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Die vorliegende Anmeldung betrifft
den Faktor PrfB (peptide chain release factor B; RF-2) aus Bacillus licheniformis
sowie alle mindestens zu 93% auf Aminosäure-Ebene und mindestens zu
80% auf DNA-Ebene identischen Faktoren PrfB. Sie betrifft ferner
die zusätzliche
Bereitstellung des Faktors PrfB und/oder eines in seiner Aktivität verbesserten
Faktors PrfB zur Steigerung der Proteinbildungsrate bei Verfahren
zur Proteinherstellung durch grampositive oder gramnegative Bakterien.
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Gentechnische Verfahren zur Proteinherstellung
sind im Stand der Technik seit langem etabliert. Hierfür werden
die Gene für
die interessierenden Proteine in Wirtszellen eingebracht und von
diesen transkribiert, translatiert und ggf. durch die betreffenden
Membranen in das Periplasma, bzw. das umgebende Medium sekretiert.
Besonders zu diesem Zweck etablierte Wirtszellen sind gramnegative
Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli oder Klebsiella,
oder grampositive Bakterien, wie beispielsweise Spezies der Gattungen
Staphylococcus oder Bacillus.
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Bei gentechnischen Verfahren zur
Proteinherstellung werden zunächst
die natürlichen
Fähigkeiten
der zur Produktion eingesetzten Mikroorganismen zur Synthese und
ggf. zur Sekretion der Proteine ausgenutzt. Grundsätzlich werden
als bakterielle Systeme zur Proteinherstellung solche ausgewählt, die
etabliert und kostengünstig
in der Fermentation sind, die eine hohe Produktbildungsrate versprechen
und die eine korrekte Faltung, Modifizierung etc. des herzustellenden
Proteins gewährleisten.
Letzteres ist mit zunehmender Verwandtschaft mit dem das interessierende
Protein ursprünglich
produzierenden Organismus umso wahrscheinlicher. Im Einzelfall werden
geeignete Systeme experimentell ermittelt. Eine hohe Produktbildungsrate
ist dabei aus wirtschaftlichen Gründen besonders erstrebenswert.
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Zur Steigerung der aus dem jeweils
gewählten
System erzielbaren Ausbeute an gebildetem Protein sind zahlreiche
sich ergänzende
und überwiegend
auch gleichzeitig anwendbare Strategien erarbeitet worden. Hierzu
gehören
beispielsweise Optimierungen, die (1.) auf den physiologischen Zustand
der jeweils gewählten Wirtszellen
einwirken, etwa die Nährmedienzusammensetzung
oder Prozeßparameter
wie die Belüftung
(beispielsweise
EP 211241
A2 ), (2.) genetische Optimierungen, wie beispielsweise
Anpassungen in der Codon-Usage, Erhöhung der Kopienzahl des Transgens,
etwa durch Verwendung sogenannter Multicopynumber-Plasmide (beispielsweise
DD 277468 A1 ),
oder Erhöhung
der Lebensdauer der zugehörigen
mRNA und (3.) die Erhöhung
der Transkriptions- und/oder der Translationsrate, etwa durch Etablierung
geeigneter Kontrollelemente. So ist beispielsweise gemäß WO 92/19721
A2 eine Regulation über
Faktoren bzw. Gene möglich,
die auf die Transkription wirken.
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Diese zuletzt genannte Strategie
setzt also an der Sekretion der gebildeten Proteine in das Periplasma (bei
gramnegativen Bakterien) bzw. in das umgebende Medium (sowohl bei
gramnegativen als auch bei grampositiven Bakterien) an, die prinzipiell
in dem Aufsatz von A.J. Driessen (1994): „How proteins cross the bacterial
cytoplasmic membrane" in
J. Membr. Biol., Band 142(2), Seite 145–159 beschrieben ist. Der dazu
notwendige Sekretionsapparat besteht aus einer Reihe unterschiedlicher,
hauptsächlich
membranassoziierter Proteine. Hierzu gehören z.B. bei Bacillus subtilis
die Proteine SecA, DF, E, G und Y (van Wely, K.H., Swaving, J.,
Freudl, R., Driessen, A.J. (2001): „Translocation of proteins
across the cell envelope of Gram-positive bacteria", FEMS Microbiol
Rev. 2001, Band 25(4), Seite 437–454). Voraussetzung für die Translokation
ist, daß die
auszuschleusenden Proteine N-terminal über ein Signalpeptid verfügen (Park,
S., Liu, G., Topping, T.B., Cover, W.H., Randall, L.L. (1988): „Modulation
of folding pathways of exported proteins by the leader sequence", Science, Band 239,
Seite 1033–1035).
Eine in Hinblick auf die vorliegende Anmeldung ergänzte Darstellung
des Translokationsapparats ist in 5 gezeigt.
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Der Translokation vorgeschaltet ist
naturgemäß die Proteinsynthese,
die ebenfalls in 5 angedeutet
ist. Nach der an den Ribosomen erfolgten Translation wird die entstandene
Peptidkette durch cytoplasmatische Proteine mit Chaperon-Funktion
in einem ungefalteten Zustand gehalten und zur Membran transportiert. Dann
wird unter ATP-Verbrauch der Transport des Peptids durch die Membran
katalysiert (Mitchell, C., Oliver, D. (1993): „Two distinct ATP-binding
domains are needed to promote Protein export by Escherichia coli
SecA ATPase", Mol.
Microbiol., Band 10(3), Seite 483–497), wobei SecA als energieliefernde
Komponente (ATPase) fungiert. Nach Überwindung der Membran wird
das Signalpeptid durch die Aktivität einer Signalpeptidase abgespalten
und damit das extrazelluläre
Protein von der Membran abgelöst.
Bei grampositiven Bakterien erfolgt auf diese Weise die Ausschleusung
der Exoproteine direkt ins umgebende Medium. Bei gramnegativen Bakterien
befinden sich die Proteine anschließend in der Regel im Periplasma
und es bedarf weiterer Modifikationen, um ihre Freisetzung in das
umgebende Medium zu erreichen.
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Nach der Lehre von WO 94/19471 A1
kann die Proteinbildungsrate durch Überexpression des an der Translokation
beteiligten Faktors PrsA erzielt werden. Die beiden Anmeldungen
WO 99/04406 A1 und WO 99/04407 A1 lehren, die Proteinproduktion
durch grampositive Bakterien könne
durch eine verstärkte
Expression der Transmembranproteine SecG bzw. SecDF gesteigert werden.
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Die Anmeldung WO 01/81597 A1 betrifft
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gramnegative
Bakterien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Produkte in das umgebende
Medium abgegeben werden. Dies wird demnach dadurch erreicht, daß gleichzeitig
zu dem das Transgen regulierenden System ein zweites System aktiv
wird, das die äußere Membran
der Bakterien partiell öffnet.
Hierbei handelt es sich um Systeme, die natürlicherweise nicht mit dem
Proteinsynthese oder -Translokationsapparat vergesellschaftet sind,
sondern im Gegenteil einen eher pathologischen Zustand der Zelle
kennzeichnen, beispielsweise das Colicin- oder das Kil-System.
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Der Faktor PrfB (peptide chain release
factor B; auch RF2) ist als Teil des Apparats zur Proteinsynthese
aus dem Stand der Technik bekannt, und zwar sowohl bei grampositiven
als auch bei gramnegativen Bakterien. Er ist im Zusammenhang mit
der Translation insbesondere für
die Ablösung
der fertig translatierten Proteine vom Ribosom, d.h. für die Termination
der Translation verantwortlich. Dies ist in 5 über
einen Pfeil angedeutet.
