JPS6019493A - 組換え体プラスミド，形質転換体微生物，ポリデオキシリボヌクレオチド断片，生物学的に活性な蛋白質およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物宿主の形質転換に使用するための組換え
体プラスミド（７ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉ
ｄ　）、このような組換体プラスミドを包含する形質転
換体微生物（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｍｉｃｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍ）及び特定の生物学的に活性な蛋白質す
なわちヒトインシュリン様発育因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）
を表現するためコードづけするポリデオキシリホスクレ
オチド断片（ｓｅｇｍｅｎｔ　）に関する。本発明はま
たこσ〕ような蛋白質の製造方法及びその蛋白質自体に
関する。

ＩＧＦ−Ｉはプロインシュリンに非常に関連したポリペ
プチドホルモン（蛋白質）である〔例えは、Ｒｉｎｄｅ
ｉｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

ｖｏｌ２５３　、　ｐｐ、２７６９−２７７６及びＲｉ
ｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔｅｔ　ａｌ、（１９７８）、ＦＥ
ＢＳ　Ｌｅｔｔ、、ｖｏｌ、９８．ｐｐ、２８３−２８
６参照〕。これはインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）体
細胞活性（ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
　）を示すものである〔例えば、Ｚａｐｆ　ｅｔ　ａｌ
、（１９８１）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、ｖｏｌ、６８．ｐｐ。Ｉ　３２１−１３
３０及びＺａｐｆ　ｅｔａｌ、（１９７８）　、Ｅｕｒ
、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、８７　、　ｐｐ２８
５−２９６参照〕。最近の生体内研究は投与弗依存形式
による下垂体切除したラットにおけるＩＧＦ−Ｉによる
発育刺激を立証している〔５ｃｈｏｅｎｌｅ　ｅｔ　ａ
ｌ。

（１９８２）　、Ｎａｔｕｆｅ、ｖｏｌ、２９６　、　
ｐｐ、２５２−２５３　）　。

ＩＧＦ−Ｉの生合成及び貯蔵の場所は知られておらず、
才たこの蛋白質の作清中濃度は非常に低い〔例えばＺｉ
ｎｇｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９７３）、Ｄｉａｂｃｔｏｌ
ｏｇｉａ。

ｖｏｌ、９．ｐｐ、４７２参照〕。

本発明は課題とするこのポリペプチドホルモンの容易に
到達できる源を提供することを目的とする。

本発明の他の目的はヒトインシュリン様発育因子−■を
表現するためにコードづけする生産遺伝子の合成を提供
することにある。

本発明の更に他の目的は合成生産遺伝子を含有するｍ換
え体プラスミドを提供することであり、これにより微生
物宿主中で該プラスミドが完全（ｍａｔｕｒｅ　）蛋白
質を合成できる。この方法において、該蛋白質は有意量
で合成されつるので、抗体の生産を可能にし、かつイン
シュリン様発育因子−■の生物学的研究及びその様々な
生物学的使用を可能にする。

上記目的及び以下の記載から明らかになるであろう他の
目的を達成するために本発明は、ヒトインシュリン様発
育因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）　を表現するためにコードづ
けする合成生産遺伝子をその中に同一線上に挿入したベ
クターを含む、微生物宿主の形質転換に使用するための
組換束体プラスミドを提供する。

このようなプラスミドは、挿入した遺伝子に対応しかつ
挿入した遺伝子が細菌プロモーターの支配下にあるよう
に細菌プロモーターを挿入部位の上流側に隣接させて有
するｍＲＮＡの適切相（ｃｏｒｒｅｃｔ　ｐｈａｓｅ　
）における翻訳を可能にする。

使用するプラスミドは原生生物中に天然に存在する自己
発生性ゲノムから誘導されるのが好ましい。遺伝子は好
適には出発コドン（ＡＴＧ　）　、終止コドン（ＴＡＧ
　）及び制限酵素部位が与えられる、遺伝子のコドンは
好１しぐはトリヌクレオチドコドンである。

本発明を説明する目的で、箪発明をエシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属から選択された微生物に関連
させて記載するが、本発明はこれらに限定されるわけで
はない。筐た、特に、本記載にて使用したプラスミドベ
クター源は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　）プラスミドｐＢＲ
３２２（Ｂｏｌｉ’ｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、２
．ｐｐ。

９５゜１９７７　により記載）である。

本発明はまたインシュリン様発育因子−■（ＩＧＦ−Ｉ
）を表現するためコードづけする合成生産遺伝子をその
中に挿入したベクターを含む胡換え体プラスミドを包含
する形り転換体微生物を提供する。好適な宿主微生物と
してはエシェリヒア属から選択したもの、例れは大腸菌
を使用できる。しかし、他の微生物、例えばサツカロマ
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）、バシルス・
ノイロスポーラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｎｅｕｒｏｓｐｏ
ｒａ　）またはストプレトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　）属その他から選択された微生物もやはり使
用できるので、本発明は上記のような微生物のみの使用
に限定されないことが理解されよう。本発明を例示する
目的で、宿主微生物として微生物大腸菌に１２　、　Ｊ
Ｍ８３　及び２９４株を使用した。

本発明は更にヒトインシュリン様発育因子−■（ＩＧＦ
−１）　を表現するためコードづけするポリデオキシリ
ボヌクレオチド断片を提供する。このような断片は好適
にはその両端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位、該部
位の一方の中に出発コドン（ＡＴＧ　）及び該部位の他
方の中に終止コドン（ＴＡＧ　）、及び該コドン間にイ
ンシュリン様発育因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）を表現するた
めにコードづけする遺伝子が与えられている。ＩＥ−ｆ
Ｌ、いポリデオキシヌクレオチド断片は添伺図面の第２
図に示したものと実質的に対応する構造を有する。

本発明の他の観点によれば、インシュリン様発育因子−
■蛋白質の製造方法が提供され、該方法はヒトインシュ
リン様発育因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）についてコードづけ
する合成生産遺伝子を含む紐喚え体プラスミドを包含す
る形質転換体微生物を適鴫な栄養培地中で蛋白質が生成
されるまで培養し、次いで′該蛋白質を単離することを
含む。

本発明は丑たその範囲内に該方法により製造された蛋白
質、特にメチオニル−１ＧＦ−Ｉまたはメチオニル−Ｉ
Ｇ’Ｆ−ＩもしくはＩＧＦ−Ｉを含む融合蛋白質も包含
する。

以下、本発明を添付図面に関連声せて非限定的実施例に
より例示する。

以下の実施例において、本発明は宿主微生物として大腸
菌を使用して例示するが、本発明はこのような微生物の
使用のみに限定されず、他の微生物もまた使用できるこ
吉が理解さノ１．よう。

ＩＧＦ−１は添＋Ｊ図面の第１図に示したような配夕Ｉ
Ｊ願序の７０個のアミノ酸からなる〔例えば、Ｒｉｎｄ
ｅｒｋｎｅｃｋｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８〕　＋　Ｊ
　、　Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　。

ｖｏｌ、２５３゜ｐｐ、２７６９−２７７６　参照〕。

ａｌ図のアミノ酸配列順序から対応する合成遺伝子配列
順序を発明した。これは多数の特定な非自明的基準にか
けられ、オリゴマヌクレオチドブロックを合成したが、
これらブロックは組立てられると、ＩＧＦ−Ｉの合成遺
伝子コードづけを形成する。これらブロックを予め定め
られた段階においてハイフリット形成し、かつ結合させ
た。この合成遺伝子に出発コドン（ＡＴＧ　）、終止コ
ドン（ＴＡＧ　）及び適当な制限酵素部位を与えた。こ
の遺伝子を大腸菌プラスミドＤＮＡによってのみ側面か
ら攻撃された全長ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を製造するため特別
に役割された大腸菌ベタター中にクーロン化した。遺伝
子は、この組換え体から切り取り、そして大腸菌乳糖オ
ペロン（ｏｐｅｒｏｎ　）から得られたプロモーターの
支配下で大腸菌における遺伝子の表現を最大にするため
に特別に設刷されたベクター中妊再クローン化した。が
（して、ＩＧＦ−１とよく似た蛋白質が大腸菌中で表現
されたのである。

所望の蛋白質をコードづけするであろうヌクレオチド配
列順序を構成するためにいくつかの非自明的基準を観察
した。第一に、使用すべき細胞、特に大腸菌、において
適当ないし好ましいトリヌクレオチドを使用しなければ
ならない〔例えば、Ｗａｉｎ　−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８１）　、Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ、１３　。

