JPS59500597A - 形質転換させた微生物からヒトＩＦＮ−βを回収する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 形質転換させた微生物からヒトＩＦＮ−βを回収する方法 技術分野 本発明は生化学工学の分野にある。更しこ詳しくは、不発明は、ヒトＩＦＮ−β をつくりだすように形質転換させた修生物からｔニドＩＦＮ−βを分離又は回収 するだめの生化学的分離回収法に関する。

背景技術 天然のヒトＩＦＮ−βは、分子量２２，０００〜２６，０００ダルトンをもつと 言われる糖タンパク質であるつ他のインターフェロンと同様、ＩＦＮ−βは抗ウ ィルス活性、ｍ砲生長又は分化の調整、免疫反応の変調、及び酵素調整を含めた 複数の生物学的効果をもつものとして報告されている。天然のヒトＩＦＮ−βは 、種々のウィルス性又は非ウィルス性誘発要因による誘発下シこ、ヒト線維芽細 胞、白血球はリンパ芽球用細胞によってつイられる。天然のヒトＩＦＮ−βをつ くるのに現在用いられている王な方法の一つは　ポリＩＣ（ポリリポ・イノシ二 ／酸：ポリリホシチジル酸）でヒト線雌芽細胞培養基を重複誘発することである 。ＩＦＮ−βは細胞の分泌物からゲルクロマトグラフィ又は電気泳動によって単 離される。この方法は、大規模臨席試験及び商業的流通に必要とされるような量 のヒ）ＩＦＮ−βをつくる実際的な方法とは、現在考えられていない。

遺伝子工学がＩＦＮ−β生産の代替え方法を提供している。ＩＦＮ−βとつくる 一つの組換え法は次のようなものである。（１）ポリアデニン酸（ポリＡ）の豊 富な１２５　ｍＲＮＡを、ウィルスで誘発したヒト白血球から抽出する。（２） このｍＲＮＡを２木調ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用する。（３）ｃＤＮＡを適 当なベクターの中へクローン化する。（４）このベクターで大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ １１）を形質転換させる。

ヒトーＩＦＮ−β生産技術については、１９８１年５月　８日公開の欧州特許出 願第２８０３３号、１８８１年７月１５日公開の欧州特許出願第３２１３４号、 １９８１年８月２６日公開の欧州特許比Ｎ第３４３０７号、及び１３８１年６月 １日付はベルギー特許第８３７３９７号も参照のこと。

スキャンデラ（Ｓｃａｈｄｅ　ｌ　ｌａ）及びコーンハーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ）［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７１年）１０巻４４４７〜４４５６頁ｊ は大腸菌からのホスホリパーゼの単離を記述している。この場合、細胞膜をドデ シル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）で可溶化し、溶液に１−ブタノールを加える と、ＳＤＳで可溶化されたタンパク質の一部が沈殿する。プリンク（Ｄｅｒｙｎ ｋ）ら　［Ｍａｔｕｒｅ　（１９８０年）２８７巻１３３〜１９７頁ｊはＩＦＮ −β遺伝子を含有するプラスミドで形質転換させた大腸菌細胞を１％ＳＤＳ、１ ”２−メルカプトエタノール、５Ｍ尿素中で加熱することによる大腸菌の溶菌を 報告している。溶菌液の５１００抽出液は、インターフェロン活性をもつことが 報告された。ＳＤＳを含有する組成物は、インターフェロン類の生物学的活性を 安定化するためにも使用された。米国特許第３，９８１，９９１号も参照のこと 。

上記の技術は、臨床試験及びその後の商業的流通に必要な量のヒトエＦＮ−βの 実用的生産に適合できるような、形質転換微生物体からのヒ）ＩＦＮ−β回収法 を教示ないし示唆してはいない。本発明の主な目的は、このような方法を提供す るにある。

