JPS611396A - インスリン様成長因子ｉの製造法 - Google Patents
インスリン様成長因子ｉの製造法Info
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- JPS611396A JPS611396A JP5551485A JP5551485A JPS611396A JP S611396 A JPS611396 A JP S611396A JP 5551485 A JP5551485 A JP 5551485A JP 5551485 A JP5551485 A JP 5551485A JP S611396 A JPS611396 A JP S611396A
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- igf
- gene
- plasmid
- sequence
- peptide
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はヒトインスリン様成長因子Ｉ （以下Ｉ Ｇ
Ｆ−１と略称する）の製造法に関する。
Ｆ−１と略称する）の製造法に関する。
ところで、ヒトインスリン様成長因子Ｉは、ある種のホ
ルモンにより刺激されたヒトの組織、肝および腎におい
て主として合成される蛋白ホルモンであって、ヒト血清
中に見出される。
ルモンにより刺激されたヒトの組織、肝および腎におい
て主として合成される蛋白ホルモンであって、ヒト血清
中に見出される。
ＩＧＩ−１は、インスリン様の活性および軟骨による硫
酸塩取込みを刺激する活性を有するとともに細胞内での
蛋白およびＤＮＡの合成を増強することが、知られてい
る。
酸塩取込みを刺激する活性を有するとともに細胞内での
蛋白およびＤＮＡの合成を増強することが、知られてい
る。
従って、それは成長の促進に有用であり、また糖尿病の
臨床治療においても有用でありうる。
臨床治療においても有用でありうる。
Ｉ ＧＦ−１はヒト血清中に分泌される量がわずかであ
り、数トンのヒト血清から数■しか単離できない。なお
、Ｉ ＧＦ−１産生細胞から純粋な形で単離され、ＩＧ
Ｆ−１が上記の生物学的性質を有することが見出され、
そのアミノ酸配列が文献に報告されている。
り、数トンのヒト血清から数■しか単離できない。なお
、Ｉ ＧＦ−１産生細胞から純粋な形で単離され、ＩＧ
Ｆ−１が上記の生物学的性質を有することが見出され、
そのアミノ酸配列が文献に報告されている。
しかしながら、ＩＧＦ−１のより実行可能な商業的製造
法が必要であり、かかる必要性が本発明の完成に対する
刺激となった。
法が必要であり、かかる必要性が本発明の完成に対する
刺激となった。
組換えＤＮＡ （遺伝子組換え）技術ならびに関連技術
の適用が、最も有効なＩ Ｇ’Ｆ−１の大量製造法とな
ると考えられた。
の適用が、最も有効なＩ Ｇ’Ｆ−１の大量製造法とな
ると考えられた。
ＩＧＦ−Ｉは、次の配列の７０個のアミノ酸からなるこ
とが知られている。
とが知られている。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ １−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｇ ｌｙ−Ｓｅｒ−９ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−八
ｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ −Ａ
ｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ −Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａこの発明の発明者らは、以下
の諸必須工程を用いて大量のＩ ＧＦ−１を製造するこ
とに成功した。
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ １−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｇ ｌｙ−Ｓｅｒ−９ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−八
ｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ −Ａ
ｌａ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ −Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａこの発明の発明者らは、以下
の諸必須工程を用いて大量のＩ ＧＦ−１を製造するこ
とに成功した。
千■上
Ｉ ＧＦ−１をコードする遺伝子を製造するプロセス。
所望により、このプロセスに続いて、保護ペプチドをコ
ードする遺伝子を、ＩＧＦ−１をコ□□□−」 の、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉ （以下、融
合ＩＧＦ＝Ｉと呼ぶ）をコードする遺伝子を製造するプ
ロセスを設ける。
ードする遺伝子を、ＩＧＦ−１をコ□□□−」 の、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉ （以下、融
合ＩＧＦ＝Ｉと呼ぶ）をコードする遺伝子を製造するプ
ロセスを設ける。
適当な「リンカ−」には、Ｉ ＧＦ−１遺伝子の上流に
保護ペプチドを連結するための適当な制限酵素認識部位
をもち、数個のアミノ酸をコードする遺伝子が包含され
得て、「リンカ−」自身が該保護ペプチドを構成する。
保護ペプチドを連結するための適当な制限酵素認識部位
をもち、数個のアミノ酸をコードする遺伝子が包含され
得て、「リンカ−」自身が該保護ペプチドを構成する。
とくに好ましい「リンカ−」は後記の実施例中で例示さ
れているごときものである。
れているごときものである。
適当な「融合ＴＧＦ−■、すなわち保護ペプチドと融合
したＩＧＦ−１」は、後記の実施例において説明９例示
されるごときものである。
したＩＧＦ−１」は、後記の実施例において説明９例示
されるごときものである。
る遺伝子または融合ＩＧＦ−１をコードする遺伝子をプ
ラスミド中に挿入することからなる発現ベクター製造プ
ロセス。
ラスミド中に挿入することからなる発現ベクター製造プ
ロセス。
とくに適当な「発現ベクター」には、プラスミドｐｓｄ
Ｍ１−３２２・ｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐ、ｐＬＨ
３ｄＭｗｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐなどが含まれう
る。
Ｍ１−３２２・ｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐ、ｐＬＨ
３ｄＭｗｔｒｐ、ｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐなどが含まれう
る。
とくに適当な「プラスミド」には、ｐＢＲ３２２などが
含まれうる。
含まれうる。
工程３
前記発現ヘクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。
る形質転換体製造プロセス。
適当な「宿主生物」には、ｍエシェリキア°コリ （Ｅ
ｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｔ） （たとえばエ
シェリキア・コリＨＢＩＯＩなど）などが含まれろる。
ｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ ｃｏｌｔ） （たとえばエ
シェリキア・コリＨＢＩＯＩなど）などが含まれろる。
工程４
前記の形質転換体を適当な培地中で培養することからな
るＩＧＦ−Ｉまたは融合ＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。
るＩＧＦ−Ｉまたは融合ＩＧＦ−Ｉ製造プロセス。
■を単離するプロセス。
工程６ （任意）
前記融合ＩＧＦ−１を保護ペプチド脱離反応に付すこと
からなるＩＧＦ−■製造プロセス。
からなるＩＧＦ−■製造プロセス。
「融合Ｉ ＧＦ−１、すなわち保護ペプチドと融合した
ＩＧＦ−ＩＪなる表現における「保護ペプチド」は、宿
主生物細胞中でのプロテアーゼによる分解に対してＩＧ
ＦＩを保護するために使用され、該融合ＩＣＦ−１の脱
離反応によって除去される。
ＩＧＦ−ＩＪなる表現における「保護ペプチド」は、宿
主生物細胞中でのプロテアーゼによる分解に対してＩＧ
ＦＩを保護するために使用され、該融合ＩＣＦ−１の脱
離反応によって除去される。
すなわち、該融合ＩＧＦ−１は、脱離反応によってＩＧ
Ｆ−Ｉを調製するための中間体であり、従って該保護ペ
プチドは、天然または合成の蛋白、天然または合成のペ
プチド、あるいはそれらの断片から誘導された任意の脱
離可能な保護ペプチドでありうる。
Ｆ−Ｉを調製するための中間体であり、従って該保護ペ
プチドは、天然または合成の蛋白、天然または合成のペ
プチド、あるいはそれらの断片から誘導された任意の脱
離可能な保護ペプチドでありうる。
適当な［融合ＩＧＦ−［１には、ｉ）蛋白ペプチドのメ
チオニンを介してその蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−
ＩＸｉｉ）Ｍ白ペプチドのトリブトフプンを介してその
蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−１、あるいはｉｉｉ
）蛋白ペプチドの一〇１ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−を介して
その蛋白ペプチドと融合したＩ ＧＦ−Ｉが含まれうる
。
チオニンを介してその蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−
ＩＸｉｉ）Ｍ白ペプチドのトリブトフプンを介してその
蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−１、あるいはｉｉｉ
）蛋白ペプチドの一〇１ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−を介して
その蛋白ペプチドと融合したＩ ＧＦ−Ｉが含まれうる
。
この脱離反応に使用される適当な試薬には、臭化シアン
、（３−ブロム−２−０−ニトロフェニルスルフェニル
）スカトール（以下ＢＮＰＳ−スカトールと略称する）
、Ｎ−クロルスクシンイミド（以下ＮＣ３と略称する）
などが含まれる。
、（３−ブロム−２−０−ニトロフェニルスルフェニル
）スカトール（以下ＢＮＰＳ−スカトールと略称する）
、Ｎ−クロルスクシンイミド（以下ＮＣ３と略称する）
などが含まれる。
この工程では、蛋白ペプチドがそれのメチオニンを介し
てＩＧＦ−Ｉと融合している場合には、融合ＩＧＦ−’
Ｉは、臭化シアンを用いる脱離反応によって高収率でＩ
ＧＦ−１に転化できる。
てＩＧＦ−Ｉと融合している場合には、融合ＩＧＦ−’
Ｉは、臭化シアンを用いる脱離反応によって高収率でＩ
ＧＦ−１に転化できる。
また、蛋白ペプチドがそれのトリプトフアンを介してＩ
ＣＦ−１と融合している場合には、融合Ｉ ＧＦ−１は
、ＢＮＰＳ−スカトールまたはＮ−クロルスクシンイミ
ドを用いる脱離反応によってＩ ＧＦ−１に転化できる
。
ＣＦ−１と融合している場合には、融合Ｉ ＧＦ−１は
、ＢＮＰＳ−スカトールまたはＮ−クロルスクシンイミ
ドを用いる脱離反応によってＩ ＧＦ−１に転化できる
。
さらに、蛋白ペプチドがそれのｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−ｊを介してＩＧＦ−１と融合している場合には、
融合Ｉ ＧＦ−１は、コラゲナーゼを用いる脱離反応に
よってＩ ＧＦ−１に転化できる。
ｌａ−ｊを介してＩＧＦ−１と融合している場合には、
融合Ｉ ＧＦ−１は、コラゲナーゼを用いる脱離反応に
よってＩ ＧＦ−１に転化できる。
本脱離反応は、反応に悪影響を及ぼさない通常の溶媒中
で緩和な条件下に実施できる。
で緩和な条件下に実施できる。
上記Ｉ Ｇｌ−Ｉのアミノ酸配列から、いくつかの特定
の非自明の基準に従って、対応するヌクレオチド配列を
発明した。Ｉ ＧＦ−Ｉ遺伝子を、クローニングベクタ
ーとしての既知のプラスミドに挿入することによって、
クローン化した。組換えプラスミドからＩＧＦ−１遺伝
子を切出し、つぎに、プロモーターによる制御下でのＩ
ＣＦ−１遺伝子の発現を極大ならしめるように特にデザ
インされたプラスミド中にＩ ＧＦ−１遺伝子を挿入し
た。この場合、所望により、保護ペプチドをコードする
構造遺伝子が前記ＩＧＦ−１遺伝子の上流にかつそれに
隣接して挿入される。
の非自明の基準に従って、対応するヌクレオチド配列を
発明した。Ｉ ＧＦ−Ｉ遺伝子を、クローニングベクタ
ーとしての既知のプラスミドに挿入することによって、
クローン化した。組換えプラスミドからＩＧＦ−１遺伝
子を切出し、つぎに、プロモーターによる制御下でのＩ
ＣＦ−１遺伝子の発現を極大ならしめるように特にデザ
インされたプラスミド中にＩ ＧＦ−１遺伝子を挿入し
た。この場合、所望により、保護ペプチドをコードする
構造遺伝子が前記ＩＧＦ−１遺伝子の上流にかつそれに
隣接して挿入される。
以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発明はそれ
らに限定されるものではない。
らに限定されるものではない。
（１）ＩＧＦ−１遺伝子の調製とクローニング：（１）
Ｉ Ｇ Ｆ −１遺伝子の調製；遺伝暗号の多様性
のため、上記アミノ酸配列から、Ｉ ＧＦ−１をコード
する多数のヌクレオチド配列を予言することが可能であ
る。
Ｉ Ｇ Ｆ −１遺伝子の調製；遺伝暗号の多様性
のため、上記アミノ酸配列から、Ｉ ＧＦ−１をコード
する多数のヌクレオチド配列を予言することが可能であ
る。
多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。
定するに当って、いくつかの自明でない基準に従った。
まず、使用する予定の宿主生物に受容れられうるトリヌ
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよう
、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが望
ましい。
クレオチドコドンを使用すべきである。第二に、その配
列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できるよう
、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつことが望
ましい。
さらに、周知のクローニングベクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきである。第三に、
合成が不必要に複雑であってはならず、また、遺伝子の
組立てを容易にすべく、誤まった交差ハイブリッド化を
極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル（ｏｆｆ−ｄ
ｉａｇｏｎａ＋）な相互反応をできるだけ避けるように
すべきである。
るような部位を選択するようにすべきである。第三に、
合成が不必要に複雑であってはならず、また、遺伝子の
組立てを容易にすべく、誤まった交差ハイブリッド化を
極少にして、不可逆的なオフダイアゴナル（ｏｆｆ−ｄ
ｉａｇｏｎａ＋）な相互反応をできるだけ避けるように
すべきである。
ｒＴＧＦ−Ｉ遺伝子部分をコードするために選んだ好ま
しい配列を一例を以下に示すことができる： Ｇｌｙ Ｐｒ。
しい配列を一例を以下に示すことができる： Ｇｌｙ Ｐｒ。
Ｃｏｄｉｎｇ ＝ ５’−ＧＧＴ−ＣＣＴ−
Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ： ３’ −ＣＣＡ−Ｇ
ＧＡ−Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−Ａ
ＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ
−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−
ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＭ−ＣＴ
Ｇ−ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇａｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＰ
ｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕＧｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ ＬｙｓＳｅｒ Ａ
ｌａ ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ ＡＧＧ−ＣＧＣ−５’ この明細書における配列の表示において、Ａ。
Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ： ３’ −ＣＣＡ−Ｇ
ＧＡ−Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−Ａ
ＣＴ−ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ
−ＧＴＴ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−
ＡＣＧ−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＭ−ＣＴ
Ｇ−ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇａｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＰ
ｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ ＧｌｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕＧｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ ＬｙｓＳｅｒ Ａ
ｌａ ＴＣＣ−ＧＣＧ−３’ ＡＧＧ−ＣＧＣ−５’ この明細書における配列の表示において、Ａ。
Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意味する：また、
５′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次式を意
味する： そして、３′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ
次式を意味する： 上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮に入れると
き、次の少しく長い配列を選択することができる。
５′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次式を意
味する： そして、３′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ
次式を意味する： 上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮に入れると
き、次の少しく長い配列を選択することができる。
実際、この発明の適当な実施態様として、ＥＣｏＲＩお
よびＢａｍＨ１部位を選択して、それぞれ５′末端およ
び３′末端に導入することができる。
よびＢａｍＨ１部位を選択して、それぞれ５′末端およ
び３′末端に導入することができる。
さらに、メチオニンコドン（ＡＴＧ）を、ＩＣＦ−Ｉの
Ｎ末端アミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿入
し、２種の停止コドン（ＴＧＡおよびＴＡＧ）を、Ｃ末
端コドンの下流に、これに隣接して、挿入した。
Ｎ末端アミノ酸コドンの上流に、これに隣接して、挿入
し、２種の停止コドン（ＴＧＡおよびＴＡＧ）を、Ｃ末
端コドンの下流に、これに隣接して、挿入した。
（Ａｖａ工工）
ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒ。
コードする鎖： ５ ’ −ＭＴＴＣ
−ＡＴＧ−ＧＧＴ−ＣＣＴ−ヨードしない鎖、
３ ’ −Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−ＡＣＴ−
ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ−ＧＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ
−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−
ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ、Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＰｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌ
ａ Ｐｒｏ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ
Ａｓｐ ＧｌｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ
八ｒｇ ＬｅｕＧｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ 八１ａＬｙ
ｓ’ＧＡＡ−ＡＴＧ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ
−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＪ端−ＣＴＴ−
ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−Ｔ
ＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−Ｓｅｒ Ａｌａ ５ｔ
ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ１本発明は、相当する多数の
オリゴヌクレオチドブロックのハイブリッド化およびラ
イゲーションからなることを特徴とする、前記のごとき
遺伝子の製造方法にも関するものである。
−ＡＴＧ−ＧＧＴ−ＣＣＴ−ヨードしない鎖、
３ ’ −Ｇ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ ＡｌａＧＭ−ＡＣＴ−
ＣＴＧ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＭ−ＣＴＧ−ＧＴ
Ｔ−ＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＴＧＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ
−ＣＣＧ−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−
ＣＧＡ−Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ、Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＴｙｒＰｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＳｅｒＡｒｇ Ａｒｇ Ａｌ
ａ Ｐｒｏ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ
Ａｓｐ ＧｌｕＣｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ
八ｒｇ ＬｅｕＧｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ 八１ａＬｙ
ｓ’ＧＡＡ−ＡＴＧ−ＴＡＣ−ＴＧＴ−ＧＣＴ−ＣＣＡ
−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−ＡＪ端−ＣＴＴ−
ＴＡＣ−ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−Ｔ
ＴＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＴＴＴ−Ｓｅｒ Ａｌａ ５ｔ
ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ１本発明は、相当する多数の
オリゴヌクレオチドブロックのハイブリッド化およびラ
イゲーションからなることを特徴とする、前記のごとき
遺伝子の製造方法にも関するものである。
（ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成：
実際、３０種の合成オリゴヌクレオチドを作成すること
によって、上記の拡張された配列を有する分子を合成す
ることとした。それら合成オリゴヌクレオチドを所定の
段階でハイブリッド化し、ライゲートするとき、上記の
二重鎖ヌクレオチド配列を与えるものである。
によって、上記の拡張された配列を有する分子を合成す
ることとした。それら合成オリゴヌクレオチドを所定の
段階でハイブリッド化し、ライゲートするとき、上記の
二重鎖ヌクレオチド配列を与えるものである。
この明細書におけるオリゴヌクレオチド類の合成に関す
る記載においては、次の略号を用いる。
る記載においては、次の略号を用いる。
Ａｐ、Ｇｐ、ＣｐおよびＴｐは、そ′れぞれ次式を意味
する： また、３′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次式
を意味する： Ａ”ｐ ｏ、 ＧＩＢｐ ｏ、 Ｃｌ１ｌＩｐ ｏ、
Ｔｐ ｏおよびＡＣＵｐＯは、それぞれ次代を意味する
。
する： また、３′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次式
を意味する： Ａ”ｐ ｏ、 ＧＩＢｐ ｏ、 Ｃｌ１ｌＩｐ ｏ、
Ｔｐ ｏおよびＡＣＵｐＯは、それぞれ次代を意味する
。
ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｂはアデニニル
、グアニニル１ シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保護基は示さない）、Ｕはウラシルであり、 ＡＣはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。
、グアニニル１ シトシニルおよびチミニル（便宜上、
保護基は示さない）、Ｕはウラシルであり、 ＡＣはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。
オリゴヌクレオチド類は次の通りである：（１１ＨＯ八
へＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｌ
ｌ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐ
ＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２）（３） ＨＯＣｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ
（Ｂｌｌ（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＤＩ）（８１
ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｄ２）（９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ（
Ｅｌｌ（１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣ
ｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｅ２）（１１）
ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣ
ｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌ）（１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐ
ＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧ
ＯＨ（Ｆ２）＋１３１ ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）
（１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）（１５１ＨＯＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴ
ｐＣＯＨ（Ｈｌｌ（１６） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐ
ＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｉ（２
）（１７） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（工１）（１８１ＨＯＣ
ｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＣｐＴｐＧＯＨ（Ｉ２１（１９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｊｌ）＋２０１ ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ（Ｊ２１（２１
） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌｌ（２２） ＨＯＧｐ
ＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣＯＨ（Ｋ２）（２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｌｌ）
（２４） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｌ２）（２５）
ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｍｌｌ（２６１ＨＯＴＰＴＰ
ＣＩ）ＡｐＧＰＴＰＧｐＧＰＡＰＧＰＣＰＡＰＣＰＡＰ
ＧＯＨ（Ｍ２）（２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｎｌ）（
２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２）（２９） ＨＯＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨ１０１）（３０） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（０２）その逐次カップ
リング反応を第１表に示す。
へＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ａｌ
ｌ（２） ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐ
ＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２）（３） ＨＯＣｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧＯＨ
（Ｂｌｌ（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＤＩ）（８１
ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴ
ｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｄ２）（９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＧｐＴｐＧｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ（
Ｅｌｌ（１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣ
ｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｅ２）（１１）
ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣ
ｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｆｌ）（１２） ＨＯＧｐＧｐＴｐ
ＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧ
ＯＨ（Ｆ２）＋１３１ ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）
（１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）（１５１ＨＯＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＧｐＴ
ｐＣＯＨ（Ｈｌｌ（１６） ＨＯＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐ
ＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡＯＨ（Ｉ（２
）（１７） ＨＯＧｐＣｐＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧＯＨ（工１）（１８１ＨＯＣ
ｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐ
ＣｐＴｐＧＯＨ（Ｉ２１（１９） ＨＯＧｐＴｐＡｐＴ
ｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｊｌ）＋２０１ ＨＯＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ
ｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴＯＨ（Ｊ２１（２１
） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｋｌｌ（２２） ＨＯＧｐ
ＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣＯＨ（Ｋ２）（２３） ＨＯＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｌｌ）
（２４） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｌ２）（２５）
ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｍｌｌ（２６１ＨＯＴＰＴＰ
ＣＩ）ＡｐＧＰＴＰＧｐＧＰＡＰＧＰＣＰＡＰＣＰＡＰ
ＧＯＨ（Ｍ２）（２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｎｌ）（
２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２）（２９） ＨＯＡｐ
ＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨ１０１）（３０） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨ（０２）その逐次カップ
リング反応を第１表に示す。
城 旨
モノ （またはジ、あるいはトリ）マー（Ｉ）は、広瀬
の方法（Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素ｌ５Ｓ
Ｎ、主５，２２５ （１９８０） 、日本で発行）によ
って調製でき、カップリングはリン酸トリエステル法（
Ｒ，Ｃｒｅａ ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、 ８． ２３３１ ＜１９８０）お
よびＭ、’ Ｌ、 Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ９．
１６９１ （１９８１） ）により、セルロース担体
上で実施できる。
の方法（Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸、酵素ｌ５Ｓ
Ｎ、主５，２２５ （１９８０） 、日本で発行）によ
って調製でき、カップリングはリン酸トリエステル法（
Ｒ，Ｃｒｅａ ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、 ８． ２３３１ ＜１９８０）お
よびＭ、’ Ｌ、 Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ＋Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ９．
１６９１ （１９８１） ）により、セルロース担体
上で実施できる。
とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌクレオチドＨ
ＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐ
ＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成に関して、合成法を
説明することとする。ヘキサデカヌクレオチド０１合成
のフローチャートを第２表に示す。
ＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐ
ＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成に関して、合成法を
説明することとする。ヘキサデカヌクレオチド０１合成
のフローチャートを第２表に示す。
（ｉｉ ）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド
化とライゲーション 第１図に示した所望しない相互反応の可能性を極小にす
るために、一連の工程においてオリゴヌクレオチド類を
ハイブリッド化し、ライゲートする。第１図では、オリ
ゴヌクレオチドを トーー（・は５′−ホスホリル化末
端を意味する）で表わし、ブロックされたオリゴヌクレ
オチド類はたとえば←ニーー（シシはライゲーションの
位置を意味する）で表わしである。ライゲーションはＴ
４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われる。
化とライゲーション 第１図に示した所望しない相互反応の可能性を極小にす
るために、一連の工程においてオリゴヌクレオチド類を
ハイブリッド化し、ライゲートする。第１図では、オリ
