JPS63294789A - ベクタ−、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法 - Google Patents

ベクタ−、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法

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JPS63294789A
JPS63294789A JP62130798A JP13079887A JPS63294789A JP S63294789 A JPS63294789 A JP S63294789A JP 62130798 A JP62130798 A JP 62130798A JP 13079887 A JP13079887 A JP 13079887A JP S63294789 A JPS63294789 A JP S63294789A
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gene
protein
restriction enzyme
vectors
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JP62130798A
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Tomomasa Kanda
智正 神田
Kaoru Saigo
薫 西郷
Ichiro Shibuya
一郎 渋谷
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NIKKA UISUKII KK
Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Original Assignee
NIKKA UISUKII KK
Nikka Whisky Distilling Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はベクター、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現
方法に関する。
ここでいう蛋白質とは、アミノ酸を複数個含むポリペプ
チドを指すものである。
［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、より優れた技術開発か大いに期
待されている。以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵素
）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々の
発展が期待されている。
従来、外来遺伝子のクローニングおよび蛋白質の発現用
として、大腸菌を宿主とするｐＵＣベクターか市販され
ている。このｐＵＣベクターは第２図に示すように、複
製開始信号（Ｏｒｉ）　、アンピシリン耐性遺伝子、ラ
クトースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ｌ　ａｃＺ’）およびマルチクローニン
グサイトより構成されている。このＰＵＣベクターは、
ジデオキシ法によるＤＮＡシークエンシングに適したプ
ラスミドベクターであり、１ａｃＺ’領域内にマルチ７
クローニングサイトを持っており、イソプロピルβ−チ
オ−ガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）と５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−ｇ
ａｌ）を含むプレート上で、外来ＤＮＡ（目的とするＤ
ＮＡ）の挿入の有無を容易に色の変化（青→白）によっ
て判別することができるものである。また、ラクトース
プロモーターを利用して外来遺伝子を発現することもで
きるものである。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、従来のｐＵＣ系ベクター（ｐＵＣ８，９
，１８，１９，１１８，１１９等）においては、各マル
チクローニングサイト部分が全く共通であり、各サイト
に外来遺伝子が挿入された場合、フレームが合う確率が
ｌ／３しがなく、残りの２／３はフレームが合わずに蛋
白の発現が不可能になるという欠点があった。
又、マルチクローニングサイトのフレームが１個及び２
個ずれた公知のｐｔｒｃｓ−ｔ、８−２゜９−１．９−
２ベクターにおいては、ｐＵＣ８゜９と組合わせて、外
来遺伝子のフレームをいずれかで合わすことが可能であ
るが、ＤＮＡ塩基配列のパリンドローム（回分）が長く
なり、２次構造を形成することとなり、発現効率が低下
するほか、ジデオキシＤＮＡシーフェンス時に正確に読
み難くなるという欠点があった。
更に、ｐＵＣ８−１，８−２，９−１，９−２の欠点を
解決するために、ｐｕｃｔｓ、１９゜１１８．１１９を
用いてフレームを１個及び２個ずらそうとした場合、い
ずれの場合においてもマルチクローニングサイト内に終
止コドンが生じ、蛋白が発現されないという欠点があっ
た。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は上記従来における問題点を解決した、新規なベ
クターとそれを用いた遺伝子の検出方法を提供すること
を目的とする。そして、その目的は、本発明によれば、
複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３ファー
ジＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペレータ
ー、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素口ｎｄ［
、Ｐｓｔ　Ｉ　。
Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃｎ　、Ｂａ５ＨＩ、
ＳｍａＩ　、Ｅｃｏ旧の各切断部位を持つマルチクロー
ニングサイトを有してなるベクター（第１発明）、複製
開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３ファージＤ
ＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペレーター、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素口ｎｄｍ　、
ＰｓｔＩ＊　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧ｎｃｌＩ　、
Ｂａ５ｌ（Ｉ、Ｓｓａ　Ｉ　、ＥｃｏＲｒの各切断部位
を持つマルチクローニングサイトを有してなるベクター
