JP2019122300A - 角質汚れ分解能の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法の提供。【解決手段】酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法を提供する。当該方法は、基準ペプチド及び１種以上の基質ペプチドに対する被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性を取得すること、及び該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性に基づいて、該被験酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価することを含み、該基準ペプチドはＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧであり、該１種以上の基質ペプチドは、ＧＧＧＸＧ、ＧＸＧＧＧ、ＧＧＸＧ及びＧＸＧＧからなる群より選択され、Ｘはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である。【選択図】なし

Description

本発明は、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法に関する。

衣類に付着する汚れの中で、ワイシャツ等の襟や袖口などに主に生じる黒〜茶色の着色を呈する汚れは、従来「襟袖汚れ」、「黒ずみ汚れ」などと称され、非常に落としにくい汚れである。これらの汚れは、皮膚表層の角質細胞又はその成分が衣類に付着することにより生じる。襟袖汚れの成分に、角質層由来のタンパク質ロリクリン及びケラチン１０が含まれることが報告されている（非特許文献１、２）。また、襟袖汚れのうち特に落としにくい汚れは、角質層由来のケラチンタンパクであると考えられている（非特許文献３）。ケラチン１０の両端及びロリクリンは、グリシンリッチ領域と呼ばれるグリシン比率が高い領域を有するタンパク質である（非特許文献４）。

このような角層細胞由来タンパク質による汚れ（以下「角質汚れ」ともいう）をターゲットとした洗浄剤又は洗浄方法が従来から開発されてきている。プロテアーゼなどのタンパク質分解に優れた酵素は、角質汚れの洗浄にも有用と考えられ、洗浄剤への配合はプロテアーゼの主要な用途のひとつとなっている。しかし、従来の洗浄剤による角質汚れに対する洗浄力は、まだ充分ではない。よって、さらに角質汚れに有効なプロテアーゼの開発が望まれる。しかし、基質となるヒト由来角質を大量に調製することは困難であり、ヒト由来角質を用いない簡易なプロテアーゼの角質汚れ分解能の評価方法が望まれている。一方、タンパク質分解に優れたプロテアーゼは、動物性繊維を分解することにより衣類を損傷することがある。羊毛や絹への損傷性を抑えたプロテアーゼが報告されている（特許文献１）。

特表平１０−５０１５７７号公報

繊維製品消費科学，１９（３），１０６−１１５，１９７８ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，３２８−３４０，２００５ Ｊ．Ｊｐｎ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ＹＵＫＡＧＡＫＵ），４２（１），ｐ２−９，１９９３ 蛋白質核酸酵素 ３８（１６）１９９３，ｐ２７１１−２７２２

角質汚れに対する洗浄力のより高い洗浄剤の開発が望まれる。本発明は、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法に関する。

角質層の主成分であるケラチン及びロリクリンはグリシンリッチ領域を有することから（非特許文献４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼであれば、角質汚れを洗浄できる可能性があると推察された。そこで本発明者らは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼとして、Ｍ２３ファミリーに属するプロテアーゼの角質汚れ分解能を確認した（下記実施例１）。その結果、予想外にも、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼであっても、角質汚れ分解能を呈しないプロテアーゼと角質汚れ分解能を示すプロテアーゼの存在することが判明した。そこで本発明者らがそれらの酵素の基質特異性を調べたところ、角質汚れ分解能を示すプロテアーゼと示さないプロテアーゼとでは、特定のペプチドに対する活性が異なることを見出した。これらの結果から、本発明者らは当該特定のペプチドに対する酵素の分解活性を基準にして、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価することができることを見出した。

したがって、本発明は、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法であって、
基準ペプチド及び１種以上の基質ペプチドに対する、被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性を測定すること、
該１種以上の基質ペプチドに対する分解活性のそれぞれについて、該基準ペプチドに対する分解活性に対する相対値を求めること、及び、
該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０Ｕ／ｍｇ以上であり、かつ該基質ペプチドのいずれか１つ以上についての該相対値が０．５以上であるか、又はそれに相当する該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する分解活性を有する被験酵素又はそれを含む組成物を選択すること、
を含み、
該基準ペプチドがＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧであり、該１種以上の基質ペプチドが、ＧＧＧＸＧ、ＧＸＧＧＧ、ＧＧＸＧ及びＧＸＧＧからなる群より選択され、Ｘはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である、
方法を提供する。

本発明によれば、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を簡便な手段で評価することができる。よって本発明は、角質汚れ分解能の高い酵素及び酵素組成物、又は角質汚れ洗浄力の高い洗浄剤の開発に有用である。

襟袖汚れに対する酵素の洗浄力。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝３）。 各種酵素で処理したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。 踵角質から抽出したケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像とウェスタンブロッティングによる検出像。 酵素処理した角質不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。 ケラチン１０のアミノ酸配列。太字は実施例４の質量分析で同定されたペプチド配列を示す。 酵素と羊毛由来Ｋｅｒａｔｉｎ ａｚｕｒｅを含む反応液の上清におけるΔＡ５９５の値。 ＢＬＰ処理したタグ配列融合組換えロリクリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像。 ロリクリンのアミノ酸配列。

本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）；及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。

Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ及びＭ２３Ｂサブファミリープロテアーゼとは、それぞれ、ＭＥＲＯＰＳデータベース[ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ]に記載されるタンパク質分解酵素ファミリーにおいて、Ｍ２３ファミリープロテアーゼのＭ２３Ａサブファミリー及びＭ２３Ｂサブファミリーに属するプロテアーゼをいう。ＭＥＲＯＰＳデータベースでは、酵素を以下の論文に記載の方法に基づいてファミリーまたはサブファミリーにまで分類している：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９９，２７：３２５−３３１、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２００１，１３４：９５−１０２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１６，４４：Ｄ３４３−Ｄ３５０。Ｍ２３ファミリープロテアーゼは、細菌の細胞壁ペプチドグリカンを分解し、溶菌活性を示すメタロエンドペプチダーゼを含む。またＭ２３ファミリープロテアーゼは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼを含む（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２４（２），３３２−３３９，１９９８、日本細菌学雑誌，５２（２），４６１−４７３，１９９７、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（１０），７５０３−７５０８，１９９３、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（１２），９０７１−９０７８，１９９３、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１（１），５４９−５５８，２００６）。

ＭＥＲＯＰＳデータベースのリリース１１．０においては、Ｍ２３Ａサブファミリーには、β−リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）（MEROPS ID：M23.001）、Staphylolysinとも呼ばれるＬａｓＡタンパク質（Las A protein；ＬＡＳ、ＬａｓＡ）（MEROPS ID：M23.002）、及びMername-AA291 peptidaseとも呼ばれるアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（Aeromonas hydrophila proteinase；ＡｈＰ）（MEROPS ID：M23.003）の３つのプロテアーゼがＨｏｌｏｔｙｐｅとして存在している。ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰは、それぞれ配列番号２、配列番号４及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。一方、Ｍ２３Ｂサブファミリーには、ALE-1 glycylglycine endopeptidase（ＡＬＥ−１）（MEROPS ID：M23.012）及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（MEROPS ID：M23.004）等複数のプロテアーゼが存在している。ＡＬＥ−１は配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

