JPS62190199A - ヒトインスリン様成長因子１の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ この発明は医薬として有用なヒトインスリン様成長因子
工（以下、ＩＧＦ−１と称する）の新規な製造法に関す
る。

［従来の技イＩｔ□ｊコ ＩＧＦ−Ｉは公知の化合物であり、その−次構造はハン
ヘル（Ｒ，Ｅ、　Ｈｕｍｂｅｌ　）らによって下記の通
りであると報告きれている。［ティ・エル・ブリュンデ
ル、ニス・ペダルカル、イー・リンデルクネヒトおよび
アール・イー・ハンヘル：プロンーディングス・才ブ・
ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンス・才ブ・ザ
・ニーニスニー、第７５Ｓ、第１８０頁〜第１８４頁（
１９７８年発行）（Ｔ、Ｌ。

Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、　Ｓ、　Ｂｃｄａｒｋａｒ、　Ｅ、
　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｃｃｈｔ　ａｎｄＲ９εＨｕｍｂｅ
ｌ二Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ
Ａ。

陳、　１８０−１８４　（１（１７８））、およびイー
・リンデルタ５＋ヒトおよびアール・イー・ハンヘル：
シ〜−ナル・才ブ・バイオロンカル・ケミストリー、第
２５３巻、第２７６９頁（１９７８年発行）（Ｅ、　Ｒ
ｉｎｄｅｒｋｎｅｃｂｔａｎｄ　　Ｒ，Ｅ、　　Ｈｕｍ
ｂｃｌ　　：　　Ｅ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｃｍ、　
　２５３．　２７６９（１９７８）　］ （式中、Ａはアラニン、Ｃはシスティン、Ｄはどスパラ
キン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、■はインロイシン、Ｋはリンフ、Ｌはロイ
シン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリ
ン、Ｑはグルタミレ、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
はトレオニン、■はバリン、Ｙはチロシンをそれぞれ意
味し、ＣとＣを結ぶ３本の実線は−５−８−結合を意味
する） ハンベルらはヒトの血液から上記の一次構造を有するＩ
ＧＦ−Ｉを単離し、その構造を決定したが、この発明の
発明者らは遺伝子組換え法により得たＩＧＦ−Ｉをアミ
ノ酸配列： Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｌ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｖ−Ｄ−Ａ
−Ｌ−Ｑ−Ｆ−Ｖ−Ｃ−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｙ−Ｆ−
Ｎ−に−Ｐ−Ｔ２Ｏ３５４Ｏ −Ｇ−Ｙ−Ｇ−３−５−３−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｑ−Ｔ−
Ｇ−１−Ｖ−Ｄ−Ｅ−Ｃ−Ｃ−Ｆ−Ｒ−３−Ｃ−Ｄ−Ｌ
−Ｒ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−Ｍ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｐ−Ｌ−に−Ｐ−
Ａ−に−８−Ａ（式中、Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、■、
Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ，Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹは前
と同し意味である） を有する還元型Ｉ　ＧＦ−１として単離し、得られた還
元型ＴＧＦ−１を酸化して酸化型ＩＧＦ−Ｉを得た。す
なわち、還元型ＩＧＦ−１とはＩＧＦ−■内の３対のン
スーｒイレ相互の−８−８−結合が切断きれて、直鎖状
のＩＧＦ−Ｉとなったものであるが、この還元堅ＩＧＦ
−■を酸化して酸化型ＩＧＦ−Ｉ、すなわち３対の−８
−５−結合を有“するＩＧＦ−１に導く過程で、この発
明の発明者らは、へレベルらとは異なった一次構造を有
するＩＧＦ−１を見出した。

その−次構造は、式 （式中、Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、１．Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ
、Ｐ、Ｑ、Ｒ，Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹならびにＣとＣを結
ぶ３本の実線はそれぞれ前と同し意味である。） で表わされ、その生物学的性質もハンヘルらによ−・て
ヰ離きれたものと異ることが判明した。

こσ）明細書では、＾ンヘルらが単離した式（Ｉ−λニ
）で表わされる一次構造を有するＩ　ＧＦ−１を酸化型
ＩＣＦ−１（Ａ型）と称し、この発明の発明ンらか新し
＼見出した式（Ｉ−ｂ）で表わされる　次構造を有する
ＩＧＦ−Ｉを酸化型ＩＧＦ−Ｉ（Ｂ型）と称することに
する。

