JPWO2016051752A1 - プロテアーゼの基質ペプチド及びプロテアーゼの活性測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなるプロテアーゼの基質ペプチド。
[2] 前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる[1]の基質ペプチド。
[3] 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である[1]又は[2]の基質ペプチド。
[4] 前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の中性プロテアーゼである[1]〜[3]のいずれかの基質ペプチド。
[6] 前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる[5]のペプチド。
[7] 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である[5]又は[6]のペプチド。
[8] クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の中性プロテアーゼによって特異的に切断される[5]〜[7]のいずれかのペプチド。
[9] クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼG、コラゲナーゼH及びクロストリパインによって切断されない[5]〜[8]のいずれかのペプチド。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記プロテアーゼと、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
[12] 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる[11]の方法。
[13] 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である[11]又は[12]の方法。
[14] 前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の中性プロテアーゼである[11]〜[13]のいずれかの方法。
[15] 前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である[11]〜[14]のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。
[17] 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる[16]の方法。
[18] 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である[16]又は[17]の方法。
[19] 前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである[16]〜[18]のいずれかの方法。
[20] 前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である[16]〜[19]のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断を検出する手順と、
を含む方法。
[22] 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる[21]の方法。
[23] 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である[21]又は[22]の方法。
[24] 前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである[21]〜「23」のいずれかの方法。
[25] 前記基質ペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のいずれか一である[21]〜[24]のいずれかの方法。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
本発明に係るプロテアーゼの基質ペプチドは、Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
また、例えば、N末端及びC末端の一方に蛍光物質を結合させ、他方の末端に消光物質を結合させた場合、基質ペプチドの切断によって消光物質(クエンチャー)から解離した蛍光物質からの蛍光を検出することによって、プロテアーゼによる基質ぺプチドの切断を検出できる。蛍光物質及び消光物質には、従来公知の物質を組み合わせて用いればよく、例えば蛍光物質として2−(N−メチル アミノ)ベンゾイル(2-(N-methyl amino)benzoyl)基又は7−メトキシコウマリン−4−イル)アセチル(7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl)基を、消光物質として2,4−ジニトロロフェニル(2, 4-dinitorophenyl)を用いることができる。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン、グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン、グリシン−フェニルアラニン−セリン、グリシン−フェニルアラニン−グリシン、グリシン−ロイシン−チロシン、グリシン−ロイシン−ヒスチジン、グリシン−ロイシン−セリン、グリシン−ロイシン−グリシン、グリシン−イソロイシン−チロシン、グリシン−イソロイシン−ヒスチジン、グリシン−イソロイシン−セリン、グリシン−イソロイシン−グリシン、グリシン−トリプトファン−チロシン、グリシン−トリプトファン−ヒスチジン、グリシン−トリプトファン−セリン、又は、グリシン−トリプトファン−グリシン。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−セリン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−グリシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−ヒスチジン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−セリン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−グリシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−ヒスチジン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−セリン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−グリシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−ヒスチジン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−セリン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−グリシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−チロシン アミド。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−チロシン アミド。
本発明に係る基質ペプチドは、プロテアーゼ活性の測定のために利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、NPに対して特異的な基質となるため、NPの活性の測定のために好適に用いられる。
本発明に係る基質ペプチドは、組成物中のプロテアーゼの有無を検出するために利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、NPによって特異的に切断されるため、組成物中にNPが含まれているか否かを検出するために好適に用いられる。
本発明に係る基質ペプチドは、組成物中に含まれるプロテアーゼの量を決定するためにも利用できる。本発明に係る基質ペプチドは、NPに対して特異的な基質となるため、組成物中に含まれるNPの定量のために好適に用いられる。
NPに特異的な基質ペプチドの候補として、「Tyr-Gly-Phe-Tyr-Glu」(配列番号1)及び「Tyr-Gly-Phe-Tyr-Arg」(配列番号2)のペンタマーペプチドを合成した。これらの合成ペプチドを用いて、NP(参考例1参照)、クロストリジウム・ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼG(ColG、Meiji Seikaファルマ(株))、コラゲナーゼH(ColH、Meiji Seikaファルマ(株))による切断によって生成するペプチド断片を以下の方法で分析した。
カラム:TSKgel ODS−120T(φ4.6×250 mm, Tosho Co.)