ゴヌクレオチドを トーー（・は５′−ホスホリル化末
端を意味する）で表わし、ブロックされたオリゴヌクレ
オチド類はたとえば←ニーー（シシはライゲーションの
位置を意味する）で表わしである。ライゲーションはＴ
４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われる。
オリゴヌクレオチドＡｌ、ＢｌおよびＡ２ｉ’−Ｃ１、
Ｂ２およびＣ％；Ｄｉ、ＥｌおよびＢ２；ＦｌおよびＦ
２．Ｇ１．ＨｌおよびＧ２；１１．Ｎ２および１２ｉＪ
１．ＫｌおよびＪ２；ＬＩ、に２およびＬ２；Ｍｌ、Ｎ
ｌよびＭ２ならびに０ＩＮ２および０２をハイブリッド
化し、ライゲートして、それぞれ相当するブロック１〜
１０を得た。
Ｂ２およびＣ％；Ｄｉ、ＥｌおよびＢ２；ＦｌおよびＦ
２．Ｇ１．ＨｌおよびＧ２；１１．Ｎ２および１２ｉＪ
１．ＫｌおよびＪ２；ＬＩ、に２およびＬ２；Ｍｌ、Ｎ
ｌよびＭ２ならびに０ＩＮ２および０２をハイブリッド
化し、ライゲートして、それぞれ相当するブロック１〜
１０を得た。
この場合、オリゴヌクレオチドＡＩ、ＢｌおよびＡ２な
らびにＯｆ、Ｎ２および０２からそれぞれ得たブロック
１および１０を互いにハイブリッド化し、ライゲートし
て、ダイマーを形成させた。
らびにＯｆ、Ｎ２および０２からそれぞれ得たブロック
１および１０を互いにハイブリッド化し、ライゲートし
て、ダイマーを形成させた。
ブロック２と３；４と５；６と７および８と９をハイブ
リッド化し、ライゲートして、それぞれブロック１１，
１２．１３および１４を得た。ブロック１，１５．１６
および１０をハイブリッド化し、ライゲートし、かくし
て得たライゲーション生成物を、ＥｃｏＲＩおよび１３
ａｍＨＩで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩ
ＧＦ−Ｉを得た。
リッド化し、ライゲートして、それぞれブロック１１，
１２．１３および１４を得た。ブロック１，１５．１６
および１０をハイブリッド化し、ライゲートし、かくし
て得たライゲーション生成物を、ＥｃｏＲＩおよび１３
ａｍＨＩで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩ
ＧＦ−Ｉを得た。
（２１Ｉ Ｇ Ｆ−Ｉ遺伝子のクローニング：ＩＣＦ−
１遺伝子のクローニングのため、これを、Ｉ ＧＦ−１
遺伝子を挿入できる適当な酵素認 −議部位をもつ適切
なプラスミド、すなわちクローニングベクターに挿入す
る。
１遺伝子のクローニングのため、これを、Ｉ ＧＦ−１
遺伝子を挿入できる適当な酵素認 −議部位をもつ適切
なプラスミド、すなわちクローニングベクターに挿入す
る。
この発明の適当な一興体化例として、エシェリキア・コ
リ （以下旦、 ｃｏｌｉ）での発現のために合成した
Ｉ ＧＦ−１を旦、匝旦由来のプラスミド（たとえばｐ
Ｂ、Ｒ３２２など）に挿入し、クローニングを行った。
リ （以下旦、 ｃｏｌｉ）での発現のために合成した
Ｉ ＧＦ−１を旦、匝旦由来のプラスミド（たとえばｐ
Ｂ、Ｒ３２２など）に挿入し、クローニングを行った。
たとえば、第２図に示された通りの、ＥｃｏＲＩおよび
１３ａｍＴ（１部位を有するプラスミドｐＢＲ３２２（
商業的に入手可能）を使用した場合には、このプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＢａ ｍ ＨＩで切断した。この
場合には、そのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断したときの長い方の断片上に、アンピシリン
抵抗性のコード（Ａｍｐで示す）を有し、テトラザイク
リン抵抗性のコード（’［’ｅｔで示す）は、ＢａｍＨ
１部位切断の結果消失する。ＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩで
切断したプラスミドｐＢＲ３２２の長い方の断片を電気
泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰
のＩ ＧＦ−１遺伝子とハイブリッド化し、ライゲート
した。かくして得た混合物を用いて旦、ｃｏｌｉ Ｈ
ＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換した。
１３ａｍＴ（１部位を有するプラスミドｐＢＲ３２２（
商業的に入手可能）を使用した場合には、このプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＢａ ｍ ＨＩで切断した。この
場合には、そのプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩで切断したときの長い方の断片上に、アンピシリン
抵抗性のコード（Ａｍｐで示す）を有し、テトラザイク
リン抵抗性のコード（’［’ｅｔで示す）は、ＢａｍＨ
１部位切断の結果消失する。ＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩで
切断したプラスミドｐＢＲ３２２の長い方の断片を電気
泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰
のＩ ＧＦ−１遺伝子とハイブリッド化し、ライゲート
した。かくして得た混合物を用いて旦、ｃｏｌｉ Ｈ
ＢＩＯＩ （ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換した。
得られたいくつかのアンピシリン抵抗性、テトラサイタ
リン感受性の形質転換体の一つからプラスミドを単離し
、制限酵素による消失および電気泳動によって、ＩＧＦ
−１遺伝子を含有することを確認した。このプロセスを
第２図に示す。このようにして得たプラスミドをｐｓｄ
Ｍｌと名付ける。
リン感受性の形質転換体の一つからプラスミドを単離し
、制限酵素による消失および電気泳動によって、ＩＧＦ
−１遺伝子を含有することを確認した。このプロセスを
第２図に示す。このようにして得たプラスミドをｐｓｄ
Ｍｌと名付ける。
（３） プラスミドｐｓｄＭｌ中のＩＧＦ−１遺伝子
の配列 マキサム−ギルバート（Ｍ ａ ｘ ａ ｍ −Ｇ１１
ｂｅｒｔ）法を使用できる。
の配列 マキサム−ギルバート（Ｍ ａ ｘ ａ ｍ −Ｇ１１
ｂｅｒｔ）法を使用できる。
ＩＣＦ−Ｉ遺伝子の配列決定のため、プラスミドｐｓｄ
Ｍ１をＥｃｏＲＩで消化し、つぎに、α−”Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素で処理した。３２ｐ標識線
状プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、二つの断片（２
２４ｂｐ、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断
片（２２４ｂｐ）を通常のマキサム−ギルバート法ＣＡ
、ＭａｘａｍとＷ、 Ｇ１１−ｂｅｒｔ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
。
Ｍ１をＥｃｏＲＩで消化し、つぎに、α−”Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素で処理した。３２ｐ標識線
状プラスミドをＢａｍＨＩで消化して、二つの断片（２
２４ｂｐ、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断
片（２２４ｂｐ）を通常のマキサム−ギルバート法ＣＡ
、ＭａｘａｍとＷ、 Ｇ１１−ｂｅｒｔ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
。
Ｌ↓、５６０ （１９７７））により分析した。他方
、プラスミドｐＳｄＭｌを先にＢａｍＨＩで消化し、次
に上記の通りにしてｆｆ２ｐで標識した。線状プラスミ
ドをＥｃｏＲＩで消化して二つの断片（２２４ｂ ｐ
、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断片（２２
４ｂｐ）をマキサム−ギルバート法で分析した。ＩＧＩ
−１遺伝子の両側から配列決定を行った結果は、設計し
たＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致した。
、プラスミドｐＳｄＭｌを先にＢａｍＨＩで消化し、次
に上記の通りにしてｆｆ２ｐで標識した。線状プラスミ
ドをＥｃｏＲＩで消化して二つの断片（２２４ｂ ｐ
、 ４．ｏ ｋｂｐ ）を得た。小さい方の断片（２２
４ｂｐ）をマキサム−ギルバート法で分析した。ＩＧＩ
−１遺伝子の両側から配列決定を行った結果は、設計し
たＩＧＦ−Ｉ遺伝子と一致した。
〔２〕プロモーター遺伝子の調製とクローニング：宿主
生物から融合Ｉ ＧＦ−１を得るため、プロモーター遺
伝子を設計した。
生物から融合Ｉ ＧＦ−１を得るため、プロモーター遺
伝子を設計した。
かかる基準で得たプロモーター遺伝子を、それがＩ Ｇ
Ｆ−Ｉまたは融合Ｉ Ｇ、Ｆ −Ｉをコードする遺伝子
の上流にかつそれに隣接する位置をとるよう、プラスミ
ド中に挿入する。
Ｆ−Ｉまたは融合Ｉ Ｇ、Ｆ −Ｉをコードする遺伝子
の上流にかつそれに隣接する位置をとるよう、プラスミ
ド中に挿入する。
この発明の適当な具体化例として、合成のｔｒｐプロモ
ーターＩ遺伝子またはｔｒｐプロモーター■遺伝子を調
製した。
ーターＩ遺伝子またはｔｒｐプロモーター■遺伝子を調
製した。
（１）合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の調製とクロー
ニング： この発明の適当な具体化例として、次のタイプの合成プ
ロモーター（以下ｔｒｐプロモーターＩと呼ぶ）を合成
した。
ニング： この発明の適当な具体化例として、次のタイプの合成プ
ロモーター（以下ｔｒｐプロモーターＩと呼ぶ）を合成
した。
実際には、１４種の合成オリゴヌクレオチドブロックを
作成し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なる
ように組立て、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得るこ
とによって、１０７ｂｐの分子を合成した。
作成し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なる
ように組立て、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得るこ
とによって、１０７ｂｐの分子を合成した。
３ ’ −ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧ
ＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴ−ＥｃＯＲ工 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡｐ
ＣｐＡＯＨ＋Ａ）（２１ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ）（
３１ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ１（４） ＨＯＧｐＡｐ
ＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣＯＨ（Ｄ）（１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨｆＭ）（１
４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣＯＨ（Ｎ）これらの合成法は、上記へキサヌクレオチ
ドＨＯＡｐＡＩ）ＡｐＣｐＣＩ）ＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成を参照すれ
ば説明されよう。
ＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴ−ＥｃＯＲ工 （ｉ）オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡｐ
ＣｐＡＯＨ＋Ａ）（２１ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ）（
３１ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴ
ｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ１（４） ＨＯＧｐＡｐ
ＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡ
ｐＣＯＨ（Ｄ）（１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨｆＭ）（１
４） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐ
ＣＯＨ（Ｎ）これらの合成法は、上記へキサヌクレオチ
ドＨＯＡｐＡＩ）ＡｐＣｐＣＩ）ＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐ
ＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成を参照すれ
ば説明されよう。
（１１）化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション
； オリゴヌクレオチド類を、第３図に示したごと＜ＩＧＦ
−Ｉ遺伝子の場合と同様の方法に従って、ハイブリッド
化し、ライゲートした。
； オリゴヌクレオチド類を、第３図に示したごと＜ＩＧＦ
−Ｉ遺伝子の場合と同様の方法に従って、ハイブリッド
化し、ライゲートした。
（ｉｉｉ ）合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の分子ク
ローニング： 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニングのため
、合成ｔｒｐプロモーターＩを挿入できる適当な酵素認
識部位をもつ適当なプラスミドに、合成ｔｒｐプロモー
ター酵素を挿入する。この発明の好ましい一実施態様と
して、クローニングを、第４図に示した通り、プラスミ
ドｐＢＲ３２５（商業的に入手できる）を用いて実施し
た。プラスミドｐＢＲ３２５をＥＣｏＲ■で切断し、合
成ｔｒｐプロモーターＩをそれに挿入した。このように
して得たプラスミドｐｓＴ−ｉを用いてＥ、ｃｏＩｉＨ
ＢＩＯＩを形質転換した。
ローニング： 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニングのため
、合成ｔｒｐプロモーターＩを挿入できる適当な酵素認
識部位をもつ適当なプラスミドに、合成ｔｒｐプロモー
ター酵素を挿入する。この発明の好ましい一実施態様と
して、クローニングを、第４図に示した通り、プラスミ
ドｐＢＲ３２５（商業的に入手できる）を用いて実施し
た。プラスミドｐＢＲ３２５をＥＣｏＲ■で切断し、合
成ｔｒｐプロモーターＩをそれに挿入した。このように
して得たプラスミドｐｓＴ−ｉを用いてＥ、ｃｏＩｉＨ
ＢＩＯＩを形質転換した。
（２１ｔｒｐプロモーター■遺伝子の調製：上記ｔｒｐ
プロモーターＩをプラスミドに正しい方向で挿入するた
め、ｔｒｐプロモーター■のＥｃｏＲ１部位の次にある
長さの塩基封鎖をもち、３′末端にＢａｍＨ−Ｉ部位を
もつ、次のタイプの合成プロモーター（以下ｔｒｐプロ
モーター■と呼ぶ）を調製した。
プロモーターＩをプラスミドに正しい方向で挿入するた
め、ｔｒｐプロモーター■のＥｃｏＲ１部位の次にある
長さの塩基封鎖をもち、３′末端にＢａｍＨ−Ｉ部位を
もつ、次のタイプの合成プロモーター（以下ｔｒｐプロ
モーター■と呼ぶ）を調製した。
実際には、２２種のオリゴヌクレオチドブロックを作成
し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。
し、それぞれの一本積が少くとも７塩基ずつ重なるよう
に組合せ、完全な二本鎖ヌクレオチド配列を得ることに
よって、１６３ｂｐの分子を合成することとした。
３ ’ −ＡＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＭＧＡ
ＣＣＧＴＴＴＡＴＭＧＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧ
ＡＣＭＴＴＭＴＣＡＴＣＧＭＣＴＡＧＴＴＭＣＴＡＧＴ
ＡＣＧＣ−ＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡ
ＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧ−
ＥｃｏＲよ りａｍＨ工 （ｉ）オリゴヌクレオチドの合成： ８種のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。
ＣＣＧＴＴＴＡＴＭＧＡＣＴＴＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧ
ＡＣＭＴＴＭＴＣＡＴＣＧＭＣＴＡＧＴＴＭＣＴＡＧＴ
ＡＣＧＣ−ＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡ
ＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧ−
ＥｃｏＲよ りａｍＨ工 （ｉ）オリゴヌクレオチドの合成： ８種のオリゴヌクレオチドをさらに合成した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐ
ＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｓ
Ｂ）（６１ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ）＋７１ ＨＯＣｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ
（ＳＧ）（８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）これらの合成法は、
前記へキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ
ｌ）（７）合成を参照すれば説明されよう。
ＣｐＴＯＨ（ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐ
ＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ｓ
Ｂ）（６１ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ）＋７１ ＨＯＣｐＧｐＡｐ
ＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ
（ＳＧ）（８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）これらの合成法は、
前記へキサデカヌクレオチドＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐ
ＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ
ｌ）（７）合成を参照すれば説明されよう。
（ｉｉ ）化学合成オリゴヌクレオチド類のハイブリッ
ド化とライゲーション： オリゴヌクレオチドＡ−Ｎおよび５Ａ−３Ｈを、第５図
に示した通り、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様のやり方
に従ってハイブリッド化し、ライゲートした。
ド化とライゲーション： オリゴヌクレオチドＡ−Ｎおよび５Ａ−３Ｈを、第５図
に示した通り、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の場合と同様のやり方
に従ってハイブリッド化し、ライゲートした。
（３１ｔｒｐプロモーター■遺伝子の神クローニング：
ｔｒｐプロモーター■遺伝子をプラスミドに挿入した。
この発明の適当な一具体化例として、ｔｒｐプロモータ
ー■遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第６図に示し
た通り、ＥＣ０ＲＩおよびＢ ａ ｍ ＨＩによってそ
の部位を開裂することによって、挿入した。こうして得
たプラスミド（ｔｒｐプロモーター■ベクター）をプラ
スミドｐＴｒｐＥＢ７と名付ける。
ー■遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第６図に示し
た通り、ＥＣ０ＲＩおよびＢ ａ ｍ ＨＩによってそ
の部位を開裂することによって、挿入した。こうして得
たプラスミド（ｔｒｐプロモーター■ベクター）をプラ
スミドｐＴｒｐＥＢ７と名付ける。
〔３〕蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製とクローニング：
ＩＧＦ−１と融合できる保護ペプチドの適当な一例とし
て、蛋白ペプチドＬＨが調製されている。
て、蛋白ペプチドＬＨが調製されている。
（１）蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製：実際には、３２
種の合成オリゴヌクレオチドブロックを作成し、一本積
オーバラ、ピングにより組合せ、完全な二重鎖ヌクレオ
チド配列を得るこトニヨって、２３３ｂｐの分子を合成
することとした。
種の合成オリゴヌクレオチドブロックを作成し、一本積
オーバラ、ピングにより組合せ、完全な二重鎖ヌクレオ
チド配列を得るこトニヨって、２３３ｂｐの分子を合成
することとした。
：Ｊ Ｆ Ｌ ナイ鎖、 ３ ’ −Ｇ−ＴＡ
Ｃ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙＳＡｓｎ
Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａ
ｒｇ Ｌｙｓ 工１ｅ Ｍａｔ５０
Ｈｉｎｄエ
エエＧｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ 工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−Ａ
ＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ
−ＴＴＣ−ＭＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ−Ｔ
Ｍ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＭＧ−ＴＴＣ−
ＧＭ−Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ工１ｅ ＧｌｎＬｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ ５ｔｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ工（ｉ）
オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１）ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ（ａｌ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（ａ２
）（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（ａ３１（４） ＨＯＴ
ｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐ
ＴｐＧＯＨ（ａ４）（５１ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡ
ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（ａ５１（
６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（託）（１０） ＨＯＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ｂ４１（１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐ
ＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５）
（１２１ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣ
ｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３） ＨＯ
ＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ（ｃｌ）（１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
（ｃ２）（１５１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３１（１６）
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ４１（１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ
忙５）（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｃ６１（１９１
ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｃｌｌ）（２０） ＨＯＡｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯ
Ｈ（ｄ２１（２１１ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯｌ（（ｄ３）（２２１Ｈ
ＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３１ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５）
（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｄ６）（２５） ＨＯ
ＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＡＯＨ（ｅｌ）（２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（
ｅ２）（２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＴ（（ｅ３１（２Ｂ
） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（ｅ４）（２９１ＨＯＧｐＧｐ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴ
ＯＨ（ｅ５）（３０）ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１）（３１１ＨＯＴ
ｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯ
Ｈ（１２１＋３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ＋１３）（ｉｉ ）化学合成オ
リゴヌクレオチド類のハイブリッド化とライゲージロン
： オリゴヌクレオチド１〜１３を、第７図に示した通り、
ＩＣＦ−１遺伝子の場合と同様のやり方で、ハイブリッ
ド化しライゲートした。
Ｃ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓ
ｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙＳＡｓｎ
Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａ
ｒｇ Ｌｙｓ 工１ｅ Ｍａｔ５０
Ｈｉｎｄエ
エエＧｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ 工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−Ａ
ＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ
−ＴＴＣ−ＭＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ−Ｔ
Ｍ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＭＧ−ＴＴＣ−
ＧＭ−Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ工１ｅ ＧｌｎＬｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ ５ｔｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ工（ｉ）
オリゴヌクレオチド類の合成： オリゴヌクレオチドブロック類は次の通りである： （１）ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧｐ
ＴｐＴＯＨ（ａｌ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（ａ２
）（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（ａ３１（４） ＨＯＴ
ｐＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐ
ＴｐＧＯＨ（ａ４）（５１ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡ
ｐＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（ａ５１（
６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（託）（１０） ＨＯＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ｂ４１（１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐ
ＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ｂ５）
（１２１ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＣ
ｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３） ＨＯ
ＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴ
ｐＴｐＴｐＣＯＨ（ｃｌ）（１４） ＨＯＴｐＴｐＡｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ
（ｃ２）（１５１ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３１（１６）
ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ４１（１７） ＨＯＴｐＣｐＣｐ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ
忙５）（１８１ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｃ６１（１９１
ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｃｌｌ）（２０） ＨＯＡｐＴｐＧ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐＴＯ
Ｈ（ｄ２１（２１１ＨＯＧｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯｌ（（ｄ３）（２２１Ｈ
ＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３１ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐ
ＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５）
（２４） ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｄ６）（２５） ＨＯ
ＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＡｐＡＯＨ（ｅｌ）（２６） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（
ｅ２）（２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐ
ＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＴ（（ｅ３１（２Ｂ
） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＴｐＧｐＡＯＨ（ｅ４）（２９１ＨＯＧｐＧｐ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴ
ＯＨ（ｅ５）（３０）ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡ
ｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（１１）（３１１ＨＯＴ
ｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯ
Ｈ（１２１＋３２） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ＋１３）（ｉｉ ）化学合成オ
リゴヌクレオチド類のハイブリッド化とライゲージロン
： オリゴヌクレオチド１〜１３を、第７図に示した通り、
ＩＣＦ−１遺伝子の場合と同様のやり方で、ハイブリッ
ド化しライゲートした。
（２）蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の分子クローニング：蛋
白ペプチドＬＨ遺伝子をプラスミドに挿入した。この発
明の適当な一具体化例として、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子
をプラスミドｐＢＲ３２２に、第８図に示した通り、Ｅ
Ｃ０ＲＩおよび１３ ａ ｍ Ｈ■によってその部位を
開裂することにより、挿入した。かくして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
白ペプチドＬＨ遺伝子をプラスミドに挿入した。この発
明の適当な一具体化例として、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子
をプラスミドｐＢＲ３２２に、第８図に示した通り、Ｅ
Ｃ０ＲＩおよび１３ ａ ｍ Ｈ■によってその部位を
開裂することにより、挿入した。かくして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
（４）ＩＧＦ−■発現ベクターの構築：Ｉ ＧＦ−Ｉ遺
伝子を、プロモーター遺伝子を含有するプラスミドに挿
入し、Ｉ ＧＦ−Ｉ遺伝子を用いて宿主生物を形質転換
した。 ′この発明の適当な一興体化例として
、次の組換えプラスミドを、旦５匹旦中でＩＧＦ−１遺
伝子を発現させるべく確立した。
伝子を、プロモーター遺伝子を含有するプラスミドに挿
入し、Ｉ ＧＦ−Ｉ遺伝子を用いて宿主生物を形質転換
した。 ′この発明の適当な一興体化例として
、次の組換えプラスミドを、旦５匹旦中でＩＧＦ−１遺
伝子を発現させるべく確立した。
（１）組み換えプラスミドｐｓｄＭ１ｔｒｐの構築：上
で調製したプラスミドｐＳＴ−１をＥｃｏＲＩで消化し
、生じた大きい断片にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入した。こ
うして得た組換えプラスミドをプラスミドｐＳＭ１ｔｒ
ｐと名付、旦、 ｃｏｌｉ、たとえばＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩの形質転換に用いた。
で調製したプラスミドｐＳＴ−１をＥｃｏＲＩで消化し
、生じた大きい断片にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を挿入した。こ
うして得た組換えプラスミドをプラスミドｐＳＭ１ｔｒ
ｐと名付、旦、 ｃｏｌｉ、たとえばＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩの形質転換に用いた。
このプロセスを第９図に示す。
（２） 組換えプラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐの
構築ニ プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、生じた大型断片（４，１ｋｂｐ）をアガロ
ースゲル電気泳動によって分離した。
構築ニ プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉで消化し、生じた大型断片（４，１ｋｂｐ）をアガロ
ースゲル電気泳動によって分離した。
一方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子をプラスミドｐｓｄＭ１から単
離し、上記プロモータベクター（４，１ｋｂｐ）とライ
ゲートした。得られたアンピシリン抵抗性、テトラサイ
クリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単離し
、制限酵素による消化と電気泳動とによって、ＩＧＦ−
Ｉ遺伝子を含有していることを確認した。こうして得た
プラスミドをプラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐと名
付け、このプラスミドを含有するＥ、 ｃｏｌｔをＥ、
ｃｏｌｔＦ−３と名付ける。このプロセスを第１０図
に示した。
離し、上記プロモータベクター（４，１ｋｂｐ）とライ
ゲートした。得られたアンピシリン抵抗性、テトラサイ
クリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単離し
、制限酵素による消化と電気泳動とによって、ＩＧＦ−
Ｉ遺伝子を含有していることを確認した。こうして得た
プラスミドをプラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐと名
付け、このプラスミドを含有するＥ、 ｃｏｌｔをＥ、
ｃｏｌｔＦ−３と名付ける。このプロセスを第１０図
に示した。
（５）ＩＧＦ−１遺伝子およびプロモーター遺伝子の配
列決定： マキサム−ギルバート法を用いうる。
列決定： マキサム−ギルバート法を用いうる。
（１１プラスミドｐｓｂＭｌｔｒｐ中のＩ ＧＦ−１遺
伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列ニブラス
ミドｐｓｄＭｌｔｒｐ中のＩＧＦ−１遺伝子および合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列を、後記プラスミド
ｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐの場合と同様のやり方で決定
した。
伝子およびｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列ニブラス
ミドｐｓｄＭｌｔｒｐ中のＩＧＦ−１遺伝子および合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の配列を、後記プラスミド
ｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐの場合と同様のやり方で決定
した。
（２） プラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐ中（７
）ＩＧＦ−■遺伝子およびｔｒｐプロモーター■遺伝子
の配列： Ｉ ＧＦ−１遺伝子および合成ｔｒｐプロモータＩ遺伝
子の配列決定のため、プラスミドｐＳｄＭｌｔｒｐをＥ
Ｃ０ＲＩで消化し、ＢＡＰ （バクテリア アルカリホ
スファターゼ）で処理し、つぎに、γ−”Ｐ−ＡＴＰの
存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理した。標
識されたＤＮＡをＨｉｎｆ Ｉで消化して、二つの断片
（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。これらの断片
をマキサム−ギルバート法により分析した。ＣＡ、 Ｍ
ａｘａｍとＷ、 Ｇｊｌｂｅｒｔ、 Ｐｒｏｃ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
）ＩＧＦ−■遺伝子およびｔｒｐプロモーター■遺伝子
の配列： Ｉ ＧＦ−１遺伝子および合成ｔｒｐプロモータＩ遺伝
子の配列決定のため、プラスミドｐＳｄＭｌｔｒｐをＥ
Ｃ０ＲＩで消化し、ＢＡＰ （バクテリア アルカリホ
スファターゼ）で処理し、つぎに、γ−”Ｐ−ＡＴＰの
存在下にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理した。標
識されたＤＮＡをＨｉｎｆ Ｉで消化して、二つの断片
（１１０ｂｐおよび４８０ｂｐ）を得た。これらの断片
をマキサム−ギルバート法により分析した。ＣＡ、 Ｍ
ａｘａｍとＷ、 Ｇｊｌｂｅｒｔ、 Ｐｒｏｃ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
１４．５６０ （１９７７））。判明した配列は、Ｉ
ＧＦ−Ｉ遺伝子および合成プロモーター■遺伝子の設
計配列と一致した。
ＧＦ−Ｉ遺伝子および合成プロモーター■遺伝子の設
計配列と一致した。
〔６〕融合ＩＧＦ−１発現ベクターの構築：ＩＧＦ〜■
遺伝子の上流にリンカ−を介在させまたはさせずに、保
護ペプチドをコードする遺伝子をＩ ＧＦ−Ｉ遺伝子と
連結することにより、融合Ｉ ＧＦ−１をコードする遺
伝子を調製した。
遺伝子の上流にリンカ−を介在させまたはさせずに、保
護ペプチドをコードする遺伝子をＩ ＧＦ−Ｉ遺伝子と
連結することにより、融合Ｉ ＧＦ−１をコードする遺
伝子を調製した。
このプロセスにおいては、次の３種の蛋白ペプチドをＩ
ＣＦ−Ｉと融合させる。
ＣＦ−Ｉと融合させる。
タイプ■：最後のアミノ酸としてメチオニンをもつ蛋白
ペプチド タイプ■：最後のアミノ酸としてトリプトファンをもつ
蛋白ペプチド タイプ■：最後のアミノ酸として−ｃ＋ｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−をもつ蛋白ペプチド このようにして得た３タイプの融合Ｉ ＣＦ−Ｉは、次
の通りである。
ペプチド タイプ■：最後のアミノ酸としてトリプトファンをもつ
蛋白ペプチド タイプ■：最後のアミノ酸として−ｃ＋ｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−をもつ蛋白ペプチド このようにして得た３タイプの融合Ｉ ＣＦ−Ｉは、次
の通りである。
タイプＩ：蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプ
チドと融合したＩ ＧＦ−１ タイプ■：蛋白ペプチドのトリプトファンを介して蛋白
ペプチドと融合したＩＧＦ−１タイプ■：蛋白ペプチド
のｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。
チドと融合したＩ ＧＦ−１ タイプ■：蛋白ペプチドのトリプトファンを介して蛋白
ペプチドと融合したＩＧＦ−１タイプ■：蛋白ペプチド
のｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。
−Ａ Ｉ ａ−Ｊを介して蛋白ペプチドと融合したＩＣ
Ｆ１ 本発明は、かかる３タイプの融合ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するものである。
Ｆ１ 本発明は、かかる３タイプの融合ＩＣＦ−１をコードす
る遺伝子の発現ベクターにも関するものである。
この発明の適当な一興体化例として、次のタイプの、蛋
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝
子の発現ベクターを調製した。
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝
子の発現ベクターを調製した。
本発明は、保護ペプチドをコードする遺伝子を、リンカ
−を介在させまたはさせずに、Ｉ ＧＦ−１遺伝子と該
ＩＧＦ−１遺伝子の上流で連結して構築されるかかる遺
伝子の発明のためのプロセスにも関するものである。
−を介在させまたはさせずに、Ｉ ＧＦ−１遺伝子と該
ＩＧＦ−１遺伝子の上流で連結して構築されるかかる遺
伝子の発明のためのプロセスにも関するものである。
（１）蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の発現ベクターの構築：
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を、プロモーター遺伝子を含有
するプラスミドに挿入し、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子によ
り宿主生物を形質転換する。
するプラスミドに挿入し、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子によ
り宿主生物を形質転換する。
この発明の好適な一具体化例として、Ｅ、ｃｏｌｔ中で
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を発現させるべく、次の組換え
プラスミドを確立した。
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を発現させるべく、次の組換え
プラスミドを確立した。
Ｔｒｐプロモーター■プラスミドｐＴｒｐＥＢ７をＥＣ
０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片（４，
１ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動により分離した。
０ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片（４，
１ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動により分離した。
他方、蛋白ペプチドＬＨ遺伝子をプラスミドｐＬＨ１０
７から単離し、前記プロモーターベクター（４，１ｋｂ
ｐ）とライゲートした。この混合物を用いてＥ、ｃｏＮ
ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシリン
抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一つから
プラスミドを単離し、それが蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を
含有していることを、制限酵素による消化と電気泳動と
によって確認した。このようにして得たプラスミドをプ
ラスミドｐＬＨｔｒｐと名付ける。このプロセスを第１
１図に示した。
７から単離し、前記プロモーターベクター（４，１ｋｂ
ｐ）とライゲートした。この混合物を用いてＥ、ｃｏＮ
ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシリン
抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一つから
プラスミドを単離し、それが蛋白ペプチドＬＨ遺伝子を
含有していることを、制限酵素による消化と電気泳動と
によって確認した。このようにして得たプラスミドをプ
ラスミドｐＬＨｔｒｐと名付ける。このプロセスを第１
１図に示した。
（２）蛋白ペプチドＬＨと融合したｒＧＦ−Ｉの発現ベ
クターの構築： ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子含有プ
ラスミドに、プロモーター遺伝子の下流に、それに隣接
して、挿入する。
クターの構築： ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、蛋白ペプチドＬ Ｈ遺伝子含有プ
ラスミドに、プロモーター遺伝子の下流に、それに隣接
して、挿入する。
この発明の好適な一具体化例として、旦６匹旦中での蛋
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉの発現のため、次
の組換えプラスミドを確立した。
白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉの発現のため、次
の組換えプラスミドを確立した。
この段階では、３タイプのリンカ−を、ＩＣＦ−■遺伝
子の上流にこれに隣接して、挿入した。
子の上流にこれに隣接して、挿入した。
ｆａ） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＣＦ−Ｉ（タ
イプ■）をコードする遺伝子の発現ベクターの構築： 上記で調製したプラスミドｐ Ｌ Ｈｔ ｒ ｐをＨｉ
ｎｄＩ［［およびＢａｍＨｒで消化し、生じた大きい断
片を分取アガロースゲル電気泳動によって分離した。一
方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、前記ＥＣ０ＲＩおよびＢａｍ
Ｈｒ消化により、上で調製したプラスミドｐｓｄＭ１か
ら単離し、その上流に、それに隣接して、オリゴヌクレ
オチドｍ１およびｍ２をリンカ−として連結した。こう
して得たリンカ一つきＩＧＦ−１遺伝子を上記プラスミ
ドｐＬ）ｒｔｒｐの大型断片とライゲートした。混合物
を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
イプ■）をコードする遺伝子の発現ベクターの構築： 上記で調製したプラスミドｐ Ｌ Ｈｔ ｒ ｐをＨｉ
ｎｄＩ［［およびＢａｍＨｒで消化し、生じた大きい断
片を分取アガロースゲル電気泳動によって分離した。一
方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、前記ＥＣ０ＲＩおよびＢａｍ
Ｈｒ消化により、上で調製したプラスミドｐｓｄＭ１か
ら単離し、その上流に、それに隣接して、オリゴヌクレ
オチドｍ１およびｍ２をリンカ−として連結した。こう
して得たリンカ一つきＩＧＦ−１遺伝子を上記プラスミ
ドｐＬ）ｒｔｒｐの大型断片とライゲートした。混合物
を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
得られたアンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感受性
の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、それが、
蛋白ペプチドＬ Ｈと融合したＩＧＦ−Ｔ（タイプＩ）
をコードする遺伝子を含有することを、制限酵素による
消化と電気泳動とによって確認した。かくして得たプラ
スミドをプラスミドｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐと名付ける。
の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、それが、
蛋白ペプチドＬ Ｈと融合したＩＧＦ−Ｔ（タイプＩ）
をコードする遺伝子を含有することを、制限酵素による
消化と電気泳動とによって確認した。かくして得たプラ
スミドをプラスミドｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐと名付ける。
このプロセスを第１２図に示す。
かくして得た、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−■ （タ
イプＩ）をコードする遺伝子は次の通りである。
イプＩ）をコードする遺伝子は次の通りである。
ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎコ
ードする鎖： ５ ’ −ＭＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ八
ＭへＴＡＣ−ＴＴＴ−ＭＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−
ＴＣＡ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−Ｍ
Ａ−ＴＴＡ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ
−ＣＡＴ−ＣＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ４〇 八ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工ｌｅ Ｍｅｔ５０
Ｈ
ｉｎｄエエエｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＩＩｅＶａｌ
Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡ
Ｇ−ＡＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−
ＴＡＣ−Ｔ’Ｉ−Ｃ−ＭＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−
ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−Ａ
ＡＧ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉ（
ｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ ＴｈｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈ
ｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ ＡｒｇＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＣｙｓＣｙｓ
ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−Ｇ
ＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧＴ−ＧＧＣ
−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−
ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ −Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ ＭｅｔＴｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
ＬｙｓＰｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡｌａＳｔ
ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ）
をコードする遺伝子は次の通りである＝Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ｇｌｎ コードする鎮： ＴＧＴ−ＴＡＣ−
ＴＧＣ−ＣＡＧ−、ｘ −）−Ｌ ナイ鎖、
ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＡ
ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工ｌｅ Ｍｅｔ５０
Ｈｉｎｄ工
Ｉ工Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−Ａ
ＧＣ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ
−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−
ＴＴＣ−ＧＡＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈｅ Ｖａ
ｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ ＡｒｇＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ ＣｙｓＧＣ
Ａ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ
−ＧＡＣ−ＧＭ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−Ｇ
ＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴ
Ｔ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｑ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖ
ａ１Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔ、＋
ｙＳ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａｆｂ）
蛋白ペプヂドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩ）を
コードする遺伝子の発現ベクターの構築二上記で調製し
たプラスミドｐＬＨｔｒｐをＨｌｎｄｌｌｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、生じた大断片を分取アガロースゲル電
気泳動によって分離した。
ードする鎖： ５ ’ −ＭＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ八
ＭへＴＡＣ−ＴＴＴ−ＭＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−
ＴＣＡ−ＧＡＴ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−Ｍ
Ａ−ＴＴＡ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ
−ＣＡＴ−ＣＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ４〇 八ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工ｌｅ Ｍｅｔ５０
Ｈ
ｉｎｄエエエｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＩＩｅＶａｌ
Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡ
Ｇ−ＡＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−
ＴＡＣ−Ｔ’Ｉ−Ｃ−ＭＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−
ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−Ａ
ＡＧ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉ（
ｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｕ ＴｈｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈ
ｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ ＡｒｇＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＣｙｓＣｙｓ
ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−Ｇ
ＴＡ−ＧＡＣ−ＧＭ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧＴ−ＧＧＣ
−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−
ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ −Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ ＭｅｔＴｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
ＬｙｓＰｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ ＡｌａＳｔ
ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ）
をコードする遺伝子は次の通りである＝Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｃｙｓ Ｇｌｎ コードする鎮： ＴＧＴ−ＴＡＣ−
ＴＧＣ−ＣＡＧ−、ｘ −）−Ｌ ナイ鎖、
ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＬｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ ＡｌａＡｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＡ
ｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ 工ｌｅ Ｍｅｔ５０
Ｈｉｎｄ工
Ｉ工Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−Ａ
ＧＣ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ
−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−
ＴＴＣ−ＧＡＡ−Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒＬｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ ＧｌｎＰｈｅ Ｖａ
ｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ ＡｓｎＬｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒ
ｇ ＡｒｇＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ ＣｙｓＧＣ
Ａ−ＣＣＧ−ＣＡＧ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ
−ＧＡＣ−ＧＭ−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−Ｇ
ＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴ
Ｔ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｑ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖ
ａ１Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔ、＋
ｙＳ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａｆｂ）
蛋白ペプヂドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩ）を
コードする遺伝子の発現ベクターの構築二上記で調製し
たプラスミドｐＬＨｔｒｐをＨｌｎｄｌｌｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、生じた大断片を分取アガロースゲル電
気泳動によって分離した。
一方、Ｉ ＧＦ−Ｉ遺伝子を、上でａ製しプラスミドｐ
Ｓ ｄ Ｍ ｌからＡｖａ■およびＢａｍＨＩを用い
て単離し、それの上流に、それに隣接して、オリゴヌク
レオチドＬＡおよびＬＢをリンカ−としてライゲートし
た。こうして得たリンカ一つきＩＧＦ−１遺伝子を上記
しプラスミドｐＬＨｔｒｐの大きい断片をライゲートし
た。その混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを
形質転換した。得られたアンピシリン抵抗性、テトララ
イタリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単離
し、それが蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ
Ｉ）をコードする遺伝子を含有していることを、制限酵
素による消化および電気泳動によって確認した。こうし
て得たプラスミドをプラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐと
名付ける。このプロセスを第１３図および第１４図に示
す。
Ｓ ｄ Ｍ ｌからＡｖａ■およびＢａｍＨＩを用い
て単離し、それの上流に、それに隣接して、オリゴヌク
レオチドＬＡおよびＬＢをリンカ−としてライゲートし
た。こうして得たリンカ一つきＩＧＦ−１遺伝子を上記
しプラスミドｐＬＨｔｒｐの大きい断片をライゲートし
た。その混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを
形質転換した。得られたアンピシリン抵抗性、テトララ
イタリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単離
し、それが蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ
Ｉ）をコードする遺伝子を含有していることを、制限酵
素による消化および電気泳動によって確認した。こうし
て得たプラスミドをプラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐと
名付ける。このプロセスを第１３図および第１４図に示
す。
こうして得た、蛋白ペプチドＬＨＭ合ＩＧＦ−■ （タ
イプＩＩ）をコードする遺伝子は次の通りである： ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓコードする
鎮： ５ ’ −ＭＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ−
ＴＡＣ−ＴＧＣ−ヨードしない鎖、 ３“−
Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−Ｇｌｎ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａ１Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＬｙｓ
Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｉｎ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅＡＴＧ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−Ｔ
ＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＧＴＣ−ＴＣ
Ｇ−ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ
−ＡＡＧ −Ｈ１ｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＣｙｓＧｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒ。
イプＩＩ）をコードする遺伝子は次の通りである： ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓコードする
鎮： ５ ’ −ＭＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ−
ＴＡＣ−ＴＧＣ−ヨードしない鎖、 ３“−
Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−Ｇｌｎ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａ１Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＬｙｓ
Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｉｎ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅＡＴＧ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＣＭ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−Ｔ
ＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＧＴＣ−ＴＣ
Ｇ−ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ
−ＡＡＧ −Ｈ１ｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＣｙｓＧｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒ。
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
ｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌ
ｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ ＡｒｇＣＡＧ−ＡＣＴ−
ＧＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＡＡ−ＴＧＣ−Ｔ
ＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡ
Ｇ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ
−ＧＣＡ−Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ ＣｙｓＡｌ
ａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ ＡｌａＳｔｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ工 ＴＧＡ−ＴＡＧ−３嘗 ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチド融合ＩＣＦ−Ｉ （タイプＩＩ
）をコードする遺伝子は次の通りである；Ｃｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｃｙｓ コードする鎮、 ５ ’ −ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ ’Ｉ’ｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａ１Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＬｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｙｓ 工１ｅＭＧ−ＭＴ−ＴＧＧ−ＭＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＴＴ
Ｃ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−Ｍｅｔ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙ
ｒ ＰｈｅＨｉｎｄエエＩ ６０ ＬＹＳ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＣＹＳＧｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒ。
ｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ ＡｒｇＣＡＧ−ＡＣＴ−
ＧＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＡＡ−ＴＧＣ−Ｔ
ＧＴ−ＴＴＴ−ＣＧＴ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−ＣＣＡ−ＴＡ
Ｇ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＡＣＧ−ＡＣＡ−ＡＡＡ
−ＧＣＡ−Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ ＣｙｓＡｌ
ａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ ＡｌａＳｔｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨ工 ＴＧＡ−ＴＡＧ−３嘗 ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ そして、蛋白ペプチド融合ＩＣＦ−Ｉ （タイプＩＩ
）をコードする遺伝子は次の通りである；Ｃｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｃｙｓ コードする鎮、 ５ ’ −ＴＧＴ
−ＴＡＣ−ＴＧＣ−Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ ’Ｉ’ｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａ１Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＬｙｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｙｓ 工１ｅＭＧ−ＭＴ−ＴＧＧ−ＭＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＴＴ
Ｃ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−Ｍｅｔ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙ
ｒ ＰｈｅＨｉｎｄエエＩ ６０ ＬＹＳ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＣＹＳＧｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｖａ１Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒ。
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
ｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒ。
ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−Ｔ
ＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＴＧＧ−ＣＣ
Ｇ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣＡ
−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工
１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈ
ｅ ＡｒｇＳｅｒ ＣｙｓＡｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ ＣｙｓＡｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ａｌａ（Ｃ）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦＩ
（タイプ■）をコードする遺伝子の発現ベクターの構
築二上で調製したプラスミドｐＬＨｔｒｐｔｌ−Ｈｉｎ
ｄＩ［［およびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片を分
取アガロースゲル電気泳動によって分離した。
ＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ−ＧＣＡ−ＣＣＧ−ＴＧＧ−ＣＣ
Ｇ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣＡ
−ＧＣＧ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工
１ｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈ
ｅ ＡｒｇＳｅｒ ＣｙｓＡｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ ＣｙｓＡｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ａｌａ（Ｃ）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦＩ
（タイプ■）をコードする遺伝子の発現ベクターの構
築二上で調製したプラスミドｐＬＨｔｒｐｔｌ−Ｈｉｎ
ｄＩ［［およびＢａｍＨＩで消化し、生じた大断片を分
取アガロースゲル電気泳動によって分離した。
一方、上で調製しプラスミドｐｓｄＭ１からＡｖａｌｌ
