DE102013215824A1

DE102013215824A1 - Wasch- oder Reinigungsmittel mit immobilisierter Enzymkomponente

Info

Publication number: DE102013215824A1
Application number: DE102013215824.6A
Authority: DE
Inventors: Thomas Weber; Timothy O'Connell; Hendrik Hellmuth; Christian Detzel; Eva Kranen; Joachim Jose
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2015-02-12
Also published as: WO2015018884A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Wasch- oder Reinigungsmittel, das ein Enzym, insbesondere ein hydrolytisches Enzym, sowie ein Faltungshelferprotein für das Enzym enthält, wobei sowohl das Enzym als auch das Faltungshelferprotein als Fusionsproteine mit der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins auf der Oberfläche einer Zelle oder der Membranfraktion einer Zelle immobilisiert sind, sowie die Verwendung der beschriebenen Wasch- und Reinigungsmittel.

Description

Die vorliegende Anmeldung richtet sich auf ein Wasch- oder Reinigungsmittel, das ein Enzym, insbesondere ein hydrolytisches Enzym enthält, wobei das Enzym auf einer Zelle oder der Membranfraktion einer Zelle immobilisiert ist, sowie die Verwendung eines solchen Enzyms in Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agenzien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, β-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
Derzeit sind Enzyme in der Regel in löslicher Form in Wasch- und Reinigungsmitteln enthalten. Nachteilig hierbei ist, dass solche Enzyme nicht oder nur unter großem Aufwand zur Wiederverwendung abtrennbar sind und, im Fall von Waschmitteln, am zu reinigenden Textil anhaften können. Diese Anhaftung am Textil verursacht durch die Restaktivität des Enzyms einen vom Verbraucher als unangenehm empfundenen Geruch, der bisher nur durch Einschränkung der Reaktivität oder des akzeptierten Substratspektrums verhindert werden kann, wie z. B. bei Lipasen. Es besteht daher Bedarf nach Wasch- und Reinigungsmitteln, die Enzyme in an Partikel gekoppelter Form enthalten, so dass nach dem Einsatz die Möglichkeit einer mechanischen Entfernung oder Abtrennung besteht und ein Anhaften auf dem zu reinigenden Gegenstand vermieden wird.
Obwohl die Immobilisierung von Enzymen auf Feststoffpartikeln bekannt und möglich ist, sind derartig immobilisierte Enzyme insoweit problematisch, als dass sie durch die Immobilisierung an Enzymleistung verlieren und daher gegenüber dem freien Enzym eine deutlich verringerte Wirksamkeit, insbesondere an ebenfalls immobilisierten Substraten, wie z. B. Anschmutzungen an Wäsche oder harten Oberflächen, aufweisen.
Es ist daher wünschenswert, immobilisierte Enzyme bereitzustellen, die die gleiche Aktivität besitzen wie die entsprechenden freien Enzyme. Darüber hinaus wäre es vorteilhaft, die Immobilisierung an Partikel direkt während der Enzymproduktion zu bewirken, um zusätzliche Prozessschritte zur Kopplung der Enzyme an feste Substrate und die damit verbundenen erhöhten Kosten zu vermeiden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Wasch- oder Reinigungsmittel bereitzustellen, das ein an Partikel immobilisiertes Enzym enthält, wobei das immobilisierte Enzym eine mit dem entsprechenden freien Enzym vergleichbare Enzymaktivität aufweist. Vorzugsweise erfolgt die Immobilisierung direkt während der Herstellung des Enzyms.
Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe durch die Ko-Expression eines Enzyms und des zugehörigen Faltungshelferproteins in einer Zelle und Ko-Immobilisierung auf der Zelloberfläche mittels Autodisplay gelöst wird. Derart exprimierte Enzyme können in auf der Zelloberfläche immobilisierter Form als Ganzzellbiokatalysator eingesetzt werden. Alternativ ist auch der Einsatz von Membranfraktionen der Zellen, die die Enzyme enthalten, denkbar.
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung daher auf ein Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend mindestens ein Enzym, insbesondere mindestens ein hydrolytisches Enzym, bevorzugt eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt eine Lipase, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon und mindestens ein Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym, bevorzugt eine Foldase, oder ein aktives Fragment davon, wobei das mindestens eine Enzym oder enzymatisch aktive Fragment davon und das mindestens eine Faltungshelferprotein oder aktive Fragment davon jeweils in Form eines Fusionsproteins, das eine Transporterdomäne eines Autotransporterproteins als Fusionspartner umfasst, gemeinsam auf der Oberfläche einer Zelle, insbesondere einem einzelligen Mikroorganismus, oder einer Membranfraktion einer Zelle, insbesondere der Membranfraktion eines einzelligen Mikroorganismus, immobilisiert sind.
„Mindestens eine”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf 1 oder mehr, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr.
Die hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittel können rekombinante Zellen als ganzes oder Membranfraktionen davon enthalten, wobei die rekombinante Zelle, insbesondere ein rekombinanter Mikroorganismus, vorzugsweise eine Bakterienzelle, mindestens ein Nukleinsäuremolekül enthält, das umfasst:

(i) mindestens eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem Enzym, insbesondere einem hydrolytischen Enzym, bevorzugt einer Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt einer Lipase, oder einem enzymatisch aktiven Fragment davon und der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins kodiert; und
(ii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem Faltungshelferprotein für das Enzym gemäß (i), bevorzugt eine Foldase, oder einem aktiven Fragment davon und der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins kodiert.

Des Weiteren ist auch die Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels wie hierin beschrieben zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle kodieren Fusionsproteine. Diese Fusionsproteine umfassen das Enzym oder Faltungshelferprotein, das üblicherweise N-terminal lokalisiert ist, und eine Transporterdomäne eines Autotransporterproteins, die üblicherweise C-terminal lokalisiert ist. Dazwischen kann eine Linkersequenz liegen, die weiter unten im Detail beschrieben wird.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Enzymaktivität von immobilisierten Enzymen, insbesondere Lipasen, nicht beeinträchtigt wird, wenn diese zusammen mit einem entsprechenden Faltungshelferprotein mittels Autodisplay auf der Oberfläche einer Zelle ko-immobilisiert werden. Ohne zu beabsichtigen an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Gegenwart des Faltungshelferproteins das Enzym derart stabilisiert, dass es korrekt faltet und/oder in der entsprechend korrekt gefalteten Konformation bleibt.
