JPH0817708B2

JPH0817708B2 - Ｍｅｔ−インスリン様成長因子Ｉの発現ベクター

Info

Publication number: JPH0817708B2
Application number: JP62255818A
Authority: JP
Inventors: 育男植田; 峰雄丹羽; 善正斎藤; 芳則石井; 忠司北口
Original assignee: 藤沢薬品工業株式会社
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1996-02-28
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: JPS63233791A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、インスリン様成長因子Ｉ誘導体の製造に関
し、さらに詳しくは、インスリン様成長因子ＩのＮ末端
にメチオニンがついたメチオニルインスリン様成長因子
（以下、Met-IGF−Ｉという）のDNA組換え法による製造
に用いるための発現ベクター、並びに、該発現ベクター
を用いてMet-IGF−Ｉを製造する方法に関するものであ
る。

従来技術インスリン様成長因子（以下IGFという）は、血中に
存在するインスリン類似のペプチドの内、酸−エタノー
ル画分から同定された物質であり、インスリン様成長因
子Ｉ（以下、IGF−Ｉという）とインスリン様成長因子I
I（以下、IGF-IIという）が含まれる。これらは種々の
細胞の増殖促進作用を有しており、その産生および分泌
は成長ホルモンに依存している。

これらのIGFはいずれも成長ホルモンの骨成長促進作
用を仲介する物質であるソマトメジン群に含まれている
が、特に、IGF−Ｉは成長ホルモン依存性が高く、ソマ
トメジンＣと同一の物質であり、成長ホルモンの作用の
発現に深く関与していることがわかっている。従って、
IGF−Ｉを大量生産し、治療や研究に供することは、極
めて有意義といえる。

しかしながら、これまでIGF−Ｉの調製は、血清から
単離する方法によっていたため、収率が低く、需要に充
分応えることができなかった。しかも、この方法は、極
めて非能率的である上、得られる物質中に様々な不純物
が含まれているおそれがあった。

しかるに、近年、遺伝子操作技術の発展に伴って、様
々な生理活性物質を大量に生合成することが可能とな
り、IGF−Ｉに関しても、その様な試みがなされてい
る。しかしながら、IGF−Ｉの如く、比較的低分子量
（約7000〜7500）のペプチドをDNA組換え法で合成する
場合、直接発現法によると、生成物が細胞内のタンパク
分解酵素（プロテアーゼ）により分解されてしまうの
で、収率が著しく低下するという問題点がある。そこ
で、適当な他のペプチドとの融合物として発現させる工
夫がなされている。融合ペプチドとして発現された生成
物は、インビトロでの切断により、IGF−Ｉを与える。

上記の方法を利用したIGFの製造例が特開昭59-205997
号等にみられる。ここでは、複製系、プロモーター、リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルを含む構造遺
伝子、並びに転写終結配列を含むDNA構成物で酵母を形
質転換し、得られた形質転換体を適当な条件下で培養す
ることにより、プレ−IGFを発現させていた。次いで、
発現されたプレ−IGFはプロセッシングされ、成熟IGFが
培地中に分泌されることになる。

本出願人も大腸菌内でIGF−Ｉを保護ペプチドとの融
合物として発現させ得る発現ベクターを組立て、該ベク
ターを用いてIGF−Ｉを大腸菌内で生産させることに成
功した（特開昭61-1396号）。即ち、上記のベクターで
大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を適当な条件
下で培養することにより、IGF−Ｉを含む融合ペプチド
を生産させ、該融合ペプチドを臭化シアンやコラゲナー
ゼを用いた脱離反応に付し、IGF−Ｉを分離した。

しかしながら、IGF−Ｉを含む融合ペプチドとしてIGF
−Ｉを発現させる方法は、融合物からのIGF−Ｉの分離
工程等を要し、工程が複雑である。

従って、目的物質IGF−Ｉを効率良く発現させ、しか
も容易に回収することのできる発現系を得ることが望ま
れている。

本発明者らは、IGF−Ｉを、簡単に、しかも高収率で
製造する方法を確立することを目的として研究を重ねた
結果、ポリシストロン性の発現系によって、IGF−Ｉと
ある種の“他のペプチド”とを同時に発現させると、こ
の“他のペプチド”の存在により、IGF−Ｉがプロテア
ーゼによる分解から保護され得るということを発現し、
本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、IGF−Ｉ、および該IGF−Ｉのプロテ
アーゼによる分解を阻止し得る“他のペプチド”とをコ
ードしており、大腸菌内で機能的かつ複製可能なポリシ
ストロン性発現ベクターを提供するものである。

また本発明は、この発現ベクターによって形質転換さ
れた宿主細胞を提供するものである。

さらに本発明は、上記の形質転換体を用いてIGF−Ｉ
を製造する方法を提供するものである。

ポリシストロン性の発現系を用いた発現ベクターの例
は、ショーナー（B.E.Schoner）により開示されている
［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンセズ（Proc.Natl.Acad.Sci）USA8
15403〜5407（1984）］。この報告では、第１シストロ
ンにアミノ酸数20〜25程度の適当なペプチドの暗号配列
であってmRNAの転写時のステム・アンド・ループ構造の
形成を阻止し得る暗号配列を含有させることにより、mR
NAをリボソームと結合し易くし、第２シストロンにコー
ドされているウシ成長ホルモン（bGH）の発現を促進す
る様に構成された発現ベクターが示されている。

これに対し、本発明の発現ベクターは、第１シストロ
ンにコードされている“他のペプチド”によって第２シ
ストロンにコードされているIGF−Ｉを酵素分解から保
護する様に設計されたものである。

IGF−Ｉは、アミノ酸70個からなる分子量約7,500の、
タンパク分解酵素に不安定な塩基性ペプチドである。本
発明者らは、この様な酵素に不安定なIGF−Ｉを、“他
のペプチド”と共にポリシストロン系ベクターを用いて
発現させることにより、IGF−Ｉを分解から保護し得る
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。

この様な“他のペプチド”としては分子量約500〜50,
000、好ましくは3,000〜15,000の酸性ペプチドが挙げら
れる。ここでいう酸性ペプチドとはpI（等電点）が4.0
〜7.0、好ましくは5.0〜6.0のペプチドである。

“他のペプチド”の例としては、例えば、ペプチドCd
（以下、Cdという、後述のFra−Ｂ−７、第16図参
照）、ペプチドLH（以下、LHという、Fra−Ｂ−４、第1
3図参照）、Cd-LH融合ペプチド（以下、Cd-LHという、F
ra−Ｂ−６参照）（以下必要に応じて同様の略号を用い
る）等を挙げることができる。これらの内、等電点を考
慮すると、発現効率の高いペプチドであると思われるCd
-LHが最も好ましい。

本発明の発現ベクターの具体例であるプラスミドpCE-
SMtrp（第２図の１）およびプラスミドpCE-SM3t（第２
図の２）は、いずれも、第１シストロンにCd-LH遺伝子
（本明細書中、Cd-LHをコードする遺伝子をCd-LH遺伝子
といい、以下、同様にこの表現法を用いる）を、第２シ
ストロンにIGF−Ｉ遺伝子を含有しており、適当な宿主
に導入されて転写されることにより、２シストロン性mR
NAを生成する。このmRNAが翻訳されると、それぞれのペ
プチドが同時に発現されることになる。

さらに詳しくは、本発明の発現ベクターのシストロン
部分は、以下の模式図で示される。

本明細書中、プロモーター遺伝子とは転写活性化配列
から始まり、下流の翻訳開始信号に至る配列（翻訳開始
信号はプロモーター遺伝子には含まれない）を含む遺伝
子単位を指す。

また本明細書中、シストロンとは翻訳開始信号（AT
G）、何らかのペプチドをコードする遺伝子および翻訳
停止信号（本明細書中に記載の式あるいは添付の図面で
は翻訳停止信号を“終止”と表示する）をこの順番で含
む遺伝子の機能単位を指す。またそれぞれのシストロン
中のペプチドをコードする遺伝子が翻訳されるために
は、それぞれのシストロンの上流にシャインダルガノ配
列（以下、SD配列という）が存在することが必須であ
る。

本発明ベクターにおいては第１シストロンの上流であ
って、かつプロモーター遺伝子の下流に、また第２シス
トロンの上流であって、かつ第１シストロンの下流にSD
配列が存在する。第１シストロンの下流のSD配列は“他
のペプチド”をコードする遺伝子の一部である。