本明細書において、グリシンリッチ領域とは、分子量２５，０００以上のタンパク質中の任意の連続した２０アミノ酸からなる領域において、グリシンが少なくとも２以上連続した配列（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）を有し、かつグリシンを１０以上有する領域をいう。

本明細書において、「動物性繊維」とは動物から得られる繊維、糸、布、生地、衣類等をいう。動物性繊維の例としては羊毛、絹、カシミヤ、羽毛等が挙げられ、好ましくは羊毛である。

本明細書において、「角質汚れ」とは皮膚表層の角質細胞又はその成分が衣類又は布製品に付着することにより生ずる該衣類又は布製品の汚れをいう。また本明細書において、「襟袖汚れ」とは、「角質汚れ」の１種であり、衣類の襟又は袖口と皮膚との接触及び擦れに起因してその襟又は袖口に生じる黒〜茶色の着色を呈する汚れであり、「黒ずみ汚れ」又は「襟袖口汚れ」とも称される。本明細書における「角質汚れ」は、衣類の襟又は袖口においてよく見られ、したがって多くの場合「襟袖汚れ」である。しかし、本明細書における「角質汚れ」は、衣類の襟や袖口の汚れに限定されて解釈されるべきではない。

角質汚れの主な原因物質は、皮膚の角質（すなわちタンパク質）であり、そのため従来、プロテアーゼを含む洗浄剤が角質汚れの洗浄のために使用されてきた。角質層の主成分はケラチン及びロリクリンであることが知られており、さらに襟袖汚れの成分に、タンパク質ロリクリン及びケラチン１０が含まれることが示唆されている（非特許文献１、２）。したがって、本明細書における「角質汚れ」は、「皮膚又は角質層由来のロリクリン及びケラチン１０を含む汚れ」と言い換えることができる。また本明細書における「襟袖汚れ」は、「衣類の襟又は袖口における、皮膚又は角質層由来のロリクリン及びケラチン１０を含む汚れ」と言い換えることができる。

角質層の主成分であるケラチン及びロリクリンはグリシンリッチ領域を有する（非特許文献３、ならびに図５及び図８）。本発明者らは、このグリシンリッチ領域のＧｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼであれば、角質汚れを洗浄できる可能性があると推察した。そこで本発明者らは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼとして知られるＭ２３ファミリープロテアーゼであるＢＬＰ、ＬＡＳ、ＡｈＰ、ＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎの角質汚れ洗浄力を調べた（実施例１）。その結果、予想外なことに、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解できるＭ２３ファミリープロテアーゼであっても、Ｍ２３Ｂサブファミリープロテアーゼに属するＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎでは角質汚れ洗浄力が確認されず、一方、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼに属するＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰでは角質汚れ洗浄力が確認された。さらに本発明者らは、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰのケラチン分解活性（実施例２、３）、ならびにＢＬＰのロリクリン分解活性（実施例６）を確認した。これらの結果から、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰが、角質のタンパク質を分解することにより角質汚れ洗浄力を発揮していることが推察された。

次いで、本発明者らは、Ｍ２３ＡサブファミリープロテアーゼとＭ２３Ｂサブファミリープロテアーゼとの角質汚れ分解能（洗浄力）の違いをもたらす機序を解明することを目的に、グリシン−グリシン結合を有する各種ペプチドに対するこれらのプロテアーゼの分解活性を調べた。その結果、角質汚れ分解能の高いＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、調べた全てのグリシン−グリシン結合を有するペプチドに対して分解活性が認められた（実施例７）。一方、角質汚れ分解能が認められなかったＭ２３Ｂサブファミリーに属するプロテアーゼは、ペンタグリシン（ＧＧＧＧＧ）配列を有するペプチドには弱い活性を示すが、グリシン−グリシン結合を有するがグリシン以外のアミノ酸も有するペプチドに対しては有意な活性を示さなかった。これらの結果から、酵素が角質汚れを分解するためには、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ結合を分解する能力に加えて、グリシンの割合が高いがグリシン以外のアミノ酸も含むペプチドを分解できる能力が必要であることが推察された。したがって、グリシン−グリシン結合を有する各種ペプチドに対する分解活性のレベルは、酵素の角質汚れ分解能（洗浄力）の指標となると判断された。

したがって、本発明は、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法を提供する。本発明の方法は、被験酵素又はそれを含む組成物の、ＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧを有するペプチド（以下、本明細書において単に「基準ペプチド」ともいう）と、グリシン−グリシン結合を有し、かつグリシン間にグリシン以外のアミノ酸を有するペプチド（以下、本明細書において単に「基質ペプチド」ともいう）に対する分解活性を測定することを含む。

本発明の方法で用いられる基準ペプチドは、好ましくはＧＧＧＧＧ（配列番号２８）及びＧＧＧＧ（配列番号２９）からなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧであり、さらに好ましくはＧＧＧＧＧである。本発明の方法で用いられる基質ペプチドは、好ましくはＧＧＧＸＧ、ＧＸＧＧＧ、ＧＧＸＧ及びＧＸＧＧからなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはＧＧＧＸＧである（Ｘはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す）。好ましくは、該基質ペプチド中のＸは、Ｓ、Ｙ、Ｌ及びＦから選択される。さらに好ましくは、該基質ペプチドは、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ及びＧＧＧＦＧ（配列番号３０〜３３）からなる群より選択される１種以上である。さらに好ましくは、該基質ペプチドは、少なくともＧＧＧＳＧ及びＧＧＧＹＧを含む。一実施形態において、該基質ペプチドは、ＧＧＧＳＧ及びＧＧＧＹＧである。別の一実施形態において、該基質ペプチドはＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ及びＧＧＧＦＧである。さらに好ましくは、該基質ペプチドは、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ及びＧＧＧＦＧである。本発明の方法においては、これらの基準ペプチドと基質ペプチドのそれぞれに対する被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性が測定される。

本発明の方法で評価される被験酵素の種類及び由来生物の種は、特に限定されない。該被験酵素は、天然に存在する酵素であっても、その人工的な変異体であってもよい。好ましくは、該被験酵素はプロテアーゼである。

また、本発明の方法で評価される被験酵素を含む組成物の例としては、被験酵素を含む２種以上の酵素の組み合わせ、又は被験酵素を含む１種又は２種以上の酵素と、該酵素以外の他の成分とを含有する組成物、などが挙げられる。好ましくは、該被験酵素はプロテアーゼである。