ｐｐ。１９９−２０９参照〕。第二に、所望の配置でプ
ラスミド中に挿入できるように分子の末端に異なる制限
酵素認識部位を有することが望ましいと決定した。

更−に、十分理解されたクーロン化用ベクター、例えば
ｐＢＲ３２２の使用を可能にする部位を選択することを
決定した〔例えば、Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、。

（］　９７７　）　、Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ、２．ｐｐ９５
−１１３　参照〕。実際、ＥｃｏＲＩ　及びＨ４ｎｄｌ
Ｕ　部位を選択し、各々、５′及び３′末端に導入した
。第三に、特徴づけ及び恐らく突然変異訪発を助けるた
め遺伝子を特別に切開できるように一連の制限エンドス
フレアーゼ認識部位を計画的に分子に沿った位置に導入
することが望ましいと考えた。第四に、遺伝子の組立て
を促進するためには合成は不必要に複雑であってはなら
ずかつ不条理な交差ハイブリッド形成をｉｉ↓少に抑え
なければならない。

実際、とりわけ上記考慮点に留意して、便宜上、添付図
面の第２図中に記載したようにわずかにより長い配列順
序を選択し、かつ制限酵素認識部位を添付図面の第３図
中に示した。

本発明に従って、本発明者らは添付図面の第２図中に図
示したように３４個の合成オリゴヌクレオチドブロック
を作成することにより上記の拡張させた配列順序を有す
る分子を合成したが、これは単一鎖重複により組立てら
れて完全な二重鎖ヌクレオチド配列順序を与える。

実施例１ テトラゾカスクレオチドの合成 上Ｇｅシたように、選択した合成ブロックを添付図面の
第２図に示した。ブロックは全自動合成機及び公知の合
成技術を用いて構成される〔例えばＥｌｍｂｌａｄ　ｅ
ｔ　ａｌ　（１９８２）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅ　−ａｒｃｈ、ｖｏｌ、１０　、　ｐｐ、
３２９．１−３３０１及びＣｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ（１９
８Ｌ　）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ、ｃｉｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、９．ｐｐ。

２８０．７−２８１７参照〕。

テトラデカヌクレオチド＊Ｐ押旬寸峙醪−ドメ円ＡｐＴ
ｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣｐＱｐＡｐＡｐＡｐＣ（第２
図：Ａ２）の合ルｙに関連させて、以下、合成方法を例
示する。

継続的カップリング反応により個々のヌクレオシドホス
−ファイトからオリゴヌクレオチドを組立てる方法はよ
く知られている〔例えば、Ｅｌｍｂｌａｔ　ｅｔ　ａｌ
、（１９８２）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｒｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ　、　Ｉ　Ｏ，ｐｐ、３２９１−
３３０’ｌ及びＣｈｏｗｅｔａｌ、＋　１９８１　）　
、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｒｅａｒｃｈ、
Ｖｏｌ、９゜ｐｐ。２８０７−２８１７　参照〕。完全
に保護されたテトラデカヌクレオチドは添付図面の第４
図に示したように海１立てた。

ＤＭＴｒＡ　ｐＣ−ソ’Ｊｆ３ ０１ＶＩ　ｅ （能動の訝明については添伺図面の第５図を参照）の合
成により例示される下ｇｅの方法によりカップリング反
応を行なった。

ＤＭＴｒ−Ｃ−シリカ（１００ｍｑ　５１１ｔｎＤｅ）
をカラムに移し、ニトロメタン（１係の水を含有）中の
ＺｎＢｒ２の飽和溶液で脱トリチル化し、次いで幹燥テ
トラヒドロフラン（Ｔ）（Ｆ　）で洗浄した。脱トリチ
ル化したＣ−シリカに’ｎｌＦ中の５−〇−ジメトキシ
トリチルーＮ−ペンソイル−２−チオキシアデノシン−
３−０−メチルボスホクロリダイト（５０μｍｏｅ）を
添加し、室温で１０分間反応させた。

シリカを肖度ＴＨＦで洗浄し、このホスファイトをヨウ
素で酸化し、更にもう一度Ｔ１１Ｆで洗浄した。

この周期の最後の工程は反応しなかったＣ−シリカのア
セチル化であった。この周期を必要な回数反復すること
によりテトラデカヌクレオチドを得た。これらオリゴマ
ーは先ずジオキサン中チオフェノールートリエチルアミ
ンで室温で３０分間処理することによりインタースクレ
オチドホスホトリエステルのメチル保獲基を除去し、次
ｔ／−１で濃アンモニア水で５℃で４時間処理１７た。

シリカを炉講により除去し、アンモニア溶液を蒸発させ
た。

１）ＭＴｒ−元トラデカマーを水に再溶解し、高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりウルトラシル（
ｕｌｔｒａｃＮ　）逆相Ｃ１，８５μ　カラム、　Ａｌ
ｔｅｘ１−ＩＰＬｃを用いて４１２製し、酢酸（８０係
）で室温で１５分間脱トリチル化し、再びスフエリソル
ブ（５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ、登録商標）逆相Ｃ１８５μ
カラムＬＤＣ−ＨＰＬＣ系を用いたＩ−１，ＰＬＯ装置
に注入した。

スクレオチドのオリゴマーブロックは望才しくない相互
反応の可能性を最小に抑えるため％一連の工程において
ハイブリット形成及び結合させ〔Ｋｈｏｒａｎａ　ｅｔ
　ａｌ、、（１９７６）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｂｅｍ
、。

Ｖｏｌ、　２５１　ｐｐ、６３４−６７５　参照〕、か
くして添付図面の第６図に示したように完全な遺伝子を
形成した。組立て計画における添加順序を不正確な結合
を最小にするため最適なものとした。

ブロックＩの結合 オリゴ？　−Ａ　２　（１４μ／？１ｎｍｏｌ水中）、
Ｂ１７’　（１４μ６１ｎｒｎｏ１水中）及びＢ１６（
１４μ（？１ｎｍｏｌ　水中）を各々５ｔｔｅの１０量
結合緩衝液（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｂｕｆｆｅｒ　）　
（０，５Ｍ　トリス−ＭＣＩＩ　、ｐＨ７，７、０，１
ＭＭｇＣｌ、）２５μｅの水、ＬｐＨの０．５Ｍジチオ
スレイトール（ＤＴＴ　）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（キナーゼ）（２μｅ、２単位／μｅ、酵素／単位
は３７℃で３０分間で１ｎｒｎｏｌのフォスファイトを
ＡＴＰからＲＮＡ″またはＤＮＡのｓ’−ＯＨ末端に移
行させることを触媒する量と定義される）及び３２Ｐ−
ｒＡＴＰ（３μ（？、１１ｐｍｏ１非活性２９００．Ｏ
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と混合した。混合物を３７℃で１０分
間培養し、次いで非標識ＡＴＰ　（２ｔｔｌ　１．０ｍ
Ｍ　）を追加の２単位のキナーゼと共に添加し、混合物
を３７℃で更に１時間培養した。オリゴマーは短２０％
変性性ポリアクリルアミドゲル（５ＱｍＭ　トリス−ホ
ウ酸塩、…８．３／Ｑ、８ｍＭ　ＥＤＴＡ中７Ｍ尿素）
にＸり調ヘタ。

上記３種のホスホリル化されたオリゴマーは更に精製す
ることなく混合し、ＡＩ（１４μＪ、１ｎｍｏｌ水中）
を２μｅの１０量結合緩衝液と共に添加した。

混合物は８０℃で５分間加熱し、２時間１０’ＧＫ冷却
した。冷却した溶液にＤＴＴ　（Ｌｌｔ６０．５Ｍ）　
ＡＴＰ（２μｅ、１．０ｍＭ）及びＤＮＡ−リガーゼ（
Ｔ４）（２μＣ２０Ｗｅｉｓａ単位、リガーゼ７１単位
は３７℃で２０分間でｌｎｍｏｌ　のホスフェートをＡ
ＴＰからピロホスフェートに交携することを触媒する酵
素の量と定義される）を添加した。結合は４℃で１晩行
なった。試料はフェノール及びエーテルで抽出し、次い
で２５倍容の９９．５％エタノールを添加することによ
りエタノール沈殿させた。結合生成物を９，９８０Ｘ、
９で１０分間遠心分離することにより回収し、最後に長
さ３０ｚ厚さ１．５間の１５％非変性性ポリアクリルア
ミドゲルを用いて精製し、２００ｖで＋４℃に冷却しな
がら１６時間操作した。これにより生成物の明白なバン
ドが得られ、これはオートラジオグラフィー及び紫外線
下２５４ｎｍの可視性両者により検出した。ＤＮＡフラ
グメントはゲル片から酢酸アンモニウム（３００μｅ。

