WO2015018884A1 - Wasch- oder reinigungsmittel mit immobilisierter enzymkomponente - Google Patents

Wasch- oder reinigungsmittel mit immobilisierter enzymkomponente Download PDF

Info

Publication number
WO2015018884A1
WO2015018884A1 PCT/EP2014/066974 EP2014066974W WO2015018884A1 WO 2015018884 A1 WO2015018884 A1 WO 2015018884A1 EP 2014066974 W EP2014066974 W EP 2014066974W WO 2015018884 A1 WO2015018884 A1 WO 2015018884A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
washing
enzyme
lipase
protein
cleaning agent
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/066974
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Weber
Timothy O'connell
Hendrik Hellmuth
Christian Detzel
Eva Kranen
Joachim Jose
Original Assignee
Henkel Ag & Co. Kgaa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel Ag & Co. Kgaa filed Critical Henkel Ag & Co. Kgaa
Publication of WO2015018884A1 publication Critical patent/WO2015018884A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38627—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing lipase

Definitions

  • the present application is directed to a washing or cleaning agent containing an enzyme, in particular a hydrolytic enzyme, wherein the enzyme is immobilized on a cell or the membrane fraction of a cell, and the use of such an enzyme in detergents or cleaners.
  • an enzyme in particular a hydrolytic enzyme, wherein the enzyme is immobilized on a cell or the membrane fraction of a cell, and the use of such an enzyme in detergents or cleaners.
  • enzymes in detergents and cleaners are well established in the art. They serve to extend the range of services of the funds concerned according to their specific activities. These include in particular hydrolytic enzymes such as proteases, amylases, lipases and cellulases. The first three hydrolyze proteins, starches and fats and thus contribute directly to soil removal. Cellulases are used in particular because of their tissue effect. Another group of washing and
  • Detergent enzymes are oxidative enzymes, in particular oxidases, which may be present in the
  • Interaction with other components preferably serves to bleach stains or to produce the bleaching agents in situ.
  • further enzymes are constantly being made available for use in detergents and cleaners in order to be able to optimally address particular soiling, such as pectinases, ⁇ -glucanases, mannanases or other hemicellulases for the hydrolysis, in particular more specifically vegetable polymers.
  • Reuse are separable and, in the case of detergents, can adhere to the textile to be cleaned.
  • This adhesion to the textile caused by the residual activity of the enzyme a consumer perceived as unpleasant odor, which can be prevented so far only by limiting the reactivity or the accepted substrate spectrum, such as lipases.
  • the present invention is therefore based on the object to provide a detergent or cleaning agent containing an enzyme immobilized on particles, wherein the immobilized enzyme has an enzyme activity comparable to the corresponding free enzyme.
  • immobilization occurs directly during the production of the enzyme.
  • the present invention is therefore directed to a washing or
  • Detergent containing at least one enzyme in particular at least one hydrolytic enzyme, preferably a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, ⁇ -glucosidase, carrageenase or lipase, more preferably a lipase, or an enzymatically active fragment thereof and at least one folding helper protein for the at least one enzyme, preferably a foldase or an active fragment thereof, wherein the at least one enzyme or enzymatically active fragment thereof and the at least one folding helper protein or active fragment thereof each in the form of a fusion protein comprising a transporter domain of an autotransporter protein Fusion partner comprises, together on the surface of a cell, in particular a unicellular microorganism, or a
  • Membrane fraction of a cell in particular the membrane fraction of a unicellular
  • Microorganism are immobilized.
  • washing or cleaning agents described herein may contain recombinant cells as a whole or membrane fractions thereof, wherein the recombinant cell, in particular a recombinant microorganism, preferably a bacterial cell, at least one
  • nucleic acid molecule comprising:
  • hydrolytic enzyme preferably a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, ⁇ -glucosidase, carrageenase or lipase, more preferably a lipase, or an enzymatically active fragment thereof and the transporter domain of an auto transporter protein encodes; and
  • washing or cleaning agent as described herein for cleaning textiles and / or hard surfaces is also an object of the present invention.
  • the nucleic acid molecules described above encode fusion proteins.
  • These fusion proteins include the enzyme or folding helper protein, which is usually N-terminally located, and a transporter domain of an auto transporter protein, which is usually located C-terminally. In between, there may be a linker sequence, which will be described in detail below.
  • the immobilized enzymes described herein are capable of replacing the free enzymes commonly used in detergents without significantly reducing the cleaning performance on enzyme sensitive soils.
  • Immobilization to cells or cell membrane fractions allows for easy mechanical separation and, if desired, recovery and thus helps to prevent the attachment of the enzymes to the objects to be cleaned.
  • Another advantage of the invention results from the fact that several enzyme molecules are anchored on the cell surface. Thereby results in a cooperative effect. When an enzyme molecule finds a substrate, the entire particle must remain in place, and so the other enzymes on the cell surface are also brought to the substrate.
  • the agent described herein comprises at least one enzyme, but may also comprise multiple enzymes.
  • all the enzymes established in the prior art for this purpose can be used in this regard.
  • it is one or more enzymes which can develop a catalytic activity in a washing or cleaning agent, in particular a protease, amylase, lipase, cellulase, hemicellulase, mannanase, pectin-splitting enzyme, tannase, xylanase, xanthanase, ⁇ - Glucosidase, carrageenase, perhydrolase, oxidase,
  • Oxidoreductase and mixtures thereof are Oxidoreductase and mixtures thereof.
  • Preferred hydrolytic enzymes in the sense of
  • Component (a) comprises in particular proteases, amylases, in particular ⁇ -amylases, cellulases, lipases, hemicellulases, in particular pectinases, mannanases, ⁇ -glucanases, and mixtures thereof.
  • proteases, amylases and / or lipases and mixtures thereof Particular preference is given to proteases, amylases and / or lipases and mixtures thereof, and very particular preference is given to lipases.
  • These enzymes are basically of natural origin; Starting from the natural molecules, improved variants are available for use in detergents or cleaning agents, which are preferably used accordingly.
  • Examples of useful lipases Triacylglycerolacylhydrolasen, EC 3.1.1.3 or cutinases, which are included in particular because of their triglyceride-cleaving activities, but also to generate from suitable precursors in situ peracids are those originally from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) available or the corresponding further developed lipases, in particular those with the amino acid exchange D96L. They are sold for example by the company Novozymes under the trade names Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® and Lipex®.
  • the cutinases can be used, which were originally isolated from Fusarium solani pisi and Humicola insolens.
  • Lipases which are likewise useful are sold by Amano under the names Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B® or Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillus sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® and Lipase AML®.
  • the lipases or cutinases can be used, the initial enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii.
  • Another important Lipases which are likewise useful are sold by Amano under the names Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B® or Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillus sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-
  • Lipases from the family 1.1 or I.2 of lipases accordinging to Apigny & Jaeger, Biochem. J. (1999) 343, 177-183), in particular a lipase from a bacterium of the genus Burkholderia or Pseudomonas are used.
  • a specific example of a suitable lipase is the Lipase lipA from Burkholderia cepacia (SEQ ID NO: 2; GenBank Accession No. FJ638612, version FJ638612.1 GL222692183, date 22 February 2013).
  • subtilisin type examples thereof are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and the enzymes thermitase, proteinase K and the subtilases, but not the subtilisins in the narrower sense Proteases TW3 and TW7.
  • subtilisin Carlsberg is available in a further developed form under the trade name Alcalase® from Novozymes A / S, Bagsvaerd, Denmark.
  • subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes. From the protease from Bacillus lentus DSM 5483 derived under the name BLAP® protease variants derived. Further useful proteases are, for example, those under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® and Ovozyme® from Novozymes, which are available under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® and Properase® from the company Genencor, which was sold under the
  • amylases examples include the Bacillus licheniformis ⁇ -amylases, from B.
  • amyloliquefaciens or from B. stearothermophilus and their improved for use in detergents or cleaners further developments.
  • the B. licheniformis enzyme is available from Novozymes under the name Termamyl® and from Genencor under the name Purastar®ST. Further development products of this ⁇ -amylase are available from Novozymes under the trade name Duramyl® and Termamy Dultra, from Genencor under the name Purastar®OxAm and from Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, as Keistase®.
  • B. amyloliquefaciens ⁇ -amylase is sold by Novozymes under the name BAN®, and variants derived from B. a-amylase.
  • amylase-LT® and Stainzyme® or Stainzyme ultra® or Stainzyme plus® are, for example, the amylase-LT® and Stainzyme® or Stainzyme ultra® or Stainzyme plus®, the latter also from the company Novozymes.
  • variants of these enzymes obtainable by point mutations can be used according to the invention.
  • amylases which can be synthesized according to the invention are preferably ⁇ -amylases.
  • cellulases may be present as pure enzymes, as enzyme preparations or in the form of mixtures in which the individual components advantageously complement each other in terms of their various performance aspects.
  • These performance aspects include in particular the contributions of the cellulase to the primary washing performance of the composition (cleaning performance), to the secondary washing performance of the composition (anti-redeposition effect or graying inhibition), to softening (tissue effect) or to the exercise of a "stone-washed" effect.
  • cleaning performance cleaning performance