Aus diesem Grund sind die immobilisierten Enzyme, die hierin beschrieben werden, dazu geeignet, die üblicherweise in Wasch- oder Reinigungsmitteln verwendeten freien Enzyme zu ersetzen ohne die Reinigungsleistung auf enzymsensitive Anschmutzungen signifikant zu verringern. Die Immobilisierung auf Zellen oder Zellmembranfraktionen ermöglicht die einfache mechanische Abtrennung und, falls gewünscht, Wiedergewinnung und trägt somit zur Vermeidung der Anhaftung der Enzyme auf den zu reinigenden Gegenständen bei. Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil ergibt sich daraus, dass auf der Zelloberfläche mehrere Enzymmoleküle verankert sind. Dadurch ergibt sich eine kooperative Wirkung. Findet ein Enzymmolekül ein Substrat, so muss der gesamte Partikel vor Ort verweilen, und so werden die anderen auf der Zelloberfläche befindlichen Enzyme ebenfalls an das Substrat gebracht.
Das hierin beschriebenen Mittel umfassen mindestens ein Enzym, können aber auch mehrere Enzyme umfassen. Prinzipiell sind diesbezüglich alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar. Vorzugsweise handelt es sich um eines oder mehrere Enzyme, die in einem Wasch- oder Reinigungsmittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Pektin-spaltendes Enzym, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase sowie deren Gemische. Bevorzugte hydrolytische Enzyme im Sinne der Komponente (a) umfassen insbesondere Proteasen, Amylasen, insbesondere α-Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen, insbesondere Pectinasen, Mannanasen, β-Glucanasen, sowie deren Gemische. Besonders bevorzugt sind Proteasen, Amylasen und/oder Lipasen sowie deren Gemische und ganz besonders bevorzugt sind Lipasen. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden.
Im Folgenden werden Beispiele für die verschiedenen Enzymklassen, die hierin eingesetzt werden können beschrieben:
Beispiele für verwendbare Lipasen (Triacylglycerolacylhydrolasen, EC 3.1.1.3) oder Cutinasen, die insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten sind, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen, sind die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen oder die entsprechenden weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase^®, Lipolase^®Ultra, LipoPrime^®, Lipozyme^® und Lipex^® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE^®, Lipase P^®, Lipase B^®, beziehungsweise Lipase CES^®, Lipase AKG^®, Bacillus sp. Lipase^®, Lipase AP^®, Lipase M-AP^® und Lipase AML^® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase^® und Lipomax^® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30^®, Lipase OF^® und Lipase PL^® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast^® von der Firma Genencor. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen werden Lipasen aus den Familie 1.1 oder 1.2 von Lipasen (gemäß Apigny & Jaeger, Biochem. J. (1999) 343, 177–183), insbesondere eine Lipase aus einem Bakterium der Gattung Burkholderia oder Pseudomonas verwendet. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete Lipase ist die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia (SEQ ID NO:2; GenBank Accession No. FJ638612, Version FJ638612.1 GI:222692183; Datum 22. Februar 2013).
Unter den Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase^® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase^®, beziehungsweise Savinase^® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP^® geführten Protease-Varianten ab. Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym^®, Relase^®, Everlase^®, Nafizym^®, Natalase^®, Kannase^® und Ovozyme^® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect^®, Purafect^® OxP, Purafect^® Prime, Excellase^® und Properase^® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol^® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi^® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather^® und Protease P^® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus.
Beispiele für verwendbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens oder aus B. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl^® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl^® und Termamyl^®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase^® erhältlich. Die α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN^® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α-Amylase aus B. stearothermophilus unter den Namen BSG^® und Novamyl^®, ebenfalls von der Firma Novozymes. Des Weiteren sind für diesen Zweck die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus B. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben.
Ebenso sind Fusionsprodukte aller genannten Moleküle einsetzbar. Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl^® von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere vorteilhaft einsetzbare Handelsprodukte sind beispielsweise die Amylase-LT^® und Stainzyme^® oder Stainzyme ultra^® bzw. Stainzyme plus^®, letztere ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Erfindungsgemäß konfektionierbare Amylasen sind ferner vorzugsweise α-Amylasen.
Cellulasen können je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen, vorhanden sein. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere die Beiträge der Cellulase zur Primärwaschleistung des Mittels (Reinigungsleistung), zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition), zur Avivage (Gewebewirkung) oder zur Ausübung eines ”stone washed”-Effekts. Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen wird von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme^® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase^® und Carezyme^® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus H. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft^®, Renozyme^® und Celluclean^®. Weiterhin einsetzbar sind beispielsweise die 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone^® und Biotouch^® erhältlich sind. Weitere Handelsprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase^® und Ecopulp^®. Weitere geeignete Cellulasen sind aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax^® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind ”Genencor detergent cellulase L” und IndiAge^®Neutra. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Ferner können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen weitere Enzyme eingesetzt sein, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefasst werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Xanthanasen, Xyloglucanasen, Xylanasen, Pullulanasen, Pektin-spaltende Enzyme und β-Glucanasen. Die aus Bacillus subtilis gewonnene β Glucanase ist unter dem Namen Cereflo^® von der Firma Novozymes erhältlich. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Hemicellulasen sind Mannanasen, welche beispielsweise unter den Handelsnamen Mannaway^® von dem Unternehmen Novozymes oder Purabrite^® von dem Unternehmen Genencor vertrieben werden. Zu den Pektin-spaltenden Enzymen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls Enzyme gezählt mit den Bezeichnungen Pektinase, Pektatlyase, Pektinesterase, Pektindemethoxylase, Pektinmethoxylase, Pektinmethylesterase, Pektase, Pektinmethylesterase, Pektinoesterase, Pektinpektylhydrolase, Pektindepolymerase, Endopolygalacturonase, Pektolase, Pektinhydrolase, Pektin-Polygalacturonase, Endo-Polygalacturonase, Poly-α-1,4-Galacturonid Glycanohydrolase, Endogalacturonase, Endo-D-galacturonase, Galacturan 1,4-α-Galacturonidase, Exopolygalacturonase, Poly(galacturonat) Hydrolase, Exo-D-Galacturonase, Exo-D-Galacturonanase, Exopoly-D-Galacturonase, Exo-poly-α-Galacturonosidase, Exopolygalacturonosidase oder Exopolygalacturanosidase. Beispiele für diesbezüglich geeignete Enzyme sind beispielsweise unter den Namen Gamanase^®, Pektinex AR^®, X-Pect^® oder Pectaway^® von dem Unternehmen Novozymes, unter dem Namen Rohapect UF^®, Rohapect TPL^®, Rohapect PTE100^®, Rohapect MPE^®, Rohapect MA plus HC, Rohapect DA12L^®, Rohapect 10L^®, Rohapect B1L^® von dem Unternehmen AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase^® von dem Unternehmen Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich.