３Ｍ）により室温で１晩溶離した。酢酸アンモニウム溶
液を年め、０．０５Ｍの最終濃度まで水で希釈した。次
いで、試料をＤＥ〜５２イオン交換カラムに伺し、ＤＮ
Ａを３Ｍ酢酸で溶離した。溶液を親液化し、収率を２６
０ｎｍ　の吸収度の測定により決定した０ ブロック［１１、Ｖ　、　■、及び■の結合これらブロ
ックの結合はフロックＩの場合と同じように行なった。

実施例２ ブロック■の結合 ブロック■の結合は精製まではブロック■の場合と同じ
ように行なった。精製は代りに２０％変性性ポリアクリ
ルアミドゲルで行なった。２種の主要バンド、すなわち
Ａ鎖からの４２量体及びＢ鎖からの２８量体、をゲルか
ら取り出し、酢酸アンモニウム（３００ｔｔｅ、３Ｍ）
　Ｔ　ＤＥ−５２イオン交換カラム中を流して溶離し、
蒸発させた。２種のフラグメントは別個に上記と同一の
方法でホスホリル化した。ホスホリル化後、２種のオリ
ゴマーを混合し、８０℃で５分間加熱し、２時間１０℃
に冷却した。かくして形成されたブロック■を１５チ非
変性性ポリアクリルアミドゲルで精製した。

バンドを上記のように溶離した。

実施例３ ブロック■の結合 ブロック■を２工程で結合した。先ず、各１ｎｍｏｌの
Ａ９及びＢ１０（第２図参照）をブロックＩの場合のよ
うにホスホリル化し、次いで１　ｎｒｎｏｌ　のＡ８及
び１　ｎｍｏ　ｌのＢ９（第２図参照）と混合し、ブロ
ックＩの場合のように結合し、次いでｎｔ製した。純粋
なフラグメントをホスホリル化し、２ｎＩＴＩＯ１のホ
スホリル化Ｌ＆ＡＪＯ及び２　ｎｍｏ　ｌのホスホリル
化したＢ８（第２図参照）と混合し、上記のように結合
した。この混合物は１５％非変性性ポリアクリルアミト
ゲ゛ルで分離すると２本のバンドを与えたが、１本は所
望のブロック■であり、他方はＡＩＯ／Ｂ８かそれ自体
に結合した結合生成物であった。ブロック■はフロック
Ｉとして精品した。

実施例４ フ゛ロック！（１００ｐｒｎｏｌ、２０　ｔｔｌ中）及
びフ゛ロックＩＩ　（６０ｐｍｏ１．１２／ｊ／中）を
４ｔＬｅ　（７）　１０　Ｘ結合緩衝液及び１μｇの水
と混合した。この溶液を５０’Ｑで５分間加熱し、２時
間１０’Ｃに冷却した。次いでＡＴＰ　（２μｅ１１ｒ
＋ｆｖｔ　）、１μ（？　）ｏ、　５　Ｍ　ＤＴＴ及０
：　２ｔｔｅ　ノリガーゼ（１０単位／μｅ）を添加し
、混合物を４℃で２時間給合した。次いで、結合混合物
を上記したようにフェノール及びエーテル抽出し、エタ
ノールで沈殿させた。沈殿した物質を最後に１５係非変
性性ポリアクリルアミドゲルで精製した。

バンド（ブロックｂ）をブロック月の場合と同一の方法
でゲルから溶離し、精製した。

実施例５ 形成 ブロックｍ　（１５０ｐｍｏｌ　）をホスホリル化した
後、これをブロックＩＶ（１００ｐｒｎｏｌ）と混合し
、これらをブロックａの場合と同一の方法で結合し、精
製した。ブロック■（１７０ｐｍｏ１．　）をホスホリ
ル化した後、これをブロック■（２００ｐｍｏｌ）と混
合し、この混合物をブロックａと同一の方法で結合し、
精製した。

実施例６ 形成 ２０μｇ　（７０ｐｍｏｌ）のホスホリル化したブロッ
クｂ及び１０　μｅ　（５０ｐｍｏｌ）　ＩＴ）ブロッ
クａを混合シ、ｌｔμｅ（７）　１ｍＭ　ＡＴＰ、　４
ｆｉｌ　（１’）　１０　ｘ結合緩衝波及ヒ４μｅの水
を添加した。混合物を５分間５０　’Ｃに加熱し、２時
間１０°Ｃに冷却した。次いで、この混合物に１μｅの
０．５　Ｍ　Ｉ）Ｉ：Ｔ及び２μ４のりガーゼ（１０単
位／μｅ）を添加し、次いで上記ブロックａについて記
載したように混合物を４℃で２時間給合させ、次いで精
製することによりブロックＡを得た。ブロックＶ　（１
００ｐｍｏｌ　）をブロックＡの場合と全く同一の方法
によりホスホリル化、結合させることによりブロックＢ
を得た。

実施例７ ブロックＡ及びＢの結合によるＩＧＦ−Ｉ遺伝子の！！ フロックＡ　（５ｐｍｏ１．２μＪ中）をブロックＢ（
１０ｐｍｏｌ、２μぎ）に混合した。この溶液に２μｇ
の１０ｘ結合緩衝液、５μｍ？　（７）　５ｏμＭ　Ａ
ＴＰ　及Ｕ　１０ｆｉｌの水を添加した。混合物を５０
’Ｃに５分抽加熱し、２ｑ間１０℃に冷却した。次いで
、上記したように混合物に１ｔｔｅの０．５　Ｍ　Ｉ）
ＴＴ及Ｕ　１ｐｅ　（７）　Ｔ　４　＋）ガーゼ・（ｌ
Ｏ単位／μｇ）を添加し、混合物を２時間４℃で結合し
、次いでフェノール及びエーテル抽出し、最後にエタノ
ールで沈殿させた。

５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　、　ｇｌｊ　７．６／Ｉ　Ｏ
ｍＭ　庵Ｃ１２／１００　ｍＭ　ＮａＣ１中の完全結合
生成物０．５ｐｍｏｌを制限酵素Ｅｃ、ｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄｌｌｌ　（各４０単位＝１単位は全ｆｔ　Ｏ，０５
ｍｌ！、中で６０分間でＬＯｔｔＥ　ＤＮＡ　）完全消
化物を生成するのに必要な酵素の開と定義される）で３
７°Ｃで６０分間消化させた。混合物をフェノール及び
エーテルで抽出し、非変性性１０％ポリアクリルアミド
ゲルで８９ｍＭ）リス−ＨＣｄ　、　ｐＨ８，３／８９
　ｒｎＭ　ホウ酸／　２．５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡを用
いて分離した。約２３０の塩基対（ｂａｓｅ　ｐａｉｒ
ｓ、ｂｐ　）の位置で流出するフラグメントをＨ９Ｏ，
５ｒｎｉ’ｔｈによりＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ（１９８０）、Ｖｏｌ。

６５、’ｐ、ｐ、３７１−３８０中に記載されたように
電気溶離した。ηＶ電気溶離た物質をフェノール抽出し
、次いでフェノールのいかなる痕跡も排除するためにエ
ーテルで大量に抽出した“。この物質は下Ｒｅのように
ベクター中のＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクーロン化のため使用
した。

ｐＫＧＩと命名された特定なベクターは本発明の目的の
利点を与えるため特に設計したものである。

発明プラスミド、ｐＫＧｌは大腸菌中で増殖する４、２
に塩基対プラスミドであり、これはｐＢＲ３２２（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）、Ｇｅｎｅ、Ｖ
ｏｌ、２゜ｐｐ、９５−１１３参照〕及びｐＫＢ　２５
８　（Ｂｅｃｌｃｍａｎｅｔ　ａｌ、（１９７８）、Ｃ
ｅ１１．ｖｏｌ、］］３．ｐｐ、６５−７１参照から、
乳糖プロモーターからの転写がｐＢＲ３２２のテトラサ
イクリン耐性遺伝子に向けられるようにｐＢＲ３２２の
Ｅｃ　ｏｆえＩ部位にｐＫＢ　２５８の２８５ｂｐＥｃ
ｏＲＩフラグメントを挿入し乳糖プロモーター領域の上
流側のＥｃｏＲＩ制限酵素部位を欠失させることにより
構成できる。

