＡＩ　　ｐｒｏ−ＴＰＡ　、又
はＴＰＡ十ｐｒｏ−ＴＰＡの溶液の調製のために適当で
ある。
以下余白 参照文献 １、　　Ｓ、Ｔｈｏｒｓｅｎ等＋’Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄ
ｉａｔｈ。
Ｈａｅｍｏｒｒｈ、　２８．６５（１９７２）。
２、　　Ｄ、Ｃ１Ｒｌｊｋｅｎ及びり、　Ｃｏ１１ｅｎ
ｒ　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、２５６．７０３５（１９８１）。
３、　　Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　２５７゜２９２０　（１９８２）。
４、　　Ｐ、Ｗａｌｌ＠ｎ等＋　Ｐｒｏｇｒ、　Ｆｉｂ
ｒｉｎ、５．１６（１９８２）。
５、　　Ｅ、Ｌ、Ｗｉｌｓｏｎ等＊　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅｇ。４０．９３３（１９８０）。
６、　　ＪＬ、Ｗｉｌｓｏｎ等、　Ｂｌｏｏｄ　６１．
５６８（１９８３）。
７、　　Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３０
１．２１４（１９８３）。
８、　　Ｔ、　Ｅｄｌｕｎｄ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　８０．３４９（１９８３）。
９、　　Ｐｅｒ１ｍａｎ等ｖ　Ｐｒｏｃ、Ｎ５ｔｌ、　
Ａｃａｄ、Ｓｃｊ。
ＵＳＡ　７９．７８１（１９８２）。
１０、　Ａ６Ｍ、　Ｍａｘａｍ等＃　ｉｎ　’Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　　　　　　　　　　’Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ”、　ｖｏｌ、６５＋　ｐ、　４９９１Ｎｅ＊Ｙｏ
ｒｋ　１９８０゜ １１、Ｊ、Ｌｏｄｄａｒ＋　　“Ｔｈｅ　　Ｙｅａｓｔ
ｓ”Ｊ　Ａｒｎｓｔｅｒｄａｍ゛１９７１゜ １２、　Ａ、Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　７５．１９２９（１９７８）。　　　　　１３
、　Ａ、Ｉ（ｉｎｎｅｎ等ｙ　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　
Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。
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２　、ｐ、１６９．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８０゜２０
、　　Ｂ、　Ｈｏｈｎ　ｉｎ　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ”。
ｖｏｌ、６８．ｐ、２９９．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　　１９
７９゜２１、　Ａ、　Ｈｉｎｎｅｎ等″Ｅｕｋａｒｙｏ
ｔｉｃ　Ｇｅｎ５　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”＋ｖｏ１．
Ｉ４１　ｐ、４Ｌ　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７９゜２
２、Ｊ、Ｄ＋　Ｂｅｇｇｓ　　Ｇａｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒ１ｎｇ＋ｖｏｌ、　　２．　　ｐ、　　１７
５７　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８１゜２３、　　Ｊ１
Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　　ｔ’ｈｓ　　３ｒｄ　　Ｃｌａｖ
ｅｌａｎｄＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｓ：Ｒａｃｏｍｂｊｎａｎｔ　ＤＮＡ　（
ａｄ、Ａ、Ｗａｌｔｏｎ）ｚｇｌｓｅｖｌｅｒ＋　　Ａ
ｍｓｔｅｒｄａｍ　１９８Ｌ　　ｐ、１４３゜２４、　
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ＢＯ−ｃｏｕｒｓｅ　ｍａｎｕａｌ　）＃１９８１゜３
９、ｍａｎｕａｌ　”Ｍ１３　ｃｌｏｎｌｎｇ　ａｎｄ
ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ１１７１１ｊ６１ｎ＃、
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ｍ、Ｓｏｃ、９７ａ７３２７　　（１９７５）。
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、Ｔ１Ｍａｎｉａｔｉｓ＋　　Ｅ、Ｆ、　　Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ＋Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