当該組成物は、当該被験酵素以外の他の酵素を含有していてもよい。当該他の酵素の例としては、被験酵素とは異なるプロテアーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ等）、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素からなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。このうち、被験酵素とは異なるプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、又はそれらの１種又は２種以上の組み合わせが好ましい。被験酵素とは異なるプロテアーゼの例としては、被験酵素とは異なるアルカリプロテアーゼが挙げられるが、これに限定されない。

当該組成物に含まれ得る、酵素以外の他の成分の例としては、洗剤組成物に通常使用される成分が挙げられる。例えば、当該他の成分としては、水、界面活性剤、キレート剤、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

したがって、本発明の方法で用いられる被験酵素を含む組成物のさらなる例としては、被験酵素を含む洗剤組成物が挙げられる。該洗剤組成物は、粉末等の固形組成物であっても液体組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物である。該洗剤組成物は、好ましくは洗濯用洗剤組成物であり、より好ましくは洗濯用液体洗剤組成物である。なお、本明細書において、本発明の方法で用いられる被験酵素又はそれを含む組成物を、まとめて「被験物」と称する場合もある。

当該被験酵素又はそれを含む組成物の、当該基準ペプチド又は基質ペプチドに対する分解活性は、該被験酵素又はそれを含む組成物と、該基準ペプチド又は該基質ペプチドとを接触させ、次いで該基準ペプチド又は該基質ペプチドの分解量を計測することによって測定することができる。ペプチドの分解量を計測する手法としては、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）アッセイ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどが挙げられる。このうち、ＦＲＥＴアッセイが好ましい。

ＦＲＥＴアッセイにより当該基準ペプチド又は基質ペプチドの分解を定量する場合、好ましくは、蛍光基と消光基の間に該基準ペプチド又は基質ペプチドを配置したＦＲＥＴ基質を準備する。酵素との接触によりＦＲＥＴ基質に含まれる該基準ペプチド又は基質ペプチドが分解されると、蛍光基と消光基の距離が変化して、蛍光基から発せられる蛍光の強度が変化する。その蛍光基からの蛍光強度の変化を測定することによって、該基準ペプチド又は基質ペプチドの分解を定量することができる。ＦＲＥＴ基質における蛍光基と消光基の組み合わせの例としては、［蛍光基］：Ｎｍａ；２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル、［消光基］：Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）；側鎖に２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）を有するリシン（Ｌｙｓ）残基、が挙げられる。これらの蛍光基及び消光基と所定のペプチドとを有するＦＲＥＴ基質や、当該基質を用いたＦＲＥＴ反応のための試薬及び溶媒は市販されており、例えば株式会社ピーエイチジャパン等から購入することができる。

当該基準ペプチド又は基質ペプチドの分解量の計測に用いられる反応溶液中において、該被験酵素の濃度は、タンパク質質量で、好ましくは０．０１〜５０μｇ／ｍＬであり、該基準ペプチド又は該基質ペプチドの濃度は、好ましくは１〜３０００μＭであるが、これらに制限されない。反応温度及びｐＨは、該被験酵素の至適条件であってもよく、あるいは該被験酵素を角質汚れ分解に適用する場合に想定される条件であってもよい。計測時間中に酵素反応が終了せずに、該基準ペプチド又は基質ペプチドの酵素分解による蛍光強度の変化を経時的に検出できるように、該被験酵素と基準ペプチド又は基質ペプチドとを接触させた後は計測を速やかに開始すること、及び反応溶液中における該基準ペプチド又は基質ペプチドの濃度を充分高くしておくことが望ましい。反応時間は、特に制限されないが、ＦＲＥＴアッセイの場合０．１〜１０分程度が好ましく、クロマトグラフィーの場合数分〜数時間程度が好ましい。

当該被験酵素又はそれを含む組成物の基準ペプチド及び基質ペプチドに対する分解活性は、例えば、以下の方法により測定される：基質としてＮｍａとＬｙｓ（Ｄｎｐ）の間がＧＧＧＸＧ（ＸはＧ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｆのいずれか）であるＦＲＥＴ基質［以下ＦＲＥＴ−ＧＧＧＸＧ］を用いる。該ＦＲＥＴ基質において、ＮｍａはＧＧＧＸＧのＮ末端側に結合し、Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）はＧＧＧＸＧのＣ末端側に結合している。９６穴のアッセイプレートに被験酵素を含む酵素溶液（被験酵素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１９０μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ−ＧＧＧＸＧ溶液（１ｍＭ ＦＲＥＴ−ＧＧＧＸＧ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製する。蛍光プレートリーダーを用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定する。一方、上記と同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５液、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＸＧの代わりにジメチルスルホキシドで溶かしたＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１（ペプチド研究所、３７２０−ｖ）を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成する。１ユニット（Ｕ）の活性は、１分間あたりに、１ｎｍｏｌのＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１による蛍光強度に相当する蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とする。該被験酵素又はそれを含む組成物の基準ペプチド又は基質ペプチドに対する比活性は、該被験酵素又はそれを含む組成物のタンパク質質量１ｍｇあたりの活性（Ｕ／ｍｇ）として表すことができる。被験酵素又はそれを含む組成物のタンパク質質量は、ＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）等の市販のキットや、公知の方法（例えば、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｒｏｄ法）で求めることができる。

好ましくは、本発明の方法においては、当該被験酵素又はそれを含む組成物の角質汚れに対する分解能を、該基準ペプチド及び基質ペプチドそれぞれに対する該被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性のレベルに基づいて評価する。該基準ペプチドに対する分解活性のレベルは、好ましくは、その比活性に基づいて評価する。一方、各基質ペプチドに対する分解活性のレベルは、好ましくは、それぞれの基質ペプチドへの分解活性の、該基準ペプチドへの分解活性に対する相対値に基づいて評価する。好ましくは、本発明の方法においては、上述した基準ペプチド及び基質ペプチドのそれぞれに対する、該被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性の比活性を求める。次いで、求めた各基質ペプチドに対する比活性のそれぞれについて、基準ペプチドに対する比活性に対する相対値を求める。該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する比活性は、上述した手順で求めることができる。

したがって、好ましくは本発明の方法では、被験酵素又はそれを含む組成物が、その当該基準ペプチドに対する分解活性の比活性が所定の値以上であり、かつ、いずれかの基質ペプチドについての上述した基準ペプチドに対する相対値が所定の値以上である場合に、該被験酵素又はそれを含む組成物を、角質汚れに対する分解能を有するものとして選択する。例えば、本発明の方法では、被験酵素又はそれを含む組成物の当該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０（Ｕ／ｍｇ）以上であり、かつ、いずれか１つ以上の基質ペプチドについての上記で求めた基準ペプチドに対する相対値が０．５以上であった場合（例えば、基準ペプチドに対する該被験酵素又はそれを含む組成物の比活性を１としたときに、いずれか１つ以上の基質ペプチドに対する該被験酵素又はそれを含む組成物の比活性が０．５以上であった場合）、該被験酵素又はそれを含む組成物を選択する。より好ましくは、被験酵素又はそれを含む組成物の該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０（Ｕ／ｍｇ）以上であり、かつ、いずれか２つ以上の基質ペプチドについての該基準ペプチドに対する相対値が０．５以上であった場合、該被験酵素又はそれを含む組成物を選択する。さらに好ましくは、被験酵素又はそれを含む組成物の該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０（Ｕ／ｍｇ）以上であり、かつ、用いた基質ペプチド全種類についての該基準ペプチドに対する相対値が０．５以上であった場合、該被験酵素又はそれを含む組成物を選択する。選択された被験酵素又はそれを含む組成物は、角質汚れに対する分解能を有すると評価される。一方、基準ペプチドに対して被験酵素の比活性が１０（Ｕ／ｍｇ）未満である被験酵素又はそれを含む組成物、又は、いずれの基質ペプチドについても該基準ペプチドに対する相対値が０．５未満である被験酵素又はそれを含む組成物は、角質汚れに対する分解能を有するとは評価されない。