実施例８ キメラクーロン化性表現ベクターｐＫＧ　１の構成大腸
菌中のＩＧＦ−Ｉの表現を促進するためには強力なプロ
モーター及び適当な制限酵素部位を有する１ｆｔｌ！以
上の°ベクターを構成するのが望ましい（添付図面の第
７図参照）。上で言及したプロモーターフラグメントを
含有している２０μｇのプラスミドｐＨＧＨ１０７（（
１；ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）Ｎａｔｕ
ｒｅ、ｖｏｌ、２８１　、ｐｐ、５４４−５４８　参照
〕を上記した緩衝液中で制限酵素Ｅｃｏ損及びＢａｍＦ
ｉＩ　（各酵素３０単位）で３７℃で２時間消化させた
。この物質を上記したようにアガロースゲルを使用して
分離し、プロモーターフラグメントを含有している大き
なフラグメントを上記したように電気溶離し、次いで上
記したようにフェノール及びエーテルで抽出して最後に
エタノールで沈殿させた。同様に２ｏｐｆｉのプラスミ
ドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７７）、Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ、２．ｐｐ、９５−１
１３参照〕を上Ｐと同じようにＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
ｌで消化させ、アガロースゲルで分離した。上記の大き
いフラグメント中では欠けていたテトラサイクリン耐性
遺伝子の部分を含有する小さい方のフラグメントを上記
のように電気溶離し、抽出し、沈殿させた。

等モル量のフラグメン、トを混合し、２μｅの緩衝液（
６６０ｍＭ　トリス−Ｈｃｇ、ｐＨ７，ｓ／１　ｏ　ｏ
ｒｒｔ　Ｍｊ９Ｃ１１２／］ＱＯｍＭ　ＤＴＴ）、２．
ｃ＋＋？ノ５ｍＭ　ＡＴＰ　２単位のＴ４−リガーせ及
び水を２０μｅまで添加した。混合物を２０℃で２時間
培養した。１０μｅの結合え合物を使用して大腸菌に１
２，２９４株（ｅｎｄ。

Ｉ　・Ｂ１．ｒＲ＋　ｍＲ＋）　（例えばＤａｇｅｒｔ
　ｅｔ　ａｌ。

（］　９７９　昌Ｇｅｎｅ、ｖｏ１．６．ｐＰ、２３−
２８参照〕を形質転換した。表現型表現に６０分かけた
後、細胞をＬｕｒｉａ寒天板（Ｍｉｌｌｅｒ、ＥＸｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ’ｕｌａｒｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎ、Ｙ、、　（１９７２）参照〕上に広げたが、この寒
天板はプラスミドが耐性を与えるテトラサイクリン１２
．５μ＆／ｄ　が補充されており、これにより形質転換
体を選択した。

３７℃にて１晩培養した後、各コロニーを公知の方法（
１３ｊｒｎｂｉｏｍ　ｅｔ　ａｌ　、　（１９７９ン　
Ｎｕｃｌｅｉｃう Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ　、７．ｐｐ、
　ｌ　５１３−１５２３参照〕に従って製造したプラス
ミドＤＮＡの制限酵素消化により乳糖プロモーター断片
の存在について調べた。期待上たプロモーター断片を含
有する一つのコロニーをＤＮＡ配列順序分析にかけるこ
とにより乳糖プロモーターの挿入を確認した。このプラ
スミドをｐＫＧ　１と命名した〔添付図面の第７図参照
〕宿主細胞として大腸菌２９４株を用いたプラスミドｐ
ＫＧ　１　’ｃ西独プツチインゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ　（ＤＳＭ　）　。

Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｓｃｈｅ　Ｆｏｒｓｃｈｕ　−ｎｇ　ｍｂＨ
に寄託酢号ＤＳＭ　２６７３として寄託した。

実施例９ キメラプラスミドｐＫＧ　３の構成 プラスミドｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１
９８２）。

ｃｒｅｎｅ、ｖｏｌ　、１９．ｐｐ、２５９−２６８参
照〕を上記したように制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ｌｌで消化させた。上記したように、消化された物質を
０．８　％アガロースゲルマ４０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ　
、　ｐＨ８，８／　２０ｍＭ酢酸を用いて分離し、そし
て大、きいフラグメントさせた。沈殿した物質を水中に
０．１ｐｍｏｌ／μｅの濃度に再懸濁した。上記のもの
からのＩＧＦ−Ｉフラグメント０．０５ｐｍｏｌ　（，
５ｔｔｌｌ　）を０．５ｐｍｏｌの大きなｐＵＣ８，Ｄ
ＮＡフラグメントと混合し、４μｅの緩衝液（６６０ｍ
Ｍ　トＩＪ　ス−ＨＣＩＪ　、　ｐＨ７，５／１００ｍ
ＭＭ、！ｉ’　Ｃ１ｚ　／　１００ｍＭ　ＤＴＴ　）及
び４ｔｔｅの１ｍＭ　ＡＴＰを添加した。混合物を６８
℃に２分間加熱し、次りてゆっくり４°Ｃに冷却した。

次いで、６単位のＴ４リガーゼを添加し、結合混合物を
１２℃で６時間培養した。細菌株ＪＭ８３　’（ａｒ　
ａ、△／ａｃ−ｐｒ　。

５ｔｒＡ、ｔｈｉ、φ８０’ｄ）ａｃｚ△１１１５．Ｖ
ｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ（１９８；１Ｇｅｎｅ、ｖｏｌ
、１９．ｐｐ、２５９−２６８参照ＪをｌＯμｅの結合
混合物で上記したように、但しテトラサイクリンの代り
に５μｆｌ／−ｔのアンピシリンを用すで形質転換させ
た。寒天板上３７℃で１８時間培養した後得られた形質
転換体をＧｅｒｇｅｎ　ｅｔａｌ、（１９７９Ｊ、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、７
ｐｐ、２１１５−＝２１３６　によりＳ己載されたよう
に、かつキナーゼ作用させたフラグメントＢ１６（添付
図面の第２図参照）をプローブとして用いたコロニーハ
イブリッド形成によりＩＧＦ−Ｉ遺伝子の存在について
スクリーニングした。添付図面の第３図に示した予想さ
れた制限酵素部位を利用する制限酵素ｆｊｈ、図作成に
よりかつよく知られた技術（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、（１９７７Ｊ、Ｐコｏｃ、１ａｔ１１．Ａｃａｄ、５
ｃｉＵＳＡ、ｖｏｌ、７４．ｐｐ、５４６３−５４６７
　参照〕を用いるヌクレオチド配列順序分析により＠性
ハイブリッド形成信号を示すコロニーにおける完全なＩ
ＧＦ−Ｉ遺伝子の存在を確認した。この方法で得られた
ＩＧＦ−１遺伝子を含有するプラスミドはｐＫｃ　３と
命名した〔添付図面の第８図参照〕。

実施例１０ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有するキメラプラスミドｐＫＧ４
の構成 ＩＧＦ−Ｉ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼのための遺伝
子に融合する〔例えば、Ｖｉｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８２）、Ｇｅｎｅ　ｖｏｌ、１９．ｐｐ、２５９
−２６８参照〕ため、プラスミドｐＫＧ　ｓを含有する
細菌細胞中合成されたいかなるＩＧＦ−Ｉ蛋白質もその
アミノ末端にβ−ガラクトシダーゼから誘導された６個
のアミノ酸を含有することになる。いかなる余分のアミ
ノ酸もないＩＧＦ−Ｉのためのプラスミドコードづけを
得るために、ＩＧＦ、−Ｉ遺伝子をｐＫＧ　１に再クー
ロン化した。ｐＫＧ　１への再クーロン化はこの一部修
正されたプラスミドを含有する細菌細胞中に合成された
ＩＧＦ−１が出発コドンＡＴＣ；　Ｋよりコードづけさ
れたメヂオニンを除いていかなる余分のアミノ酸も含有
しないような方法で行なった。プラスミド１）ＫＧ　１
を上記したように＆’ｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで消化
させ、フラグメントを上記したように０．８チアカロー
スケルで分離し、大きなフラグメントを上記したように
電気溶離し、フェノール及びエーテルで抽出し、最後に
エタノールで沈殿した。