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ｍｅｎｔａｌ　ｂｉｏｌｏｇｙｕｓｉｎｇ　ｐｕｒｉｆ
ｉｅｄ　　ｇｅｎｅｓ”＋　　ＩＣＮ−ＵＣ１Ａｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ　　ｏｎ　　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ａｎ
ｄ　　ｃｅｌｌｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ＋　　ｖｏｌ、
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１ｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　７６．１０３５　　（１９７９）。
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ａｓＪｓ　ＩＬ３０１　　（１９８３）。
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、　Ｃｈｅｍ、　２５Ｌ２０８０　　（１９８４）。
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ｍｂｏｓｌａＲｅｓｅａｒｃｈ　３１，４２７　　（１
９８３）。
５９、　Ｐ、　ＷａｌｌＱｎ、　Ｐｒｏｇｒ、　Ｃｈｓ
ｍ、　ＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏｌｙｓ
ｌｍ、３，１６７　（１９７８）。
６０、Ｊ、ＨｏＶｅｒｈａｉｊｅｎ等−Ｔｈｒｏｍｂ、
Ｈａａｍｏｓｔ。
４８．２６６　　（１９８２）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、それぞれＰＨＯ５ａ公子の分離源として、又
はＤＮＡ配列決定のために使用されるグラスミドｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＨＯ５、ＰＨＯ３及びｐａａ３ｚｚ／ｐｕ
ｏ５Ｒａｍ−８ａｌの部分的制限エンドヌクレアーゼ地
図である。 第２図は、酵母遺伝子ライブラリーから分離しのブロモ
−ター領域のＤＮＡ配列を示す。 第４図は、ハイプリトノラスミドｐ３０の造成を示す略
図である。 第５図は、ＰＨＯ５停止断片を含有するグラスミドｐ３
１の造成の略図である。 第６図は、Ｓａｕ　３Ａ−Ｐｇｔｌ　ＰＨＯ５転写停止
断片のヌクレオチド配列を示す。 第７図は、発現！ラスミドル３１中のＰ［（０５シダナ
ル配列を除去する方法の概略を示し、そして特にグラス
ミドｐ３１／Ｒの造成を示す。 第８図は、第７図に示した方法によって得られたクロー
ンの集ブリである。 第９図及び第１０図は、ＰＨＯ５／Ｒ及びＰｆ（０５／
Ｙプロモーター領域を含有するＲａｍ　Ｉ（ｌ−Ｅｃａ
　Ｒ１制限断片のヌクレオチド配列を示す。 第１１−１〜１１−４図は、Ｈｅｌａ細胞から分離した
ＴＰＡｃＤＮＡのＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列
を示す。 第１２図は、クローニングベクターＭ１３ｍｐ９／ＰＨ
Ｏ５−ＴＰＡの造成の概略である。 第１３図は、ＰＨＯ５シグナル配列を含む！ラスミドｐ
Ｊｌ）Ｂ２０７／Ｐ！（０５−ＴＰＡ（ＩＡ）の造成を
示す。 菓１４図は、短縮されたＰＦ（０５転写停止断片を含有
するグラスミドｐＪｒ）Ｂ２０７／ＰＨＯ５−ＴＰＡΔ
の造成第１６図は、ハイシリトノラスミド９３１Ｒし′
ＴＰＡ（１２−２）、シグナル配列を伴わない構成物の
造成を示す。成熟ＴＰＡのコード配列がＰＨＯ５ｆロモ
ーターに連結される。 第１７図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７ｆ’Ｕ／ＰＩ（
０５−ＴＰＡ（１２−２）の造成を示す略図である。 第１８図は、プラスミドｐ３１／Ｐｍｏ５−ｒｐＡｔ８
ｆ）造成を示す。 第１９図は、プラスミドｐ３１／Ｐ［（０５−ＴＰＡ１
８中のＰＨＯ５シグナル配列と成熟ＴＰＡのコード領域
の連結部を示す。 第２０図は、ｐｒｅｐｒｏ−ＴＰＡコード領域の部分を
含有するＩ）ＮＡ断片の分離の概略である。 第２１図は、ノラスミ）ｌ”　ｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡ
Δ２の造成を示す〇 第２２図は、中間体グラスミド０１）ＢＲ３２２／ＰＨ
Ｏ５ＢａｍＲｓａ６３７の造成を示す。 第２３図は、Ｐ）ＩＯ５コ〜ド領域に延びたＰＨＯ５シ
グナル配列を有するグラスミド０の造成を示す。 第２４図は、リンカ−Ａ、Ｂ又はＣを介する、ＰＨＯ５
プロモーター及びＰ）（０５コード配列と成熟ＴＰＡの
コード配列との連結を示す略図である。 第２５図は、　ＴＰＡ遺伝子によるＰＨＯ５遺伝子の染
色体置換の略図である。 第２６図において、Ａは酵母ＴＰＡ遺伝子生成物のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドｒルグル気泳動図であり、そして
Ｂは活性ｒル（カゼ−イングレート）上でのその酵素活
性を示す。 図中に使用されている記号等はそれぞれ次の意味を有す
る。 −ｐｓａ　；％２２配列 ｏｍｔｎ　　酵母染色体ＤＮＡ由来Ｐ［（０３、ＰＴ（