発明の開示 本発明は、適当な可溶化剤で可溶化されたヒトＩＦ、Ｎ−βを水性培地から抽出 する方法であり、この方法はヒ）ＩＦＮ−β含有水性培地を抽出剤に接触させる ことからなり、この抽出剤が式［式中Ｒは水素又はメチルコのアルコールである ことを特徴としている。

本発明方法の好ましい態様は、ヒトＩＦＮ−βをＳＤＳで可溶化し、抽出液から そのｐＨを下げることによってヒ）ＩＦＮ−βを沈殿させ、それによって抽出液 からヒトＩ　ＦＮ−βを単離するものである。

好適な態様 本明細書で使用される用語ｒＩ　ＦＮ−β」は、用語「線維等細胞インターフェ ロン」と同義である。

本明細書で使用される用語「ヒ）ＩＦＮ−β」は、ヒトＩＦＮ−β遺伝子又はヒ トインターフェロン遺伝子で形質転換させた微生物でつくられるＩＦＮ−βを指 しており　この遺伝子が発現させるインターフェロンは、そのアミノ酸配列が天 然のヒトＩＦＮ−βと同じか、実質的に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のもので ある。このようなインターフェロン類は末グリコジル化インターフェロン類、天 端メチオニン基を欠いているインターフェロン類、及び非雑種ＩＦＮ−β種と実 質的に同様な物理性状と化学性状（例えば疎水性、溶解度、安定性）をもった雑 種性インターフェロン類を包含する。

本明細書で使用される用語「形質転換させた微生物」とは、ヒ）ＩＦＮ−βを生 産するように遺伝子操作された微生物を指す。形質転換させた微生物の例は、前 掲「背景技術」で言及された特許（公開）文献やＸｔｆＪ願の実施例に記述され ている。細菌は本発明での使用に好ましい微生物である。大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１ １）が特に好ましい。

形質転換させた微生物を適当な生育培地中で、典型的には６８０ｎｎ＋で少なく とも約１０、及び好ましくは８８０ｎｍで約５０ないし約１００の光学音度（Ｏ Ｄ）まで生育させる。生育培地の組成は使用の特定微生物によって代わる。培地 は微生物の栄養要求を満たすような化合物類を含有する水性培地である。成育培 地は、典型的には同化できる炭素源と窒素源、エネルギー源、マグネシウム、カ リウム及びナトリウムイオン類、及び任意にアミ／＃類とプリン及びピリミジン 塩基を含有する。

リウユウ・オブ争メディカル・マイクロバイオロジー（Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ラングφメディカル・パブリケー ションズ社、１４版、８０〜８５頁（１９８０年）。大腸菌用の生育培地はこの 技術で周知である６本発明方法に使用される特定可溶化剤にもよるが、水中で薬 剤の可溶性を減少させるような物質の量を生育培地中で最小限度に抑えることが 望ましい。例えばカリウムイオンはＳＤＳの溶解度に影響するため、本方法の可 溶化剤としてＳＤＳを使用する時に十 は、Ｋを最小限に抑制すべきである。

培養基が望んでいる細胞密度に達したなら、任意に、加熱するか、又はクロロホ ルムやトルエンのように菌を殺した後に容易に除去できる細胞毒剤を加えて殺菌 するかする。その後、ム過、遠心分離、又はその切、の慣用方法によって、必要 に応じて約２０〜１５０１ｇ／ｙａｌ　好ましくは８０〜１００ｍｇ　／ｍｆＬ （８８０ｎｍで０Ｄ４０〜３００、好ましくは１６０〜２００）まで菌を濃縮す る。濃縮工程もまた任意である。