プラスミドｐＫＧ　３を全く同一の方法で消化させ、小
さなフラグメント（ＩＧＦ’−Ｉ遺伝子）を上記のよつ
にオｊ７製した。ｐＫＧ　］からの大きなフラグメント
２００μｇを等モル量のｐＨＧ　３から−の小さなフラ
グメントと混合した。次いで、１０ｔｔｌの緩衝液（６
ＧＯｒｎＭ）リス−ＨＣ／　、　ｐＨ７，５／　１００
ｍＭ　ＭｇＣｈ／１００ｍＭ　ＤＴＴ）０．６単位ノＴ
　４−リガーゼ１０ｔｔｅ　（７）　１ｒｎＭ　ＡＴＰ
及び水を１００ｆｉｌ　まで添加した◇上記したように
、混合物を１２℃で１晩培養・　し、テトラサイクリン
耐性の選択性がある大腸菌に１２．ＪＭ８３株の形質転
換に使用した。プラスミドｐＫＧ　１を、ＩＧＦ−Ｉ遺
伝子がＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ■部位中にクーロン化
されるときもしＩＧ、Ｆ−Ｉ遺伝子が転写されるならば
テトラサイクリン耐性形質転換体のみが生成するような
方法で構成した。

３７°Ｃで１８時間培養した後生成した形質転換からの
単純コロニーはプラスミドＤＮＡを調製し、これを添付
図面の第３図に示した制限酵素地図を利用して制限酵素
分析にかけることによりＩＧＦ−Ｉ遺伝子について調べ
た。期待するフラグメントを含有する一つの形質転換体
をｐＫＧ　４と命名し在（添付図面の第９図参照） 実施例１１ 大腸菌におけるＩＧＦ’−Ｉの表現 プラスミドｐＫＧ　３及びｐＫＧ　４各々を含有する大
腸ＭＫＩ　２　、ＪＭ８３及び２９４株をＬｕ　ｒ　ｉ
　ａ肉汁（ＬＢ　）　（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎ、Ｙ１９７２）参照〕中で３７℃で通気しなから６０
０ｎｍｌｃおいて１．０の光学的濃度になるまで発育さ
せた。細胞は４°ｃ’ｒｉｏ分間８０００ｒｐｍ　ｆ遠
心分離することＫより集めた。細胞を１０回ＴＥ（１０
ｍＭトリス−ＨＣ，ｌｌ　ｐＨ７，０／　１ｍＭ　Ｎａ
２ＥＤＴＡ　）　テ洗浄した後、細胞を１　ｆ＋／１０
倍容のＴＥ中に再懸濁し３０秒間ずつバーストさせる音
波処理に１０回かけ、バーストとバーストの間は氷水中
で冷却した。

不溶物質を上記のように遠心分離により除去し、上澄液
をＩＧＦ−Ｉ様物質の存在について分析した。

希釈液１０μｅずつのアリコートをニトロセルロース沖
紙に適用し、ヒト血清から精製ＩＧＦ−Ｉに対して生じ
させたラビット抗体及びベルオキシターゼ抗ペルオキシ
ダーゼ方法（Ｇｒａｓ＋、（１９８１）＋５Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、ｖｏｌｏ２１１．ｐｐ７０−参照〕を用いる免疫
学的分析にかけた。

プラスミドｐＫＧ　３及びｐＫＧ　４を含有する大腸菌
に１２．ＪＭ８３及び２９４株の細胞は西独ゲッティン
ゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　
Ｍｉｋｒｏｏｒｇ−ａｎｉｓｍｅｎ　（ＤＳＭ　）　、
Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｊｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏ　−１ｏｇｉｓｃｈｅ　Ｆｏｒｓｃｈｕ’ｎｇ　ｍｂ
Ｈに寄託番号ＤＳＭ２６７４及び２６７５として各々に
寄託した。

中のＩＧＦ−Ｉの製造 ＩＧＦ−Ｉを多量に製造するため、このものを蛋白質Ａ
と一緒の融合蛋白質として製造した。融合蛋白質を操作
するときは所望の蛋白質と融合の間に切断部位を挿入し
なければならない。これは５′末端にある合成遺伝子を
変えることにより、そしてここで蛋白質レベルで新しい
切断部位を導入することにより行なった（第１０図参照
）。合成遺伝子の変換はインビトロ（ｉｎ　ｖｊｔｒｏ
）突然変異誘発により達成した。３種の異なる突然変異
を行なった。

１、Ｎ末端グリシンＧＧＴをアスパラギン酸ＧＡＣに突
然変異させた（第１０図及びｉｌ１図参照）このアミノ
酸変換を行なうことにより新しいアスパラギン酸蛋白質
結合を形成した。これにより、遺伝子融合が、精製の前
捷たは後にアスパラギン酸及びプロリンの間で切断させ
る蟻酸処理により切断されうるハイブリッド蛋白石を記
号化できるようＫなる。（Ｌａｎｄｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

４７．１３２−１４５．１９７７）こｉはＮ末Ｍ　（１
）　ｆｘ　イＩＧＦ−Ｉを与える。

２、　遺伝子の前の余分なメチオニンＡＴＧをアスパラ
ギンＡＡＣに突然変異させた（第１０図及び１１図参照
）。このアミノ酸変転を行なうことにより、精製の前才
たは後にヒドロキシルアミンにより切断されうるアスパ
ラキングリジン結合を形成しｆｃ　（Ｌａｎｄｏｎ、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４７　
＋１３２−１４５．１９７７）。これは末端ＩＧＦ−Ｉ
蛋白質を力える。

３、　上記の同一メチオニンＡＴＧをトリプトファンＴ
ＧＧに突然変異はせた。このアミノ酸変換を行なうこと
により、ドリフトファンの後に切断部位を導入した。こ
の切断はＮ−プロムスクインイミドにより行なツｆｃ　
（Ｌａｎｄｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
　−１ｏｇｙ、見、１３２−１４５．１９７７）。この
方法もまた先天ＩＧＦ−Ｉ蛋白質を与える。

インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）突然変異誘発の例とし
てＧｌｙ　−）　Ａｓｐ変換を記載する。

実施例１２ 発による変性ヒトＩＧＦ−Ｉの記号化 １０ｔｔ９のプラスミドｐＫＧ　３をＥｃ　ｏＲＩ及び
Ｈｉｎｄｌｌで切断し、そしてその０．２２ｋｂフラグ
メントを電気泳動の後の５チポリアクリルアミドゲルか
ら分離した。５０ｎ、９の精製フラグメントを２ｏｏｎ
、！ｉ’のファージＭ１３ｍｐ９と混合し、全容ｉ１２
　ｏμｅ中でＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断した。

Ｔ４−リガーゼによる処理後、ＤＮＡを用し）て大腸菌
ＪＭ８３を形質転換させ、細胞をＡＸＩ板上に広げた。

切断、結合及び形質転換を上記のように行なった。１個
の白色プラークからファージ精製を行なった（Ｍｅｓｓ
−ｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　１０↓、　２０−７８　。

１９８３　）。万能プライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　
ｐｒｉｍｅｒ　）（Ｂｉｏ　−Ｌａｂｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ、ＵＳＡ）　を用いて、ファージ挿入物が２
２０ｂｐ合成ＩＧＢ”−Ｉ遺伝子であることを確認した
。このファージは■９／ＩＧＦ−Ｉと命名し、以下の突
然変異誘発に使用した。

２４個の塩基からなる１個のプライマーオリボスクＬ／
　、ｔ　チト（５’　−ＧＴＧＡＡ７１’ＴＣＴＡＴＧ
ＧＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＴ−３’　）を突然変異誘発に
使用し、１４個の塩基からなる１個のプローブ（ｐ）オ
リゴスクレオチド（５’　−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣ
ＣＣ−３’　）　を首尾よく突然変異されたファージク
ーロンを確認するために使用した。合成Ｉ　Ｇ　Ｆ　−
Ｉ遺伝子及びプライマー間の不適合（ｍ１ｓｒｎａｔｃ
ｈ　）　を第１１図に示した。

６ｐｍｏｌのｍｐ　９／Ｉ　Ｇ　Ｆ　−Ｉ及び８０ｐｒ
ｎｏｌ　のプライマーを、１００ｍＭ　ＮａＣ１、２０
ｒｎＭＭｇＣ１２及び４０ｍＭトリスートｌＣｅ　（ｐ
Ｈ７，ｓ　）からなる全容積８０μｅ中で混合した。混
合物を６５℃に３分間加熱し、３０分間で２３℃まで放
冷しに０氷浴中に移した後、１９０ｆｉｅ（’）　）４
２０　及ヒ３０ｔ’ｅ　ノ１００　ｍＭ’ＮＪｇＣ１１
２、５０ｍＭ　ＤＴＴ　及ヒ２ｏｏｍＭトリスｉ　Ｈｃ
ｅ（ｐＨ７，５）を含有する溶液を添加した。５０単位
のＫｌｅｎｏｗ　フラグメント（Ｂｏｅｈｒｉ’ｇＮｅ
ｒ　、西独マンハイム）を添加し、水浴中で１０分後試
料を３０分間で２３℃に上けた。更に、５０単位のＫｌ
ｅｎｏｗ　フラグメントを添加し、２３℃で６ｏ分後、
このポリメラーゼを６０℃で１ｏ分間加熱失活させた。