および１３ａｍＨＩを用いてＩＧＩ’−１遺伝子を単離
し、これの上流に、これに隣接して、オリゴヌクレオチ
ドＬＣおよびＬＤをリンカ−としてライゲートした。こ
うして得たリンカ−付きＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、ＥＣ０Ｒ
ＩとＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢＲ３２２の大
断片とライゲートした。こうして得たプラスミドｐｓｄ
Ｍｃを旦。
および１３ａｍＨＩを用いてＩＧＩ’−１遺伝子を単離
し、これの上流に、これに隣接して、オリゴヌクレオチ
ドＬＣおよびＬＤをリンカ−としてライゲートした。こ
うして得たリンカ−付きＩＧＦ−Ｉ遺伝子を、ＥＣ０Ｒ
ＩとＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢＲ３２２の大
断片とライゲートした。こうして得たプラスミドｐｓｄ
Ｍｃを旦。
ｃｏｌｔを用いてクローニングし、つぎに再びＥｃ。
ＲＩおよび］３ａｍＨＩで消化した。こうして得たリン
カ−付きＩ ＧＦ−１遺伝子を、タイプ■の発現ベクタ
ーと同様に、リンカ−（ｍｌおよびｍ２）とライゲート
した。最後に、こうして得た二つのリンカ−付きのＩＧ
Ｆ−１遺伝子を、プラスミドｐＬＨｔｒｐの上記大断片
とライゲートした。この反応混合物を用いて、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシ
リン抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一つ
からプラスミドを単離し、これが、蛋白ペプチドＬＨ融
合ＩＣＦ−１（タイプ■）をコードする遺伝子を含有す
ることを、制限酵素を用いての消化と電気泳動とによっ
て確認した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＬ
Ｈ３ｄＭｃｔｒｐと名付ける。
カ−付きＩ ＧＦ−１遺伝子を、タイプ■の発現ベクタ
ーと同様に、リンカ−（ｍｌおよびｍ２）とライゲート
した。最後に、こうして得た二つのリンカ−付きのＩＧ
Ｆ−１遺伝子を、プラスミドｐＬＨｔｒｐの上記大断片
とライゲートした。この反応混合物を用いて、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシ
リン抵抗性、テトラサイクリン感受性形質転換体の一つ
からプラスミドを単離し、これが、蛋白ペプチドＬＨ融
合ＩＣＦ−１（タイプ■）をコードする遺伝子を含有す
ることを、制限酵素を用いての消化と電気泳動とによっ
て確認した。こうして得たプラスミドをプラスミドｐＬ
Ｈ３ｄＭｃｔｒｐと名付ける。
このプロセスを第１５図および第１６図に示す。
こうして得た、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−■ （タ
イプ■）をコードする遺伝子は次の通りである： Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ａｓｐ ＶａｌＭＧ−Ａｊ値−ＴＡＣ−ＴＴＴ
−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ−
ＧＴＡ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＪ咳−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＧＣＧ−ＧＡＴ−ＡＡ
Ｔ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ
−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＣＧＣ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−
ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＭＴ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−Ｌｙ
ｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
ＰｈｅＨｉｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＡｌａＧｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ１８０
９゜Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ａｒｇ ＧｌｙＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＭ−ＴＴ
Ｔ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ
−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−
ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ＳｅｒＳｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１
ｅ Ｖａ１Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒ。
イプ■）をコードする遺伝子は次の通りである： Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬｙｓ Ｌｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ａｓｐ ＶａｌＭＧ−Ａｊ値−ＴＡＣ−ＴＴＴ
−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ−
ＧＴＡ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＪ咳−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−Ａｌ
ａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ工１ｅ ＬｅｕＧＣＧ−ＧＡＴ−ＡＡ
Ｔ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ
−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＣＧＣ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−
ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＭＴ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−Ｌｙ
ｓ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｌｎ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
ＰｈｅＨｉｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＡｌａＧｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ１８０
９゜Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ａｒｇ ＧｌｙＧＡＣ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＭ−ＴＴ
Ｔ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ
−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−
ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ＳｅｒＳｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１
ｅ Ｖａ１Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒ。
ＡｌａＬｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ ５ｔｏｐ ５ｔｏｐ
ＢａｍＨ工ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−
ＴＡＧ−３’ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ
−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’そして、蛋白ペプチドＬＨ融
合ＩＣＦ−１（タイプ■）をコードする遺伝子は次の通
りである：Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ コードする鎮： ｓ Ｉ−ＴＧＴ−ＴＡ
Ｃ−ＴＧＣ−Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａ１Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ工１ｅ ＬｅｕＧＣＧ−ＧＡＴ−ＭＴ−ＣＧＡ−Ａ
ＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴ
Ｇ−ＣＧＣ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＭ−
ＭＧ−ＭＴ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−・Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｔｒｐ ＬｙｓＧｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
ＰｈｅＨｉｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＡｌａＧｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ１８０９゜ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ ＧｌｙＧＡＣ−ＧＣＴ
−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−
ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−Ｇ
ＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣ
Ａ−ＣＣＡ−Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ＳｅｒＳ
ｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｑ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｉ
ｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａ１Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓ
ｐ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐ
ｒ。
ＢａｍＨ工ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−
ＴＡＧ−３’ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ
−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’そして、蛋白ペプチドＬＨ融
合ＩＣＦ−１（タイプ■）をコードする遺伝子は次の通
りである：Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ コードする鎮： ｓ Ｉ−ＴＧＴ−ＴＡ
Ｃ−ＴＧＣ−Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｎ ＬｅｕＬ
ｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａ１Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｙ工１ｅ ＬｅｕＧＣＧ−ＧＡＴ−ＭＴ−ＣＧＡ−Ａ
ＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴ
Ｇ−ＣＧＣ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＭ−
ＭＧ−ＭＴ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＭＣ−・Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｔｒｐ ＬｙｓＧｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒ
ｇ Ｌｙｓ工１ｅＭｅｔ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
工１ｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
ＰｈｅＨｉｎｄエエエ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＡｌａＧｌｙ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａ１８０９゜ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ ＧｌｙＧＡＣ−ＧＣＴ
−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−
ＧＡＴ−ＣＧＴ−ＧＧＴ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−ＧＡＣ−Ｇ
ＴＴ−ＡＡＡ−ＣＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣ
Ａ−ＣＣＡ−Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ＳｅｒＳ
ｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｑ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｉ
ｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ工１ｅ Ｖａ１Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓ
ｐ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐ
ｒ。
ＡｌａＬｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ ５ｔｏｐ ５ｔｏｐ
ＢａｍＨ工ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−
ＴＡＧ−３’ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ
−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ 、 ａｎｄ〔５〕宿
主生物でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現：するプラスミドを
用いて宿主生物を形質転換し、つぎにそのプラスミドを
有する宿主生物を、同化可能な炭素源および窒素源を含
有する栄養培地中で、好気性条件下に（たとえば振とう
培養、深部培養など）培養する。
ＢａｍＨ工ＧＣＡ−ＡＡＡ−ＴＣＣ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−
ＴＡＧ−３’ＣＧＴ−ＴＴＴ−ＡＧＧ−ＣＧＣ−ＡＣＴ
−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ 、 ａｎｄ〔５〕宿
主生物でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現：するプラスミドを
用いて宿主生物を形質転換し、つぎにそのプラスミドを
有する宿主生物を、同化可能な炭素源および窒素源を含
有する栄養培地中で、好気性条件下に（たとえば振とう
培養、深部培養など）培養する。
栄養培地中の好ましい炭素源け、グルコース。
フルクトース、スクロース、グリセリン、でん粉などの
ごとき炭水化物である。包含されうる他の炭素源は、キ
シロース、ガラクトース、マルトース、デキストリン、
ラクトースなどである。
ごとき炭水化物である。包含されうる他の炭素源は、キ
シロース、ガラクトース、マルトース、デキストリン、
ラクトースなどである。
好ましい窒素源は、酵母エキス、ペプトン、グルテン粉
、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、
小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸などの
ごとき無機および有機の窒素化合物である。
、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾燥酵母、
小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸などの
ごとき無機および有機の窒素化合物である。
炭素源および窒素源は、これらを組合せて用いるのが有
利であるが、微量の成長因子およびかなの量の無機栄養
源を含有する相対的に低純度の材料も使用に適している
ので、それらは必ずしも純粋な形で使用することを要し
ない。所望の時には、炭酸カルシウム、燐酸ナトリウム
またはカリウム。
利であるが、微量の成長因子およびかなの量の無機栄養
源を含有する相対的に低純度の材料も使用に適している
ので、それらは必ずしも純粋な形で使用することを要し
ない。所望の時には、炭酸カルシウム、燐酸ナトリウム
またはカリウム。
塩化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩類、銅
塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。
塩類などの無機塩類を培地に添加してもよい。
培養混合物の攪拌および通気は種々の方法で達成できる
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。攪拌は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより遂行しうる。
。攪拌は、プロペラまたは類似の機械的攪拌装置により
、醗酵槽の回転または振とうにより、種々のポンプ装置
により、または無菌の空気を培地に通すことにより、も
たらされる。攪拌は、醗酵混合物に無菌空気を通過させ
ることにより遂行しうる。
醗酵は、通常的２０℃と４２℃との間の温度で、好まし
くは３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時間
にわたって行う。
くは３５〜３８℃の間の温度で、数時間ないし５０時間
にわたって行う。
こうして産出されたＩＧＦ−Ｉまたは融合ＩＧＦ−１は
、他の既知の生物学的活性物質の回収に一般的に用いら
れる慣用の手段によって培養培地から回収できる。一般
的には、産出されたＩＧＦ−■または融合ＩＧＦ−Ｉは
宿主生物の細胞中に見出され、従って、ＩＧＦ−１また
は融合ＩＧＦ−Ｉは、培養液を濾過または遠心分離して
得られる細胞から、減圧下の濃縮、超音波処理などの細
胞破砕、ＨＰＬＣ，凍結乾燥、ｐＨ調節、樹脂（たとえ
ばアニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹
脂）を用いての処理、慣用の吸着剤（たとえば活性炭、
珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ）での処理、
ゲル濾過、晶出などの常法によって、分離できる。
、他の既知の生物学的活性物質の回収に一般的に用いら
れる慣用の手段によって培養培地から回収できる。一般
的には、産出されたＩＧＦ−■または融合ＩＧＦ−Ｉは
宿主生物の細胞中に見出され、従って、ＩＧＦ−１また
は融合ＩＧＦ−Ｉは、培養液を濾過または遠心分離して
得られる細胞から、減圧下の濃縮、超音波処理などの細
胞破砕、ＨＰＬＣ，凍結乾燥、ｐＨ調節、樹脂（たとえ
ばアニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹
脂）を用いての処理、慣用の吸着剤（たとえば活性炭、
珪酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ）での処理、
ゲル濾過、晶出などの常法によって、分離できる。
（１） プラスミドｐｓｄＭ１ ｔ ｒｐを用いての
旦。
旦。
ｃｏｌｉ中でのＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現ｐｓｄＭｌｔｒ
ｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをＬブロス中で一夜
培養したものをトリプトファン不含Ｍ９培地で希釈し、
細胞を、β−インドールアクリル酸誘導の条件下に、３
７℃で３時間インキュベートした。Ｉ ＧＦ−１産生の
検出は、矢内原の方法〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｈｏｒｍｏｎｅｓ １ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３．
２８ （１９８３） ）に従って、Ｉ ＧＦ−１断片
（２６−４６）の抗体を用いて、放射免疫測定法（以下
ＲＩＡという）により行った。
ｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをＬブロス中で一夜
培養したものをトリプトファン不含Ｍ９培地で希釈し、
細胞を、β−インドールアクリル酸誘導の条件下に、３
７℃で３時間インキュベートした。Ｉ ＧＦ−１産生の
検出は、矢内原の方法〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｈｏｒｍｏｎｅｓ １ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３．
２８ （１９８３） ）に従って、Ｉ ＧＦ−１断片
（２６−４６）の抗体を用いて、放射免疫測定法（以下
ＲＩＡという）により行った。
（２） プラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐを用い
ての旦１装置 中でのＩＧＦ−１遺伝子の発現プラス
ミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐを含有するＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩをＬブロス中で一夜培養したものを、ト
リプトファン不含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールア
クリル酸誘導条件下に細胞を３７℃で３時間インキュベ
ートした。Ｉ ＧＦ−Ｉ産生の検知は、矢内原の方法に
従って、ＩＣＦ−■断片（２６〜４６）の抗体を用いＲ
ＩＡによって行った。
ての旦１装置 中でのＩＧＦ−１遺伝子の発現プラス
ミドｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐを含有するＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩをＬブロス中で一夜培養したものを、ト
リプトファン不含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールア
クリル酸誘導条件下に細胞を３７℃で３時間インキュベ
ートした。Ｉ ＧＦ−Ｉ産生の検知は、矢内原の方法に
従って、ＩＣＦ−■断片（２６〜４６）の抗体を用いＲ
ＩＡによって行った。
〔５〕融合ＩＧＦ−・Ｉをコードする遺伝子の宿主生物
中での発現： ＋１１ 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｔ （タイ
プ■）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白
ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−Ｉ （タイプＩ）をコード
する遺伝子を発現させるため、プロモーター遺伝子と、
蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプ■）とを有す
るプラスミドを用いて宿主生物を形質転換し、つぎに、
そのプラスミドを有する宿主生物を適当な培地中で培養
する。得られた培養液から蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ Ｇ
Ｆ−Ｉ（タイプｌ）を単離する。
中での発現： ＋１１ 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｔ （タイ
プ■）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：蛋白
ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−Ｉ （タイプＩ）をコード
する遺伝子を発現させるため、プロモーター遺伝子と、
蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプ■）とを有す
るプラスミドを用いて宿主生物を形質転換し、つぎに、
そのプラスミドを有する宿主生物を適当な培地中で培養
する。得られた培養液から蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ Ｇ
Ｆ−Ｉ（タイプｌ）を単離する。
（ｉ）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１をコードする遺
伝子のプラスミドｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐを用いての、旦
、延中での発現： ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐを含有する旦０匹旦 ＨＢＩＯＩ
をＬブロス中で一夜培養したものを、トリプトファン不
含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールアクリル酸誘導の
条件下に細胞を３７℃で３時間インキュベートした。融
合Ｉ ＧＦ−Ｉ産出の検知は、矢内原の方法〔矢内原ら
、Ｐ ｅｐｔｉｄｅＨｏｒｏｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎ
ｃｒｅａｓ＋ ３． ２８（１９８３））に従って、
Ｉ ＣＦ−１断片（２６−４６）の抗体を用いる放射免
疫測定法（以下ＲＩＡという）によって実施した。
伝子のプラスミドｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐを用いての、旦
、延中での発現： ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐを含有する旦０匹旦 ＨＢＩＯＩ
をＬブロス中で一夜培養したものを、トリプトファン不
含Ｍ９培地で稀釈し、β−インドールアクリル酸誘導の
条件下に細胞を３７℃で３時間インキュベートした。融
合Ｉ ＧＦ−Ｉ産出の検知は、矢内原の方法〔矢内原ら
、Ｐ ｅｐｔｉｄｅＨｏｒｏｍｏｎｅｓ ｉｎ Ｐａｎ
ｃｒｅａｓ＋ ３． ２８（１９８３））に従って、
Ｉ ＣＦ−１断片（２６−４６）の抗体を用いる放射免
疫測定法（以下ＲＩＡという）によって実施した。
（１１）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ）
の単離： 培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。遠心分。
の単離： 培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。遠心分。
離によってベレットを集め、つぎに、０．１ Ｍのジチ
オスレイトール（以下、ＤＴＴと略称する）を含有する
８Ｍ尿素溶液に溶解した。遠心分離後、溶液を８３００
カラムクロマトグラフイにより精製した。ＲＩＡによっ
て検知された活性画分を集め、透析して、所望の成分を
含有する蛋白を得た。
オスレイトール（以下、ＤＴＴと略称する）を含有する
８Ｍ尿素溶液に溶解した。遠心分離後、溶液を８３００
カラムクロマトグラフイにより精製した。ＲＩＡによっ
て検知された活性画分を集め、透析して、所望の成分を
含有する蛋白を得た。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、正規
の位置（１５５００）に融合ＩＧＦ−１が検出された。
の位置（１５５００）に融合ＩＧＦ−１が検出された。
こうして得た蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−１（タイプ
Ｉ）は次の通りである。
Ｉ）は次の通りである。
Ｃｙ ５−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｖａ １−Ｌｙ ５−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏｌ１０５ｅｒ−８ｅｒ−Ａｒ工１ｅ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−９ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ −Ｔｙｒ −Ｃｙ ｓ
−Ａ ｌａ −Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ −Ｐ
ｒｏ −Ａｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａ （２） 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ
Ｉ）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：（ｉ）
プラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐを用いての、蛋白ペプ
チドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩ）をコードする遺
伝子のＥ、 ｃｏｌｔ中での発現：このプロセスは、蛋
白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−■ （タイプＩ）をコード
する遺伝子の場合と同様のやり方に従って実施できる。
Ｔｙｒ−Ｖａ １−Ｌｙ ５−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏｌ１０５ｅｒ−８ｅｒ−Ａｒ工１ｅ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−９ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ −Ｔｙｒ −Ｃｙ ｓ
−Ａ ｌａ −Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ −Ｐ
ｒｏ −Ａｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌａ （２） 蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩ
Ｉ）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現：（ｉ）
プラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐを用いての、蛋白ペプ
チドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩ）をコードする遺
伝子のＥ、 ｃｏｌｔ中での発現：このプロセスは、蛋
白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−■ （タイプＩ）をコード
する遺伝子の場合と同様のやり方に従って実施できる。
（ｉｉ ）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ （タイ
プＩＩ）の単離 このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ（タ
イプＩ）の単離と同様のやり方に従って実施できる。
プＩＩ）の単離 このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ（タ
イプＩ）の単離と同様のやり方に従って実施できる。
こうして得た蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプ
ＩＩ）次の通りである： Ｃｙ ｓ −Ｔｙｒ−Ｃｙ ５−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ １−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ｓ −Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｖａ １−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−ＡＳｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−
Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−６ｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ
１−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙ ５−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−”Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｐｈｅ
−Ｖａ １−Ｃｙ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒ ｇ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ −Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｌｙ
ｓ −Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５
ｅｒ −Ｓｅ ｒ −Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ
−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ５−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙ ５−８
ｅｒ−Ａｌａ（３）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦＩ
（タイプ■）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現
：（ｉ）プラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐをもちいての
、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ （タイプ■）の
呈、延中での発現 このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タ
イプ■）をコードする遺伝子の発現のそれと同様のやり
方に従って実施できる。
ＩＩ）次の通りである： Ｃｙ ｓ −Ｔｙｒ−Ｃｙ ５−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ １−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ｓ −Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｖａ １−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−ＡＳｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−
Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−６ｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ
１−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙ ５−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−”Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ−Ａｌ ａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｐｈｅ
−Ｖａ １−Ｃｙ ｓ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒ ｇ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ −Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｌｙ
ｓ −Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−５
ｅｒ −Ｓｅ ｒ −Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｖａｌ
−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ５−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙ ５−８
ｅｒ−Ａｌａ（３）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦＩ
（タイプ■）をコードする遺伝子の宿主生物中での発現
：（ｉ）プラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐをもちいての
、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ （タイプ■）の
呈、延中での発現 このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タ
イプ■）をコードする遺伝子の発現のそれと同様のやり
方に従って実施できる。
（１１）蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−１（タイプ■）
の単離： このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ （
タイプＩ）の単離のそれと同様のやり方に従って実施で
きる。
の単離： このプロセスは、蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ （
タイプＩ）の単離のそれと同様のやり方に従って実施で
きる。
こうして得た蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ ＧＦ−１（タイ
プ■）は次の通りである： Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇ′、ｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−６ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ １−Ｌｙｓ
−Ｈｉ ５−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ １−Ｃｙ ５
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−６ｅｒ−９ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉ １
ｅ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｑ−Ａｒ５−Ａｓｐ−７１３０Ｌｅｕ−Ａｒｑ−Ａｒ
５−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ〔７〕融合Ｉ ＧＦ−１のＩ
ＧＦ−１への変換およびＩＧＦ−Ｉの単離： こうして得た融合Ｉ ＣＦ−Ｉは、保護ペプチドの脱離
反応によってＩＧＦ−１に変換できる。
プ■）は次の通りである： Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇ′、ｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−５ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−６ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ １−Ｌｙｓ
−Ｈｉ ５−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ １−Ｃｙ ５
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｌｙ−６ｅｒ−９ｅｒ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉ １
ｅ−Ｖａ １−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｑ−Ａｒ５−Ａｓｐ−７１３０Ｌｅｕ−Ａｒｑ−Ａｒ
５−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ〔７〕融合Ｉ ＧＦ−１のＩ
ＧＦ−１への変換およびＩＧＦ−Ｉの単離： こうして得た融合Ｉ ＣＦ−Ｉは、保護ペプチドの脱離
反応によってＩＧＦ−１に変換できる。
この脱離反応は、ペプチド化学の領域で用いられる常法
に従って実施できる。融合ＩＣＦ−Ｉのタイプに応じて
適当な脱離反応を選択することができる。
に従って実施できる。融合ＩＣＦ−Ｉのタイプに応じて
適当な脱離反応を選択することができる。
この脱離反応で使用される適当な反応剤には、臭化シア
ン； （３−ブロモ−２−０−ニトロフェルスルフェニ
ル）スカトール（以下ＢＮＰＳ−スカトールと略称する
）またはＮ−クロルスクシンイミド（以下ＮＣ３と略称
する）；コラゲナーゼなどが包含されうる。
ン； （３−ブロモ−２−０−ニトロフェルスルフェニ
ル）スカトール（以下ＢＮＰＳ−スカトールと略称する
）またはＮ−クロルスクシンイミド（以下ＮＣ３と略称
する）；コラゲナーゼなどが包含されうる。
この脱離反応は通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の
溶媒中、緩和な条件下で実施される。
溶媒中、緩和な条件下で実施される。
反応温度はとくに限定されないが、通常は、冷却下ない
しは加温下で反応を実施する。
しは加温下で反応を実施する。
最も好ましい３タイプの融合Ｉ ＧＦ−１に適用できる
脱離反応を以下に詳しく説明する。
脱離反応を以下に詳しく説明する。
（１１蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチド
と融合したＩＣｌ−１からの蛋白ペプチドの脱離： 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
したＩＧＦ−１は、臭化シアンを用いた脱離反応によっ
て、Ｉ ＧＦ−Ｉに変換できる。
と融合したＩＣｌ−１からの蛋白ペプチドの脱離： 蛋白ペプチドのメチオニンを介して蛋白ペプチドと融合
したＩＧＦ−１は、臭化シアンを用いた脱離反応によっ
て、Ｉ ＧＦ−Ｉに変換できる。
この場合、ＩＧＦ−Ｉはアミノ酸配列の５９番目の位置
にメチオニンをもつが、ＩＧＦｉの５９番目のメチオニ
ンと６０番目のチロシンとを連結するアミド結合の開裂
は、ＩＧｆ−１の最初のアミノ酸の前方のメチオニンと
Ｉ ＣＦ−１の最初のアミノ酸、すなわちグリシン、と
を連結するアミド結合の開裂よりもあとで起こる。この
現象、すなわちメチオニン隣接結合の開裂の順序は本発
明者らによりはじめて見出されたものである。この現象
に従って、蛋白ペプチドは、適当な条件を選択すれば、
臭化シアンによって該融合ＩＧＩ−■から脱離反応によ
り容易に除去できる。
にメチオニンをもつが、ＩＧＦｉの５９番目のメチオニ
ンと６０番目のチロシンとを連結するアミド結合の開裂
は、ＩＧｆ−１の最初のアミノ酸の前方のメチオニンと
Ｉ ＣＦ−１の最初のアミノ酸、すなわちグリシン、と
を連結するアミド結合の開裂よりもあとで起こる。この
現象、すなわちメチオニン隣接結合の開裂の順序は本発
明者らによりはじめて見出されたものである。この現象
に従って、蛋白ペプチドは、適当な条件を選択すれば、
臭化シアンによって該融合ＩＧＩ−■から脱離反応によ
り容易に除去できる。
この反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶
媒中、緩和な条件下で行われる。
媒中、緩和な条件下で行われる。
反応温度はとくに限定されず、通常は、冷却ないし加温
のもとて反応を行う。
のもとて反応を行う。
蛋白ペプチドＬＨのメチオニンを介して蛋白ペプチドＬ
Ｈと融合したＩＧＦ−Ｉ （タイプＩ）からの蛋白ペ
プチドＬＨの離脱： 融合Ｉ ＣＦ−１を、６０％蟻酸中２５℃で３時間臭化
シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣を、５０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含有する８Ｍ尿素溶液に溶解
させ、透析して、還元型ＩＧＦ−Ｉの粗混合物を得た。
Ｈと融合したＩＧＦ−Ｉ （タイプＩ）からの蛋白ペ
プチドＬＨの離脱： 融合Ｉ ＣＦ−１を、６０％蟻酸中２５℃で３時間臭化
シアンで処理した。凍結乾燥後、残渣を、５０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含有する８Ｍ尿素溶液に溶解
させ、透析して、還元型ＩＧＦ−Ｉの粗混合物を得た。
この混合物をカチオン交換クロマトグラフィ （ＣＭ５
２）によってｎ製し、ＲＩＡで検知された活性画分を集
めて、透析した。透析後の両分を高速液体クロマトグラ
フィにかけて、純粋な還元型ＩＧＦ−１を得た。この還
元Ｉ ＧＦ−Ｉを、通常の再生法（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ
）によって酸化型Ｉ ＧＦ−１に変換した。精製された
ＩＧＦ−１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）に際して単一のバンドを示し、またそのｒＧＦ−
１は、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｔ＋ｍｂｅｌ博士から贈ら
れたＩＣＦ−Ｉの標品と重なった。
２）によってｎ製し、ＲＩＡで検知された活性画分を集
めて、透析した。透析後の両分を高速液体クロマトグラ
フィにかけて、純粋な還元型ＩＧＦ−１を得た。この還
元Ｉ ＧＦ−Ｉを、通常の再生法（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ
）によって酸化型Ｉ ＧＦ−１に変換した。精製された
ＩＧＦ−１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）に際して単一のバンドを示し、またそのｒＧＦ−
１は、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｔ＋ｍｂｅｌ博士から贈ら
れたＩＣＦ−Ｉの標品と重なった。
ＩＧＦｉのアミノ酸配列を、エドマン法とカルボキシペ
プチダーゼ法とを組合せて、決定した。
プチダーゼ法とを組合せて、決定した。
そのＩＧＦ−１はＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３？ウス細胞に
よる〔３Ｈ〕−チミジン取込みアッセイにおいて生物活
性を示した。
よる〔３Ｈ〕−チミジン取込みアッセイにおいて生物活
性を示した。
（２） 蛋白ペプチドのトリプトファンを介して蛋白
ペプチドと融合したＩ ＧＦ−１からの蛋白ペプチドの
脱離： 蛋白ペプチドのトリプトファンを介して蛋白ペプチドと
融合したＩＧＦ−１は、ＢＮＰＳ−スカトールまたはＮ
−クロルスクシンイミドを用いる脱離反応によって、Ｉ
ＧＦＩに変換できる。
ペプチドと融合したＩ ＧＦ−１からの蛋白ペプチドの
脱離： 蛋白ペプチドのトリプトファンを介して蛋白ペプチドと
融合したＩＧＦ−１は、ＢＮＰＳ−スカトールまたはＮ
−クロルスクシンイミドを用いる脱離反応によって、Ｉ
ＧＦＩに変換できる。
この反応は、通常、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶
媒中で、緩和な条件下に行われる。
媒中で、緩和な条件下に行われる。
反応温度はとくに制限されず、通常は、冷却下ないし加
温下で反応を行う。
温下で反応を行う。
蛋白ペプチドＬＨのトリプトファンを介して蛋白ペプチ
ドＬＨと融合したＩＧＦ−１（タイプＩＩ）からの蛋白
ペプチドＬＨの脱１１！ ：融合Ｉ ＧＦ−Ｉを、７０％蟻酸中ＢＮＰＳ−スカト
ールでまたは尿素中のＮＣ３で処理した。
ドＬＨと融合したＩＧＦ−１（タイプＩＩ）からの蛋白
ペプチドＬＨの脱１１！ ：融合Ｉ ＧＦ−Ｉを、７０％蟻酸中ＢＮＰＳ−スカト
ールでまたは尿素中のＮＣ３で処理した。
反応後、混合物を２−メルカプトエタノールで処理し、
つぎに逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で精製して、Ｉ
ＧＦ−１スルホキシドを得た。このＩＧＦ−１スルホキ
シドを５０℃で５Ｍチオグリコール酸処理し、混合物を
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で精製して、純粋な還
元型ＩＧＦ−１を得た。この還元型ＩＧＦ−１は、蛋白
ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−１（タイプＩ）の脱離反応に
よって得たものと同一であることを確認した。
つぎに逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で精製して、Ｉ
ＧＦ−１スルホキシドを得た。このＩＧＦ−１スルホキ
シドを５０℃で５Ｍチオグリコール酸処理し、混合物を
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で精製して、純粋な還
元型ＩＧＦ−１を得た。この還元型ＩＧＦ−１は、蛋白
ペプチドＬＨ融合ＩＣＦ−１（タイプＩ）の脱離反応に
よって得たものと同一であることを確認した。
（３）蛋白ペプチドのｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−」
を介して蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−１からの蛋白
ペプチドの脱離： 蛋白ペプチドのｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｊを介し
て蛋白ペプチドと融合したＩ ＧＦ−Ｔは、コラゲナー
ゼを用いた脱離反応によってＩ Ｇｌ−■に変換できる
。
を介して蛋白ペプチドと融合したＩＧＦ−１からの蛋白
ペプチドの脱離： 蛋白ペプチドのｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｊを介し
て蛋白ペプチドと融合したＩ ＧＦ−Ｔは、コラゲナー
ゼを用いた脱離反応によってＩ Ｇｌ−■に変換できる
。
その反応は、通常、反応に悪影響を与えない慣用の溶媒
中、緩和な条件下で実施される。
中、緩和な条件下で実施される。
反応温度はとくに限定されず、通常は、冷却下ないし加
温下で反応を行う。
温下で反応を行う。
蛋白ペプチドＬＨのｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−」を
介して蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉ（タイプ
■）からの蛋白ペプチドＬＨの脱離：融合Ｉ ＧＦ−１
を、２．４Ｍ尿素または２Ｍ塩酸グアニジン中、３０℃
で１８時間、コラゲナーゼで処理した。反応混合物にＤ
ＴＴを加えたのち、ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で分析
して、還元型Ｉ ＣＦ−１に相当するビークを検出した
。
介して蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉ（タイプ
■）からの蛋白ペプチドＬＨの脱離：融合Ｉ ＧＦ−１
を、２．４Ｍ尿素または２Ｍ塩酸グアニジン中、３０℃
で１８時間、コラゲナーゼで処理した。反応混合物にＤ
ＴＴを加えたのち、ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）で分析
して、還元型Ｉ ＣＦ−１に相当するビークを検出した
。
（８）ＩＧＦＩの放射免疫測定：
矢内原〔矢内原ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｏｒｍｏｎｅ
ｓ １ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８
３） ）が確立した方法に従って、ＩＧＦ−ＩのＲＩＡ
を行った。上記の試料または標準試料（ＩＧＦ−１断片
（２６−４６））の０．１ｍｌを、試料用緩衝液（０，
０１Ｍ ＰＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中、０．５
％ＢＳＡ（ｐＨ７，４） （０，４ｍＡり ） 、Ｉ
ＧＦ−１（２６−４６）に対するウサギの抗血清（０
，１ｍβ）および”’Ｉ−ＩＧＦ−１ （２６−４６
）（０，１ｍｊりと混合した。混合物を４℃に４８時間
放置し、っぎに、ウサギ血清（０，１ｍＪ）、ウサギγ
−グロブリン抗血清（０，１ｍｊりおよび５％Ｐ Ｅ
Ｇ６０００（０，９ｍＪ）を加えた。４℃でさらに２時
間放置したのち、遠心分離（３ｋｒｐｍ、４℃、３０分
間）によってベレットを集め、γ−カウシターで放射活
性を測定した。この放射活性からＩＧＩ−■の含量を算
出した。
ｓ １ｎＰａｎｃｒｅａｓ、 ３． ２８ （１９８
３） ）が確立した方法に従って、ＩＧＦ−ＩのＲＩＡ
を行った。上記の試料または標準試料（ＩＧＦ−１断片
（２６−４６））の０．１ｍｌを、試料用緩衝液（０，
０１Ｍ ＰＢＳ、０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中、０．５
％ＢＳＡ（ｐＨ７，４） （０，４ｍＡり ） 、Ｉ
ＧＦ−１（２６−４６）に対するウサギの抗血清（０
，１ｍβ）および”’Ｉ−ＩＧＦ−１ （２６−４６
）（０，１ｍｊりと混合した。混合物を４℃に４８時間
放置し、っぎに、ウサギ血清（０，１ｍＪ）、ウサギγ
−グロブリン抗血清（０，１ｍｊりおよび５％Ｐ Ｅ
Ｇ６０００（０，９ｍＪ）を加えた。４℃でさらに２時
間放置したのち、遠心分離（３ｋｒｐｍ、４℃、３０分
間）によってベレットを集め、γ−カウシターで放射活
性を測定した。この放射活性からＩＧＩ−■の含量を算
出した。
（９）ＩＧＦ−Ｉの生物学的アッセイ：ＢＡＬＢ／ｃ
３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クローンＡ３１）をト
リプシン処理し、５％のウシ胎児血清と２５ｍＭのＮ−
（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有するダルベツコーフ
ォークトの改変イーグル培地中に、１０’細胞／ ｍ
ｅの濃度に再懸濁した。１００μｌづつを０．３−のウ
ェル（９６ウエルのマイクロタイタープレート、コスタ
−社製）に入れた。均一な単層細胞が形成されてから（
最初のプレート調製から５〜７日後）３〜４日後に、培
地を除去し、培養物を３回洗い、つぎに、０．２μＣｉ
／ウエルの（”Ｈ）チミジン（０，６７Ｃｊ／ｍｍｏ
Ｉ）および被検試料を加えた。２４時間のインキュベー
ションののち、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗い、放
射能測定のためトリプシン処理した。細胞を半自動のマ
ルチプ／Ｌ／ セ／Ｌ／ Ａ −ヘスタ（ＬＡＶＯ，Ｍ
ＡＳＨ，ラボ・サイエンス）を使用して、ガラスフィル
ターに捕捉した。取込まれた（ Ｈ）チミジンを、アク
タゾール２（二ニー・イングランド・ニュクリアー）
−８ｍｊ２中で、パラカード・トライ−カーブ
液体シンチレーシコンカウンタを用いて、カウントした
。
３Ｔ３マウスの胚線維芽細胞（クローンＡ３１）をト
リプシン処理し、５％のウシ胎児血清と２５ｍＭのＮ−
（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有するダルベツコーフ
ォークトの改変イーグル培地中に、１０’細胞／ ｍ
ｅの濃度に再懸濁した。１００μｌづつを０．３−のウ
ェル（９６ウエルのマイクロタイタープレート、コスタ
−社製）に入れた。均一な単層細胞が形成されてから（
最初のプレート調製から５〜７日後）３〜４日後に、培
地を除去し、培養物を３回洗い、つぎに、０．２μＣｉ
／ウエルの（”Ｈ）チミジン（０，６７Ｃｊ／ｍｍｏ
Ｉ）および被検試料を加えた。２４時間のインキュベー
ションののち、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗い、放
射能測定のためトリプシン処理した。細胞を半自動のマ
ルチプ／Ｌ／ セ／Ｌ／ Ａ −ヘスタ（ＬＡＶＯ，Ｍ
ＡＳＨ，ラボ・サイエンス）を使用して、ガラスフィル
ターに捕捉した。取込まれた（ Ｈ）チミジンを、アク
タゾール２（二ニー・イングランド・ニュクリアー）
−８ｍｊ２中で、パラカード・トライ−カーブ
液体シンチレーシコンカウンタを用いて、カウントした
。
以下、実施例を示し、この発明を説明する。
実施例Ｉ
ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成＋１１ ＤＭＴ
ｒＯＴｐｏＡ口ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡＣＵｐｏ−
セルロースの合成： １）ＨＯＧ”ｐ ｏ”Ｕｐ ｏ−セルロース付加物＝Ｄ
ＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−セルロース（１３０
，４ｍｇ、 ４．５９μｍｏｌｅ”） （Ｒ、Ｃｒｅａ
の方法１）により製造）のメタノール／クロロホルム（
１：９Ｖ／Ｖ、 ５．０ｍｊ２） ＠濁液にＴＣＡ／ク
ロロホルム（２：８ Ｗ／Ｖ、 ５．０ｍ１） ヲ冷却
下ニ加工、０℃テ１０分間攪拌する。クロロホルム（２
ｍｊりおよびメタノール（６，Ｏｆｆ＋ ｊ！ ）て洗
浄後、濾紙上のセルロース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃ
Ｕｐ ｏ−セルロース）を乾燥させた。この際、水はピ
リジン（２ｍｊりとの共沸混合物として分離した。
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇｌ）の合成＋１１ ＤＭＴ
ｒＯＴｐｏＡ口ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡＣＵｐｏ−
セルロースの合成： １）ＨＯＧ”ｐ ｏ”Ｕｐ ｏ−セルロース付加物＝Ｄ
ＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−セルロース（１３０
，４ｍｇ、 ４．５９μｍｏｌｅ”） （Ｒ、Ｃｒｅａ
の方法１）により製造）のメタノール／クロロホルム（
１：９Ｖ／Ｖ、 ５．０ｍｊ２） ＠濁液にＴＣＡ／ク
ロロホルム（２：８ Ｗ／Ｖ、 ５．０ｍ１） ヲ冷却
下ニ加工、０℃テ１０分間攪拌する。クロロホルム（２
ｍｊりおよびメタノール（６，Ｏｆｆ＋ ｊ！ ）て洗
浄後、濾紙上のセルロース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃ
Ｕｐ ｏ−セルロース）を乾燥させた。この際、水はピ
リジン（２ｍｊりとの共沸混合物として分離した。
＊この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５０７ｒ＋ｍ
で測定して算出した。
で測定して算出した。
１） Ｒ，Ｃｒｅａ ら−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、＋主、２３３１ （１９８０） ｉｉ）ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏ−の調製
：ＤＭＴｒＯＴｐｏＡ”ｐｏＴｐｏ−〇Ｅ （３９，
９ｍｇ、 ２３．０μｍｏｌｅ）をトリエチルアミン−
アセトニトリル（１：Ｉ Ｖ／ν、５ｍｌ を室温で１
時間処理して得られたホスホジエステルトリマー（ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＡ口ｐｏＴｐｏ−）を乾燥させた。水はピ
リジンとの共沸混合物（０，５ｎｊ！、 ２Ｘ１ｍｌ
り として分離した。
ｄｓ Ｒｅｓ、＋主、２３３１ （１９８０） ｉｉ）ＤＭＴｒＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏ−の調製
：ＤＭＴｒＯＴｐｏＡ”ｐｏＴｐｏ−〇Ｅ （３９，
９ｍｇ、 ２３．０μｍｏｌｅ）をトリエチルアミン−
アセトニトリル（１：Ｉ Ｖ／ν、５ｍｌ を室温で１
時間処理して得られたホスホジエステルトリマー（ＤＭ
ＴｒＯＴｐｏＡ口ｐｏＴｐｏ−）を乾燥させた。水はピ
リジンとの共沸混合物（０，５ｎｊ！、 ２Ｘ１ｍｌ
り として分離した。
ｉｉｉ ）カップリング
トリマー（ＤＭＴ ｒ ＯＴ ｐ ｏ Ａ口ｐｏＴｐｏ
−）セルロース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ Ｏ−
（！／Ｉ／ロース）と１０ｍｊ！容九底フラスコ中で混
合した。
−）セルロース付加物（ＨＯＧ”ｐ ｏＡｃＵｐ Ｏ−
（！／Ｉ／ロース）と１０ｍｊ！容九底フラスコ中で混
合した。
混合物を乾燥させ（水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ
１ｍｊ２）として分離）、無水ピリジン（１ｍ Ａ ）
に再懸濁させた。
１ｍｊ２）として分離）、無水ピリジン（１ｍ Ａ ）
に再懸濁させた。
メンチレンスルホニルニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）
（６８，０ｍｇ、 ２３０μｍｏｌｅ）をこの懸濁
液に加え、室温で１時間攪拌した。次いでとリジンを反
応容器に加え、セルロース付加物を遠心分離（３０００
ｒｐｍ、 ２分間）ニヨリ回収シタ。
（６８，０ｍｇ、 ２３０μｍｏｌｅ）をこの懸濁
液に加え、室温で１時間攪拌した。次いでとリジンを反
応容器に加え、セルロース付加物を遠心分離（３０００
ｒｐｍ、 ２分間）ニヨリ回収シタ。
ｉｖ）未反応５′ヒドロキシル基のアセチル化：前記セ
ルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：Ｉ
Ｖ／Ｖ、 ５．５ｍｊ２） ニ懸濁し、室温で３０分間
攪拌した。ピリジン（５ｍ Ｉｌ）中で反復遠心分離（
３０００ｒｐｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍＡ
りで洗浄、室温で３０分間真空乾燥することにより、セ
ルロース生成物（１１３，９ｎ＋ｇ）を得た。このセル
ロース付加物（ＤＭＴ ｒ ＯＴ ｐ ｏ Ａｌｌ″ｐ
ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ ＣＵ ｐ ｏ−セ
ルロース）は次のカップリング工程に使用できる。
ルロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：Ｉ
Ｖ／Ｖ、 ５．５ｍｊ２） ニ懸濁し、室温で３０分間
攪拌した。ピリジン（５ｍ Ｉｌ）中で反復遠心分離（
３０００ｒｐｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍＡ
りで洗浄、室温で３０分間真空乾燥することにより、セ
ルロース生成物（１１３，９ｎ＋ｇ）を得た。このセル
ロース付加物（ＤＭＴ ｒ ＯＴ ｐ ｏ Ａｌｌ″ｐ
ｏ Ｔ ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ ＣＵ ｐ ｏ−セ
ルロース）は次のカップリング工程に使用できる。
（２１ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＧ”ｐｏＣＩｌ！ｐｏＴｐ。
ＡＢｚＩ）ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡＣＵｐ ｏ−セルロ
ースの合成： ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＧ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡ口ｐＯＴ
ｐＯＧＩＩｌｐＯＡｃＵｐＯ−セルロースは、ＤＭＴｒ
ＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＵｐＯ−
セルロース（１１３，９ｍｇ）とＤＭＴｒＯＧ”ｐ。
ースの合成： ＤＭＴｒＯＧ”ｐｏＧ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡ口ｐＯＴ
ｐＯＧＩＩｌｐＯＡｃＵｐＯ−セルロースは、ＤＭＴｒ
ＯＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏＡｃＵｐＯ−
セルロース（１１３，９ｍｇ）とＤＭＴｒＯＧ”ｐ。
Ｇ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ −ＣＥ （４３，７ｍｇ）か
ら前記と同様の条件により合成した。
ら前記と同様の条件により合成した。
１３） ＤＭＴ ｒ ＯＡ１１Ｉ！ｐ ｏ Ｃｌｌｚ
ｐ ｏ ＣＢｚｐ ｏ Ｇ”ｐｏ Ｇ′Ｅｐ ｏ ＣＢ
ｚｐ ｏ Ｔｐ ｏ Ａ”ｐ ｏＴｐ ｏ Ｇ”ｐｏ
Ａ ＣＵ １１） Ｏ−セルロースの合成：ＤＭＴ ｒ
ＯＡ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ ＧｉＩＩｐ
。
ｐ ｏ ＣＢｚｐ ｏ Ｇ”ｐｏ Ｇ′Ｅｐ ｏ ＣＢ
ｚｐ ｏ Ｔｐ ｏ Ａ”ｐ ｏＴｐ ｏ Ｇ”ｐｏ
Ａ ＣＵ １１） Ｏ−セルロースの合成：ＤＭＴ ｒ
ＯＡ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ ＧｉＩＩｐ
。
Ｇ”ｐ ＱＣＢ２ｐＯＴｐＯＡＢｚｌ）ＯＴｐ ｏＧ”
ｐ 。
ｐ 。
Ａ ｃ Ｕ ｐ ｏ−セルロース（１０５，８ｍｇ）は
ＤＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ
”ｐ ｏＴｐ ｏＧ″”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−セルロー
ス（１０９，５ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡＩｌｌｐ ＯＣＢ
ｚＩ） ＯＣ”ｐ ｏ −ＣＥ （４４，Ｏｍｇ）から
同様の条件により合成した。
ＤＭＴｒＯＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＣ”ｐ ｏＴｐ ｏＡ
”ｐ ｏＴｐ ｏＧ″”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−セルロー
ス（１０９，５ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡＩｌｌｐ ＯＣＢ
ｚＩ） ＯＣ”ｐ ｏ −ＣＥ （４４，Ｏｍｇ）から
同様の条件により合成した。
（４１ＤＭＴ ｒ ＯＣ”ｐ ｏ Ｃ口ｐｏＧｉＢｐｏ
ＡＩＩｇｐｏ Ｃ，ｌ１ｚｐ ｏ Ｃｌｌ２ｐ ｏ Ｇ
”ｐ ｏ ＧＩＲｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｔｐ ｏＡｌ！
ｐ ｏＴｐ ｏＧ″′ｐ ０ＡｅＵｐＯ−セルｏ−スの
合成： ＤＭＴ ｒ ＯＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ
Ｑ”ｐ ｏ Ａ１１ｚｐ 。
ＡＩＩｇｐｏ Ｃ，ｌ１ｚｐ ｏ Ｃｌｌ２ｐ ｏ Ｇ
”ｐ ｏ ＧＩＲｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｔｐ ｏＡｌ！
ｐ ｏＴｐ ｏＧ″′ｐ ０ＡｅＵｐＯ−セルｏ−スの
合成： ＤＭＴ ｒ ＯＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ
Ｑ”ｐ ｏ Ａ１１ｚｐ 。
Ｃｌ１ｚｐ ｏＣ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＧ″′ｐ ｏＣｌ
ｌｚｐ ｏＴｐｏ Ａ”ｐ ｏ Ｔｐ ｏ Ｇ′Ｂｐ
Ｏ”Ｕ Ｉ） Ｏ−セルロース（９４，５ｍｇ）はＤＭ
Ｔ ｒ ＯＡｌ１ｚｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。
ｌｚｐ ｏＴｐｏ Ａ”ｐ ｏ Ｔｐ ｏ Ｇ′Ｂｐ
Ｏ”Ｕ Ｉ） Ｏ−セルロース（９４，５ｍｇ）はＤＭ
Ｔ ｒ ＯＡｌ１ｚｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。
Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏＣＢｚｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏ
Ｔｐ 。
Ｔｐ 。
ＧＩ ｌ ｐ ｏ Ａ ＣＵ ｐｏ−セルロース（１０
５，８ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ＱＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ
Ｇ”ｐ ｏ−ＧＥ （４３，５ｍｇ）から同様の条
件により合成した。
５，８ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ＱＣ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ ｏ
Ｇ”ｐ ｏ−ＧＥ （４３，５ｍｇ）から同様の条
件により合成した。
（５１ＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ ｏ ＡＢ２ｐ ｏ Ａ１
１ｌｌｐ ｏ ＣロｐｏＣＩＩｚｐｏＧｆｆｉＢｐｏＡ
ロｐｏｃＢｚｐｏＣＢ１′ｐｏＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ
ＣＢｚｐ ｏＴｐ ｏＡＢ″ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏ
ＡｃＵｐ ｏ−セｔＬｔａ−Ｘ（Ｄ合成：ＤＭＴｒＯＡ
”ｐｏＡ口ｐ ＯＡ Ｉ Ｚ ｐ ｏ Ｃ口ｐ。
１ｌｌｐ ｏ ＣロｐｏＣＩＩｚｐｏＧｆｆｉＢｐｏＡ
ロｐｏｃＢｚｐｏＣＢ１′ｐｏＧ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ
ＣＢｚｐ ｏＴｐ ｏＡＢ″ｐ ｏＴｐ ｏＧ”ｐ ｏ
ＡｃＵｐ ｏ−セｔＬｔａ−Ｘ（Ｄ合成：ＤＭＴｒＯＡ
”ｐｏＡ口ｐ ＯＡ Ｉ Ｚ ｐ ｏ Ｃ口ｐ。
Ｃ１１ｚｐＯＧｉＩｌｐＯＡＢ″ｐｏＣＢ！ｐｏＣ１１
２ｐＯＧＩｐｏＱｉｌｌｐ ＱＣＢ！ｐ ｏＴｐ ｏＡ
Ｂ２ｐ ｏＴｐ ｏａｉ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ −セル
ｏ−ス（９０，４ｍｇ）は、ＤＭＴ ｒＯＣ”ｐ ｏ
ＣＢｌ＋ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ１１ｚｐ ｏ ＣＢｚ
ｐ ｏ Ｃ口ｐｏＧ”ｐｏＧ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｌ
ｌｌｌｐ。
２ｐＯＧＩｐｏＱｉｌｌｐ ＱＣＢ！ｐ ｏＴｐ ｏＡ
Ｂ２ｐ ｏＴｐ ｏａｉ”ｐ ｏＡｃＵｐ ｏ −セル
ｏ−ス（９０，４ｍｇ）は、ＤＭＴ ｒＯＣ”ｐ ｏ
ＣＢｌ＋ｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏ Ａ１１ｚｐ ｏ ＣＢｚ
ｐ ｏ Ｃ口ｐｏＧ”ｐｏＧ”ｐｏＣ”ｐｏＴｐｏＡｌ
ｌｌｌｐ。
Ｔｐ ｏ ＧｉＩＩｐ ｏＡｃＵｐ ｏ−セルロース（
９４，５ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ ｏ Ａ”ｐ
ｏ ＡＢｚｐ ｏ−ＣＥ（４５，１ｍｇ）から同様の条
件下で合成した。この最終段階では未反応５′−ヒドロ
キシ基はアセチル基で保護する必要はなかった。
９４，５ｍｇ）とＤＭＴ ｒ ＯＡ”ｐ ｏ Ａ”ｐ
ｏ ＡＢｚｐ ｏ−ＣＥ（４５，１ｍｇ）から同様の条
件下で合成した。この最終段階では未反応５′−ヒドロ
キシ基はアセチル基で保護する必要はなかった。
（６１Ｈ’ ＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＧＯＨの合成：ＤＭＴｒＯＡ口ｐ ｏ ＡＢ！ｐ ｏ
Ａ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐ
ＧＯＨの合成：ＤＭＴｒＯＡ口ｐ ｏ ＡＢ！ｐ ｏ
Ａ”ｐ ｏ Ｃ”ｐ 。
ＣＩＩＩＩｐｏＧＩＩＩｐｏＡ口ｐ ｏ ＣＢｆｆｉｐ
ｏ ＣＢｚｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ｃ１１ｌ
ｌｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ａ
ｅ Ｕ ｐ ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）を０．
５Ｍ Ｎ。
ｏ ＣＢｚｐ ｏ Ｇ”ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ｃ１１ｌ
ｌｐ ｏＴｐ ｏＡ”ｐ ｏＴ ｐ ｏＧ”ｐ ｏ Ａ
ｅ Ｕ ｐ ｏ−セルロース（９０，４ｍｇ）を０．
５Ｍ Ｎ。
Ｎ、Ｎ’、Ｎ′−テトラメチルグアニジニウムピリジン
２−アルドキシマート〔ジオキサン−水（１：Ｉ Ｖ／
Ｖ、 １ｍ Ａ’）中〕と封管中、２０℃テ２０時間処
理した。
２−アルドキシマート〔ジオキサン−水（１：Ｉ Ｖ／
Ｖ、 １ｍ Ａ’）中〕と封管中、２０℃テ２０時間処
理した。
反応混合物に２８％（Ｗ／Ｗ）アンモニア水（１２ｍ
ｊ２ ）を加え、６０℃で２時間加熱した。固形セルロ
ースを濾別し、水（１０ｍ １２ ）で洗浄した。濾液
と洗液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５
ｍ ／ ）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残
渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル アンモニウム緩衝！（ｐ
Ｈ７”、５．２５ｍ７！’）に溶かし、ジエチルエーテ
ル（３×２５ｍ ｊ２ ）で洗浄した。水層を蒸 発乾
固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝
液（ｐＨ７，５，２ｍｌ に溶解し、溶液中に粗ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＧＯＨを得た。
ｊ２ ）を加え、６０℃で２時間加熱した。固形セルロ
ースを濾別し、水（１０ｍ １２ ）で洗浄した。濾液
と洗液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５
ｍ ／ ）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残
渣を０．１Ｍ炭酸トリエチル アンモニウム緩衝！（ｐ
Ｈ７”、５．２５ｍ７！’）に溶かし、ジエチルエーテ
ル（３×２５ｍ ｊ２ ）で洗浄した。水層を蒸 発乾
固し、残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝
液（ｐＨ７，５，２ｍｌ に溶解し、溶液中に粗ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐ
ＡｐＴｐＧＯＨを得た。
（７） ＨＯＡ ｐ Ａ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ Ｃｐ
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐｐＧｐｃｐＴｐＡｐＴｐＧ
ＯＨ（７）精製：ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムク
ロマトグラフィー（バイオゲルＰ ２２４ Ｘ ２．６
ｃｍ Ｉ Ｄ）により行った。最初の溶出ピークに相
当する両分（５０ｍＭ ＮＨ４０Ａ ｃ、 ０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、 １ｍｊ！／分）を取り、凍結乾燥し
最初の精製物を得た。
Ｇ ｐ Ａ ｐ Ｃｐ ＣｐｐＧｐｃｐＴｐＡｐＴｐＧ
ＯＨ（７）精製：ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムク
ロマトグラフィー（バイオゲルＰ ２２４ Ｘ ２．６
ｃｍ Ｉ Ｄ）により行った。最初の溶出ピークに相
当する両分（５０ｍＭ ＮＨ４０Ａ ｃ、 ０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、 １ｍｊ！／分）を取り、凍結乾燥し
最初の精製物を得た。
ｉｉ ）最初の精製物の２回目の精製はＨＰＬＣ（ＣＤ
Ｒ−１０，２５ｃｍＸ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）になり１Ｍ
酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノールか
ら４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性−
１−タノールまでの直線勾配（８０分間、１ｍＡ／分。
Ｒ−１０，２５ｃｍＸ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）になり１Ｍ
酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノールか
ら４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性−
１−タノールまでの直線勾配（８０分間、１ｍＡ／分。
６０℃）を用いて行い、２回目の精製物を得た。
１ｉｉ）２回目の精製物の第３回目の精製は逆相ＨＰＬ
Ｃ（Ｒｐ−１８−５μ（ｘ７７） 、 １５ｃｍＸ４
ｉｎｒＤ）により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．
１Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリ
ル水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｊ！／分
、室温）を用いて行い、最終精製物（ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧ
ＯＨ）を得た。
Ｃ（Ｒｐ−１８−５μ（ｘ７７） 、 １５ｃｍＸ４
ｉｎｒＤ）により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．
１Ｍ酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリ
ル水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｊ！／分
、室温）を用いて行い、最終精製物（ＨＯＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧ
ＯＨ）を得た。
（８） オリゴヌクレオチドの分析
（ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡＩ）ＣｐＣｐＧｐＧ
ｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ） ｉ）ホスホジェステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐｃｐｃｐＧｐＡｐｃｐｃｐＧｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（５μｇ、６１．１ｔｔβ）０．
２ Ｍ ＭｇＣ４２ｇ（１０μｊり、 ０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐ Ｈ８，５）（１０μＩｌ）お
よび ０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液（１３，３μ
７＋）の混合物をホスポジエステラーゼ（５単位、５μ
β）で室温にて２０分間処理し、続いて１００℃で２分
間加熱した。
ｐＣｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ） ｉ）ホスホジェステラーゼによる消化 ＨＯＡｐＡｐＡｐｃｐｃｐＧｐＡｐｃｐｃｐＧｐＧｐｃ
ｐＴｐＡｐＴｐＧＯＨ（５μｇ、６１．１ｔｔβ）０．
２ Ｍ ＭｇＣ４２ｇ（１０μｊり、 ０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！（ｐ Ｈ８，５）（１０μＩｌ）お
よび ０．１ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ水溶液（１３，３μ
７＋）の混合物をホスポジエステラーゼ（５単位、５μ
β）で室温にて２０分間処理し、続いて１００℃で２分
間加熱した。
１ｉ）ＨＰＬＣ分析
反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ（ＣＤＲ
−１０，２５ｃｍＸ ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）により水〜
２．。
−１０，２５ｃｍＸ ４．６ｍｍ Ｉ Ｄ）により水〜
２．。
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ３，４）の直線勾配（４０分
間、１．５ｍ＃／分、６０”Ｃ）を用いて行った。標準
品の面積を比較することにより、各ピーク面積からその
ヌクレオチド組成を決定した。
間、１．５ｍ＃／分、６０”Ｃ）を用いて行った。標準
品の面積を比較することにより、各ピーク面積からその
ヌクレオチド組成を決定した。
計算値： ｐ ＣａＨ２，０００，ｐＡＯＨ４，０００
゜ｐ ＴａＨ２，０００，ｐ ＣａＨ４，０００実測値
＝ｐｃｏＨ４，７６７、ｐＡＯＨ４，１２７゜ｐＴＯＭ
２，０５４．Ｉ） ＧＯＭ ４，０５２実施例２ オリゴヌクレオチド（Ａｔ、Ａ２．Ｂｌ、Ｂ２゜ＣＩ、
Ｃ２，Ｄｉ、Ｄ２．Ｅｌ、Ｂ２．Ｆｌ、Ｆ２゜Ｇ２．Ｈ
ｌ、Ｂ２．ＩＩ、１２．Ｊｌ、Ｊ２．Ｋｌ。
゜ｐ ＴａＨ２，０００，ｐ ＣａＨ４，０００実測値
＝ｐｃｏＨ４，７６７、ｐＡＯＨ４，１２７゜ｐＴＯＭ
２，０５４．Ｉ） ＧＯＭ ４，０５２実施例２ オリゴヌクレオチド（Ａｔ、Ａ２．Ｂｌ、Ｂ２゜ＣＩ、
Ｃ２，Ｄｉ、Ｄ２．Ｅｌ、Ｂ２．Ｆｌ、Ｆ２゜Ｇ２．Ｈ
ｌ、Ｂ２．ＩＩ、１２．Ｊｌ、Ｊ２．Ｋｌ。
Ｋ２．ＬＬ、Ｌ２．Ｍｌ、Ｍ２．Ｎｌ、Ｎ２，０１およ
び０２）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＧ工と同様
の方法で製造した。
び０２）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＧ工と同様
の方法で製造した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＧ
ｐＴＯＨ（Ａｌ）＋２１ ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２）（３）
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂｌ）（４） ＨＯＣＰＡＰＧＰＣＰ
ＧＰＣＰＣＰＧｐＣＰＡＰＣＰＡＰＧＰＡＰＧＯＨ（Ｂ
２）＋５１ ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１）（６） ＨＯＡ
ｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＴｐＴＯＨ（Ｃ２）（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐ
ＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ
＋Ｄｉ）（１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｂ２１（１１）
ＨＯＧＰＧＰＴＰＴＰＴＰＣＰＴＰＡＰＣＰＴＰＴＰ
ＣＰＡＰＡＩ）ＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２） ＨＯＧｐＧｐ
ＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｆ２）（１３１ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）（
１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１５） ＨＯ
ＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡ
ｐＧｐＡＯ）Ｔ （Ｂ２）（１６） ＨＯＧｐＣｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧ
ＯＨ（ＩＩ）（１刀ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（工２）（１
８１ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌｌ（１９） ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｊ２１（２０） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｉｌｌ
（２１） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｋ２１（２２） ＨＯＣ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐ
ＣｐＴＯＨ（Ｌｌ）（２３１ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｌ
２）（２４１ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｍｌ）（２５）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ｍ２１（２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｎｌｌ（２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２１（２９１Ｈ
ＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（０１１（３０） ＨＯＧｐＡｐＴ、ｐ
ＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨｆ０２）大施亘ユ オリゴヌクレオチド（ａ １． ａ ２． ａ ３
． ａ ４゜ａ５．ａ６．ｂｌ、ｂ２．ｂ３．ｂ４．
ｂ５．ｂ６゜ｃｌ、ｃ２．ｃ３．ｃ４．ｃ５．ｃ６．ｄ
ｉ、ｄ２゜ｄ３．ｄ４．ｄ５．ｄ６．ｅｌ、ｅ２．ｅ３
．ｅ４゜ｅ５，１１．１２および１３）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１記載の０１と同様の方法で
製造した。
ｐＴＯＨ（Ａｌ）＋２１ ＨＯＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ａ２）（３）
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＧＯＨ（Ｂｌ）（４） ＨＯＣＰＡＰＧＰＣＰ
ＧＰＣＰＣＰＧｐＣＰＡＰＣＰＡＰＧＰＡＰＧＯＨ（Ｂ
２）＋５１ ＨＯＣｐＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＣｐＴｐＧｐＧｐＴＯＨ（Ｃ１）（６） ＨＯＡ
ｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＴｐＴＯＨ（Ｃ２）（７） ＨＯＴｐＧｐＡｐＣｐ
ＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＴＯＨ
＋Ｄｉ）（１０） ＨＯＴｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐ
ＣｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｂ２１（１１）
ＨＯＧＰＧＰＴＰＴＰＴＰＣＰＴＰＡＰＣＰＴＰＴＰ
ＣＰＡＰＡＩ）ＣＯＨ（Ｆｌｌ（１２） ＨＯＧｐＧｐ
ＴｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｆ２）（１３１ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｇ２）（
１４） ＨＯＧｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ＣｐＴｐＣｐＧｐＴｐＣＯＨ（Ｈｌ）（１５） ＨＯ
ＣｐＧｐＧｐＴｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＧｐＡ
ｐＧｐＡＯ）Ｔ （Ｂ２）（１６） ＨＯＧｐＣｐ
ＧｐＣｐＡｐＣｐＣｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＴｐＧ
ＯＨ（ＩＩ）（１刀ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＧＯＨ（工２）（１
８１ＨＯＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧｐＴｐＡｐＧｐＡｐＣ
ｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧＯＨ（Ｊｌｌ（１９） ＨＯＧｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＴＯＨ（Ｊ２１（２０） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＧＯＨ（Ｉｌｌ
（２１） ＨＯＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｋ２１（２２） ＨＯＣ
ｐＧｐＡｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＣｐＧｐＴｐ
ＣｐＴＯＨ（Ｌｌ）（２３１ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＣｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｌ
２）（２４１ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡ
ｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｍｌ）（２５）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐＧｐＣｐＡ
ｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ｍ２１（２７） ＨＯＣｐＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡＯＨ
（Ｎｌｌ（２８１ＨＯＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｎ２１（２９１Ｈ
ＯＡｐＡｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（０１１（３０） ＨＯＧｐＡｐＴ、ｐ
ＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣＯＨｆ０２）大施亘ユ オリゴヌクレオチド（ａ １． ａ ２． ａ ３
． ａ ４゜ａ５．ａ６．ｂｌ、ｂ２．ｂ３．ｂ４．
ｂ５．ｂ６゜ｃｌ、ｃ２．ｃ３．ｃ４．ｃ５．ｃ６．ｄ
ｉ、ｄ２゜ｄ３．ｄ４．ｄ５．ｄ６．ｅｌ、ｅ２．ｅ３
．ｅ４゜ｅ５，１１．１２および１３）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１記載の０１と同様の方法で
製造した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＧ
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（ａ２
）（６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ａ６１（１０１ＨＯ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣ
ｐＴｐＴＯＨ（ｂ４）（１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（
ｂ５１（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３
） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ｃｌ）＋１４） ＨＯＴｐ
ＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（ｃ２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐ
ＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３）
（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ４）（１７） ＨＯＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＡＯＨ（ｃ５）（１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣ
ｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
ｃ６）（１９） ｌ０ＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｄｉ）（２０１Ｈ
ＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＴＯＨ（ｄ２）＋２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ
３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３）
ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５１（２４１ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｃ
１６１（２５１ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｅｌ）（２６） Ｈ
ＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＡＯＨ（ｅ２）＋２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣ
ｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（
ｅ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐ’ｌ’ｐＴｐＴｐ’ｌ’ｐＧｐＡＯＨ（ｅ４）（
２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（ｅ５１（３０１ＨＯＴＰＧ
ｐＴｐＧＰ’ｌ’ｐＡＰＡｐＴＰＧＰＡＰＴｐＡｐＧＯ
Ｈ（１１）（３１１ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２１（３２） ＨＯＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３
）実施例４ オリゴヌクレオチド（ｍｌ、ｍ２．ＬＡ、ＬＢ。
ｐＴｐＴＯＨ（ａｌｌ（２） ＨＯＡｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（ａ２
）（６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ａ６１（１０１ＨＯ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣ
ｐＴｐＴＯＨ（ｂ４）（１１） ＨＯＡｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（
ｂ５１（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡ
ｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（ｂ６）（１３
） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣＯＨ（ｃｌ）＋１４） ＨＯＴｐ
ＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（ｃ２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐ
ＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ３）
（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（ｃ４）（１７） ＨＯＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＡＯＨ（ｃ５）（１８） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣ
ｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（
ｃ６）（１９） ｌ０ＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（ｄｉ）（２０１Ｈ
ＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＴＯＨ（ｄ２）＋２１） ＨＯＧｐＴｐＣｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（ｄ
３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（ｄ４１（２３）
ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐＧＯＨ（ｄ５１（２４１ＨＯＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｃ
１６１（２５１ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（ｅｌ）（２６） Ｈ
ＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐ
ＣｐＣｐＡＯＨ（ｅ２）＋２７） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣ
ｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（
ｅ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧ
ｐＴｐ’ｌ’ｐＴｐＴｐ’ｌ’ｐＧｐＡＯＨ（ｅ４）（
２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐＧ
ｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（ｅ５１（３０１ＨＯＴＰＧ
ｐＴｐＧＰ’ｌ’ｐＡＰＡｐＴＰＧＰＡＰＴｐＡｐＧＯ
Ｈ（１１）（３１１ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２１（３２） ＨＯＧ
ｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（１３
）実施例４ オリゴヌクレオチド（ｍｌ、ｍ２．ＬＡ、ＬＢ。
ＬＣおよびＬＤ）の合成：
下記オリゴヌ クレオチドを実施例１と同様の方法で製
造した。
造した。
（１１ＨＯＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍｌ）（２）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｍ２）実施例５ オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ。
ＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ｍｌ）（２）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（ｍ２）実施例５ オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ。
Ｇ、Ｈ，Ｈ，Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成：下記オ
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。
リゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で製造した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐ
’ｊ’ｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ
（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｅ）（１４１Ｈ
ＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ（
Ｎ）実施例６ オリゴヌクレオチド（ＳＡ、ＡＢ、ＳＣ，ＳＤ。
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（４） ＨＯＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐ
’ｊ’ｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣＯＨ
（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（Ｅ）（１４１Ｈ
ＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＣＯＨ（
Ｎ）実施例６ オリゴヌクレオチド（ＳＡ、ＡＢ、ＳＣ，ＳＤ。
ＳＥ、ＳＦ、ＳＧおよびＳＨ）の合成：（１） ＨＯＡ
ｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴＯＨ（ＳＡ
）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）実施例７ ＩＣＦ−Ｉ遺伝子の製造： 各オリゴヌクレオチド（Ａ、１−０１ ） （０，４ｎ
Ｍ）の一部を、７４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （
ｐＨ７，６）。
ｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴＯＨ（ＳＡ
）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＴＯＨ（ＳＢ）実施例７ ＩＣＦ−Ｉ遺伝子の製造： 各オリゴヌクレオチド（Ａ、１−０１ ） （０，４ｎ
Ｍ）の一部を、７４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （
ｐＨ７，６）。
１０ｍＭ ＤＴＴ、 １．６ｍＭメルカプトエタノ
ール、１０ｍＭ ＭｇＣｊ！ｚおよび０．５ｍＭＡＴ
Ｐを含有する溶液１００μｐ中でＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ＢＲＬ製）を用い３７℃で２０分間リン酸化
した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００℃で５
分間インキュベートし不活性化した。
ール、１０ｍＭ ＭｇＣｊ！ｚおよび０．５ｍＭＡＴ
Ｐを含有する溶液１００μｐ中でＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（ＢＲＬ製）を用い３７℃で２０分間リン酸化
した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００℃で５
分間インキュベートし不活性化した。
リン酸化オリゴヌクレオチドのライゲージ、ヨンは図３
に示すようにして行い、まず１０断片ブロックを得、最
終的にはクローニング用のＩＧＩ−１遺伝子を得る。ラ
イゲーションはＴａ ＤＮＡリガーゼ（７単位）を用い
、１００ｍＭＡＴ Ｐ （０，５，ｕ ｊり含有溶液中
にて４℃で２３時間（標準条件）行った。各段階におけ
るオリゴヌクレオチドのライゲージ田ン生成物は、トリ
ス−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％グラジェントＰＡＧ
Ｅで、臭化エチジウム染色により同定した。
に示すようにして行い、まず１０断片ブロックを得、最
終的にはクローニング用のＩＧＩ−１遺伝子を得る。ラ
イゲーションはＴａ ＤＮＡリガーゼ（７単位）を用い
、１００ｍＭＡＴ Ｐ （０，５，ｕ ｊり含有溶液中
にて４℃で２３時間（標準条件）行った。各段階におけ
るオリゴヌクレオチドのライゲージ田ン生成物は、トリ
ス−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％グラジェントＰＡＧ
Ｅで、臭化エチジウム染色により同定した。
実施例８
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニング：
プラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
制限エンドヌクレアーゼで消化した。反応を、６５°Ｃ
で５分間加熱して終了させ、断片を０．５％アガロース
ゲル電気泳動により分離した。
制限エンドヌクレアーゼで消化した。反応を、６５°Ｃ
で５分間加熱して終了させ、断片を０．５％アガロース
ゲル電気泳動により分離した。
ｐＢＲ３２２由来の大きな断片３９８５ｂｐを回収し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２°Ｃで１８時間ライゲートさ
せ、２２４ｂｐＩＧＦ−１遺伝子を得た。ライゲージロ
ン混合物を用いてクソシュナー法により、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体をテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｊりを含有する
プレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラサ
イクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離した
プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび１３μｍＨＩで消
化させ、適当なサイズマーカーと比較した。予期した２
２４ｂｐＩＧＦ−１断片が生じた。このプラスミドはＩ
ＧＦ−１遺伝子の完全ヌクレオチド配列によって特徴
づけられ、ｐｓｄＭｌと命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２°Ｃで１８時間ライゲートさ
せ、２２４ｂｐＩＧＦ−１遺伝子を得た。ライゲージロ
ン混合物を用いてクソシュナー法により、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性形質転
換体をテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｊりを含有する
プレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラサ
イクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離した
プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび１３μｍＨＩで消
化させ、適当なサイズマーカーと比較した。予期した２
２４ｂｐＩＧＦ−１断片が生じた。このプラスミドはＩ
ＧＦ−１遺伝子の完全ヌクレオチド配列によって特徴
づけられ、ｐｓｄＭｌと命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
実施例９
合成ｔｒｐプロモーター遺伝子■の構築ニブロックＩ、
■および■のそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ）
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、前述の
ようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次いでこ
のブロック（Ｉ−１［［）と未リン酸化オリゴヌクレオ
チド（Ａ。
■および■のそれぞれのオリゴヌクレオチド（Ｂ−Ｍ）
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、前述の
ようにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。次いでこ
のブロック（Ｉ−１［［）と未リン酸化オリゴヌクレオ
チド（Ａ。
Ｎ）を縮合させた。最後のライゲージタン生成物を分取
用７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１０７ｂ’ｐの合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。
用７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１０７ｂ’ｐの合成
ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子を得た。
実施例１０
合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニング：プラ
スミドｐＢＲ３２５をＥｃ ｏＲＩで消化し、線状ｐＢ
Ｒ３２５を前記ｔｒｐプｏモーター１遺伝子とライゲー
トした。このライゲージコン混合物によるＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩの形質転換体を抗生物質含有プレート上
でスクリーニングし、ＲＡｍｐ”０ｍコロニー４つヲ得
り。この４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＨｐ
ａｌで消化した。ＨｉｎｄＤＩおよびＥ、ｃｏＲＩ消化
によりこれらプラスミドから得た断片をＨｉｎｄｌＩ［
およびＥｃｏＲＩ消化によるｐＢＲ３２５の断片と比較
した。４つのプラスミドのうちの１つは正しい方向のプ
ロモーター遺伝子（ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子）を有
し、他のものは逆方向に挿入されていた。
スミドｐＢＲ３２５をＥｃ ｏＲＩで消化し、線状ｐＢ
Ｒ３２５を前記ｔｒｐプｏモーター１遺伝子とライゲー
トした。このライゲージコン混合物によるＥ、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩの形質転換体を抗生物質含有プレート上
でスクリーニングし、ＲＡｍｐ”０ｍコロニー４つヲ得
り。この４コロニーから得たプラスミドをそれぞれＨｐ
ａｌで消化した。ＨｉｎｄＤＩおよびＥ、ｃｏＲＩ消化
によりこれらプラスミドから得た断片をＨｉｎｄｌＩ［
およびＥｃｏＲＩ消化によるｐＢＲ３２５の断片と比較
した。４つのプラスミドのうちの１つは正しい方向のプ
ロモーター遺伝子（ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子）を有
し、他のものは逆方向に挿入されていた。
実施例１１
合成ｔｒｐプロモーターＨ遺伝子の構築およびクローニ
ング： ｔｒｐプロモータ■遺伝子は前述と同じ方法で構築した
。合成遺伝子はＥｃｏＲＩ、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
断片とライゲートし、続いて旦。
ング： ｔｒｐプロモータ■遺伝子は前述と同じ方法で構築した
。合成遺伝子はＥｃｏＲＩ、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
断片とライゲートし、続いて旦。
ｃｏｌｔ ＨＢＩＯＩをライゲージロン生成物で形質
転換させた。”Ａｍｐおよび”Ｔｅｔの形質転換体から
得たプラスミドをＨｐａｌで消化してバンド（４，１ｋ
ｂｐ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
で９０ｂｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片はＰＡＧＥでサイ
ズマーカーと比較することにより確認した。このプラス
ミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
転換させた。”Ａｍｐおよび”Ｔｅｔの形質転換体から
得たプラスミドをＨｐａｌで消化してバンド（４，１ｋ
ｂｐ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥ
で９０ｂｐのバンドを確認した。さらに、ＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片はＰＡＧＥでサイ
ズマーカーと比較することにより確認した。このプラス
ミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクターの構築に
使用した。
実施例１２
ＩＧＦ−１発現ベクター（ｐｓｄＭｌ−３２２ｔｒｐ）
の構築： Ｔ ｒ ｐプロモータ■ベクター（ｐＴｒｐＥＢ７）を
Ｅｃ ｏＲＩおよび１３μｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥに
より大きな断片（４，１ｋｂｐ）を得た。
の構築： Ｔ ｒ ｐプロモータ■ベクター（ｐＴｒｐＥＢ７）を
Ｅｃ ｏＲＩおよび１３μｍＨＩで消化し、ＰＡＧＥに
より大きな断片（４，１ｋｂｐ）を得た。
この断片をプラスミドｐｓｄＭ１から製造したＩＧＦ−
Ｉ遺伝子とライゲートした。このライゲージ５ン混合物
で−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１を形質転換し、ア
ンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質転換体
を選択した。得られたプラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔ
ｒｐをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、７．５％
ＰＡＧＥでＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂｐ）を確認した
。
Ｉ遺伝子とライゲートした。このライゲージ５ン混合物