溶媒:0.1%ギ酸添加アセトニトリル(0-10 min: 4 %, 10-40 min: 4-80 %, 40-50 min: 80 %)、流速0.5ml/分
プロテアーゼによる切断を光学的に検出可能とし、エキソペプチダーゼによる消化を防止するため、試験例1の合成ペプチドに基づいて、N末端にFA基、C末端にアミド基を付加した「FA-Gly-Phe-Tyr-amide」(N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−チロシン アミド:FAGFYA)を設計した。NP特異的基質ペプチド(FAGFYA)を用いて、試験例1と同様にして、NPによる切断によって生成するペプチド断片を分析した。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン アミド(FA-Gly-Phe-His-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−セリン アミド(FA-Gly-Phe-Ser-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−フェニルアラニン−グリシン アミド(FA-Gly-Phe-Gly-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−チロシン アミド(FA-Gly-Leu-Tyr-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−ヒスチジン アミド(FA-Gly-Leu-His-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−セリン アミド(FA-Gly-Leu-Ser-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−ロイシン−グリシン アミド(FA-Gly-Leu-Gly-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−チロシン アミド(FA-Gly-Ile-Tyr-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−ヒスチジン アミド(FA-Gly-Ile-His-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−セリン アミド(FA-Gly-Ile-Ser-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−イソロイシン−グリシン アミド(FA-Gly-Ile-Gly-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−チロシン アミド(FA-Gly-Trp-Tyr-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−ヒスチジン アミド(FA-Gly-Trp-His-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−セリン アミド(FA-Gly-Trp-Ser-NH2)。
N−[3−(2−フリル)アクロイル]−グリシン−トリプトファン−グリシン アミド(FA-Gly-Trp-Gly-NH2)。
クロストリジウム・ヒストリチクス菌の中性プロテアーゼ(NP)を以下の手順で調製した。
フォワードプライマーNP:5'-CGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTCAC-3'(配列番号3)
リバースプライマーNP:5'-TACGGCTGATGTTTTTGTAATCGGCAAAC-3'(配列番号4)
培地A組成
2% Polypepton N
1% yeast extract
1% NaCl,
20 μg/ml chloramphenicol
pH 7.5
培地B組成
4% Polypepton N
2% yeast extract
2% NaCl
10 mg/ml chloramphenicol
pH 7.5
配列番号2:基質ペプチド
配列番号3:フォワードプライマーNP
配列番号4:リバースプライマーNP
Claims (17)
- Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなるプロテアーゼの基質ペプチド。
- 前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる請求項1記載の基質ペプチド。
- 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である請求項1又は2記載の基質ペプチド。
- 前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の中性プロテアーゼである請求項1〜3のいずれか一項に記載の基質ペプチド。
- 前記アミノ酸配列が以下のいずれか一である請求項1〜4のいずれか一項に記載の基質ペプチド。
グリシン−フェニルアラニン−チロシン。
グリシン−フェニルアラニン−ヒスチジン。
グリシン−フェニルアラニン−セリン。
グリシン−フェニルアラニン−グリシン。
グリシン−ロイシン−チロシン。
グリシン−ロイシン−ヒスチジン。
グリシン−ロイシン−セリン。
グリシン−ロイシン−グリシン。
グリシン−イソロイシン−チロシン。
グリシン−イソロイシン−ヒスチジン。
グリシン−イソロイシン−セリン。
グリシン−イソロイシン−グリシン。
グリシン−トリプトファン−チロシン。
グリシン−トリプトファン−ヒスチジン。
グリシン−トリプトファン−セリン。
グリシン−トリプトファン−グリシン。 - 目的とするプロテアーゼの活性を測定する方法であって、
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記プロテアーゼと、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。 - 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる請求項6記載の方法。
- 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である請求項6又は7記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来の中性プロテアーゼである請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物中に含まれる特定のプロテアーゼの量を決定する方法であって、
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断量を定量する手順と、
を含む方法。 - 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる請求項10記載の方法。
- 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である請求項10又は11記載の方法。
- 前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物中の特定のプロテアーゼの有無を検出する方法であって、
Gly−Xaa−Yaa(XaaはPhe、Leu、Ile及びTrpから選択されるいずれか一のアミノ酸、YaaはTyr、His、Ser及びGlyから選択されるいずれか一のアミノ酸を示す)のアミノ酸配列を含んでなる基質ペプチドと、
前記組成物と、
を混合する手順と、
前記基質ペプチドの切断を検出する手順と、
を含む方法。 - 前記基質ペプチドが、前記アミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に結合する保護基を含んでなる請求項14記載の方法。
- 前記保護基が、3−(2−フリル)アクロイル基である請求項14又は15記載の方法。
- 前記組成物がクロストリジウム・ヒストリチクス菌(Clostridium histolyticum)由来のタンパク質分解酵素組成物であり、前記プロテアーゼが同菌由来の中性プロテアーゼである請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
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