試料を１回エタノールで沈殿させ、次いでＥｃｏＲＩ及
び川ｎｄｌｌｌ　テ切断シｆｔ　ｏ　コ（’）　０．２
２ｋ１１フラグメントを電気泳動後の５チポリアクリル
アミドゲルから分離し、フラグメントを上記したように
溶離、精製した。

５０ｎＪ？のＮａ１Ｉフラグメントを２００ｎＪ／　の
ファージＭ　１３　ｍｐ、　９と混合し、全容量２０μ
σ中でＥｃｏＲｌ及びＨｉｎｄｌｌで切断した。上記し
たのと全く同様に結合及び大腸菌ＪＭ８３に形質転換さ
せた後、白色プラークが青色プラークの背景中に見出さ
れた。Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（Ｎａｔｕｒｅ、２
９９．２１　Ｏｃｔ。

１９８２）　により記載されたように２個の合成プロー
ブとのハイブリッド形成により４８個の白色プラークを
更に分析した。フィルターを３２のｐ標識オリゴスクレ
オチドと室温でハイブリッド形成させ、様々な温度で洗
浄した。プローブＡ２゜ｓ’　−ＡＴＧＧＧＴＣＣＣＧ
ＡＡＡｅ　−３’を用いて、４個以外の全てのクーロン
は４４℃での洗浄後強いハイブリッド形成を示したが、
このことはこれらのクーロンが原ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含
有していることを意味する。プローブｐ　、　、５’　
−ＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＣＣ−３’を用いて、上記
陰性クーロンの４個全ては著しいハイブリッド形成を示
した。４種のファージのうちの１　ツｍｐ９／ＩＧＦ−
Ｉ　、Ｍ３　と命名したものを更に上１ピしたように万
能プライマーを用いて配列化した。このことにより第１
２図に示したように成功突然変異誘発を確認した。

２００ｎ９　のファージｍｐ９／Ｉ　ＧＦ　−Ｉ　、　
Ｍ３及び２００ｎ＃　のプラスミドｐＵｃ　８をＥｃｏ
Ｒｌ及びＨｉ　ｎｄｌｕで別個に切断した。全容積２０
μｅ中でＴ４−リガーゼ処理後、ＤＮＡを大腸菌ＪＭ８
３を形質転換するのに使用し、＃ｌ胞をＡＸＩ板上に広
げた。上記したように切断、結合及び形質転換を行なっ
た。白色コロニーの制限分析によ！７０．２２ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ　／Ｈｉ　ｎｄｌｌ挿入物を含有する期待した
プラスミドがあることが分った。このプラスミドをｐＫ
Ｇ　１１と命名し、以下の工程で使用し女。

Ｃ，ｐＫＧｌｌを含有するシャトルプラスミドｐＴＪＮ
２００の構成 １μｇの工程Ｂで得られたｐＫＧ　１１及び２μｇの−
１４、いずれもＨｉｎｄｌｌｌで消化されたもの、を全
容［１００μｅ中で＋１４℃で１晩混合、結合させた。

ＥｃｏＲＶテ消化後、ＤＮＡ混合物を大腸菌ＨＢＩＯＩ
　に形質転換させ、■−当り５０μｇのアンピシリンを
含有するＬＡ板上に広げた。５２個の単純コロニーヲ、
１０μｇ、６艷のクロラムフェニコール及ヒ５０μｍ１
／ａｔの゛アンピシリンを含有するＬＡ板に集め移した
。２８℃で２日後、１個のクーロンが現われ、このクー
ロン中のプラスミドを制限分析により更に特徴づけした
。これにより、第１３図中に模式的に示したプラスミド
ＰＩＪＮ　２００があることが分った。このプラスミド
はＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有しており、大腸菌及び黄色ブ
ドウ状球菌いずれにおｈでも複製できる。

の構成 ｌｔｔ＆　（１）　ｐＵＮ　２００及０：　Ｉｐｊｊ　
（１）プラスミｔ’　ｐＳＰＡ１６、いずれもＥｃｏＲ
Ｉで消化させたもの、を全容積１００μｅ　中で１４℃
で１晩混合、結合させた。

このリガーゼを６５℃で１ｏ分間加熱失活させた。

Ｅ（！、ＯＲＶで消化させてｐｓＰＡ１６　を含有する
背景クーロンの数を減少させた後、ＤＮＡ混合物を大腸
菌ＨＢ　１０１に形質転換し、５０μｇのアンピシリン
を含有するＬＡ板上に広げた。４８個のクーロンからの
プラスミドを制限地図作成により分析し、このうち３個
が蛋白質Ａ遺伝子の５′末端に対応する１、１ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ　挿入物を有するｐＵＮ　２００を含有してい
ることが分った。これら３個のプラスミド中の挿入物の
配置をＨｉｎｄｌｌｌによる切断により更に分析したと
ころ、２個が蛋白質Ａ及びＩＧＦ−Ｉ−ｉ記号化する遺
伝子間に予想した融合を含有することが分った。このフ
′ラスミドをｐＵＮ　２０１と命名した（第１３図）。

この遺伝子融合のヌクレオナト配列１１０序及び推定し
たアミノ酸配列順序を第１４図に示す。成熟ハイフリッ
ト蛋白質の予想分子量は３８．７０１である。

３ク一ロン中１個が蛋白質Ａに対ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の逆
配置をイｊするｐＵＮ　２０２と命名したプラスミドを
含イエしていることが分った（第１３図）。

このプラスミドは予想分子−１ｉｉ３０．９６３　のト
ランケーションした蛋白質へのコードづけをする。

の黄色ブドウ状球菌５Ａ１１３への形質転換上記の工程
ＩＤで得られた１０μ９１のプラスミドｐＵＮ　２０１
及びｐＵＮ２０２を使用しテａ；ｔｚ　、　Ｆ　。

ｅｔ　ａｌによりＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｌ、１４５．７４
−８１（１９，８１）及び国際特許出願ＰＣＴ　／　５
Ｅ８３１００２９７に記載されたように黄色ブドウ状球
菌ＳＡＩ　１３のプロトプラストに形質転換した。３７
℃で３日後りロラムフェニコール耐性クーロンが見出さ
れ、これらの形質転換体をクロラムフェニコール（１０
μｌ／ｄ＞と共ＫＴＳＡ板（トリブチカーゼ−大豆寒天
）上に再度画線培養した。各プラスミド（ｐＵＮ２０１
及びＴ）ＵＮ　２０２　）から１個の形質転換体を更に
分析するために選択した。精製プラスミドの制限地図作
成は無傷のプラスミドが黄色ブドウ状球菌５Ａ１１３宿
主中に導入されたことを示した。

上記（工程ＩＣ及びＩＤで得られた）　ｐＵＮ　２００
ｐＵＮ　２０１及びｐＵＮ　２０２各々を有する大腸菌
細胞及Ｕ　ｐＵＮ　２０１１　ｆｃ　ｔｄ、　ｐＵＮ　
２０２を有する黄色ブドウ状球菌細胞を２００ｍの液体
培地中で１晩培養した。大腸菌株はアンピシリン（５０
μ９／ｄ）と共にＬＢ培地でそして賀色フドゥ状球菌株
はクロラムフェニコール（１０μ９／ｎに）と共にＴＢ
Ｓ（トリブチカーゼ大豆肉汁）中で発育させた。細胞は
Ｓｏｒｗｅｌｌ　ＧＳＡ　ロータＴ６０００　ｒｐｍテ
Ｉ　Ｏ分間遠心分離することによりペレット化し、上澄
液（培地と命名する）を保存した。にＩＩＩ　ｋｌペレ
ットを１０ゴのＰＢＳ　＋　ＴＷＥＥＮで洗浄し、再び
上記のように遠心分離した。今度は、細胞ペレットを１
０　ｍｌのプロテアーゼ抑制剤緩衝液（０，０２Ｍ燐酸
カリウム、ｐＨ７，５、０，１Ｍ　Ｎａ（Ｊ　、　０．
５　％デオキシコール酸ナトリウム、１％トリトンＸ−
１０００、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）及
び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ　）　）中に再懸濁させた。次いで、細胞をＭＳＥ音
波処理器で４×４０秒間水浴中で音波処理し、Ｉｓ、０
００ｒｐｍ　（５ｏｒｖａｌｌ　ＳＳ　−３４０−タ）
で１０分間遠心分離した。上澄液（細胞抽出物と命名す
る）を集め、試料中の蛋白質Ａの量を決定するためＥＬ
ＩＳＡ　試験を行なった。結果を下記の第１表に示す。