ａ縮後、微生物の細胞膜を破壊させる。破壊の主目的は、次の濃縮中の粒状物質 の可溶化を容易にすることである。この点で、生物活性の検定から、インターフ ェロンの多くは細強膜に関連している（すなわち膜の中に含まれているか膜に結 合されている）ことが示されている。従って、細胞膜の破壊は可溶化剤と膜との 接触を強め、膜に結びついたインターフェロンが溶液に入っていく速度を高める 。均質化、音波処理、又は圧力循環のような慣用の細胞破壊（ないし破裂）技術 を本方法のこの工程に使用できる。好ましい方法は、細胞懸濁液を約３．４Ｘ　 １０φないしｌＸ１０ｋＰａまで圧力循環させるものである。圧力の急低下のた め細胞が破裂する。破裂前又は破裂後、場合に応じて７Ｉｓ縮液又は破裂液の液 相ｐＨ１必要により濃縮液／破裂液中の可溶化剤と粒状物質の溶解が容易になる ように調整する。ｐＨ調整は、適当な緩衝液を加えることによって行なう。大抵 の場合、約７ないし約８の範囲のｐＨが使用される。

細胞を破裂させた後、破裂液の液相から粒状物質を分離し、可溶化のため最適ｐ Ｈまで緩衝された水性培地へ再懸濁させる。いずれにしても、可溶化にかける菌 ／ｍｎ、好ましくは６ないし８　ｍｇ／ｍｕの範囲内にある。

ヒトＩＦＮ−β成分を惚めた粒状細胞物質の可溶化は、破裂と同時に、又は破裂 のあとに続いて実施でき、破裂後に別の段階として行なうのが好ましい。可溶化 を完了させる、すなわち、破裂液中の粒状物質（例えばタンパク質、脂質、核酸 、燐脂質）の実質的に全部を水性培地に溶解させるのが好ましい。粒状物質のほ ぼ完全な溶解は、適当な可溶化剤を水性懸温液へ加えることによって達成される 。ヒトＩＦＮ−βを可溶化するのに適した疎水性−親水性平衡をもち、かつヒ） ＩＦＮ−βと複合体（Ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成して有機相へ抽出できるような表 面活性剤（洗剤）を使用できる。脂肪酸のアルカリ金属塩及びアルカリ金属アル キル硫酸塩のような天然又は合成の強い陰イオン性表面活性剤を使用できる。こ のような活性剤は通常１０〜１４個の炭素原子を含有する。ＳＤＳとラウリン酸 ナトリウムが特に好ましい可溶化剤である。本方法に使用できるその他の可溶化 剤の例は、ドデシルスルホン酸す←リウム、デシル硫酸ナトリウム、テトラデシ ル硫酸すトリウム、トリデシルスル不ン酸ナトリウム、ミリスチノ酸ナトリウム 、カプリＡ　トリウム、ド゛デシルＮ−サルコシ」シトリラム叉びテトラデシル Ｎ−サルコシン酸ナトリウムである。

可溶化に用いられる可溶化剤の量は、特定可溶化剤と可溶化される夕〉′バク質 の量に左右されよう。はとんどの場合、凡そ１：１ないし１０：１の範囲の可溶 化剤：タンパク質重量比が十分であろう。ＳＤＳ使用の場合、約１：１ないし約 ５：１、好ましくは約３：１のＳＤＳ　：タンパク質重が使用される。１５℃な いし８０°Ｃの範囲の温度が通常、可溶化に使用されよう。溶液と粒状物質との 接触を強め、細胞物質を溶解するのに要する時間を短縮するため、典型的には混 合が使われるだろう。溶液が実質的に透明の時は、可溶化が完了したものと考え られる。２８０ｎｍで約０．４未満のＯＤが可溶化終点の特徴である。