なお第１シストロンの翻訳停止信号は第２シストロン
の翻訳開始信号の下流に隣接して存在してもよく、その
場合には、第１シストロンの翻訳停止信号は第２シスト
ロンのペプチドをコードする遺伝子の一部でもある。

２個のシストロン間のヌクレオチド配列は、さらに詳
しくは、式：（図中、Ａはデオキシアデニル酸、Ｇはデオキシグアニ
ル酸、Ｃはデオキシシチジル酸、Ｔはデオキシチミジル
酸を表わす）で示される。上記の、または以後のアミノ酸の略語によ
る表示は、周知の表示方法に従う。

上記の式において、第２シストロンのIGF−Ｉの第１
番目のアミノ酸であるグリシンをコードするヌクレオチ
ド配列（具体例にはGGT等）の上流にあるメチオニンを
コードするヌクレオチド配列ATGは、同時に第２シスト
ロンの翻訳開始信号でもある。

本明細書中では、このヌクレオチド配列と第１シスト
ロンの翻訳停止信号（具体的にはTAA等）とが一体とな
って形成されるヌクレオチド配列を、便宜上、“シスト
ロン連結配列”と呼称する。

“シストロン連結配列”は上記式ではその具体例とし
てTAATGで示されているが、この具体例のように、翻訳
停止信号（TAA）と翻訳開始信号（ATG）が重複したヌク
レオチド配列の外、隣接したヌクレオチド配列、１〜２
個の両者が塩基対を介して接しているヌクレオチド配列
も含まれる。重複したヌクレオチド配列としては、上述
のTAATGの外、TGATGや、翻訳停止信号と翻訳開始信号の
位置が逆転したATGA等が挙げられる。隣接したヌクレオ
チド配列としてはTAGATG、TAAATG、TGAATG等が挙げられ
る。

“シストロン連結配列”はその上流の第１シストロン
の“他のペプチド”をコードする遺伝子の一部でもある
SD配列と一体となって、第１シストロンと第２シストロ
ン間のヌクレオチド配列を形成する。この場合、SD配列
と“シストロン連結配列”の距離は５〜15塩基対、好ま
しくは６〜８塩基対である。

SD配列と“シストロン連結配列”を含むヌクレオチド
配列を含む好ましいリンカ−DNA断片としては例えば、
後述のFra−Ａ−３等が挙げられる。

このSD配列と“シストロン連結配列”を含むリンカ−
DNA断片をIGF−Ｉ遺伝子の５′末端に結合させることに
より、２シストロン性発現ベクターを得るためのDNA断
片（後述のFra−Ａ−７等）を構築した。次いで、例え
ば、本出願人の出願（特願昭61-141900号）に係るα−h
ANP発現ベクターpCLaHtrpSd（Cd-LHとα−hANPとの融合
ペプチドをコードしている発現ベクター）において、α
−hANP遺伝子（Hind III-BamHI部位）を該DNA断片で置
き換えることにより、本発明の所望の２シストロン性発
現ベクターを得ることができる。

従って、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を適当な条件下で培養すると、
２種のポリペプチド、即ち“他のペプチド”例えばCd-L
Hと、IGF−Ｉとが同時に、独立して発現される。但し、
IGF−Ｉの場合、翻訳開始信号であるATGがそのコードす
るメチオニンとして発現されたまま残るので、得られる
ペプチドはIGF−Ｉの５′末端にメチオニンのついたMet
-IGF−Ｉである。このとき、単独の直接発現において
は、細胞内プロテアーゼで分解され易いIGF−Ｉが“他
のペプチド”例えばCd-LHの存在により、安定に細胞内
に保持されることが示された。この“他のペプチド”に
よるIGF−Ｉの安定化は、塩基性のIGF−Ｉと酸性のペプ
チド、例えばCd-LHとの会合によってプロテアーゼの分
解作用が阻止されることによると思われる。次いで本発
明の２シストロン性発現ベクターで形質転換された形質
転換体を溶解し、リゼイト中に存在する会合した２種の
ペプチドを、例えば、酸に対する溶解性（IGF−Ｉは可
溶性であり、Cd-LHは不溶性である）に基づいて分離す
ることができる。

IGF−Ｉ遺伝子を宿主微生物、特に大腸菌内で効率良
く発現させるために最も一般的に用いられているプラス
ミドは、大腸菌由来のプラスミドpBR322である。本発明
においてもこのプラスミドを出発プラスミドとして用い
るが、その他のプラスミドであっても、大腸菌内で複製
保持される限り、使用し得る。そのようなプラスミドに
は、例えば、pUC9、pAT153等が含まれる。また、バクテ
リオファージも使用し得る。

本発明の発現ベクターに用いるプロモーター遺伝子
は、通常用いられる種々のプロモーター系から適宜選択
されるものであってもよいが、本明細書においては、大
腸菌のトリプトファンプロモーターのヌクレオチド配列
に基づいて、本発明者らが新たに合成した合成trpプロ
モーター遺伝子を用いて示した。

また本発明ベクターに用いる転写終結配列としては発
現ベクターの組み立てに用いるプラスミドもしくはファ
ージ由来の転写終結配列をそのまま用いてもよいが、第
２シストロンの下流に、合成ターミネーター遺伝子、例
えば合成fdファージターミネーター遺伝子等を挿入する
ことによって転写終結配列としてもよい。

本明細書において具体的に示した合成trpプロモータ
ー遺伝子は、３種あり、それぞれ、転写活性化配列は同
一であるが３′末端の構造が異なっている。それらは、
合成trpプロモーターＩ遺伝子、合成trpプロモーターII
遺伝子および合成trpプロモーターIII遺伝子である。

これらを総称して、また例えば合成プロモーターＩ遺
伝子と合成プロモーターIII遺伝子を同時に用いる場合
等も含めて合成trpプロモーター遺伝子という。また
“合成”の語は適宜省略する場合もある。

本発明の発現ベクターの組立て方法を以下に具体的に
示す。まず出発プラスミドpBR322［テトラサイクリン耐
性付与遺伝子（以下^RTetという）およびアンピシリン耐
性付与遺伝子（以下^RAmpという）を含む］をEcoRIおよ
びBamHI消化に付し、得られた大きいDNA断片と、trpプ
ロモーターII遺伝子（Fra−１、163bp）とをライゲート
させることにより、^RTetを欠失したプラスミドpTrpEB7
を得る。次いで、このpTrpEB7をEcoRI-BamHI消化に付
し、trpプロモーターII遺伝子内のEcoRI部位から下流を
欠失させ、（かくして得られるプロモーターII遺伝子か
ら、EcoRI部位から下流を欠失させた断片をプロモータ
ーＩ遺伝子という）これに、pBR322をEcoRI-BamHIで消
化して得らる小さいDNA断片を挿入すると、trpプロモー
ターＩ遺伝子を含有し、^RTetおよび^RAmpを有するプラス
ミドpBR322trpが得られる。このpBR322trpをEcoRI-ClaI
消化に付し、大きいDNA断片とtrpプロモーターIII遺伝
子（Fra−Ｂ−３）とをライゲートさせると、trpプロモ
ーターＩ遺伝子およびtrpプロモーターIII遺伝子をこの
順番で含むプラスミドp322dtrpSが得られる。

trpプロモーターIIおよびIII遺伝子（Fra−Ｂ−１お
よびFra−Ｂ−３）のヌクレオチド配列並びに制限部
位、およびプラスミドpBR322をEcoRI-BamHI消化に付し
て得られる小さいDNA断片の制限部位を以下に示す。

Fra−Ｂ−１（163bp）trpプロモーターII遺伝子 Fra−Ｂ−２（375bp）pBR322をEcoRI-BamHI消化に付し
て得られる小さいDNA断片 Fra−Ｂ−３（105bp）trpプロモーターIII遺伝子 trpプロモーターＩおよびIII遺伝子を含有するプラス
ミドp322dtrpSの組み立て模式図を第４図に、そして中
間体プラスミドpTrpEB7の組立て模式図を第３図に示
す。

次いで、CdとLH-RH（ペプチドLHと後述のペプチドRH
が結合したペプチド）との融合ペプチドをコードしてい
るプラスミドpCdγを、以下の如くにして組立てる。