  • anti-redeposition effect or graying inhibition anti-redeposition effect or graying inhibition
  • tissue effect to the exercise of a "stone-washed” effect.
  • Genencor detergent cellulase L and lndiAge®Neutra. Also variants of these enzymes obtainable by point mutations can be used according to the invention.
  • hemicellulases include, for example, mannanases, xanthan lyases, xanthanases, xyloglucanases, xylanases,
  • Pullulanases pectin-cleaving enzymes and ⁇ -glucanases.
  • the ⁇ -glucanase obtained from Bacillus subtilis is available under the name Cereflo® from Novozymes.
  • Hemicellulases which are particularly preferred according to the invention are mannanases which are sold, for example, under the trade names Mannaway® by the company Novozymes or Purabrite® by the company Genencor.
  • pectin-splitting enzymes are also counted in the context of the present invention enzymes with the names pectinase, Pectate lyase, pectin esterase, pectin methethoxylase, pectin methoxylase, pectin methyl esterase, pectase, pectin methyl esterase, pectin esterase, pectin-pectin hydrolase, pectin-polymerase, endopolygalacturonase, pectolase, pectin hydrolase, pectin-polygalacturonase, endo-polygalacturonase, poly-a-1, 4-galacturonide glycanohydrolase, endogalacturonase, endo-D galacturonase, galacturan 1, 4-a-galacturonidase, exopolygalacturonase, poly (galacturonate) hydrolase, exo
  • enzymes suitable for this purpose are, for example, under the name Gamanase®, Pektinex AR®, X-Pect® or Pectaway® from Novozymes, under the name Rohapect UF®, Rohapect TPL®, Rohapect PTE100®, Rohapect MPE®, Rohapect MA plus HC, Rohapect DA12L®, Rohapect 10L®, Rohapect B1 L® from AB Enzymes, and available under the name Pyrolase® from Diversa Corp., San Diego, CA, USA.
  • oxidoreductases for example oxidases, oxygenases, catalases (which react as peroxidase at low H2O2 concentrations), peroxidases, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin-, glucose-, can also be used in the detergents or cleaners. or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases,
  • Suitable commercial products are Denilite® 1 and 2 from Novozymes or Gluzyme® mono BG from Novozymes.
  • the folding helper proteins described herein are chaperones which cause or assist the correct folding of the enzymes described herein and are therefore selected depending on the enzyme employed.
  • the associated chaperones are known in the art.
  • the folding assistant proteins used are preferably foldases. In the case where the enzymes used are lipases, the folding helper proteins are the corresponding lipase-specific foldases.
  • the lipase lipB can be used for the lipase lipA from Burkholderia cepacia (SEQ ID NO: 4, GenBank Accession No. FJ638612, version FJ638612.1 EI: 222692183, date 22 February 2013).
  • the Lipase lipA from Burkholderia cepacia (nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, amino acid sequence SEQ ID NO: 2) is used as lipase and the foldase lipB from Burkholderia cepacia as folding assistant protein
  • fragments as used herein Related to proteins or polypeptides refers to proteins / polypeptides that are truncated from their native form by N- and / or C-terminal degradation of amino acids. Such fragments are "active” in the sense that they have at least part of the native form protein activity, preferably at least 50%, more preferably 60-90%, even more preferably the same or higher activity.
  • variant as used herein comprises nucleotide or amino acid sequences identical to 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 or 99% to the reference sequence.
  • variants which have one or more, preferably up to 5, point mutations.
  • Such variants may cause increased enzyme activity, broader or altered substrate specificity or increased stability.
  • Corresponding variants can result, for example, from those mutations which serve to remove protease cleavage sites.
  • the Foldase NpB preferably uses an N-terminally truncated fragment.
  • This fragment lacks the 70 N-terminal amino acids that serve to anchor the native protein in the membrane but are not required for chaperone function. Since this membrane anchoring sequence could interfere with the autodisplay system used, it was removed in the constructs described herein. Similarly, all other proteins involved herein can be modified.
  • Enzymes are given as formulated enzyme products in detergents or cleaners consisting of active enzyme protein as well as other ingredients.
  • the amount of enzyme added is therefore given as the "amount of enzyme in active protein", so that it is made clear that the indications of the amount of enzyme added relate to the active enzyme protein and not to the formulated enzyme product
  • the stated percentages by weight are based on the total weight of the wash - or cleaning agent.
  • the detergents or cleaners of the present invention comprise the at least one enzyme in an amount of 1 ⁇ 10 -8 to 5 wt.% Of active protein, in particular 0.001 to 3 wt.%, Preferably of 0.01 to 1, 5 wt .-%, more preferably from 0.05 to 1, 25 wt .-% based on the total weight of the washing or cleaning agent, wherein each immobilized enzyme contained can be taken in the stated amounts taken alone.
  • the (active) protein concentration can be determined by known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method.
  • the active protein can be determined via the biochemical activity, for a lipase, for example, via the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate or via titration of the hydrolysis of olive oil in the pH stat. These methods are well known to those skilled in the art of the particular enzyme.
  • the washing or cleaning agent may contain further enzymes, which may also be selected from those mentioned above, in free form, ie not immobilized.
  • Autodisplay is a method to present recombinant proteins to the cell surface, especially the surface of bacteria.
  • Autodisplay refers in this context to an expression system based on the secretory mechanism of the protein family of car transporters belonging to the type V
  • autotransporter proteins are synthesized as precursor proteins that fulfill all the structural requirements for transport to the cell surface, i. they are synthesized with an N-terminal signal peptide, which is typical of the See pathway, which allows traversing the inner membrane.
  • N-terminal signal peptide which is typical of the See pathway, which allows traversing the inner membrane.
  • Passenger protein encodes in-frame between the coding for the signal peptide and for the translocating domain of the autodisplay vector nucleotide sequence using standard genetic engineering methods. Preferably, between the
  • a peptide linker sequence which serves as a transmembrane linker and is required for unrestricted access to the surface. This can also be done by inserting the corresponding nucleotide sequence encoding the linker sequence between the sequence coding for the recombinant protein and that for the transporter domain of the
  • Car transporter coding sequence can be inserted.
  • transmembrane linker refers to a flexible one
  • this linker sequence may also include a protease cleavage site to facilitate cleavage of the recombinant protein.
  • the signal peptide can be obtained, for example, from a subunit of the cholera toxin, but is not limited thereto. In principle, all signal peptides that mediate the translocation through the inner bacterial membrane into the periplasm or into the outer membrane can be used. Usually, such signal peptides are located at the N-terminus of the fusion protein. The signal peptide is preferably cleaved off before translocation through the membrane.
  • the passenger protein is an enzyme or a folding helper protein as defined above.
  • the passenger protein is expressed as a recombinant fusion protein with the transport domain of an auto-transporter and translocated to the cell surface by the pore generated by the transport domain.
  • transporter domain of an auto transporter protein or “transporter domains of an autotransporter” as used interchangeably herein refer to polypeptides of the type V secretion system of bacteria containing a transporter domain which, as described above, is a porin-like structure ß-barrel, in the outer
  • Autotransporter proteins are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, Ssp (P09489, S. marcescens; VERSION P09489.1 EI: 131087), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens; VERSION BAA33455.1 EI: 3688585). , Ssp-h2 (BAA1 1383, S. marcescens;
  • Gl 41, 15629
  • Ssa1 AAA80490, M. haemolytica, VERSION AAA80490.1 EI: 507431
  • SphB1 AC44081, B. pertussis, VERSION CAC44081.1 EI: 14715185
  • AspA / NalP AAN71715, N. meningitides; VERSION AAN71715.1 Eq: 25140440), VacA (Q48247, H. pylori, VERSION Q48247.1 EI: 2499107), AIDA-I (Q03155, E.
  • E1A (CAI79539, E. coli; VERSION CAI79539.1 EI: 83308567), Espl (CAC39286, E. coli; VERSION CAC39286.1 EI: 14252931), EaaA
  • AAD AAP21063, A. actinomycetemcomitans; VERSION AAP21063.1
  • the auto-transporter is the AIDA-I protein from E. coli or a variant thereof. All the aforementioned proteins contain one
  • Transporter domain which can be isolated and then used as such for other proteins of interest, in particular the enzymes and folding helper proteins described herein.
  • the transporter domains are explicitly described, for example, in the abovementioned gene bank entries with regard to their position or can be identified by the skilled person simply by sequence comparisons.
  • Variants of the above-described auto transporter sequences can be obtained, for example, by altering the amino acid sequence in the loop structures of the ⁇ -barrel that are not part of the transmembrane segments.
  • those for the transporter domains are explicitly described, for example, in the abovementioned gene bank entries with regard to their position or can be identified by the skilled person simply by sequence comparisons.
  • Variants of the above-described auto transporter sequences can be obtained, for example, by altering the amino acid sequence in the loop structures of the ⁇ -barrel that are not part of the transmembrane segments.
  • those for the transporter domains are explicitly described, for example, in the abovementioned gene bank entries
  • nucleic acids are completely deleted. Moreover, within the amphipathic ⁇ -sheet structures, conservative amino acid exchanges, i. H. the replacement of a hydrophilic against another hydrophilic amino acid and / or the
  • a variant at the amino acid level has a sequence identity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% with the corresponding naturally occurring sequence of the autotransporter domain, especially in the region of ⁇ -sheet structures.
  • Car transporter protein sufficient to translocate a fused passenger protein to the outer membrane. Such a domain is therefore an active fragment of an auto transporter protein.
  • the corresponding expression units comprising the nucleotide sequences coding for the signal peptide, the recombinant passenger protein and the transport domain can be combined with any, possibly also non-natural, promoter which regulates the expression.
  • promoter usually, strong, viral promoters are used.