可溶化に続いて、溶液のイオン強度は、必要により、溶液と有機抽出液が実質的 に混ざらない水準まで調整される。イオン強度は、０．０５ないし０．１５の範 囲内にあるだろう。この目的には、ＮａＣｌのような無機塩類を溶液に添加でき る。このようなイオン強度によって、抽出後の相分離が可能となる。本方法に用 いられる抽出剤は２−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール又はこれらの混 合物である。混合物は、約５０容量２に満たない２−メチル−２−ブタノールを 含有するのが好ましい。２−ブタノールは好ましい抽出剤である。可溶化質から ヒトＩＦＮ−βを抽出するこれらのアルコール類の抽出能力は特異的である。（ 他の）同族アルコール類は無効な抽出剤であることがわがっ゛た。抽出剤は通常 、じ）ＩＦＮ−β水溶液と約０．８：１ないし約３：１、好ましくは約１：１（ 抽出剤／不溶液）の範囲内の容量比で一緒にされる。抽出は、慣用の回分式又は 連続式液−液抽出技術及び設備を使用して行なうことができる。抽出は通常２０ ℃ないし　１００°Ｃで行なわれ、約１分ないし１時間の接触時間を伴う。最適 接触時間は特定の可溶化剤二抽出剤の組合せによって決まる。ＳＤＳを使用する 時は、上の範囲内の短い時間を使用できる。ラウリン酸ナトリウムを使用する時 は、この範囲内の長い時間を使わなければならない。抽出混合物のｐＨは約６な いし９の範囲にあり、ＳＤＳ使用ではｐＨ約７．５、ラウリン酸ナトリウム使用 ではｐＨ約８．５が好ましい。

抽出が完了したら、水相と抽出液相を分け、ヒトＩＦＮ−βを抽出液相から単離 する。使用の特定単離手順は使用可溶化剤と望んでいる純度の最終生成物に応じ て選択されよう。沈殿、分子ふるいクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、 及び電気泳動のような種々の単離技術を使用できる。ＳＤＳを使用した場合ｔこ は、約２．５：１ないし約５＝１の容量比で水性緩衝液と混合した抽出液から、 典型的には約５より下にｐＨを下げることによって、ＩＦＮ−βを他のタンパク 質と一緒に沈殿させることができる。上澄液から沈殿物を分離し、沈殿物から残 留抽出液を蒸発させるｌＯ と　約９５％より高い純度のタンパク質である生成物か得られる。この生成物は 少量の核酸（く１％ないし２重量％）と５ＤＳ（＜１　ｗ／ｖ％）も含んでいる 。ＳＤＳは所望により、タスゼンスキー（Ｔｕｓｚｅｎｓｋｉ）及びウォーレン （Ｗａｒｒｅｎ）　〔Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７５年〕６５巻〕の方法 を使用する電気透析しこよって除去できる。可溶化剤としてラウリン酸ナトリウ ムを使用する時には、これはｐＨ低下によりタンパク質と一緒に抽出液から沈殿 する。ラウリン酸ナトリウムは、アセトン又はメタノールのような溶媒を使用し てタンパク質から抽出できる。

こうして単離されたヒトＩＦＮ−βを使用時まで凍結乾燥するか或は溶液にする 。所望により、無毒、非冶療性、非免疫原の安定剤をＩＦＮ−βに添加できる。

溶液中に使用できる希釈剤は、注射薬を処方するのに普通に使われる水性ベース のビーヒクルη）ら選ばれる。希釈剤は当然ながらＩＦＮ−βの生物学的活性に 影響するものであってはならない。このような希釈剤の例は食塩水、リンケル液 、ブドウ糖液、ハング液である。凍結乾燥されたヒ）ＩＦＮ−βを再構成するの に同じ希釈剤を使用できる。

本発明方法を以下の実施例によって更に説明する。これらの実施例は、いかなる 形においても本発明を限定するように意図されたものではない。

実施例１ ヒト工ＦＮ−Ｉ′ｌそ生産下るために形質転換させた大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１）か らヒトエＦＮ−βを回収した。大腸菌を６８０　ｍｍで１０〜１１の細胞畜産　 （ＯＤ）（乾燥重量８．４ｇ／４）よで、次の生育培地中で生育させた。