出発プラスミドpBR322をEcoRIおよびBamHI消化に付
し、大きいDNA断片を回収してLH遺伝子（Fra−Ｂ−４）
とライゲートさせる。得られたプラスミドpLH107をHind
IIIおよびBamHI消化に付すことによりFra−Ｂ−４のHi
nd III部位から下流を除去し、RH遺伝子（Fra−Ｂ−
５）を挿入してLH-RH遺伝子を含むプラスミドｐγＦ−
３を得る。次いで、このｐγＦ−３をEcoRIおよびBamHI
消化してLH-RH遺伝子（Fra−Ｂ−６）を得る。

次に、このFra−Ｂ−６を、pTrpEB7のEcoRIおよびBam
HI消化により得た、trpプロモーターＩ遺伝子を含むDNA
断片とライゲートさせ、trpプロモーターＩ遺伝子の下
流にLH-RH遺伝子を含有するプラスミドｐγtrpを得る。
このプラスミドｐγtrpをHrpIおよびEcoRIで消化して大
きいDNA断片を回収し、これをtrpプロモーターIII遺伝
子の一部と、Cd遺伝子とを含むDNA断片（Fra−Ｂ−７）
とライゲートさせ、trpプロモーターＩ、trpプロモータ
ーIII、Cd遺伝子およびLH-RH遺伝子をこの順番で含有す
るプラスミドpCdγを得る。Fra−Ｂ−４、Fra−Ｂ−
５、Fra−Ｂ−６およびFra−Ｂ−７のアミノ酸配列およ
びヌクレオチド配列、並びに制限部位を以下に示す。ま
た、プラスミドpCdγの組立て模式図を第５図に示す。

Fra−Ｂ−４（236bp）LH遺伝子 Fra−Ｂ−５（270bp）RH遺伝子 Fra−Ｂ−６（450bp）LH-RH遺伝子 Fra−Ｂ−７（124bp）trpプロモーターIII遺伝子の一部
とCd遺伝子とを含むDNA断片 Cd-LHとペプチドα−hANP（ヒト−心房性ナトリウム排
泄増加ポリペプチドの一部）との融合ペプチド質の遺伝
子を含有するプラスミドpCLaHtrpSdを以下の如くにして
組立てた。

まず、プラスミドpCdγのClaI-BamHIDNA断片であるFr
a−Ｂ−８を、プラスミドp322dtrpSのClaI-BamHI部位に
挿入し、CdγとLH-RHとの発現ベクターpCdγtrpSdを得
る。

次いで、pCdγtrpSdををHind IIIおよびBamHIで消化
して得られた大きいDNA断片と、リンカーDNA断片を伴っ
たα−hANP遺伝子（Fra−Ｂ−９）とをライゲートさ
せ、Cd-LH−α−hANP（Cd,LH,α−hANPがこの順番で並
んだ融合ペプチド）の発現ベクター、pCLaHtrpSdを得
る。DNA断片Fra−Ｂ−８およびFra−Ｂ−９を以下に示
す。プラスミドpCdγtrpSdおよびpCLaHtrpSdの組立模式
図を第６図に示す。

Fra−Ｂ−８（542bp） Fra−Ｂ−９（134bp）リンカーDNA断片を伴ったα−hAN
P遺伝子次に、前記の２シストロン性発現ベクターを得るため
のDNA断片、Fra−Ａ−７を調製し、IGF−Ｉ発現ベクタ
ーpLHSdMmtrpを組立てる。

まず、プラスミドpTreEB7をEcoRIおよびBamHIで消化
し、大きいDNA断片とLH遺伝子を含むFra−Ｂ−４とをラ
イゲートさせてtrpプロモーターＩ遺伝子とLH遺伝子と
を含むプラスミドpLHtrpを得る。

次に、ベクターの組立てに用いるためのIGF−Ｉ遺伝
子を以下の如くにして調製した。まずプラスミドpBR322
をEcoRIおよびBamHIで消化し、大きい方のDNA断片にIGF
−Ｉ遺伝子（Fra−Ｂ−10）をライゲートさせてプラス
ミドpSdM1を得る。このpSdM1をBamHIおよびEcoRIで消化
してIGF−Ｉ遺伝子を含むDNA断片を得、これにオリゴヌ
クレオチドｍ₁およびｍ₂をライゲートし、Fra−Ｂ−11
を得る。

このFra−Ｂ−11を、前記のプラスミドpLHtrpのHind
IIIおよびBamHI消化により得た大きいDNA断片とライゲ
ートさせ、プラスミドpLHSdMmtrpを得る。Fra−Ｂ−10
およびFra−Ｂ−11のヌクレオチドおよびアミノ酸配
列、並びに制限部位を以下に示す。また、プラスミドpL
HSdMmtrpの組立て模式図を第７図に示す。

Fra−Ｂ−10（224bp）IGF遺伝子 Fra−Ｂ−11（242bp）リンカーDNAを伴ったIGF−Ｉ遺伝
子次に、pLHSdMmtrpをHind IIIおよびBamHIで消化し、I
GF−Ｉ遺伝子とリンカーDNA断片を含むFra−Ａ−４（Fr
a−Ｂ−11と同様）を得、これをAva II消化に付してIGF
−ＩをコードしているFra−Ａ−５を得る。このFra−Ａ
−５は、その３′末端に翻訳停止信号を含有している。

他方、DNA断片Fra−Ａ−１をClaIで消化してFra−Ａ
−２を得、このFra−Ａ−２にオリゴヌクレオチドCT5お
よびCT6をライゲートすることにより、SDと、３′末端
に翻訳停止信号を含有するDNA断片、Fra−Ａ−３を得
る。このFra−Ａ−３と前記Fra−Ａ−５とをAva II部位
でライゲートさせ、IGF−Ｉ遺伝子を含有すると共に、I
GF−Ｉ遺伝子の上流にSDと“シストロン連結配列”を有
するFra−Ａ−６を得る。このFra−Ａ−６をHind III消
化に付し、２シストロン性発現ベクターを得るためのDN
A断片、Fra−Ａ−７を得る。Fra−Ａ−１、Fra−Ａ−
２、Fra−Ａ−３、Fra−Ａ−５、Fra−Ａ−６およびFra
−Ａ−７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、並び
に制限部位を以下に示す。Fra−Ａ−７の組立て模式図
を第８図に示す。

Fra−Ａ−１（46bp）SDを含有するリンカーDNA断片 Fra−Ａ−２（35bp）SDを含有するリンカーDNA断片 Fra−Ａ−３（44bp）SDを含有するリンカーDNA断片 Fra−Ａ−５（215bp） Fra−Ａ−６（259bp） Fra−Ａ−７（238bp）次にα−hANP発現ベクター、pCLaHtrpSdをHind IIIお
よびBamHI消化に付し、得られた大きいDNA断片と前記Fr
a−Ａ−７とをライゲートさせることにより、α−hANP
遺伝子と置換し、本発明の目的プラスミドであるpCE-SM
trpを得る。プラスミドpCE-SMtrpの組立て模式図を第９
図に示す。

もう一つのIGF−Ｉ発現ベクター、プラスミドpCE-SM3
tは、前記プラスミドpCE-SMtrpから以下の如くにして組
立てられる。

まず、プラスミドpBR322のEcoRI-ClaI部位にtrpプロ
モーターIII遺伝子（Fra−Ｂ−３）を挿入し、^RAmpおよ
び^RTetを有するプラスミドpBR322trpSsを得る。次い
で、pBR322trpSsのClaIおよびBamHI消化により生じた大
きいDNA断片と前記のα−hANP発現ベクターpLHtrpSdのC
laI-BamHI断片（Fra−Ｃ−２、Cd-LHとα−hANPとをコ
ードしている）とをライゲートさせることにより、trp
プロモーターIII遺伝子のコントロール下にこれらのペ
プチドをコードしている発現ベクター、pCLaHtrp−２を
得る。Fra−Ｃ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸
配列、並びに制限部位を以下に示す。プラスミドpCLaHt
rp−２の組立て模式図を第10図に示す。