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Der Zusammenhang mit der ebenfalls
dort dargestellten und oben erläuterten
Translokation ist jedoch nur indirekt gegeben, nämlich darüber, daß das Gen prfB in vielen Bakterien
gleichzeitig mit einem Gen für
ein Translokationsprotein exprimiert wird (vgl. Bsp. 1 und 3). Nach der Publikation
von Herbort et al. (1999; „Temporal
expression of the Bacillus subtilis secA gene, encoding a central
component of the preprotein translocase", J. Bacteriol., Band 181 (2), Seiten
493–500)
liegt das zugehörige
Gen prfB bei B. subtilis hinter dem für den Faktor SecA als zweites
auf einem bicistronischen Operon. Nach diesem Artikel werden beide
Gene zusammenhängend
und gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase maximal exprimiert,
was mit der höchsten
Sekretionsrate von Exoenzymen einhergeht. In der stationären Wachstumsphase
nimmt die Bildungsrate von SecA, und damit auch von PrfB demgegenüber wieder
deutlich ab.
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Die Arbeit von Karow et al. (1998; „Suppression
of TGA mutations in the Bacillus subtilis spoIIR gene by prfB mutations", J. Bacteriol.,
Band 180 (16), Seiten 4166–70)
offenbart die Aminosäuresequenzen
der PrfB aus den Mikroorganismen B. subtilis, Streptomyces coelicolor,
E. coli, Salmonella typhimurium und Haemophilus influenzae. In der
Publikation von Pel et al. (1993, „Sequence comparison of new
prokaryotic and mitochondrial members of the polypeptide chain release
factor family predicts a five-domain model for release factor structure", Nucleic Acids Res.,
Band 20 (17), Seiten 4423–38)
werden die Sequenzen der Faktoren mRF-1 aus Mitochondrien, und RF-1
und RF-2 aus B. subtilis miteinander verglichen und für diese
eine Mehrdomänenstruktur
vorgeschlagen. Hierunter soll der Domäne V des jeweiligen Faktors
die Aufgabe zukommen, mit dem Stop-Codon der mRNA in Wechselwirkung
zu treten, und die bis ungefähr
zur Aminosäure
110 des PrfB aus B. subtilis reichende Domäne I soll die Bindung ans Ribosom,
an der Berührungsstelle
der beiden ribosomalen Untereinheiten, nahe dem L7/L12-Finger der
großen
Untereinheit vermitteln.
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Der Faktor PrfB ist also bereits
aus verschiedenen Mikroorganismen isoliert und sequenziert worden. Die
betreffenden Sequenzen sind zumeist in allgemein zugänglichen
Datenbanken hinterlegt, beispielsweise bei dem National Center for
Biotechnlogy Information (NCBI), National Library of Medicine, Building
38A, Bethesda, MD 20894, USA; zugänglich über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Beispielsweise die aus E. coli und aus Bacillus subtilis tragen
dort die Eintragungsnummern Q8XD56 bzw. NP_391409. Aus B. licheniformis
ist der Faktor PrfB dagegen bislang noch nicht beschrieben worden.
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Für
PrfB ist bislang auch noch keine gewerbliche Anwendbarkeit vorgeschlagen
worden, insbesondere nicht für
den aus B. licheniformis oder hierzu hochhomologe Moleküle. Insbesondere
die Bereitstellung dieses Faktors im Überschuß zur Steigerung der Proteinsyntheserate
und damit der Ausbeute an insgesamt hergestelltem Protein ist im
Stand der Technik noch nicht beschrieben worden. Sie käme für die fermentative
Herstellung von Proteinen und darauf aufbauende Verfahren zur Protein-Herstellung
in Betracht. Ebensowenig gibt es Literatur über die Modifizierung von PrfB
durch Punktmutagenese und eine auf diese Weise mögliche Steigerung der Syntheserate
von fermentativ hergestellten Proteinen.
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Es stellte sich die Aufgabe, zusätzlich zu
den im Stand der Technik beschriebenen Systemen ein weiteres System
zu etablieren, nach welchem die Verfahren zur Proteinherstellung
durch Fermentation von Bakterien hinsichtlich einer erhöhten Ausbeute
weiter verbessert werden können.
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Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe zeigt zwei
grundsätzliche
Aspekte. Zum einen wird sie durch Bereitstellung eines Faktors PrfB
(Peptide chain release factor B) mit einer Aminosäuresequenz
gelöst, die
zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz eine gewisse Homologie
aufweist. Der andere grundsätzliche
Aspekt besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Proteinherstellung
durch Fermentation von Bakterien, die allgemein dadurch gekennzeichnet
sind, daß der
Faktor PrfB (peptide chain release factor B) in den das Protein
herstellenden Zellen in einer höheren
Aktivität
als natürlicherweise
in diesen Zellen vorliegt. Dieser zweite Aspekt führt diesen
Faktor einer wichtigen gewerblichen Anwendung zu.
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Denn wie im Modellsystem B. licheniformis überraschenderweise
gefunden wurde, führt
eine erhöhte PrfB-Aktivität insgesamt
zu einer Ausbeutesteigerung bei der Proteinherstellung (Beipiel
3). Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, könnte man
vermuten, daß dieser
Effekt darauf zurückzuführen ist,
daß eine Erhöhung der
PrfB-Aktivität die Ablösung neu
gebildeter Aminosäureketten
von den Ribosomen beschleunigt und somit die betreffenden Ribosomen
rascher für
die Synthese weiterer Proteine zur Verfügung stehen. Anhand jeder einzelnen
mRNA dürften
somit mehr Proteine synthetisiert werden als im Vergleich zum normalen intrazellulären PrfB-Aktivitätsniveau.
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Der genannte erste Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen Faktor PrfB (Peptide chain release factor
B) mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von
mindestens 93% Identität
aufweist.
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Wie einleitend bereits dargestellt
sind im Stand der Technik bereits Faktoren PrfB aus verschiedenen Mikroorganismen
beschrieben worden. Ihre Funktion im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese
ist wohlbekannt und wird beispielsweise durch 5 illustriert. Überraschenderweise ist der
Faktor PrfB aus Bacillus licheniformis bislang noch nicht beschrieben
worden.
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In Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung
ist dargestellt, wie ausgehend von einer bekannten prfB-Sequenz
die eines unbekannten PrfB gefunden werden kann. In diesem Fall
wurde auf der Grundlage der für
B. subtilis bekannten Sequenz diejenige aus B. licheniformis identifiziert.
Sowohl die Aminosäure-
als auch die Proteinsequenz des PrfB aus B. subtilis sind in den
bekannten Datenbanken hinterlegt; zusätzlich werden sie unter SEQ
ID NO. 9 und 10 angeben. Insbesondere die DNA-Sequenz kann als Sonde
verwendet werden, um in weiteren Organismen die betreffenden Homologe
zu finden. Zu dem gleichen Zweck können auch die übrigen im
Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen verwendet werden. Dem Fachmann
ist es somit über
Routine-Methoden und insbesondere in Anlehnung an Beispiel 1 möglich, weitere
PrfB aufzufinden.