虹１　１Ｌ−露 Ｎａ、ＨＰ１％　！２．２　ｈ　Ｍ ＭｇＳＯ＋Φ？Ｈ，０３牌に Ｎ　ａ　３　サイトＬ／　−”ｒ　・２Ｈ２Ｃ１ｉ、５ｇＭＭ１ＳＩＪｉ４６４ Ｈ２０３１：ｌ　ｇ　ＭＦｅＳＯｔＨ・７Ｈ２０３１）　、、Ｈ」二ｕｓＯ１ｆ 　・５ｉ４２０　３　βＮ１、、−Ｆリブトファン　７０　畔／ｌＦｅ５Ｑｑ− ・７Ｈ２，ｏ７２　ＩＬＭチアミンＨＣｉ　２０　＋ｎｇ／ｌ テトラサイタリン’　１０　ｉｇ／ｌ グルコース　４０　ｇ／１ ｐｉ（はＮＨヶＯＨで調製。

　２ 形質転換させた大腸菌の収穫物９．９　Ｍ（９，９ｋｇ）を２０°Ｃに冷却し、 ８．８ｋｇの濾液重量まで平均圧力損失１．１２　ｋｇ／ｃｍ”　（１８ｐｓｌ ）、定常状態濾液流量２６０　ｍｌｌ　分で収穫物ラフロスフローフィルターに 通して濃縮した。濃縮液（約１文）を容器に抜き出し、１５°Ｃに７４却した。

ａｉｉｉ液をマントン＝ゴ゛−リン丁モジナイザーに５°０　、　７００　ｋｇ ７ａｍ”　（ｔｏ、ｏｏｏ　ｐｓｉ）　テ通丁ことヤこよって、濃縮液中の細胞 を破裂させた。燐酸緩＃された食塩水（ｐＢｓ　、　Ｐ　Ｈ７，４＞２文で丁モ ジチイザーを洗い、洗浄液を破裂液に加え、最終容量２文とじた。この量を１２ ０００　Ｘ　ｇ　、流量毎分５０口文でＭ続遠心分離にη１けた。固形分を上澄 液から分離し、２重量％　ＳＤＳを含有する燐酸緩衝食塩水４立に再懸濁した。

二の懸濁液を室温で１５分かきまぜた後、目に見える懸濁物質はなかった。次に 溶液を２−ブタノールで、２−ブタノール：溶液容量比１：１で抽出しγこ。毎 分２００ｍ文の流量を使用する液−液分離装置で抽出を行なった。次に有機相を 分離し、乾固まで法発させると、タンパク質２１．３　ｇを生じた。これを蒸留 水へ一１Ｉ：１０の容量比で再懸濁した。

回収生成物は、ウィルスの細胞病理効果（ＣＰＥ）に対する防護に基つく検定を 使用して、ヒトＩＦＮ−βについて検定された。この検定を微量滴定プレートロ で行なった。各容器に最少基本培地５０ル立を仕込３ み、第一容器に試料２５ル交を入れ、以降の容器←こは１：３容量の６駅を連続 的に行なった。ウィルス（水泡性口内炎）、細胞（ヒト線維芽細胞系ＧＭ−２５ ０４）及び６進ｒＦＮ−β対照を各プレートに含めている。標準ＩＦＮ−βはｍ １当り１１〕０単位である。次にプレートに紫外線光を１０分照射する。照射後 、各容器に細胞懸濁液（ｍ文当り！、２　Ｘ　１０細胞）１００ｐｉを加え、ト レーをＬ８〜２４時間培養する。細胞当り　１プラ一ク形成単位のウィルス液を 細胞対照以外の各容器に加える。次につ。・ルス対照が１０ｏｚのウィルス細胞 病理効果（ＣＰＥ）を示Ｔ王でトレーを培養する。これは、ウィルス液を加えて がら１８・〜２４時間に通常起る。検定結果は、標準Ｉ　Ｆ　Ｎ−β対照の５ｏ ％細胞病理効果の位置に関連して解釈される。この点から、プレート上の全試料 に附子るインターフェロンの滴定値か決定される。回収された生成物の活性は２ ．９　Ｘ　１０　Ｕ／ｍ　ｇと決定された。