で−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１を形質転換し、ア
ンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質転換体
を選択した。得られたプラスミドｐｓｄＭ１−３２２ｔ
ｒｐをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、７．５％
ＰＡＧＥでＩＧＦ−１遺伝子（２２４ｂｐ）を確認した
。
実施例１３
Ｉ ＧＦ−１遺伝子およびｔｒｐプロモータ遺伝子の配
列決定： マキサム−ギルバート法によるＩＧＦ−１遺伝子および
ｔｒｐプロモータ遺伝子の配列決定のため、プラスミド
ｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し、大腸
菌アルカリホスホターゼを用い３７℃で１時間処理した
。
列決定： マキサム−ギルバート法によるＩＧＦ−１遺伝子および
ｔｒｐプロモータ遺伝子の配列決定のため、プラスミド
ｐｓｄＭ１−３２２ｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し、大腸
菌アルカリホスホターゼを用い３７℃で１時間処理した
。
フェノール抽出およびエタノール沈澱後、プラスミドを
γ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ボリヌクレオクドキナ
ーゼを用い３７℃で１時間リン酸−ギルバート法（Ａ、
Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｗ、 Ｇ１１ｂｅｒｔ＋Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＴＪＳＡ、 ７４゜５６０ （１９７７））に従っ
て配列決定した。得られたＩＧＦ−１およびｔｒｐプロ
モータ遺伝子の配列は設計したものと一致した。
γ−”Ｐ−ＡＴＰの存在下にＴ４ボリヌクレオクドキナ
ーゼを用い３７℃で１時間リン酸−ギルバート法（Ａ、
Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｗ、 Ｇ１１ｂｅｒｔ＋Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＴＪＳＡ、 ７４゜５６０ （１９７７））に従っ
て配列決定した。得られたＩＧＦ−１およびｔｒｐプロ
モータ遺伝子の配列は設計したものと一致した。
実施例１４
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現：
Ｅ、 ｃｏｌｔ Ｆ−３（プラスミドｐｓｄＭ１−３
２２ｔｒｐ含有旦０匹旦 ＨＢＩＯＩ）をアンピシリン
２０μｇ ／ ｍ Ｉｌ含有、Ｌブロース中で一晩培養
し、０．２％グルコース、０．５％カザミノ酸（＃加水
分解カゼイン）およびビタミンＢ１５０μｇ／ｍｊ２を
含有するＭ９培地て、１：２５の割合で希釈した。β−
インドールアクリル酸を加え、最終濃度１０μｇ ／
ｍ ｊ！とした。この時のＡ６゜。
２２ｔｒｐ含有旦０匹旦 ＨＢＩＯＩ）をアンピシリン
２０μｇ ／ ｍ Ｉｌ含有、Ｌブロース中で一晩培養
し、０．２％グルコース、０．５％カザミノ酸（＃加水
分解カゼイン）およびビタミンＢ１５０μｇ／ｍｊ２を
含有するＭ９培地て、１：２５の割合で希釈した。β−
インドールアクリル酸を加え、最終濃度１０μｇ ／
ｍ ｊ！とした。この時のＡ６゜。
は０．４であった。次に３時間培養し、遠心分離（６ｋ
ｒｐｍ、 ４℃、５分間）により菌体を集めた。
ｒｐｍ、 ４℃、５分間）により菌体を集めた。
菌体は超音波処理により破壊し遠心分離により残屑を取
り除いた。上清を３Ｍ酢酸と混合し、沈澱を遠心分Ｉｌ
ｌ ’（２０ｋｒｐｍ、 ４℃、１０分間）により除
去し、上清を凍結乾燥した。定量のため、サンプルを培
養液（０，ＯＩＭＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ ＥＤＴ
ＡＡおよび０．５％ＢＳＡ）４ｍ＃に懸濁し、０．ｌＮ
ＮａＯＨでｐＨ７−８に調製した。不溶性物質を遠心分
離により除去した後、上清を定量を行うまで一２０℃で
保存した。
り除いた。上清を３Ｍ酢酸と混合し、沈澱を遠心分Ｉｌ
ｌ ’（２０ｋｒｐｍ、 ４℃、１０分間）により除
去し、上清を凍結乾燥した。定量のため、サンプルを培
養液（０，ＯＩＭＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ ＥＤＴ
ＡＡおよび０．５％ＢＳＡ）４ｍ＃に懸濁し、０．ｌＮ
ＮａＯＨでｐＨ７−８に調製した。不溶性物質を遠心分
離により除去した後、上清を定量を行うまで一２０℃で
保存した。
実施例し摂−
ＩＧＩ−ＩのｔＡ
Ｉ ＧＦ−ＩのＲＩＡは矢内原の方法に従って行った。
前記サンプルまたは標準サンプル（Ｉ（、Ｆ−■フラグ
メント （２６−４６） ３ ０．１ｍＡ！を、サンプ
ル緩衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ ＥＤ
ＴＡ （ｐＨ７，４）中０．５％ＢＳＡ （０，４ｍｊ
２） ） 。
メント （２６−４６） ３ ０．１ｍＡ！を、サンプ
ル緩衝液（０，ＯＩＭ ＰＢＳ、 ０．０２５Ｍ ＥＤ
ＴＡ （ｐＨ７，４）中０．５％ＢＳＡ （０，４ｍｊ
２） ） 。
ＩＧＦ−１（２６−４６）のウサギ抗血清（０，１ｍ１
）およびＩｚＪ−ＩＣＦ−１（２６−４６）（０，１ｎ
＋ １４ ）と混合し、４℃で４８時間放置した後、ウ
サギ血清（０，１ｍｊり 、ウサギγ−グロブリン抗血
清（０，Ｉｎ７りおよび５％Ｐ ＥＧ６０００ （０，
９ｍ ７りを加えた。さらに２時間４℃で放置した後、
ベレットを遠心分ＩＩＩ （３ｋｒｐｍ、 ４℃、３
０分間）により集め、γ−カウシターにより放射活性を
測定した。
）およびＩｚＪ−ＩＣＦ−１（２６−４６）（０，１ｎ
＋ １４ ）と混合し、４℃で４８時間放置した後、ウ
サギ血清（０，１ｍｊり 、ウサギγ−グロブリン抗血
清（０，Ｉｎ７りおよび５％Ｐ ＥＧ６０００ （０，
９ｍ ７りを加えた。さらに２時間４℃で放置した後、
ベレットを遠心分ＩＩＩ （３ｋｒｐｍ、 ４℃、３
０分間）により集め、γ−カウシターにより放射活性を
測定した。
ＩＧＦ−１の含量はこの放射活性から算出した。
実施例１６
プラスミドｐｓｄＭｌ中ＩＧＦ−１遺伝子の配列決定：
ＩＧＦ−１遺伝子の配列を調べるため、プラスミドｐｓ
ｄＭ１をＥＣ０ＲＩで消化し、次いでα−”Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化学工業−より購入）
を用い３７℃で３０分間処理した。３Ｚｐで標識された
線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、２つの断片（２
２４ｂｐ、 ４．０ｂｐ）を得た。小さい断片（２２４
ｂｐ）は分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
回収し、マキサム−ギルバート法の手順に従って配列決
定した。
ｄＭ１をＥＣ０ＲＩで消化し、次いでα−”Ｐ−ＡＴＰ
の存在下にＡＭＶ逆転写酵素（生化学工業−より購入）
を用い３７℃で３０分間処理した。３Ｚｐで標識された
線状プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、２つの断片（２
２４ｂｐ、 ４．０ｂｐ）を得た。小さい断片（２２４
ｂｐ）は分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
回収し、マキサム−ギルバート法の手順に従って配列決
定した。
一方、プラスミドｐ Ｓ ｄ Ｍ ｌはまずＢａ ｍ
Ｈ１で消化し、次に前述のように３２Ｐで標識した。線
状プラスミドをＥ ｃ ｏ Ｒ’ Ｉで消化し、２つの
断片（２２４ｂｐ、 ４．０ ｋｂｐ）を得た。小さい
断片（２２４ｂｐ）は前述のようにマキサム−ギルバー
ト法により分析した。ＩＧＦ−１遺伝子の両側からの配
列決定の結果は、設計したＩ ＧＦ−Ｉ遺伝子と一致し
た。
Ｈ１で消化し、次に前述のように３２Ｐで標識した。線
状プラスミドをＥ ｃ ｏ Ｒ’ Ｉで消化し、２つの
断片（２２４ｂｐ、 ４．０ ｋｂｐ）を得た。小さい
断片（２２４ｂｐ）は前述のようにマキサム−ギルバー
ト法により分析した。ＩＧＦ−１遺伝子の両側からの配
列決定の結果は、設計したＩ ＧＦ−Ｉ遺伝子と一致し
た。
実施例１７
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の調製：
各オリゴヌクレオチド（ａ２−１２）の一部（０，４ｎ
Ｍ）を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ Ｈ７
，６）。
Ｍ）を５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ Ｈ７
，６）。
２０ｍＭ ＤＴＴ、５０＃ｇ／ｍＩ！、ＢＳＡ、１ｍ
Ｍスヘルミジ７．１０ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ１ｚおよび２ｍ
ＭＡＴＰを含有する溶液４０μρ中で２．５単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用い３７℃で３時間リン酸
化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００℃で
５分間インキュベートして不活性化した。リン酸化オリ
ゴヌクレオチドと２つのオリゴヌクレオチド（ａｌおよ
び１３）のライゲーションは第７図に示すようにして行
い、まず６フラグメントブロツクを得、最終的にクロー
ニング用の蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を得
た。
Ｍスヘルミジ７．１０ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ１ｚおよび２ｍ
ＭＡＴＰを含有する溶液４０μρ中で２．５単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用い３７℃で３時間リン酸
化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を１００℃で
５分間インキュベートして不活性化した。リン酸化オリ
ゴヌクレオチドと２つのオリゴヌクレオチド（ａｌおよ
び１３）のライゲーションは第７図に示すようにして行
い、まず６フラグメントブロツクを得、最終的にクロー
ニング用の蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を得
た。
ライゲージジンはＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位）を用い
、５０ｍＭＡＴＰ含有溶液（１μ７り中１６℃で５時間
行った。各段階のオリゴヌクレオチドのライゲージ１ン
生成物はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中２−１６％グラジ
ェントＰＡＧＥ、で臭化エチジウム染色により同定した
。
、５０ｍＭＡＴＰ含有溶液（１μ７り中１６℃で５時間
行った。各段階のオリゴヌクレオチドのライゲージ１ン
生成物はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中２−１６％グラジ
ェントＰＡＧＥ、で臭化エチジウム染色により同定した
。
実施例１８
蛋白ペプチドＬＨ遺伝子のクローニング：前述のように
して合成した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を
実施例８と同様の方法でｐＢＲ３２２に挿入した。旦、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨ１０？）は、制限酵素分析により蛋白ペプチド
ＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかになった
。
して合成した蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ）を
実施例８と同様の方法でｐＢＲ３２２に挿入した。旦、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨ１０？）は、制限酵素分析により蛋白ペプチド
ＬＨ（２３６ｂｐ）を有していることが明らかになった
。
実施例１９
ｔｒｐプロモーター■遺伝子の構築ニ
ブロックＩ’、 ＩＩ’、 ＩＩＩ′および■′の
各オリゴヌクレオチド（Ｂ−３Ｇ）をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化し、次いで前述のようにＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼでライゲートした。これらのブロック （
１’〜ＩＶ’） と未リン酸化オリゴヌクレオチド（Ａ
およびＳＨ）を続いて縮合した。最終ライゲージロン生
成物は分取用７．５％ＰＡＧＥで精製し、１６３ｂｐの
ｔｒｐプｔ＋モーター■遺伝子を得た。
各オリゴヌクレオチド（Ｂ−３Ｇ）をＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化し、次いで前述のようにＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼでライゲートした。これらのブロック （
１’〜ＩＶ’） と未リン酸化オリゴヌクレオチド（Ａ
およびＳＨ）を続いて縮合した。最終ライゲージロン生
成物は分取用７．５％ＰＡＧＥで精製し、１６３ｂｐの
ｔｒｐプｔ＋モーター■遺伝子を得た。
実施例２０
ｔｒｐプロモータ■遺伝子のクローニング：実施例１９
で構築したｔ！・ｐプロモータ■遺伝子をｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、次いで
Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをライゲージタン生成物を
用い形質転換させた。
で構築したｔ！・ｐプロモータ■遺伝子をｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とライゲートし、次いで
Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをライゲージタン生成物を
用い形質転換させた。
”Ａｍｐ、 ’Ｔｅｔ形質転換体から得たプラスミド
をＨｐａＩで消化してハ′ンド（４，１ｋｂｐ）を確認
し、次いでＢａｍＨＩで消化しＰＡＧＥにて９０ｂｐの
バンドを確認した。さらに、Ｅｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
消化による５５’ｂｐの断片をＰＡＧＥにてサイズマー
カーと比較することにより、確認した。
をＨｐａＩで消化してハ′ンド（４，１ｋｂｐ）を確認
し、次いでＢａｍＨＩで消化しＰＡＧＥにて９０ｂｐの
バンドを確認した。さらに、Ｅｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
消化による５５’ｂｐの断片をＰＡＧＥにてサイズマー
カーと比較することにより、確認した。
このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と命名し、発現ベクタ
ーの構築に用いた。
ーの構築に用いた。
実施例２１
蛋白ペプチドＬＨ発現ベクター（ｐＬＨｔｒｐ）の構築
： 実施例２０で製造したｔｒｐプロモーター■ベクター（
ｐＴｒｐＥＢ？）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨｌで消化し、
分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片（４，
１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製した蛋白
ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲージ９ン
混合物を用い −β−、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質
転換させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン感受
性を示す形質転換体を得た。
： 実施例２０で製造したｔｒｐプロモーター■ベクター（
ｐＴｒｐＥＢ？）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨｌで消化し、
分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片（４，
１ｋｂｐ）を得た。この断片をＥｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製した蛋白
ペプチドＬＨ遺伝子とライゲートした。ライゲージ９ン
混合物を用い −β−、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質
転換させ、アンピシリンに耐性でテトラサイクリン感受
性を示す形質転換体を得た。
形質転換体から得たプラスミド
（ｐＬＨｔｒｐ）をＥｃｏＲＩと１３ａｍＨＩで消化し
、７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３
６ｂｐ）を確認した。
、７．５％ＰＡＧＥにて蛋白ペプチドＬＨ遺伝子（２３
６ｂｐ）を確認した。
実施例２２
ＩＧＦ−１発現ベクターｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐの構築ニ
プラスミドｐｓｄＭ１をＥｃｏＲＩと１３ ａ ｍ Ｈ
■で消化し、Ｉ Ｇｌ’−１遺伝子（２２４ｂ ｐ）を
得た。一方、実施例４（２）で調製したオリゴヌクレオ
チド（ｍ２）を実施例７に記載したようにＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼでリン酸化した。。
■で消化し、Ｉ Ｇｌ’−１遺伝子（２２４ｂ ｐ）を
得た。一方、実施例４（２）で調製したオリゴヌクレオ
チド（ｍ２）を実施例７に記載したようにＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼでリン酸化した。。
このリン酸化オリゴヌクレオチド、実施例４ （１）で
調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）およびＩＧＦ−１
遺伝子（２２４ｂｐ）を混合し、ＬｏｏｍＭＡＴＰを含
有する溶液中でＴ４リガーゼを用い４℃で２０時間処理
した。ライゲージタン混合物をＢａｍＨＩで消化し、次
いで分取用ＰＡＧＥで精製してリンカ−付きＩＣＦ−Ｔ
遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。この遺伝子を、Ｈ４ｎｄ
ｌ［Ｉ−ＢａｍＨＩ消化によりｐＬＨｔｒｐから得た断
片をライゲートし、ライゲージロン混合物を用いて旦。
調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）およびＩＧＦ−１
遺伝子（２２４ｂｐ）を混合し、ＬｏｏｍＭＡＴＰを含
有する溶液中でＴ４リガーゼを用い４℃で２０時間処理
した。ライゲージタン混合物をＢａｍＨＩで消化し、次
いで分取用ＰＡＧＥで精製してリンカ−付きＩＣＦ−Ｔ
遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。この遺伝子を、Ｈ４ｎｄ
ｌ［Ｉ−ＢａｍＨＩ消化によりｐＬＨｔｒｐから得た断
片をライゲートし、ライゲージロン混合物を用いて旦。
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換させた。プラスミド
ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢｌｏｌ
をＥ、ｃｏｌｉＦ−６と命名し、１９８４年９月１７日
に寄託番号ＦＥＲＭ−７８４８の下に、工業技術院微生
物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁
目、郵便番号３０５）に寄託した。該寄託金はその後１
９８５年２月２８日に換体から得たプラスミド（ｐ Ｌ
Ｈ３ｄＭｍ ｔ ｒ ｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
（１９８，２２４ｂｐ）。
ｐＬＨ３ｄＭｍｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢｌｏｌ
をＥ、ｃｏｌｉＦ−６と命名し、１９８４年９月１７日
に寄託番号ＦＥＲＭ−７８４８の下に、工業技術院微生
物工業技術研究所（日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁
目、郵便番号３０５）に寄託した。該寄託金はその後１
９８５年２月２８日に換体から得たプラスミド（ｐ Ｌ
Ｈ３ｄＭｍ ｔ ｒ ｐ）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
（１９８，２２４ｂｐ）。
Ｈｉｎｄｌｌｒ−ＢａｍＨＩ （２４２ｂｐ）およびＨ
ｐａｌ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ）で消化し、７．
５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター、蛋白ペプチドＬ
ＨおよびＪＧＦＩ遺伝子を確認した。
ｐａｌ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ）で消化し、７．
５％ＰＡＧＥにてｔｒｐプロモーター、蛋白ペプチドＬ
ＨおよびＪＧＦＩ遺伝子を確認した。
実施例２３
Ｅ、ｃｏｌｉＦ−６における蛋白ペプチドＬＨ（タイプ
Ｉ）融合ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−６（グラ：１．ミド ｐＬＨ３
ｄＭｍ ｔ ｒ ｐ含有Ｅ、ｃｏ旦 ＨＢ １０１）
（ＦＥＲＭＢＰ−７２９）をアンビシリフ５０ｐｇ／
ｍｌ！含有しプロス中で一晩培養し、０．２％グルコー
ス。
Ｉ）融合ＩＧＦ−１をコードする遺伝子の発現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−６（グラ：１．ミド ｐＬＨ３
ｄＭｍ ｔ ｒ ｐ含有Ｅ、ｃｏ旦 ＨＢ １０１）
（ＦＥＲＭＢＰ−７２９）をアンビシリフ５０ｐｇ／
ｍｌ！含有しプロス中で一晩培養し、０．２％グルコー
ス。
０．５％カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、５０μｇ
／ｍｌ！ビタミンＢ、および２５μｇ ／ ｍ ｌアン
ピシリン含有Ｍ−９培地に１：２０の割合で希釈した。
／ｍｌ！ビタミンＢ、および２５μｇ ／ ｍ ｌアン
ピシリン含有Ｍ−９培地に１：２０の割合で希釈した。
β−インドールアクリル酸を加え最終濃度１０μｇ ／
ｍ １とした。この時のＡ６゜。は０．５であった。
ｍ １とした。この時のＡ６゜。は０．５であった。
次に、菌体を２時間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４
℃、５分間）により収集した。
℃、５分間）により収集した。
実施例２４
Ｉ ＧＦ−Ｉの分離および精製
（１） 融合ＩＧＦ−１（タイプＩ）の分離および精
製 ｍ潤細胞ペースト（６０ｇ）をｌＱｍＭＰＢｓ−ＥＤＴ
Ａ （ｐＨ８，０）１５０ｍ＃に懸濁し、菌体を超音波
処理により破壊した。菌体残屑を１８００Ｏｒｐｍで３
０分間遠心分離してペレット化した。得られたベレット
を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＡ （＋） Ｈ８，Ｏ
）／８Ｍ尿素−０．ＩＭジチオスレイトール（５０ｍＣ
）に溶かし、３５．０００ｒｐ川、２５℃で３０分間遠
心分離した。上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
２ （ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０ｍＭ２−メル
カプトエタノールで平衡化したセファクリル５３００ス
ーパーフアインカラム（５，０Ｘ８６．６ｃｍ、 １７
００ｍ１！。
製 ｍ潤細胞ペースト（６０ｇ）をｌＱｍＭＰＢｓ−ＥＤＴ
Ａ （ｐＨ８，０）１５０ｍ＃に懸濁し、菌体を超音波
処理により破壊した。菌体残屑を１８００Ｏｒｐｍで３
０分間遠心分離してペレット化した。得られたベレット
を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣＡ （＋） Ｈ８，Ｏ
）／８Ｍ尿素−０．ＩＭジチオスレイトール（５０ｍＣ
）に溶かし、３５．０００ｒｐ川、２５℃で３０分間遠
心分離した。上清を取り、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ
２ （ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０ｍＭ２−メル
カプトエタノールで平衡化したセファクリル５３００ス
ーパーフアインカラム（５，０Ｘ８６．６ｃｍ、 １７
００ｍ１！。
樹脂）にかけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速
０．６ｍ ｌ ／分で行った。セファクリルＳ ３００
クロマトグラフイを行い、両分１７ｍ１を集めた。
０．６ｍ ｌ ／分で行った。セファクリルＳ ３００
クロマトグラフイを行い、両分１７ｍ１を集めた。
セファクリル５３００クロマトグラフイを行った。
定量は全クロマトグラフィ段階について両分後直ちに行
った。活性画分を集め、合わせた両分２５５ｍ１を１Ｍ
酢酸水溶液８１を用い室温で３時間透析し、次いで新た
に１Ｍ酢酸水溶液８βを用い一晩透析した。透析画分は
凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＣＦ−１（タ
イプＩ）４５０■を得た。この融合ＩＧＦ−Ｉ （タ
イプＩ）は、１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥにて分子量１５
．５００の位置にバンドを示す。
った。活性画分を集め、合わせた両分２５５ｍ１を１Ｍ
酢酸水溶液８１を用い室温で３時間透析し、次いで新た
に１Ｍ酢酸水溶液８βを用い一晩透析した。透析画分は
凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＣＦ−１（タ
イプＩ）４５０■を得た。この融合ＩＧＦ−Ｉ （タ
イプＩ）は、１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥにて分子量１５
．５００の位置にバンドを示す。
（２）臭化シアンによる融合ＩＣＦ−１（タイプＩ）か
らの蛋白ペプチドＬＨ（タイプ■）の脱離操作（１）に
より得た融合ＩＣＦ−１（タイプＩ）（２２５ｍｇ）を
６０％ギ酸３６ｍｆに溶解した。
らの蛋白ペプチドＬＨ（タイプ■）の脱離操作（１）に
より得た融合ＩＣＦ−１（タイプＩ）（２２５ｍｇ）を
６０％ギ酸３６ｍｆに溶解した。
臭化シアン（３６ｍｇ）を加え、２５℃以下で３時間攪
拌下に反応させた。蒸留水２３４ｍ７！を加えた後、ギ
酸および臭化シアンを凍結乾燥により除去した。残渣を
ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素−
５０ｍＭ２−メルカプトエタノール３６ｍｊｌ！に溶か
した。この溶液を０．ＯＩＭ ＡｃＯＮ Ｈａ（ｐ Ｈ
４，６）／ ８ Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール（バッファーＡ）４００ｗｌを用い室温で３時間
、２回透析し、次いで新しいバッファーＡ４００ｍ ｌ
を用い一晩透析した。
拌下に反応させた。蒸留水２３４ｍ７！を加えた後、ギ
酸および臭化シアンを凍結乾燥により除去した。残渣を
ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素−
５０ｍＭ２−メルカプトエタノール３６ｍｊｌ！に溶か
した。この溶液を０．ＯＩＭ ＡｃＯＮ Ｈａ（ｐ Ｈ
４，６）／ ８ Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール（バッファーＡ）４００ｗｌを用い室温で３時間
、２回透析し、次いで新しいバッファーＡ４００ｍ ｌ
を用い一晩透析した。
透析溶液はバッファーＡで平衡化したカチオン交換樹脂
０Ｍ５２カラム（１，６Ｘ ７．５ｃｍ １５ｍＮ樹脂
）にかけた、カラムはバッファーＡ （６０ｍｇ）を用
い、室温にて流速０．２５ｎ＋４！／分で洗浄し、バッ
フｙ−Ａ （１２０ｍ７りから０．２Ｍ ＡｃＯＮ Ｈ
ａ／ ８ Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール
（１２０ｍｌ）までの直線勾配で溶出した。画分（Ｎ１
５７〜隘１００） ２．９ｆｆｌを集めた。
０Ｍ５２カラム（１，６Ｘ ７．５ｃｍ １５ｍＮ樹脂
）にかけた、カラムはバッファーＡ （６０ｍｇ）を用
い、室温にて流速０．２５ｎ＋４！／分で洗浄し、バッ
フｙ−Ａ （１２０ｍ７りから０．２Ｍ ＡｃＯＮ Ｈ
ａ／ ８ Ｍ尿素−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール
（１２０ｍｌ）までの直線勾配で溶出した。画分（Ｎ１
５７〜隘１００） ２．９ｆｆｌを集めた。
（３）高速液体クロマトグラフィ：
操作（２）により得たプール画分を用いた。
カラム二ベソクマンウルトラボアＲＰＳＣ（４，６Ｘ７
５ｍ） 流 速： １ｍ１１分 溶 出： ０．０１Ｍ ）リフルオロ酢酸中１０％から
６０％までのアセトニトリルの直 線勾配；５０分間 クロマトグラフィーは１５回繰返して還元型ｌＧ１−１
含有画分を集めた。保持時間２９．３２分の主ピークは
還元型ＩＧＦ−Ｉに相当する。前述の操作により還元型
ＩＧＦ−Ｉ約２．４ｍ ｇを得た。
５ｍ） 流 速： １ｍ１１分 溶 出： ０．０１Ｍ ）リフルオロ酢酸中１０％から
６０％までのアセトニトリルの直 線勾配；５０分間 クロマトグラフィーは１５回繰返して還元型ｌＧ１−１
含有画分を集めた。保持時間２９．３２分の主ピークは
還元型ＩＧＦ−Ｉに相当する。前述の操作により還元型
ＩＧＦ−Ｉ約２．４ｍ ｇを得た。
この還元型ＩＧＦ−■は通常の再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎ
ｇ）法により酸化型ＩＣＩ−Ｉに変えた。このＩＧＦ−
■は、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｕｍｂｅｌ博士のＩＧＦ−
Ｉ標品と重なった。
ｇ）法により酸化型ＩＣＩ−Ｉに変えた。このＩＧＦ−
■は、ＨＰＬＣにおいて、Ｈｕｍｂｅｌ博士のＩＧＦ−
Ｉ標品と重なった。
（４１１Ｇ Ｆ −Ｉのアミノ酸分析および配列分析：
Ｉ ＧＦ−１のアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ
酸分析システムを用いて得た。ＩＣＦ−１のアミノ酸配
列は、第３表に示すように、エドマン法（ＤＩＢＩＴＣ
法） （Ｊ、 Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、、１５３．６０７ （１９７６）；Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、＋ ５７
８． １８８（１９７９））とカルボキシペプチダーゼ
法を組合せて決定した。
Ｉ ＧＦ−１のアミノ酸組成はウォーターズ社製アミノ
酸分析システムを用いて得た。ＩＣＦ−１のアミノ酸配
列は、第３表に示すように、エドマン法（ＤＩＢＩＴＣ
法） （Ｊ、 Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、、１５３．６０７ （１９７６）；Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、＋ ５７
８． １８８（１９７９））とカルボキシペプチダーゼ
法を組合せて決定した。
実施例２５
ＩＧＦｉ発現ベクターｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐの構築ニ
プラスミドｐｓｄＭ１をＥｃｏＲＩとＢ ａ ｍ ＨＩ
で消化してＩ Ｇｌ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を得、こ
の遺伝子をＡ Ｖ ａ Ｉ＋で消化して、大きな断片（
２１５ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、
実施例４ （４）で調製したオリゴヌクレオチド（ＬＢ
）を実施例７に記載のようにＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いリン酸化した。
で消化してＩ Ｇｌ−Ｉ遺伝子（２２４ｂｐ）を得、こ
の遺伝子をＡ Ｖ ａ Ｉ＋で消化して、大きな断片（
２１５ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、
実施例４ （４）で調製したオリゴヌクレオチド（ＬＢ
）を実施例７に記載のようにＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いリン酸化した。
リン酸化オリゴヌクレオチド、実施例４（３）で調製し
たオリゴヌクレオチドＬＡおよび上記で調製したＩＧＦ
−１断片（２１５ｂｐ）を混合し、Ｔ４リガーゼを用い
て１００ｍＭＡＴＰ含有溶液中４℃で２０時間処理した
。ライゲーション混合物をＢａｍＨＩで消化し、次いで
分取用ＰＡＧＥにより精製し、リンカ−付きＩＧＦ−Ｉ
遺伝子（２３０ｂ ｐ）を得た。ＩＣＦ−１遺伝子（２
３０ｂｐ）を、Ｈ４ｎｄｌｌ［−ＢａｍＨＩ消化により
ｐＬＨｔｒｐから得た断片をライゲートし、次いでこの
ライゲージジン混合物を用いテＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１を形質転換した。形質転換体から得たプラスミド（
ｐ ＬＨＳ ｄＭｗ ｔ ｒ ｐ）をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ （４１６ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ
（８５９ｂｐ）、Ｈ４ｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ（２３
０ｂｐ）で消化し、７．５％ＰＡＧＥでこのプラスミド
遺伝子を確認した。プラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐ含
有旦、二旦をＦ−７と命名した。
たオリゴヌクレオチドＬＡおよび上記で調製したＩＧＦ
−１断片（２１５ｂｐ）を混合し、Ｔ４リガーゼを用い
て１００ｍＭＡＴＰ含有溶液中４℃で２０時間処理した
。ライゲーション混合物をＢａｍＨＩで消化し、次いで
分取用ＰＡＧＥにより精製し、リンカ−付きＩＧＦ−Ｉ
遺伝子（２３０ｂ ｐ）を得た。ＩＣＦ−１遺伝子（２
３０ｂｐ）を、Ｈ４ｎｄｌｌ［−ＢａｍＨＩ消化により
ｐＬＨｔｒｐから得た断片をライゲートし、次いでこの
ライゲージジン混合物を用いテＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１を形質転換した。形質転換体から得たプラスミド（
ｐ ＬＨＳ ｄＭｗ ｔ ｒ ｐ）をＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ （４１６ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ
（８５９ｂｐ）、Ｈ４ｎｄｌＩ［−ＢａｍＨＩ（２３
０ｂｐ）で消化し、７．５％ＰＡＧＥでこのプラスミド
遺伝子を確認した。プラスミドｐＬＨ３ｄＭｗｔｒｐ含
有旦、二旦をＦ−７と命名した。
（タイプＩＩ）融合ＩＣＦ−Ｉをコードする遺伝子の発
現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−７（プらスミドｐＬＨ３ｄＭｗ
ｔｒｐ含有−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１）を５０
．ｌｊｇ／ｍβアンピシリン含有Ｌプロス中で一晩培養
し、０．２％グルコース、０．５％カザミノ酸（酸加水
分解カゼイン）、５０μｇ ／ ｍ Ｉ！ビタミンＢ１
および２５μｇ ／ ｍ ｊ！アンピシリン含有Ｍ９培
地中に１：２０の割合で希釈した。β−インドールアク
リル酸を加え最終濃度１０μｇ ／ ｍ ｔｌとした。
現： Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｆ−７（プらスミドｐＬＨ３ｄＭｗ
ｔｒｐ含有−Ｅ、 ｃｏｌｉ ＨＢ １０１）を５０
．ｌｊｇ／ｍβアンピシリン含有Ｌプロス中で一晩培養
し、０．２％グルコース、０．５％カザミノ酸（酸加水
分解カゼイン）、５０μｇ ／ ｍ Ｉ！ビタミンＢ１
および２５μｇ ／ ｍ ｊ！アンピシリン含有Ｍ９培
地中に１：２０の割合で希釈した。β−インドールアク
リル酸を加え最終濃度１０μｇ ／ ｍ ｔｌとした。
この時のＡ、。。は０．５であった。次いで菌体を２時
間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、 ４°ｃ、 ５
分間）により集めた。
間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、 ４°ｃ、 ５
分間）により集めた。
実施例２７
ＩＣＦ−Ｉの分離および精製：
（１） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＣＩ−Ｉ
（タイプＩＩ）の分離および精製： 湿潤菌体ペースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴ
Ａ （ｐ Ｈ８，０） １５０ｒｒ＋ｊ！に忍濁し、菌
体を超音波処理により破壊した。菌体残渣を１８００Ｏ
ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化し、このベレ
ットを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｆｌ （１）
Ｈ８，Ｏ）／ ８ Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトー
ル（５０ｍｌ）に溶かし、４０．００Ｏｒｐｍ、 ２０
℃で３０分間遠心分離した。
（タイプＩＩ）の分離および精製： 湿潤菌体ペースト（６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ−ＥＤＴ
Ａ （ｐ Ｈ８，０） １５０ｒｒ＋ｊ！に忍濁し、菌
体を超音波処理により破壊した。菌体残渣を１８００Ｏ
ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化し、このベレ
ットを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｆｌ （１）
Ｈ８，Ｏ）／ ８ Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトー
ル（５０ｍｌ）に溶かし、４０．００Ｏｒｐｍ、 ２０
℃で３０分間遠心分離した。
上滑を集め、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（ｐＨ８，
