JPS62238219A - ソマトスタチンの製造法 - Google Patents
ソマトスタチンの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［産業上の利用分野］
この発明はソマトスタチンの遺伝子組み換λ法による。
新規な製造法ならびに該製造法で用いられイ）形質転換
体およびプラスミドに関する。 ソフトスタチンは下記アミノ酸配列を有するぺ、／’
Ｆ・ドであり、消化性潰瘍治療剤として有用である、−
とが知られており、また成長ホルモンおよびグルカフ〉
・、インシュリンを含む多数のホルモンの分泌を抑制す
ることが知られており、従って、肢端巨大症およびイン
シュリン依存性糖尿病治療薬として有用であることが期
待される。 ソマトスタチン； Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ［従来の技術］ 遺伝子Ｍ′ｉ換λ法により得られる付加蛋白およびツマ
１スタヂンを含む融合蛋白を付加蛋白の脱離反応に付す
ことによって、この発明の目的化合物であるソフト・ス
タチンを得ること自体は、アメリカ特、ｙｆ第４４２５
４３７号で公知である。 ［発明が解決しようとオ゛２）問題点］１、か１２、よ
り高収率で目的化合物であるラフ１二人タグ゛〉を得る
という観点からみれば、さまざまな−■夫の余地が残さ
れており１．−の発明はこの観点からなされ六−もので
ある。 ［問題点を解決するための手段］ この発明によれば、ソマトスタチンは、ｔｒｐプロ（；
−ター、付加蛋白およびソマトスタチンをｔむ融合蛋白
のアミノ酸配列をコー・ドする構造遺伝子、および１個
以上の終止ｊトンを含み、該付加蛋白がリンカ−に由来
するペプチドに結合・した蛋白ペプチドＬＨで、ソフト
スタチンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチす、ニ
ンを選択切断部位として含み、−上記諸要素がｍｌ記の
順序に配列している新規組換えプラスミドを用いて適切
な微生物を形質転換し、この微生物を生育、増殖させて
付加蛋白がリンカ−に由来［るブチドに結合した蛋白ペ
プチドＬＨであって、ソマトスタチンのＮ−末端アミノ
酸配列に隣接するメチ才二−ンの選択部位を含んでいる
ペプチドとソマトスタチンとの融合蛋白を生産し、この
ようにして得た融合蛋白をツマ１スタチンのＮ−末端ア
ミノ酸配列に隣接するメｆ゛（二〕・・の切断部位で除
去きれる付加蛋白の脱離反応に付してソマトスタチンに
変換することによって製造することができる。 前記および以下で使用する用語は、特に断らない限り、
以下の意味を有する。 好適な’ ｔｒｐプロモーター遺伝子、としては、その
ＤＮＡ配列がヘネノトらが文献［Ｇ、 Ｎ、 Ｂｅｎｎ
ｅｔｔａｔ Ａｌ ： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。１
２１巻、１１３頁（１９７８）コで明らかにし、第１図
に示されている大腸菌のブしｊモーター−オペレーター
領域に由来するような遺伝子、および上記プロモーター
−オペレーターｆｆｉ域の少なくとも１プロモーター領
域」および’ＳＤ配列（リポソーム結合部位としても知
られている）」を含む遺伝子が挙げられる。 そのような’ ｔｒｐプロモーター、の好ましい例とし
ては、塩基対番号−７９〜２２のプロモーター−１べし
・−ター領域からなる遺伝子で、該遺伝子の５′および
３′末端には、ＥｅｏＲＩ、 ＥｃｏＲＩ” 、旧ｎｄ
ＩＩＩ、 ＢａｍＨＩ等のような制限ユ、ンドヌクＬ・
アーゼと作用する適切な粘着性末端が付されているよう
なものが挙げられる。さらに好ましくは、塩基列番υ−
７９〜２２のプロモーターーーオベレーター領域からな
る遺伝子で５′末端にＥｅｏＲＩ”と作用する粘着性末
端が、３゛末端にＥｅｏＲＩと作用する粘着性末端が付
されているものが挙げられ、そのＤＮＡ配列は第２図に
示しである。 「融合蛋白、は付加蛋白およびソフトスタチンを含む蛋
白であって、宿主微生物中でその融合蛋白のアミノ酸配
列をコードする構造遺伝そを発現させることにより生産
される。 融合蛋白から容易に除去されソマトスタチンを遊［″る
好適な１付加蛋白、と１７では、リンカ−に由来するペ
プチドに結合した蛋白ペプチドＬＨであって、ソマトス
タチンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチオニンの
選択切断部位を含んでいるペプチドが挙げられ、ツマ］
・スタチンの安定性お大いに増大し、その精製を容易に
する。 蛋白ペプチドＬＨのアミノ酸配列は第３図に示されるも
のである。蛋白ペプチドＬＨをコードす゛る遺伝子のＤ
ＮＡ配列の好ましい例も同図に示されている。 こ、−℃、融合蛋白中の蛋白ペプチドＬＨとソマトスタ
ーｐ ＞の間には、蛋白ペプチドＬＨおよびソマト′人
タブ＞をコードする構造遺伝子をプラスミドの適当な位
置に挿入するのを容易にするため導入したリンカ−に由
来するペプチドが存在する。 ａｔ適な１リンカーオリコ′ヌクレオチド」としては、
１０−３０塩基対およびＥｃｏＲＩ％ＨｉｎｄＴＩＩ、
ＢａｍＨＩなとのような制限エンドヌクレアーゼと作用
する粘着性末端を有するものが挙げられる。 リンカ−オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列の好適な例は
第４図に示すものである。 ソマトスタチンをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の好ま
しい例は第５図に示すものである。 融合蛋白のアミノ酸配列の好ましい例は第６図に示すも
のである。 好適な１統止コドン、としては、第５図に示すよつに、
ソマトスター〉′のＤＮＡ配列の下′流に在るＴＡＧ、
ＴＡＡおよびＴＧＡが挙げられる。 ｔｉｆ適な「プラスミド、としては、 ｐＢＲ３２２、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８などのような通常用いら１
．る微生物由来のものが挙げられる。 組換λプラスミドを用い形質転換する好適なｒ微生物」
としては大腸菌などの細菌が挙げらｔｚる。 以下、添付図面第１〜１２図を参照し、この発明をさら
に詳細に説明する。 （１）プラスミド中に含まれる諸要素のＤＮＡ配列およ
び発現されるペプチドのアミノ酸配列は第１〜・６図に
示すものである。 第１図： 大腸菌のｔｒｐプロモーター−オペレーター領域の遺伝
子の模式構造 塩基対は＋１としたｔｒｐ ｍ−ＲＮＡ転写開始部位か
ら数える。制限上ンドヌクレアー・ゼ切断部位および「
プロモーター領域、および「ＳＤ配列」の領域は図示の
通りである。 第２図： ５−の発明の最も好ましいｔｒｐプロモーターのＤＮＡ
配列 １４個のオリゴヌクレオチドはＡからＮの記号で示４″
。塩基対は前記同様番号を付す。 第３図： 蛋白ペプチドＬＨのアミノ酸配列 蛋白ペプチドＬＨをコードする遺伝子のＤＮＡ配列４）
ｔｌＩましい例として示されている。 第４図ニ リンカーのＤＮＡ配列 対応するアミノ酸配列も示す。 第５図： ソマトスタチンをコードする遺伝子の模式構造８個のオ
リゴヌクレオチドは５Ａ−５Ｈの記号を付して示す、’
５ｔｏｐ Ｊは終止コドンを意味する。 第６図： 融合蛋白のアミノ酸配列 （２）各髪素の遺伝子の合成およびクローニング法を第
７および８図に示す。 第７図： ソマトスタチン遺伝子に結合（、たｔｒｐプロモーター
遺伝子構築のフローチャート オリゴヌクレオチドを、第７図に示ｔように、ｔＩｉよ
（、＜ない相互作用の可能性を最小にするため一連のス
テップでアニール化し、ライゲートする。オリゴヌクレ
オチドは □−（・は５′−リン酸化末端を意味する）
で示す、ライゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在
下に行っ。 オリゴヌクレオチドＢ、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＦをアニール
化およびライゲートし、ブロック１′ を形成する。他
のブロック１’ −ＩＶ’ もまたＧからＳＧを図示の
ようにライゲーションして得る。 オリゴヌクレオチドＡとブロックＩ′をライゲートして
ブロックＶ′を得、オリゴヌクレオチドＳＨとブロック
■′ をライゲートしてブロック■′ を得る。 このようにして得たブロックｎ’ 、ｍ’ 、ｖ’およ
び■′ を再びＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理し、得られ
た生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ソ
マトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐプロモーターを得
る。 第８図ニ シラスミドｐＴｒｐＥＢ７の構築のフローチ〜−トソン
トスタチン遺伝子に結合したｔｒｐ−プロ１ミータ−遺
伝子を、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＢａ＋ｎＨＩ制御
ｌｌエンドヌクレアーゼで処理したｐＢＲ３２２プラス
ミド中に挿入する。得られたプラスミドを用いイー・コ
リ（以下、Ｅ、 ｃｏｌｉと記す）ＨＢＩＯＩのような
適゛当な微生物を形質転換する。抗生物質耐性形質転換
体を選択することにより、ソフトスタチン遺伝子に結合
したしｒｐプロモーターを含むプラスミドが分離され、
これをｐＴｒｐＥＢ７と命名する。 （３）“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子”の
合成およびクローニング法を第９および１０図に示す。 第９図： “蛋白ペプチドＬ）を遺伝子を含む合成遺伝子゛構築の
フ［ゴーチャート 構築方法は得られる遺伝子中のＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎ
ｄｌ、ＩＩ制限部位間に蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を形Ｉ
Ｊ： １’るように設定する。この合成遺伝−ｒ−を便
宜Ｉ１、“蛋白ペプチドＬＨ遺伝了を含む合成遺伝子“
′と称する。この遺伝子の構築法はソマトスタチン遺伝
ｒに結合したｔｒｐプロモーター遺伝子の場合と同様で
ある。 第１Ｏ図： “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子パのりＬｌ
−ニングのフローチャート “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子゛′をあら
かじめＥｅｏＲＴおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア
ービで処理したｐＢＲ３２２プラスミド中に挿入する。 得られたプラスミドを用いてＥ、 ｅｏｌｉ ）１８１
０１のような適切な微生物を形質転換する。抗生物質耐
性形質転換体を選択することにより“蛋白ペプチドＬＨ
遺伝子を含む合成遺伝子”を含有するプラスミドを分離
し、これをｐＬＨ１０７と命名する。 ｐＬ）１１０７をＥｃｏＲＩおよびＢａａ＋ＨＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化することにより“蛋白ペプチド
Ｌ）を遺伝ｒ−”を含む合成遺伝子を得る。 ＜４）ソマトスタチン遺伝子およびｔｒｐブ■」モータ
ー遺伝子および“蛋白ペプチドＬｌ（遺伝子を含む遣１
云子”を含有するプラスミドｐＬＨｔｒｐの構築方法を
第１１図に示す。 第１１図： ソフトスタチン遺伝子およびプラスミドｐＬＨｔｒｐ構
築のノロ−チャート １）ソフトスタチン遺伝子はｐＴｒｐＥＢ７を５ｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化する
ことにより得る。 Ｉ）プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ０ＲＩおよびＢａ
ｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し、ｔｒｐプロモ
ーター遺伝ｒ−を含有する最も大きな断片を“蛋白ペプ
チドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°゛とライゲートし、
プラスミＦｐＬＨｔｒｐｔ得る。 （５）この発明の目的の組換えプラスミドであるプラス
ミドｐＬＨ５ｓｔｒｐ構築法を第１２図に示す。 第１２図： 組換えプラスミドｐＬＨ５ｓｔｒｐ構築のフローチャー
ト ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ末端を有するソマトスフチ
ン遺ｆ云ｒをリンカーオリコヌクレオチドに結合させ、
シラスミドの同じ制限特異性部位に挿入するための、ソ
マトスタチン遺伝子を含みＨｉｎｄＩＩＩおよび３５ｍ
１（Ｉ末端を有する遺伝子を形成する。 プラスミドｐＬＨｔｒｐ ＠ ）１ｉｎｄＩＩＩおよび
３ａｍＨＩ制限エンドメクレアーゼで消化するやしｒｐ
プロモーター遺１ムＬおよび蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を
含有する最も大きな断片を、１ｉｎｄＩＩＴ、およびＢ
ａｍＨＩ末端を有するリンカ−オリゴヌクレオチドに結
合したソマトスタチン遺伝子とライゲートし、プラスミ
ドｐＬＨ５ｓｔｒｐを形成スル。 （６）組換えプラスミドを用いて微生物を形質転換し、
構造遺伝そを発現させ、ソマトスタチンを産生きける方
法を以下に説明する（第１２図参照）。 ソフトスタチン遺伝子発現には、このようにして得たｔ
ｒｐプロモーター遺伝子、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子およ
びソマトスタチン遺伝子を含むプラスミドを用い宿主微
生物を形質転換し、次いで組換えプラスミドを含む宿主
微生物を炭素源および窒素源含有栄養培地中通気条件下
に培養する（例えば、振盪培養、深部培養、など）。 発酵は通常、温度約２０℃〜４２℃、好ましくは３５〜
３８゛Ｃで、数時間〜５０時間行う。 このようにして生産した付加蛋白およびソマトスタチン
を含む融合蛋白は、他の既知の生理活性物質の回収に通
常用いられる慣用の方法により培養培地から回収するこ
とができる。 このようにして得た融合蛋白は、付加蛋白の脱離反応に