この発明は、遺伝子組換え法なとにより得られｂ還元型
ＩＧＦ−Ｉを酸化して酸化型ＩＣＦ−１に導く際に、ヒ
トの血液由来のＩ　ＣＦ−１と同し一次構造を持ち、ヒ
トに投与する際により自然に受は入れられると思われる
酸化型ＩＧＦ−１（Ａ型）をより多く、酸化型ＩＧＦ−
Ｉ（Ｂ型）をより少く得るＩＧＦ−１（７：製造法を確
立することを目的として、この発明の発明渚らが鋭意研
究した結果完成きれたものである。

［問題点を解決するだめの手段］ この発明は還元型ＩＧＦ−１を緩衝液中で酸化する際に
該緩衝液に溶解性を有する有機溶媒を共存させることを
特徴とするが、きらに詳細には、還元型ＩＧＦ−Ｉを緩
衝液中に溶解放散し、Ｈ相液中にイｆ在する酸素にて酸
化させる際に、該緩衝液に溶解性を有４−る有機溶媒を
共存させることを特徴とするものであど）。

、−の発明の方法を実施するには、還元型ＩＧＦ−■を
緩衝液中に溶Ｍ−ａせる必要があり、そのためには還元
型Ｉ　ＧＦ−１をまずグアニジン溶ｆ＆に溶解さ七るな
き、この分野で通常行われている常套７段を用いること
ができる。

かくして得られたＩＧＦ−Ｉの溶液は、次いで例犬は！
リス・塩酸緩衝液のような通常用いられる緩衝液で希釈
されるが、その際にこの発明の方法では該緩衝液に溶解
性を有する有機溶媒を共存きせる。

ここで用いられる有機溶媒としては該緩衝液に溶解する
ものであれば特に限定きれず、例えばメタノール、エタ
、ノール、プロパツール、イソプロピルアルコールなど
の水溶性の高い低級アルコール、アセトニトリル、シメ
チルスルホキンド、ンメナルホルムアミドなどがその好
ましい例として挙げられる。

なお、還元型ＩＧＦ−１を溶解する際も緩衝液を添加す
るのが好ましい。また還元型Ｉ　ＧＦ−１を溶解希釈す
るだめの緩衝液のｐＨは好ましくは７以上、諮らに好ま
しくは７〜９である。反応系に共存きせる有機溶媒の口
は特に限定されず、好ましくは２０〜６０％、より好ま
しくは３０〜４６％である。

酸化反応は、かくして得られた還元型ＩＧＦ−■の希釈
液を冷却下ないし室温下、場合によっては約４０℃以下
の加温下で放置することによって、緩衝液中に溶解して
いる＃素による酸化反応として進行する。また、酸化−
還元グルタチオン系のようなこの分野で通常用いられる
適当な酸化系を用いてもよい。

かくして得られた酸化型ＩＧＦ−Ｉは、有機溶媒を共存
させない系を用いて同様に酸化型ＩＧＦ−■を製造した
場合と比較して、ＩＣＦ−ＩＣＡ型）の含量がはるかに
多く、したがってこの発明のＩＧＦ−１の製造法は血液
中から単離したＩＧＦ−１（ＡＱＩｌ、）と同型のもの
をより多く得ようという［１的に合致するものである。

反応生成物から酸化型ＩＧＦ−Ｉ（Ａ型）を単断り一る
には、この分野で常用きれるクロマトグラフィー、特に
高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）を用い
る方法が好ましい。

［実施例］ 以下、製造例、比較例および実施例によりこの発明をざ
らに詳しく説明する。

製造例　還元型ＩＧＦ−１の製造 Ｅ−、ｃｏｌｉ　Ｆ　　６　（プラスミドｐＬＨ５ｄＭ
　ｍｔｒｐ含（１’　Ｅ、　ｃｏ旦ＨＢＩＯＩ　）　（
本枕は工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条
約に基ついて寄託きれている。寄託番号：　ＦＥＲＭＢ
Ｐ−７２９、寄託口：　１９８４＋ｊＥ　９　月１７日
）をアンピシリン５０鴎／　ｍＱ含有Ｌしロス中で一晩
培養し、０２％グルコース、０，５％カザミノ酸（酸加
水分解カゼイン）、５０　＜　／　＋ｎＱビタミンＢ１
および２５ｘ／ｍΩアンピシリン含有Ｍ−９培地に１＝
２０の割合で希釈した。β−イ）・ドールア／）リル酸
を加ス最終濃度１０ｘ　／　ｍΩとした。この時のＡ６
ｏｏは０５であった。次に、２時間ｔ；’；　養し、遠
心分離（５Ｋｒｐｍ、４°Ｃ５５分間）により菌体を収
集した。