あるいは、本発明においては、上述した被験酵素タンパク質質量１ｍｇあたりの比活性以外の基準で、該被験酵素又はそれを含む組成物の該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する分解活性を評価してもよい。例えば、発光、蛍光、比色反応、吸光度、又はその他の酵素分解物の定量に使用される通常の方法を用いて、該被験酵素又はそれを含む組成物による該基準ペプチド及び基質ペプチドの分解量を測定する。該基準ペプチド及び基質ペプチドの分解量の測定値から、各基質ペプチドへの分解活性について基準ペプチドに対する相対値を求め、さらに予め作成した検量線や予め設定した基準値に基づいて、得られた測定値が上述した比活性１０Ｕ／ｍｇ以上に相当するか否かによって判断することができる。

以上の手順で選択された角質汚れに対する分解能を有すると評価された被験酵素又はそれを含む組成物は、さらに、角質汚れ分解酵素もしくは角質汚れ分解用組成物、又はそれらの候補物質として選択することができる。したがって、本発明の方法の一実施形態は、角質汚れ分解酵素もしくは角質汚れ分解用組成物、又はそれらの候補物質の選択方法である。

上述の手順で本発明の方法により選択された被験酵素又はそれを含む組成物は、必要に応じてさらなる評価にかけられ、目的の角質汚れ分解酵素又は角質汚れ分解用組成物として選択され得る。当該さらなる評価としては、限定ではないが、例えば、実際の襟袖汚れの分解能の評価や、角質サンプル、又はそこから抽出されたケラチン又はロリクリンの分解能の評価などが挙げられる。

本発明の方法により角質汚れに対する分解能を有すると評価される酵素又はそれを含む組成物は、グリシンを多く含む基質に対する比活性が高いことから、グリシンリッチ領域に対する選択性の高い酵素であると推測される。実際、上記基質ペプチドに対する分解活性を有するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼによる、グリシンリッチ領域を有するケラチンの分解反応産物には、グリシンリッチ領域が同定されず、グリシンリッチ領域以外の領域が残されていた（実施例４、７）。一方、羊毛ケラチンはグリシンリッチ領域を持たないため、本発明の方法により選択された酵素又はそれを含む組成物には分解されにくいと推測される［ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ＿Ｐ０２５３４、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ＿Ｐ２５６９１］。したがって、本発明の方法により選択された酵素又はそれを含む組成物は、角質汚れ分解能を有する一方、羊毛ケラチン等の動物性繊維に対する分解能が低い酵素又はその組成物である可能性が高い。すなわち、本発明の方法により角質汚れに対する分解能を有すると評価された酵素は、羊毛等の動物性繊維に対する分解能（又は動物性繊維に対する損傷性）が低い酵素であることが期待される。

したがって、本発明の方法の別の実施形態は、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れに対する分解能の評価に加え、その動物性繊維に対する分解能（又は動物性繊維に対する損傷性）を評価する方法であり得る。当該方法において、被験酵素又はそれを含む組成物は、必要に応じてさらに、動物性繊維に対する分解能の評価、又は、角質汚れと動物性繊維に対する分解能の評価にかけられ、角質汚れ分解能を有し、かつ動物性繊維に対する分解能（又は動物性繊維に対する損傷性）が低い酵素又は組成物の候補として選択され得る。好ましくは、当該方法においては、上記の手順で角質汚れ分解能を有する酵素又は組成物として選択された被験酵素又はそれを含む組成物を、さらに動物性繊維に対する分解能の評価、又は、角質汚れと動物性繊維に対する分解能の評価にかける。

被験酵素又はそれを含む組成物の動物性繊維に対する分解能の評価の手段としては、例えば、該被験酵素又はそれを含む組成物の動物性繊維又はケラチンに対する分解活性の測定、該被験酵素又はそれを含む組成物による動物性繊維又はケラチンの分解産物の解析、などが挙げられる。該動物性繊維又はケラチンとしては、動物性繊維由来のケラチンが好ましく、羊毛ケラチンがより好ましく、羊毛由来のＫｅｒａｔｉｎ ａｚｕｒｅがさらに好ましい。また色素、蛍光物質等を結合させた動物性繊維又はケラチンも、反応液の遠心上清の吸光度又は蛍光強度を測定することにより容易に分解能が評価できるため、該分解能評価に用いる基質として好ましい。

被験酵素又はそれを含む組成物の角質汚れと動物性繊維に対する分解能の評価の手段としては、例えば、該被験酵素又はそれを含む組成物のケラチンに対する分解活性の測定、該被験酵素又はそれを含む組成物によるケラチンの分解産物の解析、などが挙げられる。該ケラチンとしては、分子量が３５，０００以上のグリシンリッチ領域を有するケラチンが好ましく、ケラチン１又は１０がより好ましく、ケラチン１０がさらに好ましい。ケラチン１０は、例えば、ヒトの踵から角質を削り出し、可溶化液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２％ＳＤＳ、２５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を透析バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＳＤＳ）に対して一晩透析することで得ることができる。

被験酵素又はそれを含む組成物のケラチン分解活性は、該被験酵素又はそれを含む組成物と、該ケラチンとを接触させ、次いで、酵素反応により生成された分解産物であるケラチン断片の分子量を計測することによって測定することができる。酵素とケラチンとの接触の際、酵素の濃度は、タンパク質質量で、好ましくは０．００１〜１０００００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．０１〜１００００μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．１〜１０００μｇ／ｍＬであり、一方ケラチンの濃度は、タンパク質質量で、好ましくは０．００１〜１００００ｇ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌであるが、これらに制限されない。反応温度及びｐＨは、該被験酵素の至適条件であってもよく、あるいは該被験酵素を角質汚れ分解に適用する場合に想定される条件であってもよい。反応時間は、特に制限されないが、１〜３０００分が好ましく、６０〜１５００分がより好ましく、６０〜６００分がさらに好ましい。