Fra−Ｃ−２（406bp）他方、IGF−Ｉ遺伝子の３′末端に合成fdファージタ
ーミネーター遺伝子を導入するために、プラスミドpBR3
22をBamHIおよびSalIで消化して得た大きいDNA断片と、
合成fdファージターミネーター遺伝子（Fra−Ｃ−１）
とをライゲートさせ、プラスミドpter21を得る。次に、
前記プラスミドpLaHtrp−２をBamHIおよびPstI消化に付
して得られた大きいDNA断片と、プラスミドpter21のPst
IおよびBamHI消化による合成fdターミネーター遺伝子含
有DNA断片とをライゲートさせ、所望のプラスミドpLaHt
rp3tを得る。Fra−Ｃ−１のアミノ酸およびヌクレオチ
ド配列、並びに制限部位を以下に示す。プラスミドpLaH
trp3tの組立て模式図を第11図に示す。

Fra−Ｃ−１（47bp）合成fdファージターミネーター遺
伝子さらに、このプラスミドpLaHtrp3tをBamHIおよびHind
IIIで消化し、得られた大きいDNA断片に、前記の２シ
ストロン性発現ベクターを得るためのDNA断片Fra−Ａ−
７をライゲートすることにより、trpプロモーターIIIの
コントロール下でCd-LHおよびIGF−Ｉをコードすると共
に、fdファージターミネーター遺伝子を含有している、
所望のプラスミドpCE-SM3tを得る。プラスミドpCE-SM3t
の組立て模式図を第12図に示す。

本発明のベクターの組立てに用いた各DNA断片は、後
述する如く、対応する各種オリゴヌクレオチドブロック
のアニール化、並びにライゲーションにより合成した。
また、これらの各オリゴヌクレオチドは、イトウ（H.It
o）、イケ（Y.Ike）、イクタ（S.Ikuta）およびイタク
ラ（K.Itakura）の方法に従って合成した［ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research,10,
1,755'1982）］。

本発明のIGF−Ｉ発現ベクターは、大腸菌宿主の形質
転換に用いられるが、好ましい株は、E.coli（Esherich
ia coli、エシエリヒア・コリ）Ｋ株、E.coli B株であ
る。特にE.coli MM294が好ましい。

発現ベクターの導入は、クシュナー（Kushner）法等
の常法に従って行うことができる。この様にして得られ
た形質転換体を好適な条件下で培養するとCd-LHとMet-I
GF−Ｉとが独立に発現され、このとき、Cd-LHによってM
et-IGF−Ｉは、細胞内に安定的に保持されることにな
る。好適な培養方法は良く知られており、通常、同化可
能な炭素源および窒素源を含有する栄養培地中で好気性
条件下に（たとえば振とう培養、深部培養など）培養す
ることからなる。

栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコース、フルク
トース、スクロース、グリセリン、でん粉などの炭水化
物であり、包含されうる他の炭素源は、キシロース、ガ
ラクトース、マルトース、デキストリン、ラクトースな
どである。

好ましい窒素源は、酵母エキス、ペプトン、グルテン
粉、綿実粉、大豆粉、コーンンスチーブリカー、乾燥酵
母、小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸な
どの無機および有機の窒素化合物である。

炭素源および窒素源は、これらを組合わせて用いるの
が有利であるが、微量の成長因子およびかなりの量の無
機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も使用に適し
ているので、必ずしも純粋な形で使用されなくともよ
い。所望により、炭酸カルシウム、燐酸ナトリウムまた
はカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシ
ウム塩類、銅塩類などの無機塩類を培地に添加してもよ
い。

培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成でき
る。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置によ
り、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装
置により、または無菌の空気を培地に通すことにより、
もたらされる。通気は、醗酵混合物に無菌空気を通過さ
せることにより達成される。

醗酵は、通常約20℃〜42℃間の温度で、好ましくは35
〜38℃の間の温度で、数時間ないし50時間にわたって行
う。

こうして産生されたIGF−Ｉは、Cd-LHと一緒に安定に
宿主細胞内に保持されている。IGF−Ｉは、他の既知の
生理学的活性物質の回収に一般的に用いられる慣用の手
段に準じて培養培地から回収できる。一般的には、産生
されたタンパク質は宿主生物の細胞中に見出される。従
って、培養液を濾過または遠心分離して得られる細胞か
ら、減圧下の濃縮、超音波処理などの細胞破砕、HPLC、
凍結乾燥、pH調節、樹脂（たとえばアニオンまたはカチ
オン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂）を用いての処理、
慣用の吸着剤（たとえば活性炭、珪素、シリカゲル、セ
ルロース、アルミナ）での処理、ゲル濾過、晶出などの
常法によって分離することができる。但し、本発明にお
いては、リゼイトを1N酢酸に対して透析し、酢酸に可溶
のIGF−Ｉと不溶のCd-LHとを分離した後、精製工程に付
す。

本発明のベクターを用いる方法によれば、血清からの
単離による従来の方法よりも高収率でMet-IGF−Ｉを大
量生産することができるばかりか、不純物の含有率を低
下させることができる。従って、本発明方法によって得
られたMet-IGF−Ｉは、種々の研究分野は勿論、骨細胞
の増殖および成長異常に係る種々の疾患、その他骨粗鬆
症、糖尿病、創傷、潰瘍等の治療に有用である。例え
ば、本発明のMet-IGF−Ｉを製薬業界周知の方法で適当
な剤形に製剤化し、経口または非経口的に用いることが
できる。

以下、実施例および製造例を挙げ、本発明をさらに詳
しく説明する。なお、以下の記載に用いた略語は次の意
味を有する。

DTT:ジチオスレイトール PAGE:ポリアクリルアミドゲル電気泳動 EtOH:エチルアルコール AcOH:酢酸製造例１ LH-RH遺伝子の調製 A.LH遺伝子（Fra−Ｂ−４）の調製 A.1 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション各オリゴヌクレオチド（A2-L2）（0.4mM）を、50mMTr
is-HCl（pH7.6）、20mMDTT、50μg/ml牛血清アルブミン
（以下、BSAという）、1mMスペルミジン、10mMMgCl₂お
よび2mMATPを含有する溶液40μｌ中でT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ2.5単位を用いて37℃で３時間りん酸化し
た。反応終了後、100℃で５分間ンキュベートして反応
混合物中の酸化を不活化した。りん酸化されたオリゴヌ
クレオチドと２種のオリゴヌクレオチド（AlおよびL3）
のライゲーションは第13図−５に示すようにして行い、
まず６断片を得、最終的にはクローニング用のLH遺伝子
（236bp）を得た。ライゲーションはT4DNAリガーゼ（５
単位）を用い、50mMATP（１μｌ）含有溶液中にて16℃
で５時間行った。各段階におけるオリゴヌクレオチドの
ライゲーション生成物は、Tris-EDTA緩衝液中２−16％
グラジェントPAGEで溶出した後、臭化エチジウム染色に
より同定した。

A.2 LH遺伝子のクローニングプラスミドpBR322をBamHIおよびEcoRIで消化した。65
℃で５分間加熱して反応を終了させ、0.5％アガロース
ゲル電気泳動によりDNA断片を分離した。大きなDNA断片
を回収し、LH遺伝子とT4DNAリガーゼとの存在下におい
て12℃で18時間ライゲートさせ、236bpのLH遺伝子を含
むプラスミドpLH107を得た。ライゲーション混合物を用
いてクッシュナー（Kushner）法［マニアティス（T.Man
iatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular C
loning）p.252（1982）コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリィ参照］により、E.coli HB101を形質転
換し、アンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン
（25μg/ml）含有プレート上で選択した。アンピシリン
に耐性でテトラサイクリンに感受性を示すクローンから
分離したプラスミドを、EcoRIおよびBamHIで消化し、適
当なサイズマーカーと比較すると予期した236bpのLH遺
伝子断片が生じていた。E.coli HB101形質転換体から得
たプラスミド（pLH107）は、制限酵素分析により、LH遺
伝子（236bp）を有することが特徴づけられた。

B.1 RH遺伝子（Fra−Ｂ−５）の調製各オリゴヌクレオチド（D3〜J5）（0.4mM）をA.1.に
記載のようにりん酸化した。りん酸化されたオリゴヌク
レオチドとオリゴヌクレオチドJ6のライゲーションを第
13図−５に示すようにして行い、まず断片７ブロックを
得、最終的にRH遺伝子（270bp）を得た。RH遺伝子をPAG
Eにより精製し、LH-RH遺伝子のクローニングに使用し
た。