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Eine regulatorische Besonderheit
von PrfB besteht, wie in Beispiel 1 ebenfalls erläutert ist,
darin, daß im
zugehörigen
Gen eine Leserahmenverschiebung vorliegt. Für E. coli ist dies beispielsweise
in der Publikation „Identification
of the mutations in the prfB gene of Escherichia coli K12, which
confer UGA suppressor activity" von
Wu, E.D., Inokuchi, H. und Ozeki, N., in Jpn. J. Genet. (1990),
Band 65(3), Seiten 115 bis 119 beschrieben. Ein korrekter PrfB von
B. licheniformis wird nur dadurch erhalten, daß bei der Transkription das
T in Position 73 übersprungen
und sie erst ab der nachfolgenden Position fortgesetzt wird. Hierüber wird,
wie auch im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung jeweils
angemerkt ist, die Expression dieses Faktors reguliert. Dies gilt
sowohl für
die in Beispiel 1 beschriebene Wildtypsequenz aus B. licheniformis
DSM 13 (SEQ ID NO. 1 und 2) als auch für die der in Beispiel 2 beschriebenen
Mutante B. licheniformis E (SEQ ID NO. 3 und 4).
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Die DNA- und Aminosäure-Sequenzen
für B.
halodurans sind in SEQ ID NO. 5 und 6, beispielsweise aber auch
in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information
NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www3.ncbi.nlm.nih.gov)
unter den Nummern NC_002570 bzw. E48100 angegeben. Hier liegt keine
Leserahmenverschiebung vor. Dafür
weist dieses Gen bzw. Protein die Besonderheit auf, daß das Initiationscodon
TTG mit der Aminosäure
Methionin übersetzt
wird.
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Die beiden nachfolgend im Sequenzprotokoll
offenbarten, wie einleitend erläutert
aber auch allgemein zugänglichen
Faktoren sind die Faktoren PrfB aus E. coli und B. subtilis. Sie
weisen wiederum die genannte Leserahmenmutation auf. Und zwar wird
bei E. coli das T in Position 76 und in B. subtilis das T in Position
73 überlesen,
um einen vollständigen
PrfB zu synthetisieren. Dadurch ergeben sich die unter SEQ ID NO.
8 bzw. 10 angegebenen Aminosäuresequenzen.
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In all diesen Organismen ist zumindest über Homologievergleiche
nachgewiesen, daß dieses
Gen prfB für
einen Faktor codiert, der wie einleitend dargestellt die physiologisch
wichtige Funktion übernimmt,
im Verlaufe der Proteinbiosynthese die Termination der Translation
zu katalysieren. In diesem Sinne handelt es sich um einen Peptide
chain release factor B.
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Die Recherchen in den öffentlich
zugänglichen
Datenbanken (GenBank: National Center for Biotechnology Information
NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; EMBL-European
Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien) mit den nach Beispiel
1 aus B. licheniformis DSM 13 erhaltenen Seqenzen ergaben folgende
am nächsten
verwandte Gene bzw. Faktoren: Das nächstähnliche Gen ist das prfB aus
B. subtilis. Homologievergleiche auf DNA- und auf Aminosäureebene
ergaben hierfür Ähnlichkeiten von
78,5, bzw. 92,4% Identität.
Der zweitähnlichste,
vorbeschriebene Faktor ist PrfB aus B. halodurans mit 63% und der
drittähnlichste
der aus E. coli mit 45,7% Identität auf Aminosäure-Ebene.
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Aus diesem Grund werden erfindungsgemäß Homologe
mit mindestens 93% Identität
auf Aminosäure-Ebene
beansprucht. Hierzu gehören
sowohl Wildtyp-Enzyme als auch Varianten, die beispielsweise durch gezielte
oder ungezielte Mutagenese erhalten werden können.
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Die gewerbliche Einsetzbarkeit dieses
Faktors besteht erfindungsgemäß insbesondere
darin, daß er zur
Erhöhung
der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultur von Mikroorganismen
dienen kann. Aus diesem Grund sind innerhalb des genannten Homologiebereichs
insbesondere solche PrfB bevorzugt, die hinsichtlich der Ausbeuteerhöhung bei
der Proteinherstellung durch Kultur von Mikroorganismen eine vorteilhafte Wirkung
zeigen. Hierzu zählen
ganz besonders solche Varianten von Wildtypenzymen, die über Mutagense hinsichtlich
dieser Einsatzmöglichkeit
verbessert worden sind.
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Zunehmend bevorzugt sind solche Faktoren
PrfB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO.2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt
eine Homologie von 94%, 94,5% 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%
98%, 98,5%, 99%, 99,5% Identität
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweisen.
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Denn umso ähnlicher sind sie damit dem
gefundenen und in den Beispielen als erfindungsgemäß einsetzbar
beschriebenen PrfB aus B. licheniformis DSM 13.
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Als Variante des PrfB aus B. licheniformis
DSM 13 ist in den Beispielen 2 und 3 B. licheniformis E untersucht
worden. Er zeichnet sich, wie dort dargelegt und auch in den 1 und 2 dargestellt ist, durch zahlreiche Mutationen
aus, von denen aber nur zwei auf die Aminosäure-Ebene durchschlagen. Dabei
handelt es sich um die beiden Positionen, die in homologer Lage
den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO.2
entsprechen und dort die Aminosäuren
Asparagin (N) bzw. Serin (S) aufweisen. Gegenüber dem Wildtypmolekül handelt
es sich bei dem PrfB aus B. licheniformis E also um eine Doppelvariante
S71N/N100S.
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Wie in Beispiel 3 belegt ist, wirkt
sich diese Mutation vorteilhaft auf die Proteinbildungs- oder zumindest Proteinsekretionsate
aus. Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, könnte man
vermuten, daß dieser
Effekt auf verbesserte intramolekulare Interaktionen innerhalb dieses
Faktors zurückzuführen ist.
Aufgrund der erfindungsgemäß technisch
bedeutenden Einsatzmöglichkeit
von PrfB als ein die Proteinherstellung verbessernder Faktor sind
solche Varianten besonders bevorzugt.
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In Beispiel 1 ist nicht eigentlich
die Gewinnung des Faktors PrfB aus B. licheniformis DSM 13 sondern die
der zugehörigen
Nukleinsäure
beschrieben. Diese ist auch in SEQ ID NO. 1 und im Vergleich zu
der von prfB aus B. licheniformis E in 2 angegeben. Da diese nicht vorbeschrieben
worden ist und das nächstähnliche
Gen, nämlich
das prfB aus B. subtilis eine Ähnlichkeit
von 78,5% Identität
auf DNA-Ebene aufweist, erstreckt sich der Schutzbereich auf entsprechend ähnlichere
Nukleinsäuren.
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Beansprucht werden also alle Faktoren
PrfB, die von einer Nukleinsäure
mit einer Nukleotidsequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID
NO.1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 80%
Identität
aufweist.
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Zunehmend bevorzugt sind solche,
die von einer Nukleinsäure
mit einer Nukleotidsequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID
NO.1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von
82,5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87,5%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,
92,5%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5% Identität und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweisen.
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Entsprechend dem oben Gesagten gilt
dies insbesondere für
leistungsverbesserte Varianten eines Faktors PrfB, insbesondere
solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die betreffende Nukleinsäure für eine,
vorzugsweise beide Positionen, die in homologer Lage den Positionen
71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin
(N) bzw. Serin (S) codiert.
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Entsprechend diesen Ausführungen
gilt der Schutz auch für
die zugehörigen
Nukleinsäuren.
Denn insbesondere über
diese wird die vorliegende Erfindung realisiert, wenn beispielsweise
in einer bestimmten Zelle der betreffende Faktor in einer erhöhten Aktivität bereitgestellt
werden soll.
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Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind dementsprechend für
einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie
von mindestens 80% Identität
aufweisen.
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Hierunter sind die für einen
Faktor PrfB codierenden Nukleinsäuren
zunehmend bevorzugt, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz
eine Homologie von 82,5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87,5%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 92,5%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 99%,
99,5% Identität und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweisen.