０５領域二　酵母２μ！ラスミｌ’　ＤＮＡ 三三三　酵母染色体ＤＮＡ由来ＬＥＵ２領域ａｍρ　　
アンピシリン耐性遺伝子 ｔｅｔ　　　アトラサイクリン耐性道公子ｐｆロモータ
ー領域 ｔ　　　転写停止領域 ＝工＝　制限部位の除去 ■−■　ＴＰＡ遺伝子 ！　　ｐＢａ　３２２中の除去 ↓ ＝＝＝　　制限部位 ＝＝＝　　転写の方向 酬＝ト　リンカＤＮＡ区間

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、酵母プロモーター及び該プロモーターにより制御さ
    れる組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域を
    含んで成る酵母ハイブリドベクター。 ２、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域が
    ヒトに由来する特許請求の範囲第１項記載の酵母ハイブ
    リドベクター。 ３、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域が
    、ヒト黒色腫細胞、線維肉腫細胞、表皮癌細胞、膀胱癌
    細胞、副腎腫細胞、脂肪肉腫細胞、Ｈｅｌａ細胞、線維
    芽細胞、角質細胞、乳房上皮細胞及び胎性腎細胞から成
    る群に由来する特許請求の範囲第１項記載の酵母ハイブ
    リドベクター。 ４、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域が
    Ｈｅｌａ細胞に由来する特許請求の範囲第３項記載の酵
    母ハイブリドベクター。 ５、プロモーターが外的に制御され得る特許請求の範囲
    第１項記載の酵母ハイブリドベクター。 ６、プロモーターが酵母￥ＰＨＯ５￥プロモーターであ
    る特許請求の範囲第１項記載の酵母ハイブリドベクター
    。 ７、酵母プロモーターが、連結部に挿入されたＡＴＧ翻
    訳開始シグナルを伴って成熟組織プラスミノーゲンアク
    チベーターコード領域に直接連結されている特許請求の
    範囲第１項記載の酵母ハイブリドベクター。 ８、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域が
    シグナル配列に先行されている特許請求の範囲第１項記
    載の酵母ハイブリドベクター。 ９、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域が
    ￥ＰＨＯ５￥シグナル配列に先行されている特許請求の
    範囲第８項記載の酵母ハイブリドベクター。 １０、組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域
    が組織プラスミノーゲンアクチベータープレプロ配列に
    より先行されている特許請求の範囲第１項記載の酵母ハ
    イブリドベクター。 １１、酵母プロモーターが該プロモーターにより天然に
    制御される遺伝子のコード領域に延びており、そして酵
    母エンドペプチダーゼのためのプロセシング部位を含有
    する合成リンカーを介して組織プラスミノーゲンアクチ
    ベーターコード領域に連結されている特許請求の範囲第
    １項記載の酵母ハイブリドベクター。 １２、酵母プロモーター及び延長されたシグナル配列が
    ￥ＰＨＯ５￥遺伝子に由来する特許請求の範囲第１１項
    記載の酵母ハイブリドベクター。 １３、組織プラスミノーゲンアクチベーターの転写が酵
    母遺伝子の転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列にお
    いて停止する特許請求の範囲第１項記載の酵母ハイブリ
    ドベクター。 １４、プラスミドｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰ
    Ａ（１Ａ）、ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡΔ
    ２、ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡΔ３、及び
    ｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ（１２−２）
    から成る群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載のハ
    イブリドベクター。 １５、プラスミドｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰ
    Ａ１８、ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ４２、
    ｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨＯ５￥−ＳＳ−ＴＰＡΔ２、
    ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥５９５Ａ−ＴＰＡ、ｐＪ
    ＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥５９５Ｂ−ＴＰＡ、ｐＪＤＢ
