JPS63233791A - Ｍｅｔ−インスリン様成長因子Ｉの発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 狐果上件社且立洋 本発明は、インスリン様成長因子■誘導体の製造に関し
、さらに詳しくは、インスリン様成長因子１のＮ末端に
メチオニンがついたメチオニルインスリン様成長因子（
以下、Ｍｅｔ−ＩＧＦ−ｒという）のＤＮＡ組換え法に
よる製造に用いるための発現ベクター、並びに、該発現
ベクターを用い−てＭｅｔ−ＩＣＦ−１を製造する方法
に関するものである。

従来技術 インスリン様成長因子（以下ＩＧＦという）は、血中に
存在するインスリン類似のペプチドの内、酸−エタノー
ル画分から同定された物質であり、インスリン様成長因
子Ｉ（以下、ＩＧＦ−１という）とインスリン様成長因
子■（以下、ＩＧＩ？−１１という）が含まれる。これ
らは種々の細胞の増殖促進作用を有しており、その産生
および分泌は成長ホルモンに依存している。

これらのＩＧＦはいずれも成長ホルモンの骨成長促進作
用を仲介する物質であるソマトメジン群に含まれている
が、特に、ＩＣＦ−１は成長ホルモン依存性が高く、ソ
マトメジンＣと同一の物質であり、成長ホルモンの作用
の発現に深く関与していることがわかっている。従って
、ＩＣＦ−１を大量生産し、治療や研究に供することは
、極めて有意義といえる。

しかしながら、これまでＩ　ＣＦ−１の１１ＦＪ製は、
血清から単離する方法によっていたため、収率が低く、
需要に充分応えることができなかった。しかも、この方
法は、極めて非能率的である上、得られる物質中に様々
な不純物が含まれているおそれがあった。

しかるに、近年、遺伝子操作技術の発展に伴って、様々
な生理活性物質を大量に生合成することが可能となり、
Ｉ　Ｇ　ｌ”　−１に関して乙、その様な試みがなされ
ている。しかしながら、ＩＧＦ−１の如く、比較的低分
子量（約７０００〜７５００）のペプチドをＤＮＡ組換
え法で合成する場合、直接発現法によると、生成物が細
胞内のタンパク分解酵素（プロテアーゼ）により分解さ
れてしまうので、収率が著しく低下するという問題点が
ある。

そこで、適当な他のペプチドとの融合物として発現さ仕
る工夫がなされている。融合ペプチドとして発現された
生成物は、インビトロでの切断により、ＩＧＦ−１を与
える。

上記の方法を利用したＩＧＦの製造例が特開昭５９−２
０５９９７号等にみられる。ここでは、複製系、プロモ
ーター、リーダー配列およびプロセッシングシグナルを
含む構造遺伝子、並びに転写終結配列を含むＤＮＡ構成
物で酵母を形質転換し、得られた形質転換体を適当な条
件下で培養することにより、プレーＩＧＦを発現させて
いた。

次いで、発現されたプレーＩＧＦはプロセッシングされ
、成熟ＩＧＦ’が培地中に分泌されることになる。

本出願人も大腸菌内でＩ　ＧＦ−１を保護ペプチドとの
融合物として発現させ得る発現ベクターを組立て、該ベ
クターを用いてＩＧＦ’−１を大腸菌内で生産さＵ・る
ことに成功した（特開昭６１−１３９６号）。即ち、上
記のベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体を適当な条件下で培養することにより、ＩＧＦ−［を
含む融合ペプチドを生産させ、該融合ペプチドを臭化シ
アンやコラゲナーゼを用いた脱離反応に付し、Ｉ　ＧＦ
’−■を分離した。

しかしながら、ＩＯＦ’−Ｉを含む融合ペプチドとして
ＩＧＦ−１を発現させる方法は、融合物からのＩ　ＣＦ
’−Ｉの分離工程等を要し、工程が複雑である。

従って、目的物質Ｉ　ＣＦ−［を効率良く発現さ口“、
しかも容易に回収することのできる発現系を得ることが
望まれている。

本発明者らは、Ｉ　ＣＦ−１を、簡単に、しかも高収率
でｒＵＩＪ造する方法を確立することを目的として研究
を重ねた結果、ポリシストロン性の発現系によって、Ｉ
Ｃ：［？’−１とある種の“他のペプチド”とを同時に
発現させると、この“他のペプチド“のｑ在により、Ｉ
Ｇｒ’−１がプロテアーゼによる分解から保護され得る
ということを発見し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ＩＧＦ−１、および該ＩＣＦ−ｒのプ
ロテアーゼによる分解を阻止し得ろ“他のペプチド”と
をコードしており、大腸菌内で機能的かつ複製可能なポ
リシストロン性発現ベクターを提供するものである。

また本発明は、この発現ベクターによって形質転換され
た宿主細胞を提供するものである。

さらに本発明は、上記の形質転換体を用いて■ＧＦ−１
を製造する方法を提供するものである。

ポリシストロン性の発現系を用いた発現ベクターの例は
、ショーナー（Ｂ、　Ｅ、　５ｃｈｏｎｅｒ）により１
川示されている［プロシーディンゲス・オプ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンセズ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ８１
　５４０３〜５４０７（１９８４）］。この報告では、
第１シストロンにアミノ酸敗２０〜２５程度の適当なペ
プチドの暗号配列であってＩ！１ｒｌＮＡの転写時のス
テム・アンド・ループＩａ造の形成を阻止し得る暗号配
列を含有させることにより、ｍＲＮＡをリポソームと結
合し易くし、第２シストロンにコードされているウシ成
長ホルモン（ｂＧＨ）の発現を促進する様に構成された
発現ベクターが示されている。

これに対し、本発明の発現ベクターは、第１シストロン
にコードされている“他のペプチド“によって第２シス
トロンにコードされているＩＧＦ−１を酵素分解から保
護する様に設計されたものである。

Ｉ　ＣＦ−１は、アミノ酸７０個からなる分子ｍ約７，
５００の、タンパク分解酵素に不安定な塩基性ペプチド
である。本発明者らは、この様な酵素に不安定なＩ　（
１；Ｆ−１を、“他のペプチド′と共にポリシストロン
系ベクターを用いて発現させることにより、ＩＧＦ−［
を分解から保護し得ることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

この様な“他のペプチド”としては分子量約５００〜５
０．０００、好ましくは３．００〜１５．００（ｌの酸
性ペプチドか挙げられる。ここでいう酸性ペプチドとは
ｐＩ（等電点）が４．０〜７．０、好ましくは５．０〜
６．０のペプチドである。

“他のペプチド“の例としては、例えば、ペプチドＣｄ
（以下、Ｃｄという、後述のＦｒａ−１３−７、第１６
図参照）、ペプチドＬ　Ｉ−１（以下、ＬＨという、Ｆ
ｒａ−Ｂ−４、第１３図参照）、Ｃｄ−ＬＨ融合ペプヂ
ド（以下、Ｃｄ−１，Ｔ、ｌという、Ｆｒａ−８−６参
照）（以下必要に応じて同様の略号を用いる）等を挙げ
ることができる。これらの内、等電点を考慮すると、発
現効率の高いペプチドであると思われるＣｄ−Ｌｌ（が
最も好ましい。

本発明の発現ベクターの具体例であるプラスミドｐＣＥ
　−Ｓ　ＭＬｒｐ（第２図の１）およびプラスミドｐＣ
Ｅ　−Ｓ　Ｍ　３　ｔ（第２図の２）は、いずれも、第
１シストロンにＣｄ−ＬＩＥ遺伝子（本明細書中、Ｃｄ
−Ｌ　Ｉ（をコードする遺伝子をＣｄ−Ｌｌ−１遺伝子
といい、以下、同様にこの表現法を用いる）を、第２シ
ストロンにＩＧＦ−１遺伝子を含有しており、適当な宿
主に導入されて転写されることにより、２シストロン性
ｍＲＮＡを生成する。このｎＲＮＡが翻訳されると、そ
れぞれのペプチドが同時に発現されることになる。

さらに詳しくは、本発明の発現ベクターのシストロン部
分は、以下の模式図で示される。

１６１１′Ｉｌシストａン→十ト第２シストロン例本明
細書中、プロモーター遺伝子とは転写活性化配列から始
まり、下流の翻訳開始信号に至る配列（翻訳開始信号は
プロモーター遺伝子には含まれない）を含む遺伝子単位
を指す。

また本明細書中、ソストロンとは翻訳開始信号（ｌ＼′
ｒ　Ｇ　）、何らかのペプチドをコードする遺伝子およ
び翻訳停止信号（本明細書中に記載の式あるいは添付の
図面では翻訳停止信号を“終止”と表示する）をこの順
番で含む遺伝子の機能単位を指す。

またそれぞれのラストロン中のペプチドをコードずろ遺
伝子が翻訳されるためには、それぞれのシストロンの上
流にンヤインダルガノ配列（以下、ＳＤ配列という）が
存在することが必須である。

本発明ベクターにおいては７ｊｔ、Ｉシストロンの上流
であって、かつプロモーター遺伝子の下流に、また第２
ソストロンの上流であって、かつ第１シストロンの下流
にＳＤ配列が存在する。第１ンスト〔ノンの下流のＳＤ
配列は“他のペプチドをコードする遺伝子の一部でもあ
る。

なお第１７ストロンの翻訳停止信号は第２シストロンの
翻訳開始信号の下流に隣接して存在していてもよく、そ
の場合には、第１シストロンの翻訳停止信号は第２シス
トロンのペプチドをコードする遺伝子の一部でもある。

２個のシストロン間のヌクレオチド配列は、さらに詳し
くは、式・ （図中、Ａはデオキシアデニル酸、Ｇはデオキソグアニ
ル酸、Ｃはデオキノノチジル酸、′Ｉ゛はデオキンチミ
ジル酸を表わす） で示される。上記の、または以後のアミノ酸の略語によ
る表示は、周知の表示方法に従う。

上記の式において、第２シストロンのＩＧＦ−！の第１
番目のアミノ酸であるグリツジをコードするヌクレオチ
ド配列（具体的にはＧＧＴ等）の上流にあるメチオニン
をコードするヌクレオチド配列ＡＴＧは、同時に第２シ
ストロンの翻訳開始信号でもある。

本明細書中では、このヌクレオチド配列と第１シストロ
ンの翻訳停止信号（具体的にはＴ　Ａ　Ａ等）とか一体
となって形成されるヌクレオチド配列を、便宜上、“ン
スＩ・ロン連結配列”と呼称する。

“シストロン連結配列”は上記式ではその具体例として
Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇで示されているが、この具体例のよ
うに、翻訳停止信号（ＴＡＡ）と翻訳開始信号（Δ’Ｉ
”　Ｇ　）が重複したヌクレオチド配列の外、隣接した
ヌクレオチド配列、１〜２個の両者が塩基対を介して接
しているヌクレオチド配列ら含まれる。

重複したヌクレオチド配列としては、上述のＴＡＡ　ｉ
’　Ｇ　ノ外、Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ヤ、翻訳停止Ｆ信
号と翻訳開始信号の位置が逆転したＡＴＧＡ等が挙げら
れる。隣接したヌクレオチド配列としてはＴ　Ａ　Ｇ　
Ａ′１゛Ｇ、ＴＡΔΔＴＧ、ＴＧＡＡＴＧ等が挙げられ
る。

“シストロン連結配列”はその上流の第１シストロンの
“他のペプチド”をコードする遺伝子の一部でもあるＳ
Ｄ配列と一体となって、第１シストロノと第２シストロ
ン間のヌクレオチド配列を形成する。この場合、ＳＤ配
列と“シストロン連結配列”の距離は５〜１５塩基対、
好ましくは６〜８塩基対である。

ＳＤ配列と“シストロン連結配列”を含むヌクレオチド
配列を含む好ましいリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ断片としては例
えば、後述のＦｒａ−Ａ−３等が挙げられる。

このＳＤ配列と゛シストロン連結配列”を含むリンカ−
ＤＮＡ断片をＩＧＦ＋遺伝子の５゛末端に結合さけるこ
とにより、２シストロン性発現ベクターを得るためのＤ
ＮＡ断片（後述のＦｒａ−Ａ−７等）を構築した。次い
で、例えば、本出願人の出願（特願昭６１−１４１９０
０号）に係ろα−ｈ　Ａ　Ｎ　Ｉ）発現ベクターｐＣＬ
ａ１ｌｔｒｐＳｄ（Ｃｄ　−Ｌ　Ｈとａ　−ｈＡＮＰと
の融合ペプチドをコードしている発現ベクター）におい
て、１２−ｈＡＮＰ遺伝子（１１ｉｎｄ　［１１−１１
−ｌ３ａ部位）を該１）　Ｎ　Ａ断片で置き換えろこと
により、本発明の所望の２シストロン性発現ベクターを
得ろことができる。

従って、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し
、得られた形質転換体を適当な条件下で培養すると、２
種のポリペプチド、即ち他のべブヂド”例えばＣｄ−Ｌ
、Ｈと、［ＧＦ’−１とが同時に、独立して発現されろ
。但し、ｒ　ｃ　Ｆ−ｒの場合、翻訳開始信号であるＡ
ＴＧがそのコードするメチオニンとして発現されたまま
残るので、得られるペプチドはＩ　Ｇ　Ｆ　−１の５°
末端にメチオニンのついたＭｅｔｌＧ＋”−１である。

このとき、；１’を独の直接発現においては、細胞内プ
ロテアーゼで分解され易いＩＧＦ−１が“他のベブチ１
ご例えばＣｄ−１、ＩＩのｒｊｔＥにより、安定に細胞
内に保持されることか示された。二の“曲のペプチドに
よる１ＧＦ−１の安定化は、塩基性の１０１””−１と
酸性のペプチド、例えばＣｄ−１ｊ−１との会合によっ
てプロテアーゼの分解作用が阻止されることによると思
イつれる。次いて本発明の２７ストロノ性発現ベクター
で形質転換された形質転換体を溶解し、リゼイト中に存
在する会合した２種のペプチドを、例えば、酸に対する
溶解性（［ＧＦ−１は可溶性であり、Ｃｄ−Ｉｊ（は不
溶性である）に基づいて分離することができる。