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Dies gilt insbesondere für einen
Faktor PrfB codierende Nukleinsäuren,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie für eine, vorzugsweise beide
Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen
Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin
(N) bzw. Serin (S) codieren.
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Jeweils sehr hochverwandte, in diesem
Schutzbereich liegende erfindungsgemäße Gene werden erhalten, wenn
durch Deletion des den Leserahmen verschiebenden Nukleotids ein
durchgehendes Leseraster erzeugt wird. Dies könnte zum einen die Bildungsrate
des betreffenden Faktors und damit seine intrazelluläre Aktivität steigern
und zum anderen das betreffende Gen für den Einsatz in einem Mikroorganismus
prädestinieren,
der in vivo nicht über
solch eine Leserahmenverschiebung innerhalb des Gens prfB verfügt.
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In bevorzugten Ausführungsformen
wird die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung betreffender
Vektoren verwirklicht. Weil dadurch die betreffenden Gene charakterisiert,
kultiviert und in Wirtszellen eingebracht werden können. Dementsprechend
werden Vektoren, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren enthalten,
insbesondere solche, die für
einen der oben beschriebenen Faktoren PrfB codieren.
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Bevorzugte derartige Vektoren sind
dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei ihnen um Klonierungsvektoren und/oder um Expressionsvektoren
handelt, vorzugsweise um solche, die nach Transformation stabil in
den abgeleiteten Bakterienstämmen
gehalten werden können.
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Denn insbesondere die Klonierungsvektoren
dienen der Charakterisierung, etwa durch Sequenzierung oder der
dauerhaften Lagerung. Expressinsvektoren verwirklichen die vorliegende
Erfindung, indem sie die transformierten Zellen dazu bringen, das
betreffende Protein zu bilden. Auf diese Weise werden sie erfindungsgemäß wirksam.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn hierdurch dauerhaft transformierte
Stämme
erhalten werden, die beispielsweise zu einer Schar von abgeleiteten,
verwandten Stämmen
weiterentwickelt werden können,
indem sie zusätzlich
mit jeweils anderen Genen für
interessierende, für
die Produktion gedachte Proteine transformiert werden. Insbesondere
auf den Plasmiden vorhandene Replikationsursprünge und Resistenzmarker erlauben
es, daß die
betreffenden Plasmide stabil in den Zellen gehalten werden können. Bei
Expressionsvektoren ist es zusätzlich
besonders vorteilhaft, wenn das prfB-Gen unter der Kontrolle eines
induzierbaren Promotors steht. Hierdurch kann die Steigerung der
Proteinbildungsrate zu einem bestimmten Zeitpunkt von außen vorgenommen
werden.
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Entsprechend dem oben Gesagten wird
die Erfindung auch durch Zellen verwirklicht, die durch Transformation
mit einer der beschriebenen Nukleinsäuren erhalten worden sind oder
sich von solch einer Zelle ableitet, insbesondere durch Transformation
mit einem der beschriebenen Vektoren.
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Hierunter sind solche bevorzugt,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen der beschriebenen Faktoren
PrfB produzieren. Dies dient einerseits der Gewinnung und biochemischen
Charakterisierung dieses Proteins. Andererseits sind eben solche
Zellen, die ein erfindungsgemäßes PrfB
produzieren und somit intrazellulär über eine höhere PrfB-Aktivität als Wildtypzellen
verfügen,
besonders leistungsfähig
hinsichtlich der Proteinbildungsrate.
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Als letzte Ausführungsform dieses ersten Erfindungsaspekts
sind Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen Faktors
PrfB zu nennen. Denn durch solche Verfahren erhält man diesen Faktor in seiner reinen
Form. Entsprechend dem oben Gesagten geschieht dies molekularbiologisch
unter Einsatz einer der beschriebenen Nukleinsäuren, besonders bevorzugt unter
Einsatz eines der beschriebenen Vektoren und ganz besonders bevorzugt
unter Einsatz einer zuvorbeschriebenen, dieses Gen enthaltenden
bzw. exprimierenden Zelle. Denn über
diese Schritte erfolgt üblicherweise
die Gewinnung des Faktors in Reinform.
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Wie oben bereits erwähnt besteht
der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung in Verfahren zur Proteinherstellung
durch Kultivierung von Bakterien, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß der
Faktor PrfB (peptide chain release factor B) in den das Protein
herstellenden Zellen in einer höheren
Aktivität
als natürlicherweise
in diesen Zellen vorliegt.
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Dies macht den Faktor PrfB gegenüber seinen
Beschreibungen im Stand der Technik, die bislang eher akademischen
Charakter besessen haben, wirtschaftlich interessant. Mit ihm steht
neben anderen Möglichkeiten,
die eingangs dargestellt worden sind, ein weiterer Ansatzpunkt zur
Verfügung, über den
die Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien hinsichtlich
ihrer Ausbeute verbessert werden kann. Bislang sind insbesondere
Verbesserungen vorgenommenen worden, die (1.) auf den physiologischen
Zustand der jeweils gewählten
Wirtszellen einwirken, (2.) genetische Optimierungen, oder (3.)
die Erhöhung
der Transkriptions-, Translations- oder der Translokationsrate darstellen
(s.o.). Es steht zu erwarten, daß der nun zur Verfügung gestellte
neue Ansatzpunkt mit den bisherigen Techniken kombiniert werden
kann und somit bislang bereits befriedigende Ausbeuten weiter gesteigert
werden können.
In Einzelfällen,
wo eine der bisherigen Methoden nicht erfolgreich gewesen sein mag,
stellt dieser neue Ansatz eine neue Alternative dar.
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Verfahren zur Proteinherstellung
durch Kultivierung von Bakterien sind an sich bekannt. Es können also
prinzipiell alle Proteinherstellungsverfahren auf diese Weise weiter
verbessert werden. Insbesondere gilt dies für Verfahren, die auf der Kultivierung
in flüssigen
Medien und hierunter insbesondere auf der Fermentation beruhen.
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Da für keines dieser Verfahren die
Bedeutung des Faktors PrfB zuvor diskutiert worden ist, ist die
Verwirklichung der vorliegenden Erfindung nicht allein auf die mit
der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Faktoren PrfB
beschränkt.
Prinzipiell können
alle in den für
die Proteinherstellung gedachten Zellen funktionierenden PrfB eingesetzt
werden. Dies scheint umso erfolgversprechender, je näher verwandt
der betreffende PrfB mit dem jeweils endogen in diesen Zellen vorhandenen
PrfB ist.
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Ein bevorzugtes Verfahren zur Proteinherstellung
durch Kultivierung von Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß die höhere PrfB-Aktivität auf zusätzliche
Expression des für
diesen Faktor PrfB codierenden Gens prfB zurückzuführen ist.
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Dies wird durch Beispiel 3 veranschaulicht,
wo zusätzlich
zu dem endogenen prfB auf einem Plasmid ein prfB eingebracht wird,
welches für
dieses prfB einen konstitutiven Promotor trägt. Bereits in dem Fall, wo das
endogene prfB in einer zweiten identischen Kopie vorgelegt wird
(pCU3Ery-prfB(DSM13)), ist die Proteinbildungsrate gegenüber dem
mit dem leeren Vektor transformierten Vergleichsstamm erhöht.
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Ein besonders bevorzugtes Verfahren
ist dabei dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Expression des Faktors
PrfB auf zusätzliche
Kopien des Gens prfB im Genom der betreffenden Bakterien zurückzuführen ist,
vorzugsweise aufgrund deren stabilen Etablierung in den abgeleiteten
Bakterienstämmen
nach vorangegangener Transformation.