Unter all diesen Enzymen sind solche besonders bevorzugt, die an sich gegenüber einer Oxidation vergleichsweise stabil oder beispielsweise über Punktmutagenese stabilisiert worden sind.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können in den Wasch- oder Reinigungsmitteln auch Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen (die bei niedrigen H₂O₂-Konzentrationen als Peroxidase reagieren), Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Manganperoxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten sein. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite^® 1 und 2 der Firma Novozymes oder Gluzyme^® mono BG der Firma Novozymes zu nennen.
Die hierin beschriebenen Faltungshelferproteine sind Chaperone, die die korrekte Faltung der hierin beschriebenen Enzyme bewirken oder unterstützen und daher abhängig von dem eingesetzten Enzym ausgewählt werden. Für die oben genannten Enzyme sind die zugehörigen Chaperone im Stand der Technik bekannt. Die eingesetzten Faltungshelferproteine sind vorzugsweise Foldasen. Für den Fall, dass es sich bei den eingesetzten Enzymen um Lipasen handelt, sind die Faltungshelferproteine die zugehörigen Lipase-spezifischen Foldasen. Beispielsweise kann für die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia die Foldase lipB eingesetzt werden (SEQ ID NO:4; GenBank Accession No. FJ638612, Version FJ638612.1 GI:222692183; Datum 22. Februar 2013). In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung wird als Lipase die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia (Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1; Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2) und als Faltungshelferprotein die die Foldase lipB aus Burkholderia cepacia (Nukleotidsequenz SEQ ID NO:3; Aminosäuresequenz SEQ ID NO:4) eingesetzt.
Alle oben beschriebenen Enzyme und Faltungshelferproteine können als Volllängenproteine oder als aktive Fragmente oder Varianten eingesetzt werden. „Fragmente”, wie hierin im Zusammenhang mit Proteinen oder Polypeptiden verwendet, bezieht sich auf Proteine/Polypeptide, die gegenüber ihrer nativen Form durch N- und/oder C-terminalen Abbau von Aminosäuren verkürzt sind. Solche Fragmente sind „aktiv” in dem Sinne, als dass sie mindestens einen Teil der Proteinaktivität der nativen Form aufweisen, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter 60–90%, noch bevorzugter dieselbe oder höhere Aktivität. Der Begriff „Variante”, wie hierin verwendet, umfasst Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, die zu 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99% zu der als Referenz dienenden Sequenz identisch sind. Besonders bevorzugt sind Varianten die eine oder mehrere, vorzugsweise bis zu 5, Punktmutationen aufweisen. Solche Varianten können eine gesteigerte Enzymaktivität, eine breitere oder geänderte Substratspezifität oder eine gesteigerte Stabilität bewirken. Entsprechende Varianten können sich beispielsweise durch solche Mutationen ergeben, die der Entfernung von Proteaseschnittstellen dienen.
Beispielsweise wird von der Foldase lipB vorzugsweise ein N-terminal verkürztes Fragment eingesetzt. Diesem Fragment fehlen die 70 N-terminalen Aminosäuren, die dazu dienen das native Protein in der Membran zu verankern aber für die Chaperonfunktion nicht erforderlich sind. Da diese Membranverankerungssequenz mit dem verwendeten Autodisplaysystem interferieren könnte, wurde sie in den hierin beschriebenen Konstrukten entfernt. In ähnlicher Weise können auch alle anderen hierin erfassten Proteine modifiziert werden.
Enzyme werden als formulierte Enzymprodukte in Wasch- oder Reinigungsmittel gegeben, die aus aktivem Enzymprotein, sowie weiteren Inhaltsstoffen bestehen. Die zugegebene Enzymmenge wird daher als „Enzymmenge an aktivem Protein” angegeben, so dass verdeutlicht wird, dass sich die Angaben der zugegeben Enzymmenge auf das aktive Enzymprotein und nicht auf das formulierte Enzymprodukt beziehen. Die angegebenen Mengen in Gewichtsprozent beziehen sich auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels.
Die Wasch- oder Reinigungsmittel der vorliegenden Erfindung enthalten das mindestens eine Enzym in einer Menge von 1 × 10^–8 bis 5 Gew.-% Prozent an aktivem Protein, insbesondere 0,001 bis 3 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1,5 Gew.-%, noch bevorzugter von 0,05 bis 1,25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels, wobei jedes enthaltene immobilisierte Enzym für sich genommen in den genannten Mengen vorliegen kann.
Die (Aktiv-)Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren bestimmt werden. Alternativ kann das Aktivprotein über die biochemische Aktivität bestimmt werden, für eine Lipase beispielsweise über die Hydrolyse von p-Nitrophenylpalmitat oder via Titration der Hydrolyse von Olivenöl im pH-Stat. Diese Methoden sind dem Fachmann für das jeweilige Enzym wohlbekannt.
Zusätzlich zu den immobilisierten Enzymen kann das Wasch- oder Reinigungsmittel weitere Enzyme, die ebenfalls aus den oben genannten ausgewählt werden können, in freier Form, d. h. nicht immobilisiert enthalten.
Wie hierin beschrieben werden die eingesetzten Enzyme mittels Autodisplay auf der Oberfläche von Zellen immobilisiert und die Zellen und/oder Membranfraktionen dieser Zellen in den beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzt. Autodisplay ist eine Methode, um rekombinante Proteine an der Zelloberfläche, insbesondere der Oberfläche von Bakterien, zu präsentieren. Autodisplay bezeichnet in diesem Zusammenhang ein Expressionssystem, das auf dem Sekretionsmechanismus der Proteinfamilie der Autotransporter, die zum Typ V Sekretionssystem gehören, basiert. Es wird in gram-negativen Bakterien sowohl für den Transport von Proteinen zur Zelloberfläche als auch für die Sekretion von Proteinen in den Extrazellularraum verwendet. Dazu werden die Autotransporter-Proteine als Vorläuferproteine synthetisiert, die alle strukturellen Voraussetzungen für den Transport zur Zelloberfläche erfüllen, d. h. sie werden mit einem N-terminalen Signalpeptid synthetisiert, welches für den Sec-Weg typisch ist, der das Durchqueren der inneren Membran ermöglicht. Im Periplasma angelangt, faltet sich der C-terminale Teil des Vorläufers nach Trunkation des Signalpeptids als eine porinartige Struktur, ein sogenanntes β-Barrel, in die äußere Membran hinein. Durch diese Pore hindurch wird die N-terminal gebundene Passagierdomäne zur Oberfläche transloziert. Dort kann sie – entweder autoproteolytisch oder durch eine zusätzliche Protease – abgespaltet werden oder kann über die Transporterdomäne an der Zellhülle verankert bleiben.