よりソマトスタチンに変換することができる。 この脱離反応は、臭化シアンなどを用いる方法のような
ペプチド化学の分野において使用される常法に従って行
うことができる。 この反応は通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒
中で、穏やかな条件下で行う。 反応温度は特に限定されず、反応は通常、冷却ないし加
温下に行う。 本明細書に用いた略号をド記に示ｔ。 ｔ ｌ Ｌｆ’ ３クレオチド配列中に用いたＡおよび
Ａｐニアγニン ：４リロヌクレオチド配列中に用いたＴおよびＴｐ：チ
ミン オリコメクレオチド配列中に用いたＧおよびＧｐニゲア
ニン オリゴヌクレオチド配列中に用いたＣおよびＣｐ： シ
トンン ＡＢＺｐｏ、アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれベン
ゾイルおよびｐ−クロロフェニルで保護されているアデ
ニン エｐＯ： ヒドロキシ基がｐ−クロロフェニルで保
護されているチミン ＧｉＢｐｏ ： アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれ
インブチリルおよびｐ−クロロフェニルで保護されてい
るグアニン ｃＢｚｐＯ，アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれベン
ソイルおよびｐ−クロロフェニルで保護されているシト
シン ＡｃＬｌｐｏ ： １−ドロキシ基がアセチルで保護さ
れているウラシル ＤＭＴｒ ： ジメトキシトリチル ［発、明の効果］ この発明によれば、付加蛋白およびソマトスタチンを含
む融合蛋白が高収率で得られること、該融合蛋白からの
ソマトスタチンの単離と精製が容易であることなどのす
ぐれた効果が奏せられる。 ［実施例］ 以下、製造例および実施例を示し、この発明を説明する
。 製造例Ｉ ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＩｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）（第７図にＳＢの記号で
示すオリゴヌクレオチドに相応する）の合成 （１） ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ” ｐｏｒｐｃ？’
Ｕｐｏ−セＬ Ｏ−ス（７）合成： ｉ ） Ｉ（ＯＴｐｏＡｏＵｐｏ−セルロースの製造：
ＤＭＴｒＯＴｐｏ” Ｕｐｏ−セルロース（２５０，０
ｍｇ、 ２６．１μモル、以下、この値はクロロホルム
での洗液の吸光度を５０７ｎｎｔで調べることにより算
出する。）（フレア法［Ｒ，Ｃｒｅａ ａｔ ａｌ、
Ｎｕｅｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ８巻
、２３３１頁（１９８０）コにより製造）のメタノール
／りｏｏホルム（１：９ｖ／ｖ、５．ＱｍＱ）中懸肩液
にトリクロロ酢酸／クロｌＪホルム（２：３ ｗ／ｖ、
５． ＱｍＱ ）を氷冷下に加え、混合物をｏ”ｃで
１０分間攪拌する。フィルター上でクロロホルム（２ｍ
ｅ）およびメタノール（６，ＱｍＱ ）で順次洗浄した
後、ヒルロース付加物（ＨＯＴｐｏＡｃｌＪｐ□−セル
ロース）を乾燥させ、水はピリジン（２ｍＡ）共沸物と
して分離する。 ｉ ） ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏ−の製造：Ｄ
ＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏ−ＣＥ （２２３ｎ＋
ｇ＞をトリエチルアミン−アセトニトリル（１： ｌｖ
／ｖ、 ５ｍＱ）で室温で１時間処理する。このように
して得たホスホジエステルトリ” （ＤＭＴｒＯＴｐ
ｏＴｐｏＣ”２ｐｏ−）を乾燥させ、水はピリジン共沸
物（０，５ｍＱ、２ Ｘ １ ｄ、 ）として分離する
。 ｉ）カフプリング： １リマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏ ）と七
）しＵｊ −スイ・ｊ加物（ＨＯＴｐｏＡｃＵｐｏ−セ
ルｃ＋ −ス）をｌＱｍＱ容丸底７ ’−、７２表−１
中′ｒ混合４る。混合物を乾燥させ、水はピリジン共沸
物（２Ｘ１ｍＱ）として分離し、最後に無水ビリ：、；
’＞（１ｍＱ）に再懸濁する。メシチレンスルホ−ルニ
Ｆ・ロトリアゾリド（１９３■、６５２．５μモ゛
ル）をこの懸濁液に加え、混合物を室温で１時間撹拌４
る。次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース付加
物を遠心分離（３，０００ｒｐ＋ｎ、 ２分間）により
回収する。 ■）非反応５′−ヒドロキシ基のアセチル化＝１−記の
ようにして得たセルロース付加物ヲビリジ〉・−無水酢
酸溶液（１０：ｌｖ／ｖ、５，５ｍＱ）に懸濁し、室温
で３０分間攪拌する。セルロース生成物（２５８，４ｍ
ｇ ）をピリジン（５ｍＱ）中で繰返し遠心分１１１１
（３，００Ｏｒｐｍ、２分間）シテ得、）タノール（
１５ｍＱ ’）で洗い、室温で３０分間真空乾燥する。 このセル「Ｊ−ス付加物（ＤＭＩｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”
２ｐｏＴｐｏＡｅＵｐｏ−セルロース）は次のカップリ
ング段階に使用できく２） ＤＭＴｒＯＡＢ”ｐｏＡ
”ｐｏＣ””ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏＴｐｏＡｅＩ
Ｊｐｏ−セル［１−スの合成 団子ｒＯＡ””ｐｏＡ”’ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ
Ｂ”ｐｏＴｐｏ”１Ｊｐｏ−＋ル
体およびプラスミドに関する。 ソフトスタチンは下記アミノ酸配列を有するぺ、／’
Ｆ・ドであり、消化性潰瘍治療剤として有用である、−
とが知られており、また成長ホルモンおよびグルカフ〉
・、インシュリンを含む多数のホルモンの分泌を抑制す
ることが知られており、従って、肢端巨大症およびイン
シュリン依存性糖尿病治療薬として有用であることが期
待される。 ソマトスタチン； Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ［従来の技術］ 遺伝子Ｍ′ｉ換λ法により得られる付加蛋白およびツマ
１スタヂンを含む融合蛋白を付加蛋白の脱離反応に付す
ことによって、この発明の目的化合物であるソフト・ス
タチンを得ること自体は、アメリカ特、ｙｆ第４４２５
４３７号で公知である。 ［発明が解決しようとオ゛２）問題点］１、か１２、よ
り高収率で目的化合物であるラフ１二人タグ゛〉を得る
という観点からみれば、さまざまな−■夫の余地が残さ
れており１．−の発明はこの観点からなされ六−もので
ある。 ［問題点を解決するための手段］ この発明によれば、ソマトスタチンは、ｔｒｐプロ（；
−ター、付加蛋白およびソマトスタチンをｔむ融合蛋白
のアミノ酸配列をコー・ドする構造遺伝子、および１個
以上の終止ｊトンを含み、該付加蛋白がリンカ−に由来
するペプチドに結合・した蛋白ペプチドＬＨで、ソフト
スタチンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチす、ニ
ンを選択切断部位として含み、−上記諸要素がｍｌ記の
順序に配列している新規組換えプラスミドを用いて適切
な微生物を形質転換し、この微生物を生育、増殖させて
付加蛋白がリンカ−に由来［るブチドに結合した蛋白ペ
プチドＬＨであって、ソマトスタチンのＮ−末端アミノ
酸配列に隣接するメチ才二−ンの選択部位を含んでいる
ペプチドとソマトスタチンとの融合蛋白を生産し、この
ようにして得た融合蛋白をツマ１スタチンのＮ−末端ア
ミノ酸配列に隣接するメｆ゛（二〕・・の切断部位で除
去きれる付加蛋白の脱離反応に付してソマトスタチンに
変換することによって製造することができる。 前記および以下で使用する用語は、特に断らない限り、
以下の意味を有する。 好適な’ ｔｒｐプロモーター遺伝子、としては、その
ＤＮＡ配列がヘネノトらが文献［Ｇ、 Ｎ、 Ｂｅｎｎ
ｅｔｔａｔ Ａｌ ： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。１
２１巻、１１３頁（１９７８）コで明らかにし、第１図
に示されている大腸菌のブしｊモーター−オペレーター
領域に由来するような遺伝子、および上記プロモーター
−オペレーターｆｆｉ域の少なくとも１プロモーター領
域」および’ＳＤ配列（リポソーム結合部位としても知
られている）」を含む遺伝子が挙げられる。 そのような’ ｔｒｐプロモーター、の好ましい例とし
ては、塩基対番号−７９〜２２のプロモーター−１べし
・−ター領域からなる遺伝子で、該遺伝子の５′および
３′末端には、ＥｅｏＲＩ、 ＥｃｏＲＩ” 、旧ｎｄ
ＩＩＩ、 ＢａｍＨＩ等のような制限ユ、ンドヌクＬ・
アーゼと作用する適切な粘着性末端が付されているよう
なものが挙げられる。さらに好ましくは、塩基列番υ−
７９〜２２のプロモーターーーオベレーター領域からな
る遺伝子で５′末端にＥｅｏＲＩ”と作用する粘着性末
端が、３゛末端にＥｅｏＲＩと作用する粘着性末端が付
されているものが挙げられ、そのＤＮＡ配列は第２図に
示しである。 「融合蛋白、は付加蛋白およびソフトスタチンを含む蛋
白であって、宿主微生物中でその融合蛋白のアミノ酸配
列をコードする構造遺伝そを発現させることにより生産
される。 融合蛋白から容易に除去されソマトスタチンを遊［″る
好適な１付加蛋白、と１７では、リンカ−に由来するペ
プチドに結合した蛋白ペプチドＬＨであって、ソマトス
タチンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチオニンの
選択切断部位を含んでいるペプチドが挙げられ、ツマ］
・スタチンの安定性お大いに増大し、その精製を容易に
する。 蛋白ペプチドＬＨのアミノ酸配列は第３図に示されるも
のである。蛋白ペプチドＬＨをコードす゛る遺伝子のＤ
ＮＡ配列の好ましい例も同図に示されている。 こ、−℃、融合蛋白中の蛋白ペプチドＬＨとソマトスタ
ーｐ ＞の間には、蛋白ペプチドＬＨおよびソマト′人
タブ＞をコードする構造遺伝子をプラスミドの適当な位
置に挿入するのを容易にするため導入したリンカ−に由
来するペプチドが存在する。 ａｔ適な１リンカーオリコ′ヌクレオチド」としては、
１０−３０塩基対およびＥｃｏＲＩ％ＨｉｎｄＴＩＩ、
ＢａｍＨＩなとのような制限エンドヌクレアーゼと作用
する粘着性末端を有するものが挙げられる。 リンカ−オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列の好適な例は
第４図に示すものである。 ソマトスタチンをコードする遺伝子のＤＮＡ配列の好ま
しい例は第５図に示すものである。 融合蛋白のアミノ酸配列の好ましい例は第６図に示すも
のである。 好適な１統止コドン、としては、第５図に示すよつに、
ソマトスター〉′のＤＮＡ配列の下′流に在るＴＡＧ、
ＴＡＡおよびＴＧＡが挙げられる。 ｔｉｆ適な「プラスミド、としては、 ｐＢＲ３２２、
ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２８などのような通常用いら１
．る微生物由来のものが挙げられる。 組換λプラスミドを用い形質転換する好適なｒ微生物」
としては大腸菌などの細菌が挙げらｔｚる。 以下、添付図面第１〜１２図を参照し、この発明をさら
に詳細に説明する。 （１）プラスミド中に含まれる諸要素のＤＮＡ配列およ
び発現されるペプチドのアミノ酸配列は第１〜・６図に
示すものである。 第１図： 大腸菌のｔｒｐプロモーター−オペレーター領域の遺伝
子の模式構造 塩基対は＋１としたｔｒｐ ｍ−ＲＮＡ転写開始部位か
ら数える。制限上ンドヌクレアー・ゼ切断部位および「
プロモーター領域、および「ＳＤ配列」の領域は図示の
通りである。 第２図： ５−の発明の最も好ましいｔｒｐプロモーターのＤＮＡ
配列 １４個のオリゴヌクレオチドはＡからＮの記号で示４″
。塩基対は前記同様番号を付す。 第３図： 蛋白ペプチドＬＨのアミノ酸配列 蛋白ペプチドＬＨをコードする遺伝子のＤＮＡ配列４）
ｔｌＩましい例として示されている。 第４図ニ リンカーのＤＮＡ配列 対応するアミノ酸配列も示す。 第５図： ソマトスタチンをコードする遺伝子の模式構造８個のオ
リゴヌクレオチドは５Ａ−５Ｈの記号を付して示す、’
５ｔｏｐ Ｊは終止コドンを意味する。 第６図： 融合蛋白のアミノ酸配列 （２）各髪素の遺伝子の合成およびクローニング法を第
７および８図に示す。 第７図： ソマトスタチン遺伝子に結合（、たｔｒｐプロモーター
遺伝子構築のフローチャート オリゴヌクレオチドを、第７図に示ｔように、ｔＩｉよ
（、＜ない相互作用の可能性を最小にするため一連のス
テップでアニール化し、ライゲートする。オリゴヌクレ
オチドは □−（・は５′−リン酸化末端を意味する）
で示す、ライゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在
下に行っ。 オリゴヌクレオチドＢ、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＦをアニール
化およびライゲートし、ブロック１′ を形成する。他
のブロック１’ −ＩＶ’ もまたＧからＳＧを図示の
ようにライゲーションして得る。 オリゴヌクレオチドＡとブロックＩ′をライゲートして
ブロックＶ′を得、オリゴヌクレオチドＳＨとブロック
■′ をライゲートしてブロック■′ を得る。 このようにして得たブロックｎ’ 、ｍ’ 、ｖ’およ
び■′ を再びＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理し、得られ
た生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ソ
マトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐプロモーターを得
る。 第８図ニ シラスミドｐＴｒｐＥＢ７の構築のフローチ〜−トソン
トスタチン遺伝子に結合したｔｒｐ−プロ１ミータ−遺
伝子を、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＢａ＋ｎＨＩ制御