〃潤Ｉｌｌ胞ベース１〜（７６０ｇ）を１０ｍＭＰＢＳ
−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８、０）　１５０ｍｇに懸７蜀し、
菌体を超音波処Ｊ’ｌｉにより破壊した。菌体残層を１
８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレット化した
。得られたペレットを０．１ＭＴｒｉｓ　−ＩＩｃＩ　
（ｐＨ８，０）　／　８　Ｍ尿素−０，１Ｍジチオスレ
イトール（５０ｍｇ）に溶かし、３５．００Ｏｒｐｍ、
２５℃で３０分間遠心分離した。上清を取り、０．１Ｍ
　Ｉｒｉｓ−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）／８Ｍｆｆ素および
１０ｍＭ２−メルカプ１、エタノールで平衡化したセフ
ァクリル５３００スーパーフアインカラム（ｉｆ［：フ
ァルマシア社製）　（５，０ｘ　８６．６ｃｍ、１７０
０ｍＱｍ脂）にかけた。溶出は４°Ｃで平衡Ｂ衝液を用
い、流速０．５ｍＱ／分で行った。セファクリル５３０
０クロマトグラフイを行い、画分１７ｍＱを集めた。定
量は全り１コマトグラ−・・イ段階について両分後直ち
に行った。活性画分手、集め、合わ廿た画分２５５ｍＱ
を１Ｍ酢酸水溶液８ｆを用い室温で３時間透析し、次い
で新たにＩＭ酊酢酸７各液８ｉ！を用い一晩透析した。

透析画分は凍結乾燥し、ｒＬ望の成分を含有する融合Ｉ
ＧＦ−１４５０ｍｇを得た。この融合ＩＧＦ−１は、１
５％ＳＤＳ　ＰＡＧＥにて分子量１５．５００の位置に
ハンドを示す。

融合Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１（２２５ｍｇ）を６０％キＭ３６
ｍＱに溶解した。。５！−化シアン（３６ｍｇ）を加え
、２５°Ｃ以下で３時間攪拌下に反応許せた。蒸留水２
３４ｍＱを加えた後、キ酸および臭化シアンを凍結乾燥
により除去した。ｈＱ渣をＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ
　（ｐＨ８，０）　／　８　Ｍ原素−５０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール３５ｍＨに溶かした。この溶液を０
０１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４，６）／　８　Ｍｉ累
−５０ｍＭ２−メルカプトエタノール（以下、バッファ
　−Ａと称する）　４００ｍｇを用い室温で３時間、２
回透析し、次いで新しいバッファ−Ａ　４００ｍｇを用
い一晩透析した。

透析溶液はバッファーＡで平衡化したカチオン交換樹脂
ＣＭ５２ツノラム（１，６Ｘ７．５ｃｍ　１５ｍＱｉ＋
脂）にか１すた。カラムはバッファーＡ　（６０ｍＱ）
を用い、（ｌＺＬｌｍＭ　）から０．２Ｍと冊■／　Ｂ
　Ｍ　Ｋ　Ｎ　−５０ｍＭ　２−メルカプトエタノール
（１２０ｍｇ　）までの直線勾配でＷｒ出した。両分（
Ｎｏ　５［ｉ　−Ｎｏ　６１　）　２．９ｍＵ　７画分
を集めた。

集めた両分を次の条件でＨＰＬＣにかけた。

力′ツム：ウルトラボアＲＰＳＣ（４，６Ｘ　７５ｍ＋
ｎ　）　（商標：ベックマン社製） 疏　速：１ｍＱ／分 溶　出：　０．ＩＭ　トリフルオロ酊酸中１０％から６
０％までのアセ（・ニトリルの直線勾配；５０分間 ２０マドグラフイーは１５回繰返して還元型ＩＧＦ−１
含有画分を集めた。保持時間２９３２分の（−ピークは
還元型ＩＧＦ−Ｉに相当する。前述の１Ｎ・作により得
た還元型ＩＧＦ−１を凍結乾燥し粉末として約２．４ｍ
ｇを得た。

比較例 前記の製造例と同様にして得た還元型Ｉ　ＣＦ−■を６
　Ｍ　Ｑ”アニ〉ン／　０．０５Ｍ　　）リス・塩酸緩
種１？＆　（ｐＨ８，０’−）に溶解し、濃度＜ｔ　３
　、３ｍｇ　／　ｍＱとした。