［Ｇ　Ｆ　−１遺伝子を宿主微生物、特に大腸菌内で効
率良く発現さＵ゛るために最乙一般的に用いられている
プラスミドは、大腸閉由来のブラスミ（・ｐｌ’３１え
３２２である。本発明においてらこのプラスミドを出発
ブラスミＦとして用いろか、その他のプラスミドであっ
て乙、大腸菌内で複製保持される限り、使用し得る。そ
のようなプラスミドには、例えば、ｐＵｃ９、ｐＡＴ１
５３等が含まれる。

また、バクテリオファージら使用しく１．）る。

本発明の発現ベクターに用いるブ〔ｌモーター遺伝子（
よ、通常用いられる種々のプロモーター系から適宜選択
される乙のであってよいか、本明堝１１占においては、
大腸菌のトリプトファンプロモーターのヌクレオチド配
列に基づいて、本発明台らか新たに合成した合成Ｌｒｐ
プロモーター逍伝子を用いて示した。

また本発明ベクターに用いる転写終結配列としでは発現
ベクターの組み立てに用いるプラスミドもしくはファー
ジ由来の転写終結配列をそのまま用いてもよいが、第２
シストロンの下流に、合成ターミネータ−遺伝子、例え
ば合成ｆｄファージターミネーター遺伝子等を挿入する
ことによって転写終結配列としてもよい。

本明細書において具体的に示した合成ｔｒｐプロモータ
ー遺伝子は、３種あり、それぞれ、転写活性代配７１１
は同一であるが３°末端の構造が異なっている。それら
は、合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子、合成ｔｒｐプロ
モーターＩ＋遺伝子および合成ｔｒｐブ［７モーターＩ
ＩＩ遺伝子である。

これらを総称して、また例えば合成プロモーター■遺伝
子と合成プロモーター■遺伝子を同時に用いろ場合等も
含めて合成Ｌｒｐプロモーター遺伝子という。また“合
成”の語は適宜省略する場合らある。

本発明の発現ベクターの組立て方法を以下に具体的に示
す。まず出発プラスミドｐＢ＋１３２２［テトラザイク
リン耐性付与遺伝子（以下ＲＴｅｔという）およびアン
ピシリン耐性付与遺伝子（以下１くΔｍｐという）を含
む］をＥｃｏｎｌおよびＢａｍＨ［消化に付し、得られ
た大きいＤＮＡＩ析片と、ｔｒｐプロモーターｌ遺伝子
（Ｆｒａ−１，１６３ｂｐ）とをライゲートさけろこと
により、Ｒ１’ｅｔを欠失したプラスミドｐＴｒｐ［シ
＋３７を得る。次いて、この１）’１’　ｒｐＥ　［３
７をＩＥ　ｃｏｎ　ｒ　−Ｂ　ａｍ＋−１１消化に付し
、ｔｒｐプ（Ｉモーター■遺伝子内のｌ”＞ｃｏｆ１１
部位から下流を欠失させ、（かくして得られるプロモー
ター■遺伝子から、ＩＥ　Ｃｏ　Ｔ（Ｉ　Ｆ＜　（ｆか
ら下流を欠失さＵた断片をプロモーター！遺伝子という
）これに、ｐｎｆ１３２２をＥｃｏｎｌＩ−ＢａｍＨｌ
て消化して（すらる小さいＤＮＡ断片を挿入すると、ｔ
ｒｐプロモーターＩ遺伝子を含ａし、Ｉ？’ｒ’ｅｔお
、ｋ　Ｕ　ＲＡ　ｍｐ８　（ＴスルプラスミドｐＢＲ３
２２ｔｒｐが得られろ。このｐ［３ｆ１３２２ｔｒｐを
Ｅｃｏ［’ｌ［−Ｃ１ａｌ消化に付し、大きいＤＮＡ断
片とＬｒｐブ〔ノモーターＩＩＩ遺伝子（Ｆｒａ−ｒ３
−３）とをライゲートさせ−ると、ｔｒｐプロモーター
Ｉ遺伝子およびＬｒｐプロモーターｌｌ造伝手伝子の順
番で含むプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳが得られる。

Ｌｒｐプロモーター■および■遺伝子（Ｆｒａ−１３−
１およびＦｒａ−Ｂ−３）のヌクレオチド配クリ並びに
制限部位、およびプラスミドｐＢＩ（３２２をＥｃｏＲ
Ｉ−１３ａｍＨＩ消化に付して得られる小さいＤＮＡ断
片の制限部位を以下に示す。

Ｆｒａ−８−１（１６３ｂｐ）ｔｒｐプロモーター■遺
伝子１ｐａｌ ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣ Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＣＧ　Ｔ　’ｒ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　
Ａ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　’Ｉ”　Ａ　ＣＴ　ＣＧ　Ａ　
ＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｇ
　Ｔ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＡ　Ａ　Ｔ　
Ｔ　Ｇ　Ａ　’ｒ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　ＣＧ　Ｔ　’ｒ　Ｃ
ＡＡ　Ｇ　’Ｉ’　ＯＣＡ’Ｉ’Ｔ１’Ｔｉ’　ＣＣＣ
ＡＴ　ＡＧ　ＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣ’ｒＴＣＴＧＡＡ
ＡＧＴＧＡＡＧ１６６　　ＢａｍＨＩ Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＧＣＡ　ＣＡ　
Ａ　Ｃ’Ｆ　ＡＴ　ＯＣＴ　Ａ　ＧＦｒａ−８−２（３
７５ｂｐ）　ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ　−１３ａｍｌ
−１１消化に付して得られる小さいＤＮＡ断片１ａｌ Ｐｒａ−Ｂ−３（１０５ｂｐ）ｔｒｐプロモーター■遺
伝子１ｐａｌ ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣ ＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴ’ｒＴＡＣＴＣ
ＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴ　ＧＡ
’Ｉ”　ＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡ　Ｔ　ＣＡＴＧ　ＣＧ’ｒ
ＴＣ９０１００Ｃ１ａｌ ＴＴ　ＣＡ　ＣＧ　ＴＡ　ＡＡＡＡＧ　Ｇ　ＧＴ　ＡＴ
ＡＡＧ　Ｔ　Ｇ　ＧＡＴＴＴ’ｒＴ　ＣＣＣＡ’１’Ａ
Ｇ　Ｃｔｒｐプロモーター■および■遺伝子を含有する
プラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳの組み立て模式図を第４
図に、そして中間体プラスミドｐＴｒｐＥＢ７の組立て
模式図を第３図に示す。

次いで、ＣｄとＬ　Ｈ−ＲＨ（ペプチドＬ　Ｉ−１と後
述のペプチドＲＨが結合したペプチド）との融合ペプチ
ドをコードしているプラスミドｐＣｄγを、以下の如く
にして組立てる。

出発プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏｆｌＩおよびｎａ
ｍＨＩ消化に付し、大きいＤＮＡ断片を回収してＬＨ遺
伝子（Ｆｒａ−Ｂ−４）とライゲートさせる。

得られたプラスミドｐＬＨ＋０７をＨｉｎｄｌｌｌおよ
びＢａｍＨＩ消化に付すことによりＦｒａ−８−４のト
ｌ１ｎｄＩｎ部位から下流を除去し、ｒｔＨ遺伝子（Ｆ
ｒａ−Ｂ−５）を挿入してＬ　Ｉ−１−ＲＨ遺伝子を含
むプラスミドｐγＦ−３を得る。次いで、このｐγＦ−
３をＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＬ　ｆ（−
Ｉｔ　Ｈ遺伝子（Ｆｒａ−Ｂ−６）を得る。

次に、このＰｒａ−Ｂ−６を、ｐＴｒｐＥＢ７のＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により得た、ｔｒｐプロモー
ターｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片とライゲートさせ、ｔｒ
ｐプロモーター１遺伝子の下流にＬ　Ｈ−Ｉｔｌ−！遺
伝子を含有するプラスミドｐγｔｒｐを得る。このプラ
スミドｐγｔｒｐをＨｐａＥおよびＥｃｏＲｒで消化し
て大きいＤＮＡ断片を回収し、これをｔｒｐプロモータ
ー■遺伝子の一部と、Ｃｄ遺伝子とを含むＤＮＡ断片（
Ｆｒａ−Ｂ−７）とライゲートさせ、ｔｒｐプロモータ
ー［、ｔｒｐプロモーター■、Ｃｄ遺伝子およびＬ　Ｉ
−１−ＲＨ遺伝子をこの順番で含有するプラスミドｐＣ
ｄ７を得る。　Ｆｒａ−Ｂ−４、Ｆｒａ−Ｂ−５、Ｆｒ
ａ−Ｂ−６およびＦ’ｒａ−Ｂ−７のアミノ酸配列およ
びヌクレオヂド配列、並びに制限部位を以下に示す。ま
た、プラスミドＩ）Ｃｄγの組立て模式図を第５図に示
す。

Ｆｒａ−８−４（２３６ｂｐ）　Ｌｉｔ遺伝子ＡＡＴＴ
Ｃ−ＡＴＧ　−ＴＧＴ　−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ　−
ＧＡＣ−ＣＣＡ　−ＴＡＴ　−Ｇ　−ＴＡＣ−ＡＣＡ−
ＡＴＧ−ＡＧＧ　−ＧＴＣ−ＣＴＧ　−ＧＧＴ　−ＡＴ
Ａ　−Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ
　Ｌｅｕ　Ｉ＋ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＧＴＡ　
−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−＾ＡＣ−ＣＴＴ−
＾＾Ｇ−＾＾Ａ　−ＴＡＣ−ＴＴＴ　−ＣＡＴ　−ＴＴ
Ｔ　−ＣＴＴ　−ＣＧＴ　−ＣＴＴ　−ＴＴＧ　−ＧＡ
　Ａ　−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＡＴＧ　−ＡＡＡ　−八ｓｎ
　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　１ｌｉｓ　　Ｓｅｒ　　Ａｓ
ｐ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｌ
ｙＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ−
ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＧＡＴ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＴＴＡ　−
ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＣＴ　−ＣＴＡ　−ＣＡＴ
　−ＣＧＣ−ＣＴＡ　−ＴＴＡ　−ＣＣＴ　−Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　ＬｙｓＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴ
Ｃ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＡＡＴ
　−ＴＧＧ　−ＡＡＡ　−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−Ａ
ＡＴ−ＣＣＧ　−ＴＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−八
ＣＣ−ｒＴＴ　−Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａ
ｒｇ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｎＧＡＧ　＝ＧＡＧ　−ＡＧＴ　−ＧＡＣ−ＡＧＡ　
−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＣＡＡ−
ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−Ｔ
ＡＴ−ＴＡＣ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ−１１ｉｎｄＩ
Ｉ［６０ １ｉｅ　Ｍａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＡＴＴ　−ＧＴ
Ｃ−ＴＣＣ−ＴＴＴ　−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−ＣＴ
Ｔ　−ＴＴＣ−ＡＡＡ　−ＡＡＣ−ＴＡＡ　−ＣＡＧ　
−ＡＧＧ　−ＡＡＡ　−ＡＴＧ　−ＡＡＧ　−ＴＴＣ−
ＧＡＡ　−ＡＡＧ　−ＴＴＴ　−ＴＴＧ　−Ｐｈｃ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｇｉ
ｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＶａｔＴＴＴ　−ＡＡＧ−ＧＡＴ
−ＧＡＣ−ＣＡＧ−八ＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡ＾−ＡＡＧ−
ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＡＡＡ　−ＴＴＣ−ＣＴＡ　−ＣＴＧ
　−ＧＴＣ−ＴＣＧ　−ＴＡＧ　−ＧＴＴ　−ＴＴＣ−
ＴＣ＾〜ＣＡＣ−終止終止終止ＢａｍＨＩ ＴＡＡ　−ＴＧＡ　−ＴＡＧ ＡＴＴ　−ＡＣＴ　−ＡＴＣＣＴＡＧ Ｆｒａ−８−５（２７０ｂｐ）　　ＲＨ遺遺伝子 路止 １１ｉｎｄｌＩＩ　　６０ Ｐｈｅ　Ｌｙｓ ＡＧ　−ＣＴＴ−ＴＴＣ−＾Ａ＾− Ａ−ＡＡＧ−ＴＴＴ− Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　
Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　　Ｌｙｓ　　５
ｅｒＡＡＣ−ＴＴＴ−八ＡＣ−ＧＡＴ−ＧＡＣ−ＣＡＧ
−＾ＧＣ−＾ＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−＾ＧＴ−ＴＴＧ−
ＡＡＡ　−ＴＴＣ−ＣＴＡ　−ＣＴＧ　−ＧＴＣ−ＴＣ
Ｇ　−ＴＡＧ　−ＧＴＴ　−ＴＴＣ−ＴＣＡ　−Ｖａｌ
　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＧＩＬ！　ＡＳＩ
）　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｍａｌ　ＬｙｓＧＴＧ−ＧＡＧ−
＾ＣＣ−ＡＴＣ−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＧＡＣ−ＡＴＧ−＾
＾Ｔ−ＧＴＣ−＾＾Ｇ−ＣＡＣ−ＣＴＣ−ＴＧＧ　−Ｔ
ＡＧ　−ＴＴＣ−ＣＴＴ　−ＣＴＧ　−ＴＡＣ−ＴＴＡ
−ＧＡＧ　−ＴＴＣ−Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　
Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　
Ａｒｇ　　Ａｓｐ　　ＡｓｐＴＴＴ　−ＴＴＣ−ＡＡＴ
−ＡＧＣ−＾ＡＣ−＾ＡＡ−＾ＡＧ−ＡＡ＾−ＣＧＴ　
−ＧＡＴ　−ＧＡＣ−ＡＡＡ−＾ＡＧ−ＴＴＡ　−ＴＣ
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■とペプチドα−ｈΔＮＰ（ヒトー心房性ナトリウム排
泄増加ポリペプチドの一部）との融合タンパク質の遺伝
子を含有するプラスミドｐＣＬ　ａｔｌ　ｔｒｐｓ　ｄ
を以下の如くにして組立てた。