    ２０７／￥ＰＨＯ５￥５９５Ｃ−ＴＰＡ、ｐＪＤＢ２０
    ７／￥ＰＨＯ５￥６３７Ａ−ＴＰＡ、ｐＪＤＢ２０７／
    ￥ＰＨＯ５￥６３７Ｂ−ＴＰＡ、及びｐＪＤＢ２０７／
    ￥ＰＨＯ５￥６３７Ｃ−ＴＰＡから成る群から選ばれる
    特許請求の範囲第１項記載のハイブリドベクター。 １６、酵母プロモーター及び該プロモーターにより制御
    される組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域
    をベクターＤＮＡに導入することを含んで成る、酵母プ
    ロモーター及び該プロモーターにより制御される組織プ
    ラスミノーゲンアクチベーターコード領域を含んで成る
    酵母ハイブリドベクターの製造方法。 １７、酵母プロモーター、該プロモーターにより制御さ
    れる組織プラスミノーゲンアクチベーターの遺伝子、及
    び酵母遺伝子の転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列
    を含んで成るＤＮＡセグメント。 １８、プロモーター、及び転写停止シグナル含有ＤＮＡ
    配列が￥ＰＨＯ５￥遺伝子に由来する特許請求の範囲第
    １７項記載のＤＮＡセグメント。 １９、酵母プロモーター及び該プロモーターの制御のも
    とにある組織プラスミノーゲンアクチベーターコード遺
    伝子を含んで成るハイブリドベクターにより形質転換さ
    れた酵母宿主、及び酵母染色体に安定に組み込まれてお
    りそして染色体性酵母プロモーターの制御下にある組織
    プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子を有する酵母宿
    主、並びにこれらの変異株から成る群から選ばれた形質
    転換された酵母宿主。 ２０、酵母がサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃ
    ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である特
    許請求の範囲第１９項記載の形質転換された酵母。 ２１、サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ（１Ａ）、サッカロ
    ミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥
    ＰＨＯ５￥−ＴＰＡΔ１、サッカロミセス・セレビシェ
    ーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ
    Δ２、サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡΔ３、サッカロミセ
    ス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨ
    Ｏ５￥−ＴＰＡΔ４、及びサッカロミセス・セレビシェ
    ーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰ
    Ａ（１２−２）からなる群から選ばれた特許請求の範囲
    第１９項記載の形質転換された酵母。 ２２、サッカロミセス・セレビシェーＧＲＦ１８／ｐＪ
    ＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ１８株、ＧＲＦ１８
    ／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥−ＴＰＡ４２株、ＧＲ
    Ｆ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／￥ＰＨＯ５￥−ＳＳ−ＴＰ
    ＡΔ２株、ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥
    ５９５Ａ−ＴＰＡ株、ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥
    ＰＨＯ５￥５９５Ｂ−ＴＰＡ株、ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ
    ２０７／￥ＰＨＯ５￥５９５Ｃ−ＴＰＡ株、ＧＲＦ１８
    ／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥６３７Ａ−ＴＰＡ株、
    ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ５￥６３７Ｂ−
    ＴＰＡ株、及びＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／￥ＰＨＯ
    ５￥６３７Ｃ−ＴＰＡ株から成る群から選ばれた特許請
    求の範囲第１９項記載の形質転換された宿主。 ２３、染色体に組込まれた組織プラスミノーゲンアクチ
    ベーター遺伝子を有し、そしてサッカロミセス・セレビ
    シェーＧＲＦ１８（ｐｈｏ５−ＴＰＡ）である特許請求
    の範囲第１９項記載の宿主。 ２４、組織プラスミノーゲンアクチベーターを生産する