ｌｌエンドヌクレアーゼで処理したｐＢＲ３２２プラス
ミド中に挿入する。得られたプラスミドを用いイー・コ
リ（以下、Ｅ、 ｃｏｌｉと記す）ＨＢＩＯＩのような
適゛当な微生物を形質転換する。抗生物質耐性形質転換
体を選択することにより、ソフトスタチン遺伝子に結合
したしｒｐプロモーターを含むプラスミドが分離され、
これをｐＴｒｐＥＢ７と命名する。 （３）“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子”の
合成およびクローニング法を第９および１０図に示す。 第９図： “蛋白ペプチドＬ）を遺伝子を含む合成遺伝子゛構築の
フ［ゴーチャート 構築方法は得られる遺伝子中のＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎ
ｄｌ、ＩＩ制限部位間に蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を形Ｉ
Ｊ： １’るように設定する。この合成遺伝−ｒ−を便
宜Ｉ１、“蛋白ペプチドＬＨ遺伝了を含む合成遺伝子“
′と称する。この遺伝子の構築法はソマトスタチン遺伝
ｒに結合したｔｒｐプロモーター遺伝子の場合と同様で
ある。 第１Ｏ図： “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子パのりＬｌ
−ニングのフローチャート “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子゛′をあら
かじめＥｅｏＲＴおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア
ービで処理したｐＢＲ３２２プラスミド中に挿入する。 得られたプラスミドを用いてＥ、 ｅｏｌｉ ）１８１
０１のような適切な微生物を形質転換する。抗生物質耐
性形質転換体を選択することにより“蛋白ペプチドＬＨ
遺伝子を含む合成遺伝子”を含有するプラスミドを分離
し、これをｐＬＨ１０７と命名する。 ｐＬ）１１０７をＥｃｏＲＩおよびＢａａ＋ＨＩ制限エ
ンドヌクレアーゼで消化することにより“蛋白ペプチド
Ｌ）を遺伝ｒ−”を含む合成遺伝子を得る。 ＜４）ソマトスタチン遺伝子およびｔｒｐブ■」モータ
ー遺伝子および“蛋白ペプチドＬｌ（遺伝子を含む遣１
云子”を含有するプラスミドｐＬＨｔｒｐの構築方法を
第１１図に示す。 第１１図： ソフトスタチン遺伝子およびプラスミドｐＬＨｔｒｐ構
築のノロ−チャート １）ソフトスタチン遺伝子はｐＴｒｐＥＢ７を５ｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化する
ことにより得る。 Ｉ）プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ０ＲＩおよびＢａ
ｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し、ｔｒｐプロモ
ーター遺伝ｒ−を含有する最も大きな断片を“蛋白ペプ
チドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°゛とライゲートし、
プラスミＦｐＬＨｔｒｐｔ得る。 （５）この発明の目的の組換えプラスミドであるプラス
ミドｐＬＨ５ｓｔｒｐ構築法を第１２図に示す。 第１２図： 組換えプラスミドｐＬＨ５ｓｔｒｐ構築のフローチャー
ト ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ末端を有するソマトスフチ
ン遺ｆ云ｒをリンカーオリコヌクレオチドに結合させ、
シラスミドの同じ制限特異性部位に挿入するための、ソ
マトスタチン遺伝子を含みＨｉｎｄＩＩＩおよび３５ｍ
１（Ｉ末端を有する遺伝子を形成する。 プラスミドｐＬＨｔｒｐ ＠ ）１ｉｎｄＩＩＩおよび
３ａｍＨＩ制限エンドメクレアーゼで消化するやしｒｐ
プロモーター遺１ムＬおよび蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を
含有する最も大きな断片を、１ｉｎｄＩＩＴ、およびＢ
ａｍＨＩ末端を有するリンカ−オリゴヌクレオチドに結
合したソマトスタチン遺伝子とライゲートし、プラスミ
ドｐＬＨ５ｓｔｒｐを形成スル。 （６）組換えプラスミドを用いて微生物を形質転換し、
構造遺伝そを発現させ、ソマトスタチンを産生きける方
法を以下に説明する（第１２図参照）。 ソフトスタチン遺伝子発現には、このようにして得たｔ
ｒｐプロモーター遺伝子、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子およ
びソマトスタチン遺伝子を含むプラスミドを用い宿主微
生物を形質転換し、次いで組換えプラスミドを含む宿主
微生物を炭素源および窒素源含有栄養培地中通気条件下
に培養する（例えば、振盪培養、深部培養、など）。 発酵は通常、温度約２０℃〜４２℃、好ましくは３５〜
３８゛Ｃで、数時間〜５０時間行う。 このようにして生産した付加蛋白およびソマトスタチン
を含む融合蛋白は、他の既知の生理活性物質の回収に通
常用いられる慣用の方法により培養培地から回収するこ
とができる。 このようにして得た融合蛋白は、付加蛋白の脱離反応に
よりソマトスタチンに変換することができる。 この脱離反応は、臭化シアンなどを用いる方法のような
ペプチド化学の分野において使用される常法に従って行
うことができる。 この反応は通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒
中で、穏やかな条件下で行う。 反応温度は特に限定されず、反応は通常、冷却ないし加
温下に行う。 本明細書に用いた略号をド記に示ｔ。 ｔ ｌ Ｌｆ’ ３クレオチド配列中に用いたＡおよび
Ａｐニアγニン ：４リロヌクレオチド配列中に用いたＴおよびＴｐ：チ
ミン オリコメクレオチド配列中に用いたＧおよびＧｐニゲア
ニン オリゴヌクレオチド配列中に用いたＣおよびＣｐ： シ
トンン ＡＢＺｐｏ、アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれベン
ゾイルおよびｐ−クロロフェニルで保護されているアデ
ニン エｐＯ： ヒドロキシ基がｐ−クロロフェニルで保
護されているチミン ＧｉＢｐｏ ： アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれ
インブチリルおよびｐ−クロロフェニルで保護されてい
るグアニン ｃＢｚｐＯ，アミノおよびヒドロキシ基がそれぞれベン
ソイルおよびｐ−クロロフェニルで保護されているシト
シン ＡｃＬｌｐｏ ： １−ドロキシ基がアセチルで保護さ
れているウラシル ＤＭＴｒ ： ジメトキシトリチル ［発、明の効果］ この発明によれば、付加蛋白およびソマトスタチンを含
む融合蛋白が高収率で得られること、該融合蛋白からの
ソマトスタチンの単離と精製が容易であることなどのす
ぐれた効果が奏せられる。 ［実施例］ 以下、製造例および実施例を示し、この発明を説明する
。 製造例Ｉ ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＩｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）（第７図にＳＢの記号で
示すオリゴヌクレオチドに相応する）の合成 （１） ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ” ｐｏｒｐｃ？’
Ｕｐｏ−セＬ Ｏ−ス（７）合成： ｉ ） Ｉ（ＯＴｐｏＡｏＵｐｏ−セルロースの製造：
ＤＭＴｒＯＴｐｏ” Ｕｐｏ−セルロース（２５０，０
ｍｇ、 ２６．１μモル、以下、この値はクロロホルム
での洗液の吸光度を５０７ｎｎｔで調べることにより算
出する。）（フレア法［Ｒ，Ｃｒｅａ ａｔ ａｌ、
Ｎｕｅｌｅｉｅ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ８巻
、２３３１頁（１９８０）コにより製造）のメタノール
／りｏｏホルム（１：９ｖ／ｖ、５．ＱｍＱ）中懸肩液
にトリクロロ酢酸／クロｌＪホルム（２：３ ｗ／ｖ、
５． ＱｍＱ ）を氷冷下に加え、混合物をｏ”ｃで
１０分間攪拌する。フィルター上でクロロホルム（２ｍ
ｅ）およびメタノール（６，ＱｍＱ ）で順次洗浄した
後、ヒルロース付加物（ＨＯＴｐｏＡｃｌＪｐ□−セル
ロース）を乾燥させ、水はピリジン（２ｍＡ）共沸物と
して分離する。 ｉ ） ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏ−の製造：Ｄ
ＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏ−ＣＥ （２２３ｎ＋
ｇ＞をトリエチルアミン−アセトニトリル（１： ｌｖ
／ｖ、 ５ｍＱ）で室温で１時間処理する。このように
して得たホスホジエステルトリ” （ＤＭＴｒＯＴｐ
ｏＴｐｏＣ”２ｐｏ−）を乾燥させ、水はピリジン共沸
物（０，５ｍＱ、２ Ｘ １ ｄ、 ）として分離する
。 ｉ）カフプリング： １リマー（ＤＭＴｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏ ）と七
）しＵｊ −スイ・ｊ加物（ＨＯＴｐｏＡｃＵｐｏ−セ
ルｃ＋ −ス）をｌＱｍＱ容丸底７ ’−、７２表−１
中′ｒ混合４る。混合物を乾燥させ、水はピリジン共沸
物（２Ｘ１ｍＱ）として分離し、最後に無水ビリ：、；
’＞（１ｍＱ）に再懸濁する。メシチレンスルホ−ルニ
Ｆ・ロトリアゾリド（１９３■、６５２．５μモ゛
ル）をこの懸濁液に加え、混合物を室温で１時間撹拌４
る。次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース付加
物を遠心分離（３，０００ｒｐ＋ｎ、 ２分間）により
回収する。 ■）非反応５′−ヒドロキシ基のアセチル化＝１−記の
ようにして得たセルロース付加物ヲビリジ〉・−無水酢
酸溶液（１０：ｌｖ／ｖ、５，５ｍＱ）に懸濁し、室温
で３０分間攪拌する。セルロース生成物（２５８，４ｍ
ｇ ）をピリジン（５ｍＱ）中で繰返し遠心分１１１１
（３，００Ｏｒｐｍ、２分間）シテ得、）タノール（
１５ｍＱ ’）で洗い、室温で３０分間真空乾燥する。 このセル「Ｊ−ス付加物（ＤＭＩｒＯＴｐｏＴｐｏＣ”
２ｐｏＴｐｏＡｅＵｐｏ−セルロース）は次のカップリ
ング段階に使用できく２） ＤＭＴｒＯＡＢ”ｐｏＡ
”ｐｏＣ””ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏＴｐｏＡｅＩ
Ｊｐｏ−セル［１−スの合成 団子ｒＯＡ””ｐｏＡ”’ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ
Ｂ”ｐｏＴｐｏ”１Ｊｐｏ−＋ル
【−１−スをＤＭＴｒ
ＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−セルａ −
ス（２５８，４ｍｇ）と ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＡ”ｐ
ｏＣＢ７：ｐｏ−ＣＥ（２５２ｍｇ ）から０１１記と
同様の条件で合成する。 ＜３） ＤＭＴｒＯＡＢｚ ｐｏＡＢｚ ｐｏＧｉＢ
ｐｏＡＢｚ ｐｏＡＢｙ ｐｏＣＢｚ、ｏ丁ｐｏＴ−
ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−（ルａ −ス（７１合
成りＭＴ ｒＯＡ” ｐｏＡ”２：ｐｏＧ ”’ｐｏＡ
”ｐｏＡ””ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ−”ｐｏＴ
ｐｏＡｏｔＪｐｏ−セルロース （２５６，４ｍｇ）を
ＤＭＴｒＯＡＢ”−ｐｏＡ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏ
Ｃ”ｐｏＴｐｏ”Ｕｐｏ−セｔしａ −ス＜２６０．４
ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡ ｐｏＡ ｐｏＧ ｐｏ
−ＣＥ （２５３ｍＨ）から同様の条件で合成する。 （４） ＤＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＴｐｏＡ”ｐ
ｏＡ”７：ｐｏＧｌＢｐｏ−Ａ”ｐｏ−Ａ”ｐｏＣ”ｐ
ｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｅＩＪｐｏ−ｔ＝ 、
Ｌ ｏ −スｃｙ＞合成 りＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＴｐｏＡ ｐｏＡ
ｐｏＧ ｐｏＡ ｐｏＡ ｐｏＣ−Ｂ
”ｐｏ−ＴｐｏＴｐｏＣＢｚｐｏＴｐｏＡｏＵｐｏ−セ
ルｏ −７，（２３４，０ｍｇ）を ＤＭＴｒＯＡ””
ｐｏＡ”７′ｐａＧｉＢｐｏＡＢ″ｐｏＡＢ”ｐｏＣＢ
”ｐｏＴｐｏ丁ｐｏ−Ｃ””ｐｏＴｐｏ−ＡｏＵｐｏ−
セルｒ＋−ｘ （２５６，４ｍｇ）と ＤＭＴｒＯＴ
−ｐｏＧｌＢｐｏＴｐｏ−ＣＥ （２２４ｍｇ）から同
様の条件で合成する。 （５） ＤＭＴｒＯＧ１ＢｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ
ＧｉＢｐｏ丁ｐＯ−ＡＢｚ ｐｏＡＢｚ −ｐｏＧｌＢ
ｐｏＡ””ｐｏＡＢ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐ
ｏＴｐｏ−”Ｕｐｏ−ヒル１７−スの合成 りＭＴｒＯＧ １ＢｐｏＧ １ＢｐｏＴｐｏＴｐｏＧ
１Ｂｐｏ ＴｐｏＡ””ｐｏＡ””ｐｏＧ １Ｂ−ｐｏ
−Ａ”ｐｏＡ”ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏ
ＴｐｏＡｃＵ ｐ ｏ−セルＩＪ−：ｈ （２２４，
０ｍｇ）を ＤＭＩｒＯＴｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＡＢ”
ｐｏＡＢ”−９０−Ｇ １” ＩＩ）ＯＡ””ｐｏＡＢ
” ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣＢ” ｐｏＴｐｏ”
Ｌｌ ｐｏ −（−ル１１−ス （２３４，０ｍｇ）と
聞丁ｒＯＧｉＢｐｏＧｉＢｐｏＩｐｏ−ＣＥ（２３６ｍ
ｇ）から同様の条件下で合成する。この最終段階で非反
応５′−ヒドロキシ基はアセデル基で保護する必要はな