まず、プラスミド［）Ｃ（１７のＣｌａ　Ｉ　−Ｂａｍ
ＨＩ　ＤＮＡ断片であるＰ　ｒａ　−１３−８を、プラ
スミドｐ３２２ｄＬｒｐＳのＣＩａ　ｒ　−Ｂａｍｔｌ
　１部位に挿入し、Ｃ（１γとＬ　Ｈ−ＲＩ−１との発
現ベクター１）Ｃｄ７ＬｒｐＳ（１を得る。

次いで、ｐｃｄγｔｒｐｓｄをＩ−目ｎｄｌｌｌおよび
Ｂａｍｆ（１で消化して得られた大きいＤＮＡ断片と、
リンカ−ＤＮＡ断片を伴ったα−ｈ　Ａ　Ｎ　Ｐ遺伝子
（Ｆｒａ−Ｉｉ　−９）とをライゲートさｉｔ、　Ｃｄ
　−Ｌ　ＩＩ　−ａ　−ｈＡ　Ｎ　Ｐ　（Ｃ（１，Ｌ　
ＩＩ　、α−ｈＡＮＰがこの順番で並んだ融合ペプチド
）の発現ベクター、ｐＣＬ　ａｌ−１ｔｒｐＳ（Ｉを得
る。ＤＮＡ断片Ｆｒａ−Ｂ−８およびＦｒａ−１３−９
を以下に示す。プラスミドｐＣｄγｔｒｐＳｄおよびｐ
ＣＬ　ａｌ−１ｔｒｐＳ　ｄの組立て模式図を第６図に
示す。

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ＡＧ−ＣＣＡ−＾ＴＧ終止終止Ｂａｍ１ｌｌ ＴＧＡ　−ＴＡＧ ＡＣＴ−ＡＴＣ−Ｃ，ｒＡＧ 次に、前記の２シストロン性発現ベクターを得るための
ＤＮＡ断片、Ｆｒａ−Ａ−７を調製し、ｒＣＦ−１発現
ベクターｐＬ　ＨＳ　ｄＭｍｔｒｐを組立てる。

まず、プラスミドｐＴ　ｒｐＥ　Ｂ　７をＥｃｏＲＩお
よびＢａｍ１（Ｉで消化し、大きいＤＮＡ断片とＬｌ（
遺伝子を含むＦ　ｒａ−Ｂ−４とをライゲートさせてｔ
ｒｐプロモーターＩ遺伝子とＬＨ遺伝子とを含むプラス
ミドｐＬＨｔｒｐを得る。

次に、ベクターの組立てに用いるためのＩＧＦ−１遺伝
子を以下の如くにして調製した。まずプラスミドｐｔＨ
７３２２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、大き
い方のＤＮＡ断片にＩＧＦ−１遺伝子（Ｆｒａ−１３−
１０）をライゲートさせてプラスミドｐｓｄＭｌを得る
。このｐｓｄＭＩをＢａｍＨｆおよびＥｃｏＲｒで消化
してＩ　ＧＦ−１遺伝子を含むＤＮＡ断片を得、これに
オリゴヌクレオチド１１１１およびｍ２をライゲートし
、Ｆｒａ−１３−１１を得る。

このＦｒａ−Ｂ−ＩＩを、前記のプラスミドｐＬＩ−１
ｔｒｐのＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩ消化により得
た大きいＤＮＡ断片とライゲートさせ、プラスミドｐＬ
ＨＳ　ｄＭｍｔｒｐを得る。Ｆｒａ−Ｂ−ＩＱおよびＦ
’ｒａ−Ｉ３−ＩＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列
、並びに制限部位を以下に示す。また、プラスミドｐ＋
、　ｔｌ　Ｓ　ｄＭｍｔｒｐの組立て模式図を第７図に
示す。

Ｆｒａ−８−１０（２２４ｂｐ）　Ｉ　ＣＦ遺伝子ＡＡ
ＴＴＣ−＾ＴＧ−ＧＧＴ−ＣＣ丁−ＧＡＡ−ＡＣＴ−Ｃ
ＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−
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ＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＣ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＧＴ
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ＧＴ−ＴＴＴ−＾ＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴ
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−ＣＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＣ−ＧＧＴ　−ＣＣＴ　−＾−
ＣＴＴ　−ＣＡＴ　−ＴＴＴ　−ＧＴＡ　−ＣＴＴ　−
ＡＡＧ　−ＴＡＣ−ＣＣＡ　−ＧＧＡ　−Ｇｌｕ　　Ｔ
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ｌｕ　　Ｌａｕ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　ＡｌａＧＡＡ
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ｇ　Ｇｌｙ　Ｉ’ｈｅ　ＴｙｒＣＴＧ　−ＣＡＡ　−Ｔ
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−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ　−５’次に、ｐ
Ｌ　ＨＳ　ｄＭｍｔｒｐをＨｉｎｄ［ＩＩおよびＢａｍ
ｔｌ■で消化し、Ｉ　ＣＰ−［遺伝子とリンカ−ＤＮＡ
断片を含むＦｒａ−Ａ−４（Ｆｒａ−Ｂ　−１１と同様
）を得、これをＡｖａＩ［消化に付してＩＣＦ−１をコ
ードしているＦｒａ−Ａ−５を得る。このＦｒａ−Ａ−
５は、その３°末端に翻訳停止信号を含有している。

他方、ＤＮＡ断片旨ａ−Ａ−１をＣ１ａｌで消化してＦ
ｒａ−Ａ−２を得、このＦｒ３−Ａ−２にオリゴヌクレ
オチドＣＴ５およびＣＴ６をライゲートすることにより
、ＳＤと、３°末端に翻訳停止信号を含有するＤＮＡ断
片、Ｆｒａ−Ａ−３を得る。

このＦｒａ−Ａ−３と前記Ｆｒａ−Ａ−５とをＡｖａ１
１部位でライゲートさせ、ＩＣＦ−１遺伝子を含有する
と共に、ＩＣＦ’ｉ遺伝子の上流にＳＤと“シストロン
連結配列”を存するＦｒａ−Ａ−６を得る。

このＦｒａ−Ａ−６をＨｉｎｄＩＩ［消化に付し、２シ
ストロン性発現ベクターを得るためのＤＮＡ断片、Ｆｒ
ａ−Ａ−７を得る。Ｆｒａ−Ａ−１、Ｆ　ｒａ　−Ａ　
−２、Ｐｒａ−Ａ−３、Ｆｒａ−Ａ−５、Ｆｒａ−Ａ−
６およびＦｒａ−Ａ−７のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列、並びに制限部位を以下に示す。Ｆｒａ−Ａ−
７の組立て模式図を第８図に示す。

Ｆｒａ−へ−１（４６ｂｐ）Ｓ　Ｄを含ｒＴ４″ろリン
ノＪ　ＤＮＡ断片 、Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　
Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＧＴ−ＴＧＣ
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ＴＣ−ｌａｌ Ａｓｎ ΔＡＴ ’Ｉ’Ｔ、〜−ＧＣ Ｆｒａ−八−３（＋１４　ｈｐ）Ｓｌ）を含存するリン
カ−りＤＮＡ断片 １〜ｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ’Ａｓｐ　
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ＣＴ−ＡＴ−ＴＡＣ−ＣＣＡ　−ＧＦｒａ−Ａ−５（２
１５ｂｐ） 〆正 ＧＴ−ＣＣ’「−ＧＡＡ−ＡＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−Ｇ
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ＣＧ＾−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−終止Ｂａｍ
１ｌｌ Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ　−ＴＧＡ　−ＴへＧ
ＣＧＴ−ＴＴＴ−、へＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−
ＣＴＴＧＦｒａ−Ａｍ６　　　（２５９ｂｐ） Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌ
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終止ｆ３ａｍｌｌ１ １’ｒｏ　１．ｃｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　１．ｙ
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ＡＧＦｒａ−Ａｍ７　　　（２３８ｂｐ） （ｌｙｓ］、ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＡ
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ＣＡ　−ＧＧＡ　−ＣＴＴ　−ＴＧＡ　−ＧＡＣ−ＡＣ
Ｇ　−ＣＣＧ　−ＣＧＡ　−ＣＴＴ　−ＧＡＣ−Ｖａｌ
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ＴＴＴ　−ＧＴＡ　−ＴＧＴ　−ＧＧＴ　−ＧＡＴ　−
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Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＧＧＴ−ＴＴ
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Ａ−八ＡＡ　−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＴＡＧＧＧＴ
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−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ次にａ−ｈΔＮＰ発現ベクター、ｐ
ＣＬ　ａＴ（ＬｒｐＳｄを１１ｉｎｄｌｌｌおよびＢａ
ｍ１−１１消化に付し、得られた大きいＤ　Ｎ　Ａ断片
と１１ｆｉ記Ｆｒａ−Ａ−７とをライゲートさＵ・るこ
とにより、α−ｈＡＮＰ遺伝子と置換し、本発明の目的
プラスミドであるｐｃ　ｔ：　−ｓＭｔｒｐを得る。プ
ラスミドｐＣＥ　　ＳＭＬｒｐの組立て模式図を第９図
に示す。

もう一つのＩＧＦ−１発現ベクター、プラスミドｐｃＥ
−ＳＭ３ｔは、前記のプラスミドｐＣＥ−８Ｍｔｒｐか
ら以下の如くにして組立てられろ。

まず、プラスミドｐ［３Ｒ３２２のＥｃｏＲｌ　−Ｃｌ
ａ　１部位にｔｒｐプロモーター■遺伝子（Ｆｒａ−１
’１−３）を挿入し、ＲＡｎ＋＋）およびＲＴｅｔ４：
有するプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐＳｓを得る。次い
で、ｐＢＩ１２２ＬｒｐＳｓのＣ１ａｌおよびｒ３ａｍ
ｌ１１消化により生した大きいＤＮＡ断片と前記のα−
ｈΔＮ　Ｐ発現ベクターｐＣＬ　ａＨｔｒｐｓ　（ｌの
Ｃｌａ　Ｉ　　Ｂ　ａｍＨＩ断片（Ｆｒａ　−Ｃ−２、
Ｃｄ−Ｌｒ（とａ−ｈＡＮＰとをコードしている）とを
ライゲートさせることにより、ｔｒｐプロモーター■遺
伝子のコントロール下にこれらのペブヂドをコードして
いる発現ベクター、ｐＣＬａＨｔｒｐ−２を得る。Ｆｒ
ａ−Ｃ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、並
びに制限部位を以下に示す。プラスミドｐＣＬ　ａＨｔ
ｒｐ　−２の組立て模式図を第１θ図に示す。

Ｆｒａ−Ｃ−２（４０６ｂｐ） Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｎＣＧＡＴＡＡ
Ａ−ＡＴＣ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−＾ＡＣ−ＴＡＴ
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Ｃ−ＴＴＴ−ＣＡＴ　−ＴＴＴ　−ＣＴＴ　−ＣＧＴ　
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Ｃ−ＴＣＴ　−ＴＧＣ−ＴＴＴ　−ＧＯＴ　−ＧＧＣ−
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ＧＧ−ＡＧＡ−ＡＣＣ−ＡＡＡ　−ＣＣＡ　−ＣＣＧ　
−ＧＣＡ　−Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ
　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＡ
ＴＧ　−ＧＡＣ−ＣＯＣ−ＡＴＣ−ＧＧＴ　−ＧＣＴ　
−ＣＡＧ　−ＴＣＣ−ＧＧＴ　−ＣＴＧ　−ＧＧＣ−Ｔ
ＡＣ−ＣＴＧ　−ＧＣＧ　−ＴＡＧ　−ＣＣＡ　−ＣＧ
Ａ　−ＧＴＣ−ＡＧＧ　−ＣＣＡ　−ＧＡＣ−ＣＣＧ　
−終止終止Ｂａａｌｌｌ Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＴｙｒＴＧ
Ｔ−ＡＡＣ−ＴＣＴ　−ＴＴＣ−ＣＧＴ　−ＴＡＣ−Ｔ
ＧＡ　−ＴＡＧＡＣ＾−ＴＴＧ　−ＡＧＡ　−ＡＡＧ−
ＧＣＡ−＾ＴＧ−ＡＣＴ−＾ＴＣ−ＣＴＡ他方、ＩＧＦ
−１遺伝子の３°末端に合成ｆｄファージターミネータ
ー遺伝子を導入するために、プラスミドｐＢＲ３２２を
ＢａｍＨＩおよび５ａｌｔで消化して得た大きいＤＮＡ
断片と、合成「ｄファージターミネータ−遺伝子（Ｆｒ
ａ−Ｃ−１）とをライゲートさせ、プラスミドｐｔｅｒ
２　ｔを得る。次に、前記プラスミドｐｃ　Ｌ　ａＨｔ
ｒｐ　−２をＢａｍＨＩおよびｒ’ｓｔｌ消化に付して
得られた大きいＤＮＡ断片と、プラスミドｐｔｅｒ２１
のＰｓ口および［３ａｍＨＩ消化による合成ｆｄターミ
ネーター遺伝子含有ＤＮＡ断片とをライゲートさせ、所
望のプラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ３ｔを得る。Ｆｒａ−
Ｃ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列、並びに制限
部位を以下に示す。プラスミドｐｃＬａＨｔｒｐ３ｔの
組立て模式図を第１１図に示す。