Fra−Ｂ−４およびFra−Ｂ−５の合成に用いたオリゴ
ヌクレオチドおよび組立て模式図を第13図に示す。

B.2 LH-RH遺伝子のクローニング A.2で得たプラスミド（pLH107）をHind IIIおよびBam
HIで消化した。大きい方のDNA断片をアガロースゲル電
気泳動により回収し、続いてB.1に記載のRH遺伝子（270
pb）と、T4DNAリガーゼの存在下にライゲートさせた。
このライゲーション混合物を用いE.coli HB101を形質転
換した。この形質転換体から得たプラスミドｐγＦ−３
をEcoRI-BamHI消化に付し、LH-RH遺伝子（450bp）（Fra
−Ｂ−６）を得た。

製造例２ trpプロモーターII遺伝子の構築およびクロ
ーニング製造例１と同様にしてtrpプロモーターII遺伝子（Fra
−Ｂ−１）を構築した。trpプロモーターII遺伝子（Fra
−Ｂ−１）をpBR322のEcoRI-BamHI断片とライゲート
し、続いてライゲーション生成物でE.coli HB101を形質
転換した。^RAmpおよび^STetの形質転換体から得たプラス
ミドをHpaIで消化してバンド（4.1Kbp）を確認し、続い
てBamHIで消化し、PAGEで90bpのバンドを確認した。さ
らに、EcoRI-BamHI消化で得た56bpの断片をPAGEでサイ
ズマーカーと比較することにより確認した。このプラス
ミドをpTrpEB7と命名し、発現ベクターの構築に使用し
た（第３図）。Fra−Ｂ−１の合成に用いたオリゴヌク
レオチドおよびその組立て模式図を第14図に示す。

製造例３ trpプロモーターＩおよびtrpプロモーターII
Iを含有するプラスミドp322dtrpSの構築 A.プラスミドpBR322trp プラスミドpBR322（９μｇ）をEcoRIおよびBamHIで消
化した。65℃で５分間加熱して反応を止め、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動によって分離し、375bpの小さいDNA
断片（500ng）を得た。一方、製造例２で調製したプラ
スミドpTrpEB7（10μｇ）をEcoRIおよびBamHI消化に付
し、次いで、ゲル電気泳動にかけて大きいDNA断片（409
4bp、５μｇ）を得た。

このpTrpEB7のEcoRI-BamHI断片（4094bp、200μｇ）
をpBR322のEcoRI-BamHI断片（Fra−Ｂ−２、375bp、100
ng）と、T4リガーゼ（宝酒造、360unit）を含有するラ
イゲーション緩衝液（50mMTris-HCl、pH7.6、10mMMgC
l₂、20mMDTT、1mMATP、1mMスペルミジンおよび50μg/ml
BSA）（20μｌ）中、15℃で一夜ライゲーションを行っ
た。ライゲーション混合物でE.coli HB101を形質転換
し、テトラサイクリン含有（25μg/ml）プレート上でテ
トラサイクリン耐性形質転換体を得た。形質転換体から
単離した生成プラスミドpBR322trpを、EcoRIおよびBamH
I消化（375bp、4094bp）、並びにHpaI消化（4469bp）に
付し、7.5％PAGE並びに0.8％アガロースゲル電気泳動に
より、trpプロモーターＩ遺伝子の存在を確認した。

B.trpプロモーターIII遺伝子（Fra−Ｂ−３）の構築第15図に示した、ブロックＩ′、II′およびIII′の
各オリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ′）（各0.2nモル）をラ
イゲーション緩衝液（70μｌ）中、T4ポリヌクレオチド
キナーゼ（BRL、2.5単位）により、37℃において１時
間、りん酸化した。各ブロックの反応混合物にT4DNAリ
ガーゼ（300単位）と20mMATP（２μｌ）とを加え、得ら
れた混合物を15℃で30分間インキュベートした。65℃で
10分間加熱して反応を止めた。これらのブロック
（Ｉ′、II′およびIII′）の反応混合物を一緒にし、T
4DNAリガーゼ（360単位）と20mMATP（２μｌ）との存在
下、非りん酸化オリゴヌクレオチド（ＡおよびＮ′）と
混合した。15℃で１時間インキュベーションした後、最
終ライゲーション混合物を、２〜16％グラディエントPA
GEにかけて精製し、trpプロモーターIII遺伝子（105b
p）（Fra−Ｂ−３）を得た。Fra−Ｂ−３の合成に用い
たオリゴヌクレオチド、並びに組立て模式図を第15図に
示す。

C.プラスミドp322dtrpSの組立てプラスミドpBR322trpをEcoRIおよびCla消化に付し、
次いで、アガロースゲル電気泳動にかけ、大きいDNA断
片（4446bp）を得た。この断片と、上記Ｂで得たtrpプ
ロモーターIII遺伝子（105bp）とを、T4DNAリガーゼの
存在下で、ライゲートさせた。このライゲーション混合
物でE.coli HB101を形質転換し、アンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性の形質転換体を得た。この形質転換
体から分離したプラスミドp322dtrpSを、ClaI-BamHI（3
52bp）、HpaI（107bp）およびAat II-ClaI（287bp）に
よる制限エンドヌクレアーゼ分析に基づいて確認した。
p322dtrpSの組立て模式図を第４図に示す。

製造例４ LH-RH遺伝子とCd遺伝子の発現ベクターpCdγ
の構築 A.LH-RH発現ベクター（ｐγtrp）の構築製造例２で調製したtrpプロモーターIIベクター（pTr
pED7）をEcoRIおよびBamHIで消化し、アガロースゲル電
気泳動により大きなDNA断片（4.1kbp）を得た。このDNA
断片を、EcoRI-BamHI消化によりプラスミドｐγＥ−３
から調製したLH-RH遺伝子とライゲートした。このライ
ゲーション混合物を用いE.coli HB101を形質転換して、
アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質転換
体を得た。この形質転換体から得たプラスミドｐγtrp
をEcoRIおよびBamHIで消化し、7.5％PAGEでLH-RH遺伝子
（Fra−Ｂ−６、450bp）を確認した。

B.プラスミドpCdγの構築 B.1 trpプロモーターIII遺伝子の一部とCd遺伝子とを
含むDNA断片（Fra−Ｂ−７）の調製ブロックＩ″、II″およびIII″の各オリゴヌクレオ
チド（Nb1-Cd8）（各0.2nモル）をライゲーション緩衝
液（60μｌ）中、T4ヌクレオチドキナーゼ（2.5単位）
により、37℃で１時間、りん酸化した。各ブロックの反
応混合物に、T4DNAリガーゼ（360単位）とATP（２μ
ｌ）とを加え、混合物を15℃で１時間、インキュベート
した。これら各ブロック（Ｉ″、II″およびIII″）の
反応混合物を一緒にし、T4DNAリガーゼ（360単位）と20
mMATP（２μｌ）との存在下、15℃で一夜インキュベー
トした後、80℃で10分間加熱した。この混合物に500mMN
aCl（20μｌ）とEcoRI（20単位）とを加えた。37℃で２
時間インキュベートした後、この最終ライゲーション産
物を15％PAGEで精製し、trpプロモーターIII遺伝子の一
部とCd遺伝子を含むDNA断片（124bp）（Fra−Ｂ−７）
を得た。Fra−Ｂ−７の合成に用いたオリゴヌクレオチ
ドおよび組立て模式図を第16図に示す。

B.2 プラスミドpCdγの構築およびクローニング A.で調製したプラスミドｐγtrp（4544bp）をHpaIお
よびEcoRI消化に付し、大きいDNA断片（4510bp）を得
た。このDNA断片とB.1.で調製した合成trpプロモーター
III遺伝子の一部とCd遺伝子とを含むDNA断片（124bp）
とをT4DNAリガーゼの存在下でライゲートさせた。この
ダイゲーション混合物をE.coli HB101に導入した。^RAmp
を示す形質転換体から得たプラスミドpCdγを、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析にかけ、ClaI-BamHI（543bp）、C
laI-Hind III（273bp）、ClaI-EcoRI（93bp）およびAat
II-ClaI（180bp）の各DNA断片により、確認した。プラ
スミドpCdγの組立て模式図を第５図に示す。