０）／８Ｍ尿、！−１０ｍＭ２−メルカプトエタノール
で平衡化したセファクリル５３００スーパーフアインカ
ラム（５，０Ｘ８６．８ｃｍ ； １，７００ｍ１樹
脂）にかけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速０
．６ｍ ｌ ７分で行った。セファクリル５３００クロ
マトグラフイを行い。両分１７ｍ７！を集めた。定量は
全クロマトグラフィ段階につき両分直後に行った。活性
画分を集め、プールした両分２０４ｍｊ！を室温で３時
間ＩＭ酢酸水溶液８１を用いて透析し、次いで新しい１
Ｍ酢酸水溶液８７！を用い一晩透析した。透析した両分
を凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＣＦ−■
（タイプＩＩ）４５０ｍｇを得た。この粗融合ＴＧＦＩ
（タイプＩＩ）を１０％ＣＨ３ＣＮ （０，ＯＩＭ
ＴＦＡ）の直線勾配を用い、逆相ＨＰＬ、Ｃ（ウル
トラボアＲＰＳＣカラム）により精製し、精製融合ＩＧ
Ｆ−Ｉ （タイプＩＩ）を得た。
０）／８Ｍ尿、！−１０ｍＭ２−メルカプトエタノール
で平衡化したセファクリル５３００スーパーフアインカ
ラム（５，０Ｘ８６．８ｃｍ ； １，７００ｍ１樹
脂）にかけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速０
．６ｍ ｌ ７分で行った。セファクリル５３００クロ
マトグラフイを行い。両分１７ｍ７！を集めた。定量は
全クロマトグラフィ段階につき両分直後に行った。活性
画分を集め、プールした両分２０４ｍｊ！を室温で３時
間ＩＭ酢酸水溶液８１を用いて透析し、次いで新しい１
Ｍ酢酸水溶液８７！を用い一晩透析した。透析した両分
を凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＣＦ−■
（タイプＩＩ）４５０ｍｇを得た。この粗融合ＴＧＦＩ
（タイプＩＩ）を１０％ＣＨ３ＣＮ （０，ＯＩＭ
ＴＦＡ）の直線勾配を用い、逆相ＨＰＬ、Ｃ（ウル
トラボアＲＰＳＣカラム）により精製し、精製融合ＩＧ
Ｆ−Ｉ （タイプＩＩ）を得た。
（２）融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩ）からの蛋白ペプチ
ドＬＨ（タイプＩＩ）の脱離： （ａｌ Ｂ Ｎ Ｆ Ｓ−スカトールによる融合ＩＧ
Ｆ−Ｉ （タイプＩＩ）からの蛋白ペプチドＬＨ（タイ
プＩＩ）の脱離： 融合ＩＧＦ−■ （タイプ１１）（８３０μｇ）を７０
％酢酸中ＢＮＰＳ−スカトールを用い０℃で３時間処理
した。反応混合物に２−メルカプトエタノール（１２０
μｌ）を加え、次いで溶媒を真空中で留去した。残渣を
６Ｍグアニジン−５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＪ緩衝液（２ｍ
＃）に溶かし、ＣＨＣＩＩ ｓ（２ｍｊｌ！’）で洗浄
した。水層を２−メルカプトエタノール（２００μ７り
で処理し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ Ｓ Ｃカラム）で精製
して、ＩＧＦ−Ｉスルフオキシド（５０ｇ）を得た。
ドＬＨ（タイプＩＩ）の脱離： （ａｌ Ｂ Ｎ Ｆ Ｓ−スカトールによる融合ＩＧ
Ｆ−Ｉ （タイプＩＩ）からの蛋白ペプチドＬＨ（タイ
プＩＩ）の脱離： 融合ＩＧＦ−■ （タイプ１１）（８３０μｇ）を７０
％酢酸中ＢＮＰＳ−スカトールを用い０℃で３時間処理
した。反応混合物に２−メルカプトエタノール（１２０
μｌ）を加え、次いで溶媒を真空中で留去した。残渣を
６Ｍグアニジン−５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＪ緩衝液（２ｍ
＃）に溶かし、ＣＨＣＩＩ ｓ（２ｍｊｌ！’）で洗浄
した。水層を２−メルカプトエタノール（２００μ７り
で処理し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ Ｓ Ｃカラム）で精製
して、ＩＧＦ−Ｉスルフオキシド（５０ｇ）を得た。
ｆｂｌ 尿素中ＮＣ３による融合ＩＧＦ−１（タイプ
ＩＩ）からの蛋白ペプチドＬＨ（タイプＩＩ）の脱離： 融合ＩＧＦＩ （タイプＩＩ）（７１μｇ）を酢酸（
１ｍ７り、尿素（１ｇ）および水（２ｍｌ）混合物中で
ＮＣ３（６，６μｇ）と０°Ｃで２４時間処理した。反
応混合物をＴｒｉｓで中和し、２−メルカプトエタノー
ル（２０ｍｊ２）で処理し、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ
ＳＣカラム）で精製して、ｒＧＦ−Ｉスルフオキシド（
４，２μｇ）を得た。
ＩＩ）からの蛋白ペプチドＬＨ（タイプＩＩ）の脱離： 融合ＩＧＦＩ （タイプＩＩ）（７１μｇ）を酢酸（
１ｍ７り、尿素（１ｇ）および水（２ｍｌ）混合物中で
ＮＣ３（６，６μｇ）と０°Ｃで２４時間処理した。反
応混合物をＴｒｉｓで中和し、２−メルカプトエタノー
ル（２０ｍｊ２）で処理し、次いで逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ
ＳＣカラム）で精製して、ｒＧＦ−Ｉスルフオキシド（
４，２μｇ）を得た。
＋３１ Ｉ Ｇ Ｆ −１スルフオキシドのチオグリ
コール酸による還元： ＩＧＦ−Ｉスルフオキシド（１７μｇ）を５Ｍチオグリ
コール酸と６Ｍ尿素の溶液（４００ｍｎ）中５０℃で３
．５時間加温した。６Ｍグアニジン（１ｍ７りおよび２
−メルカプトエタノール（１００ｍ ｊ２ ）を加えた
後、混合物をＴｒｉｓでｐＨ８，０に調製し、次いで逆
相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）により精製し、純粋な還
元型ＩＧＦ−Ｉ （７μｇ）を得た。
コール酸による還元： ＩＧＦ−Ｉスルフオキシド（１７μｇ）を５Ｍチオグリ
コール酸と６Ｍ尿素の溶液（４００ｍｎ）中５０℃で３
．５時間加温した。６Ｍグアニジン（１ｍ７りおよび２
−メルカプトエタノール（１００ｍ ｊ２ ）を加えた
後、混合物をＴｒｉｓでｐＨ８，０に調製し、次いで逆
相ＨＰＬＣ（ＲＰＳＣカラム）により精製し、純粋な還
元型ＩＧＦ−Ｉ （７μｇ）を得た。
実施例２８
ＩＧＦ−１発現ベクターｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐの構築ニ
プラスミドｐ Ｓ ｄ Ｍ ｌをＡｖａ ＩＩで消化し
、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有する遺伝子（６４０ｂｐ）を
得、この遺伝子を１３ａｍＨＩで消化し、大きな断片（
２１５ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、
実施例４（５）および４（６）において調製したオリゴ
ヌクレオチド（ＬＣおよびＬＤ）を実施例７に記載のよ
うにリン酸化した。リン酸化オリゴヌクレオチドと上記
のように調製したＩＣＦ−１断片（２１５ｂｐ）を混合
し、Ｔ４ＤＮＡリカ′−ゼを用い、１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ含有溶液中４°Ｃで２４時間処理した。得られたライ
ゲーション混合物をＥｃｏＲＴとＢａｍＨＩで消化し、
次いで分取用ＰＡＧＥにより精製して、リンカ−付きＩ
ＧＩ’−Ｉ遺伝子（２３０ｂｐ）を得た。
、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有する遺伝子（６４０ｂｐ）を
得、この遺伝子を１３ａｍＨＩで消化し、大きな断片（
２１５ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、
実施例４（５）および４（６）において調製したオリゴ
ヌクレオチド（ＬＣおよびＬＤ）を実施例７に記載のよ
うにリン酸化した。リン酸化オリゴヌクレオチドと上記
のように調製したＩＣＦ−１断片（２１５ｂｐ）を混合
し、Ｔ４ＤＮＡリカ′−ゼを用い、１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ含有溶液中４°Ｃで２４時間処理した。得られたライ
ゲーション混合物をＥｃｏＲＴとＢａｍＨＩで消化し、
次いで分取用ＰＡＧＥにより精製して、リンカ−付きＩ
ＧＩ’−Ｉ遺伝子（２３０ｂｐ）を得た。
このＩＧＦ−Ｉ遺伝子（２３０ｂｐ）をＥｃｏＲｌ−Ｂ
ａｍＨＩ消化によりｐＢＲ３２２から得た断片（４ｋｂ
ｂｐ）とライゲートし、次いでライゲーション混合物を
用いてＥ、ｃｏｌｉ ＤＨＩを形質転換した。形質転
換体から得たプラスミドｐＳｄＭｃをＥｃｏＲＩとＢａ
ｍＨＩで消化し、７．５％ＰＡＧＥによりこのプラスミ
ド遺伝子を確認した。プラスミドｐ Ｓ ｄ Ｍ ｃを
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨｌで消化し、小さな断片（２３０
ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、実施例
４（２）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）を実施
例７に記載のようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いリン酸化した。リン酸化オリゴヌクレオチド、実施例
４ （１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）およ
びＩＣＦ−１遺伝子（２３０ｂ ｐ）を混合し、Ｔ４リ
ガーゼを用い、１００ｍＭ ＡＴＰ含有溶液中にて４°
Ｃで２０時間処理した。ライゲーション混合物をＢａｍ
ＨＩで消化し、分取用ＰＡＧＥにより精製して、リンカ
−付きＩＧＦ−１遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。遺伝子
（２４８ｂｐ）を、Ｈ４ｎｄｌＩｌ−ＢａｍＨＩ消化に
よりｐｔ。
ａｍＨＩ消化によりｐＢＲ３２２から得た断片（４ｋｂ
ｂｐ）とライゲートし、次いでライゲーション混合物を
用いてＥ、ｃｏｌｉ ＤＨＩを形質転換した。形質転
換体から得たプラスミドｐＳｄＭｃをＥｃｏＲＩとＢａ
ｍＨＩで消化し、７．５％ＰＡＧＥによりこのプラスミ
ド遺伝子を確認した。プラスミドｐ Ｓ ｄ Ｍ ｃを
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨｌで消化し、小さな断片（２３０
ｂｐ）を分取用ＰＡＧＥにより回収した。一方、実施例
４（２）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍ２）を実施
例７に記載のようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用
いリン酸化した。リン酸化オリゴヌクレオチド、実施例
４ （１）で調製したオリゴヌクレオチド（ｍｌ）およ
びＩＣＦ−１遺伝子（２３０ｂ ｐ）を混合し、Ｔ４リ
ガーゼを用い、１００ｍＭ ＡＴＰ含有溶液中にて４°
Ｃで２０時間処理した。ライゲーション混合物をＢａｍ
ＨＩで消化し、分取用ＰＡＧＥにより精製して、リンカ
−付きＩＧＦ−１遺伝子（２４２ｂｐ）を得た。遺伝子
（２４８ｂｐ）を、Ｈ４ｎｄｌＩｌ−ＢａｍＨＩ消化に
よりｐｔ。
１（ｔ ｒｐから得た断片とライゲートし、ライゲーシ
ョン混合物を用い、Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質
転換させた。プラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐ含有旦９
匹旦 ＨＢＩＯＩを旦、萱旦 Ｆ−８と命名した。Ｊ転
換体から得たプラスミド（ｐＬＨ３ｄＭｃ ｔ ｒｐ）
をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１９８，２３０ｂｐ）、Ｈ
４ｍｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ（２４８ｂｐ）、Ｈｐａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ）で消化し、７．５％
Ｐ Ａ Ｇ ’Ｅによりｔｒｐプロモータ、蛋白ペプチ
ドＬＨおよびＩＧＦ−１遺伝子を確認した。
ョン混合物を用い、Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質
転換させた。プラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐ含有旦９
匹旦 ＨＢＩＯＩを旦、萱旦 Ｆ−８と命名した。Ｊ転
換体から得たプラスミド（ｐＬＨ３ｄＭｃ ｔ ｒｐ）
をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（１９８，２３０ｂｐ）、Ｈ
４ｍｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ（２４８ｂｐ）、Ｈｐａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ （４５６ｂｐ）で消化し、７．５％
Ｐ Ａ Ｇ ’Ｅによりｔｒｐプロモータ、蛋白ペプチ
ドＬＨおよびＩＧＦ−１遺伝子を確認した。
実施例２９
蛋白ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−１（タイプ■）コード遺
伝子の発現： 且９匹旦 Ｆ−８（プラスミドｐ Ｌ ＨＳ ｄ Ｍ
ｃｔｒｐ含有旦６匹旦 ＨＢ １０１）を５０μｇ／ｍ
７！アンピシリン含有しブロス中で一晩培養し、０．２
％グルコース、０．５％カザミノ酸（＠加水分解カゼイ
ン）、５０μｇ ／ ｍ ｊ！ビタミンＢ＋ および２
５μｇ ／ ｍ ｊ２アンピシリン含有Ｍ９培地中に１
＝２０の割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を
加えて環路濃度１０μｇ ／ ｍ Ｉｌとした。
伝子の発現： 且９匹旦 Ｆ−８（プラスミドｐ Ｌ ＨＳ ｄ Ｍ
ｃｔｒｐ含有旦６匹旦 ＨＢ １０１）を５０μｇ／ｍ
７！アンピシリン含有しブロス中で一晩培養し、０．２
％グルコース、０．５％カザミノ酸（＠加水分解カゼイ
ン）、５０μｇ ／ ｍ ｊ！ビタミンＢ＋ および２
５μｇ ／ ｍ ｊ２アンピシリン含有Ｍ９培地中に１
＝２０の割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を
加えて環路濃度１０μｇ ／ ｍ Ｉｌとした。
この時のＡ６゜。は０．５であった。次いで菌体を２時
間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４°ｃ、 ５分間
）により集めた。
間培養し、遠心分離（５ｋｒｐｍ、４°ｃ、 ５分間
）により集めた。
実施例３０
ＩＧＦ−１の分離および精製：
（１） 蛋白ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−１（タ
イプ■）の分離および精製 湿潤菌体ペースト（６０ｇ）を１０ｍＭ ＰＢＳ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）１５０ｍｎに懸濁し、菌体を超
音波処理により破壊した。菌体残渣を１８．００Ｏｒｐ
ｍで３０分間遠心分離してベレット化した。ベレットを
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（！ （ｐ Ｈ８，０）
／ ８Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトール（５０ｍ
ｌ）に溶かし、４０．００Ｏｒｐｍで２０°Ｃて３０分
間遠心分離した。上清を集め、０．１ Ｍ Ｔ ｒｉｓ
−ＨＣｊ！（ｐ Ｈ８，０）／ ８ Ｍ尿素−１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリル
５３００スーパーフアインカラム（５，０Ｘ８６．６ｃ
ｍ、 １，７００ｍ Ａ樹脂）にかけた。溶出は４°Ｃ
で平衡緩衝液を用い流速０．６ｍ ｌ！ ／分で行った
。セファクリル５３００クロマトグラフイを行い、両分
１７ｍｊ２を集めた。
イプ■）の分離および精製 湿潤菌体ペースト（６０ｇ）を１０ｍＭ ＰＢＳ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）１５０ｍｎに懸濁し、菌体を超
音波処理により破壊した。菌体残渣を１８．００Ｏｒｐ
ｍで３０分間遠心分離してベレット化した。ベレットを
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（！ （ｐ Ｈ８，０）
／ ８Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレイトール（５０ｍ
ｌ）に溶かし、４０．００Ｏｒｐｍで２０°Ｃて３０分
間遠心分離した。上清を集め、０．１ Ｍ Ｔ ｒｉｓ
−ＨＣｊ！（ｐ Ｈ８，０）／ ８ Ｍ尿素−１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリル
５３００スーパーフアインカラム（５，０Ｘ８６．６ｃ
ｍ、 １，７００ｍ Ａ樹脂）にかけた。溶出は４°Ｃ
で平衡緩衝液を用い流速０．６ｍ ｌ！ ／分で行った
。セファクリル５３００クロマトグラフイを行い、両分
１７ｍｊ２を集めた。
定量は全クロマトグラフィ段階につき両分直後に行った
。活性画分を集め、プールした画分２０４ｍ１を室温で
３時間ＩＭ酢酸水溶液８１を用いの透析し、次いで新し
い１Ｍ酢酸水溶液８ｊ２を用いて一晩透析した。透析し
た画分を凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＧＦ
−１（タイプ■）４５０ｍｇを得た。粗融合ＩＧＦ−１
（タイプ■）を１０％ＣＨｓＣＮ （０，０１Ｍ ＴＦ
Ａ）〜６０％ＣＨ３ＣＮ （０，ＯＩＭ ＴＦＡ）の直
線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し、精製融合
ＩＧＦ−■ （タイプ■）を得た。
。活性画分を集め、プールした画分２０４ｍ１を室温で
３時間ＩＭ酢酸水溶液８１を用いの透析し、次いで新し
い１Ｍ酢酸水溶液８ｊ２を用いて一晩透析した。透析し
た画分を凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合ＩＧＦ
−１（タイプ■）４５０ｍｇを得た。粗融合ＩＧＦ−１
（タイプ■）を１０％ＣＨｓＣＮ （０，０１Ｍ ＴＦ
Ａ）〜６０％ＣＨ３ＣＮ （０，ＯＩＭ ＴＦＡ）の直
線勾配を用いた逆相ＨＰＬＣによって精製し、精製融合
ＩＧＦ−■ （タイプ■）を得た。
（２） コラゲナーゼによる融合ＩＣＦ−１（タイプ
■）からの！白ペプチドＬＨ（タイプ■）のＷＡ離： 融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩＩ）（２５μｇ）の８Ｍ尿
素または８Ｍ塩酸グアニジン溶液を水で希釈し、２．４
Ｍ （尿素）または２ＭＪ塩酸グアニジン折とした。こ
の溶液に５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！。
■）からの！白ペプチドＬＨ（タイプ■）のＷＡ離： 融合ＩＧＦ−１（タイプＩＩＩ）（２５μｇ）の８Ｍ尿
素または８Ｍ塩酸グアニジン溶液を水で希釈し、２．４
Ｍ （尿素）または２ＭＪ塩酸グアニジン折とした。こ
の溶液に５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！。
１００ Ｍ Ｃａ Ｃｊ！ ２および２００ｍＭ酢酸を
加え、ＩＮＨＣ７！でｐ ８７．２に調製し、次いで０
．１ｍＭフルオロリン酸ジイスプロビルおよびコラゲナ
ーゼ（１０ｍｇ）を加えた。混合物を穏かに３０゛Ｃで
１８時間攪拌した。反応は、最終濃度 ８Ｍまで塩酸グ
アニジンを加えて停止させた。ＤＴＴ（１００ｍＭ／分
）を加えた後、混合物をＨＰＬＣ（カラム：ベックマン
ウルトラボアＲＰＳＣ；流速：１ｍ７！／分；溶出：０
．０１ＭＴＦＡ中１０％〜６０％アセトニトリルの直線
勾配、５０分間）により分析し、還元型ＩＣＦ−Ｉに相
当するピークを検出した。
加え、ＩＮＨＣ７！でｐ ８７．２に調製し、次いで０
．１ｍＭフルオロリン酸ジイスプロビルおよびコラゲナ
ーゼ（１０ｍｇ）を加えた。混合物を穏かに３０゛Ｃで
１８時間攪拌した。反応は、最終濃度 ８Ｍまで塩酸グ
アニジンを加えて停止させた。ＤＴＴ（１００ｍＭ／分
）を加えた後、混合物をＨＰＬＣ（カラム：ベックマン
ウルトラボアＲＰＳＣ；流速：１ｍ７！／分；溶出：０
．０１ＭＴＦＡ中１０％〜６０％アセトニトリルの直線
勾配、５０分間）により分析し、還元型ＩＣＦ−Ｉに相
当するピークを検出した。
第１図はＩＧＦ−１遺伝子の構築の工程を、第２図＋；
！ＩＧＦ−ｊｉｆｆ伝子のクローニングの工程を、第３
図は合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の構築の工程を、
第４図は合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニン
グの工程を、第５図は合成ｔｒｐプロモーター■の構築
の工程を、第６図は合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の
構築の工程を、第７図は蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の構築
の工程を、第８図は蛋白ペプチドＬＨ遺伝子のクローニ
ングの工程を、第９図は組換えプラスミドｐｓｄＭ１ｔ
ｒｐの構築の工程を、第１０図は組換えプラスミドｐｓ
ｄＭ１−３２２ｔｒｐの構築の工程を、第１１図は組換
えプラスミドｐＬＨｔｒｐの構築の工程を、第１２図は
組換えプラスミドｐ ＬＨ３ｄＭｍｔｒｐの構築の工程
を、第１３図および第１４図は組換えプラスミドｐＬＨ
３ｄＭｗｔｒｐの構築の工程を、第１５図および第１６
図は組換えプラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐの構築の工
程を、それぞれ示す。 第２図 Ｉ＆Ｆ−Ｉ 潰ＩＴ、”ｒのりＯ−ニシグρＳ
ｄＭ１ 第 ３ 図 合成ｔ？ｌ）アロモーター Ｉ遣Ａム吾の
才鼻藝、 合仄廿ＰアロＬ−夕−１ｉＩ松手 Ｍ８［Ｋ 仮白付７°子ドＬＨ謹浪りクローニ）り°
“１ 焙着と単島髪 ｐＬＨ１０７ 蛋白ｌで７子ドＬｌ−１遣４がト ａ ９ Ｚ ａｔ央ｔ７°ラスミド ＰＳＣＩ
Ｍ １ ｔ？ｒ ｅ）＊ＩＪｐｓｄＭＨｒｐ １珍 １０図 糸且シ赴え７°うλミド ｐｓ＋ＪＭ＋
−３２２±？ｐの積重１↓惚着ヒｌ＋Ｌ ｐＳｄＭｌ−３２２ｔｒｐ 負−１１図 仙Ｊ粂え７゛ラス三ド ｐＬＨｔｒＰの才
艮１トρＬＨｔｒｐ 第 １２ 図 ａｎえプラスミド ＦＬＨ５己ビ１ηｔ
？Ｐのキー１と１焙看と単離 ｐＬ）ＩＳｄＭｍｔｒｐ 第１３図 ｃｏＲＩ Ａｖａｎ Ｂａｒｎ）（Ｉ ＡｖａｌＩ ８−よ？／” １３ａ１１１ ）１ 工で
間製した１６Ｆ−Ｉ環指ト
！ＩＧＦ−ｊｉｆｆ伝子のクローニングの工程を、第３
図は合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の構築の工程を、
第４図は合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のクローニン
グの工程を、第５図は合成ｔｒｐプロモーター■の構築
の工程を、第６図は合成ｔｒｐプロモーター■遺伝子の
構築の工程を、第７図は蛋白ペプチドＬＨ遺伝子の構築
の工程を、第８図は蛋白ペプチドＬＨ遺伝子のクローニ
ングの工程を、第９図は組換えプラスミドｐｓｄＭ１ｔ
ｒｐの構築の工程を、第１０図は組換えプラスミドｐｓ
ｄＭ１−３２２ｔｒｐの構築の工程を、第１１図は組換
えプラスミドｐＬＨｔｒｐの構築の工程を、第１２図は
組換えプラスミドｐ ＬＨ３ｄＭｍｔｒｐの構築の工程
を、第１３図および第１４図は組換えプラスミドｐＬＨ
３ｄＭｗｔｒｐの構築の工程を、第１５図および第１６
図は組換えプラスミドｐＬＨ３ｄＭｃｔｒｐの構築の工
程を、それぞれ示す。 第２図 Ｉ＆Ｆ−Ｉ 潰ＩＴ、”ｒのりＯ−ニシグρＳ
ｄＭ１ 第 ３ 図 合成ｔ？ｌ）アロモーター Ｉ遣Ａム吾の
才鼻藝、 合仄廿ＰアロＬ−夕−１ｉＩ松手 Ｍ８［Ｋ 仮白付７°子ドＬＨ謹浪りクローニ）り°
“１ 焙着と単島髪 ｐＬＨ１０７ 蛋白ｌで７子ドＬｌ−１遣４がト ａ ９ Ｚ ａｔ央ｔ７°ラスミド ＰＳＣＩ
Ｍ １ ｔ？ｒ ｅ）＊ＩＪｐｓｄＭＨｒｐ １珍 １０図 糸且シ赴え７°うλミド ｐｓ＋ＪＭ＋
−３２２±？ｐの積重１↓惚着ヒｌ＋Ｌ ｐＳｄＭｌ−３２２ｔｒｐ 負−１１図 仙Ｊ粂え７゛ラス三ド ｐＬＨｔｒＰの才
艮１トρＬＨｔｒｐ 第 １２ 図 ａｎえプラスミド ＦＬＨ５己ビ１ηｔ
？Ｐのキー１と１焙看と単離 ｐＬ）ＩＳｄＭｍｔｒｐ 第１３図 ｃｏＲＩ Ａｖａｎ Ｂａｒｎ）（Ｉ ＡｖａｌＩ ８−よ？／” １３ａ１１１ ）１ 工で
間製した１６Ｆ−Ｉ環指ト
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の配列の７０個のアミノ酸からなるヒトインスリ
ン様成長因子Ｉ（以下ＩＧＦ−Ｉと略称する）の製造法
であって、 （ａ）ＩＧＦ−Ｉの発現をコードする合成のＩＧＦ−Ｉ
遺伝子と該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、それに隣接して
存在し、構造遺伝子を有さず、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現
をコントロールするプロモーター遺伝子とを包含するプ
ラスミドを自身の中に含有する生物を培養すること、お
よび、 （ｂ）培養液からＩＧＦ−Ｉを回収することを包含する
ことを特徴とする該方法。 【遺伝子配列があります】 ２、（ａ）宿主生物がエシェリキア・コリ（￥Ｅｓｃｈ
ｅ−ｒｉｃｈｉａ￥ ￥ｃｏｌｉ￥）であり、（ｂ）
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子が次の配列を包含し、コードする鎖：
【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】そして、 （ｃ）プロモーター遺伝子が次の配列を包含する 【遺伝子配列があります】 ものである特許請求の範囲第１項記載の方 法。 ３、次の配列の７０個のアミノ酸からなるＩＧＦ−Ｉの
発現をコードする合成遺伝子またはそのサブユニット： 【遺伝子配列があります】 ４、遺伝子が次の配列またはそのサブユニットを包含す
るところの特許請求の範囲第３項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】５、遺伝子
が次の配列またはそのサブユニットを包含するところの
特許請求の範囲第３〜４項記載の合成遺伝子： コードする鎖：【遺伝子配列があります】 コードしない鎖：【遺伝子配列があります】６、いくつ
かの数のオリゴヌクレオチドブロックのハイブリッド化
とライゲーションを包含することを特徴とする特許請求
の範囲第３〜５項のいずれかに記載の合成遺伝子の製造
法。 ７、次の配列の７０個のアミノ酸からなるＩＧＦ−Ｉの
発現をコードする合成のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有するプ
ラスミド： 【遺伝子配列があります】 ８、次の配列の７０個のアミノ酸からなるＩＧＦ−Ｉの
発現をコードする合成のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を包含するプ
ラスミドを自身の中に含有することを特徴とする生物： 【遺伝子配列があります】 ９、次の配列の７０個のアミノ酸からなるＩＧＦ−Ｉの
発現をコードする合成のＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該ＩＧＦ
−Ｉ遺伝子の上流にそれに隣接して存在し、構造遺伝子
を有さずＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現をコントロールするプ
ロモーター遺伝子とを包含していることを特徴とするＩ
ＧＦ−Ｉ発現プラスミド： 【遺伝子配列があります】 １０、次の配列の７０個のアミノ酸からなるＩＧＦ−Ｉ
の発現をコードする合成のＩＧＦ−Ｉ遺伝子と、該ＩＧ
Ｆ−Ｉ遺伝子の上流にそれに隣接して存在し、構造遺伝
子を有さず、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現をコントロールす
るプロモーター遺伝子とを包含しているプラスミドを自
身の中に含有することを特徴とする生物： 【遺伝子配列があります】 １１、次の配列を含むところの、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発
現をコントロールする合成のプロモーター遺伝子： 【遺伝子配列があります】 １２、いくつかの数のオリゴヌクレオチドブロックのハ
イブリッド化およびライゲーションを包含することを特
徴とする特許請求の範囲 第１１項記載の合成遺伝子の製造法。 １３、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミド： 【遺伝子配列があります】 １４、次の配列を包含する合成のプロモーター遺伝子を
含有するプラスミドを自身の中に含有することを特徴と
する生物： 【遺伝子配列があります】 １５、特許請求の範囲第３〜５項記載のＩＧＦ−Ｉ遺伝
子と特許請求の範囲第１１項記載のプロモーター遺伝子
とを適当なプラスミド中へ挿入することを含むことを特
徴とする、特許請求の範囲第９項記載のＩＧＦ−Ｉ発現
プラスミドの製造法。 １６、適当な生物を特許請求の範囲第９項記載のＩＧＦ
−Ｉ発現プラスミドで形質転換することを含むことを特
徴とするＩＧＦ−Ｉ生産性生物の製造法。 １７、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉを脱離反応に
付すことを特徴とするＩＧＦ−Ｉの製造法。 １８、ｉ）保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該メチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合しており、ｉ
ｉ）脱離反応は臭化シアンを用いて行われるところの、
特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、ｉ）保護ペプチドが最終のアミノ酸としてトリプ
トファンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプ
チドの該トリプトファンを介してＩＧＦ−Ｉと融合して
おり、ｉｉ）脱離反応はＢＮＰＳ−スカトールまたはＮ
−クロルスクシンイミドを用いて行われるところの、特
許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０、ｉ）保護ペプチドが最終のアミノ酸群として「Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−」を有する蛋白ペプチドであっ
て、その蛋白ペプチドの該「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
」を介してＩＧＦ−Ｉと融合しており、ｉｉ）脱離反応
はコラゲナーゼを用いて行われるところの、特許請求の
範囲第１７項記載の方法。 ２１、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉ。 ２２、保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオニン
を有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチドの該
メチオニンを介してＩＧＦ−Ｉと融合しているところの
、特許請求の範囲第２１項記載の保護ペプチド融合ＩＧ
Ｆ−Ｉ。 ２３、保護ペプチドが最終のアミノ酸としてトリプトフ
ァンを有する蛋白ペプチドであって、その蛋白ペプチド
の該トリプトファンを介してＩＧＦ−Ｉと融合している
ところの、特許請求の範囲第２１項記載の保護ペプチド
融合ＩＧＦ−Ｉ。 ２４、保護ペプチドが最終のアミノ酸群として「−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−」を有する蛋白ペプチドであって
、その蛋白ペプチドの該「−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
」を介してＩＧＦ−Ｉと融合しているところの、特許請
求の範囲第２１項記載の保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ。 ２５、次のアミノ酸配列をもつ蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉ（タイプ I ）であるところの、特許請求の範
囲第２２項記載の保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ： 【遺伝子配列があります】 ２６、次のアミノ酸配列をもつ蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉ（タイプII）であるところの、特許請求の範囲
第２３項記載の保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ： 【遺伝子配列があります】 ２７、次のアミノ酸配列をもつ蛋白ペプチドＬＨ融合Ｉ
ＧＦ−Ｉ（タイプIII）であるところの、特許請求の範
囲第２４項記載の保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ： 【遺伝子配列があります】 ２８、保護ペプチドと融合したＩＧＦ−Ｉをコードする
遺伝子。 ２９、保護ペプチドをコードする遺伝子をＩＧＦ−Ｉを
コードする遺伝子に、該ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流に、リ
ンカーを用いて連結することを特徴とする保護ペプチド
融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子の製造法。 ３０、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合ＩＧＦ−
Ｉをコードする遺伝子とを含有する発現ベクター。 ３１、プロモーター遺伝子と保護ペプチド融合ＩＧＦ−
Ｉをコードする遺伝子とをプラスミドに挿入することを
特徴とする発現ベクターの製造法。 ３２、特許請求の範囲第３０項で定義した通りの発現ベ
クターを含有する形質転換体。 ３３、特許請求の範囲第３０項で定義した通りの発現ベ
クターで宿主生物を形質転換することを特徴とする形質
転換体の製造法。 ３４、特許請求の範囲第３２項で定義した通りの形質転
換体を培養することを特徴とする保護ペプチド融合ＩＧ
Ｆ−Ｉの製造法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8407044 | 1984-03-19 | ||
| GB848407044A GB8407044D0 (en) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | Producing human insulin |
| GB8424197 | 1984-09-25 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4153492A Division JPH07108229B2 (ja) | 1984-03-19 | 1992-06-12 | 保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ遺伝子 |
| JP4153493A Division JPH0713080B2 (ja) | 1984-03-19 | 1992-06-12 | 保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611396A true JPS611396A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH055840B2 JPH055840B2 (ja) | 1993-01-25 |
Family
ID=10558294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5551485A Granted JPS611396A (ja) | 1984-03-19 | 1985-03-18 | インスリン様成長因子ｉの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611396A (ja) |
| GB (1) | GB8407044D0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62190199A (ja) * | 1986-02-14 | 1987-08-20 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ヒトインスリン様成長因子１の製造法 |
| WO2016051752A1 (ja) * | 2014-09-29 | 2016-04-07 | 国立大学法人東北大学 | プロテアーゼの基質ペプチド及びプロテアーゼの活性測定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163600A (en) * | 1977-11-08 | 1979-12-26 | Genentech Inc | Microbiological polypeptide expression method and means |
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
-
1984
- 1984-03-19 GB GB848407044A patent/GB8407044D0/en active Pending
-
1985
- 1985-03-18 JP JP5551485A patent/JPS611396A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163600A (en) * | 1977-11-08 | 1979-12-26 | Genentech Inc | Microbiological polypeptide expression method and means |
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62190199A (ja) * | 1986-02-14 | 1987-08-20 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ヒトインスリン様成長因子１の製造法 |
| WO2016051752A1 (ja) * | 2014-09-29 | 2016-04-07 | 国立大学法人東北大学 | プロテアーゼの基質ペプチド及びプロテアーゼの活性測定方法 |
| JPWO2016051752A1 (ja) * | 2014-09-29 | 2017-06-29 | 国立大学法人東北大学 | プロテアーゼの基質ペプチド及びプロテアーゼの活性測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8407044D0 (en) | 1984-04-26 |
| JPH055840B2 (ja) | 1993-01-25 |
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