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Denn die stabile Transformation mit
diesem leistungssteigernden Element ermöglicht es, wie oben ausgeführt, nach
demselben Prinzip Produktionsstämme
für eine
Vielzahl verschiedener interessierender Produkte herzustellen. Eine
stabile Etablierung kann beispielsweise über geeignete, auf den Vektoren
mit dem prfB-Gen gelegenen Selektionsmarkern oder durch Integration
des prfB ins bakterielle Chromosom erzielt werden. Hierdurch würde die,
auch in Beispiel 3 vorgenommene Selektion über eine extern zugesetzte
Substanz entfallen.
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Besonders vorteilhaft ist es, einen
endogenen PrfB, der in dem möglicherweise
aus anderen Gründen interessanten
Produktionsstamm weniger aktiv ist, gegen einen leistungsfähigeren
PrfB zu ersetzen. So legt etwa Beispiel 3 nahe, daß es sinnvoll
ist, das in B. licheniformis DSM endogen vorhandene Gen prfB gegen das
punktmutierte Gen aus B.licheniformis E auszutauschen. Dies kann
beispielsweise über
eine homologe Rekombination erfolgen. Zusätzlich ergibt sich die Möglichkeit,
beispielsweise über
die oben ausgeführten Vektoren
zusätzliche
Genkopien in die betreffende Zelle einzubringen und damit über den
Gendosiseffekt eine zusätzliche
Leistungssteigerung zu erzielen.
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Ein entsprechend bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren
ist somit dadurch gekennzeichnet, daß in den das Protein herstellenden
Zellen der endogene Faktor PrfB durch einen PrfB mit höherer Aktivität ersetzt worden
ist, vorzugsweise unter Ersatz mindestens eines endogen vorhandenen
prfB-Gens durch das für
den prfB mit höherer
Aktivität
codierende prfB-Gen.
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Vorteilhafterweise wird hierbei und
bei allen anderen bisher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien auf die
mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Elemente zurückgegriffen.
Denn diese stellen, wie insbesondere in den Beispielen gezeigt,
brauchbare Werkzeuge dafür
dar.
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Derartige Verfahren sind dadurch
gekennzeichnet, daß die
zusätzliche
PrfB-Aktivität
durch einen erfindungsgemäß mit dem
Faktor PrfB aus B. licheniformis verwandten Faktor erzielt wird,
vorzugsweise mit Hilfe einer in diesem Zusammenhang ausgeführten Nukleinsäure, besonders
bevorzugt mit Hilfe eines entsprechenden Vektors und ganz besonders
bevorzugt durch eine entsprechend transformierte Zelle. Bei dieser
Zelle handelt es sich also um den Produzenten eines interessierenden
Proteins, die zusätzlich
einen erfindungsgemäßen PrfB
bereitstellt und damit hinsichtlich ihrer Produktbildungsrate verbessert
ist.
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Aufgrund der großen Bedeutung, die grampositiven,
und hierunter bestimmten grampositiven Bakterien bei der technischen
Proteinherstellung zukommt, ist ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren
dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei den das Protein herstellenden Zellen um grampositive Bakterien
handelt, vorzugsweise der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien
oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus,
Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis,
B. amyloliquefaciens, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders
um Stämme
von B. licheniformis oder B. amyloliquefaciens.
-
Wie oben gesagt ist insbesondere
dann eine erfindungsgemäße Leistungssteigerung
zu erwarten, wenn der die Proteinsynthese verbessernde Faktor PrfB
mit der betreffenden Proteinsynthesemaschinerie gut zusammenarbeitet.
Hierfür
besteht besonders dann eine hohe Wahrscheinlichkeit, wenn der PrfB
ursprünglich aus
einem verwandten Organismus stammt. Dies betrifft also die Wildtyp-Sequenzen
der bereitgestellten PrfB und solche PrfB, die ausgehend von diesen
Wildtyp-Sequenzen hinsichtlich ihrer Leistungssteigerung in der Proteinsynthese
verbessert worden sind, insbesondere über Punktmutagenese.
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Ein derartiges Verfahren für grampositive
Mikroorganismen ist somit dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche
PrfB-Aktivität
durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypsegenz aus
einem grampositiven Bakterium stammt.
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Bevorzugt ist ein derartiges Verfahren,
wenn es dadurch gekennzeichnet ist, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch
einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung wie die
das Protein herstellenden grampositiven Bakterien stammt, vorzugsweise
aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben Stamm.
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Besonders leicht zu realisierende,
weil mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellte derartige Verfahren
sind dadurch gekennzeichnet, daß ein
PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus B. licheniformis,
B. halodurans oder B. subtilis ableitet, vorzugsweise einer Wildtypsequenz
nach SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 bzw. SEQ ID NO. 10, besonders bevorzugt
codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz nach
SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5 bzw. SEQ ID NO. 9 ableitet.
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Denn hierbei handelt es sich die
betreffenden Wildtyp-Sequenzen aus den genannten grampositiven Mikroorganismen.
Im Falle eines anderen grampositiven Bakteriums erscheint es dennoch
vielversprechend, die Leistungssteigerung ersteinmal mit einem der
hier angegebenen Faktoren bzw. Gene zu versuchen. Vorteilhafterweise
werden hiervon leistungsverbesserte Varianten eingesetzt. Insbesondere
die Wahlmöglichkeit zwischen
den Segenzen aus B. halodurans und den anderen Bacilli bietet einen
guten Ansatzpunkt, weil in den zuletzt genannten Fällen in
vivo über
eine Leserahmenverschiebung reguliert wird, bei B. halodurans aber nicht
(s.o.). Diese Eigenheit sollte vorteilhafterweise mit den entsprechenden
Regulationsfähigkeiten
des Wirtsorganismus korrelieren. Andernfalls bietet sich, wie bereits
oben gesagt, die Möglichkeit, über Punktmutagenese
einen durchgängigen
Leserahmen zu erzeugen und entsprechende Vorteile zu erzielen.
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Insbesondere für die Charakterisierung von
Genen und Proteinen im Labormaßstab
aber auch für
die großtechnische
Produktion werden auch gramnegative Bakterien eingesetzt. Entsprechend
ihrer Bedeutung sind auch entsprechende erfindungsgemäße Proteinherstellungsverfahren
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung.
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Derartig bevorzugte Verfahren mit
den zuvor dargestelltten Eigenschaften sind zusätzlich dadurch gekennzeichnet,
daß es
sich bei den das Protein herstellenden Zellen um gramnegative Bakterien
handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere
um Stämme
von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella
planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia
coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1
oder Klebsiella planticola (Rf).
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Entsprechend dem für die grampositiven
Organismen Gesagten sind Verfahren auf der Grundlage dieser Organismen
dadurch gekennzeichnet, daß die
zusätzliche
PrfB-Aktivität
durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypsegenz aus
einem gramnegativen Bakterium stammt.
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Weiter bevorzugt sind dementsprechend
solche Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die zusätzliche
PrfB-Aktivität
durch einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung
wie die das Protein herstellenden gramnegativen Bakterien stammt,
vorzugsweise aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben
Stamm.
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Auch hierfür liefert die vorliegende Anmeldung
einen konkreten Ansatzpunkt, der dementsprechend bevorzugt ist,
nämlich
die prfB-Sequenz aus dem gramnegativen Modellorganismus E. coli.
Entsprechend dem zu den übrigen
Sequenzen Gesagten sind derartige Verfahren bevorzugt, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß ein
PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus Escherichia
coli ableitet, vorzugsweise von der Wildtypsequenz nach SEQ ID NO.