い。 （６） １（ＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（７）合成 りＭＴｒＯＧｉＢｐｏＧｉＢｐｏ丁ｐｏＴｐｏＧｉＢｐ
ｏＴｐｏＡＢ”ｐｏＡ”ｐｏＧｉＢ−ｐｏ−Ａ”ｐｏＡ
”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｏｔＪ
ｐ ｏ−セル＋１−ス（２２４，０ｍｇ＞を０．５Ｍ
Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメブールグアニジウムビ
リジン２−アルドキシメート［しオキサン−水（１：１
ｖ／ｖ、１ｍＱ）中コで、２０°ＣＴ′２０時間封管中
で処理する。反応混合物に２８％（讐／讐）アンモニア
水（１６＋１１Ｑ ）を加え、混合物を６０℃で５時間
加熱する。固形セル１】−スを濾去し、水（ＩＱＩＩＩ
Ｑ ）で洗う。濾液および洗液を蒸発乾固
ＯＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−セルａ −
ス（２５８，４ｍｇ）と ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＡ”ｐ
ｏＣＢ７：ｐｏ−ＣＥ（２５２ｍｇ ）から０１１記と
同様の条件で合成する。 ＜３） ＤＭＴｒＯＡＢｚ ｐｏＡＢｚ ｐｏＧｉＢ
ｐｏＡＢｚ ｐｏＡＢｙ ｐｏＣＢｚ、ｏ丁ｐｏＴ−
ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−（ルａ −ス（７１合
成りＭＴ ｒＯＡ” ｐｏＡ”２：ｐｏＧ ”’ｐｏＡ
”ｐｏＡ””ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ−”ｐｏＴ
ｐｏＡｏｔＪｐｏ−セルロース （２５６，４ｍｇ）を
ＤＭＴｒＯＡＢ”−ｐｏＡ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏ
Ｃ”ｐｏＴｐｏ”Ｕｐｏ−セｔしａ −ス＜２６０．４
ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡ ｐｏＡ ｐｏＧ ｐｏ
−ＣＥ （２５３ｍＨ）から同様の条件で合成する。 （４） ＤＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＴｐｏＡ”ｐ
ｏＡ”７：ｐｏＧｌＢｐｏ−Ａ”ｐｏ−Ａ”ｐｏＣ”ｐ
ｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｅＩＪｐｏ−ｔ＝ 、
Ｌ ｏ −スｃｙ＞合成 りＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＴｐｏＡ ｐｏＡ
ｐｏＧ ｐｏＡ ｐｏＡ ｐｏＣ−Ｂ
”ｐｏ−ＴｐｏＴｐｏＣＢｚｐｏＴｐｏＡｏＵｐｏ−セ
ルｏ −７，（２３４，０ｍｇ）を ＤＭＴｒＯＡ””
ｐｏＡ”７′ｐａＧｉＢｐｏＡＢ″ｐｏＡＢ”ｐｏＣＢ
”ｐｏＴｐｏ丁ｐｏ−Ｃ””ｐｏＴｐｏ−ＡｏＵｐｏ−
セルｒ＋−ｘ （２５６，４ｍｇ）と ＤＭＴｒＯＴ
−ｐｏＧｌＢｐｏＴｐｏ−ＣＥ （２２４ｍｇ）から同
様の条件で合成する。 （５） ＤＭＴｒＯＧ１ＢｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ
ＧｉＢｐｏ丁ｐＯ−ＡＢｚ ｐｏＡＢｚ −ｐｏＧｌＢ
ｐｏＡ””ｐｏＡＢ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐ
ｏＴｐｏ−”Ｕｐｏ−ヒル１７−スの合成 りＭＴｒＯＧ １ＢｐｏＧ １ＢｐｏＴｐｏＴｐｏＧ
１Ｂｐｏ ＴｐｏＡ””ｐｏＡ””ｐｏＧ １Ｂ−ｐｏ
−Ａ”ｐｏＡ”ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ””ｐｏ
ＴｐｏＡｃＵ ｐ ｏ−セルＩＪ−：ｈ （２２４，
０ｍｇ）を ＤＭＩｒＯＴｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＡＢ”
ｐｏＡＢ”−９０−Ｇ １” ＩＩ）ＯＡ””ｐｏＡＢ
” ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣＢ” ｐｏＴｐｏ”
Ｌｌ ｐｏ −（−ル１１−ス （２３４，０ｍｇ）と
聞丁ｒＯＧｉＢｐｏＧｉＢｐｏＩｐｏ−ＣＥ（２３６ｍ
ｇ）から同様の条件下で合成する。この最終段階で非反
応５′−ヒドロキシ基はアセデル基で保護する必要はな
い。 （６） １（ＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（７）合成 りＭＴｒＯＧｉＢｐｏＧｉＢｐｏ丁ｐｏＴｐｏＧｉＢｐ
ｏＴｐｏＡＢ”ｐｏＡ”ｐｏＧｉＢ−ｐｏ−Ａ”ｐｏＡ
”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｏｔＪ
ｐ ｏ−セル＋１−ス（２２４，０ｍｇ＞を０．５Ｍ
Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメブールグアニジウムビ
リジン２−アルドキシメート［しオキサン−水（１：１
ｖ／ｖ、１ｍＱ）中コで、２０°ＣＴ′２０時間封管中
で処理する。反応混合物に２８％（讐／讐）アンモニア
水（１６＋１１Ｑ ）を加え、混合物を６０℃で５時間
加熱する。固形セル１】−スを濾去し、水（ＩＱＩＩＩ
Ｑ ）で洗う。濾液および洗液を蒸発乾固
【７、残渣を
８０％酢酸水溶液（１５０ｍＱ ）で室温にて１５分間
処理する。溶媒除去後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，５，２５ｍＱ ）に溶解
し、ジエチルエーテル（３Ｘ２５ｍ１１）で洗う。水層
を蒸発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７，５，２ｍＱ、）に溶解し、溶液中
に粗ＨＯＧｐＧｐｌｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐ−工ｐＴｐＣｐｒＯＨを得る。 （７） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（７）精製 １）粗生成物の最初の精製はバイオゲルｐ２（カラ１、
：内径２４ Ｘ ２．６ＣＩＴｌ、商標バイオランド社
製）カラムクロマトグラフィーにより行う。最初の溶出
ビーク（５０ｄ酢酸アンモニウム、０．１ｍＭ ＥＤＩ
Ａ。 １ｍＱ／分）に相応する両分を集め、凍結乾燥して第１
回精製物を得る。 １１）第１回精製物の第２回目ｊｉｌｆ！８！は、ＩＭ
酢酸アンモーウムー１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノールか
ら４．５Ｍ酢酸アンｅ＝ウノ、−１０％（Ｖ／Ｖ）水性
−ｘ 夕／−，Ｌの直線勾配（８０分間、１ｍＱ／分、
６０″Ｃ）を用い、ｃｒ＋Ｒ−ｔｏ（カラム：内径２５
ｅｍ Ｘ ４．６ｍ、商標二加奄化成工業株式会社製）
をカラムとする高速液体クロマトグラフィーにより行い
、第２回精製物を得る。 −）第２回精製物の第３回目精製は、０．１Ｍ酢酸アン
モニウムから０．１ＭＭ酸アンモニウム−１５０≦（Ｖ
／Ｖ）水性アセトニトリルの直線勾配（４０分間、１，
５ｍＱ／分、室温）を用いる逆相高速液体クロマトグラ
フィー［カラム： Ｒｐ−１８−５μ（Ｘ７７）、内径
１５ｃｍＸ４ｍｍ、商標：メルク社製コにより行い、ａ
終精製物（ｌｌＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴ−ｐｃｐ’ｒｏｏ ）を得る。 ＜ｓ＞：ｔリコ゛ヌクレオチドの分析：（ＨＯＧｐＧｐ
ＴｐＴｐＧｐ、ＴｐＡｐ酊〕ＧｐＡｐΔｐｃｐＴｐ］：
ｐｃｐｌｏ旧１）ボスホジエステラー ビ（Ｊよる消化
ＨＯＧｐＧｐ丁ｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐΔｐＡｐｃ
ｘ汀ｐＴｐｃｐ丁０ｌ−１（３０鴎、１３０ｕ ）、０
．２Ｍ塩化マグネシウム（４５４）、０２Ｎ４丁ＲＩＳ
−塩酸（ｐＨ８，５） （４５縛）」−ンよび０，１ｍ
ｌづＥＤＴへの水溶液（１７０４）中４２合物をホスホ
ジエステラービ［クロタルス・ドゥリ９ス（釘３シリゼ
鋭づ朋ｙ漫）由来コ（６０１４，６０ｍ 、ベーリンガ
ーマンハイム社より購入）で、３７°Ｃにて３０分間処
理し、次に１００℃で２分間船舶する。 ｉ＞高速液体クロマトグラフィー分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドを、水から２゜０Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直流勾配（４０分間
、１．５ｍＱ／分、６０℃）を用いる高速液体りＴｉ１
１７１−グラブイーＥカラム： ＣＤＲ−１０、内径２
５ｅｍ Ｘ ４．１３ｍ］に誹り分析する。得られた各
ピーク面積から、そのヌクレオチド組成物を標品の面積
と比較して測定する。 ５１１値： ｐＣｏＨ２，０００，ｐＡｏＨａ、ｏｏｏ
、 ｐＴｏ、６．０００゜ｐｃｏＨ３，０００ 実測イ！ｆ ： ｐＣｏｔ（２，０３０，ｐＡｏＨ
４，２５７，ｐＴｏＨ５，８４３゜”’ｏ）ｌ” ８７
１ 製造例２ オリゴヌクレオチドＳＡ、 ＳＣ，５０，ＳＦ％ＳＧお
よびＳＨ（第７図の各オリゴヌクレオチドの記号に対応
する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例１と同様にして製造す
る。 （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐ
’Ｌ’ＯＨ（ＳＡＩ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｏＧｐ
ＡｐＡＰＧｏＡｐＣｐＴｐＴｐ’ｒＯＨ（ＳＣＩ（３１
ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨｆｓＤｌ（４１ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ
（ＳＥ＋（５） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐ’ｒｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ”１（６１ＨＯＣｐ
ＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ＳＣＩ（７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯ［（ＳＨＩ製ｊ１礼ユ オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ，
Ｉ、Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ（第７図の各オリゴヌクレ
オチドの記号に対応する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例１と同様にして製造す
る。 （１１ＦＩＯＡｐＡｐＴｐＴｐ’ｒｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａｌ（２１ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
ｌ（３１ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐ’ｒｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ＋（４１ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐ’ｒｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄｉ（５１ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐ
Ｔｐ’ｒｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐ’ｌ”ｐＧｐＡＯ
Ｈ（Ｅｌ（６１ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
’ｒｐＣｐＡｐ’ｒｐＴｐＴｐＣｐＡＯ！（（Ｆｌ（９
１ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐ’ｒｐＡｐＧ
ｐ’ｒｐ’ｒｐＡｐＡｐＣＯＩ（（工１（１０１ＨＯＧ
ｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐ
ＣｐＴｐＡＯＨ＋・丁）（１１１ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐ
ＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ
（Ｋ）（１２１ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ）ｆ１３）
ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡ
ｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍｌ（１４１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯｒ（（Ｎｌ製造イｌＡ４ 下記リンカ−オリゴヌクレオチド（ｍｌおよびＡ２）を
製造例１と同様の方法で製造する。 （１１ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍ１１（２１Ｈ
ＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨｆｍ２１製造例５ ソマトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐプロモーター遺
伝子の製造（第７図参照）： 各オリゴヌクレオチド（Ａ −Ｎ、 ５Ａ−５１（）の
一部（０，４ｎＭ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
ＢＲＬ製）４屯位を用い、７４ｍＭ ＴＲｌ５−塩酸（
ｐＨ７，６）、１０ｍ１１ンチオ、！、レイトール、１
．６ｉＭメルカプ）−エタノール、ｌ ０ｍＭ塩化“マ
グネシウムおよび０．５ｍ１ｌ ＡＴＰ含有溶液１００
ｄ中において３７゛Ｃで２０分間リン酸化Ｊ−る。反応
終了後、反応混合物中の酵素はｉｏｏ”ｃで５分間イン
キュベートして不活性化する。リン酸化されたオリコ゛
′ヌクレオチドのライゲーションを第７図に示すように
行い、まず、４つの断片ブロックを、最終的にクローニ
ング用のソマトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐブ１コ
七−ター遺伝子を得る。ライゲーションはＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（７屯位）を用い１００ｍＭ Ａ１：Ｐ含有溶
液（０，５４）中において４°Ｃで２３時間（標準条件
）行う、各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲー
ション生成物は、ＴＲｌ５−ＥＤＴＡ緩衝液中２−１６
％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動での溶出後、臭
化エチジウムで染色して同定する。最終ライゲーション
生成物をＥｅｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、分取用
７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し
、ｔｒｐプロモーター遺伝子に結合したソマトスタチン
遺伝子（１６３ｂｐ）を得る。 腎喜例ｊ ｊｒｐプロモーター遺伝子に結合したソマトスタチン遺
伝子のクローニング（第８図参照）二合成遺伝子をＴ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にｐＢＲ３２２（市販）のＥ
ｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、このライ
ゲーション生成物を用いクッシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ
）の方法［Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｆｒ
１ｔｓｈ、 Ｊ。 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏ
ｎｉｎ、ｇ、 ２５２頁 （１９８２）コによりＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４）を形
質転換する。 ＲＡｍｐおよび５ＴＱＬの形質転換体か
ら得たプラスミドを）ＩｐａＬで消化しバンド（４，ｔ
ｘｂｐ ）を確認し、次に３ａｍＨ１で消化して９０ｂ
ｐのバンドをＰＡＧＥで確認Ｃる。さらに、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ消化によるソマトスタチン遺伝子５６ｂ
ｐを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサイズマーカ
ーと比較して確認する。このプラスミドをｐＩｒｐＥＢ
７と命名し、発現ベクターの構築に使用する。 製造例７ オリゴヌクレオチドａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ
６、ｂｌ、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｂ６、ｃｌ、Ｃ２
、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ｄｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４、
Ａ５、Ａ６、ｅｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ａ５、Ｎｌ、１
２２および２３（第９図の各オリゴヌクレオチドの記号
に対応する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例】に記載のＳＲと同様
の方法で製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ａ２
）（コＩ ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴ
ｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐ
’ｒｐＧＯＥ（（Ａ４）（５） １（ＯＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＣｐＡｐ’ｒｐＡｐ’］？ｐＧｐＧｐＧｐ’ｒｐＣｐ
ＣＯＨ（Ａ５＞（６１ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯ！（（Ａ６）
（７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐ’ｒｐ’ｒｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨＴｂ１）（８） Ｈ
ＯＣｐ’ｒｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧ
ｐＴｐＣｐＡＯＩ（（ｂ２１（９） ＨＯＴｐＴｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐ’ｒｐＧｐ’ｒｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡ
Ｏ１（（ｂ３）（１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｂ４１（
１１１ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ’ （ｂ５１（１；ｊ ＨＯ
ＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐ丁ｐｃｐｃｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐｃＯＨ（ｂ６１（１３）１（ＯＴｐＡｐＡｐ
’ＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐｒｐＴｐＴｐ
ＣＯＨ（ｃｌ）（１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣ
ｐＡｐ？ｐ′１″ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（ｃ２
）＋１５）ＨＯＡｐＡｐＴｐ’ｒｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３１（１６＞ ＨＯ
ＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＧＣ＋Ｈ（ｃ４）（１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯｔ
ｌ （ｃ５１（１Ｂ） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐ’ｒｐＣｐＴｐＣｐＣｐ’ｒｐＣｐＴｐ’ｒＯＨ
（（：６）（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐ’ｒｐＡｏＨ（ｄｉ）（２
（１１ＫＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯ’［ｉ （ｄ２）（２１１ＨＯＧ
ｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐτＰＡＰＣＰ”Ｐ
τＯＨ（ｄ３）（２２３ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐτｐＴｐＴＯＨ（ｄ４＞＋２
３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴ
ｐＴｐ’ｒｐＧｐＧＯＨ（ｄ５）（２４１ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡ
Ｏｔ（（ｄ６）＋２５） Ｉ（ＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐ士ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｓｌ）
（２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐ’ｒｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＡｐＴｐ（’；ｐＡｐｃｐｃｐＡＯＨ（ｅ２）（２７）
Ｈ○ＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐ’ｒｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＩＩ （ｅ３）（２８） Ｈ
ＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐΔＯＩ４ （ｅ４）！２９） ＨＯＧｐＧ
ｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴ’ｐＧｐＧｐ’丁’ｐｃ
ｐＡｐＴＯ１ｌ（ｆｅ５）（ＩＱ） ＨＯＴｐＧｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐ’ｒｐＡｐＧＯ［（（す
）（３１） ｔ（Ｏ１２）ＡＰＣＰＡＰＣＰＡｐＣＰ
ＴｐＣｐ丁ｐＴｐＴｐＴＯＨ（］、２）（：１２）
ｔ（ＯＧｐ入ＰＴＰＣＰＣＰτｐＡｐＴｐｃｐＡｐ’Ｔ
Ｏｔ（（１−３）１益ｊ１ 一蛋白ベプチドＬｌ（遺伝子を含む合成遺伝子”の製造
（第９図参照）： 各オリゴヌクレオチド（ａ２−１２）の一部（０，４ｎ
Ｍ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２．５単位を用い
、５０ｍＭ ＴＲｌ５−塩酸（ｐｔｔ７．６）、２０＋
＋１ｔｉジｆオスレイトール、５０＜ １ｍｌ牛血清ア
ルブミン、１ｍ１１スペルミジン、１０ｍＭ塩化マグネ
シウムおよび２ ｍＭ ＡＴＰ含有溶液４０所中におい
て３７℃で３時間リン酸化する０反応終了後、反応混合
物中の酵素をＬＯＯ”Ｃで５分間イ〉・キュベートして
不活性化する。リン酸化７オリ＝２ヌクレオチドおよび
２つのオリゴヌクレオグ・ド（ａｔおよびｆｆ１３）の
ライゲーションは第９図に示すように行い、まず、６つ
の断片ブロックを、最終的にり１．ｆｆ−ニング用の蛋
白ペプチドＬＨ遺伝了−（ｚ３６ｂｐ ）を（外る。ラ
イゲーションはＴＡ ＤＮＡリガービ（５単位）を用い
、５０ｍＭ ＡｒＰ含有溶液（１ｐ）中において１６°
Ｃで５時間行う、各段階におけるオリゴヌクレオチドの
ライゲーション生成物は、ＴＲｌ５−ＥＤＴＡ緩衝液中
２−１６％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動での溶
出後、臭化エチジウムで染色することにより同定する。 １巌輿１ “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°゛のクロ
ーニング（第１０図参照）ニ プラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
制限エン制限エンドヌク上で消化する０反応は６５℃で
５分間加熱することにより終了させ、断片をｏ、ｓ％ア
ガロースゲル電気泳動により分離する。 ｐＢＲ３２２
由来の３９８５ｂｐの大きな断片を回収し、前記のよう
に合成した“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子
” （２３６ｂｐ）とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に１
２℃で１８時間ライゲートする。ライゲーション混合物
を用いクッシュナー法によりＥ、 ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉを形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体をテトラ
サイクリン（２５ｕｇ／ｉｌＱ ）含有プレート上に選
択する。アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の
プラスミドＤＮＡをＥｅｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、断片をアガロースゲル電気泳動で適当なサイズマー
カーと比較する０期待した２３６ｂｐの″蛋白ベブグ・
ドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°”断片を得る。 このプラスミドをｐＬＨ１０７と命名し、発現ベクター
の構築に使用する。 製造例１０ 蛋白ペプチドＬＨ発現ベクター（ｐＬＨｔｒｐ ）の構
築（第１１図参照）： 製造例６で製造したｐＴｒｐＥＢ７をＥｅｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩで消化、分取用アガロースゲル電気泳動によ
り大きな断片（４，１ｋｂｐ ）を得る。この断片を、
プラスミドｐＬ）＋１０７をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化して得た゛窟白ペプチドＬＨ遺伝ｒ・を含む合
成遺伝子゛とつ・イゲートする。ライゲーション混合物
を用いＥ、 ｅｏｌｉ、 ＨＢＩＯＩを形質転換してア
ンピシリン耐性でｊトラサイクリン感受性の形質転換体
を得る。 この形質転換体から得Ｉとプラスミド（ｐＬＨｔｒｐ
）をＥＣＱＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、“蛋白ペプ
チドＬＨ遺（Ｉ：了を含む合成遺伝子” （２３６ｂｐ
）を７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認す
る。 実施例１ ソマトスタチン発現ベクターｐＬＨ５ｓｔｒｐの構築（
第１２図参照）： プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化してソマトスタチン遺伝子（５６ｂｐ）を得る
。一方、製ｍｆ列４（２）で製造したオリゴヌクレオチ
ド（ｍ２）を丁４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、製
造例５に記毅のようにリン酸化する。このリン酸化−（
リフヌクＬ−オチド、製造例４（１）で製造したオリゴ
ヌクレオチド（ｍｌ）およびソマトスタチン遺伝子（５
６ｂｐ）を屍合し、１００ｒ＋＋Ｍ ＡＹＰ含有溶液中
において４°Ｃで２０時間Ｔ４リガーゼで処理する。ラ
イゲーノ−（ン混合物をＢａｍＨＩ−ｒ消化し、分取用
ポリアクリルアミドゲル１気泳動セ精製してＳリンカ一
才すコヌイ７しオチドに結合したソマトスタチ〉・遺イ
１、Ｔ（７４ｂｐ ）を得る。この遺伝子（７４ｂｐ）
を、ｐＬＨｔｒｐのＨｉｔｉｄＬＩＩ−ＢａｍＨＩ消化
により得た断片とライゲーション、このライゲーション
混合物を用いでＥ、 ｃｏ、ハＨＢＩＯ１を形質転換す
る。プラスミドｐＬｌｌｓｓｔｒｐを含有するこのＥ、
ｅｏｌｉ ＨＢＩＯＩをもをｕ５５−１と命名する。 形質転換体から得たプラスミド（ｐＬＨ５ｓｔｒｐ ）
をＥｃｏＲＴ、−ＢａｍＨＩ （１９８，５６ｂｐ ）
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍｌ（Ｉ （７４ｂｐ ）およ
びＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ （２８８ｂｐ ）で消化し、
７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でｔｒｐプロ
モーター、蛋白ペプチドＬＨおよびソマトスタチン遺伝
子を確認４−る。 Ｘ及遭１ Ｅ、 ｅｏｌｉ ５５−１での付加蛋白ペプチドＩ、１
（およびソマトスタチンを含む融合蛋白をコードする遺
伝子の発現： Ｅ、 ｅｏｌｉ ５５−１（プラスミドｐＬＨ５ｓｔｒ
ｐｉＭ有Ｅ、 ｃｏ旦ＨＢ１０１）を５Ｑ４／Ｉｌｌア
ンピシリン含有Ｌヅ１コス中で一晩坏＜養したものを、
０．２％グルコース、０．５％力りミ・′酸（＃加水分
解カゼイン）、５０Ｐ＠／ｍＱビタミンＢ１および２５
に／ＩＩＩＱアンピシリン含有Ｍ９培地に１＝２０の割
合で希釈する。β−インドールアクリル酸を加え最終濃
度１０に／ｍＱとする。その時のＡ６００は０５である
。次に細胞を３時間培養し、遠心分＠ （８ｋｒｐｎｍ
、４°Ｃ１１０分間）により湿潤細胞ペーストを集める
。 及庵輿ユ ソマトスタチンの分離・精製 実施例２で得たｆｆｌ潤細脳細胞ペースト化シアン（１
０ｍｇ／唾）含有７０％ギ酸に懸濁し、室温で一晩攪拌
Ｖる。溶媒を凍結乾燥により除去し、残渣を８Ｍ尿素棋
衝液（８Ｍ尿素、０．１ＭＴＲｌ５−塩酸（ｐＨ８，０
）、０．１Ｍジチオスレイトール）に懸濁し、ＴＲｌ５
ｆ ｐｕｓ、 ０に調整する。溶液を遠心分離した後、
−ヒ澄みを高速液体グロマトグラフィーのゲＪ１．−濾
過によりｊＩｌｆ製する（ カラム： ｌ５Ｋ３０００
ＳＷ、商標：東洋痺達工業株式会社製）。８Ｍ尿素綴衝
液で溶出した両分を逆相＾１速液体りｔ」マドグラフィ
ー（カラム：ヘックマンウル１−ラボアＲＰＳＣ１商標
：ヘノクマン社製、０．ＯＩＭ三ツノ化酢酸中１０％〜
６０％アセトニトリルの直線勾配）により精製し、精製
ソマトスタチンを得る。ソマトスタチンのＮ末端配列（
ａｌａ（１）−ｐｈｅ＜７） ）をアミノ酸配列分析に
より決定する。この操作により、培養液１ｅから精製ソ
マトスタチン１ｍＢを得る。 及産週１ １）付加蛋白およびソマトスタチンを含む融合蛋白の単
離・精製 実施例２と同様の方法で得た湿潤細胞ペースト（６ｇ）
を１０ｍＭリン酸−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０） 、ｆｆｌ
衝液（１５ｍＱ ）に懸濁し、細胞を超音波処理により
溶解する。１ａ磨残屑を１８．０００ｒｐｍで３０分間
遠心分離してベレット化する。ベレットを０．１ＭＴＲ
ｌ５−塩酸（ｐｏｓ、ｏ） ６ Ｍ塩酸グアニジン、ｌ
ｏｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍジチオスレイトールの
１０誰に溶解して４℃’ｃ’−−・晩攪）↑し、４°Ｃ
で遠心分離する（１５．０００ｒｐｍ、３０分間）、上
澄みを集め、６Ｍ塩酸グアニジン、０．１ＭＴＲｌ５−
塩酸（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍ
Ｍノグオス【・イトールで平衡化した高速液体り【１７
）・グラノィーによるゲノし濾過（カラム：ＴＳＫ３、
０ＯＯ５Ｗ ）に付す。溶出は４°Ｃで、溶出緩衝液を
流速Ｑ、７ｍＱ／分で用いて行う、保持時間３０分にビ
ータタ有する画分を集め、１Ｍ酢酸水溶液で透析する。 透析両分を凍結乾燥してず・１加蛋白およびソマトメタ
チンを含む融合蛋白を得る。この融合蛋白は、１５％ド
デシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動で分子医９．
５００の位置にバンドを示ｔ。 ２〉臭化シアンによる付加蛋白およびソマトスタチンを
含む融合蛋白からの付加蛋白（蛋白ペプチドＬＨ）の脱
離 前記で得た付加蛋白およびソマトスタチンを含む融合蛋
白を８０％ギ酸１ ｍＱに溶解する。臭化シアン（３ｍ
ｇ）を加え、混合物を室温で一晩放置する。溶媒を凍結
乾燥により除去し、残渣を６Ｍ塩塩酸テアニシン０．１
ＭＴＲｌ５−塩酸（ｐＨ８，０）、１０關ＥＤ丁Ａｊ（
よび０．ＩＭ’ンチオスレイトールのｌ ｍＱに溶解す
る。″ 高速液体クロマトグラブイ−・〜： 十記で得た溶液を用いる。 カジノ、：ヘノクマンウル［・ラボアＲｐＳＣ流速：１
ｍＱ／分 溶出： ０．０１Ｍ トリプルオロ酢酸中１０％−６０
％アセト−＝ｈウリル直線勾配；５０分間 グ［１マドグラフイーを繰返し、保持時間１７．２３分
にピークを有する両分を集める。プールした両分を凍結
乾燥１７でソマトスタチンを得る。
８０％酢酸水溶液（１５０ｍＱ ）で室温にて１５分間
処理する。溶媒除去後、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，５，２５ｍＱ ）に溶解
し、ジエチルエーテル（３Ｘ２５ｍ１１）で洗う。水層
を蒸発乾固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７，５，２ｍＱ、）に溶解し、溶液中
に粗ＨＯＧｐＧｐｌｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐ−工ｐＴｐＣｐｒＯＨを得る。 （７） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（７）精製 １）粗生成物の最初の精製はバイオゲルｐ２（カラ１、
：内径２４ Ｘ ２．６ＣＩＴｌ、商標バイオランド社
製）カラムクロマトグラフィーにより行う。最初の溶出
ビーク（５０ｄ酢酸アンモニウム、０．１ｍＭ ＥＤＩ
Ａ。 １ｍＱ／分）に相応する両分を集め、凍結乾燥して第１
回精製物を得る。 １１）第１回精製物の第２回目ｊｉｌｆ！８！は、ＩＭ
酢酸アンモーウムー１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノールか
ら４．５Ｍ酢酸アンｅ＝ウノ、−１０％（Ｖ／Ｖ）水性
−ｘ 夕／−，Ｌの直線勾配（８０分間、１ｍＱ／分、
６０″Ｃ）を用い、ｃｒ＋Ｒ−ｔｏ（カラム：内径２５
ｅｍ Ｘ ４．６ｍ、商標二加奄化成工業株式会社製）
をカラムとする高速液体クロマトグラフィーにより行い
、第２回精製物を得る。 −）第２回精製物の第３回目精製は、０．１Ｍ酢酸アン
モニウムから０．１ＭＭ酸アンモニウム−１５０≦（Ｖ
／Ｖ）水性アセトニトリルの直線勾配（４０分間、１，
５ｍＱ／分、室温）を用いる逆相高速液体クロマトグラ
フィー［カラム： Ｒｐ−１８−５μ（Ｘ７７）、内径
１５ｃｍＸ４ｍｍ、商標：メルク社製コにより行い、ａ
終精製物（ｌｌＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴ−ｐｃｐ’ｒｏｏ ）を得る。 ＜ｓ＞：ｔリコ゛ヌクレオチドの分析：（ＨＯＧｐＧｐ
ＴｐＴｐＧｐ、ＴｐＡｐ酊〕ＧｐＡｐΔｐｃｐＴｐ］：
ｐｃｐｌｏ旧１）ボスホジエステラー ビ（Ｊよる消化
ＨＯＧｐＧｐ丁ｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐΔｐＡｐｃ
ｘ汀ｐＴｐｃｐ丁０ｌ−１（３０鴎、１３０ｕ ）、０
．２Ｍ塩化マグネシウム（４５４）、０２Ｎ４丁ＲＩＳ
−塩酸（ｐＨ８，５） （４５縛）」−ンよび０，１ｍ
ｌづＥＤＴへの水溶液（１７０４）中４２合物をホスホ
ジエステラービ［クロタルス・ドゥリ９ス（釘３シリゼ
鋭づ朋ｙ漫）由来コ（６０１４，６０ｍ 、ベーリンガ
ーマンハイム社より購入）で、３７°Ｃにて３０分間処
理し、次に１００℃で２分間船舶する。 ｉ＞高速液体クロマトグラフィー分析 反応混合物中のオリゴヌクレオチドを、水から２゜０Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直流勾配（４０分間
、１．５ｍＱ／分、６０℃）を用いる高速液体りＴｉ１
１７１−グラブイーＥカラム： ＣＤＲ−１０、内径２
５ｅｍ Ｘ ４．１３ｍ］に誹り分析する。得られた各
ピーク面積から、そのヌクレオチド組成物を標品の面積
と比較して測定する。 ５１１値： ｐＣｏＨ２，０００，ｐＡｏＨａ、ｏｏｏ
、 ｐＴｏ、６．０００゜ｐｃｏＨ３，０００ 実測イ！ｆ ： ｐＣｏｔ（２，０３０，ｐＡｏＨ
４，２５７，ｐＴｏＨ５，８４３゜”’ｏ）ｌ” ８７
１ 製造例２ オリゴヌクレオチドＳＡ、 ＳＣ，５０，ＳＦ％ＳＧお
よびＳＨ（第７図の各オリゴヌクレオチドの記号に対応
する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例１と同様にして製造す
る。 （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐ
’Ｌ’ＯＨ（ＳＡＩ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｏＧｐ
ＡｐＡＰＧｏＡｐＣｐＴｐＴｐ’ｒＯＨ（ＳＣＩ（３１
ＨＯＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨｆｓＤｌ（４１ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ
（ＳＥ＋（５） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐ’ｒｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ”１（６１ＨＯＣｐ
ＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ＳＣＩ（７） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯ［（ＳＨＩ製ｊ１礼ユ オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ，
Ｉ、Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ（第７図の各オリゴヌクレ
オチドの記号に対応する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例１と同様にして製造す
る。 （１１ＦＩＯＡｐＡｐＴｐＴｐ’ｒｐＧｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＡＯＨ（Ａｌ（２１ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
ｌ（３１ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴ
ｐＴｐＣｐ’ｒｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ＋（４１ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐ’ｒｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄｉ（５１ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐ
Ｔｐ’ｒｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐ’ｌ”ｐＧｐＡＯ
Ｈ（Ｅｌ（６１ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ
’ｒｐＣｐＡｐ’ｒｐＴｐＴｐＣｐＡＯ！（（Ｆｌ（９
１ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣｐ’ｒｐＡｐＧ
ｐ’ｒｐ’ｒｐＡｐＡｐＣＯＩ（（工１（１０１ＨＯＧ
ｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐ
ＣｐＴｐＡＯＨ＋・丁）（１１１ＨＯＴｐＡｐＧｐＴｐ
ＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ
（Ｋ）（１２１ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ）ｆ１３）
ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡ
ｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍｌ（１４１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯｒ（（Ｎｌ製造イｌＡ４ 下記リンカ−オリゴヌクレオチド（ｍｌおよびＡ２）を