  • the person skilled in the art will be familiar with such promoters and other sequences suitable for expression regulation, e.g. Enhancers that can also be used in the described constructs and trusts procedures for the functional connection of these sequences with a nucleic acid molecule.
  • the complete expression unit of regulatory sequence for example promoters, and the nucleotide sequences encoding signal peptide, recombinant passenger protein and transport domain may be part of a plasmid, for example an expression vector.
  • nucleic acid molecules which encode a fusion protein of an enzyme as defined above and a transport domain, or a fusion protein from a folding helper protein as defined above and a transport domain can be part of a plasmid, in particular a
  • a preferred nucleic acid molecule comprises in 5'-3 'direction nucleotide sequences that for a promoter, a signal peptide, the Passenger protein, ie encode enzyme or folding helper, transmembrane linker and transport domain of an auto transporter protein.
  • the nucleic acid molecules and / or fusion proteins described herein may be contained in cells, in particular bacterial cells, preferably Gram-negative bacterial cells, more preferably E. coli cells. These cells present the above-described fusion proteins, preferably the enzyme and folding helper protein-comprising fusion protein, on the cell surface.
  • the cells may be live, dormant (i.e., non-proliferative but restricted metabolically active) at the time of use, or non-living. Non-viable cells are preferred when gene-modified cell spread is undesirable for the intended application.
  • the method of co-expressing the fusion proteins of enzyme and auto-transporter protein and folding helper protein and carotene protein on the surface of a cell comprises culturing a recombinant cell described herein under conditions suitable for expression of the fusion proteins. Such conditions usually include incubation of the cells in a nutrient medium and induction of expression if an inducible promoter is used. Subsequently, the cells can be cleaned and processed for further use.
  • detergents and cleaning agents described herein include all conceivable types of detergents, both concentrates and undiluted agents, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing
  • detergents for textiles, carpets, or natural fibers for which the term detergent is used.
  • detergents for textiles, carpets, or natural fibers for which the term detergent is used.
  • dishwashing detergents for dishwashers or manual dishwashing detergents or cleaners for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, painted surfaces, plastics, wood or leather, for which the term detergent is used, ie in addition to manual and machine Dishwashing agents, for example, scouring agents, glass cleaner, toilet scenters, etc.
  • the detergents and cleaning agents also include washing aids, which are added to the actual detergent in the manual or machine textile laundry to achieve a further effect.
  • laundry detergents and cleaners also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry article is brought into contact before the actual laundry, for example, for dissolving more stubborn
  • the fabric softeners are calculated.
  • Particle form as homogeneous solutions or suspensions may be present, in addition to the enzymes described in principle all known and customary in such agents ingredients, preferably at least one further ingredient is present in the agent.
  • the washing or cleaning agents preferably contain (a) surfactant (s), more preferably a mixture of several surfactants from different classes.
  • surfactants may be anionic, nonionic, cationic or amphoteric surfactants and suitable surfactant systems and blends are known in the art for a variety of applications.
  • washing or cleaning agent may contain other ingredients that further improve the performance and / or aesthetic properties of the detergent or cleaning agent.
  • the washing or cleaning agent may contain other ingredients that further improve the performance and / or aesthetic properties of the detergent or cleaning agent.
  • the washing or cleaning agent may contain other ingredients that further improve the performance and / or aesthetic properties of the detergent or cleaning agent.
  • the washing or cleaning agent contains the washing or
  • Cleaning agent preferably additionally one or more substances from the group of builders, bleaching agents, electrolytes, nonaqueous solvents, pH adjusters, perfumes, perfume carriers, fluorescers, dyes, hydrotropes, foam inhibitors, silicone oils,
  • Color transfer inhibitors antimicrobial agents, germicides, fungicides, antioxidants, preservatives, corrosion inhibitors, antistatic agents, bittering agents, ironing aids, repellents and impregnating agents, swelling and anti-slip agents, plasticizing components and UV absorbers.
  • ingredients to be selected as well as the conditions under which the agent is used such as temperature, pH, ionic strength, redox ratios or mechanical influences, should be optimized for the particular cleaning problem. So are usual
  • Temperatures for the use of detergents in ranges from 10 ° C over 40 ° C and 60 ° C up to 95 ° C for mechanical means or in technical applications.
  • the ingredients of the respective agents are coordinated, in particular in such a way that synergies arise with regard to the cleaning performance.
  • synergies that are present in a temperature range between 10 ° C and 60 ° C.
  • the present invention also relates to the use of the detergents or cleaners described herein for cleaning articles, in particular textiles or hard
  • Example 1 Provision of the Autodisplay System with Lipase Bacterial Strains, Plasmids and Culture Conditions
  • the Escherichia coli strains UT5600 (DE3) [F “ , ara-14, leuB6, secA6, lacY1, proC14, tsx-67, A (ompT-fepC) 266, entA403, trpE38, rfbD1, rpsL109 (Str r ), xyl-5, ml-1, thi-1, A (DE3)] and E. coli BL21 (DE3) [B, F, the, ompT, Ion, hsdS (rB " mB " ), gal, A (DE3)] E.
  • Plasmid pBL001 is a derivative of pCOLA-Duet TM -1 in which the second MCS (multiple cloning site) was removed and the autotransporter expression cassette inserted using the Ncol and Blpl restriction sites.
  • the plasmid pHes8, which encodes the lipase and foldase of Burkholderia cepacia, is a derivative of pHes12 as described by Quyen et al. (Quyen et al., Applied and Environmental Microbiology 1999, 65: 787-794).
  • the nucleotide and amino acid sequences of lipase (lipA) (SEQ ID NO: 1 and 2, respectively) and foldase (lipB) (SEQ ID NO: 3 and 4, respectively) of Burkholderia cepacia are shown in SEQ ID Nos. 1 -4 indicated.
  • the bacteria were cultured at 37 ° C in LB medium with carbenicillin (100 mg L ⁇ ) or kanamycin (30 mg L ⁇ ) or both.
  • a culture of the strain E. coli BL21 (DE3) pAT-LipBc which already attracted the plasmid coding for the lipase autotransporter fusion protein, was grown in the next step according to a modified electrocompetent cell Protocol by Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).
  • the plasmid pAT-FoldBc was then transfected by electroporation into an aliquot of these cells to give strain BL21 (DE3) pAT-LiFoBc containing both plasmids.
  • the lipase gene was amplified by PCR.
  • the plasmid pHes8 and as primer EK009 CGCTCGAGGCGAGCGCGCCCGCCGAC, SEQ ID NO: 5
  • EK010 GGTACCCACGCCCGCGAGCTTCAGCCG, SEQ ID NO: 6
  • To the Cloning of the lipase PCR fragment into the autotransporter cassette was PCR-introduced with an Xhol site at the 5'-end and a KpnI site at the 3'-end of the lipase PCR fragment.
  • the foldase gene was amplified by means of PCR, again using the plasmid pHes8 as template for the primers CD004 (CTCGAGCCGTCGTCGCTGGCCGGCTCC, SEQ ID NO : 7) and CD005 (GGTACCCTGCGCGCTGCCCGCGCCGCG; SEQ ID NO: 8). Analogous to the lipase PCR fragment, a 5 ' Xhol and a 3 ' -Kpnl restriction site were inserted by PCR.
  • Both PCR products were each cloned into the vector pCR®4-TOPO® and then subjected to a targeted PCR mutagenesis according to the manufacturer's instructions Stratagene to remove unwanted restriction sites within the genes.
  • the mutant plasmids were then cut with Xhol and Kpnl and the restriction fragment containing the lipase gene was cloned into the pET derivative pCD003 (Detzel et al., Supra) cut with the same enzymes.
  • the restriction fragment containing the foldase gene was cloned into the pCOLA-Duet TM -1 derivative pBL001 cut with the same enzymes.
  • Plasmid DNA preparation, restriction digestion, ligation and DNA electrophoresis and transformation were performed according to standard protocols (Sambrook et al., Supra). Gel extraction of the digested fragments was performed by Qiagen Gel Extraction Kit.
  • E. coli cells were cultured overnight and 1 ml of the culture used to inoculate LB medium (40 ml). The cells were cultured with vigorous shaking at 37 ° C (200 rpm) for approximately 2 h until an optical density OD578 of 0.5 was reached. The culture was then split into two aliquots and protein expression induced by adding IPTG (final concentration 1 mM) to one of the aliquots. The cultures were then incubated again with shaking (200 rpm) at 30 ° C for 1 h. The induction was stopped by incubating the cells on ice for 15 minutes.
  • Proteinase K was added at a final concentration between 0.2 mg mL and 0.5 mg mL and the cells incubated for 1 h at 37 ° C. The digestion was stopped by washing the cells twice with Tris-HCl (0.2 M, pH 8) containing 10% fetal calf serum (FCS) and preparing the outer membrane proteins as described above.
  • the cells were not treated with proteinase K, but the prepared membrane protein pellet was resuspended in 1 mL of distilled water and used in a 1:10 dilution for activity testing.
  • the cells used coexpress the lipase and foldase and the host cells E. coli BL21 (DE3) without lipase / foldase were used as control.
  • the substrate p-nitrophenyl palmitate was suspended in water with constant stirring to a final concentration of 0.26 mM.
  • the activity measurement was started by adding the cells to this substrate suspension to an OD578 of 1. identical
  • the activity of the lipase was tested on five different, standardized, lipase-sensitive soils.
  • the soiling contained either Biskin® (Peter Kölln KGaA, Elmshorn, DE), Butaris® (DFF Dairy Fine Food GmbH, Ratzeburg, DE), butter oil, a mixture of carbon black and mineral oil (C01, Center for Test Materials, Viaardingen, NL). or a mixture of tallow and pigment (20D, wfk Testgewebe GmbH, Krefeld, DE).
  • the lipases tested were a) 0.0746 mg Lipex® 100 L active lipase per test tube, b) B.
  • test fabric was washed three times with deionized water and dried at room temperature in the dark. Stain color measurement was performed with a Minolta colorimeter (Konica-Minolta, Kunststoff-Neuperlach, Germany) calibrated against a manufacturer's standard, using CIE L * a * b * , D65 / 10 SCI settings. Each soiling was measured three times and the average L * value determined. The performance was determined as the difference in value L * of the enzyme-containing sample from the enzyme-free control and is expressed as a percentage of the performance of standard (a) set at 100%.
  • Minolta colorimeter Konica-Minolta, Kunststoff-Neuperlach, Germany