３種類からなるベクターシリーズであって、該ベクター
シリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレーム
を３種類すべて有するものであるベクターシリーズ（第
２発明）、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ
１３ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、
オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵
素旧ｎｄ、ｍ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃ
ｌ、旧ｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩ
の各切断部位を持つマルチクローニングサイトを有して
なるベクター３種類からなるベクターシリーズであって
、該ベクターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応
するフレームを３種類すべて有するものであるベクター
シリーズの中から所望のベクターを選択し、そのベクタ
ーおよび蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制限酵
素にて切り出した後両者を結合することにより、色の変
化を判別して蛋白質をコードしている遺伝子を検出する
ことを特徴とする特定遺伝子の検出方法（第３発明）、
および複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３
ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペ
レーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素旧
ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｄ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧
ｎｃＩＩ　、Ｂａ５ＨＩ、Ｓｇ＊ａＩ　、Ｅｃ。
Ｒ１の各切断部位を持つマルチクローニングサイトを有
してなるベクター３種類からなるベクターシリーズであ
って、該ベクターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて有するものであるベク
ターシリーズの中から蛋　　　゛白質をコードしている
遺伝子の５′末端のフレームの合うベクターを選択し、
所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合し、大腸菌
に導入し、蛋白質を発現することを特徴とする特定蛋白
質の発現方法（第４発明）、により達成することができ
る。
本発明のベクターの特徴は、クローニングサイトとして
制限酵素旧ｎｄＩＩ［、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、
ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、ＳｍａＩ　、Ｅ
ｃｏＲＩの各切断部位の塩基配列を有していることであ
る。
このベクターの一例は、第１図に示す如く、複製開始信
号、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’）、Ｍ１３ファ
ージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペレー
ター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＪｌａｃＺ’）及
びクローニングサイトとしての制限酵素旧ｎｄｍ　、Ｐ
ｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃ［、ＨｉｎｃＩＩ　
、Ｒａｍ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩
基配列から構成されているものであり、この場合、−末
鎖プラスミドが直接回収てき、ジデオキシ法によるＤＮ
Ａシーケンシング及び部位特異的突然変異体作成が容易
になるという利点がある。
本発明のベクターは、従来公知のＰＵＣ１１８／ｐＵｃ
１１９ベクター（宝酒造■販売）のマルチクローニング
サイトを、同じく公知のｐＵＣ８／ｐＵＣ９ベクター（
宝酒造■販売）のマルチクローニングサイトに置換えた
もの、およびそのマルチクローニングサイトのアミノ酸
のフレームを１塩基（−１）ずらしたもの、さらに２塩
基（−２）ずらしたものである。これらベクターのマル
チクローニングサイトを第１表に示す。
本発明のベクターは、前記の通り、マルチクローニング
サイトとして制限酵素器ｎｄｍ　、Ｐｓｔ　Ｉ　。
Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、ｆｌｉｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧
、ＳｍａＩ　、Ｅｃｏ旧の各切断部位の塩基配列を有し
ており、また、前記切断部位のアミノ酸に対応するフレ
ームを３種類すべて取り揃えてベクターシリーズとし、
且ついずれのベクターにおいてもマルチクローニングサ
イト内にストップコドンを有しないことを特徴としてい
る。
［発明の効果］ このベクターおよびベクターシリーズを用いることによ
り、蛋白質をコードしている遺伝子を検出することがで
きる。すなわち、ベクターシリーズの中から所望のベク
ターを選択し、そのベクター及び目的の蛋白質をコード
する遺伝子を所定の制限酵素により切断し、ＤＮＡリガ
ーゼ等の連結酵素により結合すると、色の変化を判別す
ること、例えば白０青により蛋白質をコードしている遺
伝子を検出することができる。
さらに、本発明のベクターおよびベクターシリーズによ
れば、蛋白質をコートしている遺伝子の５′末端のフレ
ームの合うベクターを前記ベクターシリーズから選択し
、所定の制限酵素にて切り出した後、両者を結合し、大
腸菌に導入することにより蛋白質を発現させることが可
能になるという利点を有する。
［実施例］ 以下１本発明を実施例に基いて、詳細に説明する。
まず、本発明のベクターの作成方法から説明する。
■　ＵＣ１０９０の １）プラスミドｐＵＣ９（ｌｏｇｇ）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄＩ［Ｉ（５０４１位）
を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、分解産物を
０．７％アガロース電気泳動を用いて分離しＥｃｏＲ■