Ｆｒａ−Ｃ−１（４７ｂｐ）合成ｆｄ７ｙ−ジターミネ
ーター遺伝子 Ｂａｍ１ｌｌ　　　　　５ａｌ１ ４−← ＴＴＴＴＧ ＡＡＡＡＣＡＧＣＴ さらに、このプラスミドｐＣＬ　ａＨｔｒｐ３　ｔを１
３ａｍト■およびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、得られた大
きいＤＮＡ断片に、前記の２シストロン性発現ベクター
を得るためのＤＮＡ断片Ｆｒａ−Ａ−７をライゲートす
ることにより、ｔｒｐプロモーター■のコントロール下
でＣｄ−ＬＨおよびＩＧＦ’−ｒをコードすると共に、
ｃｄファージターミネータ−遺伝子を含有している、所
望のプラスミドｐＣＥ−ＳＭ３ｔを得る。プラスミドｐ
ＣＥ−５Ｍ３ｔの組立て模式図を第１２図に示す。

本発明のベクターの組立てに用いた各ＤＮＡ断片は、後
述する如く、対応する各種オリゴヌクレオチドブロック
のアニール化、並びにライゲーションにより合成した。

また、これらの各オリゴヌクレオチドは、イ）・つ（Ｉ
ｌ、　　Ｉ　ｔｏ）、イケＧＹ　、　　Ｉ　ｋｃ）、ベ
クタ（Ｓ　、　　Ｉ　ｋｕｔａ）およびイタクラ（Ｋ　
、　ｒ　ｔａｋｕｒａ）の方法に従って合成した［ヌク
レイツク・アシツズ・リザーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１０゜１．７５５（ｌ
　９８２）］。

本発明のＩＧＦ−ｒ発現ベクターは、大腸菌宿主の形質
転換に用いられるが、好ましい株は、Ｅ。

ｃｏｌｉ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、エシェリ
ヒア・コリ）Ｋ株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｉｌ株である。特に
、Ｅ　、ｃｏｌｉ−ＭＭ２９４が好ましい。

発現ベクターの導入は、クシュナ−（Ｋｕｓｈｎｅｒ）
法等の常法に従って行うことができる。この様にして得
られた形質転換体を好適な条件下で培養するとＣｄ−Ｌ
ＨとＭｅｔ−ＩＣＦ’−１とが独立に発現され、このと
き、Ｃｄ−ＬＨｌ、：、よってＭｅｔ−ＩＧＦ−ｒは、
細胞内に安定的に保持されることになる。好適な培養方
法は良く知られており、通常、同化可能な炭素源および
窒素源を含有する栄養培地中で好気性条件下に（たとえ
ば振とう培養、深部培養など）培養することからなる。

栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース、フルクト
ース、スクロース、グリセリン、でん粉などの炭水化物
であり、包含されうる他の炭素源は、キシロース、ガラ
クトース、マルトース、デキストリン、ラクトースなど
である。

好ましい窒素源は、酵母エキス、ペプトン、グルテン粉
、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、
小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸などの
無機および有機の窒素化合物である。

炭素源および窒素源は、これらを組合わせて用いるのが
有利であるが、微量の成長因子およびかなりの量の無機
栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使用に適して
いるので、必ずしも純粋な形で使用されなくともよい。

所望により、炭酸カルシウム、燐酸ナトリウムまたはカ
リウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム
塩類、銅塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。

培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成できる
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。通気は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより達成される。

醗酵は、通常約２０℃〜４２℃間の温度で、好ましくは
３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時間にわ
たって行う。

こうして産生されたＩ　ＣＦ−１は、Ｃｄ−ＬＩＩと一
緒に安定に宿主細胞内に保持されている。ＩＧＦ−１は
、他の既知の生理学的活性物質の回収に一般的に用いら
れる慣用の手段に準じて培養培地から回収できる。一般
的には、産生されたタンパク質は宿主生物の細胞中に見
出される。従って、培養液を濾過または遠心分離して得
られる細胞から、減圧下の濃縮、超音波処理などの細胞
破砕、１１ＰＬＣ，凍結乾燥、ｐｉ−１ｇ節、樹脂（た
とえばアニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸
着樹脂）を用いての処理、慣用の吸着剤（たとえば活仕
度、珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ）での処
理、ゲル濾過、晶出などの常法によって分離することが
できる。但し、本発明においては、リゼイトをＩＮ酢酸
に対して透析し、酢酸に可溶のＩ　ＣＦ−１と不溶のＣ
ｄ−ＬＨとを分離した後、精製工程に付す。

本発明のベクターを用いる方法によれば、血清からの単
離による従来の方法よりら高収率でＭｅｔ−Ｉ　ＧＦ−
１を大量生産することができるばかりか、不純物の含有
率を低下させることができる。

従って、本発明方法によって得られたＭｅｔ−ＩＧＦ−
１は、種々の研究分野は勿論、骨細胞の増殖および成長
異常に係る種々の疾患、その他骨粗傾症、糖尿病、創傷
、潰瘍等の治療に有用である。

例えば、本発明のＭｅｔ−ＩＧＦ＝１を製薬業界周知の
方法で適当な剤形に製剤化し、経口または非経口的に用
いることができる。

以下、実施例および製造例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。なお、以下の記載に用いた略語は次の意味
を有する。　　　　　　　　　　□Ｄ　’１’　Ｔ　：
　ジチオスレイトール１’　Ａ　Ｇ　Ｉε：ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動ＥＬＯ１［・エヂルアルコール Ａｃ０ＩＩ：酢酸 乞」弓４ 各オリゴヌクレオチド（Ａ２−Ｌ２Ｘ０．４ｎＭ）を、
５０ｍＭＴｒｉｓ−１−ＩＣＩ（ｐＨ７，（ｉ）、２０
ｍＭＤＴ′ｒ、　５０　ｕ９／ｌｌＱ牛血清アルブミン
（以下、ｌ３ＳＡという）、１ｍＭスペルミジン、Ｉ　
ＯｍＭＭｇＣＬおよび２　ｍＭ　Ａ　’Ｉ’　Ｐを含有
する溶液４０μσ中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２
．５単位を用いて３７℃で３時間りん酸化した。反応終
了後、１００℃で５分間インキュベートして反応混合物
中の酵素を不活化した。りん酸化されたオリゴヌクレオ
チドと２Ｍのオリゴヌクレオチド（ＡＩおよびＩ、３）
のライゲーションは第１３図−５に示すようにして行い
、まず６断片を得、最終的にはクローニング用のＬＨ遺
伝子（２３６ｂｐ）を得た。ライゲーションは’ｌ”　
４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（５単位）を用い、５０ｍＭＡ
ＴＰ（１μｍ２）含有溶液中にて１６℃で５時間行った
。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーション
生成物は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ暖衝液中２−１６％グラ
ジェントＰＡＧＥで溶出した後、臭化エチジウム染色に
より同定した。

Ａ、２ＬＨ遺伝子のクローニング プラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃ。

１工１て消化した。６５℃で５分間加熱して反応を終了
させ、０．５％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断
片を分離した。大きなりＮＡ断片を回収し、　ＬＩ■遺
伝子とＴ４ＤＮＡリガーゼとの存在下において１２℃で
１８・時間ライゲートさせ、２３６ｂｐのＬ１１遺伝子
を含むプラスし、ドｐＬＨ１０７を得た。ライゲーショ
ン混合物を用、いてクッシュナ−（Ｋ　（１３ｈｎｅｒ
）法［マニアナイス（Ｔ、　ＭａｎｉａＬｉｓ）ら、モ
レキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ）　ｌ）、２５２（＋　９８２）コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ参照］により、Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｈ［３１０１を形質転換し、アンピシリン耐
性形質転換体をテトラサイクリン（２５μｇ／Ｒρ）含
有プレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラ
サイクリンに感受性を示すクローンから分離したプラス
ミドを、ＥｃｏｒＺｌおよびＢａｍＨＩで消化し、適当
なサイズマーカーと比較すると予期した２３６ｂｐのＬ
　Ｉ−［遺伝子断片が生じていた。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈｎ　Ｉ　０１形質転換体から得たプ
ラスミド（ｐＬＨＩ　０７）は、制限酵素分析により、
Ｉ７■遺伝子（２３６ｂｐ）を存することが特徴づけら
れた。

Ｉ３．ｌＲＨ遺伝子（Ｆｒａ−Ｂ−５）の調製各オリゴ
ヌクレオチド（Ｄ３〜Ｊ５Ｘ０．４ｍＭ）をＡ、、、１
．に記載のようにりん酸化した。りん酸化されたオリゴ
ヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＪ６のライゲーショ
ンを第１３図−５に示すようにして行い、まず断片７ブ
ロツクを得、最終的にｆｌ　１−１遺伝子（２７０ｈｐ
）を得た。ＲＩ−１遺伝子をＰＡＧＥにより精製し、ｔ
、　ｒ−ｔ　−ＲＨ遺伝子のクローニングに使用した。

Ｆｒａ−Ｂ−４およびＦｒａ−８−５の合成に用いたオ
リゴヌクレオチドおよび組立て模式図を第１３図に示す
。

ｒ３，２　　Ｌｌ−１−ｆｌＨ遺伝子のクローニングＡ
、２で得たプラスミド（ｐＬ　１１１０７　）をＨｉｎ
ｄ■１およびＩ３ａｍｔｒｒで消化した。大きい方のＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し、続い
てＢ、ｌに記載のｆｌ　Ｉ−Ｉ遺伝子（２７０ｂｐ）と
、Ｔ４ＤＮΔリガーゼの存在下にライゲートさせた。

このライゲーション混合物を用いＥ、　ｃｏｌｉ　Ｉ−
ｒＢｌｏｌを形質転換した。この形質転換体から得たプ
ラスミドＩ）７　Ｆ−３をＥｃｏｒｊ　ｒ　−１３ｏｍ
ｌｌ　ｌ消化に付し、Ｌ　Ｈ−ＲＩ（遺伝子（４５０ｂ
ｐＸＦ　ｒａ　−Ｂ−６）を得た。

製造例１と同様にしてｔｒｐプロモーター■遺伝子（Ｐ
ｒａ−Ｂ−１）を構築した。ｔｒｐプロモーター１１（
Ｐｒａ−Ｉ３−１）をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＴ　−Ｂ
ａｍ１−ＩＩ断片とライゲートし、続いてライゲーショ
ン生成物でＦ、　ｃｏｌｉ　１１Ｂｌ　０１を形質転換
した。

１７ＡｍｐおよびＳ′ｒｅＬの形質転換体から（ワたプ
ラスミドをＨｐａ［で消化してバンド（４、Ｉ　Ｋｂｐ
）を確認し、続いて［３μｍＨ＋で消化し、Ｉ）　Ａ　
Ｇ　Ｅで９０ｂｐのバンドを確認した。さらに、Ｅｃｏ
ｆｌ　［−１３ｏｍＨｌ消化で得た５６ｂｐの断片をＰ
ＡＧＥでサイズマーカーと比較することにより確認した
。このプラスミドをＩ）Ｔ　ｒｐＥＢ　７と命名し、発
現ベクターの構築に使用した（第３図）。Ｆｒａ−１３
−１の合成に用いたオリゴヌクレオチドお、及びその組
立て模式図を第１４図に示す。

匙！ Ａ、プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐ プラスミドｐＢＲ３２２（９μｇ）をＥｃｏｒｔｌおよ
びＵａｍｌ（Ｉで消化した。６５℃で５分間加熱して反
応を止め、０，８％アガロースゲル電気泳動によって分
離し、３７５ｂｐの小さいＤＮＡ断片（５００ｎｇ）を
得た。一方、製造例２で調製したプラスミドｐＴｒｐＥ
Ｂ７（ｌ　０ｕ９）をＥｃｏＲＩおよびＢａｎ＋ＩＩ　
（消化に付し、次いで、ゲル電気泳動にかけて大きいＤ
ＮＡ断片（４０９４ｂｐ、５μ９）を得た。

このｐｉ’　ｒｐＥ　Ｂ　７のＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍ１
−［１断片（４０９４ｂｐ、２００μ９）をｐＢＲ３２
２のＥｃｏＲＩ−Ｂ　ａｍ）Ｉ　［断片（Ｆ’ｒａ−Ｉ
３−２．３７５ｂｐ、１０ｏ　ｎｇ）と、Ｔ４リガーゼ
（宝酒造、３６０　ｕｎｉｔ）を倉荷するライゲーショ
ン緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ　−１ｌ　ＣＩ、ｌ）Ｈ７
、６、Ｉ　０ｍＭＭｇＣｌ、、２０ｍＭＤＴ′Ｉ゛、１
ｍＭＡＴＰ、１ｍＭスペルミジンおよび５０μ９／肩Ｑ
、　ｌ３ＳＡＸ２０μｍ２）中、１５℃で一夜うイゲー
ソヨンを行った。ライゲーション混合物でＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１を形質転換し、テトラザイクリン含有
（２５μ９／ｆｆ１２）プレート上でテトラサイクリン
耐性形質転換体を得た。形質転換体から単離した生成プ
ラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐを、Ｅｃ。

Ｒ■および１３ｏｍｌ−１１消化（３７５ｂｐ、４０９
４ｂｐ）、並びにＩ−ｒｐａｌ消化（４４Ｇ　９ｂｐ）
に付し、７．５％ＰＡＧＥ並びに０．８％アガロースゲ
ル電気泳動により、ｔｒｐプロモーター■遺伝子の存在
を確認した。