    ことができる形質転換された酵母細胞の製造方法であっ
    て、酵母プロモーター及び該プロモーターにより制御さ
    れる組織プラスミノーゲンアクチベーターコード領域を
    含んで成るハイブリドベクターにより酵母を形質転換し
    、又は組織プラスミノーゲンアクチベーターの遺伝子を
    酵母染色体に組込むことを含んで成る方法。 ２５、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロ−組
    織プラスミノーゲンアクチベーター又はこれらの混合物
    （ここで、組織プラスミノーゲンアクチベーター及びプ
    ロ−組織プラスミノーゲンアクチベーターはグリコシル
    化形もしくは非グリコシル化形、又はこれらの形の混合
    物として存在する）の製造方法であって、酵母プロモー
    ター及び該プロモーターにより制御される組織プラスミ
    ノーゲンアクチベーターコード領域を含んで成るハイブ
    リドベクターにより形質転換された酵母菌株、もしくは
    酵母染色体に安定に組込まれておりそして染色体性酵母
    プロモーターの制御下にある組織プラスミノーゲンアク
    チベーターの遺伝子を有する酵母菌株、又はこのような
    酵母菌株の変異株を適当な栄養条件下で培養し、そして
    前記蛋白質を分離し、そして精製し、そして所望により
    得られた組織プラスミノーゲンアクチベーター及びプロ
    −組織プラスミノーゲンアクチベーターの混合物を個々
    の成分に分離し、そして、プロ−組織プラスミノーゲン
    アクチベーターを含有しない組織プラスミノーゲンアク
    チベーターを製造するために生成したプロ−組織プラス
    ミノーゲンアクチベーターを組織プラスミノーゲンアク
    チベーターに転換し、そして所望により混合物として得
    られた非グリコシル化生成物からグリコシル化形を分離
    し、そして、グリコシル化蛋白質を含有しない非グリコ
    シル化蛋白質を製造するために、得られた蛋白質におい
    てグリコシル残基を除去する各段階を含んで成る方法。 ２６、酵母が特許請求の範囲第１項〜第１５項のいずれ
    かのハイブリドベクターによって形質転換され、又は酵
    母が染色体に組込まれたＴＰＡ遺伝子を含有する特許請
    求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、酵母がサッカロミセス・セレビシェーである特許
    請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８、酵母を、資化性の炭素源、窒素源及び無機塩を含
    有する液体培地中で培養する特許請求の範囲第２５項記
    載の方法。 ２９、組織プラスミノーゲンアクチベーター及びプロ−
    組織プラスミノーゲンアクチベーター、並びにこれらの
    混合物を、ＤＥ−３セファロースカラム上での選択的吸
    着によって培養液から分離する特許請求の範囲第２５項
    記載の方法。 ３０、組織プラスミノーゲンアクチベーター及びプロ−
    組織プラスミノーゲンアクチベーター、並びにこれらの
    混合物を、モノクローナル抗体を用いるアフィニティー
    クロマトグラフィーにより培養液から分離する特許請求
    の範囲第２５項記載の方法。 ３１、得られたプロ−組織プラスミノーゲンアクチベー
    ターを酵素的に組織プラスミノーゲンアクチベーターに
    転換する特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ３２、精製過程にプロテアーゼ阻害剤を導入し、そして
    ＤＥ−３セファロースカラム上でのクロマトグラフィー
    を組織プラスミノーゲンアクチベーターとのみ選択的に
    結合する阻害剤の存在下で行って組織プラスミノーゲン
    アクチベーターを実質上含有しないプロ−組織プラスミ
    ノーゲンアクチベーターを製造する特許請求の範囲第２
    ５項記載の方法。 ３３、グリコシル化生成物と非グリコシル化生成物とを
    コンカナバリン−Ａセファロースカラム上でのクロマト
    グラフィーにより分離する特許請求の範囲第２５項記載
    の方法。 ３４、酵母特異的グリコシル化を有する組織プラスミノ
    ーゲンアクチベーター、プロ−組織プラスミノーゲンア
    クチベーター及びこれらの混合物。 ３５、サッカロミセス・セレビシェーに特異的なグリコ
    シル化を有する特許請求の範囲第３４項記載の組織プラ
    スミノーゲンアクチベーター、プロ−組織プラスミノー
    ゲンアクチベーター及びこれらの混合物。 ３６、酵母特異的グリコシル化を有する組織プラスミノ
    ーゲンアクチベーター、プロ−組織プラスミノーゲンア
    クチベーター又はこれらの混合物を医薬として許容され
    る担体と共に含んで成る医薬。
JP59243529A 1983-11-21 1984-11-20 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−遺伝子 Pending JPS6119489A (ja)

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