第１表 ＥＬＩ　ＳＡ試験により決定した音波処理した細胞培養
物１ｄ当りの蛋白質Ａの都、０値は０．１μＥｌ／ｍ１
未満に対応 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＵＮ２００）　０　０
Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＬＢＩＯＩ　（ｐＩＪＮ２０１）　２
　０Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＴＪＮ２０２）　
２　０Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　５Ａ１１３　（ｐｌＪＮ２０
１）　０２　、’　５Ｓ、５ｕｒｅｕｓ　５Ａ１１３　
（ｐＵＮ２０２）　０　’　５Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯ
Ｉ　０　Ｏ ８，ａｕｒｅｕｓ　ＳＡ］１３　０　０大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　）及び黄色ブドウ状球菌（Ｓ。

ａｕｒｅｕｓ　）いずれにおいても生成された蛋白質Ａ
の量は蛋白質Ａ遺伝子を含有するフラグメントの配置に
より影響さね、ないこと（プラスミドｐＵＮ　２０１対
ｐｌＪＮ　２０２　）が第１図から分る。かぐして、ｐ
ＵＮ　２０１により記号化された蛋白質ＡＩＧＦ−Ｉハ
イブリッド蛋白質をｐＵＮ　２０２によし記号化された
トランケーションした蛋白質Ａとほぼ同一のレベルで生
成された。予想した通り、いずれの蛋白質も大腸菌の細
胞抽出物及び黄色ブドウ状球菌の培地中に見出された。

Ｉａ　ｍ　Ｔ　ｍ　Ｃ：ｙ　１ｔ７ｊ　ｐＩＪＮ　２０
１　及Ｕ：　ｐｒＪＮ　２０２　各各を有する黄色ブド
ウ状球菌ＳＡ］１３の培地を酢酸ナトリウム緩衝液（０
，１Ｍ′＃：酸ナトリウム、２％ＮａＣ１、ｐＨ５，５
）　Ｔ予め平衡化しておいりＩｇＧ−セファロース（５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　、登録商標）４Ｂカラム（Ｐｈｒｒ
ｍａｃｉａ　Ａ　Ｂ　、　スウェーデンアプサラ）（Ｈ
ｉｅｌｍ　ｅｔ　ａｌ、Ｆ”ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２８，
７３−７６（１９７２Ｊ）に通した。次すで、カラムを
上記と同一の緩衝液で洗浄し、吸着した蛋白質Ａをグリ
シン緩衝液（０，１Ｍグリシン、２１　ＮａＣ１１！　
、　ｐＨ３，０）　’ｔｌ’溶離した。溶離した両分を
蒸留水に対して透析し、次いで２種のアリコートとして
親液化した。アリコートの一方の蛋白質へレフトを１３
　％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで１００ｖで１
２時間分析した。

ゲルをアミドブラック（０，１９６，４５％メタノール
、１０％酢酸中）で染色した。こハによりｐＵＮ　２０
１については３８．７０１及びｐｌＪＮ　２０２につい
ては３０．９６３の分子量を有する主要蛋白質が分った
。これはＤＮＡ配列順序から推定した予想した大きさと
一致している（上記工程ＩＤ参照）第二のアリコートを
０．５　ｍの７０チ蟻酸中に再懸濁し、３７℃で２日間
培養した。この方法はジペプチド配列順序アスパラギン
酸−プロリンのところで蛋白質を切断する。ｐＴＪＮ　
２０１により記号化されたハイブリ％′ｌド蛋白質から
の予想した分解生成物はＮ末端グリシンのないＩＧＦ−
Ｉ部分は別としで、６８００．６６００．６６００．６
６００　及び６００　の分子量を有する５種のオリゴペ
プチドであった。−上記したように、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動によりやはり主蛋白質バンドは約３
８．０００から７０００付近の数本のバンドへ移行され
ることが確認される。

＠酸処理した蛋白質を親液化し、蒸留水に再懸濁した。

ｐＵＮ　２０１からの試料を上記したように１９Ｇ−セ
ファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ登録商標）４Ｂカラム
に通した。流出５ｉ及び溶離した物質（グリシン緩衝液
と一緒）を更に分析するため保存した。

■　ラジオレセター分析（ＲＲＡ　）による蛋白質生成
物の分析 Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、　４８２７１−２９８（１９
７４）に従ってマトリックスとしてヒト胎盤粘膜の粒状
画分を用いてラジオレセプター分析（ＲＨＡ　）を行な
った。この分析にて使用した標準はｉｉ当り１単位（Ｕ
）のＩＧＦ−Ｉの効力を有する保存正常ヒト血清からな
っていた。

分析の下限は１　ｍｌ当り１０ｍＵ　であった。標識に
使用したペプチドはＣｏｈｎ画分■から（ＲＲＡ　Ｋよ
り）５００Ｕ／ｎ、９蛋白質の比活性ｌで精製した。

ペプチドの標識はＴｈｏｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏ
ｅｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔｌａ　２５１　、３６３−３６
９　（１９７１）　に従って行なった。トレーサーの精
製はｐＨ４，０からｐＨ１６，８までの０．１　Ｍ　Ｎ
ｔ（４０Ａｃ　の溶離勾配を用いてカルボキシメチルセ
ルロースカラムで行なった。トレーサーの比活性は約２
０μＣｉ／μｇであった。分析は下記のように行なった
０ 標準１′ｆＣは未知試料（ｉｏｏμＪ）を１００／ｊＪ
の胎盤粘膜及びＺｏｏμｅの標識ＩＧＦ−Ｉと共に４℃
で１晩培養した。遠心分離後、ペレットを１回洗浄し、
カンマカウンターで計測した。試料の効力は「自家（ｉ
ｎ　ｈｏｕｓｅ　）　Ｊコンピュータープログラムを用
いて計ｑした。

上記工程■で得られた蟻酸処理の前及び後の試料をＲＲ
Ａ試験により分析し、結果を下記の８１！２表に示した
。

第２表 １９Ｇ親和性クロマトグラフイーによる分離及び精製後
の黄色ブドウ状球菌ＳＡ ］　１３　（ｐＵＮ　２０２　）　及ヒ黄色７−　トウ
状球菌Ｓ　Ａ　１１３　（ｐＵＮ　２０１　）がらの発
育培地中のＩＧＦ−Ｉ活性のラジオレセプター分析（皿
Ａ）。０はＩ　Ｕ／１石地未満に対応する。

蟻酸忙よる処理の後　０ ｐＵＮ２０］　蟻酸による処理の前　〇蟻酸による処理
！の後　１−４３ ×　− 流出液　１０６ 溶離液　１９ Ｘ＠酸処理した試料をＩ、９Ｇセフアローズ（５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ登録商標）カラムに通し、そして吸着した（
溶離液）及び吸着しなかった（流出液）ＩＧＦ−Ｉにつ
いて活性を測゛定した。

第２表から、ｐＵＮ２０１により記号化したハイブリッ
ド蛋白質は何ら検出可能なＩＧＦ−Ｉ活性を有していな
いことが窮える。蟻酸による処理はＩＧＦ−Ｉ活性を与
え、この活性のほとんどがＩ、９Ｇ親和性カラムに結合
しない。このことは蛋白質Ａ及びＩＧＦ−Ｉ部分間の成
功した切断を示す。

以上、本発明の態様を示してきたが、本発明は勿論これ
らに限定されるものではなく、特許請求の範囲により定
義されたようにその範囲から離れることなく多数の変化
及び一部修正が可能である。

本発明は上に示し記載したような操作と同一の詳細また
は同一の遺伝子、ベクター、プラスミドもしくは方法に
限定されるべきではないことが理解されよう。なぜなら
ば、明白な一部修正及び同等物は当業者にとって明らか
であるからである。