実施例２ 可溶化剤としてＳＤＳ　、抽出剤とＩ−で２−ブタノール、２−メチリレー２− ブタ、ノール又はその種々の混合物を使用して、ヒｈＩＮＦ−βの部分的精製を 行なった。

その他のアルコール頚を使用する精製も試みた。これらの精製に用いた手順は次 のとおりである。

大腸菌の細胞１．３ｇ（湿量）を０．１Ｍ燐酸緩衝食塩水１４ ＣＰ　Ｂ　Ｓ　、　ｐＨ７，４”、＋中（７）１　ｗ／ｖ　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　１ ０ｍ文中に懸濁した。懸濁液を透明になるまで超音波処理した。超音波処理液に 同量の抽出剤を加えて混合し、周囲温度で１０分　間、？００ＱＸｇで遠・し分 離した。抽出副相と水相とを分離し、抽出副相は実施例１に言及された検定法を 用いてヒ）ＩＦＮ−βの検定にかけた。下表はこれらの検定の結果を提示してい る。

第一二し一麦 ヒ１線維芽細胞インター フェニンの抗ウィルス活性 １撲旦ｊ」１゜Ｊｌ 燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ） １％超音波処理液（出発材料）６゜ ２−ブタ７′−ル（２ＢｕＯＨ）　５．５２−Ｍｅ−１−ブタノール　く１ ３−Ｍｅ−１−ブタノール　く１ ２−Ｅｔ−１−ブタノール　く１ ２−Ｍｅ−２−ブタノ−）Ｌｙ　５．Ｑｊ−ブタノール　く１ ２−　Ｍ　ｅ　−１−ペンタノール　く１７５％　２−ＢｕＯＨ／２５％２−Ｍ ｅ−２−７り／　−／ｌ／　（ｖ／ｖ）　５．！ｉ５１２−ＢｕＯＨ１５０％　 ２−Ｍｅ−２−ブタノール（ｖ／ｖ）　５．５２５％　２−８ｕＯＨ／７５％　 ２−Ｍｅ−２−ブタ／　−ル（ｖ／ｖ）　５．０６ 第１表のデータは、本方法における　２−ブタノール及び２−メチル−２−ブタ ノールの特異性を示している。１よだ、ｌ−ブタノール、２−メチル−１−ブタ ノール及びニーペンタノールのような他の同族アルコール類が本方法で抽出剤と して有効でないことをデータは示している。

実施例３ １０ｕタンクから収獲物（９゜８　ｋｇ）を得て、クロヌフロー濾過によって２ ．２見に濃縮１７た。スラリーそ凍結させ、３４日間貯えてから解凍した。

解凍された濃縮液をマントン＝ゴウリン式ホモジナイザーで７Ｘ１０’ｋＰａで ３回舛理して細胞を破砕させた。破砕液を集め、テラリン酸塩１ｗ／ｖ％の最終 濃度を与えるようにラウリン酸ナトリウム溶液で全量を４文にした。１０％Ｎ　 ａ　ＯＨでｐＨを８．５に調製した。溶液をスタティックミキサー中で５０容量 ％２−ブタノールと５０容量％２−メチルー２−ブタノールとの混合物に接触さ せた。エマルシヨンを保持タンクにポンプで送り、１５分の接触時間を取るべく かきまぜた。このエマルショノ化実施例１と同様に分離し、工ＦＮ−βを有機相 へ回収した。回収された生成物の活性は初期の１６％であり、タンパク質ｍｇ当 たり　３．７×ｌＯＳ　Ｕの７ペシフイツク　アクティウ゛イティ　（実岸例１ のとおりに決定）をもっていた。