8, besonders bevorzugt codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz
nach SEQ ID NO. 7 ableitet.
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Wie bereits angesprochen sind insbesondere
leistungsverbesserte Varianten von PrfB von erfindungsgemäßem Interesse.
Als solch eine Variante wurde in Beispiel 2 der PrfB aus B. licheniformis
beschrieben, der gegenüber
dem Wildtyp die Austausche S71N und N100S aufweist.
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Bevorzugte erfindungsgemäße Proteinherstellungsverfahren
sind somit dadurch gekennzeichnet, daß eine aktivitätsverbesserte
Variante eines Faktors PrfB eingesetzt wird, vorzugsweise eine,
die in einer, besonders bevorzugt beiden Positionen, die in homologer
Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID
NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren
Asparagin (N) bzw. Serin (S) trägt.
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Eine Vielzahl technischer Proteinherstellungsverfahren
baut auf den von den betreffenden Mikroorganismen natürlicherweise
gebildeten Faktoren auf. So wurden beispielsweise die wirtschaftlich
bedeutenden Subtilisine als solche Faktoren gefunden, die von Bacilli,
die mit B. subtilis verwandt sind, gebildet und sekretiert werden.
Wenn also nicht nur die betreffenden Gene vorhanden sondern auch
abgelesen werden, handelt es sich um bevorzugte Verfahren.
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Entsprechend bevorzugte Verfahren
sind folglich dadurch gekennzeichnet, daß das für das hergestellte Protein
codierende Gen natürlicherweise
in den das Protein herstellenden Zellen vorhanden ist, vorzugsweise
dieses Protein von diesen Zellen natürlicherweise gebildet wird.
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Demgegenüber gewinnen solche Proteinherstellungsverfahren
zunehmend an Bedeutung, die auf sogenannten Transgenen aufbauen,
also solchen, die in geeignete Wirtszellen eingebracht worden sind
und von diesen exprimiert werden. Denn hierdurch können für die Produktion
optimierte Stämme
für verschiedene
Zwecke ausgenutzt werden und es können über die bekannten molekularbiologischen
Methoden optimierte Proteine hergestellt werden, die in dieser Form
in der Natur nicht vorkommen.
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Dementsprechend bevorzugte Verfahren
sind dadurch gekennzeichnet, daß das
für das
hergestellte Protein codierende Gen durch Transformation in die
Vorläuferzellen
der zur Herstellung eingesetzten Bakterien eingebracht worden ist,
vorzugsweise über
einen Expressionsvektor, besonders bevorzugt aufgrund dessen stabiler
Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen. Zwei Beispiele gehen
aus Beispiel 3 hervor.
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Sowohl für endogen codierte Proteine
als auch für
solche die von Transgenen abgeleitet sind, ist es besonders vorteilhaft,
wenn sie aus dem umgebenden Kulturmedium isoliert und damit aufgereinigt
werden können.
So konnte etwa auch in Beispiel 3 die Erhöhung der Proteinbildungsrate
durch Messung der betreffenden Aktivität im Überstand bestimmt werden. Eine
erfindungsgemäß mögliche Alternative
besteht jedoch auch darin, die betreffenden das Protein herstellenden
Zellen im Anschluß an
die eigentliche Produktion aufzuschließen und dadurch das Produkt
zu erhalten.
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Entsprechend bevorzugte Verfahren
sind folglich dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Protein
sekretiert wird.
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Von ganz besonderem Interesse sind
erfindungsgemäße Verfahren,
die auf bestimmte, durch die Kultivierung der Mikroorganismen hergestellte
Produkte ausgerichtet sind. Entsprechend bevorzugt sind somit Proteinherstellungsverfahren,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten
Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch
relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
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Aber auch Enzyme sind von großer technischer
Bedeutung, beispielsweise für
die Biotransformation, d.h. die chemische Synthese über enzymatische
Katalysatoren oder als wirksame Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Also werden erfindungsgemäß auch solche
Verfahren beansprucht, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich
bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise
um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders
bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase,
Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase.
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Die vorliegende Erfindung wird nicht
allein durch die bislang ausgeführten
Substanzen und Verfahren sondern auch durch bestimmte Verwendungsmöglichkeiten
der genannten Substanzen realisiert. Sie werden ebenfalls und entsprechend
den bisherigen Ausführungen
in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung einbezogen.
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So besteht eine wichtige Umsetzung
der Erfindung darin, den Faktor PrfB zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung
durch Kultivierung von Bakterien durch Erhöhung der PrfB-Aktivität in den
das Protein herstellenden Zellen zu verwenden. Dies geschieht beispielsweise
dadurch, daß dieser
Faktor in den treffenden Zellen in größerer Zahl oder mit einer höheren Aktivität vorgelegt
wird.
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Eine bevorzugte Verwendung ist die,
wobei der Faktor PrfB von einem Faktor der SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8
oder 10 abgeleitet ist und besonders bevorzugt in den eingangs ausgeführten Homologiebereich
des PrfB von B. licheniformis fällt
bzw. die entsprechend bevorzugten Eigenschaften aufweist.
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Solch eine Verwendung wird günstigerweise über die
zugehörigen
Nukleinsäuren
erreicht, etwa indem sie über
molekularbiologische Methoden in die proteinherstellenden Zellen
bzw. die Vorläuferzellen
eingebracht werden. Erfindungsgemäß ist somit eine Verwendung
einer für
den Faktor PrfB codierenden Nukleinsäure zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung
durch Kultivierung von Bakterien durch zusätzliche Expression dieses Gens.
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Vorteilhafterweise greift man dabei
auf die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen und als entsprechend
günstig
erkannten Sequenzen zurück.
Dementsprechend bevorzugt ist jede derartige Verwendung einer Nukleinsäure, wobei
die für
den Faktor PrfB codierende Nukleinsäure von einer Nukleinsäure der
SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 oder 9 abgeleitet ist; besonders bevorzugt
fällt sie
in den beschriebenen Homologiebereich des Gens prfB aus B. licheniformis.
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Entsprechend den molekularbiologischen
Möglichkeiten
sind erfindungsgemäß bevorzugte
Verwendungen zusätzlich
dadurch gekennzeichnet, daß sie
auf einer Transformation mit der für den Faktor PrfB codierenden
Nukleinsäure
beruht, vorzugsweise aufgrund deren stabiler Etablierung in den
abgeleiteten Bakterienstämmen
nach vorangegangener Transformation.
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Aufgrund der oben dargestellten Bedeutung
grampositiver Bakterien sind entsprechend bevorzugte Verwendungen
dadurch gekennzeichnet, daß es
sich um grampositive Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen
Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der
Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus
subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii oder
B. lentus, und ganz besonders um Stämme von B.licheniformis oder
B. amyloliquefaciens.
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Entsprechendes gilt für erfindungsgemäße Verwendungen,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um gramnegative Bakterien
handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um
Stämme
von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella
planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli
BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder
Klebsiella planticola (Rf).
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Weiter bevorzugt sind analog dem
oben Gesagten derartige Verwendungen, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß eine
leistungsverbessete Variante eines Faktors PrfB oder eine hierfür codierende
Nukleinsäure
eingesetzt wird, vorzugsweise eine, die in einer, besonders bevorzugt
beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100
des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin
(N) bzw. Serin (S) trägt
bzw. hierfür
codiert.
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Da derartige Verwendungsmöglichkeiten
insbesondere im Zuammenhang mit der Herstellung wirtschaftlich bedeutender
Proteine relevant sind, sind besonders solche derartigen Verwendungen
bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten
Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch
relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
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Entsprechendes gilt für derartige
Verwendungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich
bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise
um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders
bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase,
Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase.