Ｉ３；ｔｒｐプロモーター■遺伝子（Ｆｒａ−１３−３
）の構築 第１５図１ユ示した、ブロックト、■°および■。

の各オリゴヌクレオチド（［３−Ｍ’）（各０．２ｎモ
ル）をライゲーション緩衝液（７０μＱ）中、′Ｉ゛４
ボリヌクレオヂドキナーゼ（ＢＲＬ、２．５単位）によ
り、３７℃において１時間、りん酸化した。各ブロック
の反応混合物にＴ４ＤＮΔリガーゼ（３０ｏ単位）と２
０ｍＭＡＴＰ（２ｔｔＱ’）とを加え、得られた混合物
を１５℃で３０分間インキュへ一トシた。６５℃で１０
分間加熱して反応を止めた。これらのブロック（ド、■
°、およびＩＩＩ　’　）の反応混合物を一緒にし、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（３６０！ｌ’−位）と２０ｍＭＡＴ
Ｐ（２μｇ）との存在下、非りん酸化オリゴヌクレオチ
ド（ΔおよびＮ’）と混合した。１５℃で１時間インキ
ユベーノヨンした後、最終ライゲーション混合物を、２
〜＋６％グラディエンドＰＡＧＥにかけて精製し、ｔｒ
ｐプロモーター■遺伝子（Ｉ　Ｏ５ｂｐ）（Ｆｒａ−Ｂ
−３）をｆＧだ。

Ｆｒａ−Ｂ−３の合成に用いたオリゴヌクレオチド、並
びに組立て模式図を第１５図に示す。

Ｃ，プラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳの組立てプラスミド
ｐＢ１１３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩおよびＣｔａｔ消化
に付し、次いで、アガロースゲル電気泳動にかけ、大き
いＤＮＡ断片（４４４ｅｂｐ）を得た。

この断片と、上記Ｂで得たｔｒｐプロモーター■遺伝子
（１０５ｂｐ）とを、Ｔ４ＤＮＡ’ノガーゼの存在下、
ライゲートさせた。このライゲーション混合物でＥ、　
ｃｏｌｉｌｌＢ　１０１を形質転換し、アンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の形質転換体を得た。この形
質転換体から分離したプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳを
、Ｃｌａ　Ｉ　−ＢａｍＨＴ　（３５２ｂｐ）、１（ｐ
ａ　Ｉ　（＋　０７　ｂｐ）およびＡａｔＩ［−Ｃ１ａ
ｌ（２８７ｂｐ）による制限エンドヌクレアーゼ、分析
に基づいて確認した。ｐ３２２　ｄｔｒｐＳの組立て模
式図を第４図に示す。

Ａ、Ｌｌ−１−ｒｌ［−１発現ベクター（ｐｙｔｒｐ）
の構築製造例２で調製したｔｒｐプロモーター■ベクタ
ー（ｐＴｒｐＥＢ７）をＥｃｏｎＩおよびＢａｍＨ［で
消化し、アガロースゲル電気泳動により大きなりＮＡ断
片（４、１ｋｂｐ）を得た。このＤＮＡ断片を、Ｅｃｏ
Ｒ１−ｒ３ａｍｔｌ　Ｉ消化によりプラスミド１）７Ｆ
−３から調製したＬ　Ｈ−ｒ（Ｈ遺伝子とライゲートし
た。このライゲーション混合物を用いＥ、　ｃｏｌｉＨ
Ｉ３１０１を形質転換して、アンピシリン耐性でテトラ
サイクリン感受性の形質転換体を得た。この形質転換体
から得たプラスミドｐγｔｒｐをＥｃｏＲＩおよび［３
μｍｌ−ｆｌで消化し、７．５％ＰＡＧＥでＬＨ−ｎ　
ｔｉ遺伝子（Ｆｒａ−Ｂ−６，４５０ｂｐ）を確認した
。

ブロックビ、■“および■”の各オリゴヌクレオチド（
ＮＰＩ−Ｃｄ８Ｘ各０．２ｎモル）をライゲーション緩
衝液（６０μＱ）中、Ｔ４ヌクレオヂドキナーゼ（２，
５単位）により、３７℃で１時間、りん酸化した。各ブ
ロックの反応混合物ｊ、：、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３ｄ
Ｏ単位）とＡＴＰ（２μＱ）とを加え、混合物を１５℃
で１時間、インキエベートした。これら各ブロック（ピ
、■″嘲よび■”）の反応混合物を一緒にし、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ（３６０単位）と２０ｍＭＡＴＰ（２μｇ）
との存在下、１５℃で一部インキユベートした後、８０
℃で１０分間加熱した。この混合物に５００ｍＭＮａＣ
１（２０μＱ）とＥｃｏＲＩ　（２０単位）とを加えた
。３７℃で２時間インキエベートした後、この最終ライ
ゲーション産物を１５％ＰＡＧＥで精製し、ｔｒｐプロ
モーター■遺伝子の一部とＣｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片
（１２４ｂｐ）（Ｆｒａ−Ｂ　−７）を得た。Ｆｒａ−
Ｂ−７の合成に用いたオリゴヌクレオチドおよび組立て
模式図を第１６図に示す。

８、２　　プラスミドｐＣｄγの構築およびクローニＡ Ａ、で調製したプラスミドＰｙ　ｔｒｐ（４５４４ｂｐ
）をＨｐａｌおよびＥｃｏＲＩ消化に付し、大きいＤＮ
Ａ断片（４５１０ｂｐ）を得た。このＤＮＡ断片とＢ。

１、で調製した合成ｔｒトプロモーター■遺伝子の一部
とＣｄ遺伝子とを含むＤＮＡ断片（＋２４ｂｐ）とをＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在下でライゲートさせた。このラ
イゲーション混合物をＥ、　ｃｏｌｉＨＢｌｏｌｌこ導
入した。ＲＡｍｐを示す形質転換体から得たプラスミド
Ｉ）Ｃｄγを、制限エンドヌクレアーゼ分析にかけ、Ｃ
Ｉａ　１−　Ｉ３ａｍｌ−Ｉ　１　（５４３ｂｐ）、Ｃ
１ａｌ　−Ｈｌｎｄ［Ｉｒ（２７３ｂｐ）、Ｃ１ａｌ　
−Ｅｃｏｎ　Ｉ　（９ａ　ｂｐ）およびＡａｔ［ｌ−Ｃ
１ａｌ（１８０ｂｐ）の各ＤＮＡ断片により、確認した
。プラスミドｐＣｄγの組立て模式図を第５図に示す。

製造例５　プラスミドｐＣｄγｔｒｐｓｄの構築および
クローニング 製造例４で調製したプラスミドｐＣｄγをＣ１ａｌおよ
びＢａ＋ｓＨＩで消化し、小さい断片（５４２ｂｐ、Ｆ
ｒａ−Ｂ−８）を得た。このＦｒａ−Ｂ−８を、′ｌ゛
４ＤＮＡリガーゼの存在下、製造例３．０で調製したプ
ラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳのＣ１ａｌ　−ＢａｍＨＩ
断片（４２２３ｂｐ）とライゲートさせた。このライゲ
ーション混合物をｍ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　ｌ　０１　Ｉ
コ導入した。ＲＡｍｐを示す形質転換体からプラスミド
ｐＣｄγｔｒｐＳｄを得、制限エンドヌクレアーゼ分析
にかけて確認した。ｌ−１ｐａ　［−ＢａｍＨＩ　（ｌ
　Ｏ７，５７５ｂｐ）、Ｃ１ａＩ−Ｂａｍｒ−ＩＩ（５
４３ｂｐ）、Ｐｓｔｌ　−Ｅｃｏｆｌ　Ｉ　（Ｉ　Ｏ５
７ｂｐ）、ＥｃｏＵｔ　Ｉ　−１３ａｍＨＩ（４５０ｂ
ｐ）、ＩＩ　１ｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ　（２７０ｂｐ
）およびＣ１ａｌ　−１（ｉｎｄＩＩＩ（２７３ｂｐ）
。プラスミドｐＣｄγｔｒｐＳｄの組立て模式図を第６
図に示す。

ブロックＩ°°゛および■°°°の各オリゴヌクレオチ
ド（Ａ８２７ＡＨ１７）（各０．２ｎモル）を、ライゲ
ーション緩衝液（７０μｍ２）中１．３７℃において１
時間、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼ（２，５単位）により
、りん酸化した。各ブロックの反応混合物にＴ　４　Ｄ
　Ｎ　Ａリガーゼ（３００単位）と２０ｍＭＡ′ｒＰ（
２μ１２）とを加え、混合物を１５℃で３０分間インキ
ュベートした。６５℃で１０分間加熱して反応を止めた
。２ブロツク（［”’お、よびＩＩ”’）の反応混合物
を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）と２Ｏ
ｎ＋ＭＡＴＰ（２μｍ）との存在下、非りん酸化オリゴ
ヌクレオチド（ＡＨＩ、ＡＨＩ８）と混合した。この混
合物を１５℃で１時間インキュベートした後、最終ライ
ゲーション産物を２−１６％グラディエンドＰＡＧＥに
かけて精製し、リンカ−ＤＮＡ断片を伴ったα−ｈＡＮ
Ｐ遺伝子（１３４ｂｐ、　Ｆｒａ−Ｂ−９）を得た。Ｆ
ｒａ−［３−９の合成に用いたオリゴヌクレオチドおよ
び組立て模式図を第１７図に示す。

Ｂ、プラスミドｐＣＬ　ａＨｔｒｐｓ　ｄの構築および
クローニング 製造例５で調製したプラスミドｐＣｄγＬｒｐＳｄを１
−Ｉｉｎｄ［［ＩおよびＢａｌ１ｌＨＩで消化して大き
いＤＮＡ断片（４７４３ｂｐ）を得、これと、Ａ、で調
製したリンカ−ＤＮＡ断片を伴ったαｈＡＮＰ遺伝子（
１３４ｂｐ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、ライゲ
ートさせた。このライゲーション混合物をＥ。

ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１に導入し、形質転換体Ｅ、ｃｏ
Ｌ！ＨＩを得た。ＲＡｍｐを示す形質転換体（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉＨｌ　）から、Ｃｄ−ＬＨ−α−ｈ　ＡＮＰ遺伝
子（Ｃｄ−Ｌ　Ｈとα−ｈＡＮＰとの融合ペプチドをコ
ードする遺伝子）を含むプラスミドｐｃ　Ｌ　ａｌ−ｒ
　ｔｒｐＳ　ｄを得た。このプラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼ分析にかけて確認した。ＡａｔＩＩ−Ｃｌａ
ｒ（２８７ｂｐ）、Ｃ１ａｌ　−ＢａｍＨＴ　（４０７
ｂｐ）、Ｃ１ａｌ　−Ｅｃ。

ｆｌ　Ｉ　（９３、ｌ　９８　ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ　−
ＢａｍＨＩ　（１１６、ｌ　９８　ｂｐ）、Ｈ１ｎｄｎ
ｌ　−Ｂ　ａｍＩ（Ｉ　（１３４ｂｐ）およびＨｐａ　
Ｉ　−ＢａｍＨＩ　（１０７，４３９ｂｐ）。プラスミ
ドｐＣＬ　ａ［ｌ　ＬｒｐＳ　ｄの組立て模式図を第６
図に示す。

製造例７　　ＬＨ発現ベクター（ｐＬ　Ｈｔｒｐ）の構
築製造例２で製造したｔｒｐプロモーター■ベクター　
（ｐＴ　ｒｐＥ　Ｂ　７　）をＥｃｏＲｒとＢａｍＨＩ
で消化し、アガロースゲル電気泳動により大きなりＮＡ
断片（４、１ｋｂｐ）を得た。このＤＮＡ断片をＥＣＯ
ＲＩ　−１３ａｍＨＩ消化によりプラスミドｐＬＨＩ０
７から調製したＬＨ遺伝子（Ｆｒａ−Ｂ−４）とライゲ
ートさせた。ライゲーション混合物を用いてＥｃｏｌｉ
！−１［３１０１を形質転換し、アンピシリンに耐性で
テトラサイクリン感受性を示す形質転換体を得た。

形質転換体から得たプラスミドｐＬＨｔｒｐをＥｃｏｌ
ｌ■とＢａｍＨＩで消化し、７．５％ＰＡＧＥにＬｌ−
１遺、伝子（２３６ｂｌ））を確認した。プラスミドｐ
ＬＨｔ「ｐの組立て模式図を第７図に示す。

製造例８　１ＣＦ−ｒ発現ベクターｐＬＨＳｄＭｍｔｒ
ｐの構築 鼠 各オリゴヌクレオチド（Ａ　ｌ−０１８０，４ｎＭ）を
、　　７　４ｍＭ　　　’ｒｒｉｓ−１−ＩＣ（！（ｐ
Ｈ７，６）、　　Ｉ　　ＯｍＭＤＴＴ、１．６＋ｎＭメ
ルカプトエタノール、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．および０
．５ｍＭＡ’ｌ”Ｐを含有する溶液１００μａ中でＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ製）を用い３７℃で
２０分間りん酸化した。

反応終了後、１００℃で５分間インキュベートして反応
混合物中の酵素を不活性化した。りん酸化オリゴヌクレ
オチドのライゲーションは第１８図＝３に示すようにし
て行い、まず！０ブロックを得、最終的にはクローニン
グ用のＩＧＩ−１遺伝子を得た。ライゲーションはＴ　
４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（７単位）を用い、１００ｍＭ
ΔＴＰ（０，５μｆ２）含有溶液中にて４°Ｃで２３時
間（標阜条件）行った。

各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーション生
成物を、ｉ’ｒｉｓ−ＥＤＴＡ′４１衝溶液中２−１６
％グラディエンドｌ）　Ａ　Ｇ　Ｅで、臭化エチジウム
染色により同定した。