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Wasch- oder Reinigungsmittel, das ein Enzym, insbesondere ein hydrolytisches Enzym, sowie ein Faltungshelferprotein für das Enzym enthält, wobei sowohl das Enzym als auch das Faltungshelferprotein als Fusionsproteine mit der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins auf der Oberfläche einer Zelle oder der Membranfraktion einer Zelle immobilisiert sind, sowie die Verwendung der beschriebenen Wasch- und Reinigungsmittel.

Description

„Wasch- oder Reinigungsmittel mit immobilisierter Enzymkomponente"
Die vorliegende Anmeldung richtet sich auf ein Wasch- oder Reinigungsmittel, das ein Enzym, insbesondere ein hydrolytisches Enzym enthält, wobei das Enzym auf einer Zelle oder der Membranfraktion einer Zelle immobilisiert ist, sowie die Verwendung eines solchen Enzyms in Wasch- oder Reinigungsmitteln.
Der Einsatz von Enzymen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist im Stand der Technik etabliert. Sie dienen dazu, das Leistungsspektrum der betreffenden Mittel entsprechend ihren speziellen Aktivitäten zu erweitern. Hierzu gehören insbesondere hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Amylasen, Lipasen und Cellulasen. Die ersten drei genannten hydrolysieren Proteine, Stärke und Fette und tragen somit unmittelbar zur Schmutzentfernung bei. Cellulasen werden insbesondere wegen ihrer Gewebewirkung eingesetzt. Eine weitere Gruppe von Wasch- und
Reinigungsmittelenzymen sind oxidative Enzyme, insbesondere Oxidasen, die ggf. im
Zusammenspiel mit anderen Komponenten vorzugsweise dazu dienen, Anschmutzungen zu bleichen oder die bleichenden Agenzien in situ zu erzeugen. Neben diesen Enzymen, die einer fortwährenden Optimierung unterworfen werden, werden laufend weitere Enzyme für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bereitgestellt, um insbesondere spezielle Anschmutzungen optimal angehen zu können, wie beispielsweise Pektinasen, ß-Glucanasen, Mannanasen oder weitere Hemicellulasen zur Hydrolyse insbesondere spezieller pflanzlicher Polymere.
Derzeit sind Enzyme in der Regel in löslicher Form in Wasch- und Reinigungsmitteln enthalten. Nachteilig hierbei ist, dass solche Enzyme nicht oder nur unter großem Aufwand zur
Wiederverwendung abtrennbar sind und, im Fall von Waschmitteln, am zu reinigenden Textil anhaften können. Diese Anhaftung am Textil verursacht durch die Restaktivität des Enzyms einen vom Verbraucher als unangenehm empfundenen Geruch, der bisher nur durch Einschränkung der Reaktivität oder des akzeptierten Substratspektrums verhindert werden kann, wie z.B. bei Lipasen. Es besteht daher Bedarf nach Wasch- und Reinigungsmitteln, die Enzyme in an Partikel gekoppelter Form enthalten, so dass nach dem Einsatz die Möglichkeit einer mechanischen Entfernung oder Abtrennung besteht und ein Anhaften auf dem zu reinigenden Gegenstand vermieden wird. Obwohl die Immobilisierung von Enzymen auf Feststoffpartikeln bekannt und möglich ist, sind derartig immobilisierte Enzyme insoweit problematisch, als dass sie durch die Immobilisierung an Enzymleistung verlieren und daher gegenüber dem freien Enzym eine deutlich verringerte Wirksamkeit, insbesondere an ebenfalls immobilisierten Substraten, wie z.B. Anschmutzungen an Wäsche oder harten Oberflächen, aufweisen.
Es ist daher wünschenswert, immobilisierte Enzyme bereitzustellen, die die gleiche Aktivität besitzen wie die entsprechenden freien Enzyme. Darüber hinaus wäre es vorteilhaft, die
Immobilisierung an Partikel direkt während der Enzymproduktion zu bewirken, um zusätzliche Prozessschritte zur Kopplung der Enzyme an feste Substrate und die damit verbundenen erhöhten Kosten zu vermeiden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Wasch- oder Reinigungsmittel bereitzustellen, das ein an Partikel immobilisiertes Enzym enthält, wobei das immobilisierte Enzym eine mit dem entsprechenden freien Enzym vergleichbare Enzymaktivität aufweist. Vorzugsweise erfolgt die Immobilisierung direkt während der Herstellung des Enzyms.
Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe durch die Ko-Expression eines Enzyms und des zugehörigen Faltungshelferproteins in einer Zelle und Ko-Immobilisierung auf der Zelloberfläche mittels Autodisplay gelöst wird. Derart exprimierte Enzyme können in auf der Zelloberfläche immobilisierter Form als Ganzzellbiokatalysator eingesetzt werden. Alternativ ist auch der Einsatz von Membranfraktionen der Zellen, die die Enzyme enthalten, denkbar.
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung daher auf ein Wasch- oder
Reinigungsmittel enthaltend mindestens ein Enzym, insbesondere mindestens ein hydrolytisches Enzym, bevorzugt eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt eine Lipase, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon und mindestens ein Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym, bevorzugt eine Foldase, oder ein aktives Fragment davon, wobei das mindestens eine Enzym oder enzymatisch aktive Fragment davon und das mindestens eine Faltungshelferprotein oder aktive Fragment davon jeweils in Form eines Fusionsproteins, das eine Transporterdomäne eines Autotransporterproteins als Fusionspartner umfasst, gemeinsam auf der Oberfläche einer Zelle, insbesondere einem einzelligen Mikroorganismus, oder einer
Membranfraktion einer Zelle, insbesondere der Membranfraktion eines einzelligen
Mikroorganismus, immobilisiert sind.
„Mindestens eine", wie hierin verwendet, bezieht sich auf 1 oder mehr, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr. Die hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittel können rekombinante Zellen als ganzes oder Membranfraktionen davon enthalten, wobei die rekombinante Zelle, insbesondere ein rekombinanter Mikroorganismus, vorzugsweise eine Bakterienzelle, mindestens ein
Nukleinsäuremolekül enthält, das umfasst:
(i) mindestens eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem Enzym,
insbesondere einem hydrolytischen Enzym, bevorzugt einer Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt einer Lipase, oder einem enzymatisch aktiven Fragment davon und der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins kodiert; und
(ii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem
Faltungshelferprotein für das Enzym gemäß (i), bevorzugt eine Foldase, oder einem aktiven Fragment davon und der Transporterdomäne eines Autotransporterproteins kodiert.
Des Weiteren ist auch die Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels wie hierin beschrieben zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle kodieren Fusionsproteine. Diese Fusionsproteine umfassen das Enzym oder Faltungshelferprotein, das üblicherweise N-terminal lokalisiert ist, und eine Transporterdomäne eines Autotransporterproteins, die üblicherweise C-terminal lokalisiert ist. Dazwischen kann eine Linkersequenz liegen, die weiter unten im Detail beschrieben wird.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Enzymaktivität von immobilisierten Enzymen, insbesondere Lipasen, nicht beeinträchtigt wird, wenn diese zusammen mit einem entsprechenden Faltungshelferprotein mittels Autodisplay auf der Oberfläche einer Zelle ko-immobilisiert werden. Ohne zu beabsichtigen an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Gegenwart des Faltungshelferproteins das Enzym derart stabilisiert, dass es korrekt faltet und/oder in der entsprechend korrekt gefalteten Konformation bleibt.
Aus diesem Grund sind die immobilisierten Enzyme, die hierin beschrieben werden, dazu geeignet, die üblicherweise in Wasch- oder Reinigungsmitteln verwendeten freien Enzyme zu ersetzen ohne die Reinigungsleistung auf enzymsensitive Anschmutzungen signifikant zu verringern. Die
Immobilisierung auf Zellen oder Zellmembranfraktionen ermöglicht die einfache mechanische Abtrennung und, falls gewünscht, Wiedergewinnung und trägt somit zur Vermeidung der Anhaftung der Enzyme auf den zu reinigenden Gegenständen bei. Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil ergibt sich daraus, dass auf der Zelloberfläche mehrere Enzymmoleküle verankert sind. Dadurch ergibt sich eine kooperative Wirkung. Findet ein Enzymmolekül ein Substrat, so muss der gesamte Partikel vor Ort verweilen, und so werden die anderen auf der Zelloberfläche befindlichen Enzyme ebenfalls an das Substrat gebracht.
Das hierin beschriebenen Mittel umfassen mindestens ein Enzym, können aber auch mehrere Enzyme umfassen. Prinzipiell sind diesbezüglich alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar. Vorzugsweise handelt es sich um eines oder mehrere Enzyme, die in einem Wasch- oder Reinigungsmittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Pektin-spaltendes Enzym, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase,
Oxidoreduktase sowie deren Gemische. Bevorzugte hydrolytische Enzyme im Sinne der
Komponente (a) umfassen insbesondere Proteasen, Amylasen, insbesondere a-Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Hemicellulasen, insbesondere Pectinasen, Mannanasen, ß-Glucanasen, sowie deren Gemische. Besonders bevorzugt sind Proteasen, Amylasen und/oder Lipasen sowie deren Gemische und ganz besonders bevorzugt sind Lipasen. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden.
Im Folgenden werden Beispiele für die verschiedenen Enzymklassen, die hierin eingesetzt werden können beschrieben:
Beispiele für verwendbare Lipasen (Triacylglycerolacylhydrolasen, EC 3.1.1.3) oder Cutinasen, die insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten sind, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen, sind die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen oder die entsprechenden weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® und Lipex® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B®, beziehungsweise Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillus sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® und Lipase AML® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige
Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase® und Lipomax® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30®, Lipase OF® und Lipase PL® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast® von der Firma Genencor. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen werden Lipasen aus den Familie 1.1 oder I .2 von Lipasen (gemäß Apigny & Jaeger, Biochem. J. (1999) 343, 177-183), insbesondere eine Lipase aus einem Bakterium der Gattung Burkholderia oder Pseudomonas verwendet. Ein spezielles Beispiel für eine geeignete Lipase ist die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia (SEQ ID NO:2; GenBank Accession No. FJ638612, Version FJ638612.1 GL222692183; Datum 22. Februar 2013).
Unter den Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Protease-Varianten ab. Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem
Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd. , Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd. , China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp. , Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme. Besonders bevorzugt eingesetzt werden auch die Proteasen aus Bacillus gibsonii und Bacillus pumilus.
Beispiele für verwendbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B.
amyloliquefaciens oder aus B. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser a- Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamy Dultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc. , Tokyo, Japan, als Keistase® erhältlich. Die α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der a- Amylase aus B.
stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von der Firma Novozymes. Des Weiteren sind für diesen Zweck die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus B. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ebenso sind Fusionsprodukte aller genannten Moleküle einsetzbar. Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von dem Unternehmen Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der a-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Weitere vorteilhaft einsetzbare Handelsprodukte sind beispielsweise die Amylase-LT® und Stainzyme® oder Stainzyme ultra® bzw. Stainzyme plus®, letztere ebenfalls von dem Unternehmen Novozymes. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Erfindungsgemäß konfektionierbare Amylasen sind ferner vorzugsweise a- Amylasen.