Ein Ersetzen des natürlichen Passagiers durch ein rekombinantes Protein führt zu dessen Oberflächentranslokation. Gentechnisch kann hierfür ein nicht-natürlicher Vorläufer konstruiert werden, der aus einem Signalpeptid, dem rekombinanten Protein und dem Autotransporterprotein, d. h. dem β-Barrel, besteht. Dazu wird die Nukleotidsequenz, die für das rekombinante Passagierprotein kodiert, im Leseraster zwischen die für das Signalpeptid und die für die translozierende Domäne des Autodisplay-Vektors kodierende Nukleotidsequenz unter Verwendung von üblichen gentechnischen Verfahren eingefügt. Vorzugsweise kann zwischen dem rekombinanten Protein und der Transporterdomäne des Autotransporterproteins ferner eine Peptidlinkersequenz eingefügt werden, die als Transmembranlinker dient und für einen uneingeschränkten Zugang zur Oberfläche erforderlich ist. Diese kann ebenfalls durch das Einfügen der entsprechenden Nukleotidsequenz, die die Linkersequenz kodiert, zwischen der für das rekombinante Protein kodierenden Sequenz und der für die Transporterdomäne des Autotransporters kodierenden Sequenz eingefügt werden.
Der Begriff ”Transmembranlinker”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen flexiblen Polypeptidabschnitt, der zur Verbindung der Autotransporterdomäne mit dem rekombinanten Protein dient, jedoch flexibel genug ist, um ein unabhängiges Falten und/oder Transportieren des Proteins zu ermöglichen. In verschiedenen Ausführungsformen kann diese Linkersequenz auch eine Proteaseschnittstelle umfassen, um die Abspaltung des rekombinanten Proteins zu ermöglichen.
Das Signalpeptid kann beispielsweise von einer Untereinheit des Cholera-Toxins gewonnen werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Prinzipiell sind alle Signalpeptide, die die Translokation durch die innere Bakterienmembran in das Periplasma oder in die äußere Membran vermitteln einsetzbar. Üblicherweise sind derartige Signalpeptide am N-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert. Das Signalpeptid wird vorzugsweise vor der Translokation durch die Membran abgespalten.
In der vorliegenden Erfindung ist das Passagierprotein ein Enzym oder ein Faltungshelferprotein wie oben definiert. In dem Autodisplaysystem wird das Passagierprotein als rekombinantes Fusionsprotein mit der Transportdomäne eines Autotransporters exprimiert und durch die von der Transportdomäne erzeugte Pore an die Zelloberfläche transloziert.
Die Begriffe „Transporterdomäne eines Autotransporterproteins” oder „Transporterdomäme eines Autotransporters”, wie hierin austauschbar verwendet, beziehen sich auf Polypeptide des Typ V Sekretionssystems von Bakterien, die eine Transporterdomäne enthalten, die sich, wie oben beschrieben, als eine porinartige Struktur, ein so genanntes β–Barrel, in die äußere Bakterienmembran hineinfaltet und durch die so entstandene Pore hindurch die N-terminal gebundene Passagierdomäne zur Oberfläche der Membran transloziert. Derartige Autotransporterproteine sind dem Fachmann bekannt und schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Ssp (P09489, S. marcescens; VERSION P09489.1 GI:131087), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens; VERSION BAA33455.1 GI:3688585), Ssp-h2 (BAA11383, S. marcescens; VERSION BAA11383.1 GI:1100764), PspA (BAA36466, P. fluorescens; VERSION BAA36466.1 GI:4115628), PspB (BAA36467, P. fluorescens; VERSION BAA36467.1 GI:4115629), Ssa1 (AAA80490, M. haemolytica; VERSION AAA80490.1 GI:507431), SphB1 (CAC44081‚ B. pertussis; VERSION CAC44081.1 GI:14715185), AspA/NalP (AAN71715, N. meningitides; VERSION AAN71715.1 GI:25140440), VacA (Q48247, H. pylori; VERSION Q48247.1 GI:2499107), AIDA-I (Q03155, E. coli; VERSION Q03155.1 GI:543788), IcsA (AAA26547, S. flexneri; VERSION AAA26547.1 GI:152804), MisL (AAD16954, S. enterica; VERSION AAD16954.1 GI:4324610), TibA (AAD41751‚ E. coli; VERSION AAD41751.1 GI:5305639), Ag43 (P39180, E, coli; VERSION P39180.3 GI:54040656), ShdA (AAD25110, S. enterica; VERSION AAD25110.2 GI:5107805), AutA (CAB89117, N. meningitidis; VERSION CAB89117.1 GI:7649687), Tsh (Q47692, E. coli; VERSION Q47692.1 GI:73622064), SepA (CAC05786, S. flexneri; VERSION CAC05786.1 GI:12329055), EspC (AAC44731, E. coli; VERSION AAC44731.1 GI:1764164), EspP (CAA66144, E. coli; VERSION CAA66144.1 GI:2244638), Pet (AAC26634, E. coli; VERSION AAC26634.1 GI:3095184), Pic (AAD23953, E. coli; VERSION AAD23953.1 GI:4574220), SigA (AAF67320, S. flexneri; VERSION AAF67320.1 GI:7682555), Sat (AAG30168, E. coli; VERSION AAG30168.1 GI:11096073), Vat (AAO21903, E. coli; VERSION AAO21903.1 GI:34099063), EpeA (AAL18821, E. coli; VERSION AAL18821.1 GI:16417609), EatA (CA179539, E. coli; VERSION CA179539.1 GI:83308567), Esp1 (CAC39286, E. coli; VERSION CAC39286.1 GI:14252931), EaaA (AAF63237, Enterobacterial phage P-EibA; VERSION AAF63237.1 GI:7532795), EaaC (AAF63038, Enterobacterial phage P-EibC; VERSION AAF63038.1 GI:7523532), Pertactin (P14283, B. pertussis; VERSION P14283.3 GI:464364), BrkA (AAA51646, B. pertussis; VERSION AAA51646.1 GI:562026), Tef (AAQ82668, B. pertussis; VERSION AAQ82668.1 GI:34809494), Vag8 (AAC31247, B. pertussis; VERSION AAC31247.1 GI:2997419), PmpD (084818, C. trachomatis; VERSION 084818.1 GI:14195037), Pmp20 (Q9Z812, C. pneumoniae; VERSION Q9Z812.2 GI:14195024), Pmp21 (Q9Z6U5, C. pneumoniae; VERSION Q9Z6U5.1 