Ａ、２　　ＩＧＦ−１遺伝子のクローニングプラスミド
ｌ）＋３ｒｊ３２２をＢａｍｔｌｌおよびＥｃ。

ｒ（＋で消化した。反応を６５℃で５分間加熱して終了
させ、得られたＤＮＡ断片を０．５％アガロースゲル電
気泳動により分離した。

ｐｒ３Ｒ３２２由来の大きなりＮ、Ａ断片３９８５ｂｐ
を回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１８時間ライ
ゲートし、２２４ｂｐｌＯＦ−１遺伝子を得た。ライゲ
ーション混合物を用いてクッンユナー法により、Ｅ、　
ｃｏｌｉ　）ＩＢ　１０１を形質転換し、アンピシリン
耐性形質転換体をテトラサイクリン（２５μｙ／ｘｃ）
を含有するプレート上で選択した。

アンピシリンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示す
５クローンの１つから分離したプラスミドをＥｃｏＲｔ
およびＢａｍ１−１１で消化し、適当なサイズマーカー
と比較すると予期した２２４ｂｐ［ＧＦ−■遺伝子が生
じていた。ＩＣＦ−［遺伝子の完全なヌクレオチド配列
によって特徴づけられるこのプラスミドをｐｓｄＭｌと
命名した。

ＩＧＦ’−１遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列並びに制限部位を第１図に示す。

Ｂ、ＩＣＦ−１発現ベクターｐＬ　ｔｌ　Ｓ　ｄＭｍｔ
ｒｐの構を Ａ、２で調製したプラスミドｐｓｄＭ１をＥＣ０ＲＩと
Ｂａ１ｍ１−目で消化し、ＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂ
ｐ）を得た。一方、オリゴヌクレオチドｍ２を製造例８
、Ａ、１に記載したように７４ポリヌクレオチドキナー
ゼでりん酸化した。このりん酸化オリゴヌクレオチド、
オリゴヌクレオチドｍ１および夏ＣＦ’−１遺伝子（２
２４ｂｐ）を混合し、１００ｍＭＡ’ｌ”Ｐを含有する
溶液中でＴ４リガーゼを用い４℃で２０時間処理した。

ライゲーション混合物をＢａｍｌ−［１で消化し、次い
でＰＡＣＥで精製し、リンカ−ＤＮＡ断片を伴ったＩＧ
Ｆ−１遺伝子（２４２ｂｐ、　Ｆｒａ−Ｂ　−１１）を
得た。この遺伝子を、ＩＩ　１ｎｄｌＩｌ−１３ａｍｔ
ｌ　ｌ消化によりｐＬＨｌｒｐから得たＤＮＡ断片とラ
イゲートし、ライゲージロン混合物を用いてＥ、　ｃｏ
ｌｉ　ＨＢ　Ｉ　Ｏｌを形質転換した。

生成プラスミドｐＬ　ＨＳｄＭｍｔｒｐを含有するＥ、
ｃ。

１ｉ１１ｎｌｏｌをＥ、ｃｏｌｉＦ−６と命名した。形
質転換体から得たプラスミドｐｔ、　ｔ−ｉ　Ｓ　ｄＭ
ｍｔｒｐをＥｃｏＲｌ　−ＢａｍＨｒ（１９８，２２４
ｂｐ）、ｌ−１ｉｎｄＩ［Ｉ−ｎａｍＨＩ　（２４２ｂ
ｐ）およびＨｐａ　Ｉ　−Ｉ３ａｍｌｌ　ｆ　（４５６
ｂｐ）で消化し、７．５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロー［
−−ター（遺伝子、Ｌ　ｒ−ｉ　オ、及びＩＣ；Ｆ’−
１遺伝子を確認した。プラスミドｐｔ、　ｔｔ　Ｓ　ｄ
Ｍｍｔｒｐの組立て模式図を第７図に示す。

Ｆｒａ−Ｂ−１０およびＦｒａ−Ｉ３−１１めためのオ
リゴヌクレオチド、並びにＦｒａ−Ｂ−１０の組立て模
式図を第１８図に示す。

プラス°ミドｐＩ３Ｒ３２２ｔｒｐＳｓの横築およびク
ローニング プラスミドｐｎＲ３２２をＥｃｏＲ［およびＣ１ａ■で
消化した。大きいＤＮＡ断片（４３４ｏｂｐ）を０．８
％アガロースゲル電気泳動にかけて精製し、１ｍＭＡ’
ｒＰの存在下、合成ｔｒｐ［［プロモーター遺伝子（Ｆ
ｒａ−Ｂ−３）とライゲートした。ライゲーション混合
物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　ｌ　Ｏｌを形質転換し
た。形質転換体のクローンからプラスミドｐＢＲ３２２
ｔｒｐＳｓを単離し、制限エンドヌクレアーゼ分析によ
り、確認した。Ｉｐａ　Ｉ　（４４４５ｂｐ）、Ｃ１ａ
ｌ　−ＰｓＬＩ　（８３４ｂｐ）。ｐＢＲ３２２ｔｒｐ
Ｓｓの組立て模式図を第１０図に示す。

製造例！０　プラスミドｐＣＬ　ａｌ−１ｔｒｐ　−２
の構築 ｔｒｐプロモーター■遺伝子のコントロール下に、Ｃ（
ＩとＬｉｔの融合ペプチドをコードする遺伝子、並びに
α−ｈＡＮＰをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＣ
Ｌ　ａＨＬｒｐ　−２を以下の如くにして組立てた。即
ち、製造例６．８で調製したプラスミドｐＣＬ、　ａｌ
ＩｔｒｐＳ　ｄをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩて消化し、
小さいＩ）　Ｎ　Ａ断片（４０６ｂｐ、　Ｆｒａ−Ｃ−
２）を得ノコ。池方製造例９で調製したプラスミドＩ）
ＢｆＬ　３２２　ｔｒｐｓｓをＣＩａ［およびＢａｍ［
（＋で消化して大きいＤＮＡ断片（４０９３ｂｆ））を
得た。これらの断片をライゲートし、ライゲーション混
合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　Ｉｔ［３１０１を形質転
換し、形質転換体クローンから所望のプラスミドｐｃＬ
ａｌ−１ｔｒｐ−２を単離し、制限エンドヌクレアーゼ
により、特性化を行った。Ｃ１ａｌ−Ｐｓｔｌ（８３４
ｂｐ）、Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｂａｍ１（Ｉ　（４０６ｂｐ）
。プラスミドｐＣＬａＨｔｒｐ”２の組立て模式図を第
１０図に示す。

ろａ　−ｈ　Ａ　Ｎ　Ｐ発現ベクターｐＣＬ　ａＨｔｒ
ｐ３　Ｌの構を Ａｌｄファージターミネータ−の調製およびクローニン
グ ｆｄファージターミネータ−ＣＦｒａ−Ｃ−１）を、製
造例３、Ｂ　と同様にして調製した。用いたオリゴヌク
レオチドを以下に示す。

Ｆｒａ−Ｃ−１ （１）　ｌｌ０ＧｐＡｐ’ｒｐＣｐＣｐＴｐＣｐＧｐＡ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡｐ＾ＯＨ（ＴＩ）（６）　ｔｌＯ
ＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐΔｐＡＯＩｌ　　　
　　　　（Ｔ６）（式中、ＡｐＳＯｐ、Ｃｐおよび’ｒ
ｐは、それぞれデオキンアデニル酸、デオキソグアニル
酸、デオキンンチジル酸およびデオギシヂミジル酸を表
す。）なお、ＡｐＳＧｐＳＣｐおよび′ｒｐの意味する
ところは第１３図〜第１９図においてら同様である。

ＤＮＡオリゴマー１゛２、Ｔｓ、Ｔ４才ｊよび１゛５（
各０．４ｎモル）を混合し、ｌ　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ＜７
）？７：在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、
りん酸化した。反応混合物を６５℃で１０分間加熱して
酵素を不活化した。得られた混合物に、ＤＮＡオリゴ７
−ＴＩおよび’ｒ６（０，８ｎモルづつ）、並びにＴ４
ＤＮＡリガーゼを加えた。混合物を１５℃で３０分間イ
ンキュベートし、２→１６％グラディエンド・ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけた。所望のＤＮＡ断片（
４７ｂｐ）を溶出して回収し、ＢａｍＨＩおよび５ａｌ
ｒ消化ｐＢＲ３２２の大きいＤＮＡ断片（４（１８８ｂ
ｐ）とライゲートし、プラスミドｐｔｅｒ２　＋を得た
。このプラスミドを制限酵素分析にかけ、ｒ３ａｍＨｒ
−Ｓａｌ＋（４７ｂｐ）、Ａｖａｌ（８１７ｂｐ）を確
認した。

Ｂ、プラスミドｐＣＬ　ａＨｔｒｐ３　ｔの構築および
クローニング 製造例１０で調製したプラスミドｐｃｔ、ａｒ−Ｉｔｒ
ｐ−２をＰｓｔｌおよびＢａｍ１−ＩＩで消化し、小さ
いＤＮＡ断片（１２４１ｂり）を単離し、プラスミドｐ
ｔｅｒ２１のＰｓｔｒおよびｒ３ａｍｌ−１ｆ消化によ
る制限フラグメント（３００５ｂｐ）とライゲートした
。

ライゲーション混合物をＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　Ｉ　Ｏ
１に導入して形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＨ２を得た。ＲＡ
ｍｐを示す形質転換体（Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｈ２）から得
たプラスミ　ドｐＣＬ　ａｔ（ｔｒｐ３　ｔ（Ｃｄ　−
Ｌ　Ｉ−１とα−ｈＡＮＰの融合ペプチドをコードする
遺伝子を自存）を、制限エンドヌクレアーゼ分析に付し
、Ｃ１ａ［−Ｅｃｏａｌ（９３９ｂｐ、Ｉ　９８ｂｌ）
）、ｆ−１ｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂ　ａｍ　ｌ−１１（
１３４ｂｐ）およびＰｓｔｌ　−Ｃ１ａｌ−Ｘｈａｌ（
８３４ｂｐ、　４．　ｌ　１ｂｐ）の各ＤＮＡ断片を確
認した。

プラスミドｐＣＬ　ａＨｔｒｐ３　ｔの組辻て模式図を
第１１図に示す。

実施例１　１Ｇｒ；’−１発現ベクター、プラスミドｐ
ＣＥ−Ｓ　Ｍｔｒｐの構築 ＤＮＡオリゴマーＳｓ　Ｔｓ　　ＣＴ　１％　ＣＴｔ、
Ｃ’ｒ　ｘ、Ｃ’ｒ、（各０　、４　ｎｍｏｌ）をライ
ゲーション緩衝液［５０ｍＭ　ＴＲＩ　５−ＨＣｌ２（
ｐＨ７，６）、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣｌｙ、　２０　ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＩ’。

１＋ｎＭスペルミジン、５０μ９牛血清アルブミン、液
ｆｆ１１３０μｇ］に移し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（宝酒造、５　ｕｎｉｔ）を加えて３７℃で１時間
インキュベーションした。反応液に２０＋＋＋ＭＡＴｌ
’Ｃ３ｕＱ）とＴ４リガーゼ（宝酒造、　　８７５ｕｎ
ｉｔ）を加え１５℃で３０分インキュベーションした。

生成した４６ｂｐＤＮＡ断片（Ｆｒａ−Ａ−１）を含む
ライゲーション混杏液を６５℃で２０分加熱して酵素を
失活させテノち、５００ｍＭ　ＮａＣｆｆ（＋　４　μ
ｅ）とＣ１ａｌ（Ｉ　０ｕｎｉｔ）を加えて３７℃で２
時間インキエベーションした。反応混合物を２→１６％
グラディエンドＰＡＧＥで精製し、３５ｂｐのＤＮＡフ
ラグメント（Ｆｒａ−Ａ−２，３００ｎｇ）を得た。

Ａ、２　　Ｆｒａ−Ａ−３（４４ｂｐのＤＮＡ断片）の
調毀 Ｆｒａ−Ａ　−２（３００ｎｇ）、ＣＴ　ｓ、ＣＴ　ｓ
　（各０．４　ｎｌｌ１ｏ＋）とＴ４リガーゼ（３５０
ｕｎｉｔ）をライゲーション緩衝液（２０μｍ２）に移
し、１５℃で３０分インキュベーションした。ライゲー
ション混合物を２．２５％アガロースゲル電気泳動（２
，２５％ＡＧＥ）で精製し、４４　ｂｐのＤＮＡフラグ
メント（Ｆ　ｒａ　−Ａ　−３、ｌ　００　ｎｇ）を得
た。

Ａ、　３　　Ｆｒａ−Ａ−５の調製 製造例８．８で調製したｐＬ　ＨＳ　ｄＭｍｔｒｐ（Ｉ
　ＧＦ−Ｉ融合物発現ベクター４．５ｋｂｐ、１０ｐｇ
）をＨｉｎｄｌｌ［とＢａｍＨＩで処理して２４２ｂｐ
のＩＧＦ−１−ＤＮＡ断片（Ｆ’ｒａ−Ａ−４，３００
ｎｇ）を得た。このＤＮＡを更にＡｖａｉｌで切断して
２＋５ｂ９のＤＮＡ断片（Ｆｒａ−Ａ−５、Ｉ　００　
ｎｇ）を得た。

Ｆｒａ−Ａ−３（１００ｎｇ）、Ｐｒａ−Ａ−５（１０
０ｎｇ）及びＴ４リガーゼ（３５０ｕｎｉｔ）をライゲ
ージジン緩衝液（１２μＱ）に移し、４℃で一部インキ
ユベーションした。反応混合液（Ｆｒａ−Ａ−６を含有
）を６５℃で１０分加熱した後、［３ａｍＨＩ（５ｕｎ
ｉｔ）とＩ−１１ｎｄｌｌｒ（５ｕｎｉｔ）で処理した
。反応混合物を２．２５％ＰＡＧＥで精製して２３８ｂ
ｐのＦｒａ−Ａ−７（３０ｎｇ）を得た。