こＱ２溶液１ｍΩに、０．０５Ｍ　　トリス・塩酸級衝
液（ｐｌｙ、　０　）　１１ｍＱを加えて希釈した後、
室温下７２時間放置した。不溶物を０．４ＳＰのフィル
ターで除去した後、下記条件により）ＩＦ’Ｌｃにより
測定した結果、酸化型ＩＧＦ−１（Ａ型）　０．９３ｍ
ｇ、　ｖ化型ＩＧＦ−１（Ｂ型）　０．３５ｍｇをそれ
ぞれ含有していることが判明した。

［ＨＰＬＣ−１］ カ　ラ　ム：ウルトラボア（Ｕｌｔｒａｐｏｒｃ　）　
ＲＰＳＣ（４，６ｘ７５ｍｍ）（商標：へツクマン社製
）検出方法、：　２１４ｎｍの吸収による溶出方性：０
．ＩＭトリフルオロ酢酸中１０％から６０％までのアセ
トニトリルの直線勾配を つけた溶出（５０分） ？ＸＥ　　速：　１．０ｍ１Ｆ／　ｍｉｎ保持時間：酸
化型ＩＧＦ−Ｉ（Ｂ型）１７．２分酸化型ＩＧＦ−１（
Ａ型）１８．２分 上記の反応液をＩＭ酢酸水溶液ＩＰに対し透析（分子量
カソトオ）３５００）　ｌ、た後、凍結乾燥した。得ら
れた粉末を０．１Ｍトリフルオロ酢Ｂ　１　ｒｎＱに溶
解後、下記条件によりＨＰＬＣを用いて精製して、ＩＧ
Ｆ−１（Ａ型）　０．５３ｍｇを得た。（収率１６２％
） ［ＨＰＬＣ−２］ カ　　ラ　　ム　：　　ＡＰ−３４３−１０（Ｓ　　−
１０、２００八　　〇ＤＳ　）（２０Ｘ　２５０腫）（
ＹＭＣ社製） 検出方法：　２３０ｎｍの吸収による 溶　　出：下記のハラＬ・アーａおよびバッファーすの
組み合わせによるアセトニトリル で勾配をつけた溶出。

（ｍｉｎ）　　　ｍＱ／ｍｉｎ　　　（％）　　　（％
）バッファーａ：１０％アセトニトリル含有０１Ｍトリ
フルオロ酢酪 ハ・／ファーｂ＝６０％アヤトニトリル含有０１Ｍトリ
フルオロ酢酸 保持時間：ＩＧＦ−Ｉ　　Ｂ型１５０分ＩＧＦ−Ｉ　　
Ａ型　１７５分 に遍−１ １１１ｊ記の製造例と同様にして得た還元型ＩＧＦ−１
’５６　Ｍグアエレン１０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液
（：ｐＨ８０）に溶解し、濃度を３．３ｍｇ／　ｍＱと
した。

二のｌ合液１　ｍＱに０．０５Ｍ＋−リス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８、０）　７４ｍＱおよびアセトニトリル３，５
ｍＱを加え、最終イ１槻溶奴濃度を３０％としたのち、
室温下７２時間放置した。不溶物を０．４５戸のフィル
ターで除去した後、前記の比較例と同様にＨＰＬＣで分
析した結果、酸化型ＩＧＦ−１（Ａ型）　１．６０ｍｇ
、　ｍ化型Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１（Ｂｉｂ　）０．２２ｍｇ
をそれぞれ含有していることが判明した。

反応液をＩＭＦＩＩ酸で２倍に希釈した後、反応液中の
−どヤトニトリルを除く目的で１Ｍ酢酸に対して透析（
分子量力ットオ）３．５００）シ、凍結乾燥した。得ら
れた粉末に０．０１Ｍトリフルオロ酢酸水溶液１ｍＱを
加えて溶解し、ＨＰＬＣで前記の比較例と同様の条件で
精製し、酸化型ＩＧＦ−１（Ａ型）０、９４ｍｇを得た
。（収率２８４％）実施例２ 前記の製造例と同様にして得た還元型ＩＧＦ−■を６Ｍ
’ｆアニンン１０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８
０）に溶解し、濃度を３．３ｍｇ／　ｍＱとした。