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Beispiele
-
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte
folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch
von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory
manual", Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken
angegeben sind. Enzyme und Baukästen
(Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
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Beispiel 1
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Isolierung des Gens prfB
aus B. licheniformis
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Identifizierung des prfB-Locus
in B. licheniformis
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Zur Identifizierung des secAlprfB-Locus
in B.licheniformis wurde über
PCR eine Gensonde anhand der bekannten Sequenz des prfB-secA-Genorts
von B. subtilis (Datenbank „Subtilist" des Institut Pasteur,
25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich; http://genolist.pasteur.fr/Subtilist/;
Stand: 16.8.2002) abgeleitet. Dieser Genort ist auch in 3 dargestellt. Die erhaltene
Sonde war 3113 bp lang und umfaßte
zusätzlich
die ersten 451 bp des N-terminalen Bereichs des Gens prfB. Anschließend wurden
Präparationen
von chromosomaler DNA von B. licheniformis, der beispielsweise von
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) unter
der Bestellnummer 13 erhältlich
ist, und zur Kontrolle chromosomale DNA von B. subtilis mit verschiedenen
Restriktionsenzymen verdaut und einer Southern-Hybridisierung mit
der genannten Sonde unterworfen. An der mit dem Restriktionsenzym
Mun1 behandelten chromosomalen DNA von B. licheniformis wurde ein
einziges Fragment in der Größe von ca.
5,5 kB identifiziert, während
der Verdau der chromosomalen DNA von B. subtilis mit Mun1 die für B. subtilis
erwarteten Fragmente lieferte.
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Klonierung des identifizierten
Bereich aus B. licheniformis DSM13
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Chromosomale DNA desselben Stamms
B. licheniformis wurde isoliert, präparativ mit Mun1 verdaut und
der DNA-Bereich um 5,5 kB über
Agarosegel-Elektrophorese isoliert sowie die Nucleinsäuren daraus
mit kommerziell erhältlichen
Kits extrahiert. Das erhaltene Gemisch von Mun1-geschnittenen DNA-Fragmenten wurde
in die mit Mun1 kompatible EcoRI-Schnittstelle des Low-copy-number-Vektors
pHSG575 (beschrieben in: "High-copy-number
and low-copy-number vectors for lacZ alpha-complementation and chloramphenicol-
or kanamycin-resistance selection"; S. Takeshita; M. Sato; M. Toba; W.
Masahashi; T. Hashimoto-Gotoh; Gene (1987), Band 61, Seiten 63–74) ligiert
und in E. coli JM109 (erhältlich
von der Firma Promega, Mannheim, Deutschland) transformiert.
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Es wurde auf die vom Vektor kodierte
Resistenz selektiert. Zusätzlich
diente die Methode des Blau/Weiß-Screenings
(Selektionsplatten enthielten 80 μg/ml
X-Gal) zur Identifizierung von Klonen, die einen Vektor mit Insert
aufgenommen hatten. Darüber
wurden 200 Klone erhalten, von denen über Koloniehybridisierung 5
Klone identifiziert werden konnten, die das B, licheniformis secA-Gen
trugen. Diese wurden durch erneute Southern-Blot-Analyse mit der
oben beschriebenen Sonde überprüft und ein
von pHSG575 abgeleiteter Vektor mit dem das secA-Gen von B. licheniformis
tragenden, 5,5 kB umfassenden Mun1 Fragment unter der Bezeichnung
pHMH1 fortgeführt.
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Restriktionsanalyse
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Der klonierte 5,5 kB-Bereich wurde
zunächst über Restriktionskartierung
charakterisiert. Hierzu wurden mit verschiedenen Enzymen Einzel-
und Doppelverdaus von pHMH1 durchgeführt und mittels Southern-Blot-Analyse
solche Fragmente identifiziert, die Teile des secA/prfB-Operons
tragen. Die daraus resultierende Restriktionskarte wurde nach vollständiger Sequenzierung
des 5,5 kB Fragments (siehe unten) ergänzt und ist in 4 zu sehen.
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Sequenzanalyse
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Das in 4 gezeigte
5,5 kB große
Fragment wurde in Teilsequenzen nach Standard-Methoden sequenziert. Die Teilsequenzen
zeigten starke Homologien zu folgenden Genen aus B. subtilis: fliT
(codiert für ein
Flagellen-Protein), orf 189/yvyD (unbekannte Funktion), secA (Translokase-bindende
Untereinheit; ATPase) und prfB (Peptide Chain Release Factor 2),
in genau der gleichen Genabfolge wie bei B. subtilis. Diese Gene
sind ebenfalls in 4 gezeigt.
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In der Sequenz wurde auch ein offener
Leserahmen im Bereich von Bp 4177–5278 gefunden, der für ein 366
Aminosäuren
großes
Protein codiert. Im Bereich –14
bis –8
zum Translationsstart befindet sich homolog zu dem entsprechenden
Bereich im B. subtilis-Genom
eine mögliche
Ribosomen-Bindestelle (GAGGTGA). Diese aus B. licheniformis DSM
13 ermittelte DNA-Sequenz ist unter SEQ ID NO. 1 dargestellt; die
abgeleitete Aminosäuresequenz
geht aus SEQ ID NO. 2 hervor.
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Dazu ist zu bemerken, daß in zahlreichen
Spezies, und offensichtlich auch in B. licheniformis die Expression
von prfB auf eine besondere Weise reguliert wird: Dabei erfolgt
innerhalb des Gens ein Wechsel des Leserahmens. Aus diesem Grunde
ist die Zahl der in SEQ ID NO. 1 angebenen Positionen um 1 höher als
eine Vielfache von Drei. Bei vollständiger In-vivo-Synthese dieses
Faktors werden die ersten 72 Nukleotide, also die, die für die ersten
24 Aminosäuren
codieren, korrekt transkribiert, dann das T in Position 73 übersprungen und
zur Erzeugung eines durchgängigen
Leserahmens die Transkription ab Position 74 mit dem Codon GAC (entsprechend
Asp 25) bis zum Ende des Gens fortgesetzt. In SEQ ID NO. 2 ist die
zusammenhängende
Aminosäuresequenz
des PrfB aus B. licheniformis DSM 13 wiedergegeben, wie er nach
diesem Beispiel erhalten wurde. Diese Sequenz und insbesondere der
Wechsel des Leserahmens werden durch Homologievergleiche mit den
Sequenzen anderer Faktoren PrfB aus den einschlägigen Datenbanken unterstützt.
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Recherchen in öffentlich zugänglichen
Datenbanken (GenBank: National Center for Biotechnology Information
NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; EMBL-European
Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien) ergaben als nächstähnliches
Gen das prfB aus B. subtilis. Homologievergleiche auf DNA- und auf
Aminosäureebene
ergaben hierfür Ähnlichkeiten
von 78,5, bzw. 92,4% Identität.
Für den
PrfB aus B. halodurans wurden 63% und für den aus E. coli 45,7% Identität auf Aminosäure-Ebene
bestimmt.
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Aufgrund dieser Werte kann ferner
davon ausgegangen werden, daß das
PrfB aus B. licheniformis dieselbe biochemische Aktivität wie insbesondere
das PrfB von B. subtilis ausübt
und damit dieselbe physiologische Funktion übernimmt.