Ｂ、　ｐＣＥ−ＳＭＬｒｐの構築 製造例６で調製したα−ｈＡＮＰ発現ベクター、ｐＣＬ
　ａＨｔｒｐＳ　ｄ（約４，６ｋｂｐ、１０μ９）をＨ
ｉｎｄ［Ｉ［とＢａｌｌｌ１−ＩＩで切断した。０．８
％ＰＡＧＥで精製し大きい方のＤＮＡ断片（約４　、５
　ｋｂ、　５μｇ）を得た。このＤＮＡ断片（２００ｎ
ｇ）とＦｒａ−Ａ−７（３ｏ　ｎｇ）とをライゲージロ
ン緩衝液（２０μＱ）に移し、Ｔ４リガーゼ（３５０ｕ
ｎ口）を加えて１５℃で３０分インキュベーションした
。ライゲーション混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ
−１を形質転換した。□ＲＡ　ｓｐを有する形質転換体
からプラスミドを抽出し、制限酵素分析により目的とす
るプラスミドｐＣＥ−ＳＭｔｒｐであることを確認した
。Ｉ）ＧＥ−ＳＭｔｒｐの組立て模式図を第９図に示す
。制限酵素分析：　Ｃ１ａ［−ＥｃｏＲＩ：　９３，１
９３ｂｐ、　ＥｃｏｒＬｌ　−Ｈｌｎｄｌｌｌ：　　ｌ
　８０ｂｐ、　ＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｍＨ［：　２３８
ｂｐ１１−１ｐａｌ　−ＢａｍＨＩ　：　　１０７．５
”４４１１ｐ。

プラスミドｐＣＥ　−Ｓ　ＭｔｒｐをＥ、　ｃｏｌｉ　
ＨＢ　１０１に導入し、形質転換体ＨＢＩ　Ｏｌ／ｐＣ
Ｅ−ＳＭＬｒｐを調製した。

実施例２　１０Ｆ−１発現ベクター、プラスミドｐＣＥ
−３Ｍ３ｔの構築 ｔｒｐプロモーター■遺伝子（１０５ｂｐ）、融合α−
ｈＡＮＰ遺伝子（４０６ｂｐ）、および「ｄラアージタ
ーミネータ−（４７ｂｐ）を含有するプラスミドｐＣＬ
ａＨｔｒｐ３ｔ（製造例１１において調製）をＨｉｎｄ
ｌｌＩおよびＢａｍ１（Ｉで消化し、０．８％アガロー
スゲル電気泳動にかけて大きい断片（４１３７ｂｐ）を
単離した。次いで、実施例１で調製したプラスミドｐＣ
Ｅ　−Ｓ　Ｍｔｒｐを旧ｎｄｌ［［とＢａｎ＋Ｈ［で消
化□、得られた小さいＤＮＡ断片（２３８ｂｐＸＦ　ｒ
ａ　−Ａ−７）を上記のＤＮＡフラグメント（４１３７
ｂｐ）にライゲートさ仕た。このライゲーション混合物
を用いてＥ、　ｃｏｌｔ　ｌ−ｌｌ３１０１を形質転換
した。

形質転換体ブローンから組換えプラスミドを単離し、制
限エンドヌクレアーゼ分析によって確認した（Ｃｌａ　
Ｉ、２８６　ｂｐ）。プラスミドｐＣＥ−ＳＭ３ｔの組
立て模式図を第１２図に示す。

実施例３　　Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ／ｐＣＥ−ＳＭＬ
ｒｐによるＩＣＦ−１の生産 Ａ、ＩＣＦ−１遣　の、現 Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ［３ｌ　０１をプラスミドｐＣＥ−
ＳＭｔｒｐで形質転換し、得られた形質転換体Ｅ、ｃｏ
ｌｉＨＢ　１０１　／ｐＣＥ　−ＳＭｔｒｐの単一コロ
ニーを５０μ９／酎のアンピシリンを含むし培地（ＬＡ
ブロス：５１）に移し３７℃で８時間培養した。培養液
をＬＡブロス（１００ｊＩＱ）に移し３７℃で終夜培養
した。終夜培養液（２０Ｊ！１２）をＭ９ＣＡ培地［０
゜５％カザミノ酸、０．２％グルコース、チアミン１−
Ｉ　ＣＱ（５０ｕ９／ｍＱ）、アンピシリン（２５ｕ９
ＩＲＱ）：４００ｍＱ］に添加し、３７℃でＡ６００（
６００ｎｍにおける吸光度）が０．５になるまで培養し
た。

培地にＩ　ＡＡ（β−インドールアクリル酸、２肩９／
ｘｆ２ＥｔＯＨ：　２ｍ１２）を加え、更に３時間培養
した（最終Ａａｏｏ＝　Ｉ　、４０）。培養液を４℃、
６０００ｒｐｍで５分間遠心し、集菌した。

Ｂ０発現したタンパク質の単離、精製 湿菌体をＩ　ＯｍＭ　ＰＢＳ−ＥＤＴＡＩ衝液［ＮａＣ
１２（’８　、０ｇ）、ＫＣｌ２（０、２９）、Ｎａｔ
ＨＰ　Ｏ４・ｌ　２１■、Ｏ（２，９ｇ）、ＫＨ２ＰＯ
，（０，２９）、ＥＤＴＡ（３゜７３　ｇ）／（！（Ｎ
ａＯＴ−１で吐■８．０に調節）；　　８Ｒ（２］に懸
濁し、０℃で超音波処理した。、処理液を遠心（４℃、
　Ｉ　５０００ｒｐｍ、２０分）して上清を除いた。残
渣をＧｎ−Ｉ■Ｃ１２緩衝液（６Ｍグアニジン−ｔ（ｃ
Ｌｌ　０ｍＭ　ＰＢＳ−ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプ
トエタノール；８ｘ（２］に懸濁し、再び０℃で超音波
処理した。この懸澗液を遠心（４”Ｃ，ｌ５０００ｒｐ
ｎ＋、　２０　ｍ１ｎ）　して、上清をＩＭＡｃＯＩ−
１各１０００肩ρに対して３回透析した。透析液を遠心
（４℃。

１５００Ｏｒｐｍ、２０ｍ１ｎ）して、上清を７０％Ｅ
ｔＯＨ（７００ｘｆｆ）に対して透析した。透析液にア
セトン（３０！１１２）を加え一７８℃で１０分静置し
たのち、遠心（４℃、　ｌ　５０００　ｒｐＩｍ、　２
０ｍ１ｎ）した。

沈澱物を減圧乾燥して粗ＭｅＬ−ＩＣＦ−１を得た。

粗生成物をｌＯ％β−メルカプトエタノールを含むＧｎ
ｉ−ＩＣ１２緩衝液に溶解し、逆相ＨＬ　Ｃ［カラム；
ベックマンＲＰＳＣ１流速；　Ｉ　ｘｇ／ｍｉｎ、溶出
；０．０８％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−１０％５ｏ
ｌｌｌｊｎ ＣＩ　、　ＣＮ　　→　　０．０８％ＴＩｉ’Ａ−６０
％ＣＨ＋＋ＣＮ、検出波長；２１４ｎａ＋］で精製した
。収量１゜６Ｒｇ。

Ｃ１発現タンパク質の同定 精製したタンパク質を、Ｎ末端分析及びキモトリプシン
消化によるペプチドマツピングにかけ、Ｍｅｔ−４０Ｆ
−１であることを確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＣＦ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列の模式図、第２図（１）はプラスミドｐＣＥ
−Ｓ　Ｍｔｒ＋）の制限部位および機能地図、（２）は
プラスミドｐＣＥ−ＳＭ３ｔの制限部位および機能地図
、第３図はプラスミドｐｔｒｐＥ　Ｂ　７の組立て模式
図、第４図はプラスミドｐ３２２ｄｔｒｐＳの組立て模
式図、第５図はプラスミドｐＣｄγの組立て模式図、第
６図はプラスミドｐｃＬａＨｔｒｐｓｄの組立て模式図
、第７図はプラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐの組立て模
式図、第８図は２シストロヅ性発現ベクターを得るため
のＤＮＡ断片（Ｆｒａ−Ａ−７）の組立て模式図、第９
図はプラスミドｐＣＥ−ＳＭｔｒｐの組立て模式図、第
１Ｏ図はプラスミドｐＣＬ　ａｌ−１ｔｒｐ　２の組立
て模式図、第１１図はプラスミドｐＣＬａ＋−［ｔｒｐ
３　ｔの組立て模式図、第１２図はプラスミドｐＣＥＳ
Ｍ３ｔの組立て模式図、第１３図はＬ　Ｉ（遺伝子およ
びＲＩ−１遺伝子、Ｆｒａ−Ｂ−４およびＦｒａ−Ｂ−
５の構築工程並びに用いたオリゴヌクレオチドを示す模
式図、第１゛４図はＦｒａ−［３−１の構築工程および
用いたオリゴヌクレオチドを示す模式図、第１５図はＦ
ｒａ−Ｂ−３の構築工程および用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す模式図、第１６図はＦｒａ−Ｂ−７の構築工程
および用いたオリゴヌクレオチドを示す模式図、第１７
図はＦｒａ−Ｂ−９の構築および用いたオリゴヌクレオ
チドを示す模式図、第１８図はＦ’ｒａ−Ｂ−１０の構
築および用いたオリゴヌクレオチドを示す模式図、並び
に内部ＳＤ配列を含有するリンカ−ＤＮＡを伴ったＩＣ
Ｆ−Ｉ遺伝子（Ｐｒａ−Ｂ　−１１）の構築のためのオ
リゴヌクレオチドの模式図、第Ｎ９図はＦｒａ−Ａ　−
［、Ｆｒａ−Ａ−ＵおよびＦｒａ−Ａｌｌｌの構築に用
いたオリゴヌクレオチドを示す図である。 特許出願人　藤沢薬品工業株式会社 代理　人弁理士　前出　葆外１名 ［１図 ＥｃｏＲＸ　　Ｍｅｔ　　ＧＩＹ　　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　
　Ｔ’ｈｒ　　Ｌｅｕ５’−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧ−ＧＧ
Ｔ−ＣＣＴ−ＧＡＡ−ＡＣ丁〜ＣＴＧ−３’　−Ｇ−Ｔ
ＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−Ｃｙ
ｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ
　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｎ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　
ＧｌｙＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＧＴＡ
−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−
ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−Ａ
ＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＯＣＡ−Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　Ｐｈ＠Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ
ｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＳａｒＳａｒ　
　Ｓａｒ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　
　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　ＩＩ＠　Ｖａｌ　Ａ
ｓｐ　　Ｇｌｕ　　ＣｙｓＣ：ｙｓ　　Ｐｈａ　Ａｒｇ
　Ｓａｒ　　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ
　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｍｓｔ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＡＣＡ−Ａ
ＡＡ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＡＣＧ−ＣＴＡ−ＧＡＧ−ＧＣ
Ｇ−ＧＣＡ−ＧＡＣ−ＣＴＴ−ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣＡ
−ＣＧＡ−ＣＣＴ−ＧＡＣ−ＴＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−
ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＣ−
５’匹ε−５ＭＬｒρ ｐＣε−５Ｍ３を 第３図 ｐＴｒｐＥＢ７ 第５１！ｌ−１ ＥｃｏＲＸ ぐ ｒＦ−３ ｐハｒｐ ｐＣｄｒ 第７図−１ ρＬＨｔｒｐ 第９図 ｐＣＥ−５Ｍｔｊｐ 第１２図 ｐＣＬａＨｔｒｐ３を 第１３図−１ ＦｒＧ−８−４７＋’よＶＦｒａ−ｔ３−５ｎｎ桑工牲
’＆Ｖ＋Ｊｍｒ４オリブヌ７し丁＋ド ｉｌｌ　　ＨＯＡｐＡｐ丁ｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐ
Ｇｐ丁ｐＴｏ）（（ａ１コ＋２１　ＨＯＡｐＣｐＴｐＧ
ｐＣｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨｆ
ａ２）ｆ３１　　ＨＯＡ、丁ｐＧｐＴｐＡｐＡρＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ＋ａ３１１４１　Ｈ
ＯＴｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐ
ＡｐＴｐＧＯＨ（ａ４＋＋５１　　ＨＯ丁ＰＴＩＩＴＰ
ＡＩ）ＣＰＡＰ丁１）ＡＰＴＩ”ＰＧＰＧＩ）丁ｐｃｐ
ｃＯＨｆａ５ン１６）　　ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐ丁
ｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴｐ下ｐＯｐＴＯＨｆａ６
１＋７１　　ＨＯＡρＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｂｌン＋８１　　
ＨＯＣρ丁ｐＴｐＴｐＡｐＡｐ”ｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧ
ｐ丁ｐｃｐＡＯＨｆｂ２１＋９１　　ＨＯＴρ丁ρＣｐ
ＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ
ｆｂ３１（１０）　）（ＯＡｐＴｐ％ＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｂ４１１　ｌ　
１１　　ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐ丁ｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨｆｂ５１１１２１Ｎｏ丁ｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐ丁ｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＣＯＨ１ｂ６１１＋３コＨＯＴｐ　ＡｐＡ　ｐＴｐ
　ＧｐＧｐＡｐ　Ａｐ　ＣｐＴｐＣｐ　ＴｐＴｐ　Ｔｐ
Ｔｐ　ＣＯＨ（ｃ　１１ｆ１４１　　ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐ丁ｐ丁ｐ丁ｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
ｆｃ２）Ｌ１５１　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３１＠１３図
−２ ＋１６ン　ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐ丁ｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｃ４１（１７）　ＨＯＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＡＯＨ（ｃ５ン＋ｌ［３１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣ
ｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
ＣＧ）Ｎ９１　ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｔＮ）＋２０１　　
ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡ’ｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＡｐＡｐ丁ｐＴＯＨ［ｄ２１＋２１）　　ＨＯＧｐＴｐ
Ｃρ丁ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐ下ｐＴＯＨ
１ｄ３）１２２＋　）ＩＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡ
ｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨτｄ４１＋２３
１　　ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐ
Ｔρ丁ｐＧｐＧＯＨ１ｄ５１（２４１ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ
ｌｄ６＋＋２５１　ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨＣｅ１）Ｃ２６１
ＨＯＣρ丁ｐ丁ｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡ
ｐＣｐＣｐＡＯＨ（ａ２）＋２７１　　ＨＯＧｐＡｐＧ
ｐＣｐＡｐ丁ｐｃｐｃｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯ
Ｈ（・３１＋２１３１　　ＨＯＣｐＣｐ丁ｐＴｐＡｐＡ
ｐＡｐＧρ丁ｐ’ｒρ丁ｐ丁ｐ丁ρＧｐＡＯＨ（・引１
２９）ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐ丁ｐＧｐ
ＧｐＴｐＣｐ＾ｐＴｏ）＋　　（６５）１３０１　　Ｈ
ＯＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
丁ｐ工ｐＴＯＨｌｅ６＋１３１）　　ＨＯＴｐＧｐ丁ρ
ＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡρ丁ｐｃｐＡｐＡＯＨ
（ｆｌｌ＋３２１　ＨＯＧｐＧρ＾ｐＡρＧｐＡｐＣｐ
ＡρＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧ　ｐＴＯＨｌ　ｆ　２）第
１３図−４ （５０）　ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴＯ）（（ｉ２）（５目ＨＯＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧ
ｐＡＯＨ（１３）＋５２）ＨＯＧｐＧｐ（ｐＧｐＡｐＣ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣＯ）ｌ　　（１
４ンＣ５３）　ＨＯＣρＣｐＴｐＧｐＴｐ、ＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＧｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴＯＲ（１５）＋５４）　
　ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＣＯＨ（１６ン（５５）ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣ
ＤＨ（］１１（５６）、　ＨＯＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣ
ｐＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡＯＨ［３２）（
５７）　ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＣｐＡ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｊ３１（５８）　ＨＯＴｐ
ＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＡＯＨ＋　３４）（５９）　ＨＯＧＰＡｐＴｐＧｐＣ
ｐＴｐＣｐＴｐＴρＣｆＪＧρＡρＣｐＣｐＴＯＨ（３
５１（６０）　ＨＯＧ、ＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＧＯ）ｌ　Ｅ　Ｊ６）（６１］　、ＨＯＴ
ｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯ
Ｈ（１１１（６２）　ＨＯＴｔｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）＋６３）　Ｈ
ＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（
１３＋Ｐｒｏ　−８，−１ ニオ１あ°Ｊび′用１１たオリゴ°ズフレオ千戸−１Ｏ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡＯＨ
［Ａ＋−ＩＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＧ
ｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ）−１ＯＴｐｃｐＡ
ｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐ
ＣＯＨ（Ｃ）−１ＯＧｐＡｐＡｐ丁ｐＡｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）−ＩＯＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐ９ｐＡＯＨ（Ｅ）−ＩＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧ
ｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨＴＦ）−１
ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐ
ＴｐＡｐＡＰＴＯＨ（Ｇｌ−ＩＯＧｐＴｐＴｐＣｐＧｐ
ＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｈ
ｌ−１ＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨｌ工］ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐ
ＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨ
（Ｊ）ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（ＫＩＨＯＣｐＴｐＴｐ丁
１）ＴｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐｃｐＴｐＴ
ＯＨ（ＬＩＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
Ｇｐ丁ｐＡｐＴｐｃｐＧＯＨ（Ｍ）ＨＯＡｐＡｐ丁ｐＴ
ｐＣｐＧｐＡｐ丁ｐＡｐｃｐｃＯＨ（Ｎ）笛１５図 Ｆｒａ−８−３ Ｆｒａ−８−３のｊＸ壕ＩＲ７，Ｊび°用イｒｚオソゴ
ズ７ＬＸ手ド（ｌｌ　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２）ＨＯＣｐＧｐＴ
ｐＴｐＡｐ丁ｐＧｐＡｐ丁ｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐ
ＡＯＨ（Ｂ）（３）　）（ＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐ
ＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（
４）ＨＯＧｐＡｐＡｐＴＧＩＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５１ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧ
ｐＡＯＨ（Ｅ）＋６１　　ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐ丁ｐｃｐＡＯＨ（Ｆ）
（７）　　ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐ丁ｐＧｐＡｐＣｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ）（８）ＨＯＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＧｐＡ９ＴｐＧＰＡＰＴＰＴＭＰＡＰＴＰ
ＴＰＧＯＨ（）Ｉ）（ｓ）　ＨＯＣＰＡＰＴ９ＣＧＩＧ
ｐＡＰＡＰＣＰＴＰＡｐＧｐＴＰＴＰＡＰＡＰＣＯＨ（
工）（１０１ＨＯＯＣｐＧｐＴｐＡ９ＣｐＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＴ９ＡｐＡｐＣＰＴρ鳩Ｈ（Ｊ）（Ｉ　ｌ）　　Ｈ
ＯＴｐＡｐＧｐＴｐＡＰＣｐＧｐＱＩＡＰＡＰＧＰＴｌ
）丁ＰＣＰＡｐＣＯＨ（Ｋ）（１２）ＨＯＣｐＴｐＴｐ
丁ｐＴｐ％ＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯ
Ｈ（Ｌ）（１３１ＨＯＧｐＴｐＡｐＡＧＩＡｇ）ＡＰＡ
ｐＧＰＧＰＧＰＴＰＡＰ丁ＯＨ（Ｍ’）（１引ＨＯＣｐ
ＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ（Ｎす１ツ ｅ’Ｊ、−ＯＪ？ Φ　　　工　　　工　　　Ｈ 察１６図−２ ＮＰＩ　　　ＮＦ２　　げＰ３　　　　　　　　　Ｃｄ
ｌ　　　　Ｃｄ３　　　ｈｌ　　　　　　　　　ＩＩ　
　Ｃｄ５　　　Ｃｄ７鼾１７図−１ Ｆｒａ−８−９の末１刺工、を呈ア°Ｊｖ：／７ＩＩＩ
ｒＳオソゴ又りレ１ナト（１１ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴρＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐ丁ｐ
ＧＯＨｆＡＨ（＋＋２１　　）１０ＡｐＡｐＴｐ丁ｐＣ
ｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣρＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐ
ＡＯ）Ｉ　　ｆＡ）（２１＋３１ＨＯＡｐＡｐＴｐ下ｐ
’ｐＧｐＧｐ丁ｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐｃＯＨ（ＡＨ３
１＋４１　ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐ
ＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＧＯＨ＋Ａｌ−１４１＋５１
　　ＨＯＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＡｐＡ
ｐＡｐ丁ｐＣｐＴＯＨｆＡＨ５１＋６１　ＨＯＣｐＧｐ
ＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＡｐＧｐＣＯＨ
ｆＡＨ６１＋７１　　ＨＯＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＴｐＡ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐ丁ｐｃｐＴＯＨｆＡＨ７１＋Ｉ
３１　　ＨＯＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧ
ｐＡｐ丁ｐＣｐ丁ｐＡＯＨＩＡＨ８１＋９１　　ＨＯＴ
ｐＧｐＣρＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＴρＧｐＧｐＣｐＣｐ
Ｇρ丁ＯＨｆＡＨ９１ＮＯＩ　ＨＯＴｐＣｐＣρＡｐＴ
ｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣｐＣｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨＩＡＨ
ｌｏ　１１　Ｉｌｌ　ＨＯＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＧＴＯＨＩＡＨ（４＋Ｎ２
１　　’）ｌＯｐ丁ｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧ
ｐＡｐＴｐＧｐＣｐＧｐＧＯＨ（ＡＨＩ２１＋１３１　
ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＡρＧｐＴｐＣｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＣｐＴｐＧＯＨｆＡ）１１３１＋１４１　ＨＯＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＡｐ
ＣＯＨＩＡＨ１４１１ｆ　５１　　ＨＯＧｐＧｐＣｐＴ
ｐＧｐ丁ｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴしＴｐＣＯＨｆ
ＡＨ１５１な１８面一１ Ｆｒａ−８−１０のｉｔ工ｉ％　ｓ−；よ２／′＠ｓ＋
ｆ：スフしズ子ド（Ｉ）　ＨＯＡｐＡｐＴｐ丁ｐｃｐＡ
ｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｎ（２１ＨＯＴｐＴｐＴ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨＩ
Ａ２）＋３１　　ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐ丁ｐＧＯＨ（Ｂ１１（４１ＨＯＣｐ
ＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｂ２）（５１ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＣρ丁、ＧｐＧＰＴＯＨ（Ｃ１１１６
１ＨＯＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧρＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＴｐ丁ＯＨ（Ｃａ１１７１　８０丁１）Ｇ
ｐＡＰ’１１ＧＰＣｐＴＰ’９丁ＧＩＧＰ’ＰＡＰＡＧ
Ｉ丁、Ｔ、ＴＯＨＩＤＩ＋＋１３１　ＨＯＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣＯＨ
（０２３＋９１　　ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＴｐＯｐ
Ｇｐ丁ｐＧｐＡｐＴｐ（：ｐＧｐＴＯＨ＜Ｅｌ）ＴＩＯ
Ｉ　ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＣｐＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨｉＥ２＋＋ｌｌｌ　　ＨＯＧｐＧ
ｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐ
ＣＯ，ＨＩＦ（Ｉ（１２１ＨＯＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧ
ｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｆ２
）＋Ｉ３１　ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣ
ｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１１（１４１Ｈ
ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐ
ＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）０５）　ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨｊＨ
ｌ）第１８図−２ Ｆｒａ、Ｂ−１０ ＋１６）　ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ＋Ｈ２１Ｔ＋７１　ＨＯＧ
ｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐ（４ＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐ
ＴｐＧＯＨｌ　１１　）ｉ１＋３１　　ＨＯＣｐＴｐＡ
ｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐ
ＧＯＨ（Ｉ２１＋１９１　　ＨＯＧｐＴｐＡｐ丁ｐＣｐ
ＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨＩＪ
ＩＩ＋２０１　ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＡｐｒｐｒｐＣｐＧｐＴＯ）Ｉ　１ｆｆ２１Ｃ２目
　ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐ丁ｐＴｐ
ＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌ＋（２２１ＨＯＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ
ＩＫ２）１２３１　　ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣρ丁＋）
ＣＰＣｐＧｐＣＰＣＩＩＧＰＴＰＣＰテ０ＨＩＬ１１＋
２４１　ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣｐＡ
ｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｌ２１１２５）　ＨＯ
ＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＣｐＴＯＨ（ＮＨ＋＋２６１　　ＨＯＴｐＴｐＣ
ｐＡｐＧｐＴＰＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＣｐＡｐＧＯ
Ｈ（Ｍ２）＋２７）　ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ＋Ｎ１１（２１
３１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐ丁ｐＧｐＣ
ｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨｌＮ２１１２９１　ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ、ｐ
ＧＯＨｒｏｌｌ（３０１ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨＴ０２）第１８図−３ Ｆｒａ−？＋１ ０Ｉ　　ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐ丁
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐ丁ｐＧＯＨ１ｍｌ＋１２１
　　ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐ丁ｐａｐ丁ｐ丁ｐＴ
ｐＴｐＡｐＣｐ丁ｐＴｐｃｐＡＯＨ１ｍ２３丁ｔｏ−１
１−−１０ 培１９図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロモーター遺伝子、分子量約５００〜５０，００
   ０の“他のペプチド”をコードする遺伝子を含む第１シ
   ストロンおよびＭｅｔ−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含む第２シ
   ストロンをこの順に含み、各シストロンの上流にＳＤ配
   列をそれぞれ有するポリシストロン性発現ベクターであ
   って、大腸菌内で選択可能かつ自己複製可能な発現ベク
   ター。 ２、“他のペプチド”が酸性ペプチドである第１項記載
   のベクター。 ３、“他のペプチド”がＣｄ−ＬＨである第１または２
   項記載の発現ベクター。 ４、第１シストロンと第２シストロンを連結する“シス
   トロン連結配列”が翻訳停止信号と翻訳開始信号が重複
   したヌクレオチド配列であるか、翻訳停止信号と翻訳開
   始信号が隣接したヌクレオチド配列であるか、または翻
   訳停止信号と翻訳開始信号が１〜２個の塩基対を介して
   接しているヌクレオチド配列である第１〜３項のいずれ
   かに記載の発現ベクター。 ５、プロモーター遺伝子がｔｒｐプロモーター遺伝子で
   ある第１〜４項のいずれかに記載の発現ベクター。 ６、“シストロン連結配列”がＴＡＡＴＧである第１〜
   ５項のいずれかに記載の発現ベクター。 ７、転写終止配列がｐＢＲ３２２由来の終止配列または
   ｆｄファージ由来の終止配列である第１〜６項のいずれ
   かに記載の発現ベクター。 ８、プラスミドである第１〜７項のいずれかに記載のベ
   クター。 ９、プラスミドｐＣＥ−ＳＭｔｒｐまたはプラスミドｐ
   ＣＥ−ＳＭ３ｔである第１〜８項のいずれかに記載の発
   現ベクター。 １０、第１〜９項のいずれかに記載の発現ベクターによ
   って形質転換された形質転換体。 １１、大腸菌である第１０項記載の形質転換体。 １２、大腸菌がエシエリヒア・コリＨＢ１０１である第
   １１項記載の形質転換体。 １３、第１項〜第９項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ
   発現ベクターで細胞を形質転換し、得られた形質転換体
   を遺伝子の発現に適した条件下で培養した後、細胞を溶
   解し、得られたリゼイトから、Ｍｅｔ−ＩＧＦ−Ｉを分
   離することからなるＭｅｔ−ＩＧＦ−Ｉの製造方法。