製造例５プラスミドpCdγtrpSdの構築およびクローニ
ング製造例４で調製したプラスミドpCdγをClaIおよびBam
HIで消化し、小さい断片（542bp、Fra−Ｂ−８）を得
た。このFra−Ｂ−８を、T4DNAリガーゼの存在下、製造
例3.Cで調製したプラスミドp322dtrpSのClaI-BamHI（42
23bp）とライゲートさせた。このライゲーション混合物
をE.coli HB101に導入した。^RAmpを示す形質転換体から
プラスミドpCdγtrpSdを得、制限エンドヌクレアーゼ分
析にかけて確認した。HpaI-BamHI（107、575bp）、ClaI
-BamHI（543bp）、PstI-EcoRI（1057bp）、EcoRI-BamHI
（450bp）、Hind III-BamHI（270bp）およびClaI-Hind
III（273bp）。プラスミドpCdγtrpSdの組立て模式図を
第６図に示す。

製造例６ α−hANP発現ベクターpCLaHtrpSdの構築およ
びクローニング A.リンカーDNA断片を伴ったα−hANP遺伝子（Fra−Ｂ−
９）の調製ブロックＩおよびIIの各オリゴヌクレオチド（AH
2-AH17）（各0.2nモル）を、ライゲーション緩衝液（70
μｌ）中、37℃において１時間、T4ヌクレオチドキナー
ゼ（2.5単位）により、りん酸化した。各ブロックの反
応混合物にT4DNAリガーゼ（300単位）と20mMATP（２μ
ｌ）とを加え、混合物を15℃で30分間ンキュベートし
た。65℃で10分間加熱して反応を止めた。２ブロック
（ＩおよびII）の反応混合物を一緒にし、T4DNAリ
ガーゼ（300単位）と20mMATP（２μｌ）との存在下、非
りん酸化オリゴヌクレオチド（AH1、AH18）と混合し
た。この混合物を15℃で１時間インキュベートした後、
最終ライゲーション産物を２−16％グラディエントPAGE
にかけて精製し、リンカーDNA断片を伴ったα−hANP遺
伝子（134bp、Fra−Ｂ−９）を得た。Fra−Ｂ−９の合
成に用いたオリゴヌクレオチドおよび組立て模式図を第
17図に示す。

B.プラスミドpCLaHtrpSdの構築およびクローニング製造例５で調製したプラスミドpCdγtrpSdをHind III
およびBamHIで消化して大きいDNA断片（4743bp）を得、
これと、A.で調製したリンカーDNA断片を伴ったαhANP
遺伝子（134bp）とをT4DNAリガーゼの存在下、ライゲー
トさせた。このライゲーション混合物をE.coli HB101に
導入し、形質転換体E.coli H1を得た。^RAmpを示す形質
転換体（E.coli H1）から、Cd-LH−α−hANP遺伝子（Cd
-LHとα−hANPとの融合ペプチドをコードする遺伝子）
を含むプラスミドpCLaHtrpSdを得た。このプラスミドを
制限エンドヌクレアーゼ分析にかけて確認した。Aat II
−ClaI（287bp）、ClaI-BamHI（407bp）、ClaI-EcoRI
（93、198bp）、EcoRI-BamHI（116、198bp）、Hind III
-BamHI（134bp）およびHpaI-BamHI（107、439bp）。プ
ラスミドpCLaHtrpSdの組立て模式図を第６図に示す。

製造例７ LH発現ベクター（pLHtrp）の構築製造例２で製造したtrpプロモーターIIベクター（pTr
pEB7）をEcoRIとBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳
動により大きなDNA断片（4.1kbp）を得た。このDNA断片
をEcoRI-BamHI消化によりプラスミドpLH107から調製し
たLH遺伝子（Fra−Ｂ−４）とライゲートさせた。ライ
ゲーション混合物を用いてEcoli HB101を形質転換し、
アンピシリンに耐性でテトラサイクリン感受性を示す形
質転換体を得た。形質転換体から得たプラスミドpLHtrp
をEcoRIとBamHIで消化し、7.5％PAGEにLH遺伝子（236b
p）を確認した。プラスミドpLHtrpの組立て模式図を第
７図に示す。

製造例８ IGF−Ｉ発現ベクターpLHSdMmtrpの構築 A.IGF−Ｉ遺伝子の製造 A.1 IGF−Ｉ遺伝子（Fra−Ｂ−10）の調製各オリゴヌクレオチド（A1-01）（0.4nM）を、74mM T
ris-HCl（pH7.6）,10mM DTT,1.6mMメルカプトエタノー
ルm,10mM MgCl₂および0.5mMATPを含有する溶液100μｌ
中でT4ポリヌクレオチドキナーゼ（BRL製）を用い37℃
で20分間りん酸化した。反応終了後、100℃で５分間イ
ンキュベートして反応混合物名の酵素を不活性化した。
りん酸化オリゴヌクレオチドのライゲーションは第18図
３に示すようにして行い、まず10ブロックを得、最終的
にはクローニング用のIGF−Ｉ遺伝子を得た。ライゲー
ションはT4DNAリガーゼ（７単位）を用い、100mMATP
（0.5μｌ）含有溶液中にて４℃で23時間（標準条件）
行った。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲー
ション生成物を、Tris-EDTA緩衝溶液中２−16％グラデ
ィエントPAGEで、臭化エチジウム染色により同定した。

A.2 IGF−Ｉ遺伝子のクローニングプラスミドpBR322をBamHIおよびEcoRIで消化した。反
応を65℃で５分間加熱して終了させ、得られたDNA断片
を0.5％アガロースゲル電気泳動により分離した。

pBR322由来の大きなDNA断片3985bpを回収し、T4DNAリ
ガーゼと12℃で18時間ライゲートし、224bp IGF−Ｉ遺
伝子を得た。ライゲーション混合物を用いてクッシュナ
ー法により、E.coli HB101を形質転換し、アンピシリン
耐性形質転換体をテトラサイクリン（25μg/ml）を含有
するプレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテト
ラサイクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離
したプラスミドをEcoRIおよびBamHIで消化し、適当なサ
イズマーカーと比較すると予期した224bp IGF−Ｉ遺伝
子が生じていた。IGF−Ｉ遺伝子の完全なヌクレオチド
配列によって特徴づけられるこのプラスミドをpSdM1と
命名した。

IGF−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列並びに制限部位を第１図に示す。

B.IGF−Ｉ発現ベクターpLHSdMmtrpの構築 A.2で調製したプラスミドpSdM1をEcoRIとBamHIで消化
し、IGF−Ｉ遺伝子（224bp）を得た。一方、オリゴヌク
レオチドm2を製造例８、A.1に記載したようにT4ポリヌ
クレオチドキナーゼでりん酸化した。このりん酸化オリ
ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドm1およびIGF−Ｉ
遺伝子（224bp）を混合し、100mM ATPを含有する溶液中
でT4リガーゼを用い４℃で20時間処理した。ライゲーシ
ョン混合物をBamHIで消化し、次いでPAGEで精製し、リ
ンカーDNA断片を伴ったIGF−Ｉ遺伝子（242bp、Fra−Ｂ
−11）を得た。この遺伝子を、Hind III-BamHI消化によ
りpLHtrpから得たDNA断片とライゲートし、ライゲーシ
ョン混合物を用いてE.coli HB101を形質転換した。生成
プラスミドpLHSdMmtrpを含有するE.coli HB101をE.coli
F−６と命名した。形質転換体から得たプラスミドpLHS
dMmtrpをEcoRI-BamHI（198、224bp）、Hind III-BamHI
（242bp）およびHpaI-BamHI（456bp）で消化し、7.5％P
AGEにてtrpプロモーターＩ遺伝子、LHおよびIGF−Ｉ遺
伝子を確認した。プラスミドpLHSdMmtrpの組立て模式図
を第７図に示す。

Fra−Ｂ−10およびFra−Ｂ−11のためのオリゴヌクレ
オチド、並びにFra−Ｂ−10の組立て模式図を第18図に
示す。

製造例９ trpプロモーターIII遺伝子を有するプラスミ
ドpBR322trpSsの構築およびクローニングプラスミドpBR322をEcoRIおよびClaIで消化した。大
きいDNA断片（4340bp）を0.8％アガロースゲル電気泳動
にかけて精製し、1mM AMPの存在下、合成trp IIIプロモ
ーター遺伝子（Fra−Ｂ−３）とライゲートした。ライ
ゲーション混合物を用いてE.coli HB101を形質転換し
た。形質転換体のクローンからプラスミドpBR322trpSs
を単離し、制限エンドヌクレアーゼ分析により、確認し
た。HpaI（4445bp）、ClaI-PstI（834bp）。pBR322trpS
sの組立て模式図を第10図に示す。