GI:14195023), IgA1 protease (CAA57857, N. meningitidis; VERSION CAA57857.1 GI:732874), App (CAC14670, N. meningitides; VERSION CAC14670.1 GI:11071863), IgA1 protease (P45386, H. influenzae; VERSION P45386.1 GI:1170517), Hap (P45387, H. influenzae; VERSION P45387.1 GI:1170167), rOmpA (P15921, R. rickettsii; VERSION P15921.1 GI:112710), rOmpB (Q53047, R. rickettsii; VERSION Q53047.1 GI:6685726), ApeE (AAC38796, S. enterica; VERSION AAC38796.1 GI:2896133), EstA (AAB61674, P. aeruginosa; VERSION AAB61674.1 GI:2218156), Lip-1 (P40601, P. luminescens; VERSION P40601.1 GI:729942), McaP (AAP97134, M. catarrhalis; VERSION AAP97134.1 GI:33150472), BabA (AAC38081, H. pylori; VERSION AAC38081.1 GI:2804778), SabA (AAD06240, H. pylori; VERSION AAD06240.1 GI:4155217), AlpA (CAB05386, H. pylori; VERSION CAB05386.1 GI:2344807), Aae (AAP21063, A. actinomycetemcomitans; VERSION AAP21063.1 GI:30230642), NanB (AAG35309, P. multocida; VERSION AAG35309.1 GI:11464736) und Varianten dieser Autotransporter. Für jedes der beispielhaften Autotransporterproteine sind in Klammern Beispiele für geeignete Genbank-Hinterlegungsnummern und Spezies angegeben, von denen der Autotransporter erhalten werden kann. Vorzugsweise ist der Autotransporter das AIDA-I-Protein aus E. coli oder eine Variante davon. Alle vorgenannten Proteine enthalten eine Transporterdomäne, die isoliert und dann als solche für andere Proteine von Interesse, insbesondere die hierin beschriebenen Enzyme und Faltungshelferproteine, verwendet werden kann. Die Transporterdomänen sind beispielsweise in den oben genannten Genbank-Einträgen explizit im Hinblick auf ihre Position beschrieben oder können vom Fachmann einfach durch Sequenzvergleiche identifiziert werden.
Varianten der oben angegebenen Autotransportersequenzen können beispielsweise durch Verändern der Aminosäuresequenz in den Schleifenstrukturen des β-Barrels, die nicht zu den Transmembranabschnitten gehören, erhalten werden. Optional können die für die Oberflächenschleifen kodierenden Nukleinsäuren vollständig deletiert werden. Außerdem können innerhalb der amphipathischen β-Faltblattstrukturen konservative Aminosäurenaustausche, d. h. der Austausch einer hydrophilen gegen eine andere hydrophile Aminosäure und/oder der Austausch einer hydrophoben gegen eine andere hydrophobe Aminosäure, vorgenommen werden. Vorzugsweise hat eine Variante auf Aminosäureebene eine Sequenzidentität von mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 98% mit der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz der Autotransporterdomäne, insbesondere im Bereich der β-Faltblattstrukturen.
Generell bezieht sich der Begriff ”Transporterdomäne eines Autotransporters/Autotransporterproteins”, wie hierin verwendet, auf eine Domäne eines Autotransporterproteins, die ausreichend ist um ein damit fusioniertes Passagierprotein zur äußeren Membran zu translozieren. Eine solche Domäne ist daher ein aktives Fragment eines Autotransporterproteins.
Die entsprechenden Expressionseinheiten umfassend die Nukleotidsequenzen, die für das Signalpeptid, das rekombinante Passagierprotein und die Transportdomäne kodieren, können mit einem beliebigen, ggf. auch nicht-natürlichen Promotor kombiniert werden, der die Expression reguliert. Üblicherweise werden starke, virale Promotoren eingesetzt. Der Fachmann ist mit solchen Promotoren und anderen zur Expressionsregulation geeigneten Sequenzen, wie z. B. Enhancern, die ebenfalls in den beschriebenen Konstrukten eingesetzt werden können und Verfahren zum funktionellen Verbinden dieser Sequenzen mit einem Nukleinsäuremolekül vertraut.
Die komplette Expressionseinheit aus Regulationssequenz, beispielsweise Promoter, und den Nukleotidsequenzen, die für Signalpeptid, rekombinantes Passagierprotein und Transportdomäne kodieren, kann Bestandteil eines Plasmids, beispielsweise eines Expressionsvektors sein.
Die Nukleinsäuremoleküle, die für ein Fusionsprotein aus einem Enzym wie oben definiert und eine Transportdomäne, oder ein Fusionsprotein aus einem Faltungshelferprotein wie oben definiert und eine Transportdomäne kodieren, können Bestandteil eines Plasmids, insbesondere eines Expressionsvektors sein und/oder können weitere Nukleotidsequenzen umfassen, die beispielsweise für regulatorische Regionen, u. a. Promoter, Enhancer, etc., Signalpeptide, wie oben definiert, und Linkersequenzen, wie oben definiert, kodieren. Ein bevorzugtes Nukleinsäuremolekül umfasst in 5'-3' Richtung Nukleotidsequenzen die für einen Promoter, ein Signalpeptid, das Passagierprotein, d. h. Enzym oder Faltungshelfer, Transmembranlinker und Transportdomäne eines Autotransporterproteins kodieren.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und/oder Fusionsproteine können in Zellen, insbesondere Bakterienzellen, vorzugsweise gram-negative Bakterienzellen, besonders bevorzugt E. coli Zellen enthalten sein. Diese Zellen präsentieren die oben beschriebenen Fusionsproteine, vorzugsweise das Enzym- und das Faltungshelferprotein-umfassende Fusionsprotein, auf der Zelloberfläche. Die Zellen können zum Zeitpunkt der Anwendung lebend, ruhend (d. h. sich nicht vermehrend, jedoch eingeschränkt stoffwechselaktiv) oder aber in nichtlebendiger Form vorliegen. Nichtlebendige Zellen sind bevorzugt, wenn eine Ausbreitung genveränderter Zellen für die beabsichtigte Anwendung unerwünscht ist.