この溶液１　ｍＱに０．０５Ｍ）、リス・塩酸緩衝液（
ｐＨ８、０）　ｓ６ｍｕおよびアセトニトリル５．４ｍ
Ｑを加え、最終有機溶媒濃度手−４６％としたのち、室
温下７２時間放置した。不溶物を０４５Ｐのフィルター
で除去した後、１油記の北東；・例と同様にＨＰＬＣで
分析した結果、酸化型ＩＧＦ−Ｔ（Ａ型）　１．９４ｍ
ｇ、　９化型ＩＧＦ−１ＣＢ型）　０．３２ｍｇをそれ
ぞれ含有していることが判明した。

反応７夜をＩＭ酢酊・で２倍に希釈した後、反応液中の
アを一トー　トリルを除く目的でＩＭ＋￥１酸に対しＴ
透析（分子量力ントオ）３，５００）Ｌ、凍結乾燥した
。得られた粉末に０．ＯＩＭｌ−リフルオロ酢酸水溶液
１　ｍＱを加えて溶解し、ＨＰＬＣで前記の比較例と［
１）様の条件で精製し、酸化型ＩＧＦ−１（Ａ型）１．
１４ｍｇを得た。（収率３４３％）実施例３ 前記の製造例と同様にして得た還元型Ｉ　ＧＦ−Ｉｔ６
Ｍグアニジン１０．０５Ｍ　ｈリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解し、濃度を３．３＋ｎｇ／　ｍＱとした
。

この溶液１　ｍＨに０．０５Ｍ１−リス・塩酸緩衝液（
ｐＨ８、０）　５．５ｍＵおよびメタノール５．４ｍＱ
を加え、最終有機溶媒濃度を４６％としたのち、室温下
７２時間放置した。不溶物を０４５−のフィルターで除
去した後、１°１ｉｉ記の比較例と同様にＨＰＬＣで分
析した結果、酸化型！ＩＧＦ−Ｉ（Ａ型）　１．７４ｍ
ｇ、　酸化型（Ｂ”Ｉ　）　０．１９ｍｇをそれぞれ含
有していることが判明した。

Ｘ１Ｊ」↓ 前記の製造例と同様にして得た還元型Ｉ　ＧＦ−１を６
Ｍグアニジン１０．０５Ｍ＋−リス・塩Ｖ緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解し、ａ度を３．３ｍｇ／ｍＱとした。

この溶液１　ｍＱに０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８、０）　７４ｍＱおよび〉メグールスルホキンド３
．５ｍＱを加え、最終イ１機溶媒濃度を３０％としたの
ら、室温下７２時間放置した。不溶物を０４５戸のフィ
ル７？−で除去した後、前記の比較イＩ；：ｊと同様に
ＨＰＬＣで分析した結果、酸化型Ｉ　Ｇ　Ｆ　　Ｉ　（
Ａ’４’！　）　１．１４ｍｇ、　酸化型Ｉ　ＧＦ　−
１（ＢＷ）０．１８ｍｇをそれぞれ含有していることが
判明した。

医」Ｕ礼旦 前記の製造例と同様にして得た還元型ＩＧＦ−■を６Ｍ
グアニ／ン１０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）に溶解し、濃度を３．３ｍｇ／ｍＱとした。

この溶液ｌｌｌ１Ωに０．０５Ｍトリス・塩Ｉ９ａ帽液
（ｐＨ８、０）　５６ｍＱお町びジメチルスルホキシド
５．４ｍＱを加え、最終有機溶媒濃度を４５％としたの
ち、室温下７２時間放置した。不溶物を０．４５−のフ
ィルターで除去した後、前記の比較例と同様にＨＰＬＣ
で分析しｌ−結果、酸化型Ｉ　ＧＦ　−Ｉ　（Ａ５）２
．０３ｍｇ、　酸化型ＩＧＦｉ（Ｂ型）　０．２３ｍｇ
をそれぞれ含有していることが判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
   ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
   はグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイ
   シン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリ
   ン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
   はトレオニン、Ｖはバリン、Ｙはチロシンをそれぞれ意
   味する） を有する還元型ヒトインスリン様成長因子Ｉを緩衝液中
   で酸化し、得られる反応液から一次構造▲数式、化学式
   、表等があります▼ （式中、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ
   、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹはそれぞれ前と同じ
   意味であり、ＣとＣを結ぶ３本の実線は−Ｓ−Ｓ−結合
   を意味する） を有する酸化型ヒトインスリン様成長因子Ｉ（Ａ型）を
   分離採取するに際し、該緩衝液に溶解性を有する有機溶
   媒を、該反応系に共存させることを特徴とする酸化型ヒ
   トインスリン様成長因子Ｉ（Ａ型）の製造法。