Cellulasen können je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen, vorhanden sein. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere die Beiträge der Cellulase zur Primärwaschleistung des Mittels (Reinigungsleistung), zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition), zur Avivage (Gewebewirkung) oder zur Ausübung eines "stone washed' -Effekts. Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren
Weiterentwicklungen wird von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase® und Carezyme® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus H. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft®, Renozyme® und Celluclean®. Weiterhin einsetzbar sind beispielsweise die 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone® und Biotouch® erhältlich sind. Weitere Handelsprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase® und Ecopulp®. Weitere geeignete Cellulasen sind aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax® erhältlich ist.
Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind "Genencor detergent cellulase L" und lndiAge®Neutra. Auch durch Punktmutationen erhältliche Varianten dieser Enzyme können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Ferner können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen weitere Enzyme eingesetzt sein, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefasst werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Xanthanasen, Xyloglucanasen, Xylanasen,
Pullulanasen, Pektin-spaltende Enzyme und ß-Glucanasen. Die aus Bacillus subtilis gewonnene ß- Glucanase ist unter dem Namen Cereflo® von der Firma Novozymes erhältlich. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Hemicellulasen sind Mannanasen, welche beispielsweise unter den Handelsnamen Mannaway® von dem Unternehmen Novozymes oder Purabrite® von dem Unternehmen Genencor vertrieben werden. Zu den Pektin-spaltenden Enzymen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls Enzyme gezählt mit den Bezeichnungen Pektinase, Pektatlyase, Pektinesterase, Pektindemethoxylase, Pektinmethoxylase, Pektinmethylesterase, Pektase, Pektinmethylesterase, Pektinoesterase, Pektinpektylhydrolase, Pektindepolymerase, Endopolygalacturonase, Pektolase, Pektinhydrolase, Pektin-Polygalacturonase, Endo- Polygalacturonase, Poly-a-1 ,4-Galacturonid Glycanohydrolase, Endogalacturonase, Endo-D- galacturonase, Galacturan 1 ,4-a-Galacturonidase, Exopolygalacturonase, Poly(galacturonat) Hydrolase, Exo-D-Galacturonase, Exo-D-Galacturonanase, Exopoly-D-Galacturonase, Exo-poly-o Galacturonosidase, Exopolygalacturonosidase oder Exopolygalacturanosidase. Beispiele für diesbezüglich geeignete Enzyme sind beispielsweise unter den Namen Gamanase®, Pektinex AR®, X-Pect® oder Pectaway® von dem Unternehmen Novozymes, unter dem Namen Rohapect UF®, Rohapect TPL®, Rohapect PTE100®, Rohapect MPE®, Rohapect MA plus HC, Rohapect DA12L®, Rohapect 10L®, Rohapect B1 L® von dem Unternehmen AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase® von dem Unternehmen Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich.
Unter all diesen Enzymen sind solche besonders bevorzugt, die an sich gegenüber einer Oxidation vergleichsweise stabil oder beispielsweise über Punktmutagenese stabilisiert worden sind.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können in den Wasch- oder Reinigungsmitteln auch Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen (die bei niedrigen H2O2- Konzentrationen als Peroxidase reagieren), Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Manganperoxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen,
Polyphenoloxidasen) enthalten sein. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite® 1 und 2 der Firma Novozymes oder Gluzyme® mono BG der Firma Novozymes zu nennen.
Die hierin beschriebenen Faltungshelferproteine sind Chaperone, die die korrekte Faltung der hierin beschriebenen Enzyme bewirken oder unterstützen und daher abhängig von dem eingesetzten Enzym ausgewählt werden. Für die oben genannten Enzyme sind die zugehörigen Chaperone im Stand der Technik bekannt. Die eingesetzten Faltungshelferproteine sind vorzugsweise Foldasen. Für den Fall, dass es sich bei den eingesetzten Enzymen um Lipasen handelt, sind die Faltungshelferproteine die zugehörigen Lipase-spezifischen Foldasen.
Beispielsweise kann für die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia die Foldase lipB eingesetzt werden (SEQ ID NO:4; GenBank Accession No. FJ638612, Version FJ638612.1 Gl:222692183; Datum 22. Februar 2013). In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung wird als Lipase die Lipase lipA aus Burkholderia cepacia (Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 ; Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2) und als Faltungshelferprotein die die Foldase lipB aus Burkholderia cepacia
(Nukleotidsequenz SEQ ID NO:3; Aminosäuresequenz SEQ ID NO:4) eingesetzt.
Alle oben beschriebenen Enzyme und Faltungshelferproteine können als Volllängenproteine oder als aktive Fragmente oder Varianten eingesetzt werden.„Fragmente", wie hierin im Zusammenhang mit Proteinen oder Polypeptiden verwendet, bezieht sich auf Proteine/Polypeptide, die gegenüber ihrer nativen Form durch N- und/oder C-terminalen Abbau von Aminosäuren verkürzt sind. Solche Fragmente sind„aktiv" in dem Sinne, als dass sie mindestens einen Teil der Proteinaktivität der nativen Form aufweisen, vorzugsweise mindestens 50 %, bevorzugter 60-90 %, noch bevorzugter dieselbe oder höhere Aktivität. Der Begriff„Variante", wie hierin verwendet, umfasst Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, die zu 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 oder 99 % zu der als Referenz dienenden Sequenz identisch sind. Besonders bevorzugt sind Varianten die eine oder mehrere, vorzugsweise bis zu 5, Punktmutationen aufweisen. Solche Varianten können eine gesteigerte Enzymaktivität, eine breitere oder geänderte Substratspezifität oder eine gesteigerte Stabilität bewirken. Entsprechende Varianten können sich beispielsweise durch solche Mutationen ergeben, die der Entfernung von Proteaseschnittstellen dienen.
Beispielsweise wird von der Foldase NpB vorzugsweise ein N-terminal verkürztes Fragment eingesetzt. Diesem Fragment fehlen die 70 N-terminalen Aminosäuren, die dazu dienen das native Protein in der Membran zu verankern aber für die Chaperonfunktion nicht erforderlich sind. Da diese Membranverankerungssequenz mit dem verwendeten Autodisplaysystem interferieren könnte, wurde sie in den hierin beschriebenen Konstrukten entfernt. In ähnlicher Weise können auch alle anderen hierin erfassten Proteine modifiziert werden.
Enzyme werden als formulierte Enzymprodukte in Wasch- oder Reinigungsmittel gegeben, die aus aktivem Enzymprotein, sowie weiteren Inhaltsstoffen bestehen. Die zugegebene Enzymmenge wird daher als„Enzymmenge an aktivem Protein" angegeben, so dass verdeutlicht wird, dass sich die Angaben der zugegeben Enzymmenge auf das aktive Enzymprotein und nicht auf das formulierte Enzymprodukt beziehen. Die angegebenen Mengen in Gewichtsprozent beziehen sich auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels.
Die Wasch- oder Reinigungsmittel der vorliegenden Erfindung enthalten das mindestens eine Enzym in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gew.-% Prozent an aktivem Protein, insbesondere 0,001 bis 3 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-%, noch bevorzugter von 0,05 bis 1 ,25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels, wobei jedes enthaltene immobilisierte Enzym für sich genommen in den genannten Mengen vorliegen kann.
Die (Aktiv-)Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA- Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren bestimmt werden. Alternativ kann das Aktivprotein über die biochemische Aktivität bestimmt werden, für eine Lipase beispielsweise über die Hydrolyse von p-Nitrophenylpalmitat oder via Titration der Hydrolyse von Olivenöl im pH-Stat. Diese Methoden sind dem Fachmann für das jeweilige Enzym wohlbekannt. Zusätzlich zu den immobilisierten Enzymen kann das Wasch- oder Reinigungsmittel weitere Enzyme, die ebenfalls aus den oben genannten ausgewählt werden können, in freier Form, d.h. nicht immobilisiert enthalten.
Wie hierin beschrieben werden die eingesetzten Enzyme mittels Autodisplay auf der Oberfläche von Zellen immobilisiert und die Zellen und/oder Membranfraktionen dieser Zellen in den beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzt. Autodisplay ist eine Methode, um rekombinante Proteine an der Zelloberfläche, insbesondere der Oberfläche von Bakterien, zu präsentieren. Autodisplay bezeichnet in diesem Zusammenhang ein Expressionssystem, das auf dem Sekretionsmechanismus der Proteinfamilie der Autotransporter, die zum Typ V
Sekretionssystem gehören, basiert. Es wird in gram-negativen Bakterien sowohl für den Transport von Proteinen zur Zelloberfläche als auch für die Sekretion von Proteinen in den Extrazellularraum verwendet. Dazu werden die Autotransporter-Proteine als Vorläuferproteine synthetisiert, die alle strukturellen Voraussetzungen für den Transport zur Zelloberfläche erfüllen, d.h. sie werden mit einem N-terminalen Signalpeptid synthetisiert, welches für den See-Weg typisch ist, der das Durchqueren der inneren Membran ermöglicht. Im Periplasma angelangt, faltet sich der C- terminale Teil des Vorläufers nach Trunkation des Signalpeptids als eine porinartige Struktur, ein sogenanntes ß-Barrel, in die äußere Membran hinein. Durch diese Pore hindurch wird die N- terminal gebundene Passagierdomäne zur Oberfläche transloziert. Dort kann sie - entweder autoproteolytisch oder durch eine zusätzliche Protease - abgespaltet werden oder kann über die Transporterdomäne an der Zellhülle verankert bleiben.
Ein Ersetzen des natürlichen Passagiers durch ein rekombinantes Protein führt zu dessen Oberflächentranslokation. Gentechnisch kann hierfür ein nicht-natürlicher Vorläufer konstruiert werden, der aus einem Signalpeptid, dem rekombinanten Protein und dem Autotransporterprotein, d.h. dem ß-Barrel, besteht. Dazu wird die Nukleotidsequenz, die für das rekombinante
Passagierprotein kodiert, im Leseraster zwischen die für das Signalpeptid und die für die translozierende Domäne des Autodisplay-Vektors kodierende Nukleotidsequenz unter Verwendung von üblichen gentechnischen Verfahren eingefügt. Vorzugsweise kann zwischen dem
rekombinanten Protein und der Transporterdomäne des Autotransporterproteins ferner eine Peptidlinkersequenz eingefügt werden, die als Transmembranlinker dient und für einen uneingeschränkten Zugang zur Oberfläche erforderlich ist. Diese kann ebenfalls durch das Einfügen der entsprechenden Nukleotidsequenz, die die Linkersequenz kodiert, zwischen der für das rekombinante Protein kodierenden Sequenz und der für die Transporterdomäne des
Autotransporters kodierenden Sequenz eingefügt werden. Der Begriff "Transmembranlinker", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen flexiblen
Polypeptidabschnitt, der zur Verbindung der Autotransporterdomäne mit dem rekombinanten Protein dient, jedoch flexibel genug ist, um ein unabhängiges Falten und/oder Transportieren des Proteins zu ermöglichen. In verschiedenen Ausführungsformen kann diese Linkersequenz auch eine Proteaseschnittstelle umfassen, um die Abspaltung des rekombinanten Proteins zu ermöglichen.
Das Signalpeptid kann beispielsweise von einer Untereinheit des Cholera-Toxins gewonnen werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Prinzipiell sind alle Signalpeptide, die die Translokation durch die innere Bakterienmembran in das Periplasma oder in die äußere Membran vermitteln einsetzbar. Üblicherweise sind derartige Signalpeptide am N-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert. Das Signalpeptid wird vorzugsweise vor der Translokation durch die Membran abgespalten.