Das Verfahren zur Ko-Expression der Fusionsproteine aus Enzym und Autotransporterprotein und Faltungshelferprotein und Autotransportprotein auf der Oberfläche einer Zelle umfasst das Kultivieren einer hierin beschriebenen rekombinanten Zelle unter Bedingungen, die zur Expression der Fusionsproteine geeignet sind. Derartige Bedingungen schließen üblicherweise die Inkubation der Zellen in einem Nährmedium und Induktion der Expression, sofern ein induzierbarer Promoter verwendet wird, ein. Anschließend können die Zellen gereinigt und für die weitere Verwendung prozessiert werden.
Zu den hierin beschriebenen Wasch- und Reinigungsmitteln zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche und/oder -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmitteln auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u. a. die Weichspüler gerechnet.
Die Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer den beschriebenen Enzymen im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist.
Zur Entfaltung der Wasch- oder Reinigungsleistung enthalten die Wasch- oder Reinigungsmittel vorzugsweise (ein) Tensid(e), besonders bevorzugt eine Mischung mehrerer Tenside aus unterschiedlichen Stoffklassen. Tenside können anionische, nichtionische, kationische oder amphotere Tenside sein und geeignete Tensidsysteme und -mischungen sind im Stand der Technik für die unterschiedlichsten Anwendungsformen bekannt.
Zusätzlich kann das Wasch- oder Reinigungsmittel weitere Inhaltsstoffe enthalten, die die anwendungstechnischen und/oder ästhetischen Eigenschaften des Wasch- oder Reinigungsmittels weiter verbessern. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthält das Wasch- oder Reinigungsmittel vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe der Gerüststoffe, Bleichmittel, Elektrolyte, nichtwässrigen Lösungsmittel, pH-Stellmittel, Parfüme, Parfümträger, Fluoreszenzmittel, Farbstoffe, Hydrotrope, Schauminhibitoren, Silikonöle, Antiredepositionsmittel, Vergrauungsinhibitoren, Einlaufverhinderer, Knitterschutzmittel, Farbübertragungsinhibitoren, antimikrobiellen Wirkstoffe, Germizide, Fungizide, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Korrosionsinhibitoren, Antistatika, Bittermittel, Bügelhilfsmittel, Phobier- und Imprägniermittel, Quell- und Schiebefestmittel, weichmachenden Komponenten sowie UV-Absorber.
Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für den Einsatz von Wasch- und Reinigungsmitteln in Bereichen von 10°C über 40°C und 60°C bis hin zu 95°C bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt, insbesondere derart, dass sich Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung ergeben. Besonders bevorzugt sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 10°C und 60°C vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittel zur Reinigung von Gegenständen, insbesondere Textilien oder harten Oberflächen, sowie Verfahren zur Reinigung von Gegenständen, insbesondere Textilien oder harten Oberflächen, die das in Kontakt bringen der Gegenstände mit den hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmitteln einschließen.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf die erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsverfahren sowie die erfindungsgemäßen Verwendungen anwendbar und ungekehrt. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass die Offenbarung im Kontext der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung sowie alle beschriebenen Verfahren gilt.
Beispiele
Beispiel 1: Bereitstellung des Autodisplay-Systems mit Lipase
Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen
Für die Expression der Autotransporter-Fusionsproteine wurden die Escherichia coli Stämme UT5600(DE3) [F^–, ara-14, leuB6, secA6, lacY1, proC14, tsx-67, Δ(ompT-fepC)266, entA403, trpE38, rfbD1, rpsL109(Str^r), xyl-5, mtl-1, thi-1, λ(DE3)] und E. coli BL21(DE3) [B, F^–, dcm, ompT, lon, hsdS(rB^– mB^–), gal, λ(DE3)] verwendet. E. coli TOP10 (F- mcrA Δ(mrrhsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZDM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu) 7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG) und der Vektor pCR^®4-TOPO^® wurden für die Umklonierung der Produkte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem TOPO-TA Klonierungskit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Die zielgerichtete Mutagenese der Restriktionsschnittstellen für XhoI und KpnI in den Genen von Interesse wurde unter Verwendung des QuikChange Site Directed Mutagenesis Kits (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) und entsprechenden Mutagenese-Primern durchgeführt. Die Konstruktion des Plasmids pCD003, das den AIDA-I Autotransporter kodiert wurde bereits in Detzel et al. beschrieben (Detzel et al., ChemCatChem 2011, 3: 719–725). Das Plasmid pBL001 ist ein Derivat von pCOLA-Duet^TM-1, in dem die zweite MCS (multiple cloning site) entfernt und die Autotransporter-Expressionskassette unter Verwendung der NcoI und BlpI Restriktionsschnittstellen eingefügt wurde. Das Plasmid pHes8, das die Lipase und Foldase von Burkholderia cepacia kodiert, ist ein Derivat von pHes12 wie von Quyen et al. beschrieben (Quyen et al., Applied and environmental microbiology 1999, 65: 787–794). Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Lipase (lipA) (SEQ ID NO:1 bzw. 2) und Foldase (lipB) (SEQ ID NO:3 bzw. 4) von Burkholderia cepacia sind in SEQ ID Nos. 1–4 angegeben. Die Bakterien wurden bei 37°C in LB-Medium mit Carbenicillin (100 mg L^–1) bzw. Kanamycin (30 mg L^–1) oder beiden kultiviert. Für die Ko-Expression der Lipase und Foldase wurde eine Kultur des Stammes E. coli BL21(DE3) pAT-LipBc, der bereits das Plasmid, das für das Lipase-Autotransporter Fusionprotein kodiert, angezogen, um im nächsten Schritt elektrokompetente Zellen gemäß einem modifizierten Protokoll von Sambrook et al. herzustellen (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). Das Plasmid pAT-FoldBc wurde dann mittels Elektroporation in ein Aliquot dieser Zellen transfiziert um den Stamm BL21(DE3)pAT-LiFoBc, der beide Plasmide enthält, zu ergeben.
Rekombinante DNA Techniken
Für die Konstruktion des Plasmids pAT-LipBc, das das Gen, das für das Lipase-Fusionsprotein LipBc-FP kodiert, enthält, wurde das Lipasegen mittels PCR amplifiziert. Als Template wurde das Plasmid pHes8 und als Primer EK009 (CGCTCGAGGCGAGCGCGCCCGCCGAC; SEQ ID NO:5) und EK010 (GGTACCCACGCCCGCGAGCTTCAGCCG; SEQ ID NO:6) eingesetzt. Um die Klonierung des Lipase PCR-Fragments in die Autotransporterkassette zu ermöglichen, wurde mittels PCR eine XhoI-Schnittstelle am 5'-Ende und eine KpnI-Schnittstelle am 3'-Ende des Lipase PCR-Fragments eingefügt.