切断部位から旧ｎｄＩＩＩ切断部位までのポリリンカー
断片（３０塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処
理を行なうことにより精製した。
２）プラスミドｐＵｃ１１９　（１０ｇｇ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄＩＩ［（５０単
位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、分解産
物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離しＥｃｏ
ＲＩ切断部位から旧ｎｄｍ切断部位までのポリリンカ一
部分を含まない断片（約３，１００塩基対）をゲルより
切り出し、フェノール処理を行なうことにより精製した
。
３）１）で得られたポリリンカー断片０．０１１Ｌｇと
２）で得られたポリリンカーを含まない断片０．１ｋｇ
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４℃
にて一昼夜反応させることにより連結反応を行なった。
４）３）で得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、ｒｐｓＬ、φ８０
　、１ａｃＺΔＭｔＳ）を用いて形質転換を行ない、受
容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｍ１当り１１
００ＩＬ含むＬ寒天培地（組成：ｌｉ当りトリプトン１
０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ｐＨ７，５）
に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行ないいくつかのコ
ロニー（形質転換体）を得た。
５）コロニーの一つをアンピシリンを１ｒｎＪｌあたり
１１００ＪＬ含むＬ液体培地１０ｍＭに移植し、３７°
Ｃにて１２時時間上う培養を行ない、アルカリ−５ＤＳ
法によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＵｃ
１０９０を得た。
■ｐＵｃ１０８０の作成方法 ■ＰＵＣ１０９０の作成方法のうち、１）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐＵＣ８を、又２）のプラスミドＤＮＡと
してｐＵｃ１１８を用いることにより、同様の操作を経
て、プラスミドｐＵｃ１０８０を作成した。
次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ｐＵｃ１０９０とＰＵＣ１０９１，ｐｔｒＣ１０９２の
関係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をは
さんで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものが
ｐＵｃ１０９１で、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分
をはさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させたも
のがｐＵＣ１０９２である。また、ｐｕｃｔｏａｏとｐ
ｕＣ１０８１，ｐＵｃ１０８２の関係も、上記と同様で
ある。
■ｐＵｃ１０９１の作成方法 ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。
１）ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成 ３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成 ６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ｐｕｃ
■−１） ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。
Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、（φ８０，
１ａｃＺ　６Ｍ１５）、Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）：１０
６：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、Ｆ’　　：ｔｒａＤ３６
．ｐｒｏＡＢ。
１ａｃｌＱＺΔ旧５）を用いて形質転換を行なった。
■形質転換体を、アンピシリンを１ｍＪ１当り１１００
ＩＬ含む２ＸＹＴ液体培地（組成：１文当りトリプトン
１６ｇ、イーストエキスｌｏｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，６
）１０ｍＪ１に植菌し、３７°Ｃにて１２時時間上う培
養を行なった。
■　■で得られた培養液１００ＪＬｉに、Ｍ１３に０７
由来のへルバーファージ液（１０”ｐｆｕ／ｍ　ｌ）を
加え、３７℃で３０分間静置した後、アンピシリンを１
　ｍ　ｌ当り１５０μｇ、カナマイシンを１ｍＪｌ当り
７０ＩＬｇ、チアミンを０．０１％含む２ＸＹＴ液体培
ｔ＃Ａ１０　ｍ　ｌに加え、３７６Ｃにて２４時間振ど
う培養を行なった。
■培養液１ｍＪｌを取り、遠心分離により菌体を除いた
後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣ文混合溶
液を２００ｇＪＬ加え遠心分離を行なうことにより、フ
ァージ粒子を沈殿させた。以下、フェノール処理、クロ
ロホルム処理、エタノ−ル沈殿処理を行なうことにより
、１＊ｆｉＤＮＡを分離精製し、最終的に５０ＩＬ文の
ＴＥ温溶液１０ｍＭ）リス塩酸、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、
ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。
収量は約２〜１０ＩＬｇ程度であった。
■−２） 変異部分を含む合　ＤＮＡの作成 りＮＡ合成機を用いて第２表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７℃にて１時間反応を
行ない、５′末端部分をリン酸化させ、プライマーＤＮ
Ａとした。
■−３） ポリリンカー前うに　　を　　る　、　　　の■−１）
で得られた一水銀ＤＮＡＩ用ｇと、■−２）で得られた
ブライマーＤＮＡ　　２０ｐｍｏ文を混合して６０℃で
３０分間、引続き３７℃で３０分冊保温し、アニーリン
グさせた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰ
を最終濃度が各々０．５ｍＭとなるように加え、および
ＡＴＰを２５ｐｍｏｕ加え、クレノー（ＫＬＥＮＯＷ）
酵素（４単位）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単位）を用
いて３７℃にて３時間反応を行ない、突然変異部分を含
む２本ｊ０ＤＮＡを合成した。
次に、反応生成物の一部（約０．１ｐｇ）を大腸菌ＪＭ
８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１．５
％寒天、アンピシリンを１ｍＪｌ当り１１００１Ｌ及び
Ｘ−ｇａｌをｏ、ｏｏｓ％含むＬ寒天培地に塗布し、３
７℃にて一昼夜培養を行ない、出現するコロニーの内、
白色コロニーを選択した。白色コロニーの出現率は５〜
ｌＯ％程度であった。
次いて、白色コロニーを、アンピシリンを１ｍ文当り１
１００ＩＬ含むＬ液体培地１０ｍ見に移植し、３７℃に
て１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミド
ＤＮＡを回収した０回収したプラスミドＤＮＡを再び大
腸菌ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった後、受
容菌を寒天１゜５％、アンピシリンを１　ｍ　ｌ当りｔ
ｏｏ＝ｇ、Ｘ−ｇａｉをｏ、ｏｏｓ％及びＩＰＴＧを１
ｍＭ含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を
行ない、白色コロニーを選択し、アンピシリンを１ｍ見
当りｌｏｏＩＬｇ含むＬ液体培地１０ｍＪｌに移植し、
３７℃にて１２時時間上う培養を行ない、常法によりプ
ラスミドＤＮＡを分離した。
■−４）、　　　−ＤＮＡの ■−３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大腸
菌ＭＶ１１８４株より、■−１）と全く同じ方法を用い
て突然変異を有する一本鎖ＤＮＡを得た。
■−２）と同じ方法を用いて第２表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成りＮＡを作成し、リン酸化を
行ないプライマーＤＮＡを作成した。
■−６）再−然変異体の作成 ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）で得られた一本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたブライマーＤＮＡより
二、ｔ［ＤＰＪＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形
質転換を行なうことにより青色コロニーを得た。これよ
りプラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４
株を用いて形質転換を行なうことにより青色コロニーを
出現させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収すること
により、ポリリンカ一部分の前ｖｋ２４Ｆ１１所に合計
３塩基対欠失したプラスミドＰＵＣ１０９１を得た。
＠ｐＵｃ１０９２の作成方法 プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドｐＵｃ１０９１の作成例に準じて行なった。変更点は
次の通りである。
（１）■−２）の塩基配列を第２表のＮｏ、９−１−３
とする。
（２）■−５）の塩基配列を第２表のＮｏ、９−１−５
とする。
これによりプラスミドｐＵｃ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた
突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。
■ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２の作成　法前記■■
＠と同様に、プラスミドｐＵｃ１０８０を基本としてポ
リリンカ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変異
プラスミドｐＵｃ１０８１、ｐＵｃ１０８２を作成した
。
変更点は次の通りである。
（１）ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２共に、■−１）
のプラスミドとしてｐｕｃ　１０８０を用いた。
（２）■−２）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−５、ｐｕｃ１０８２に
おいてはＮｏ、８−２−５を用いた。
（３）■−５）の合成りＮＡとして、ＰＵＣ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−３、ｐｔｒｃ１０８２
においてはＮｏ、８−１−５を用いた。
以上、基本となるプラスミドｐＵｃ１０９０、ｐｔｒｃ
ｉｏａｏ及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９
１．ｐＵｃ１０９２．ｐＵｃ１０８１及びｐｕｃ１０８
２の間の関係についてまとめると、第３表のとおりとな
る。
（以下、余白） 第　　２　　表 合成りＮＡの塩基配列表 変異部分を含むＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　３　　表 次に、本発明のｐＵＣベクターシリーズを用いて大腸菌
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させる場合の実施
例を説明する。
（実施例） １）大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子
を有するプラスミドｐＭｃ１８７１　（ファルマシア■
販売）１０ｐｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（ｌＯ小単
位及びＰｓｔｌ　（１０単位）を用いて、３７０Ｃにて
１時間反応を行ない、分解産物な（１７％アガロース電
気泳動を用いて分離し、ゲルより大腸菌のβ−ガラクト
シダーゼをコードする遺伝子のうち制限酵素ＥｃｏＲＩ
サイトよりＰｓｔｌサイトまでのＤＮＡＰｌ′ｒ片（約
３０００塩基対）を切す出シ、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。
２）プラスミドｐＵｃ１０８１　１０ルｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（１０単位）及びＰｓｔＩ　（１０単位）を用
いて、３７℃にて１時間反応を行ない、分解産物を０．
７％アガロース電気泳動を用いて分離し、ゲルより制限
酵素ＥｃｏＲＩサイトよりＰｓｔｌサイトまでの大きい