In der vorliegenden Erfindung ist das Passagierprotein ein Enzym oder ein Faltungshelferprotein wie oben definiert. In dem Autodisplaysystem wird das Passagierprotein als rekombinantes Fusionsprotein mit der Transportdomäne eines Autotransporters exprimiert und durch die von der Transportdomäne erzeugte Pore an die Zelloberfläche transloziert.
Die Begriffe„Transporterdomäne eines Autotransporterproteins" oder„Transporterdomäme eines Autotransporters", wie hierin austauschbar verwendet, beziehen sich auf Polypeptide des Typ V Sekretionssystems von Bakterien, die eine Transporterdomäne enthalten, die sich, wie oben beschrieben, als eine porinartige Struktur, ein so genanntes ß-Barrel, in die äußere
Bakterienmembran hineinfaltet und durch die so entstandene Pore hindurch die N-terminal gebundene Passagierdomäne zur Oberfläche der Membran transloziert. Derartige
Autotransporterproteine sind dem Fachmann bekannt und schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Ssp (P09489, S. marcescens; VERSION P09489.1 Gl: 131087), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens; VERSION BAA33455.1 Gl:3688585), Ssp-h2 (BAA1 1383, S. marcescens;
VERSION BAA1 1383.1 Gl: 1 100764), PspA (BAA36466, P. fluorescens; VERSION
BAA36466.1 Gl:41 15628), PspB (BAA36467, P. fluorescens; VERSION BAA36467.1
Gl:41 15629), Ssa1 (AAA80490, M. haemolytica; VERSION AAA80490.1 Gl:507431 ), SphB1 (CAC44081 , B. pertussis; VERSION CAC44081.1 Gl: 14715185), AspA/NalP (AAN71715, N. meningitides; VERSION AAN71715.1 Gl:25140440), VacA (Q48247, H. pylori; VERSION Q48247.1 Gl:2499107), AIDA-I (Q03155, E. coli; VERSION Q03155.1 Gl:543788), IcsA (AAA26547, S. flexneri; VERSION AAA26547.1 Gl:152804), MisL (AAD16954, S. enterica; VERSION AAD16954.1 Gl:4324610), TibA (AAD41751 , E. coli; VERSION AAD41751.1 Gl:5305639), Ag43 (P39180, E, coli; VERSION P39180.3 Gl:54040656), ShdA (AAD251 10, S. enterica; VERSION AAD251 10.2 Gl:5107805), AutA (CAB891 17, N. meningitidis; VERSION CAB891 17.1 GI7649687), Tsh (Q47692, E. coli; VERSION Q47692.1 GI73622064), SepA (CAC05786, S. flexneri; VERSION CAC05786.1 Gl: 12329055), EspC (AAC44731 , E. coli; VERSION AAC44731.1 Gl: 1764164), EspP (CAA66144, E. coli; VERSION CAA66144.1 Gl:2244638), Pet (AAC26634, E. coli; VERSION AAC26634.1 Gl:3095184), Pic (AAD23953, E. coli; VERSION AAD23953.1 Gl:4574220), SigA (AAF67320, S. flexneri; VERSION
AAF67320.1 Gl:7682555), Sat (AAG30168, E. coli; VERSION AAG30168.1 Gl:1 1096073), Vat (AAO21903, E. coli; VERSION AAO21903.1 Gl:34099063), EpeA (AAL 18821 , E. coli;
VERSION AAL18821 .1 Gl: 16417609), EatA (CAI79539, E. coli; VERSION CAI79539.1 Gl:83308567), Espl (CAC39286, E. coli; VERSION CAC39286.1 Gl:14252931 ), EaaA
(AAF63237, Enterobacterial phage P-EibA; VERSION AAF63237.1 Gl:7532795), EaaC
(AAF63038, Enterobacterial phage P-EibC; VERSION AAF63038.1 Gl:7523532), Pertactin (P14283, B. pertussis; VERSION P14283.3 Gl:464364), BrkA (AAA51646, B. pertussis;
VERSION AAA51646.1 Gl :562026), Tef (AAQ82668, B. pertussis; VERSION AAQ82668.1 Gl:34809494), Vag8 (AAC31247, B. pertussis; VERSION AAC31247.1 Gl:2997419), PmpD (084818, C. trachomatis; VERSION 084818.1 Gl: 14195037), Pmp20 (Q9Z812, C.
pneumoniae; VERSION Q9Z812.2 Gl:14195024), Pmp21 (Q9Z6U5, C. pneumoniae; VERSION Q9Z6U5.1 Gl:14195023), lgA1 protease (CAA57857, N. meningitidis; VERSION CAA57857.1 Gl:732874), App (CAC14670, N. meningitides; VERSION CAC14670.1 Gl : 1 1071863), lgA1 Protease (P45386, H. influenzae; VERSION P45386.1 Gl: 1 170517), Hap (P45387, H.
influenzae; VERSION P45387.1 Gl: 1 170167), rOmpA (P15921 , R. rickettsii; VERSION
P15921.1 Gl:1 12710), rOmpB (Q53047, R. rickettsii; VERSION Q53047.1 Gl:6685726), ApeE (AAC38796, S. enterica; VERSION AAC38796.1 Gl:2896133), EstA (AAB61674, P. aeruginosa; VERSION AAB61674.1 Gl:2218156), Lip-1 (P40601 , P. luminescens; VERSION P40601.1 GI729942), McaP (AAP97134, M. catarrhalis; VERSION AAP97134.1 Gl:33150472), BabA (AAC38081 , H. pylori; VERSION AAC38081 .1 Gl:2804778), SabA (AAD06240, H. pylori;
VERSION AAD06240.1 Gl:4155217), AlpA (CAB05386, H. pylori; VERSION CAB05386.1 Gl:2344807), Aae (AAP21063, A. actinomycetemcomitans; VERSION AAP21063.1
Gl:30230642), NanB (AAG35309, P. multocida; VERSION AAG35309.1 Gl:1 1464736) und Varianten dieser Autotransporter. Für jedes der beispielhaften Autotransporterproteine sind in Klammern Beispiele für geeignete Genbank-Hinterlegungsnummern und Spezies angegeben, von denen der Autotransporter erhalten werden kann. Vorzugsweise ist der Autotransporter das AIDA- I-Protein aus E. coli oder eine Variante davon. Alle vorgenannten Proteine enthalten eine
Transporterdomäne, die isoliert und dann als solche für andere Proteine von Interesse, insbesondere die hierin beschriebenen Enzyme und Faltungshelferproteine, verwendet werden kann. Die Transporterdomänen sind beispielsweise in den oben genannten Genbank-Einträgen explizit im Hinblick auf ihre Position beschrieben oder können vom Fachmann einfach durch Sequenzvergleiche identifiziert werden. Varianten der oben angegebenen Autotransportersequenzen können beispielsweise durch Verändern der Aminosäuresequenz in den Schleifenstrukturen des ß-Barrels, die nicht zu den Transmembranabschnitten gehören, erhalten werden. Optional können die für die
Oberflächenschleifen kodierenden Nukleinsäuren vollständig deletiert werden. Außerdem können innerhalb der amphipathischen ß-Faltblattstrukturen konservative Aminosäurenaustausche, d. h. der Austausch einer hydrophilen gegen eine andere hydrophile Aminosäure und/oder der
Austausch einer hydrophoben gegen eine andere hydrophobe Aminosäure, vorgenommen werden. Vorzugsweise hat eine Variante auf Aminosäureebene eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 98 % mit der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz der Autotransporterdomäne, insbesondere im Bereich der ß-Faltblattstrukturen.
Generell bezieht sich der Begriff "Transporterdomäne eines
Autotransporters/Autotransporterproteins", wie hierin verwendet, auf eine Domäne eines
Autotransporterproteins, die ausreichend ist um ein damit fusioniertes Passagierprotein zur äußeren Membran zu translozieren. Eine solche Domäne ist daher ein aktives Fragment eines Autotransporterproteins.
Die entsprechenden Expressionseinheiten umfassend die Nukleotidsequenzen, die für das Signalpeptid, das rekombinante Passagierprotein und die Transportdomäne kodieren, können mit einem beliebigen, ggf. auch nicht-natürlichen Promotor kombiniert werden, der die Expression reguliert. Üblicherweise werden starke, virale Promotoren eingesetzt. Der Fachmann ist mit solchen Promotoren und anderen zur Expressionsregulation geeigneten Sequenzen, wie z.B. Enhancern, die ebenfalls in den beschriebenen Konstrukten eingesetzt werden können und Verfahren zum funktionellen Verbinden dieser Sequenzen mit einem Nukleinsäuremolekül vertraut.
Die komplette Expressionseinheit aus Regulationssequenz, beispielsweise Promoter, und den Nukleotidsequenzen, die für Signalpeptid, rekombinantes Passagierprotein und Transportdomäne kodieren, kann Bestandteil eines Plasmids, beispielsweise eines Expressionsvektors sein.
Die Nukleinsäuremoleküle, die für ein Fusionsprotein aus einem Enzym wie oben definiert und eine Transportdomäne, oder ein Fusionsprotein aus einem Faltungshelferprotein wie oben definiert und eine Transportdomäne kodieren, können Bestandteil eines Plasmids, insbesondere eines
Expressionsvektors sein und/oder können weitere Nukleotidsequenzen umfassen, die
beispielsweise für regulatorische Regionen, u.a. Promoter, Enhancer, etc., Signalpeptide, wie oben definiert, und Linkersequenzen, wie oben definiert, kodieren. Ein bevorzugtes Nukleinsäuremolekül umfasst in 5'-3' Richtung Nukleotidsequenzen die für einen Promoter, ein Signalpeptid, das Passagierprotein, d.h. Enzym oder Faltungshelfer, Transmembranlinker und Transportdomäne eines Autotransporterproteins kodieren.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und/oder Fusionsproteine können in Zellen, insbesondere Bakterienzellen, vorzugsweise gram-negative Bakterienzellen, besonders bevorzugt E. coli Zellen enthalten sein. Diese Zellen präsentieren die oben beschriebenen Fusionsproteine, vorzugsweise das Enzym- und das Faltungshelferprotein-umfassende Fusionsprotein, auf der Zelloberfläche. Die Zellen können zum Zeitpunkt der Anwendung lebend, ruhend (d.h. sich nicht vermehrend, jedoch eingeschränkt stoffwechselaktiv) oder aber in nichtlebendiger Form vorliegen. Nichtlebendige Zellen sind bevorzugt, wenn eine Ausbreitung genveränderter Zellen für die beabsichtigte Anwendung unerwünscht ist.
Das Verfahren zur Ko-Expression der Fusionsproteine aus Enzym und Autotransporterprotein und Faltungshelferprotein und Autotransportprotein auf der Oberfläche einer Zelle umfasst das Kultivieren einer hierin beschriebenen rekombinanten Zelle unter Bedingungen, die zur Expression der Fusionsproteine geeignet sind. Derartige Bedingungen schließen üblicherweise die Inkubation der Zellen in einem Nährmedium und Induktion der Expression, sofern ein induzierbarer Promoter verwendet wird, ein. Anschließend können die Zellen gereinigt und für die weitere Verwendung prozessiert werden.
Zu den hierin beschriebenen Wasch- und Reinigungsmitteln zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche
und/oder -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmitteln auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger
Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche
nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet. Die Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter
Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer den beschriebenen Enzymen im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist.
Zur Entfaltung der Wasch- oder Reinigungsleistung enthalten die Wasch- oder Reinigungsmittel vorzugsweise (ein) Tensid(e), besonders bevorzugt eine Mischung mehrerer Tenside aus unterschiedlichen Stoffklassen. Tenside können anionische, nichtionische, kationische oder amphotere Tenside sein und geeignete Tensidsysteme und -mischungen sind im Stand der Technik für die unterschiedlichsten Anwendungsformen bekannt.
Zusätzlich kann das Wasch- oder Reinigungsmittel weitere Inhaltsstoffe enthalten, die die anwendungstechnischen und/oder ästhetischen Eigenschaften des Wasch- oder Reinigungsmittels weiter verbessern. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthält das Wasch- oder
Reinigungsmittel vorzugsweise zusätzlich einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe der Gerüststoffe, Bleichmittel, Elektrolyte, nichtwässrigen Lösungsmittel, pH-Stellmittel, Parfüme, Parfümträger, Fluoreszenzmittel, Farbstoffe, Hydrotrope, Schauminhibitoren, Silikonöle,
Antiredepositionsmittel, Vergrauungsinhibitoren, Einlaufverhinderer, Knitterschutzmittel,
Farbübertragungsinhibitoren, antimikrobiellen Wirkstoffe, Germizide, Fungizide, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Korrosionsinhibitoren, Antistatika, Bittermittel, Bügelhilfsmittel, Phobier- und Imprägniermittel, Quell- und Schiebefestmittel, weichmachenden Komponenten sowie UV- Absorber.
Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche
Temperaturen für den Einsatz von Wasch- und Reinigungsmitteln in Bereichen von 10°C über 40°C und 60°C bis hin zu 95°C bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt, insbesondere derart, dass sich Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung ergeben. Besonders bevorzugt sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 10°C und 60°C vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmittel zur Reinigung von Gegenständen, insbesondere Textilien oder harten
Oberflächen, sowie Verfahren zur Reinigung von Gegenständen, insbesondere Textilien oder harten Oberflächen, die das in Kontakt bringen der Gegenstände mit den hierin beschriebenen Wasch- oder Reinigungsmitteln einschließen.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf die erfindungsgemäßen Wasch- und