従って本発明はその同等物原理の適用も含めて特許請求
の範囲の完全な範囲によってのみ限定される０

【図面の簡単な説明】

第１図は合成ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のコードづけ部分のため
選択した特定の好ましい配列順序を示したものである。 図中、この蛋白質の分子量は７７７５．９３である。 第２図は合成遺伝子を構成する合成オリゴヌクレオチド
ブロックを表わしたものである。図中、２本のＤＮＡ　
鎖（Ｉ　ＧＦ−Ｉ遺伝子のためのもの）はオリゴマーＡ
１〜Ａ１７及びＢｌ〜Ｂ１７に分割されている。第１図
に記載したＤＮＡコードに加えこの配列順序は出発コド
ン（ブロックＡ２中のＡ’Ｉ”Ｇ　）、終止コドン（）
゛ロックＡ１７中のＴＡＧ）　１及びＥｃｏＲｉ　（ブ
ロックＡＩ）及び川ｎｄｌｌｌ　（ブロックＡ１７）が
ｂえられている。 第３図はＩＧＦ−Ｉ遺伝子のためのＴＸＪｉ分制限酵素
地図である。　？ 第４図は完全に保繰されたテトラデカヌクレオチドの組
立てを図示したものである。 第５図は実施例１にて使用した化合物中の記号の説明で
ある。 第６図は完全合成された遺伝子を図示したもの（ＩＧＦ
−Ｉの結合パターン）である。 第７図はキメラクーロン形成性表現ベクターのｍ成を図
示したものである。 第８図はＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有するキメラプラスミド
の構成を図示したものである。 第９図はＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有する他のキメラプラス
ミドの構成を図示したものである。 第１０図は突然変異誘発による蛋白質の合成に訃ける切
断部仏の挿入を説明した図である。 第１１図は合成ＩＧＦ−Ｉ遺伝子及びプライマー間の不
適合を示す図である。 第１２図は成功した突然変異誘発の一例を示すものであ
る。 第１３図はｐＵＮ　２００を経由するｐｔＪＮ　２０１
及＞　ＰＵＮ　２０２の製造の模式図である。 第１４図は第１３図に示した遺伝子融合によるヌクレオ
チド配列順序及び推定アミノ酸配列順序である。 代理人　弁理士　秋　沢　政　光 他１名 ００　Ω〉−〇 ＞　ｒ　ｎ　ｒ　Ｃ”ｌ　べ 〉仁　−＞　１”’）Ｃ／１ 葺〉　■　矢β　茶口　１ １’ｊｉ＝　ＣＡＡＡＧ　＋　Ｃ＋≦１譬ＣＡＡＡＧＣ
＋　Ｃ＋！；ｉ、＝ＣＡＡＡＧＣＣ＋　Ｃ”（Ｓ）ＣＡ
ＡＡＧＣＣＣ＋　Ｔ　−５ｉ）−ＣＡＡＡＧＣＣＣＴ　
＋　Ｇ　−（ｊｉ−ｃＡＡＡｃｃｃｃｒｃ　＋　ｃ、＋
　、９ｆ−ｃＡＡＡｃｃｃｃｒｃｃ　＋　ｃ→（Ｓｉ’
←ＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＡじ　リ　じ　リ ＩＧＦ−Ｉ　Ａｓｐ 、、、、、、ＣＣＧＧＴＣＡＣＴＴΔＡＧＡＴＡＣＣＣ
ＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＣ，、、、、
−５’ＩＧＦ−Ｉ　Ａｓｎ 、、、、、、ＣＣＧＧ１’ＣＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＣＣ
ＣＡＧＣＧＣＴＴ’ｒＧＡＧＡＣＡＣＧＣＣＡＣ，、、
、、−５’ＩＧＦ−Ｉ　Ｔｒｐ 、、、、、、ＣＣＧＧ’ｒＣＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＣＣ
ＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧΔＧＡＣＡＣＧＣＣＡＣ，、、、
、、−５’Ｓ’−ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧ（？ＧＧＴＣ
ＣＣＧＡ−３’ＶＨＩＩＡｓｎＳｅｒＴｒｐＧ１ｙＰｒ
ｏＣ１ｕ寸　、、Ｏω　ｏ　Ｎ　寸　Ｏ Ｎ　＋？　６　の　（Ｉリ　ｃ　ト ド　−　Ｎ　Ｎ　Ｉ′　寸　ψ　Ｌ） 第１頁の続き ０発　明　者　ガンナー・パル云 スエーデン国ストックホルム ニス−１１２５４オ一フアーオ ヅフエーグ５番 ０発　明　者　スタフアン・ジオセフソンスエーデン国
ストックスンド エス−１８２７４ヘ一グスチー ン２番 ０発　明　者　ラールーオロフ・ヘーデンスエーデン国
ファクスホルム エス−１８５００バイゲ工ルドニ フエーゲン２５番 ■発明　者　エリク・ホルムグレン スエーデン国すデインゲエー・ ニス−１８１４７０モフ工−ゲシ ３番 ”　ｌＴ＋）　昭和タ２年２月１１コ 特許庁　長省　殿 堆５１　の名　称を県才費えタト７′ラスミド；干９Ｉ
Ｆ嘩＝ｆ黄乍トｊ警跨マ勿、不°リスえ〉・）ボ゛ヌフ
レイ堡ド°件升ロ、住乍勿を台勺Ｃニジ奮↑１７−、蚤
台９ｔｑ’＝’＋ｓ％’＝為補正をする者 事件との関係　出滑女又 、代　理　人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒトインシュリン様発育因子−Ｉ　（ＩＧＦ−
   Ｉ）を表現するためにコードづけする合成生産遺伝子を
   その中に同一線上に挿入したベクターを含むことを特徴
   とする微生物宿主の形質転換に使用するための組換え体
   プラスミド。 （２）捜大した遺伝子に対し、かっ捜大した遺伝子が細
   菌プロモーターの支配下にあるように細菌プロモーター
   を挿入部位の上流側にｌｌＡ接書せで有するｍＲＮＡの
   適切相における翻訳を特徴とする特許請求の範囲第（１
   ）項記載のプラスミド。 （３）原生生物中に天然に存在する自己発生性ゲノムか
   ら誘導された特許請求の範囲第（１）または（２）項記
   載のプラスミド。 （・１）該遺伝子は出発コドン（ＡＴＧ　）、終止コド
   ン（ＴＡＧ　）及び制限酵素部位が与えられている特許
   請求の範囲第（１１〜（３）項のいずれか一つの項記載
   のプラスミド。 （５）　コドンはトリヌクレオチドコドンである特許請
   求の範囲第（４）項記載のプラスミド。 （６）プラスミドベクターの源がエシェリヒア属から選
   択される微生物である特許請求の範囲第（１）〜（５）
   項のいずれか一つの項に記載のプラスミド。 （７）該ベクターは大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２から
   なる特許請求の範囲第（６）項に記載のプラスミド。 （８）　ヒトインシュリン様発育因子−Ｉ　（ＩＧＦ−
   ４）を表現するためコードづけする合成生産遺伝子をそ
   の中に挿入したベクターを含む組換え体プラスミドを包
   含する形質転換体微生物。 （９）微生物はエシェリヒア属から選択される特許請求
   の範囲第（８）項記載の形質転換体微生物。 α■　微生物は大腸菌である特許請求の範囲第（９）項
   記載の形質転換体微・生物。 αＩ）微生物は大腸菌Ｋ１２のＪＭ８３及び２９４株で
   ある特許請求の範囲第（１（１１項記載の形質転換体微
   生物。 Ｑ擾　ヒトインシュリン様発育因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）
   を表現するためにコードづけするポリデオキシリボヌク
   レオチド断片。 （１３）その両端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位、
   該部位の一方の中に出発コドン（ＡＴＧ　）及び該部位
   の他方の中に終止コドン（ＴＡＧ　）　、及び該コドン
   間にヒトインシュリン様発育因子−■・、（ＩＧＦ−Ｉ
   ）　を表現するためにコードづけする遺伝子を有する特
   許請求の範囲第０３項記載のポリデオキシリボヌクレオ
   チド断片。 （＋４１　実質的に第２図に示した特許請求の範囲第０
   項記載のポリデオキシリボヌクレオチド断片。 ０９　ヒトインシュリン様発育因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）
   を表現するためコードづけする合成生産遺伝子を含む絹
   換え体プラスミドを包含する形質転換体微生物を適当な
   栄養培地中で蛋白質が生成されるまで培養し、次いで該
   蛋白質を単離することを含むヒトインシュリン様発育因
   子−■蛋白質（ＩＧＦ−Ｉ）　の製造、方法。 αｅ　メチオニル−ＩＧＦ−Ｉト ａη　メチオニル−ＩＧＦ−Ｉ−ｉたはＩＧＦ−Ｉを含
   む融合蛋白質。