方のＤＮＡ断片（約２７００塩基対）を切り出し、フェ
ノール処理を行なうことにより精製した。
３）次に、１）て得られたＤＮＡ断片０．ｌ終ｇと２）
で得られたＤＮＡ断片０．ｔＩＬｇを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（２単位）を用いて４℃、１２時間連結反応
を行なった後、反応液の一部を大腸菌Ｃ３Ｈ２６（ラク
トースマイナス）株を用いて形質転換を行なった後、受
容菌を１．５％寒天、アンピシリンを１ｍＭ当り１１０
０ＩＬ及びＸ−ｇａｆＬを０．００５％含むし寒天培地
に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行ない、青色の形
質転換体コロニーを得た。
本形質転換体コロニーは、大腸菌のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子かプラスミドｐＵｃ１０８１の所定の制限酵素
サイトに連結され、フレームか一致することにより大腸
菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠いた宿主大腸菌Ｃ
５Ｈ２６（ラクトースマイナス）棟内において大腸菌の
β−ガラクトシダーゼが発現し、培地中のＸ　−ｇ　ａ
　ｌが分解され、コロニーが青色を呈したものである。
以上の実施例の結果より、プラスミドｐＵｃ１０８１を
用いることにより大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
を容易に発現させることができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は従来のベクターの遺伝子地図、を夫々示すもので
ある。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３
    ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペ
    レーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素Ｈ
    ｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ａｃｃ I 、Ｈｉｎ
    ｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、ＥｃｏＲ I の各切断
    部位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベク
    ター。
  2. （２）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３
    ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペ
    レーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素Ｈ
    ｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ａｃｃ I 、Ｈｉｎ
    ｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、ＥｃｏＲ I の各切断
    部位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベク
    ター３種類からなるベクターシリーズであって、該ベク
    ターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレ
    ームを３種類すべて有するものであるベクターシリーズ
    。
  3. （３）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３
    ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペ
    レーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素Ｈ
    ｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ａｃｃ I 、Ｈｉｎ
    ｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、ＥｃｏＲ I の各切断
    部位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベク
    ター３種類からなるベクターシリーズであって、該ベク
    ターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレ
    ームを３種類すべて有するものであるベクターシリーズ
    の中から所望のベクターを選択し、そのベクターおよび
    蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制限酵素にて切
    り出した後両者を結合することにより、色の変化を判別
    して蛋白質をコードしている遺伝子を検出することを特
    徴とする特定遺伝子の検出方法。
  4. （４）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、Ｍ１３
    ファージＤＮＡのＩＧ、ラクトースプロモーター、オペ
    レーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素Ｈ
    ｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、Ａｃｃ I 、Ｈｉｎ
    ｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、ＥｃｏＲ I の各切断
    部位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベク
    ター３種類からなるベクターシリーズであって、該ベク
    ターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレ
    ームを３種類すべて有するものであるベクターシリーズ
    の中から蛋白質をコードしている遺伝子の５′末端のフ
    レームの合うベクターを選択し、所定の制限酵素にて切
    り出した後両者を結合し、大腸菌に導入し、蛋白質を発
    現することを特徴とする特定蛋白質の発現方法。
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