Reinigungsverfahren sowie die erfindungsgemäßen Verwendungen anwendbar und ungekehrt. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass die Offenbarung im Kontext der erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung sowie alle beschriebenen Verfahren gilt.
Beispiele
Beispiel 1 : Bereitstellung des Autodisplay-Systems mit Lipase Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen
Für die Expression der Autotransporter-Fusionsproteine wurden die Escherichia coli Stämme UT5600(DE3) [F", ara-14, leuB6, secA6, lacY1 , proC14, tsx-67, A(ompT-fepC)266, entA403, trpE38, rfbD1 , rpsL109(Strr), xyl-5, mtl-1 , thi-1 , A(DE3)] und E. coli BL21 (DE3) [B, F, dem, ompT, Ion, hsdS(rB" mB"), gal, A(DE3)] verwendet. E. coli TOP10 (F- mcrA A(mrrhsdRMS-mcrBC) (|)80lacZDM15 AlacX74 deoR recA1 araD139 A(ara-Ieu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) und der Vektor pCR®4-TOPO® wurden für die Umklonierung der Produkte der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) mit dem TOPO-TA Klonierungskit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Die zielgerichtete Mutagenese der Restriktionsschnittstellen für Xhol und Kpnl in den Genen von Interesse wurde unter Verwendung des QuikChange Site Directed Mutagenesis Kits (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) und entsprechenden Mutagenese-Primern durchgeführt. Die Konstruktion des Plasmids pCD003, das den AIDA-I Autotransporter kodiert wurde bereits in Detzel et al. beschrieben (Detzel et al., ChemCatChem 201 1 , 3:719-725). Das Plasmid pBL001 ist ein Derivat von pCOLA-Duet™-1 , in dem die zweite MCS (multiple cloning site) entfernt und die Autotransporter-Expressionskassette unter Verwendung der Ncol und Blpl Restriktionsschnittstellen eingefügt wurde. Das Plasmid pHes8, das die Lipase und Foldase von Burkholderia cepacia kodiert, ist ein Derivat von pHes12 wie von Quyen et al. beschrieben (Quyen et al., Applied and environmental microbiology 1999, 65:787-794). Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Lipase (lipA) (SEQ ID NO: 1 bzw. 2) und Foldase (lipB) (SEQ ID NO:3 bzw. 4) von Burkholderia cepacia sind in SEQ ID Nos. 1 -4 angegeben. Die Bakterien wurden bei 37°C in LB-Medium mit Carbenicillin (100 mg L~ ) bzw. Kanamycin (30 mg L~ ) oder beiden kultiviert. Für die Ko-Expression der Lipase und Foldase wurde eine Kultur des Stammes E. coli BL21 (DE3) pAT-LipBc, der bereits das Plasmid, das für das Lipase-Autotransporter Fusionprotein kodiert, angezogen, um im nächsten Schritt elektrokompetente Zellen gemäß einem modifizierten Protokoll von Sambrook et al. herzustellen (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, 1989). Das Plasmid pAT-FoldBc wurde dann mittels Elektroporation in ein Aliquot dieser Zellen transfiziert um den Stamm BL21 (DE3)pAT-LiFoBc, der beide Plasmide enthält, zu ergeben.
Rekombinante DNA Techniken
Für die Konstruktion des Plasmids pAT-LipBc, das das Gen, das für das Lipase-Fusionsprotein LipBc-FP kodiert, enthält, wurde das Lipasegen mittels PCR amplifiziert. Als Template wurde das Plasmid pHes8 und als Primer EK009 (CGCTCGAGGCGAGCGCGCCCGCCGAC; SEQ ID NO:5) und EK010 (GGTACCCACGCCCGCGAGCTTCAGCCG; SEQ ID NO:6) eingesetzt. Um die Klonierung des Lipase PCR-Fragments in die Autotransporterkassette zu ermöglichen, wurde mittels PCR eine Xhol-Schnittstelle am 5'-Ende und eine KpnI-Schnittstelle am 3'-Ende des Lipase PCR-Fragments eingefügt.
Für die Konstruktion des Plasmids pAT-FoldBc, das das Gen, das für das Foldase-Fusionsprotein FoldBc-FP kodiert, enthält, wurde das Foldasegen mittels PCR amplifiziert, wobei wiederum das Plasmid pHes8 als Template für die Primer CD004 (CTCGAGCCGTCGTCGCTGGCCGGCTCC; SEQ ID NO:7) and CD005 (GGTACCCTGCGCGCTGCCCGCGCCGCG; SEQ ID NO:8) eingesetzt wurde. Analog zu dem Lipase PCR-Fragment wurden eine 5'-Xhol- und eine 3'-Kpnl- Restriktionsschnittstelle mittels PCR eingefügt.
Beide PCR-Produkte wurden jeweils in den Vektor pCR®4-TOPO® kloniert und dann einer zielgerichteten PCR-Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers Stratagene unterzogen, um unerwünschte Restriktionsschnittstellen innerhalb der Gene zu entfernen. Die mutierten Plasmide wurden dann mit Xhol und Kpnl geschnitten und das Restriktionsfragment enthaltend das Lipasegen wurde in das pET-Derivat pCD003 (Detzel et al., supra), das mit denselben Enzymen geschnitten war, kloniert. Das Restriktionsfragment, das das Foldasegen enthielt, wurde in das mit denselben Enzymen geschnittene pCOLA-Duet™-1-Derivat pBL001 kloniert. Die beiden
Ligationsschritte ergaben eine Fusion der Lipase bzw. Foldase im Leserahmen mit den
Autotransporterdomänen unter Kontrolle eines T7/lac-Promotors.
Die Plasmid DNA Präparation, der Restriktionsverdau, die Ligation und die DNA Elektrophorese und Transformation wurden gemäß Standardprotokollen (Sambrook et al., supra) durchgeführt. Die Gelextraktion der verdauten Fragmente wurde mittels eines Gelextraktionskits von Qiagen durchgeführt.
Präparation der äußeren Membran
E. coli Zellen wurden über Nacht kultiviert und 1 ml der Kultur verwendet um LB Medium (40 ml) anzuimpfen. Die Zellen wurden unter kräftigem Schütteln bei 37 °C (200 rpm) für ungefähr 2 h kultiviert bis eine optische Dichte OD578 von 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde dann in zwei Aliquots aufgeteilt und die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1 mM) zu einem der Aliquots induziert. Die Kulturen wurden dann wiederum unter Schütteln (200 rpm) bei 30 °C für 1 h inkubiert. Die Induktion wurde durch Inkubation der Zellen auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Nach dem Ernten und Waschen der Zellen mit Tris-HCI (0.2 M, pH 8) wurde eine Differential-Zelltrennung gemäß dem Verfahren von Hantke (Hantke, Mol Gen Genet 1981 , 182:288-292) modifiziert nach Schultheiss et al. (Schultheiss et al., J Mol Catal B Enzym 2002, 18:89-97) durchgeführt. Die Proteine der äußeren Membran wurden gewaschen, in Wasser resuspendiert und für SDS-PAGE vorbereitet. Für die Behandlung der gesamten Zellen mit Protease wurden E. coli Zellen geerntet, gewaschen und in 1 ml Tris-HCI (0.2 M, pH 8) resuspendiert. Proteinase K wurde mit einer Endkonzentration zwischen 0,2 mg mL und 0,5 mg mL zugegeben und die Zellen für 1 h bei 37 °C inkubiert. Der Verdau wurden durch zweimaliges Waschen der Zellen mit Tris-HCI (0.2 M, pH 8) enthaltend 10 % fötales Kälberserum (FCS) gestoppt und die Proteine der äußeren Membran wie oben beschrieben präpariert.
Um die äußeren Membranen, die für Aktivitäts-Assays eingesetzt wurden, zu erhalten, wurden die Zellen nicht mit Proteinase K behandelt, sondern das präparierte Pellet der Membranproteine in 1 mL destilliertem Wasser resuspendiert und in einer 1 : 10 Verdünnung für die Aktivitätstests verwendet.
Bestimmung der Lipaseaktivität
Um die lipolytische Aktivität der Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren zu bestimmten, wurden photometrische Messungen gemäß einem modifizierten Protokoll nach Winkler und Stuckmann mit Nitrophenylpalmitat als Substrat durchgeführt (Winkler & Stuckmann, J Bacteriol 1979, 138:663- 670). Die Zellen, die in den Messungen verwendet wurden, wurden standardmäßig in LB-Medium kultiviert bis eine optische Dichte von 1 ,0 erreicht war. Die Induktion der Proteinexpression wurde durch Zugabe von IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM gestartet und die Zellen für eine weitere Stunde bei 30 °C und 200 rpm inkubiert. Die Zellen wurden dann mittels Zentrifugation geerntet und zweimal in Kaliumphosphatpuffer, 50 mM, pH 7,4, gewaschen und in diesem Puffer bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Die verwendeten Zellen koexprimieren die Lipase und Foldase und die Wirtszellen E. coli BL21 (DE3) ohne Lipase/Foldase wurden als Kontrolle verwendet. Das Substrat p-Nitrophenylpalmitat wurde in Wasser unter ständigem Rühren bis zu einer Endkonzentration von 0,26 mM suspendiert. Die Aktivitätsmessung wurde durch Zugabe der Zellen zu dieser Substratsuspension bis zu einer OD578 von 1 gestartet. Identische
Aktivitätsmessungen wurden mit Präparationen der äußeren Membran von E. coli Zellen, die Lipase und Foldase koexprimieren, durchgeführt. Die lipolytische Produktion von gelb gefärbtem Nitrophenolat bei Raumtemperatur wurde mit einem Mikroplatten-Auslesegerät (Mithras LB940, Berthold, Bad Wildbach, Germany) bei 405 nm bestimmt. Der erhaltene Anstieg in der Absorption wurde verwendet, um die enzymatische Aktivität gemäß Lambert-Beer zu berechnen (enitrophenoi = 17,000 L mol- cm 1 , d = 0,57 cm Pfadlängenkorrektur für die Schichtdicke von 200 [iL Testvolumen in einem Well). Eine Einheit wurde als die Menge von Enzym definiert, die die Freisetzung von 1 μιηοΙ p-Nitrophenol pro Minute ergab (Quyen et al. , supra). Die Ergebnisse zeigten, dass Ganzzell-Biokatalysatoren und äußere Membran-Präparationen, die sowohl Lipase als auch Foldase exprimieren, eine gute lipolytische Aktivität zeigten, wohingegen Mischungen von Zellen und Membranpräparaten, die jeweils Lipase oder Foldase separat exprimieren, nur geringe lipolytische Aktivität zeigten. Aus diesem Grund wurden im Folgenden Zellen oder Membranpräparate eingesetzt, in denen das Enzym und das zugehörige Faltungshelferprotein koexprimiert wurden.
Beispiel 2: Waschtests mit Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren E. coli BL21 (DE3) pAT-LipBc
Die Aktivität der Lipase wurde auf fünf unterschiedlichen, standardisierten, lipase-sensitiven Anschmutzungen getestet. Die Anschmutzung enthielt entweder Biskin® (Peter Kölln KGaA, Elmshorn, DE), Butaris® (DFF Dairy Fine Food GmbH, Ratzeburg, DE), Butteröl, eine Mischung aus Ruß und Mineralöl (C01 , Center for Test Materials, Viaardingen, NL) bzw. eine Mischung aus Hauttalg und Pigment (20D, wfk Testgewebe GmbH, Krefeld, DE). Die getesteten Lipasen waren a) 0,0746 mg aktive Lipase Lipex® 100 L pro Testgefäß, b) freie Lipase von B. cepacia, c) die hierin beschriebenen Lipase-Ganzzell-Biokatalysatoren und d) ein Membranpräparat davon. Um eine Vergleichbarkeit herzustellen, wurden alle Lipasen in denselben Mengen im Hinblick auf ihre enzymatische Aktivität eingesetzt. Der Waschvorgang wurde in einem Linitest Plus Gerät (Atlas, Rock Hill, SC, USA) durchgeführt. Die Waschlauge wurde mit 3,53 g eines enzymfreien, ansonsten handelsüblichen europäischen Premium-Waschmittels in Wasser (16 °dH) gepuffert mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 angesetzt. Der Waschvorgang wurde in einem Gesamtvolumen von 170 mL für eine Stunde bei 40 °C und 45 rpm durchgeführt. Um den Mechanismus eines
Standardwaschvorgangs zu simulieren, wurden 10 Edelstahlkugeln von 5 mm Durchmesser zugegeben und mit Testgewebe auf eine Gesamtmenge von 14,3 g Textilgewicht aufgefüllt. Nach dem Waschvorgang wurde das Testgewebe dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur im Dunkeln getrocknet. Eine Farbmessung der Anschmutzung wurde mit einem Minolta Kolorimeter (Konica-Minolta, München-Neuperlach, Deutschland), kalibriert gegen einen Herstellerstandard, unter Anwendung von CIE L*a*b*, D65/10 SCI Einstellungen, durchgeführt. Jede Anschmutzung wurde dreimal gemessen und der durchschnittliche L* Wert bestimmt. Die Leistung wurde als Differenz des Werts L* der enzymhaltigen Probe gegenüber der enzymfreien Kontrolle bestimmt und ist in Prozent der Leistung des Standards (a), der auf 100% gesetzt wurde, angegeben.
Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt, wobei die gezeigten Werte Durchschnittswerte aus drei Messungen sind und zusätzlich Standardabweichungen angegeben sind, (a) Weiße Balken:
Standard, (b) hellgraue Balken: freie Lipase aus B. cepacia, (c) dunkelgraue Balken: die erfindungsgemäßen, hierin beschriebenen Lipase Ganzzell-Katalysatoren, (d) schraffierte Balken: Membranpräparationen der Zellen.
Das Ergebnis belegt die überraschend gleichwertige Reinigungsleistung des immobilisierten Enzyms.