製造例10 プラスミドpCLaHtrp−２の構築 trpプロモーターIII遺伝子のコントロール下に、Cdと
LHの融合ペプチドをコードする遺伝子、並びにα−hANP
をコードする遺伝子を含むプラスミドpCLaHtrp−２を以
下の如くにして組立てた。即ち、製造例6.Bで調製した
プラスミドpCLaHtrpSdをClaIおよびBamHIで消化し、小
さいDNA断片（406bp、Fra−Ｃ−２）を得た。他方製造
例９で調製したプラスミドpBR322trpSsをClaIおよびBam
HIで消化して大きいDNA断片（4093bp）を得た。これら
の断片をライゲートし、ライゲーション混合物を用いて
E.coli HB101を形質転換し、形質転換体クローンから所
望のプラスミドpCLaHtrp−２を単離し、制限エンドヌク
レアーゼにより、特性化を行った。ClaI-PstI（834b
p）、ClaI-BamHI（406bp）。プラスミドpCLaHtrp−２の
組立て模式図を第10図に示す。

製造例11 fdファージターミネーターを有するα−hANP
発現ベクターpCLaHtrp3tの構築 A.fdファージターミネーターの調製およびクローニング fdファージターミネーター（Fra−Ｃ−１）を、製造
例3.B.と同様にして調製した。用いたオリゴヌクレオチ
ドを以下に示す。

Fra−Ｃ−１（１） HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpApTpCpApAOH （T1）（２） HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpGpApTpCpTpCpGpApGOH
（T2）（３） HOTpTpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpTpTpGpGpAOH（T
3）（４） HOApApApApApGpGpCpTpCpCpApApApApGpGpAOH（T
4）（５） HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTpGOH （T5）（６） HOTpCpGpApCpApApApApAOH （T6）（式中、Ap、Gp、CpおよびTpは、それぞれデオキシア
デニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸お
よびデオキシチミジル酸を表す。）なお、Ap、Gp、CpおよびTpの意味するところは第13図
〜第19図においても同様である。

DNAオリゴマーT2、T3、T4およびT5（各0.4nモル）を
混合し、1mM ATPの存在下、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼにより、りん酸化した。反応混合物を65℃で10分間加
熱して酵素を不活化した。得られた混合物に、DNAオリ
ゴマーT1およびT6（0.8nモルづつ）、並びにT4DNAリガ
ーゼを加えた。混合物を15℃で30分間インキュベート
し、２→16％グラディエント・ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけた。所望のDNA断片（47bp）を溶出して
回収し、BamHIおよびSalI消化pBR322の大きいDNA断片
（4088bp）とライゲートし、プラスミドpter21を得た。
このプラスミドを制限酵素分析にかけ、BamHI-SalI（47
bp）、AvaI（817bp）を確認した。

B.プラスミドpCLaHtrp3tの構築およびクローニング製造例10で調製したプラスミドpCLaHtrp−２をPstIお
よびBamHIで消化し、小さいDNA断片（1241bp）を単離
し、プラスミドpter21のPstIおよびBamHI消化による制
限フラグメント（3005bp）とライゲートした。

ライゲーション混合物をE.coli HB101に導入して形質
転換体E.coli H2を得た。RAmpを示す形質転換体（E.col
i H2）から得たプラスミドpCLaHtrp3t（Cd-LHとα−hAN
Pの融合ペプチドをコードする遺伝子を含有）を、制限
エンドヌクレアーゼ分析に付し、ClaI-EcoRI（939bp、1
98bp）、Hind III-BamHI（134bp）およびPstI-ClaI-Xha
I（834bp、411bp）の各DNA断片を確認した。プラスミド
pCLaHtrp3tの組立て模式図を第11図に示す。

実施例１ IGF−Ｉ発現ベクター、プラスミドpCE-SMtrp
の構築 A.2シストロン性発現ベクターを得るためのDNA断片（Fr
a−Ａ−７）の調製 A.1 SD配列を含むFra−Ａ−２の調製 DNAオリゴマーＳ、Ｔ、CT₁、CT₂、CT₃、CT₄（各0.4nm
ol）をライゲーション緩衝液［50mM TRIS-HCl（pH7.
6）,10mM MgCl₂,20mMジチオスレイトール,1mM ATP,1mM
スペルミジン,50μｇ牛血清アルブミン，液量130μｌ］
に移し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造,5unit）
を加えて37℃で１時間インキュベーションした。反応液
に20mM ATP（３μｌ）とT4リガーゼ（宝酒造,875unit）
を加え15℃で30分インキュベーションした。生成した46
bp DNA断片（Fra−Ａ−１）を含むライゲーション混合
液を65℃で20分加熱して酵素を失活させてのち、500mM
NaCl（14μｌ）とClaI（10unit）を加えて37℃で２時間
インキュベーションした。反応混合物を２→16％グラデ
ィエントPAGEで精製し、35bpのDNAフラグメント（Fra−
Ａ−２、300ng）を得た。

A.2 Fra−Ａ−３（44bpのDNA断片）の調製 Fra−Ａ−２（300ng）、CT₅、CT₆（各0.4nmol）とT4
リガーゼ（350unit）をライゲーション緩衝液（20μ
ｌ）に移し、15℃で30分インキュベーションした。ライ
ゲーション混合物を2.25％アガロースゲル電気泳動（2.
25％ AGE）で精製し、44bpのDNAフラグメント（Fra−
Ａ−３、100ng）を得た。

A.3 Fra−Ａ−５の調製製造例8.Bで調製したpLHSdMmtrp（IGF−Ｉ融合物発現
ベクター4.5kbp、10μｇ）をHind IIIとBamHIで処理し
て242bpのIGF−Ｉ−DNA断片（Fra−Ａ−４、300ng）を
得た。このDNAを更にAva IIで切断して215bpのDNA断片
（Fra−Ａ−５、100ng）を得た。

A.4 ２シストロン性発現ベクターを得るためのDNA断片
（Fra−Ａ−７）の調製 Fra−Ａ−３（100ng）、Fra−Ａ−５（100ng）及びT4
リガーゼ（350unit）をライゲーション緩衝液（12μ
ｌ）に移し、４℃で一夜インキュベーションした。反応
混合液（Fra−Ａ−６を含有）を65℃で10分加熱した
後、BamHI（5unit）とHind III（5unit）で処理した。
反応混合物を2.25％PAGEで精製して238bpのFra−Ａ−７
（30ng）を得た。

B.pCE-SMtrpの構築製造例６で調製したα−hANP発現ベクター、pCLaHtrp
Sd（約4.6kbp,10μｇ）をHind IIIとBamHIで切断した。
0.8％PAGEで精製し大きい方のDNA断片（約4.5kb,5μ
ｇ）を得た。このDNA断片（200ng）とFra−Ａ−７（30n
g）とをライゲーション緩衝液（20μｌ）に移し、T4リ
ガーゼ（350unit）を加えて15℃で30分インキュベーシ
ョンした。ライゲーション混合物を用いてE.coli DH−
１を形質転換した。^RAmpを有する形質転換体からプラス
ミドを抽出し、制限酵素分析により目的とするプラスミ
ドpCE-SMtrpであることを確認した。pCE-SMtrpの組立て
模式図を第９図に示す。制限酵素分析:ClaI-EcoRI:93,1
93bp、EcoRI-Hind III:180bp、Hind III-BamHI:238bp、
HpaI-BamHI:107、544bp。プラスミドpCE-SMtrpをE.coli
HB101に導入し、形質転換体HB101/pCE-SMtrpを調製し
た。

実施例２ IGF−Ｉ発現ベクター、プラスミドpCE-SM3t
の構築 trpプロモーターIII遺伝子（105bp）、融合α−hANP
遺伝子（406bp）、およびfdファージターミネーター（4
7bp）を含有するプラスミドpCLaHtrp3t（製造例11にお
いて調製）をHind IIIおよびBamHIで消化し、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動にかけて大きい断片（4137bp）を単
離した。次いで、実施例１で調製したプラスミドpCE-SM
trpをHind IIIとBamHIで消化し、得られた小さいDNA断
片（238bp）（Fra−Ａ−７）を上記のDNAフラグメント
（4137bp）にライゲートさせた。このライゲーション混
合物を用いてE.coli HB101を形質転換した。形質転換体
クローンから組換えプラスミドを単離し、制限エンドヌ
クレアーゼ分析によって確認した（ClaI、286bp）。プ
ラスミドpCE-SM3tの組立て模式図を第12図に示す。