ケラチン断片の分子量を計測する手法としては、電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ゲル濾過クロマトグラフィー、動的光散乱法などが挙げられる。このうちＳＤＳ−ＰＡＧＥが好ましい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の手順の例を以下に記載する：ケラチン断片を含む試料溶液を５０ｍＭジチオトレイトールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと等量混合し、１００℃で５分間加熱することで泳動サンプルを調製する。この泳動サンプルをＡｎｙ ｋＤ^TMミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸ^TMプレキャストゲル及び電気泳動用バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％（ｗ/ｖ）ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を用いて電気泳動する。このとき分子量マーカーにはプレシジョン Ｐｌｕｓ プロテイン^TM２色スタンダードを使用する。泳動後のゲルはＣＢＢ染色又はルビー染色する。分子量マーカーの分子量と移動度から作成できる検量線の式に、目的タンパク質又はポリペプチドの移動度を代入することで得られる値を、該目的タンパク質又はポリペプチドの分子量とする。ここでサンプルの移動度（Ｒｆ値）は、該サンプルを流したレーンにおける、ゲルの上端（又はサンプルをアプライした位置）から先行色素（ブロモフェノールブルー）までの距離を１としたときの、該ゲルの上端（又はサンプルをアプライした位置）から該サンプルのバンドまでの距離の相対値とする。なお、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の手順は、本発明によるケラチン断片分子量の計測手順の一例であって、使用するケラチン断片や分解物の分子量に合わせて、適宜測定条件を決定し、マーカー等を選択することができる。

本発明の方法においては、上記で求めたケラチン断片の分子量が、該被験酵素又はそれを含む組成物との接触前のケラチン（例えば全長ケラチン）の分子量の５０％以上９７％以下である場合、該被験酵素又はそれを含む組成物は、角質汚れに対する分解能を有し、さらに動物性繊維に対する分解能が低いと評価される。このような被験酵素又は組成物は、動物性繊維の損傷性が低い角質汚れ分解酵素又は角質汚れ分解用組成物として選択される。

一方、上記で求めたケラチン断片の分子量が全長ケラチンの分子量の９７％より大きい（ケラチンの分解が認められない）場合、該被験酵素又はそれを含む組成物は、角質汚れに対する分解能が低いと評価される。または、上記で求めたケラチン断片の分子量が全長ケラチンの分子量の５０％未満である場合、該被験酵素又はそれを含む組成物は、動物性繊維に対する分解能が高いと評価される。このような被験酵素又は組成物は、動物性繊維の損傷性が高い。

本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法であって、
基準ペプチド及び１種以上の基質ペプチドに対する、被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性を測定すること、
該１種以上の基質ペプチドに対する分解活性のそれぞれについて、該基準ペプチドに対する分解活性に対する相対値を求めること、及び、
該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０Ｕ／ｍｇ以上であり、かつ該基質ペプチドのいずれか１つ以上についての該相対値が０．５以上であるか、又はそれに相当する該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する分解活性を有する被験酵素又はそれを含む組成物を選択すること、
を含み、
該基準ペプチドがＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧであり、該１種以上の基質ペプチドが、ＧＧＧＸＧ、ＧＸＧＧＧ、ＧＧＸＧ及びＧＸＧＧからなる群より選択され、Ｘはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である、
方法。
〔２〕好ましくは、前記基準ペプチドがＧＧＧＧＧである、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記基質ペプチド中のＸがＳ、Ｙ、Ｌ及びＦから選択される、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記基質ペプチドが、
好ましくはＧＧＧＸＧであり、
より好ましくはＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ及びＧＧＧＦＧからなる群より選択される１種以上であり、
さらに好ましくはＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ及びＧＧＧＦＧである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記被験酵素がプロテアーゼである、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記分解活性の測定が、前記被験酵素又はそれを含む組成物と前記基準ペプチド又は前記基質ペプチドとを接触させ、次いで該基準ペプチド又は該基質ペプチドの分解量を計測することを含む、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記基準ペプチド又は前記基質ペプチドの分解量の計測がＦＲＥＴアッセイ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、又は薄層クロマトグラフィーにより行われる、〔６〕記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記基準ペプチド又は前記基質ペプチドの各々に対する前記被験酵素又はそれを含む組成物の分解の比活性を求めることをさらに含む、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記選択した被験酵素又はそれを含む組成物を、角質汚れ分解酵素又は角質汚れ分解用組成物の候補物質として選択する、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。

〔１０〕好ましくは、酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能、及び動物性繊維への損傷性を評価する方法である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕好ましくは、前記選択した被験酵素又はそれを含む組成物を、角質汚れ分解能を有し、かつ動物性繊維の損傷性が低い酵素又は組成物として選択する、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕好ましくは、前記被験酵素又はそれを含む組成物の動物性繊維に対する分解能を評価することをさらに含む、〔１０〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記選択した被験酵素又はそれを含む組成物をケラチンと接触させ、生成されたケラチン断片の分子量を計測することをさらに含む、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、計測されたケラチン断片の分子量が、前記被験酵素又はそれを含む組成物との接触前のケラチンの分子量の５０％以上９７％以下である場合に、該被験酵素又はそれを含む組成物を、角質汚れ分解能を有し、かつ動物性繊維の損傷性が低い酵素又はそれを含む組成物として選択することをさらに含む、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記ケラチンが分子量３５，０００以上のケラチンである、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記ケラチンがケラチン１０である、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記ケラチンがＫｅｒａｔｉｎ ａｚｕｒｅである、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１８〕好ましくは、前記動物性繊維が羊毛である、〔１０〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
〔１９〕好ましくは、前記角質汚れが襟袖汚れである、〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記被験酵素を含む組成物が洗剤組成物である、〔１〕〜〔１９〕のいずれか１項記載の方法。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

本実施例で使用したプライマーの一覧を表１に示す

参考例１ プロテアーゼの調製
（１）ＢＬＰを含む培養上清の調製
（１−１）発現ベクターの作製
ＢＬＰ遺伝子（配列番号１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ／ＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ（配列番号９及び１０）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８ Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−ｓｉｇ−Ｒ（配列番号１１及び１２）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。

Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いてＥＣＯＳ^TMＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ α（ニッポンジーン、３１０−０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ／ｐＨＹ）を抽出した。抽出したＢＬＰ／ｐＨＹを鋳型としてプライマーペアΔＳ２３７Ｎ＿ｆｗ／ΔＳ２３７Ｎ＿ｒｖ（配列番号１３及び１４）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ２／ｐＨＹ）を抽出した。

（１−２）酵素産生形質転換株の作製
１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１ｍＬの新たなＬＢ培地にこの培養液を１０μＬ植菌して３７℃、２００ｒｐｍで３時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ）］を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液１３μＬ、（１−１）で得たプラスミドＢＬＰ２／ｐＨＹ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、３４．２ｎｇ／μＬ）２μＬ、ＳＭＭＰ２０μＬを混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。この液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リシン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％］に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。

（１−３）形質転換株培養による酵素製造
ＬＢ培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに（１−２）で得た枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。翌日この培養液４００μＬを２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン、６ｐｐｍ硫酸亜鉛七水和物；％は（ｗ／ｖ）％）２０ｍＬに植菌し、３２℃、２３０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。

（２）ＬａｓＡを含む培養上清の調製
ＬａｓＡ遺伝子（配列番号３）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿ＣＲ（配列番号１５及び１６）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８ Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を用いて、上記（１−２）と同様の手順で枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを鋳型として、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｒ（配列番号１９及び２０）、ならびにＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して、ＰＣＲ反応、Ｄｐｎ Ｉによるプラスミドの消化、及びライゲーションを行い、プラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を得た。

得られたプラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（３）ＡｈＰを含む培養上清の調製
ＡｈＰ遺伝子（配列番号５）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡｈＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡｈＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペア２Ｆ／２Ｒ＿ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃｈｉｓ（配列番号２１及び２２）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８ Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−Ｒ（配列番号１１及び２３）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌１６８株を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（４）ＡＬＥ−１を含む培養上清の調製
Ｍ２３ＢサブファミリープロテアーゼであるALE-1 glycylglycine endopeptidase（ＡＬＥ−１）（MEROPS ID：M23.012；配列番号８）を調製した。ＡＬＥ１遺伝子（配列番号７）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−Ｆ／ｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−ＣＨｉｓＲ（配列番号２４及び２５）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８ Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で枯草菌１６８株の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＡＬＥ１／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌Ｄｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号公報の実施例１〜５において作製されたＫａｏ９株）を使用した。得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（５）培養上清からのプロテアーゼの調製
（１）〜（４）で得た培養上清から目的のプロテアーゼを調製した。培養上清をアミコンウルトラ 分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いてＢｕｆｆｅｒＡでバッファー交換した。バッファー交換後の液から、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて酵素を調製した。まず該バッファー交換で得られた液をカラム１に通し、次いでＢｕｆｆｅｒＢを使用してカラム１の吸着成分を溶出させた。溶出分画のうちＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ（参考例５）の分解活性が認められる分画液を回収した。続いて、回収した分画液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌの溶液で平衡化したカラム２を用いてＳｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにかけ、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの分解活性が認められる分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ 分画分子量１０Ｋを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液でバッファー交換し、目的のプロテアーゼを含む酵素溶液を得た。各培養上清に使用したＢｕｆｆｅｒＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ、カラム１、及びカラム２は、表２のとおりとした。

参考例２ 酵素溶液の濃度測定
酵素溶液の濃度測定にはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはＢＳＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＷＡＫＯ）を用いた。

参考例３ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
５０ｍＭジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）と試料溶液を等量混合し、１００℃で５分間加熱することで泳動サンプルを調製した。この泳動サンプルをＡｎｙ ｋＤ^TMミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸ^TMプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及び１０倍希釈した１０×トリス／グリシン／ＳＤＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１０７３２）を用いて電気泳動した。分子量マーカーにはプレシジョン Ｐｌｕｓ プロテイン^TM２色スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０３７４）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ染色又はルビー染色した。ＣＢＢ染色にはＢｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１−０７８６）を使用した。ルビー染色にはＯｎｅ−ｓｔｅｐ Ｒｕｂｙ（ＡＰＲＯ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＳＰ−４０４０）を使用した。分子量マーカーの分子量と移動度から作成できる検量線の式に、目的タンパク質又はポリペプチドの移動度を代入することで得られた値を、該目的タンパク質又はポリペプチドの分子量とした。サンプルの移動度（Ｒｆ値）は、該サンプルを流したレーンにおける、ゲルの上端（サンプルをアプライした位置）から先行色素（ブロモフェノールブルー）までの距離を１としたときの、該ゲルの上端から該サンプルのバンドまでの距離の相対値として計測した。

参考例４ ウェスタンブロッティング
ケラチン溶液を参考例３に記載の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（未染色）にかけた後、ゲルをトランスブロットＴｕｒｂｏ^TMシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏ^TMミニ ＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７０−４１５６）を用いてＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体反応にはＩｂｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。１次抗体としてＫＲＴ１０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍ０１），ｃｌｏｎｅ １Ｈ６（Ａｂｎｏｖａ）、２次抗体としてＳｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３２４３０）、検出試薬としてＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）を使用した。

参考例５ 酵素活性の測定
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質[以下ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ]（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｎｐ）とは２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴のアッセイプレート（ＡＧＣテクノグラス、３８８１−０９６）に参考例１（５）で得た酵素溶液（酵素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１９０μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭ ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５液、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの代わりにジメチルスルホキシドで溶かしたＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１（ペプチド研究所、３７２０−ｖ）を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１分間あたりに、１ｎｍｏｌのＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１による蛍光強度に相当する蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。

実施例１ 角質汚れに対する酵素洗浄力の評価
（１）襟袖汚れの作製
ワイシャツの襟の領域に布（組成：ポリエステル６５％、綿３５％）を縫い合わせたものを準備した。このシャツを成人男性に３日間にわたって日中に着用させた。その後、襟に縫い合わせた布を回収し、１辺が６ｍｍの正方形となるように裁断して、襟袖汚れを有するサンプル布として用いた。

（２）洗浄力評価
洗浄液の組成：酵素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、硬度１０°ＤＨ（カルシウム／マグネシウム＝４／１（モル比））、０．１（ｗ／ｖ）％ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（エマール（登録商標）２０Ｃ、花王（株）製、有効分換算）。酵素としては、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ及びＡＬＥ−１、ならびにＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、１２０−０４３１３）を使用した。各酵素は最終濃度が１５０Ｕ／Ｌになるように添加した。対照として、同じ組成で酵素無添加の洗浄液を用いた。

スキャナーＧＴ−Ｘ９７０（ＥＰＳＯＮ）を用いてサンプル布の画像を取り込んだ。その後、該サンプル布を５００μＬの洗浄液に浸漬して３０℃で５時間静置した。静置後のサンプル布を硬度１０°ＤＨ水ですすいだ後に乾燥させ、再度スキャナーＧＴ−Ｘ９７０を用いて画像を取り込んだ。取り込んだ画像から、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて、洗浄前後のサンプル布のＭｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅを測定した。汚れが付着する前の原布の画像を同様に取得し、Ｍｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅを測定した。得られたＭｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅを以下の式に代入することで洗浄率を算出した。
洗浄率（％）＝（Ｇ２−Ｇ１）／（Ｇ０−Ｇ１）＊１００
Ｇ０：サンプル布の原布のＭｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅ
Ｇ１：洗浄前のサンプル布のＭｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅ
Ｇ２：洗浄後のサンプル布のＭｅａｎ Ｇｒａｙ Ｖａｌｕｅ

洗浄率の測定結果を図１に示す。Ｍ２３ＡサブファミリープロテアーゼであるＢＬＰ、ＬａｓＡ、及びＡｈＰは、襟袖汚れに対する洗浄力を有していた。一方でＭ２３ＢサブファミリープロテアーゼであるＡＬＥ−１及びリゾスタフィンでは、襟袖汚れに対する洗浄力は検出されなかった。

実施例２ 酵素によるケラチン分解活性の評価
（１）ケラチン溶液の調製
ヒトの踵から、ベルベットスムーズ電動角質リムーバー ダイヤモンド（レキットベンキーザー）を使用して角質を削り出した。踵角質５ｍｇに対し、１ｍＬの可溶化液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２％ＳＤＳ、２５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｋｉｔ ８ｋＤａ ｃｕｔ−ｏｆｆ ２ｍＬ（ＧＥヘルスケア、＃８０−６４８４−３２）を用いて、透析バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＳＤＳ）に対して一晩透析し、ケラチン溶液を得た。

（２）酵素によるケラチン分解
（１）で得られたケラチン溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２０倍希釈した。この希釈溶液３０μＬに対し、酵素溶液を１μＬ添加した。酵素としては、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ及びＡＬＥ−１、ならびにＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、＃１２０−０４３１３）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ３１１１）、Ａｌｃａｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ４８６０）、プロテイナーゼＫ（関東化学、３４０７６−９２）を使用した。酵素の終濃度は、ＢＬＰ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ、プロテイナーゼＫが１μｇ／ｍＬ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎが１０μｇ／ｍＬとなるように調整した。反応液を３０℃で１５時間静置した後、参考例３の手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）にて評価した。

結果を図２に示す。Ｍ２３Ａサブファミリーの酵素であるＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰを添加した溶液では、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にバンドが検出され、これらの酵素がケラチンを分解したことが示された。一方で、Ｍ２３Ｂサブファミリーの酵素であるＡＬＥ−１又はＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎを添加した溶液ではケラチンの分解が見られなかった。すなわち、Ｍ２３ファミリーのなかでもＭ２３Ａサブファミリーの酵素のみがケラチンを分解することが示された。また、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ、プロテイナーゼＫを添加した溶液では、主要なバンドが消失していた。これらの酵素でケラチン断片のバンドが検出されなかったのは、ケラチンが様々な分子量の断片へと分解されたことで検出限界以下となったためか、断片が低分子化したためにゲルの外へと流出したためであると考えられた。

（３）ケラチン画分の評価
（１）で得られたケラチン溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２０倍希釈し、参考例３〜４と同様の手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）とウェスタンブロッティングにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによる評価の結果、踵角質から調製したケラチン溶液がケラチン１０を含むことが確認された（図３）。図３では複数のバンドが検出されたが、これらは単量体のケラチン１０の他に、複合体化したケラチン１０、修飾されたケラチン１０、ケラチン１及び他の種類のケラチン等であると考えられた。

実施例３ Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼによる角質細胞由来不溶性ケラチンの分解
テープ（ニチバン、ＣＴ−２４）を２ｃｍ使用して、テープストリッピングによりヒトの首から角質を取得した。この角質に可溶化液（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２％ＳＤＳ、２５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１００℃で１０分加熱した後、遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。沈殿物に対して該可溶化液の添加、加熱、遠心分離の操作をさらに２回行うことで、角質細胞由来の不溶性成分を得た。得られた不溶性成分に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を４０μＬ添加し、さらに酵素溶液を１μＬ添加した。酵素としては、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、及びＡｈＰを使用した。酵素の終濃度は、ＢＬＰが１μｇ／ｍＬ、ＬａｓＡ及びＡｈＰが１０μｇ／ｍＬに調整した。反応液を３０℃で１５時間静置した後、参考例３の手順に従って、上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ルビー染色）を行った。結果を図４に示す。ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰを添加した溶液では、いずれも分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間にバンドが検出され、これらの酵素が角質の不溶性画分中のケラチンを分解したことが示された。

実施例４ Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの基質の解析
図２、４に示すとおり、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ処理ケラチン溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量３７，０００マーカーと分子量５０，０００マーカーの間に２つのバンドが検出された。このうち、図４に示すＢＬＰ処理溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルについて、低分子側のバンドの質量分析を行った。質量分析では株式会社リバネスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いた。質量分析の結果、このバンド領域に含まれるタンパク質はケラチン１０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＿ＡＡＨ３４６９７）の断片であることが判明した。

図５にケラチン１０のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。太字は、質量分析で同定された酵素処理液からのバンド中のペプチド配列を示す。図５に示すように、ケラチン１０の両末端にはグリシンリッチ領域が存在し、一方、本実施例での質量分析で検出されたペプチド配列（太字）は中央領域に含まれていた。該質量分析で検出されたペプチド配列は、いずれもケラチン１０のアミノ酸配列の番号１５７から４５０の間に存在していた。以上より、ＢＬＰ及び他のＭ２３Ａサブファミリーの酵素が、ケラチン１０のアミノ酸配列の両末端、すなわち１〜１５６番アミノ酸領域又は４５１〜５８４番アミノ酸領域にあるグリシンリッチ領域を切断することで、角質に含まれる全長ケラチン１０を分解することが判明した。

実施例５ 羊毛ケラチンの分解性評価
原料に羊毛が使用されているＫｅｒａｔｉｎ ａｚｕｒｅ（ＳＩＧＮＡ、Ｋ８５００，ロット；ＳＬＢＭ２９２１Ｖ）を使用して酵素の羊毛ケラチン分解性（損傷性）を評価した。酵素としてＳａｖｉｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ３１１１）、Ａｌｃａｌａｓｅ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ４８６０）、及びプロテイナーゼＫ（関東化学、３４０７６−９２）、ならびに参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰを使用した。６ｍｇのＫｅｒａｔｉｎ ａｚｕｒｅを１ｍＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５液に浸漬し、１００μｇ／ｍＬに調整した酵素溶液を１００μＬ添加した。室温で７２時間静置した後、遠心分離して上清を回収し、ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。酵素を添加した溶液の上清の吸光度から酵素無添加の溶液の上清の吸光度を引いた値をΔＡ５９５とした。

結果を図６に示す。Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ、プロテイナーゼＫを添加したサンプルではＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰを添加したサンプルよりも吸光度の増大が認められた。以上より、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ａｌｃａｌａｓｅ、プロテイナーゼＫはＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰよりも効率よく羊毛由来Ｋｅｒｔｉｎ ａｚｕｒｅを分解する、すなわち羊毛損傷性が高いことが判明した。

実施例１〜４では、ケラチン１０のグリシンリッチな領域を分解可能な酵素が角質汚れへの洗浄力を有することが示唆された。さらに実施例４〜５ではケラチン１０のグリシンリッチ領域を分解する一方でケラチン１０の中央領域を分解できない酵素は、羊毛ケラチンに対する分解性が低いことが判明した。これは動物性繊維を構成するタンパク質にはケラチン１０のグリシンリッチ領域ほどのグリシンリッチな領域が存在しないためであると考えられる。したがって、グリシンリッチな領域の分解性を基準にして酵素の角質汚れ分解能と動物性繊維の分解能（損傷性）を評価できることが示唆された。

実施例６ ＢＬＰのロリクリン分解活性
タグ配列が融合されている組換えロリクリン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｌｏｒｉｃｒｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ａｂｃａｍ、ａｂ１１４２６１）を、アミコンウルトラ 分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いて、反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、硬度１０°ＤＨ（カルシウム／マグネシウム＝４／１（モル比））、０．１（ｗ／ｖ）％ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム）の溶液へと調製した。この溶液３０μＬに、参考例１で調製したＢＬＰ溶液（６０μｇ酵素／ｍＬ）を１μＬ添加し、３０℃で３時間静置した。反応後の溶液の参考例３の手順によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）の結果、３本の主要なバンドが検出された（図７、矢印）。

同様に調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（未染色）後のゲルを、トランスブロットＴｕｒｂｏ^TMシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏ^TMミニ ＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７０−４１５６）を用いてＰＶＤＦ膜へ転写した。転写した膜を、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７８６）で染色し、５０％メタノール液で脱色した後、図７と同様の位置に現れた３本のバンドの領域を切り出した。切り出したバンドのＮ末端アミノ酸配列の解析を、株式会社リバネスのＮ末端アミノ酸配列解析サービスへ依頼した。その結果、いずれのバンドのＮ末端アミノ酸配列もロリクリン配列ではないことが判明したことから、バンドはタグ配列に由来するものと推定された。すなわち、ＢＬＰがロリクリンを分解したことが示された。

図８に、本実施例で用いたロリクリンのアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。図８に示すように、ロリクリンはグリシンリッチなタンパク質である。一方、本実施例で用いたタグ配列（図８には示されていない）には、グリシンリッチな領域はほとんど存在しない。したがって、本実施例の結果及び実施例４の結果と合わせると、ＢＬＰが、グリシンリッチ領域を分解することで、ロリクリンを分解したことが示唆された。

実施例７ 角質汚れ分解酵素の基質特異性
各種酵素について、角質汚れ分解能による基質特異性の違いを調べた。参考例５と同じ手順で、ただし、ペプチド配列としてＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ、及びＧＧＧＦＧ（配列番号２８、３０〜３３）の５種類のペプチドのそれぞれを含むＦＲＥＴ基質を用いて、各種基質ペプチドに対するプロテアーゼの分解活性を調べた。プロテアーゼには、参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ及びＡＬＥ−１、ならびにＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、１２０−０４３１３）を用いた。また、参考例２の方法で各プロテアーゼ溶液の濃度を測定した。各プロテアーゼについて、酵素１ｍｇあたりの活性（比活性；Ｕ／ｍｇ）を求めた。

結果を表３に示す。実施例１で角質汚れを分解したＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ（ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰ）は、ＧＧＧＧＧのＦＲＥＴ基質で比活性が１０Ｕ／ｍｇ以上であった。さらに、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ，ＧＧＧＦＧのいずれかのＦＲＥＴ基質の１つ以上で、ＧＧＧＧＧのＦＲＥＴ基質に対する相対活性が０．５を上回った。一方で、実施例１で角質汚れを分解しなかったＭ２３Ｂサブファミリープロテアーゼ（ＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）は、ＧＧＧＧＧのＦＲＥＴ基質で比活性が１０Ｕ／ｍｇ未満であった。さらに、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ，ＧＧＧＬＧ、ＧＧＧＦＧのいずれのＦＲＥＴ基質でも、活性が認められず、ＧＧＧＧＧのＦＲＥＴ基質に対する相対活性が０．５未満であった。

以上の実施例の結果からは、ＧＧＧＧＧを基準ペプチド、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ，ＧＧＧＬＧ、ＧＧＧＦＧを基質ペプチドとした場合、角質汚れ分解能を有する酵素は、基準ペプチドに対し１０Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かついずれか１以上の基質ペプチドに対し５Ｕ／ｍｇ以上（相対活性が０．５以上）の分解活性を有することが認められた。したがって、各種グリシンリッチな基準ペプチド及び基質ペプチドに対する酵素の活性を基準にして、当該酵素の角質汚れ分解能を評価することができることが示唆された。さらに、ケラチン分解挙動を確認することにより、角質汚れ分解能に加え動物性繊維への損傷性を評価できることが示唆された。よって、本発明の評価方法を用いることにより、角質汚れ分解能を有する酵素を効率的にスクリーニングすることができ、さらに角質汚れ分解能を有しかつ動物繊維への損傷性が低い酵素も効率的にスクリーニングすることができる。

以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

Claims (9)

1. 酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能を評価する方法であって、
   基準ペプチド及び１種以上の基質ペプチドに対する、被験酵素又はそれを含む組成物の分解活性を測定すること、
   該１種以上の基質ペプチドに対する分解活性のそれぞれについて、該基準ペプチドに対する分解活性に対する相対値を求めること、及び、
   該基準ペプチドに対する分解の比活性が１０Ｕ／ｍｇ以上であり、かつ該基質ペプチドのいずれか１つ以上についての該相対値が０．５以上であるか、又はそれに相当する該基準ペプチド及び基質ペプチドに対する分解活性を有する被験酵素又はそれを含む組成物を選択すること、
   を含み、
   該基準ペプチドがＧＧＧＧＧ又はＧＧＧＧであり、該１種以上の基質ペプチドが、ＧＧＧＸＧ、ＧＸＧＧＧ、ＧＧＸＧ及びＧＸＧＧからなる群より選択され、Ｘはグリシン以外の任意のアミノ酸残基である、
   方法。
2. 前記１種以上の基質ペプチドが、ＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＹＧ、ＧＧＧＬＧ及びＧＧＧＦＧからなる群より選択される１種以上である、請求項１記載の方法。
3. 前記被験酵素がプロテアーゼである、請求項１又は２記載の方法。
4. 酵素又はそれを含む組成物の角質汚れ分解能、及び動物性繊維への損傷性を評価する方法である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記選択した被験酵素又はそれを含む組成物をケラチンと接触させ、次いで生成されたケラチン断片の分子量を計測することをさらに含む、請求項４記載の方法。
6. 計測されたケラチン断片の分子量が、前記被験酵素又はそれを含む組成物との接触前のケラチンの分子量の５０％以上９７％以下である場合に、該被験酵素又はそれを含む組成物を、角質汚れ分解能を有し、かつ動物性繊維の損傷性が低い酵素又はそれを含む組成物として選択することをさらに含む、請求項５記載の方法。
7. 前記ケラチンがグリシンリッチ領域を有し、かつ分子量３５，０００以上のケラチンである、請求項５又は６記載の方法。
8. 前記ケラチンがケラチン１０である、請求項５又は６記載の方法。
9. 前記動物性繊維が羊毛である、請求項４〜８のいずれか１項記載の方法。