Für die Konstruktion des Plasmids pAT-FoldBc, das das Gen, das für das Foldase-Fusionsprotein FoldBc-FP kodiert, enthält, wurde das Foldasegen mittels PCR amplifiziert, wobei wiederum das Plasmid pHes8 als Template für die Primer CD004 (CTCGAGCCGTCGTCGCTGGCCGGCTCC; SEQ ID NO:7) and CD005 (GGTACCCTGCGCGCTGCCCGCGCCGCG; SEQ ID NO:8) eingesetzt wurde. Analog zu dem Lipase PCR-Fragment wurden eine 5'-XhoI- und eine 3'-KpnI-Restriktionsschnittstelle mittels PCR eingefügt.
Beide PCR-Produkte wurden jeweils in den Vektor pCR^®4-TOPO^® kloniert und dann einer zielgerichteten PCR-Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers Stratagene unterzogen, um unerwünschte Restriktionsschnittstellen innerhalb der Gene zu entfernen. Die mutierten Plasmide wurden dann mit XhoI und KpnI geschnitten und das Restriktionsfragment enthaltend das Lipasegen wurde in das pET-Derivat pCD003 (Detzel et al., supra), das mit denselben Enzymen geschnitten war, kloniert. Das Restriktionsfragment, das das Foldasegen enthielt, wurde in das mit denselben Enzymen geschnittene pCOLA-Duet^TM-1–Derivat pBL001 kloniert. Die beiden Ligationsschritte ergaben eine Fusion der Lipase bzw. Foldase im Leserahmen mit den Autotransporterdomänen unter Kontrolle eines T7/lac-Promotors.
Die Plasmid DNA Präparation, der Restriktionsverdau, die Ligation und die DNA Elektrophorese und Transformation wurden gemäß Standardprotokollen (Sambrook et al., supra) durchgeführt. Die Gelextraktion der verdauten Fragmente wurde mittels eines Gelextraktionskits von Qiagen durchgeführt.
Präparation der äußeren Membran
E. coli Zellen wurden über Nacht kultiviert und 1 ml der Kultur verwendet um LB Medium (40 ml) anzuimpfen. Die Zellen wurden unter kräftigem Schütteln bei 37°C (200 rpm) für ungefähr 2 h kultiviert bis eine optische Dichte OD₅₇₈ von 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde dann in zwei Aliquots aufgeteilt und die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) zu einem der Aliquots induziert. Die Kulturen wurden dann wiederum unter Schütteln (200 rpm) bei 30°C für 1 h inkubiert. Die Induktion wurde durch Inkubation der Zellen auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Nach dem Ernten und Waschen der Zellen mit Tris-HCl (0.2 M, pH 8) wurde eine Differential-Zelltrennung gemäß dem Verfahren von Hantke (Hantke, Mol Gen Genet 1981, 182: 288–292) modifiziert nach Schultheiss et al. (Schultheiss et al., J Mol Catal B Enzym 2002, 18: 89–97) durchgeführt. Die Proteine der äußeren Membran wurden gewaschen, in Wasser resuspendiert und für SDS-PAGE vorbereitet.
Für die Behandlung der gesamten Zellen mit Protease wurden E. coli Zellen geerntet, gewaschen und in 1 ml Tris-HCl (0.2 M, pH 8) resuspendiert. Proteinase K wurde mit einer Endkonzentration zwischen 0,2 mg mL^–1 und 0,5 mg mL^–1 zugegeben und die Zellen für 1 h bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurden durch zweimaliges Waschen der Zellen mit Tris-HCl (0.2 M, pH 8) enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS) gestoppt und die Proteine der äußeren Membran wie oben beschrieben präpariert.
Um die äußeren Membranen, die für Aktivitäts-Assays eingesetzt wurden, zu erhalten, wurden die Zellen nicht mit Proteinase K behandelt, sondern das präparierte Pellet der Membranproteine in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert und in einer 1:10 Verdünnung für die Aktivitätstests verwendet.
Bestimmung der Lipaseaktivität
Um die lipolytische Aktivität der Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren zu bestimmten, wurden photometrische Messungen gemäß einem modifizierten Protokoll nach Winkler und Stuckmann mit Nitrophenylpalmitat als Substrat durchgeführt (Winkler & Stuckmann, J Bacteriol 1979, 138: 663–670). Die Zellen, die in den Messungen verwendet wurden, wurden standardmäßig in LB-Medium kultiviert bis eine optische Dichte von 1,0 erreicht war. Die Induktion der Proteinexpression wurde durch Zugabe von IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM gestartet und die Zellen für eine weitere Stunde bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Die Zellen wurden dann mittels Zentrifugation geerntet und zweimal in Kaliumphosphatpuffer, 50 mM, pH 7,4, gewaschen und in diesem Puffer bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die verwendeten Zellen koexprimieren die Lipase und Foldase und die Wirtszellen E. coli BL21(DE3) ohne Lipase/Foldase wurden als Kontrolle verwendet. Das Substrat p-Nitrophenylpalmitat wurde in Wasser unter ständigem Rühren bis zu einer Endkonzentration von 0,26 mM suspendiert. Die Aktivitätsmessung wurde durch Zugabe der Zellen zu dieser Substratsuspension bis zu einer OD₅₇₈ von 1 gestartet. Identische Aktivitätsmessungen wurden mit Präparationen der äußeren Membran von E. coli Zellen, die Lipase und Foldase koexprimieren, durchgeführt. Die lipolytische Produktion von gelb gefärbtem Nitrophenolat bei Raumtemperaturwurde mit einem Mikroplatten-Auslesegerät (Mithras LB940, Berthold, Bad Wildbach, Germany) bei 405 nm bestimmt. Der erhaltene Anstieg in der Absorption wurde verwendet, um die enzymatische Aktivität gemäß Lambert-Beer zu berechnen (ε_nitrophenol = 17,000 L mol^–1 cm^–1, d = 0,57 cm Pfadlängenkorrektur für die Schichtdicke von 200 μL Testvolumen in einem Well). Eine Einheit wurde als die Menge von Enzym definiert, die die Freisetzung von 1 μmol p-Nitrophenol pro Minute ergab (Quyen et al., supra). Die Ergebnisse zeigten, dass Ganzzell-Biokatalysatoren und äußere Membran-Präparationen, die sowohl Lipase als auch Foldase exprimieren, eine gute lipolytische Aktivität zeigten, wohingegen Mischungen von Zellen und Membranpräparaten, die jeweils Lipase oder Foldase separat exprimieren, nur geringe lipolytische Aktivität zeigten. Aus diesem Grund wurden im Folgenden Zellen oder Membranpräparate eingesetzt, in denen das Enzym und das zugehörige Faltungshelferprotein koexprimiert wurden.