７ 実施例４ 実施例１の方法をくり返したが、但し抽出して水相と有機相を分離し、有機相に 燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＠３　：　１の容量比で混合した後、氷酢酸添加によ って混合物ｐＨを約５に低下させた。生ずる沈殿物を１ｏＯＱｏ〜１７０００　 Ｘｇで１５分の遠心分離によって分離し、ペレットをＬｏｗ、／ｖ％ＳＤＳに再 溶解した。

でパクリルＳ−２００ヌーパーファイン（ファーマシア）マトリックスを入れた 分子ふるいカラムに沈殿物を通した。２ｍＭジチオスレイトール及び０．１ｗ　 ／　ｖ％ＳＤＳを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）でカラ ムを平衡化した。同じ緩衝液で毎時ｃ　ｍ’−当たり１５．６ｍｌの流量でカラ ムを展開１−だ。紫外線分光光度計でタン、・ζり質分布を２８０ｎｒｒｚでモ ニターした。集めた分画上ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）の方法でタンパク質含量につ いて検定した。インターフェロン濃度は、実施例１に説明されたウィルス細胞病 理効果（ＣＰＥ）検定法によって決定された。

イ〉′ターフェロン純度の決定をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔レ ムレ（Ｌａｅｚｍｌｅ）、Ｎａｔｕｒｅ　１９７０年〕によって決定した。最高 のインターフェロン活性を含有する分画をプールし、プールされたインターフェ ロン調製剤のスペシフィック　アクティヴ、ｆティ１８ はタンパク質ｍｚ当たり１〜２Ｘ１０”国際単位と決定さｎた。

国際調査報告　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■。 Ｈ ［式中Ｒは水素又はメチル］のアルコールであることを特徴とする抽出剤に、ヒ ｈＩＦＮ−β含有水性培地を接触させることからなる、適当な可溶化剤で可溶化 されたヒトＩ　ＦＮ−βを水性培地から抽出する方法。 ２、　可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であることを特徴とする請求の範囲第１ 項の方法。 ３、可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はラウリン酸ナトリウムであることを 特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ４、Ｘ相と抽出剤相との相分離を容易にするような条件下に接触が行なわれるこ と七特徴とする請求の範囲第１項の方法。 ５、Ｘ性培地のイオン強度が約０．０５ないし約０．１５であることを特徴とす る請求の範囲第１項の方法。 ６、　イオン強度が塩化ナトリウムによって提供されることを特徴とする請求の 範囲第１項の方法。 ７、抽出剤が２−ブタノールであることを特徴とする請求の範囲第１．２．３又 は４項の方法。 ８、抽出剤からヒトＩＦＮ−βを単離する工程が更に　０ 本方法に含まれることを特徴とする請求の範囲第■、２．３又は４項の方法。 ａ、　次の工程を含むことを特徴とする、ヒトＩ　ＦＮ−βそ含有する形質転換 させた微生物からヒ）　Ｉ　ＦＮ−βを回収Ｔる方法： （ａ’＋徽生物の細胞膜を破裂させる、（ｂ）ｈｈＩＦＮ−βと抽出可能な複合 体（Ｃｏｍｐｌｅ＋ｔ）を形成するような可溶化剤で　破裂液出のヒ）ＩＦＮ− βそ水性培地中へ可溶化する、 〔式ＯＲは水素又はメチルコの有機抽出剤で水性培地から複合体（Ｃｏｍｐｌｅ ｘ）　ｖｉ：抽出する、（［１〕　ヒ）　Ｉ　ＦＮ−βを抽出剤から単離する。 ｉｏ、＠生物が細菌であることを特徴とする請求の範囲第９項の方法つ １１、微生物が大腸菌ＣＥ、　Ｃｏ１１）であることを特徴とする請Ｘの範囲第 ９又は１０項の方法。 １２、微生物が発酵培地中に含よれ、工程（ａ）の前にブａ縮されることを特徴 とする請求の範囲第９又は第ｉｔ項の方法。 １３、細胞膜を破裂させるために微生物を圧力機環にかけることによってこの破 裂が行なわれるこΣを特徴２、 特許請求の範囲第９又は第１１項の方法。 １４、工程（ｂ）の可溶化で、破裂液中の実質的に全部の粒状物質を溶解するこ とを特徴とする請求の範囲第９横の方法。 １５、水性培地のｐＨが可溶化剤を溶液中に保持するようなｐｉ＋であることを 特徴とする請求の範囲第９又は１４項の方法。 １６、可溶化剤が陰イオン性表面活性剤であることを特徴とする請求の範囲第９ 項の方法。 １７、可溶化剤がアルカリ金属アルキル−硫酸塩又は脂肪酸のアルカリ金属塩で あって、この硫酸塩又は塩が１０個ないし１４個の炭素原子を含有することを特 徴とする請求の範囲第９項の方法。 １８、陰イオン性表面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム又はラウリン酸す１リウ ムであることを特徴とする請求の範囲第１５項の方法。 ＋Ｓ、ｐＨが約７ないし約８であることを特徴とする請求の範囲第１５項の方法 。 ２０、表面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、本性培地中におけるドデシ ル硫酸ナトリウムとタンパク質との重量比が約１：１ないし約５：１の範囲にあ ることを特徴とする請求の範囲第１６項の方法。 ２１、該重量比か約３：１であることを特徴とする請求の範囲第９項の方法。 ２２、水相と抽出剤相との相分離が容易になるような条件下に抽出か行なわれる ことを特徴とする請求の範囲第９項の方法。 ２３、水性培地のイオン強度が約０．０５ないし約０．１５であることを特徴と する請求の範囲第２２項の方法。 ２４、イオン強度が水性培地市の塩化ナトリウムによって提供されることを特徴 とする請求の範囲第２３項の方法。 ２５、有櫨抽出剤が２−ブタノールであることを特徴とする請求の範囲第９．２ ２．２３ヌは２４項の方法。 ２６、単離には次の工程が含まれることを特徴とする請求の範囲第９項の方法： （１）　抽出液を水性緩衝液と混合する、（ｉｉ）　（ｉ）の混合物のｐｉ（を 下げることによってヒトＩＦＮ−βを混合物から沈殿させる、（１目）沈殿した ヒ）ＩＦＮ−βを上澄液から単離する。 ２７、ｐＨが約５より下まで下げられることを特徴とする請求の範囲第２６項の 方法。 ２８、可溶化剤がドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第 ２６又は２７項の方法。 ２８、ヒトＩＦＮ−βを含有する形質転換させた大腸菌が発酵培地中に含まれて おり、この細菌から３ ヒトＩＦＮ−βを回収するための、以下の工程を特徴とする方法： （ａ）発酵培地中の細菌を濃縮する、 （ｂ）細菌を圧力循環にかけることによって、細菌の細胞膜を破裂する、 ＜Ｃ）固体細胞物質を破裂液の残りから分離する、（ｄ）２ないし１５ｍｇ／ｍ 　ｌの範囲のタンパク質濃度及び約７ないし約８の範囲のＰＨで、細胞物質を水 性培地に懸濁する、 （ｅ）　細胞物質をドデシル硫酸ナトリウムにより、約ｌ：工ないしｌ：５のド デシル硫酸ナトリウム／タンパ〃質の重量比で可溶化する、 （ｆ）水性培地からヒトＩＦＮ−βを２−ブタノールで抽出する（その場合、水 性培地のイオン強度は水性培地と２−ブタノールを実質的に混ざらない状態に保 持するのに十分なものとする）、 （ｇ）　ヒトＩＦＮ−βを含有する２−ブタノール相から丞相を分離する、 （ｈ）２−ブタノール相に水性緩衝液を混合し、混合物ＰＨを約５より下に低下 させることによって。 ２−ブタノール相η１らヒ）ＩＦＮ−βを沈殿させる。