Claims

Patentansprüche
Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend mindestens ein Enzym, insbesondere
mindestens ein hydrolytisches Enzym, bevorzugt eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase,
Carrageenase oder Lipase, besonders bevorzugt eine Lipase, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon und mindestens ein Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym, bevorzugt eine Foldase, oder ein aktives Fragment davon, dadurch
gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym oder enzymatisch aktive Fragment davon und das mindestens eine Faltungshelferprotein oder aktive Fragment davon jeweils in Form eines Fusionsproteins, das die Transporterdomäne eines Autotransporterproteins als Fusionspartner umfasst, gemeinsam auf der Oberfläche einer Zelle, insbesondere einem einzelligen Mikroorganismus, oder einer Membranfraktion einer Zelle, insbesondere der Membranfraktion eines einzelligen Mikroorganismus, immobilisiert sind.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel das mindestens eine Enzym in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gew.-% Prozent an aktivem Protein, insbesondere 0,001 bis 3 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-%, noch bevorzugter von 0,05 bis 1 ,25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Wasch- oder Reinigungsmittels enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel ferner mindestens einen weiteren Bestandteil, vorzugsweise mindestens zwei weitere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Tensiden, vorzugsweise eine Mischung mehrerer verschiedener Tenside, Gerüststoffen, Bleichmittel, Elektrolyten, nichtwässrigen Lösungsmitteln, pH-Stellmitteln, Parfümen, Parfümträgern, Fluoreszenzmitteln, Farbstoffen, Hydrotropen, Schauminhibitoren,
Silikonölen, Antiredepositionsmitteln, Vergrauungsinhibitoren, Einlaufverhinderern, Knitterschutzmitteln, Farbübertragungsinhibitoren, antimikrobiellen Wirkstoffen, Germiziden, Fungiziden, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Korrosionsinhibitoren, Antistatika, Bittermitteln, Bügelhilfsmitteln, Phobier- und Imprägniermitteln, Quell- und
Schiebefestmitteln, weichmachenden Komponenten sowie UV-Absorbern enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym eine Lipase der Familie 1.1 oder I.2, insbesondere eine Lipase aus einem Bakterium der Gattung Burkholderia oder Pseudomonas, bevorzugt die Lipase aus Burkholderia cepacia, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon ist.
5. Wasch- oder Reinigungsmittel Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Faltungshelferprotein für das mindestens eine Enzym eine lipase-spezifische Foldase (Lif), insbesondere die lipase-spezifische Foldase Lif aus Burkholderia cepacia oder ein aktives Fragment davon ist.
6. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, dass die Transporterdomäne eines Autotransporterproteins ausgewählt wird aus den Transporterdomänen der Autotransportproteine der Gruppe bestehend aus: Ssp, Ssp-h1 , Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1 , SphB1 , AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espl, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21 , AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1 , McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon, vorzugsweise AIDA-I und Varianten davon.
7. Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass die Zelle oder die Membranfraktion einer Zelle eine Bakterienzelle, insbesondere eine gramnegative Bakterienzelle, vorzugsweise eine Escherichia coli Zelle, oder eine Membranfraktion einer solchen Zelle ist.
8. Verwendung eines Wasch- oder Reinigungsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Reinigung von Textilien und/oder harten Oberflächen.
PCT/EP2014/066974 2013-08-09 2014-08-07 Wasch- oder reinigungsmittel mit immobilisierter enzymkomponente WO2015018884A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102013215824.6A DE102013215824A1 (de) 2013-08-09 2013-08-09 Wasch- oder Reinigungsmittel mit immobilisierter Enzymkomponente
DE102013215824.6 2013-08-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015018884A1 true WO2015018884A1 (de) 2015-02-12

Family

ID=51292977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2014/066974 WO2015018884A1 (de) 2013-08-09 2014-08-07 Wasch- oder reinigungsmittel mit immobilisierter enzymkomponente

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102013215824A1 (de)
WO (1) WO2015018884A1 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000071692A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-30 Medical Research Council Refolding method of thrombin
WO2004078773A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Oregon Health And Science University Stabilizing proteins for use in personal care, cosmetic, and pharmaceutical products
DE102008038479A1 (de) * 2008-08-20 2010-02-25 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- oder Reinigungsmittel mit gesteigerter Waschkraft

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000071692A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-30 Medical Research Council Refolding method of thrombin
WO2004078773A1 (en) * 2003-03-03 2004-09-16 Oregon Health And Science University Stabilizing proteins for use in personal care, cosmetic, and pharmaceutical products
DE102008038479A1 (de) * 2008-08-20 2010-02-25 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- oder Reinigungsmittel mit gesteigerter Waschkraft

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHAWNA MADAN ET AL: "Co-expression of the lipase and foldase of Pseudomonas aeruginosa to a functional lipase in Escherichia coli", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 85, no. 3, 21 July 2009 (2009-07-21), pages 597 - 604, XP019778499, ISSN: 1432-0614 *
HAUSMANN SASCHA: "Einfluss des Lipase-spezifischen Chaperons LipH auf die Faltung und Sekretion der Lipasen LipA und LipC aus Pseudomonas aeruginosa", 1 April 2008 (2008-04-01), pages 1 - 202, XP002730190, Retrieved from the Internet <URL:http://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DerivateServlet/Derivate-8593/Dissertation%20Sascha%20Hausmann.pdf> [retrieved on 20140925] *
KRANEN EVA ET AL: "Autodisplay for the co-expression of lipase and foldase on the surface of E. coli: washing with designer bugs.", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 13, 19, 29 January 2014 (2014-01-29), BIOMED CENTRAL, LONDON, NL, pages 1 - 12, XP002730181, ISSN: 1475-2859, DOI: 10.1186/1475-2859-13-19 *
WILHELM SUSANNE ET AL: "Functional cell-surface display of a lipase-specific chaperone", CHEMBIOCHEM - A EUROPEAN JOURNAL OF CHEMICAL BIOLOGY,, vol. 8, no. 1, 2 January 2007 (2007-01-02), WILEY VCH, WEINHEIM, DE, pages 55 - 60, XP002730189, ISSN: 1439-4227, DOI: 10.1002/cbic.200600203 *
WU XIANGPING ET AL: "In vivo functional expression of a screened P. aeruginosa chaperone-dependent lipase in E. coli.", BMC BIOTECHNOLOGY, vol. 12, 58, 6 September 2012 (2012-09-06), BIOMED CENTRAL LTD. LONDON, GB, pages 1 - 9, XP002730180, ISSN: 1472-6750, DOI: 10.1186/1472-6750-12-58 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102013215824A1 (de) 2015-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106164236B (zh) 洗涤剂组合物
US6015783A (en) Process for removal or bleaching of soiling or stains from cellulosic fabric
FI106315B (fi) Menetelmä entsyymien stabiilisuuden parantamiseksi sekä stabiloidut entsyymit
US20200308510A1 (en) Polypeptides having rnase activity
CN110651040A (zh) 具有dna酶活性的多肽
JP2002513808A (ja) 修飾抗微生物タンパク質を含有した洗濯洗剤および／または布帛ケア組成物
JP6126086B2 (ja) プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド
EP3058057A1 (de) Proteasevarianten mit erhöhter stabilität
EP2809816A1 (de) Expressionsverfahren
US20220033799A1 (en) Polypeptides having Peptidoglycan Degrading Activity and Polynucleotides Encoding Same
CN112272671A (zh) 多肽
US10927358B2 (en) Endoglucanase compositions and methods
KR20140019436A (ko) 발현 방법
US7858354B2 (en) Subtilases
WO2014195214A1 (de) Alkoholoxidase mit aktivität für glycerol
WO2015018884A1 (de) Wasch- oder reinigungsmittel mit immobilisierter enzymkomponente
WO2017133974A1 (de) Verbesserte waschleistung durch eine alpha-amylase aus bacillus cereus
JP2003507039A (ja) マルブランケア属Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ由来アルカリ性キシログルカナーゼ
WO2020193532A1 (en) Cleaning composition having amylase enzymes
WO2010060822A1 (de) Neue proteasen und mittel enthaltend diese proteasen
WO2024037686A1 (de) Leistungsverbesserte protease-varianten x
WO2024037685A1 (de) Leistungsverbesserte protease-varianten ix
DE102022209246A1 (de) Wasch- und reinigungsmittel enthaltend tannase ii
DE102022208890A1 (de) Leistungsverbesserte protease-varianten ix
JP5714830B2 (ja) 変異アルカリセルラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14747954

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14747954

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1