実施例３ E.coli HB101/pCE-SMtrpによるIGF−Ｉの生
産 A.IGF−Ｉ遺伝子の発現 E.coli HB101をプラスミドpCE-SMtrpで形質転換し、
得られた形質転換体E.coli HB101/pCE-SMtrpの単一コロ
ニーを50μg/mlのアンピシリンを含むＬ培地（LAブロ
ス:5ml）に移し37℃で８時間培養した。培養液をLAブロ
ス（100ml）に移し37℃で終夜培養した。終夜培養液（2
0ml）をM9CA培地［0.5％カザミノ酸、0.2％グルコー
ス、チアミンHCl（50μg/ml），アンピシリン（25μg/m
l）;400ml］に添加し、37℃でA600（600nmにおける吸光
度）が0.5になるまで培養した。培地にIAA（β−インド
ールアクリル酸、2mg/mlEtOH;2ml）を加え、更に３時間
培養した（最終Ａ₆₀₀＝1.40）。培養液を４℃、6000rpm
で５分間遠心し、集菌した。

B.発現したタンパク質の単離、精製湿菌体を10mM PBS-EDTA緩衝液［NaCl（8.0g）,KCl
（0.2g），Na₂HPO₄・12H₂O（2.9g），KH₂PO₄（0.2g）,E
DTA（3.73g）/l（NaOHでpH8.0に調節）;8ml］に懸濁
し、０℃で超音波処理した。処理液を遠心（４℃,15000
rpm,20分）して上清を除いた。残渣をGn・HCl緩衝液（6
Mグアニジン・HCl,10mM PBS-EDTA,2mM β−メルカプト
エタノール;8ml］に懸濁し、再び０℃で超音波処理し
た。この懸濁液を遠心（４℃,15000rpm,20min）して、
上清を1M AcOH各100mlに対して３回透析した。透析液を
遠心（４℃,15000rpm,20min）して、上清を70％EtOH（7
00ml）に対して透析した。透析液にアセトン（30ml）を
加え−78℃で10分静置したのち、遠心（４℃,15000rpm,
20min）した。沈澱物を減圧乾燥して粗Met-IGF−Ｉを得
た。

粗生成物を10％β−メルカプトエタノールを含むGn・
HCl緩衝液に溶解し、逆相HLC で精製した。収量1.6mg。

C.発現タンパク質の同定精製したタンパク質を、Ｎ末端分析及びキモトリプシ
ン消化によるペプチドマッピングにかけ、Met-IGF−Ｉ
であることを確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はIGF−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミ
ノ酸配列の模式図、第２図（１）はプラスミドpCE-SMtr
pの制限部位および機能地図、（２）はプラスミドpCE-S
M3tの制限部位および機能地図、第３図はプラスミドptr
pEB7の組立て模式図、第４図はプラスミドp322dtrpSの
組立て模式図、第５図はプラスミドpCdγの組立て模式
図、第６図はプラスミドpCLaHtrpSdの組立て模式図、第
７図はプラスミドpLHSdMmtrpの組立て模式図、第８図は
２シストロン性発現ベクターを得るためのDNA断片（Fra
−Ａ−７）の組立て模式図、第９図はプラスミドpCE-SM
trpの組立て模式図、第10図はプラスミドpCLaHtrp2の組
立て模式図、第11図はプラスミドpCLaHtrp3tの組立て模
式図、第12図はプラスミドpCESM3tの組立て模式図、第1
3図はLH遺伝子およびRH遺伝子、Fra−Ｂ−４およびFra
−Ｂ−５の構築工程並びに用いたオリゴヌクレオチドを
示す模式図、第14図はFra−Ｂ−１の構築工程および用
いたオリゴヌクレオチドを示す模式図、第15図はFra−
Ｂ−３の構築工程および用いたオリゴヌクレオチドを示
す模式図、第16図はFra−Ｂ−７の構築工程および用い
たオリゴヌクレオチドを示す模式図、第17図はFra−Ｂ
−９の構築および用いたオリゴヌクレオチドを示す模式
図、第18図はFra−Ｂ−10の構築および用いたオリゴヌ
クレオチドを示す模式図、並びに内部SD配列を含有する
リンカーDNAを伴ったIGF−Ｉ遺伝子（Fra−Ｂ−11）の
構築のためのオリゴヌクレオチドの模式図、第19図はFr
a−Ａ−I,Fra−Ａ−IIおよびFra−Ａ−IIIの構築に用い
たオリゴヌクレオチドを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭59−203495（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−19493（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）プロモーター遺伝子：（ｂ） Met-IGF−Ｉのプロテアーゼによる分解を阻止
しうる分子量約500〜50,000の他のペプチドをコードす
る遺伝子を含む第１シストロン：および（ｃ） Met-IGF−Ｉ遺伝子を含む第２シストロンをこの順に含み、各シストロンの上流にSD配列をそれぞ
れ有するポリシストロン性発現ベクターであって、大腸
菌内でMet-IGF−Ｉを生産するための発現ベクター。
【請求項２】他のペプチドが酸性ペプチドである第１項
記載のベクター。
【請求項３】他のペプチドがCd-LHである第１項記載の
ベクター。
【請求項４】第１シストロンと第２シストロンとが、シ
ストロン連結配列によって連結されており、該シストロ
ン連結配列は、第１シストロンに含まれる翻訳停止信号
と第２シストロンに含まれる翻訳開始信号とが重複して
いるか、隣接しているか、または１または２個のヌクレ
オチドを介して接しているヌクレオチド配列で示される
ものである、第１〜３項のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】プロモーター遺伝子がtrpプロモーター遺
伝子である第１〜４項のいずれかに記載の発現ベクタ
ー。
【請求項６】シストロン連結配列がTAATGである第１〜
５項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項７】第２シストロンの転写終止配列がプラスミ
ドpBR322由来の終止配列またはfdファージ由来の終止配
列である第１〜６項のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】プラスミドである第１〜７項のいずれかに
記載の発現ベクター。
【請求項９】プラスミドpCE-SMtrpまたはプラスミドpCE
-SM3tである第１〜８項のいずれかに記載の発現ベクタ
ー。
【請求項１０】大腸菌を、（ａ）プロモーター遺伝子：（ｂ） Met-IGF−Ｉのプロテアーゼによる分解を阻止
しうる分子量約500〜50,000の他のペプチドをコードす
る遺伝子を含む第１シストロン：および（ｃ） Met-IGF−Ｉ遺伝子を含む第２シストロンをこの順に含み、各シストロンの上流にSD配列をそれぞ
れ有するポリシストロン性発現ベクターであって、大腸
菌内でMet-IGF−Ｉを生産するための発現ベクターによ
って形質転換することにより得られる形質転換体。
【請求項１１】発現ベクターにおける他のペプチドが酸
性ペプチドである第10項記載の形質転換体。
【請求項１２】発現ベクターにおける他のペプチドがCd
-LHである第10項記載の形質転換体。
【請求項１３】発現ベクターにおける第１シストロンと
第２シストロンとが、シストロン連結配列によって連結
されており、該シストロン連結配列は、第１シストロン
に含まれる翻訳停止信号と第２シストロンに含まれる翻
訳開始信号とが重複しているか、隣接しているか、また
は１または２個のヌクレオチドを介して接しているヌク
レオチド配列で示されるものである、第10〜12項のいず
れかに記載の形質転換体。
【請求項１４】発現ベクターにおけるプロモーター遺伝
子がtrpプロモーター遺伝子である第10〜13項のいずれ
かに記載の形質転換体。
【請求項１５】発現ベクターにおけるシストロン連結配
列がTAATGである第10〜14項のいずれかに記載の形質転
換体。
【請求項１６】発現ベクターにおける第２シストロンの
転写終止配列がプラスミドpBR322由来の終止配列または
fdファージ由来の終止配列である第10〜15項のいずれか
に記載の形質転換体。
【請求項１７】発現ベクターがプラスミドである第10〜
16項のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１８】発現ベクターがプラスミドpCE-SMtrpま
たはプラスミドpCE-SM3tである第10〜17項のいずれかに
記載の形質転換体。
【請求項１９】大腸菌がエシェリヒア・コリ HB101で
ある第10〜18項のいずれかに記載の形質転換体。