Beispiel 2: Waschtests mit Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren E. coli BL21(DE3) pAT-LipBc
Die Aktivität der Lipase wurde auf fünf unterschiedlichen, standardisierten, lipase-sensitiven Anschmutzungen getestet. Die Anschmutzung enthielt entweder Biskin^® (Peter Kölln KGaA, Elmshorn, DE), Butaris^® (DFF Dairy Fine Food GmbH, Ratzeburg, DE), Butteröl, eine Mischung aus Ruß und Mineralöl (C01, Center for Test Materials, Vlaardingen, NL) bzw. eine Mischung aus Hauttalg und Pigment (20D, wfk Testgewebe GmbH, Krefeld, DE). Die getesteten Lipasen waren a) 0,0746 mg aktive Lipase Lipex^® 100 L pro Testgefäß, b) freie Lipase von B. cepacia, c) die hierin beschriebenen Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren und d) ein Membranpräparat davon. Um eine Vergleichbarkeit herzustellen, wurden alle Lipasen in denselben Mengen im Hinblick auf ihre enzymatische Aktivität eingesetzt. Der Waschvorgang wurde in einem Linitest Plus Gerät (Atlas, Rock Hill, SC, USA) durchgeführt. Die Waschlauge wurde mit 3,53 g eines enzymfreien, ansonsten handelsüblichen europäischen Premium-Waschmittels in Wasser (16°dH) gepuffert mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 angesetzt. Der Waschvorgang wurde in einem Gesamtvolumen von 170 ml für eine Stunde bei 40°C und 45 rpm durchgeführt. Um den Mechanismus eines Standardwaschvorgangs zu simulieren, wurden 10 Edelstahlkugeln von 5 mm Durchmesser zugegeben und mit Testgewebe auf eine Gesamtmenge von 14,3 g Textilgewicht aufgefüllt. Nach dem Waschvorgang wurde das Testgewebe dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur im Dunkeln getrocknet. Eine Farbmessung der Anschmutzung wurde mit einem Minolta Kolorimeter (Konica-Minolta, München-Neuperlach, Deutschland), kalibriert gegen einen Herstellerstandard, unter Anwendung von CIE L*a*b*, D65/10°/SCI Einstellungen, durchgeführt. Jede Anschmutzung wurde dreimal gemessen und der durchschnittliche L* Wert bestimmt. Die Leistung wurde als Differenz des Werts L* der enzymhaltigen Probe gegenüber der enzymfreien Kontrolle bestimmt und ist in Prozent der Leistung des Standards (a), der auf 100% gesetzt wurde, angegeben.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, wobei die gezeigten Werte Durchschnittswerte aus drei Messungen sind und zusätzlich Standardabweichungen angegeben sind. (a) Weiße Balken: Standard, (b) hellgraue Balken: freie Lipase aus B. cepacia, (c) dunkelgraue Balken: die erfindungsgemäßen, hierin beschriebenen Lipase Ganzzell-Katalysatoren, (d) schraffierte Balken: Membranpräparationen der Zellen.
Das Ergebnis belegt die überraschend gleichwertige Reinigungsleistung des immobilisierten Enzyms.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Apigny & Jaeger, Biochem. J. (1999) 343, 177–183 [0016]
Detzel et al., ChemCatChem 2011, 3: 719–725 [0051]
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Winkler & Stuckmann, J Bacteriol 1979, 138: 663–670 [0059]
Quyen et al., [0059]

Claims

Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend mindestens ein Enzym, insbesondere mindestens ein hydrolytisches Enzym, bevorzugt eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase, Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt eine Lipase, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon und mindestens ein Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym, bevorzugt eine Foldase, oder ein aktives Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym oder enzymatisch aktive Fragment davon und das mindestens eine Faltungshelferprotein oder aktive Fragment davon jeweils in Form eines Fusionsproteins, das die Transporterdomäne eines Autotransporterproteins als Fusionspartner umfasst, gemeinsam auf der Oberfläche einer Zelle, insbesondere einem einzelligen Mikroorganismus, oder einer Membranfraktion einer Zelle, insbesondere der Membranfraktion eines einzelligen Mikroorganismus, immobilisiert sind.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel das mindestens eine Enzym in einer Menge von 1 × 10^–8 bis 5 Gew.-% Prozent an aktivem Protein, insbesondere 0,001 bis 3 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1,5 Gew.-%, noch bevorzugter von 0,05 bis 1,25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel ferner mindestens einen weiteren Bestandteil, vorzugsweise mindestens zwei weitere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, vorzugsweise eine Mischung mehrerer verschiedener Tenside, Gerüststoffen, Bleichmittel, Elektrolyten, nichtwässrigen Lösungsmitteln, pH-Stellmitteln, Parfümen, Parfümträgern, Fluoreszenzmitteln, Farbstoffen, Hydrotropen, Schauminhibitoren, Silikonölen, Antiredepositionsmitteln, Vergrauungsinhibitoren, Einlaufverhinderern, Knitterschutzmitteln, Farbübertragungsinhibitoren, antimikrobiellen Wirkstoffen, Germiziden, Fungiziden, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Korrosionsinhibitoren, Antistatika, Bittermitteln, Bügelhilfsmitteln, Phobier- und Imprägniermitteln, Quell- und Schiebefestmitteln, weichmachenden Komponenten sowie UV-Absorbern enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym eine Lipase der Familie 1.1 oder 1.2, insbesondere eine Lipase aus einem Bakterium der Gattung Burkholderia oder Pseudomonas, bevorzugt die Lipase aus Burkholderia cepacia, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym eine lipase-spezifische Foldase (Lif), insbesondere die lipase-spezifische Foldase Lif aus Burkholderia cepacia oder ein aktives Fragment davon ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Transporterdomäne eines Autotransporterproteins ausgewählt wird aus den Transporterdomänen der Autotransportproteine der Gruppe bestehend aus: Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1, SphB1, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, EspI, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21, AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon, vorzugsweise AIDA-I und Varianten davon.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle oder die Membranfraktion einer Zelle eine Bakterienzelle, insbesondere eine gramnegative Bakterienzelle, vorzugsweise eine Escherichia coli Zelle, oder eine Membranfraktion einer solchen Zelle ist.
Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen.