KR20140019436A

KR20140019436A - 발현 방법

Info

Publication number: KR20140019436A
Application number: KR1020137029683A
Authority: KR
Inventors: 루카스 막심; 라모나 나브; 슈테판 에버스; 카를-하인츠 마우러; 요한네스 본가에르츠
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2014-02-14
Also published as: BR112013025951A2; CN103608457A; JP2014511702A; MX2013011816A; WO2012139964A1; JP6099627B2; EP2697376B1; DE102011007313A1; RU2642324C2; US20140220628A1; PL2697376T3; DK2697376T3; US9663798B2; ES2639114T3; MX348766B; JP2017079768A; CA2831473A1; RU2013150276A; EP2697376A1

Abstract

본 발명의 목적은 미생물 발효에서 단백질 산물 수율을 증가시키는 것이다. 상기 목적은 단백질을 코딩하는 제1 발현 구축물 외에도, 상기 단백질과는 상이하고 단백질분해 활성을 가지며 서열 1에 제공된 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 보조 프로테아제를 코딩하는 제2 발현 구축물을 미생물에 도입하는 방법에 의해 달성된다.

Description

발현 방법 {EXPRESSION METHOD}

본 발명은 생물공학, 보다 구체적으로는 미생물 단백질 합성 분야에 속한다. 본 발명은 특히 유전자 변형 미생물에 의해 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이며 추가로 상기 방법에 사용되는 미생물을 제안한다. 본 발명은 추가로 단백질 제조를 위한 상기 미생물의 용도에 관한 것이다.

미생물은 가치 있는 물질의 제조에 사용될 수 있다. 가치 있는 물질로는 예를 들어 저분자량 화합물, 예를 들어 식품 보조물이나 제약상 유효 화합물, 또는 단백질이 있으며, 그리고 단백질의 경우에는 단백질의 다양성 때문에 응용의 대규모 산업분야가 존재한다. 첫 번째로, 해당 미생물의 대사 특성을 이용하고/하거나 변경하여 가치 있는 물질을 제조하고 있으며; 두 번째로, 관심의 대상이 되는 단백질의 유전자를 발현하는 미생물이 바람직하게 사용되고 있다.

산업규모 생물공학적 생산의 경우, 해당 미생물을 그 미생물의 대사 특성에 알맞게 적응되는 발효조에서 배양한다. 배양하는 동안, 미생물은 공급된 기질을 대사하고 목적 산물을 형성하며, 목적 산물은 발효의 말기 후에, 통상적으로 생산 유기체로부터 분리되어 발효조 슬러리 및/또는 발효 배지로부터 정제 및/또는 농축된다. 단백질의 발효생산에서, 탄소원(전형적으로, 글루코스) 이외에도 기질로서 복합 단백질-풍부 원료가 전형적으로 사용된다. 따라서 단백질 생산이란 기질 단백질에서 표적 단백질로의 생체내변환에 해당한다. 여기에는 기질 단백질에서 개별 아미노산으로의 완전 가수분해가 요구되며, 그런 다음 이들 아미노산은 표적 단백질의 생합성에 이용가능하다.

미생물의 발효에 대해, 그 결과로서 발효조의 기술적 설계를 통해 예를 들어 형성 및 영양소 이용의 속도에 관하여 해당 균주의 최적화에서부터 해당 미생물 및/또는 발효 배지로부터 가치 있는 물질의 획득에 이르기까지 망라하는 포괄적인 종래기술이 존재한다.

통상적으로, 미생물 발효에서는 매우 높은 산물 수율이 요망된다. 예를 들어, 국제 특허출원 WO 91/02792에서는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터의 유전자 조절 서열, 보다 구체적으로는 바실루스 리케니포르미스 프로모터의 제어하에 최적화된 바실루스 리케니포르미스 균주에서 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의 알칼리성 프로테아제의 향상된 발효생산을 개시하고 있다.

우(Wu) 등으로부터의 문헌 [J. Bacteriol. 173(16), 4952-8 (1991); Appl. Environ. Microbiol. 68(7), 3261-9 (2002)]에서는 표적 단백질의 수율 증대를 위하여 미생물에 의해 내인성으로 발현된 프로테아제의 스위치 오프(switching off)를 제안하고 있다. 이는 표적 단백질의 단백질 분해를 방지하고 미생물의 합성능력을 목적 산물에 집중시키고자 하는 것이다.

높은 산물 수율을 가능케 하는 미생물 발효 방법에 대한 많은 수요가 계속되고 있다. 본 발명에 이르러 놀랍게도, 전술한 문헌과 대조적으로, 구체적으로는 특정 보조 프로테아제의 추가적인 발현이 산물 수율에 유리하다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 목적은 미생물 발효에서 특히 단백질 산물 수율을 증가시키는 것이다.

본 발명은

(a) 단백질을 코딩하는 제1 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계;

(b) 상기 단백질과는 상이하고 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 단백질분해 활성을 갖는 보조 프로테아제를 코딩하는 제2 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계; 및

(c) 단백질 및 보조 프로테아제를 미생물에서 발현시키는 단계

를 포함하는, 미생물에 의해 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 임의로는 (d) 미생물을 배양하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 따라서 발효 방법이다.

미생물에/내로의 보조 프로테아제의 도입 및 발현은 뜻밖에도, 예를 들어 합성된 표적 단백질을 분해할지도 모르는 발현된 보조 프로테아제의 단백질분해 활성에 기인하는 단백질 산물 수율(표적 단백질) 감소를 초래하지 않는다. 그 반대로, 보조 프로테아제의 발현은 단백질 산물 수율의 증가를 초래한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 보조 프로테아제는 기질 단백질의 가수분해에 관여하며, 바람직하게는 미생물의 추가적인 염색체-코딩 프로테아제(= 백그라운드 프로테아제)와 함께, 기질 단백질의 향상된 소화를 가져오며, 그리하여 단위시간당 더 많은 양의 필요 전구체 분자, 보다 구체적으로는 아미노산이 생산 과정에서 표적 단백질의 합성에 이용가능하다. 본 발명에 따른 그러한 실시양태에서, 따라서 백그라운드 프로테아제의 기질 특이성과 보조 프로테아제의 기질 특이성은 유리하게는 미생물에 의한 기질 소화에 관하여 서로 보완한다.

이와 관련하여, 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 보조 프로테아제는 발효 산물의 상당 비율을 차지해야 하는 것은 아니다. 보조 프로테아제는 이와 관련하여 단백질의 발현에 및 따라서 단백질 산물 수율에 유익한 영향을 미치지만, 발효 산물내 그의 비율은 바람직하게는 소량이거나 또는 심지어는 확인불가능한 양이다. 바람직하게는, 발효 산물내 보조 프로테아제의 비율은 25% 미만이고, 보다 더 바람직하게는 20 중량%, 15 중량%, 10 중량%, 8 중량%, 7 중량%, 6 중량%, 5 중량%, 2.5 중량%, 2 중량%, 1.5 중량%, 1 중량%, 0.5 중량%, 0.1 중량% 및 0.05 중량% 미만이다. 발효 산물은 이와 관련하여, 본 발명에 따른 방법을 수행하고, 미생물을 배양 배지에서 배양한 다음, 임의로는, 단백질이 상기 미생물에 의해 분비되지 않은 경우 그로부터 단백질을 방출시키기 위하여 미생물을 붕괴시킨 후에 단백질이 존재하는 조성물이다. 바람직하게는, 미생물 또는 그들의 단편을 발효 산물로부터 분리시킨다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 따라서 미생물에서의 단백질 발현을 증가시키는 방법이다. 방법 단계 b)의 생략이라는 점에서만 본 발명에 따른 방법과 상이하고 결과적으로 그에 따라 방법 단계 c)에서 미생물에서 보조 프로테아제가 발현되지 않는 유사 방법과 비교하여 본 발명에 따른 방법이 더 많은 양의 단백질을 생성할 때 단백질의 증가된 발현이 존재한다. 비교 대상의 두 방법은 이와 관련하여 동일 조건하에서 동일 지속기간 동안, 및 보조 프로테아제의 존재 또는 부재를 통해서만 상이한 미생물을 가지고 수행한다.

발현 구축물은 단백질 또는 보조 프로테아제가 미생물에서 발현될 수 있게 하는 핵산 서열이다. 발현 구축물은 유전정보, 즉 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열(유전자)을 포함한다. 핵산 서열의 발현은 상기 서열에 의해 코딩된 유전자 산물(들)로, 즉 폴리펩티드(단백질)로 또는 다중 폴리펩티드(단백질)로의 그의 번역이다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 출원에서 동의어로 사용된다. 본 발명의 목적상, 발현은 따라서 유전정보로부터 리보핵산(RNA) 및 단백질의 생합성을 의미한다. 일반적으로, 발현은 전사, 즉 유전자의 DNA(데옥시리보핵산) 서열에 기초한 메신저 리보핵산(mRNA)의 합성, 및 mRNA에서 상응하는 폴리펩티드 쇄로의 번역을 포함하며, 상응하는 폴리펩티드 쇄는 부가적으로 번역후 변형될 수 있다. 단백질의 발현이란 따라서 미생물에서 본 발명에 따라 존재하는 유전정보로부터의 단백질의 생합성을 말하는 것이다.

발현 구축물은 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열의 발현에 대한 제어 기능을 갖는 적어도 1종의 핵산 서열(유전자 조절 서열로 알려져 있음), 바람직하게는 DNA를 추가로 포함한다. 유전자 조절 서열은 이 경우에, 특정 미생물에서의 그의 존재를 통해서 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열의 전사 속도에 영향을 미치는, 바람직하게는 증가시키는 임의의 핵산 서열이다. 바람직하게는, 유전자 조절 서열은 프로모터 서열이며, 그 이유는 그러한 서열은 핵산 서열의 발현에 필수이기 때문이다. 그러나, 본 발명에 따른 발현 구축물은 또한 또 다른 추가 유전자 조절 서열, 예를 들어 1종 이상의 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 발현 구축물은 따라서 유전자와 프로모터로 이루어진 적어도 1종의 기능 단위를 포함한다. 그것은 반드시 그러해야 하는 것은 아니지만 물리적 실체로서 존재할 수 있다.

적어도 1종의 프로모터의 존재가 본 발명에 따른 발현 구축물에 필수이다. 프로모터는 따라서 유전자의 조절된 발현을 가능하게 하는 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 프로모터 서열은 본래 유전자의 성분이며 종종 그의 5' 말단에 및 따라서 RNA-코딩 영역의 앞쪽에 위치한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현 구축물내 프로모터 서열은 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 상류에 위치한다. 프로모터의 가장 중요한 특성은 RNA 폴리머라제에 의한 유전자의 전사 개시를 매개하며 "전사인자"로 언급되는 적어도 1종의 DNA-결합 단백질 또는 폴리펩티드와의 특이적 상호작용이다. 다양한 전사인자 및/또는 추가 단백질이 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시에 빈번하게 관여된다. 프로모터는 따라서 바람직하게는 프로모터 활성을 지닌 DNA 서열, 즉 적어도 1종의 전사인자가 적어도 일시적으로 결합하여 유전자의 전사를 개시하는 DNA 서열이다. 프로모터의 세기는 발현 유전자의 전사 속도를 통해, 즉 단위시간당 생성된 RNA 분자, 보다 구체적으로는 mRNA 분자의 개수를 통해 측정가능하다. 본 발명에 따른 발현 구축물의 프로모터는 미생물의 내인성 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터 서열은 따라서 미생물에 본래 존재한다. 이와 달리, 본 발명에 따른 발현 구축물의 프로모터는 또한 재조합 방식으로 미생물에 도입시킬 수도 있다. 이는 본 발명에 따른 발현 구축물이 구비할 수 있는 모든 추가의 유전자 조절 서열에도 동일하게 적용된다.

제1 발현 구축물은 단백질을 코딩한다. 제1 발현 구축물은 따라서 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 목적을 위해서는, 단백질로 번역될 수 있는 어떠한 목적 핵산 서열도 원칙적으로는 사용가능하다. 이 경우에, 그러한 단백질은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조될 단백질(표적 단백질)이다. 바람직하게는, 단백질은 효소, 더욱 바람직하게는 후술하는 바의 효소이다.

제2 발현 구축물은 보조 프로테아제를 코딩한다. 보조 프로테아제는 상기 단백질과는 다른 것이며, 즉 보조 프로테아제와 단백질은 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 보조 프로테아제는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50%의 정도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 정도까지, 매우 특히 바람직하게는 100%의 정도까지 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직하게는, 보조 프로테아제는 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 동일하고, 보다 더 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 정도까지 동일하고, 매우 특히 바람직하게는 100%의 정도까지 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 측정된다. 그러한 비교는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에서의 유사 연속물(similar succession)을 서로에 배정함으로써 달성된다. 상기 서열 비교는 바람직하게는 종래기술에서 확립되고 통상적으로 사용되고 있는 BLAST 알고리즘에 기초하여 수행되며(예를 들어, 문헌 [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pages 3389-3402] 참조), 주로 핵산 또는 아미노산 서열내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 유사 연속물을 서로에 배정함으로써 일어난다. 해당 위치의 표 형식 배정(tabular assignment)을 "정렬"로서 언급한다. 종래기술에서 이용 가능한 추가 알고리즘으로는 FASTA 알고리즘이 있다. 서열 비교(정렬), 보다 구체적으로는 다중 서열 비교는 통상적으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 생성된다. 빈번하게 사용되는 것으로는 예를 들어 Clustal 시리즈(예를 들어, 문헌 [Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-Coffee(예를 들어, 문헌 [Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조) 또는 상기 프로그램 또는 알고리즘에 기반한 프로그램이 있다. 본 발명의 목적상, 서열 비교 및 정렬은 바람직하게는 소정 표준 (디폴트) 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 벡터(Vector) NTI^® 스위트(Suite) 10.3(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), 미국 캘리포니아주 칼스배드 패러데이 애비뉴 1600)을 이용하여 생성된다.

그러한 비교는 서로에 대한 비교 서열의 유사성을 밝혀줄 수 있게 해준다. 비교 서열의 유사성은 통상적으로 %동일성, 즉 정렬에서의 동일 위치 또는 서로에 상응하는 위치상에서의 일치하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율로 보고된다. 상동성의 확장된 용어는 아미노산 서열의 경우에 보존된 아미노산 치환, 즉 유사 특성을 지닌 아미노산을 고려에 넣으며, 그 이유는 그들이 통상적으로 단백질내에서 유사 활성 또는 기능을 발휘하기 때문이다. 따라서, 비교 서열의 유사성은 또한 %상동성 또는 %유사성으로도 보고될 수 있다. 동일성 및/또는 상동성 값은 전체 폴리펩티드 또는 유전자 전역에 걸쳐서 또는 오로지 특정 영역만에 걸쳐서 보고될 수 있다. 상이한 핵산 또는 아미노산 서열의 상동 또는 동일 영역은 따라서 서열에서의 일치점에 의해 규정된다. 그들은 종종 동일 또는 유사 기능을 띤다. 그들은 소형일 수 있고 소수의 뉴클레오티드 또는 아미노산만을 포함할 수 있다. 그러한 소형 영역은 종종 단백질의 완전한 활성을 위한 필수 기능을 발휘한다. 따라서 특정의 아마도 소형 영역상에서만 염기 서열 일치점에 대하여 권해질만 할 수 있다. 그러나, 달리 표시하지 않는 한, 본 출원에서의 동일성 또는 상동성 값은 다양한 표시된 핵산 또는 아미노산 서열의 전장을 언급한다. 단백질, 보다 구체적으로는 효소 및 이하에서 특히 프로테아제의 경우에, 달리 표시하지 않는 한 그 값은 각종 성숙 단백질을 추가로 언급한다. 비록 관련 유전자가 번역 후에 성숙 형태로 추가로 프로세싱되는 미성숙 형태를 코딩하더라도, 달리 표시하지 않는 한, 서열 뷰(view)는 따라서 항상 성숙한 완전히 프로세싱된 단백질을 지향한다.

보조 프로테아제는 또한 단백질분해 활성을 갖는다. 보조 프로테아제는 따라서 촉매적으로 활성이며, 즉 보조 프로테아제는 활성 효소이다. 효소 활성의 측정은 이와 관련하여 - 특정 효소 유형에 적응된 - 당해분야에서의 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 활성을 측정하는 방법은 효소기술 분야의 당업자에게는 잘 알려져 있으며 당업자에에 의해 일상적으로 사용된다. 프로테아제 활성을 측정하는 방법은 예를 들어 문헌 [Tenside, volume 7 (1970), pages 125-132]에 개시되어 있다. 단백질분해 활성은 또한 기질 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드(suc-AAPF-pNA)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린(pNA)의 방출을 통해 측정될 수 있다. 프로테아제는 기질을 절단하고 pNA를 방출시킨다. pNA의 방출은 410　nm에서의 흡광도 증가를 초래하며, 시간에 따른 그의 변화가 효소 활성의 척도이다 (문헌 [Del Mar et al., 1979] 참조). 측정은 25℃의 온도, pH 8.6 및 410 nm의 파장에서 수행된다. 측정 시간은 5 min이고, 측정 간격은 20 s 내지 60 s이다. 프로테아제 활성은 바람직하게는 PU(프로테아제 단위)로 보고된다.

본 발명에 따른 핵산 및 발현 구축물은 핵산을 변형하기 위한 자체로 공지된 방법을 통해 생성될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Fritsch, Sambrook and Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989]에 의한 것, 및 생물공학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 것과 같은 관련 매뉴얼에 제시되어 있다. 그러한 방법의 예로는, 임의로는 분자생물학 및/또는 화학 또는 생화학에서의 추가의 표준 방법과 연계하여 사용되는, 화학적 합성 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 있다.

본 발명은 단백질, 보다 구체적으로는 효소의 재조합 제조에 특히 적합하다. 이러한 목적을 위하여, 제1 및 제2 발현 구축물을 미생물 내로 바람직하게는 형질전환에 의해 도입시킨다. 이와 관련하여, 특정 발현 구축물 또는 그의 일부가 바람직하게는 벡터, 보다 구체적으로는 발현 벡터를 통해 도입된다. 그러나, 완성된 발현 구축물만이 오직 미생물에서 나타나도록 하는 방식으로 발현 구축물의 일부만, 바람직하게는 적어도 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산이 미생물 내로 도입되도록 하는 것도 또한 가능하다. 이는 예를 들어 단백질에 대한 유전자 및/또는 보조 프로테아제에 대한 유전자가 숙주세포에, 염색체, 염색체 DNA 또는 다른 벡터 등과 같은 이미 존재하는 유전 요소 내로 도입되도록 해주는 벡터에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터가 단백질에 대한 유전자 또는 보조 프로테아제에 대한 유전자의 발현에 사용된다. 보다 구체적으로는, 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자는 이러한 방식으로 미생물의 내인성 프로모터에 기능적으로 연결되고 그리하여 제2 발현 구축물을 구성할 수 있다. 용어 "도입"은 따라서 발현 구축물이 전부 미생물 내로 도입, 바람직하게는 형질전환되는 가능성을 포함하지만, 또한 발현 구축물의 일부만이, 특히 바람직하게는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산이 미생물 내로 도입, 바람직하게는 형질전환되고 완전한 발현 구축물만이 오직 미생물에서 나타나는 가능성도 포함한다. 그러나, 본 발명의 목적상, 발현 구축물의 적어도 일부가 항상 미생물 내로 도입된다.

벡터는 생물공학 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 특히 박테리아에서 사용될 때, 그들 벡터는 특정 플라스미드, 즉 환상 유전 요소이다. 본 발명의 목적상, 발현 구축물은 바람직하게는 벡터 내로 클로닝된다. 벡터로는 예를 들어 박테리아 플라스미드로부터, 바이러스로부터 또는 박테리오파지로부터 유래되는 것들, 또는 주된 것들로는 매우 다양한 기원의 요소를 함유하는 합성 벡터 또는 플라스미드가 포함될 수 있다. 각 경우에 존재하는 추가 유전 요소는 벡터가 여러 세대에 걸쳐서 안정한 단위로서 미생물에 확립되도록 해준다. 이와 관련하여, 본 발명의 목적상 그들이 별도의 단위로서 염색체외에서 확립되든 또는 염색체 또는 염색체 DNA 내로 통합되든 중요하지 않다. 다수 시스템중에서 어느 것이 선택될지는 개별 경우에 따라 결정된다. 중요한 인자는 예를 들어, 달성가능한 카피수, 특히 항생제 내성을 비롯한 이용가능한 선별 시스템, 또는 벡터 섭취를 할 수 있는 미생물의 배양 가능성일 수 있다.

발현 벡터는 또한 배양조건의 변화, 예를 들어 세포 밀도 또는 특정 화합물의 첨가를 통해 조절될 수 있다. 그러한 화합물의 일례는 갈락토스 유도체 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)이며, 이는 박테리아 락토스 오페론(lac 오페론)의 활성화인자로 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단백질이 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나 보조 프로테아제가 미생물에 본래 존재하지 않는 것이라는 사실에 의해 구별된다.

이와 관련하여, "본래 존재하지 않는"이란 단백질 또는 보조 프로테아제가 미생물의 내인성 단백질 또는 효소가 아니라는 것을 의미한다. 단백질 또는 보조 프로테아제는 따라서 야생형 형태의 미생물의 염색체 DNA의 일부인 핵산 서열에 의해서 미생물에서 발현될 수 없다. 단백질 또는 보조 프로테아제 및/또는 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열은 따라서 야생형 형태의 미생물에는 존재하지 않고/않거나 야생형 형태의 미생물로부터 단리될 수 없다. 바람직하게는, 미생물에 본래 존재하지 않는 단백질 또는 미생물에 본래 존재하지 않는 보조 프로테아제 또는 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열은 유전자-기술 방법을 이용하여 미생물 내로 특이적으로 도입시키며, 그리하여 그 미생물에는 단백질 또는 보조 프로테아제 또는 단백질 또는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열이 풍부해진다. 그러나, 단백질 또는 보조 프로테아제는 물론 또 다른 미생물에 본래 존재할 수 있다 - 오로지 그 방법에 사용된 미생물만이 검토대상으로 적절하다.

단백질과 보조 프로테아제 둘 모두 미생물에 본래 존재하지 않을 수 있다. 그러나, 대안적인 실시양태에서, 단백질은 미생물에 본래 존재할 수 있고 보조 프로테아제는 미생물에 본래 존재하지 않을 수 있다. 추가의 대안적인 실시양태에서, 또한 단백질은 미생물에 본래 존재하지 않도록 하고 보조 프로테아제는 미생물에 본래 존재하도록 하는 것도 가능하다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 보조 프로테아제가 미생물에서 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체한다는 사실에 의해 구별된다. 이 경우에, 적어도 1종의 현존하는 염색체 프로테아제가 본 발명에 따른 보조 프로테아제로서 작용하는 이종 프로테아제로 치환된다. 바람직하게는, 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열을 미생물의 프로테아제를 코딩하는 염색체 핵산 서열 내로 도입시킨다. 그 결과, 염색체-코딩 프로테아제는 기능적으로 불활성화된다. 미생물은 염색체-코딩 프로테아제 대신에 보조 프로테아제를 발현한다. 보조 프로테아제의 발현을 위해, 염색체-코딩 프로테아제를 위해 사용된 오리지널 프로모터를 사용하는 것이 가능하며, 그에 따라 제2 발현 구축물은 이 경우에 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 염색체-코딩 프로테아제의 프로모터 서열, 즉, 미생물의 천연 프로모터 서열도 포함한다. 이와 달리, 보조 프로테아제 전용의 프로모터를 사용하는 것이 가능하며, 그에 따라 제2 발현 구축물은 이 경우에 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열 이외에는, 염색체-코딩 프로테아제의 프로모터 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 제2 발현 구축물은 이 경우에 미생물의 비천연 프로모터 서열을 포함한다. 보조 프로테아제 전용의 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터는 바람직하게는 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열과 함께 미생물의 프로테아제를 코딩하는 염색체 핵산 서열 내로 도입된다. 추가의 대안적인 실시양태에서, 보조 프로테아제의 발현을 위해, 염색체-코딩 프로테아제용으로 사용된 프로모터 및 보조 프로테아제 전용의 프로모터 둘 모두를 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 염색체-코딩 프로테아제 외에도 보조 프로테아제가 미생물에서 발현된다는 사실에 의해 구별된다. 이 경우에, 본 발명에 따른 보조 프로테아제로서 작용하는 이종 프로테아제에 의해 미생물에 추가적인 단백질분해 활성이 제공된다. 제2 발현 구축물은 따라서 바람직하게는 적어도 보조 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열 및 또한 보조 프로테아제의 발현을 목적으로 하는 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 제2 발현 구축물은 이 경우에 미생물의 비천연 프로모터 서열을 포함한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 보조 프로테아제가 미생물에서 적어도 80%의 정도까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 정도까지, 매우 특히 바람직하게는 100%의 정도까지 서열 2에 나타낸 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체한다는 사실에 의해 구별된다. 특히 바람직하게는, 염색체-코딩 프로테아제는 서열 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, 보다 더 바람직하게는 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 정도까지, 매우 특히 바람직하게는 100%의 정도까지 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특히 바람직하게는, 그러한 프로테아제는 박테리아, 보다 구체적으로는 바실루스 속의 하나인 미생물에서, 및 이하에서 바람직하게는 바실루스 리케니포르미스에서 대체된다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단백질의 발현이 보조 프로테아제의 발현에 의해 증진된다는 사실에 의해 구별된다. 이미 앞서 설명하였듯이, 본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서 보조 프로테아제의 발현은 단백질 산물 수율의 증가를 초래한다. 이러한 증가는 미생물에 의한 증가된 발현, 즉 단백질의 증가된 합성에 의해 달성된다. 보조 프로테아제는 기질 단백질의 가수분해에 관여되며, 임의로는 미생물의 추가적인 염색체-코딩 프로테아제와 함께, 배양중에 미생물에 공급되는 기질 단백질의 향상된 소화를 가져온다. 그 결과, 더 많은 양의 필요 전구체 분자, 보다 구체적으로는 아미노산이 단백질의 합성에 이용가능하다.

이 문제는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 전사 속도 및 목적 단백질로의 그의 번역에 의해, 즉 단위시간당 생성된 단백질의 개수에 의해 결정된다. 번역 단계는 발현의 결정에 포함된다. 보조 프로테아제의 부재 때문에 본 발명에 따른 방법과는 상이한 방법이 비교로서의 역할을 한다. 그러한 비교는 측정의 비교가능성을 확보하도록 동일 유형의 미생물에서 동일 조건하에서 본 발명에 따라 행해진다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 방법은 단백질이 효소, 보다 구체적으로는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 만나나제, 탄나제, 크실라나제, 크산타나제, 크실로글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 카라기나제, 퍼히드롤라제, 옥시다제, 옥시도리덕타제 또는 리파제라는 사실에 의해 구별된다. 매우 특히 바람직하게는, 단백질은 프로테아제이다. 생산하고자 하는 프로테아제(= 표적 프로테아제)는 이어서 단백질 기질의 가수분해에도 또한 동시에 관여되며, 유리하게는 기질 단백질의 더욱 향상된 소화를 가져올 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 유리하게는 후술하는 효소를 제조하는 것이 가능하다.

프로테아제 가운데 서브틸리신이 바람직하다. 그의 예로는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스로부터의 알칼리성 프로테아제, 서브틸리신 DY 및 서브틸라제에 배정된 효소가 있지만, 좁은 의미에서는 서브틸리신에 배정되지 않는 것으로 여기에는 써미타제, 프로테이나제 K 및 프로테아제 TW3와 TW7이 있다. 서브틸리신 칼스버그는 노보자임즈 에이/에스(Novozymes A/S, 덴마크 백스배어드)사로부터 알칼라제(Alcalase)^®라는 상표명으로 추가 개발된 형태로 입수가능하다. 서브틸리신 147 및 309는 노보자임즈사에서 에스페라제(Esperase)^® 또는 사비나제(Savinase)^®라는 상표명으로 판매하고 있다. 바실루스 렌투스로부터의 DSM 5483 프로테아제에서 유래하는 것으로는 블랩(BLAP)^®이라는 이름으로 알려진 프로테아제 변이체가 있다. 추가의 바람직한 프로테아제로는 또한 예를 들어 퍼(PUR)라는 이름으로 알려진 효소가 있다. 추가적인 프로테아제로는 또한 듀라짐(Durazym)^®, 릴라제(Relase)^®, 에버라제(Everlase)^®, 나피짐(Nafizym)^®, 나탈라제(Natalase)^®, 칸나제(Kannase)^® 및 오보자임(Ovozyme)^®(이상, 노보자임즈)이라는 상표명으로 입수가능한 효소, 퓨라펙트(Purafect)^®, 퓨라펙트^® 옥스피(Purafect^® OxP), 퓨라펙트^® 프라임(Purafect^® Prime), 엑셀라제(Excellase)^® 및 프로퍼라제(Properase)^®(이상, 제넨코, Genencor)라는 상표명으로 입수가능한 효소, 프로토졸(Protosol)^®(어드밴스트 바이오케미컬즈 리미티드(Advanced Biochemicals Ltd.), 인도 테인)라는 상표명으로 입수가능한 효소, 욱시(Wuxi)^®(욱시 스나이더 바이오프로덕츠 리미티드(Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.), 중국)라는 상표명으로 입수가능한 효소, 프롤레더(Proleather)^® 및 프로테아제 피(Protease P)^®(이상, 아마노 파마슈티컬즈 리미티드(Amano Pharmaceuticals Ltd.), 일본 나고야)라는 상표명으로 입수가능한 효소, 및 프로테이나제(Proteinase) K-16(가오 코포레이션(Kao Corp.), 일본 도쿄)하에 입수가능한 효소가 있다. 또한 바람직한 것으로는 추가로 바실루스 깁소니이(Bacillus gibsonii) 및 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus)로부터의 프로테아제가 있으며, 이들은 국제 특허출원 WO2008/086916 및 WO2007/131656에 개시되어 있다.

아밀라제의 예로는 바실루스 리케니포르미스로부터의 α-아밀라제, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 α-아밀라제 또는 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터의 α-아밀라제, 및 특히, 또한 세척제 또는 세정제에서의 사용을 위해 개선된 그들의 추가 개발품이 있다. 바실루스 리케니포르미스로부터의 효소는 노보자임즈사로부터 테르마밀(Termamyl)^®라는 이름으로 및 대니스코(Danisco)/제넨코사로부터 퓨라스타(Purastar)^®ST라는 이름으로 입수가능하다. 이러한 α-아밀라제의 추가 개발 제품은 노보자임즈사로부터 듀라밀(Duramyl)^® 및 테르마밀^®울트라(Termamyl^®ultra)라는 상표명으로, 대니스코/제넨코사로부터 퓨라스타^®옥스앰(Purastar^®OxAm)이라는 이름으로 및 다이와 세이코 인코포레이티드(Daiwa Seiko Inc., 일본 도쿄)사로부터 케이스타제(Keistase)^®로서 입수가능하다. 바실루스 아밀로리퀘파시엔스의 α-아밀라제는 노보자임즈사에서 밴(BAN)^®이라는 이름으로 판매하고 있으며, 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제의 유도 변이체 역시도 노보자임즈사에서 BSG^® 및 노바밀(Novamyl)^®이라는 이름으로 판매하고 있다. 또한, 바실루스 종 A 7-7(DSM 12368)로부터의 α-아밀라제 및 바실루스 아가어드히어런스(Bacillus agaradherens, DSM 9948)로부터의 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라제(CGTase)도 언급되어야 할 것이다. 마찬가지로, 전술한 모든 분자의 융합 산물이 사용가능하다. 더욱이, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 및 아스페르길루스 오리재(A. Oryzae)로부터의 α-아밀라제의 추가 개발품이 적합하며, 상기 추가 개발품은 노보자임즈사로부터 펑가밀(Fungamyl)^®이라는 상표명으로 입수가능하다. 추가의 유리한 시판 제품으로는 예를 들어 아밀라제인 파워라제(Powerase)^®(대니스코/제넨코) 및 아밀라제인 아밀라제-엘티(Amylase-LT)^®, 스테인자임(Stainzyme)^® 및 스테인자임 플러스(Stainzyme plus)^®(이상, 노보자임즈)가 있다. 점 돌연변이에 의해 수득가능한 이들 효소의 변이체 또한 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 추가의 바람직한 아밀라제가 공개 명세서 WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177 및 WO　07/079938에 개시되어 있으며, 이들의 개시내용은 따라서 명백히 본원에 참고로 포함되며, 그들의 관련 개시내용은 따라서 명백히 본 특허출원에 편입된다. 본 발명에 따라 제조하고자 하는 아밀라제는 또한 바람직하게는 α-아밀라제이다.

리파제 또는 큐티나제의 예로는 휴미콜라 라누지노사(Humicola lanuginosa) (써모미세스 라누지노수스, Thermomyces lanuginosus)로부터 유래하는 원상태로 이용가능하거나 또는 보다 개발된 형태의 리파제, 보다 구체적으로는 아미노산 치환 D96L을 갖는 것들이 있다. 이들은 예를 들어 노보자임즈사에서 리폴라제(Lipolase)^®, 리폴라제^®울트라(Lipolase^®Ultra), 리포프라임(LipoPrime)^®, 리포자임(Lipozyme)^® 및 리펙스(Lipex)^®라는 상표명으로 판매되고 있다. 또한, 예를 들어, 푸사리움 솔라니 피사이(Fusarium solani pisi) 및 휴미콜라 인솔렌즈(Humicola insolens)로부터 처음 단리된 큐티나제를 제조하는 것이 가능하다. 대니스코/제넨코사로부터, 예를 들어, 출발 효소가 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) 및 푸사리움 솔라니로부터 처음 단리된 리파제 또는 큐티나제를 제조하는 것이 가능하다. 언급되어야 할 추가의 중요한 시판 제품으로는 기스트-브로케이즈(Gist-Brocades) (현(現) 대니스코/제넨코)사에서 처음 판매한 제제인 엠1 리파제(M1 Lipase)^®와 리포맥스(Lipomax)^® 및 메이토 산교 가부시키가이샤(Meito Sangyo KK, 일본)사에서 리파제 엠와이-30(Lipase MY-30)^®, 리파제 오에프(Lipase OF)^® 및 리파제 피엘(Lipase PL)^®이라는 이름으로 판매하는 효소, 및 또한 대니스코/제넨코사로부터의 제품 루마패스트(Lumafast)^®가 있다.

셀룰라제 (엔도글루카나제, EG)의 예는 셀루자임(Celluzyme)^®이라는 상표명으로 노보자임즈사에서 공급하는 진균 엔도글루카나제(EG)-풍부 셀룰라제 제제, 또는 그의 추가 개발품의 연속물을 포함한다. 역시 노보자임즈사로부터 입수가능한 제품인 엔돌라제(Endolase)^® 및 케어자임(Carezyme)^®은 각각 휴미콜라 인솔렌즈 DSM 1800으로부터의 50 kD EG 및 43 kD EG를 기재로 한다. 제조될 수 있는 상기 회사의 추가 시판 제품으로는 셀루소프트(Cellusoft)^®, 레노자임(Renozyme)^® 및 셀루클린(Celluclean)^®이 있다. 예를 들어, 에이비 엔자임즈(AB Enzymes, 핀란드)사로부터 에코스톤(Ecostone)^® 및 바이오터치(Biotouch)^®라는 상표명으로 입수가능하고 적어도 부분적으로는 멜라노카르푸스(Melanocarpus)로부터의 20 kD EG을 기재로 하는 셀룰라제를 제조하는 것이 또한 가능하다. 에이비 엔자임즈사로부터의 추가의 셀룰라제로는 에코나제(Econase)^® 및 에코펄프(Ecopulp)^®가 있다. 추가의 적합한 셀룰라제는 바실루스 종 CBS 670.93 및 CBS 669.93으로부터 유래하며, 바실루스 종 CBS 670.93으로부터의 것은 대니스코/제넨코사로부터 퓨라닥스(Puradax)^®라는 상표명으로 입수가능하다. 제조될 수 있는 대니스코/제넨코사의 추가 시판 제품으로는 "제넨코 디터전트 셀룰라제 엘(Genencor detergent cellulase L)" 및 인디에이지^®뉴트라(IndiAge^®Neutra)가 있다.

본 발명에 따르면, 점 돌연변이에 의해 수득가능한 이들 효소의 변이체를 제조하는 것이 또한 가능하다. 특히 바람직한 셀룰라제는 국제 공개 명세서 WO 98/12307에 개시되어 있는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris) 셀룰라제 변이체, 국제 공개 명세서 WO 97/14804에 개시되어 있는 멜라노카르푸스, 보다 구체적으로는 멜라노카르푸스 앨보미세스(Melanocarpus albomyces)로부터의 셀룰라제, 유럽 특허출원 EP 1 305 432에 개시되어 있는 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)로부터의 EGIII 셀룰라제 또는 그로부터 수득가능한 변이체, 보다 구체적으로는 유럽 특허출원 EP 1240525 및 EP 1305432에 개시되어 있는 것들, 및 또한 국제 공개 명세서 WO 1992006165, WO 96/29397 및 WO 02/099091에 개시되어 있는 셀룰라제이다. 그들의 각 개시내용은 따라서 명백히 본원에 참고로 포함되며, 그들의 관련 개시내용은 따라서 명백히 본 특허출원에 편입된다.

또한, 용어 "헤미셀룰라제"에 의해 망라되는 추가 효소를 제조하는 것이 가능하다. 이러한 것들로는 예를 들어, 만나나제, 크산탄 리아제, 크산타나제, 펙틴 리아제(=펙티나제), 펙틴에스테라제, 펙테이트 리아제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 풀루라나제 및 β-글루카나제가 포함된다. 이와 관련하여 적합한 효소는 예를 들어, 가마나제(Gamanase)^®, 펙티넥스 에이알(Pektinex AR)^®과 펙타웨이(Pectaway)^®(이상, 노보자임즈), 로하펙(Rohapec)^® B1L(에이비 엔자임즈) 및 파이롤라제(Pyrolase)^®(다이버사 코포레이션(Diversa Corp.), 미국 캘리포니아주 샌디에고)라는 이름으로 입수가능하다. 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 수득되는 β-글루카나제는 세레플로(Cereflo)^®(노보자임즈)라는 이름으로 입수가능하다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 헤미셀룰라제는 만나나제이며, 예를 들어 만나웨이(Mannaway)^®(노보자임즈) 또는 퓨라브라이트(Purabrite)^®(제넨코)라는 상표명으로 판매되고 있다.

또한, 옥시도리덕타제, 예를 들어 옥시다제, 옥시게나제, 카탈라제, 퍼옥시다제, 예컨대 할로퍼옥시다제, 클로로퍼옥시다제, 브로모퍼옥시다제, 리그닌 퍼옥시다제, 글루코스 퍼옥시다제 또는 망간 퍼옥시다제, 디옥시게나제 또는 락카제(페놀 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제)를 제조하는 것도 가능하다. 언급되어야 하는 적합한 시판 제품으로는 데닐라이트(Denilite)^® 1 및 2(이상, 노보자임즈)가 있다. 추가의 효소는 국제 특허출원 WO 98/45398, WO 2005/056782, WO 2004/058961 및 WO 2005/124012에 개시되어 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 방법은 미생물이 박테리아라는 사실에 의해 구별된다.

박테리아는 본 발명에 따른 방법에서의 바람직한 미생물이다. 박테리아는 배양조건의 관점에서 짧은 세대시간 및 낮은 요구성을 갖는다. 그 결과, 비용-효과적인 배양 방법 또는 제조 방법을 확립하는 것이 가능하다. 또한, 발효 기술에서 박테리아의 경우에는 당업자에게 풍부한 경험이 이용가능하다. 그램-음성 및 그램-양성 박테리아 둘 모두 적합할 수 있다.

그램-음성 박테리아, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 경우, 다수의 단백질이 주변세포질 공간, 즉 세포를 감싸는 두 막 사이의 구획 내로 분비된다. 이러한 점은 특정 적용에 유리할 수 있다. 또한, 발현 단백질을 주변세포질 공간 내로뿐만 아니라 박테리아 주변의 배지 내로도 배출하도록 하는 방식으로 그램-음성 박테리아를 구성하는 것도 가능하다. 이와는 반대로, 그램-양성 박테리아, 예를 들어 간균(桿菌) 또는 방선균과(科) 또는 방선균목(目)의 기타 대표균과 같은 미생물은 외막이 없으며, 그에 따라 분비 단백질은 박테리아 주변의 배지, 일반적으로 배양 배지 내로 바로 방출되며, 그로부터 발현 단백질을 정제해낼 수 있다. 발현 단백질은 배지로부터 직접 단리되거나 또는 추가 프로세싱될 수 있다.

본 발명에 따라 바람직한 박테리아는 에스케리키아, 클레브시엘라(Klebsiella), 부르크홀데리아(Burkholderia), 바실루스, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 슈도모나스 및 비브리오(Vibrio) 속(屬)의 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 박테리아는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 부르크홀데리아 글루매(Burkholderia glumae), 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 깁소니이, 바실루스 푸밀루스, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 비브리오 메츠크니코비이(Vibrio metschnikovii)의 군으로부터 선택된 것이다. 바실루스 리케니포르미스가 매우 특히 바람직하다.

그러나, 미생물은 또한 핵을 보유함을 특징으로 하는 진핵생물 세포일 수 있다. 원핵생물 세포와는 반대로, 진핵생물 세포는 형성된 단백질을 번역후 변형할 수 있다. 진핵생물 세포의 예로는 진균, 예컨대 방선균과 또는 효모균, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로미세스(Kluyveromyces)가 있다. 이는 예를 들어, 단백질이 그의 합성과 함께 그러한 시스템에 의해 허용되는 특이적 변형을 거치게 하려는 경우에 특히 유리할 수 있다. 진핵생물 시스템이 특히 단백질 합성과 함께 수행하는 변형은 예를 들어 막 앵커 또는 올리고사카라이드와 같은 저분자량 화합물의 결합을 포함한다. 그러한 올리고사카라이드 변형은 예를 들어 발현 단백질의 알레르기유발성을 낮추는 데에 바람직할 수 있다. 그러한 세포에 의해 자연적으로 형성된 효소, 예를 들어 셀룰라제 또는 리파제와의 공발현(coexpression) 또한 유리할 수 있다. 또한, 호열성 진균 발현 시스템은 예를 들어 내열성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합할 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 미생물은 배양조건의 관점에서 그들의 필요 조건에 관하여 변형될 수 있고, 다른 또는 추가적인 선별마커를 보유할 수 있거나, 또는 또 다른 또는 추가적인 단백질을 발현할 수 있다. 보다 구체적으로는, 미생물은 다중 표적 단백질을 트랜스제닉 발현하는 것들일 수 있다. 바람직하게는, 그들은 단백질(표적 단백질)을 미생물 주위의 배지 내로 분비한다.

본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 미생물은 관례적인 방식으로, 예를 들어 배치 시스템 또는 연속 시스템에서 배양 및 발효시킬 수 있다. 첫 번째의 경우에, 적당한 배양 배지를 미생물로 접종하고, 실험적으로 측정하고자 하는 기간의 경과 후에 배지로부터 단백질을 수확한다. 연속 발효는 비교적 장기간에 걸쳐서 세포가 부분적으로 사멸하기도 하지만 또한 다시 증식하기도 하며 형성된 단백질이 동시에 배지로부터 제거될 수 있는 안정 상태의 달성을 수반한다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 발효 방법이다. 발효 방법은 종래기술로부터 그 자체로 공지되어 있으며 실제 공업규모 생산 단계를 구성하고, 일반적으로는 제조된 단백질에 대한 적당한 정제 방법이 후속된다. 단백질을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법을 수반하는 모든 발효 방법은 본 발명 요지의 실시양태를 구성한다.

발효가 흡입 전략(intake strategy)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 하나의 특별한 가능성이다. 이 경우에, 진행중인 배양에 의해 소모되는 배지 성분은 부가적으로 공급된다. 그 결과, 세포 밀도와 세포 매스 또는 건조질량 모두에서 상당한 증가가 달성될 수 있다. 또한, 발효는 바람직하지 못한 대사산물이 걸러지거나 또는 각 경우에 적당한 완충제 또는 반대이온의 첨가에 의해 중화되도록 하는 방식으로 또한 구성될 수 있다.

제조된 단백질은 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 그러한 발효 방법은 미생물로부터의 단백질 단리, 즉, 세포 매스 (건조질량)로부터의 산물 프로세싱보다 바람직하다. 이는 예를 들어 1종 이상의 적합한 분비 마커 또는 메커니즘 및/또는 수송 시스템의 적합한 미생물을 제공함으로써 달성될 수 있으며, 그리하여 미생물은 단백질을 발효 배지 내로 분비한다. 분비의 부재하에서는, 대안적으로 숙주세포로부터 단백질을 단리하는 것, 즉 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올로의 침전에 의해 또는 크로마토그래피 정제에 의해 세포 매스로부터 단백질을 정제하는 것이 가능하다.

본 발명은

(a) 단백질을 코딩하는 제1 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계; 및

(b) 상기 단백질과는 상이하고 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 단백질분해 활성을 갖는 보조 프로테아제(= Blap S)를 코딩하는 제2 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계

를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 미생물을 추가로 제공한다.

이는 따라서 본 발명에 따른 방법의 요지일 수 있는 모든 미생물이다. 본 발명에 따른 방법에서 기술하는 모든 사실, 요지 및 실시양태는 본 발명 요지에 또한 적용가능하다. 따라서, 이 시점에서는 개시내용이 본 발명에 따른 미생물에도 또한 적용됨을 나타내고 있는 상응하는 시점에서의 개시내용이 명백히 참조된다.

본 발명에 따른 미생물의 특히 바람직한 실시양태는

(a) 단백질이 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나,

(b) 보조 프로테아제가 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나,

(c) 보조 프로테아제가 미생물에서 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체하거나, 또는 염색체-코딩 프로테아제 외에도 보조 프로테아제가 미생물에서 발현되고/거나,

(d) 보조 프로테아제의 발현이 단백질의 발현을 증진시키고/거나,

(e) 미생물이 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아, 클레브시엘라, 부르크홀데리아, 바실루스, 스타필로코쿠스, 코리네박테리움, 아르트로박터, 스트렙토미세스, 스테노트로포모나스, 슈도모나스 및 비브리오 속의 군으로부터 선택된 것, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라, 부르크홀데리아 글루매, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 글로비기이, 바실루스 깁소니이, 바실루스 푸밀루스, 스타필로코쿠스 카르노수스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 아르트로박터 옥시단스, 스트렙토미세스 리비단스, 스트렙토미세스 코엘리컬러, 스테노트로포모나스 말토필리아 및 비브리오 메츠크니코비이의 군으로부터 선택된 것이라는 사실에 의해 구별된다. 바실루스 리케니포르미스가 매우 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 미생물은 단백질 제조를 위하여 유리하게는 본 발명에 따른 방법에 사용된다. 그 결과로서, 본 발명은 따라서 단백질, 보다 구체적으로는 효소를 제조하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명에 따른 방법 및 미생물에 대하여 기재하는 모든 사실, 요지 및 실시양태는 본 발명 요지에 또한 적용가능하다. 따라서, 이 시점에서는 개시내용이 본 발명에 따른 용도에도 또한 적용됨을 나타내고 있는 상응하는 시점에서의 개시내용이 명백히 참조된다.

실시예

모든 분자생물학 절차적 단계는 예를 들어 문헌 [Fritsch, Sambrook and Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989]에 의한 매뉴얼, 또는 필적하는 관련 연구에서 명시하는 바처럼 표준 방법을 따른다. 효소, 키트 및 기구는 각 제조업자로부터의 사용설명서에 준하여 사용하였다.

실시예 1

바실루스 리케니포르미스에서 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자로 서열 2에 따른 프로테아제를 코딩하는 유전자(aprE)를 치환함

하기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하였다 (5'→3' 배향으로 명시):

치환은 aprE 유전자를 먼저 테트라사이클린 내성 유전자 tet로 치환시킨 중간 단계를 이용하여 달성하였다. aprE 유전자를 tet 유전자로 치환하기 위하여, 프라이머 aprE1와 aprE2 및 프라이머 aprE3와 aprE4를 사용하여 aprE 유전자의 상류 및 하류에 위치한 각각 1033 bp 및 1015 bp의 서열 세그먼트(플랭크(flank) A 및 B)를 증폭하였다. 프라이머 aprE2 및 aprE3의 적당한 오버행(overhang)으로 인하여, 외측 프라이머 aprE1 및 aprE4를 사용하여 융합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 두 플랭크를 융합시켰다. 2018 bp 융합 PCR 산물을 벡터 pE194 (문헌 [Horinouchi & Weisblum, J. Bacteriol. (150), pages 804ff. (1982)])의 PstI 및 XbaI 제한 부위 내로 클로닝하였다. tet 유전자를 프라이머 tet5 및 tet6를 사용하여 플라스미드 pBC16(Bernhard et al., J. Bacteriol. (133), pages 897ff., (1978))로부터 증폭한 다음 융합 aprE 플랭크의 중앙 BamHI 및 HindIII 제한 부위 내로 클로닝하였다 (도 1 참조). 수득된 플라스미드 pRK25을 바실루스 리케니포르미스에 형질전환시켰다. 선별은 30℃에서 5 ㎍/ml 에리트로마이신과 15　㎍/ml 테트라사이클린 둘 모두로 달성하였다. 42℃에서 배양 후, 통합 벡터를 함유한 클론을 0.3 ㎍/ml 에리트로마이신에서의 성장에 의해 동정하였다. 에리트로마이신의 사용 없이 42℃에서의 갱신 배양 후(renewed culturing), 테트라사이클린 내성 및 PCR에 의해, tet 유전자로의 aprE 유전자의 성공적인 치환에 대하여 스크리닝한 클론을 수득하였다 (바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::tet, 도 2 참조).

tet 유전자를 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자로 치환하기 위하여, 프라이머 aprE1와 aprE7 및 프라이머 aprE8와 aprE4를 사용하여 aprE 유전자의 상류 및 하류에 위치한 각각 1061 bp 및 1058 bp의 서열 세그먼트(플랭크 C 및 D)를 증폭하였다. 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자를 프라이머 ziel9 및 ziel10을 사용하여 플라스미드 pCB76R49CK로부터 증폭하였다. 프라이머 aprE7와 ziel9 및 aprE8와 ziel10의 적당한 오버행으로 인하여, 외측 프라이머 aprE1 및 aprE4를 사용하여 융합 PCR에 의해 두 플랭크를 보조 프로테아제 PCR 산물과 융합시켰다. 3704 bp 융합 PCR 산물을 벡터 pRK25(도 1 참조)의 PstI 및 NdeI 제한 부위 내로 클로닝하였다. 수득된 플라스미드 pRK19를 바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::tet(상기 참조)에 형질전환시켰다. 30℃에서 5 ㎍/ml 에리트로마이신으로 선별을 달성하였다. 42℃에서 배양 후, 통합 벡터를 함유하는 클론을 0.3 ㎍/ml 에리트로마이신에서의 성장에 의해 동정하였다. 항생제의 사용 없이 42℃에서의 갱신 배양 후, 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자로의 tet 유전자의 성공적인 치환에 대하여 PCR에 의해 스크리닝한 클론을 수득하였 다 ( 바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::보조 프로테아제, 도 2 참조).

실시예 2

생산 균주 바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::보조 프로테아제를 사용한 프로테아제(표적 단백질)의 발효생산

바실루스 리케니포르미스 출발 균주 및 치환 돌연변이체 ΔaprE::보조 프로테아제를 프로테아제(표적 단백질)에 대한 생산 플라스미드를 사용하여 형질전환시켰다. 생성되는 생산 균주를 표준 발효 방법에 사용하였으며 수득된 프로테아제 활성을 측정하였다. 출발 균주와 비교하여, 2 리터 실험실 발효조에서의 수율이 65%까지 증가하였다 (도 3 참조). 표적 프로테아제의 발현이 뚜렷하게 증가하였으므로, 측정된 프로테아제 활성은 실질적으로 표적 프로테아제의 활성에 기초하였다. 이는 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::보조 프로테아제/표적 프로테아제의 배양물의 발효 상청액의 분비 분석에 의해 입증되었다 (참조: 도 4; t는 배양시간; AP103은 보조 프로테아제(두 밴드); AP217은 표적 프로테아제이다). 표적 프로테아제와 비교하여, 배양 상청액에는 극소량의 보조 프로테아제만이 존재한다.

<도면의 간단한 설명>

도 1: 각각 테트라사이클린 내성 유전자 tet 및 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자로 서열 2에 따른 프로테아제를 코딩하는 유전자(aprE)의 염색체 치환을 위한 벡터 pRK25 및 pRK19의 구축을 도시하는 다이어그램. 화살표는 유전자 ydeD, aprE 및 yhfN의 판독 프레임, ▶는 프라이머, 및 막대는 PCR 산물을 표시한다.

도 2: 바실루스 리케니포르미스에서 aprE 유전자의 유전자 위치. 도면은 야생형 위치(상단), 테트라사이클린 내성 유전자 tet으로의 aprE 유전자의 pRK19-매개 치환(중앙), 및 서열 1에 따른 보조 프로테아제를 코딩하는 유전자로의 테트라사이클린 내성 유전자 tet의 pRK25-매개 치환(하단)을 도시한다.

도 3: 생산 균주 바실루스 리케니포르미스/표적 프로테아제 및 바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::보조 프로테아제/표적 프로테아제의 상대적 수율. 균주를 표적 프로테아제의 생산을 위한 표준 발효 방법에 사용하였다.

도 4: 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 본 발명에 따른 방법에서 또는 본 발명에 따른 미생물(바실루스 리케니포르미스 ΔaprE::보조 프로테아제/표적 프로테아제, 또한 도 3 참조)에서의 발효 상청액의 분비 분석. 표적 프로테아제의 발현 및 분비가 뚜렷하게 증가하였으므로, 증가된 프로테아제 활성은 실질적으로 표적 프로테아제의 활성을 기초로 하였다 (t: 배양시간; AP103: 보조 프로테아제 (두 밴드); AP217: 표적 프로테아제; Mpr: 추가의 사이즈 마커).

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Expressionsverfahren <130> H 08980 PCT <150> DE102011007313.2 <151> 2011-04-13 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Ala Gln Thr Ile Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Met Ala Pro Gly Val Asn Ile Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Asp Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala 260 265 270 Ala Gln <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE1 <400> 3 aaactgcagc gtaccggctc cttgaaagg 29 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE2 <400> 4 gagaagacta agcttcccga ggatcccgaa tgacaggaga ttgctccatc 50 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE3 <400> 5 ttcgggatcc tcgggaagct tagtcttctc attctgatga aggttgttca atattttgaa 60 tcc 63 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE4 <400> 6 aaatctagat agacctcgaa gaggagaagc 30 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer tet5 <400> 7 gcggatccaa acgggccata ttgttgtata ag 32 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer tet6 <400> 8 ccaagcttct ctcgtatctt ttattcagca atcgc 35 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE7 <400> 9 cgaaagtatg aatagaccgc ttcagcctgg cagggaaaga ggtcccgagg 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer aprE8 <400> 10 ctgccgctca ataacatatt ctaacaaata gcatatagaa aaagctagtg 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer ziel9 <400> 11 ctgccaggct gaagcggtct attcatactt tcgaactgaa catttttcta 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer ziel10 <400> 12 atttgttaga atatgttatt gatcggcagc ttcgacattg atcagacctt 50

Claims

(a) 단백질을 코딩하는 제1 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계;
(b) 상기 단백질과는 상이하고 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 단백질분해 활성을 갖는 보조 프로테아제를 코딩하는 제2 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계; 및
(c) 단백질 및 보조 프로테아제를 미생물에서 발현시키는 단계
를 포함하는, 미생물에 의해 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 단백질이 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나 보조 프로테아제가 미생물에 본래 존재하지 않는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 보조 프로테아제가 미생물에서 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체하거나, 또는 염색체-코딩 프로테아제 외에도 보조 프로테아제가 미생물에서 발현되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 보조 프로테아제가 미생물에서 서열 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 발현이 보조 프로테아제의 발현에 의해 증진되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 효소, 보다 구체적으로는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 만나나제, 탄나제, 크실라나제, 크산타나제, 크실로글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 카라기나제, 퍼히드롤라제, 옥시다제, 옥시도리덕타제 또는 리파제인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 부르크홀데리아(Burkholderia), 바실루스(Bacillus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 비브리오(Vibrio) 속의 군으로부터 선택된 것, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 부르크홀데리아 글루매(Burkholderia glumae), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 깁소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 및 비브리오 메츠크니코비이(Vibrio metschnikovii)의 군으로부터 선택된 것인 방법.
(a) 단백질을 코딩하는 제1 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계; 및
(b) 상기 단백질과는 상이하고 서열 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하며 단백질분해 활성을 갖는 보조 프로테아제를 코딩하는 제2 발현 구축물을 미생물 내로 도입하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 미생물.
제8항에 있어서,
(a) 단백질이 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나,
(b) 보조 프로테아제가 미생물에 본래 존재하지 않는 것이고/거나,
(c) 보조 프로테아제가 미생물에서 적어도 1종의 염색체-코딩 프로테아제를 대체하거나, 또는 염색체-코딩 프로테아제 외에도 보조 프로테아제가 미생물에서 발현되고/거나,
(d) 보조 프로테아제의 발현이 단백질의 발현을 증진시키고/거나,
(e) 미생물이 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아, 클레브시엘라, 부르크홀데리아, 바실루스, 스타필로코쿠스, 코리네박테리움, 아르트로박터, 스트렙토미세스, 스테노트로포모나스, 슈도모나스 및 비브리오 속의 군으로부터 선택된 것, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라, 부르크홀데리아 글루매, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 글로비기이, 바실루스 깁소니이, 바실루스 푸밀루스, 스타필로코쿠스 카르노수스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 아르트로박터 옥시단스, 스트렙토미세스 리비단스, 스트렙토미세스 코엘리컬러, 스테노트로포모나스 말토필리아 및 비브리오 메츠크니코비이의 군으로부터 선택된 것인 미생물.
단백질, 보다 구체적으로는 효소의 제조를 위한 제8항 또는 제9항에 따른 미생물의 용도.