製造例１と同様の方法で製造する。 （１１ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍ１１（２１Ｈ
ＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨｆｍ２１製造例５ ソマトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐプロモーター遺
伝子の製造（第７図参照）： 各オリゴヌクレオチド（Ａ −Ｎ、 ５Ａ−５１（）の
一部（０，４ｎＭ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
ＢＲＬ製）４屯位を用い、７４ｍＭ ＴＲｌ５−塩酸（
ｐＨ７，６）、１０ｍ１１ンチオ、！、レイトール、１
．６ｉＭメルカプ）−エタノール、ｌ ０ｍＭ塩化“マ
グネシウムおよび０．５ｍ１ｌ ＡＴＰ含有溶液１００
ｄ中において３７゛Ｃで２０分間リン酸化Ｊ−る。反応
終了後、反応混合物中の酵素はｉｏｏ”ｃで５分間イン
キュベートして不活性化する。リン酸化されたオリコ゛
′ヌクレオチドのライゲーションを第７図に示すように
行い、まず、４つの断片ブロックを、最終的にクローニ
ング用のソマトスタチン遺伝子に結合したｔｒｐブ１コ
七−ター遺伝子を得る。ライゲーションはＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（７屯位）を用い１００ｍＭ Ａ１：Ｐ含有溶
液（０，５４）中において４°Ｃで２３時間（標準条件
）行う、各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲー
ション生成物は、ＴＲｌ５−ＥＤＴＡ緩衝液中２−１６
％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動での溶出後、臭
化エチジウムで染色して同定する。最終ライゲーション
生成物をＥｅｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、分取用
７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し
、ｔｒｐプロモーター遺伝子に結合したソマトスタチン
遺伝子（１６３ｂｐ）を得る。 腎喜例ｊ ｊｒｐプロモーター遺伝子に結合したソマトスタチン遺
伝子のクローニング（第８図参照）二合成遺伝子をＴ４
ＤＮＡリガーゼの存在下にｐＢＲ３２２（市販）のＥ
ｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、このライ
ゲーション生成物を用いクッシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ
）の方法［Ｔ、 Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｆｒ
１ｔｓｈ、 Ｊ。 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏ
ｎｉｎ、ｇ、 ２５２頁 （１９８２）コによりＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４）を形
質転換する。 ＲＡｍｐおよび５ＴＱＬの形質転換体か
ら得たプラスミドを）ＩｐａＬで消化しバンド（４，ｔ
ｘｂｐ ）を確認し、次に３ａｍＨ１で消化して９０ｂ
ｐのバンドをＰＡＧＥで確認Ｃる。さらに、ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ消化によるソマトスタチン遺伝子５６ｂ
ｐを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサイズマーカ
ーと比較して確認する。このプラスミドをｐＩｒｐＥＢ
７と命名し、発現ベクターの構築に使用する。 製造例７ オリゴヌクレオチドａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ
６、ｂｌ、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｂ６、ｃｌ、Ｃ２
、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ｄｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４、
Ａ５、Ａ６、ｅｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ａ５、Ｎｌ、１
２２および２３（第９図の各オリゴヌクレオチドの記号
に対応する）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを製造例】に記載のＳＲと同様
の方法で製造する。 （１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ａ２
）（コＩ ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴ
ｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐ
’ｒｐＧＯＥ（（Ａ４）（５） １（ＯＴｐＴｐＴｐＡ
ｐＣｐＡｐ’ｒｐＡｐ’］？ｐＧｐＧｐＧｐ’ｒｐＣｐ
ＣＯＨ（Ａ５＞（６１ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯ！（（Ａ６）
（７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐ’ｒｐ’ｒｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨＴｂ１）（８） Ｈ
ＯＣｐ’ｒｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＧ
ｐＴｐＣｐＡＯＩ（（ｂ２１（９） ＨＯＴｐＴｐＣｐ
ＡｐＧｐＡｐ’ｒｐＧｐ’ｒｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡ
Ｏ１（（ｂ３）（１０） ＨＯＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｂ４１（
１１１ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ’ （ｂ５１（１；ｊ ＨＯ
ＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐ丁ｐｃｐｃｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐｃＯＨ（ｂ６１（１３）１（ＯＴｐＡｐＡｐ
’ＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐｒｐＴｐＴｐ
ＣＯＨ（ｃｌ）（１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣ
ｐＡｐ？ｐ′１″ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（ｃ２
）＋１５）ＨＯＡｐＡｐＴｐ’ｒｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３１（１６＞ ＨＯ
ＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＧＣ＋Ｈ（ｃ４）（１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯｔ
ｌ （ｃ５１（１Ｂ） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐ’ｒｐＣｐＴｐＣｐＣｐ’ｒｐＣｐＴｐ’ｒＯＨ
（（：６）（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐ’ｒｐＡｏＨ（ｄｉ）（２
（１１ＫＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯ’［ｉ （ｄ２）（２１１ＨＯＧ
ｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐτＰＡＰＣＰ”Ｐ
τＯＨ（ｄ３）（２２３ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐτｐＴｐＴＯＨ（ｄ４＞＋２
３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴ
ｐＴｐ’ｒｐＧｐＧＯＨ（ｄ５）（２４１ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡ
Ｏｔ（（ｄ６）＋２５） Ｉ（ＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐ
ＴｐＴｐＴｐ士ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｓｌ）
（２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐ’ｒｐＡｐＡｐＧｐＧｐ
ＡｐＴｐ（’；ｐＡｐｃｐｃｐＡＯＨ（ｅ２）（２７）
Ｈ○ＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐ’ｒｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＩＩ （ｅ３）（２８） Ｈ
ＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐΔＯＩ４ （ｅ４）！２９） ＨＯＧｐＧ
ｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴ’ｐＧｐＧｐ’丁’ｐｃ
ｐＡｐＴＯ１ｌ（ｆｅ５）（ＩＱ） ＨＯＴｐＧｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐ’ｒｐＡｐＧＯ［（（す
）（３１） ｔ（Ｏ１２）ＡＰＣＰＡＰＣＰＡｐＣＰ
ＴｐＣｐ丁ｐＴｐＴｐＴＯＨ（］、２）（：１２）
ｔ（ＯＧｐ入ＰＴＰＣＰＣＰτｐＡｐＴｐｃｐＡｐ’Ｔ
Ｏｔ（（１−３）１益ｊ１ 一蛋白ベプチドＬｌ（遺伝子を含む合成遺伝子”の製造
（第９図参照）： 各オリゴヌクレオチド（ａ２−１２）の一部（０，４ｎ
Ｍ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２．５単位を用い
、５０ｍＭ ＴＲｌ５−塩酸（ｐｔｔ７．６）、２０＋
＋１ｔｉジｆオスレイトール、５０＜ １ｍｌ牛血清ア
ルブミン、１ｍ１１スペルミジン、１０ｍＭ塩化マグネ
シウムおよび２ ｍＭ ＡＴＰ含有溶液４０所中におい
て３７℃で３時間リン酸化する０反応終了後、反応混合
物中の酵素をＬＯＯ”Ｃで５分間イ〉・キュベートして
不活性化する。リン酸化７オリ＝２ヌクレオチドおよび
２つのオリゴヌクレオグ・ド（ａｔおよびｆｆ１３）の
ライゲーションは第９図に示すように行い、まず、６つ
の断片ブロックを、最終的にり１．ｆｆ−ニング用の蛋
白ペプチドＬＨ遺伝了−（ｚ３６ｂｐ ）を（外る。ラ
イゲーションはＴＡ ＤＮＡリガービ（５単位）を用い
、５０ｍＭ ＡｒＰ含有溶液（１ｐ）中において１６°
Ｃで５時間行う、各段階におけるオリゴヌクレオチドの
ライゲーション生成物は、ＴＲｌ５−ＥＤＴＡ緩衝液中
２−１６％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動での溶
出後、臭化エチジウムで染色することにより同定する。 １巌輿１ “蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°゛のクロ
ーニング（第１０図参照）ニ プラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
制限エン制限エンドヌク上で消化する０反応は６５℃で
５分間加熱することにより終了させ、断片をｏ、ｓ％ア
ガロースゲル電気泳動により分離する。 ｐＢＲ３２２
由来の３９８５ｂｐの大きな断片を回収し、前記のよう
に合成した“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子
” （２３６ｂｐ）とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に１
２℃で１８時間ライゲートする。ライゲーション混合物
を用いクッシュナー法によりＥ、 ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉを形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体をテトラ
サイクリン（２５ｕｇ／ｉｌＱ ）含有プレート上に選
択する。アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の
プラスミドＤＮＡをＥｅｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、断片をアガロースゲル電気泳動で適当なサイズマー
カーと比較する０期待した２３６ｂｐの″蛋白ベブグ・
ドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝子°”断片を得る。 このプラスミドをｐＬＨ１０７と命名し、発現ベクター
の構築に使用する。 製造例１０ 蛋白ペプチドＬＨ発現ベクター（ｐＬＨｔｒｐ ）の構
築（第１１図参照）： 製造例６で製造したｐＴｒｐＥＢ７をＥｅｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩで消化、分取用アガロースゲル電気泳動によ
り大きな断片（４，１ｋｂｐ ）を得る。この断片を、
プラスミドｐＬ）＋１０７をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化して得た゛窟白ペプチドＬＨ遺伝ｒ・を含む合
成遺伝子゛とつ・イゲートする。ライゲーション混合物
を用いＥ、 ｅｏｌｉ、 ＨＢＩＯＩを形質転換してア
ンピシリン耐性でｊトラサイクリン感受性の形質転換体
を得る。 この形質転換体から得Ｉとプラスミド（ｐＬＨｔｒｐ
）をＥＣＱＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、“蛋白ペプ
チドＬＨ遺（Ｉ：了を含む合成遺伝子” （２３６ｂｐ
）を７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認す
る。 実施例１ ソマトスタチン発現ベクターｐＬＨ５ｓｔｒｐの構築（
第１２図参照）： プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ
Ｉで消化してソマトスタチン遺伝子（５６ｂｐ）を得る
。一方、製ｍｆ列４（２）で製造したオリゴヌクレオチ
ド（ｍ２）を丁４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、製
造例５に記毅のようにリン酸化する。このリン酸化−（
リフヌクＬ−オチド、製造例４（１）で製造したオリゴ
ヌクレオチド（ｍｌ）およびソマトスタチン遺伝子（５
６ｂｐ）を屍合し、１００ｒ＋＋Ｍ ＡＹＰ含有溶液中
において４°Ｃで２０時間Ｔ４リガーゼで処理する。ラ
イゲーノ−（ン混合物をＢａｍＨＩ−ｒ消化し、分取用
ポリアクリルアミドゲル１気泳動セ精製してＳリンカ一
才すコヌイ７しオチドに結合したソマトスタチ〉・遺イ
１、Ｔ（７４ｂｐ ）を得る。この遺伝子（７４ｂｐ）
を、ｐＬＨｔｒｐのＨｉｔｉｄＬＩＩ−ＢａｍＨＩ消化
により得た断片とライゲーション、このライゲーション
混合物を用いでＥ、 ｃｏ、ハＨＢＩＯ１を形質転換す
る。プラスミドｐＬｌｌｓｓｔｒｐを含有するこのＥ、
ｅｏｌｉ ＨＢＩＯＩをもをｕ５５−１と命名する。 形質転換体から得たプラスミド（ｐＬＨ５ｓｔｒｐ ）
をＥｃｏＲＴ、−ＢａｍＨＩ （１９８，５６ｂｐ ）
ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍｌ（Ｉ （７４ｂｐ ）およ
びＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ （２８８ｂｐ ）で消化し、
７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でｔｒｐプロ
モーター、蛋白ペプチドＬＨおよびソマトスタチン遺伝
子を確認４−る。 Ｘ及遭１ Ｅ、 ｅｏｌｉ ５５−１での付加蛋白ペプチドＩ、１
（およびソマトスタチンを含む融合蛋白をコードする遺
伝子の発現： Ｅ、 ｅｏｌｉ ５５−１（プラスミドｐＬＨ５ｓｔｒ
ｐｉＭ有Ｅ、 ｃｏ旦ＨＢ１０１）を５Ｑ４／Ｉｌｌア
ンピシリン含有Ｌヅ１コス中で一晩坏＜養したものを、
０．２％グルコース、０．５％力りミ・′酸（＃加水分
解カゼイン）、５０Ｐ＠／ｍＱビタミンＢ１および２５
に／ＩＩＩＱアンピシリン含有Ｍ９培地に１＝２０の割
合で希釈する。β−インドールアクリル酸を加え最終濃
度１０に／ｍＱとする。その時のＡ６００は０５である
。次に細胞を３時間培養し、遠心分＠ （８ｋｒｐｎｍ
、４°Ｃ１１０分間）により湿潤細胞ペーストを集める
。 及庵輿ユ ソマトスタチンの分離・精製 実施例２で得たｆｆｌ潤細脳細胞ペースト化シアン（１
０ｍｇ／唾）含有７０％ギ酸に懸濁し、室温で一晩攪拌
Ｖる。溶媒を凍結乾燥により除去し、残渣を８Ｍ尿素棋
衝液（８Ｍ尿素、０．１ＭＴＲｌ５−塩酸（ｐＨ８，０
）、０．１Ｍジチオスレイトール）に懸濁し、ＴＲｌ５
ｆ ｐｕｓ、 ０に調整する。溶液を遠心分離した後、
−ヒ澄みを高速液体グロマトグラフィーのゲＪ１．−濾
過によりｊＩｌｆ製する（ カラム： ｌ５Ｋ３０００
ＳＷ、商標：東洋痺達工業株式会社製）。８Ｍ尿素綴衝
液で溶出した両分を逆相＾１速液体りｔ」マドグラフィ
ー（カラム：ヘックマンウル１−ラボアＲＰＳＣ１商標
：ヘノクマン社製、０．ＯＩＭ三ツノ化酢酸中１０％〜
６０％アセトニトリルの直線勾配）により精製し、精製
ソマトスタチンを得る。ソマトスタチンのＮ末端配列（
ａｌａ（１）−ｐｈｅ＜７） ）をアミノ酸配列分析に
より決定する。この操作により、培養液１ｅから精製ソ
マトスタチン１ｍＢを得る。 及産週１ １）付加蛋白およびソマトスタチンを含む融合蛋白の単
離・精製 実施例２と同様の方法で得た湿潤細胞ペースト（６ｇ）
を１０ｍＭリン酸−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０） 、ｆｆｌ
衝液（１５ｍＱ ）に懸濁し、細胞を超音波処理により
溶解する。１ａ磨残屑を１８．０００ｒｐｍで３０分間
遠心分離してベレット化する。ベレットを０．１ＭＴＲ
ｌ５−塩酸（ｐｏｓ、ｏ） ６ Ｍ塩酸グアニジン、ｌ
ｏｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１Ｍジチオスレイトールの
１０誰に溶解して４℃’ｃ’−−・晩攪）↑し、４°Ｃ
で遠心分離する（１５．０００ｒｐｍ、３０分間）、上
澄みを集め、６Ｍ塩酸グアニジン、０．１ＭＴＲｌ５−
塩酸（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍ
Ｍノグオス【・イトールで平衡化した高速液体り【１７
）・グラノィーによるゲノし濾過（カラム：ＴＳＫ３、
０ＯＯ５Ｗ ）に付す。溶出は４°Ｃで、溶出緩衝液を
流速Ｑ、７ｍＱ／分で用いて行う、保持時間３０分にビ
ータタ有する画分を集め、１Ｍ酢酸水溶液で透析する。 透析両分を凍結乾燥してず・１加蛋白およびソマトメタ
チンを含む融合蛋白を得る。この融合蛋白は、１５％ド
デシル硫酸−ポリアクリルアミド電気泳動で分子医９．
５００の位置にバンドを示ｔ。 ２〉臭化シアンによる付加蛋白およびソマトスタチンを
含む融合蛋白からの付加蛋白（蛋白ペプチドＬＨ）の脱
離 前記で得た付加蛋白およびソマトスタチンを含む融合蛋
白を８０％ギ酸１ ｍＱに溶解する。臭化シアン（３ｍ
ｇ）を加え、混合物を室温で一晩放置する。溶媒を凍結
乾燥により除去し、残渣を６Ｍ塩塩酸テアニシン０．１
ＭＴＲｌ５−塩酸（ｐＨ８，０）、１０關ＥＤ丁Ａｊ（
よび０．ＩＭ’ンチオスレイトールのｌ ｍＱに溶解す
る。″ 高速液体クロマトグラブイ−・〜： 十記で得た溶液を用いる。 カジノ、：ヘノクマンウル［・ラボアＲｐＳＣ流速：１
ｍＱ／分 溶出： ０．０１Ｍ トリプルオロ酢酸中１０％−６０
％アセト−＝ｈウリル直線勾配；５０分間 グ［１マドグラフイーを繰返し、保持時間１７．２３分
にピークを有する両分を集める。プールした両分を凍結
乾燥１７でソマトスタチンを得る。
【図面の簡単な説明】
第１図は大腸菌のｔｒｐプロモーターーーオベレーター
領域の遺伝子の模式構造を示し、第２図は最も好ましい
ｔｒｐブ１１モーターのＤＮＡ配列を示し、第３図は蛋
白ペプチドＬＨのアミノ酸配列を示し、第４図はリンカ
−のＤＮＡ配列を示し、第５図はソマトスタチンをコー
ドする遺伝子の模式構造を示ｊ７、第６図は融合蛋白の
アミノ酸配列を示し、第７図はソマトスタチン遺伝子に
結合したｔｒｐプロモーター遺伝子構築のブローチヤー
ドを示し、第８図はプラスミドｐＴｒｐＥＢ７の構築の
フローチャー１を示し、第９図は″蛋白ペプチドＬＨ遺
伝子を含む合成遺伝子゛構築のフローブーヤードを示し
、第１０図は“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝
ｒ−”のクローニングのフローチャートを示し、第１１
因はツマ１−スタチン遺伝子とプラスミドｐＬＨｔｒｐ
の構築のプし１−チャートを示し、第１２図は組換えプ
ラスミドＬＨ５Ｓｔｒｐ構築のフローチャートを示す。 特許出願人 藤沢薬品工業株式会社 （ＨｉｎｄｌＩＩ） ＬｅｕＧ ＡＧＣＴＴＧ。 Ｃ ＩｕＶａ［ＬｙｓＨｉｓ （ＥｃｏＲＩ）λＡＧＴＡ
ＡＡＡＣＡ丁Ｇ ｒＴＣＡＴＴＴＴＧ丁ＡＣＴＴＡＡ １’）０− 工 Ｈ μ 〒
領域の遺伝子の模式構造を示し、第２図は最も好ましい
ｔｒｐブ１１モーターのＤＮＡ配列を示し、第３図は蛋
白ペプチドＬＨのアミノ酸配列を示し、第４図はリンカ
−のＤＮＡ配列を示し、第５図はソマトスタチンをコー
ドする遺伝子の模式構造を示ｊ７、第６図は融合蛋白の
アミノ酸配列を示し、第７図はソマトスタチン遺伝子に
結合したｔｒｐプロモーター遺伝子構築のブローチヤー
ドを示し、第８図はプラスミドｐＴｒｐＥＢ７の構築の
フローチャー１を示し、第９図は″蛋白ペプチドＬＨ遺
伝子を含む合成遺伝子゛構築のフローブーヤードを示し
、第１０図は“蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を含む合成遺伝
ｒ−”のクローニングのフローチャートを示し、第１１
因はツマ１−スタチン遺伝子とプラスミドｐＬＨｔｒｐ
の構築のプし１−チャートを示し、第１２図は組換えプ
ラスミドＬＨ５Ｓｔｒｐ構築のフローチャートを示す。 特許出願人 藤沢薬品工業株式会社 （ＨｉｎｄｌＩＩ） ＬｅｕＧ ＡＧＣＴＴＧ。 Ｃ ＩｕＶａ［ＬｙｓＨｉｓ （ＥｃｏＲＩ）λＡＧＴＡ
ＡＡＡＣＡ丁Ｇ ｒＴＣＡＴＴＴＴＧ丁ＡＣＴＴＡＡ １’）０− 工 Ｈ μ 〒
Claims (3)
- （１）ｔｒｐプロモーター、付加蛋白およびソマトスタ
チンを含む融合蛋白のアミノ酸配列をコードする構造遺
伝子、および１個以上の終止コドンを含有する組換えプ
ラスミドであり、前記付加蛋白がリンカーに由来するペ
プチドに結合した蛋白ペプチドＬＨであり、ソマトスタ
チンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチオニンを選
択切断部位として含み、上記諸要素が前記の順序で配列
している前記組換えプラスミドを用いて形質転換した微
生物を培地に培養して、得られる菌体から該融合蛋白を
分離し、次いで該融合蛋白を付加蛋白の脱離反応に付し
てソマトスタチンを得ることを特徴とするソマトスタチ
ンの製造法。 - （２）ｔｒｐプロモーター、付加蛋白およびソマトスタ
チンを含む融合蛋白のアミノ酸配列をコードする構造遺
伝子、および１個以上の終止コドンを含有する組換えプ
ラスミドであり、前記付加蛋白がリンカーに由来するペ
プチドに結合した蛋白ペプチドＬＨであり、ソマトスタ
チンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチオニンを選
択切断部位として含み、上記諸要素が前記の順序で配列
している前記組換えプラスミドを用いて形質転換したこ
とを特徴とする形質転換体。 - （３）ｔｒｐプロモーター、付加蛋白およびソマトスタ
チンを含む融合蛋白のアミノ酸配列をコードする構造遺
伝子、および１個以上の終止コドンを含有する組換えプ
ラスミドであり、前記付加蛋白がリンカーに由来するペ
プチドに結合した蛋白ペプチドＬＨであり、ソマトスタ
チンのＮ−末端アミノ酸配列に隣接するメチオニンを選
択切断部位として含み、上記諸要素が前記の順序で配列
していることを特徴とする前記組換えプラスミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8509289 | 1985-04-11 | ||
| GB858509289A GB8509289D0 (en) | 1985-04-11 | 1985-04-11 | Production of somatostatin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62238219A true JPS62238219A (ja) | 1987-10-19 |
Family
ID=10577467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61078704A Pending JPS62238219A (ja) | 1985-04-11 | 1986-04-04 | ソマトスタチンの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0197558A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62238219A (ja) |
| GB (1) | GB8509289D0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| US6074872A (en) | 1996-05-15 | 2000-06-13 | The Scripps Research Institute | Cortistatin: nucleic acids that encode these neuropeptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT373280B (de) * | 1977-11-08 | 1984-01-10 | Genentech Inc | Verfahren zur erzeugung eines spezifischen polypeptids aus einem mikrobiellen rekombinations -clonbildungstraeger |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| IL70704A0 (en) * | 1983-01-19 | 1984-04-30 | Amgen | Methods and materials for development of parvovirus vaccines |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
-
1985
- 1985-04-11 GB GB858509289A patent/GB8509289D0/en active Pending
-
1986
- 1986-04-04 JP JP61078704A patent/JPS62238219A/ja active Pending
- 1986-04-09 EP EP86104873A patent/EP0197558A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0197558A2 (en) | 1986-10-15 |
| GB8509289D0 (en) | 1985-05-15 |
| EP0197558A3 (en) | 1988-08-03 |
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