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Beispiel 2
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Die Variante S71N/N100S
-
Aus der Anmeldung WO 91/02792 A1
geht ein spezieller B. licheniformis-Stamm hervor, der bei der American
Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110–2209,
USA (http://www.atcc.org) hinterlegt worden ist. Er trägt dort
die Bezeichnung B. /icheniformis ATCC 53926 und im Zusammenhang
mit der vorliegenden Anmeldung B. licheniformis E. Er ist ursprünglich über Mutagenese
von dem Stamm B. licheniformis DSM 641 abgeleitet worden und zeichnet
sich durch vorteilhafte Kultur- und
Proteinsyntheseleistungen aus.
-
Analog dem Vorgehen in Beispiel 1
ist das prfB-Gen aus diesem B. licheniformis E isoliert und sequenziert
worden. Es ist unter SEQ ID NO. 3 und in 2 im Vergleich zu dem prfB aus B. licheniformis
DSM 13 dargestellt. Wie in 2 zu
sehen ist, weist das prfB aus diesem Stamm gegenüber dem Stamm B. licheniformis
DSM 13 einige Punktmutationen auf, die in den meisten Fällen jedoch
stille Mutationen sind. Lediglich die Austausche in den Positionen
213 und 300 wirken sich auf die Aminosäuresequenz aus: Auf Aminosäure-Ebene
ergeben sich somit für
B.licheniformis E gegenüber
B.licheniformis DSM 13 die beiden Aminosäure-Austausche S71N und N100S.
Die betreffenden Codons sind in 2 und
die abgeleiteten Aminosäuren
in 1 hervorgehoben.
-
Auch SEQ ID NO. 4 zeigt die betreffende
Aminosäuresequenz.
Sie ist wie die von 1 wiederum
an den für
prfB von B. licheniformis charakteristischen Leserahmenwechsel in
DNA-Position 73 angepaßt
(vgl. Beispiel 1). Sowohl SEQ ID NO. 4 als auch 1 zeigen somit die vollständige Aminosäuresequenz,
wie sie sich nach vollständig
korrekter In-vivo-Translation ergibt.
-
Es liegt nahe, daß die guten Protein-Syntheseleistungen
des Stammes B. licheniformis E zumindest zu einem Teil auf diese
beiden Aminosäureautausche
S71N und N100S im Faktor PrfB zurückzuführen sind.
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Beispiel 3
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Messung der
Bildungsrate von extrazellulärer
Protease bei gleichzeitiger Expression des prfB-Gens
-
Um zu untersuchen, ob PrfB tatsächlich ein
interessanter Kandidat ist, um darüber gezielt Einfluß auf die
Proteinsynthese in Bacillus licheniformis zu nehmen, wurden die
Gene prfB aus B. licheniformis DSM13 und aus B. licheniformis E
wurden jeweils zusammen mit dem für die sekretierte Protease
Subtilisin von B. lentus (BLAP), die in der Anmeldung WO 91/02792
A1 beschrieben worden ist, in dem Wirtsstamm B. licheniformis (DSM
13) zur Expression gebracht. Als Indikator für die Proteinherstellung und
-Sekretion dient in diesem System die extrazelluläre, auf
das Subtilisin aus B. lentus zurückzuführende Proteaseaktivität.
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Dafür wurden ausgehend von der
jeweiligen chromosomalen DNA zunächst
die prfB-Gene aus
B. licheniformis DSM13 und aus B. licheniformis E mittels PCR amplifiziert
und über
die Restriktionsschnittstellen SalI und BamHI in den Escherichia
coli/Bacillus subtilis-Shuttle Vektor pCU3 kloniert. Anschließend wurde
ein Teil der ursprünglich
im Vektor pCU3 vorliegenden Chloramphenicol-Resistenzkassette mit
den Restriktionsenzymen Mun1 und Ncol ausgeschnitten und gegen eine
Erythromycin-Resistenzkassette ausgetauscht. Diese Erythromycin-Resistenzkassette
war zuvor mittels PCR und entsprechenden Primern aus dem Vektor pE194
amplifiziert worden. Das hierdurch erhaltene Konstrukt pCU3Ery-prfB
ist in 6 dargestellt.
Das jeweilige Gen prfB steht darin unter der Kontrolle eines konstitutiven
Promotors. In der Tat handelte es sich je nach dem enthaltenem prfB
um zwei Vektoren, um pCU3Ery-prfB(DSM13) und um pCU3Ery-prfB(E).
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Der Stamm B. licheniformis DSM13,
der zuvor mit dem in WO 91/02792 A1 genannten Vektor pCB56C transformiert
worden war (8. licheniformis DSM 13 pCB56) und somit auf einem Expressionsvektor
das Subtilisin-Gen aus B. lentus (BLAP) enthielt, wurde dann mit
diesen beiden Konstrukten und zur Kontrolle mit dem pCU3Ery-Leervektor
ohne prfB transformiert.
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Zur Bestimmung der prfB-Wirkung wurden
die Subtilisin-Aktivitäten
der erhaltenen Transformanten bei Kultivierung im Schüttelkolben
bei konstantem pH-Wert von 7,2 über
einen Zeitraum von 3 Tagen hin untersucht. Dazu wurden nach 48,5
und nach 72,5 h Proben zur Bestimmung der Subtilisin-Aktivitäten im Kulturüberstand
genommen. Die Aktivitätsbestimmung
erfolgte photometrisch mit Hilfe des Peptidsubstrats Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (AAPF).
Das Ergebnis ist in folgender Tabelle 1 zusammengfaßt:
-
Tabelle 1: Subtilisin-Aktivitäten von
B. licheniformis DSM13 pCB56C bei gleichzeitiger prfB-Expression.
-
Angegeben ist jeweils die in U/ml
des Überstands
ermittelte Aktivität
des gebildeten Subtilisins.
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Diese Werte zeigen, daß die zusätzliche
Expression des Faktors PrfB aus dem Wildtyp-Stamm DSM 13 durch das Plasmid pCU3Ery-prfB(DSM13),
d.h. durch die intrazelluläre
Erhöhung
der PrfB-Aktivität
die Produktbildungsrate bereits steigert. Eine zusätzliche
Steigerung erkennt man bei Verwendung des Faktors PrfB S71N/N100S,
wie er ausgehend von dem Plasmid pCU3Ery-prfB(E) gebildet wird.
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Beschreibung
der Figuren
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1:
Alignment des PrfB aus B. licheniformis E mit der Wildtypsequenz
des PrfB aus B. halodurans auf Aminosäure-Ebene.
Darin bedeuten:
PrfB_Baclich_E:
Variante S71N/N100S des PrfB aus B. licheniformis
PrfB_Bachalo:
Wildtypsequenz des PrfB aus B. halodurans
Consensus: Consensus-Sequenz
Diese
beiden PrfB weisen auf Aminosäure-Ebene
eine Homologie von 63,2% Identität
auf. Die Wildtypsequenz von PrfB aus B. licheniformis DSM 13 besitzt
an den beiden Positionen 71 und 100 die beiden Aminosäuren S,
bzw. N, wodurch sich dieselben Homologiewerte ergeben. Diese beiden
Positionen sind hervorgehoben.
-
2:
Alignment der DNA-Sequenzen des PrfB aus B. licheniformis E, d.h.
der erfindungsgemäßen Variante
S71 NIN100S, mit der Wildtypsequenz des PrfB, wie sie aus B. licheniformis
DSM 13 erhalten wird.
Darin bedeuten:
prfB_Baclich_E:
Sequenz der Variante S71 N/N100S aus B. licheniformis E
prfB_Baclich_DSM:
Wildtypsequenz des PrfB aus B. licheniformis DSM 13
Consensus:
Consensus-Sequenz
Die Codons, die die beiden Aminosäure-Austausche
S71N und N100S betreffen, sind hervorgehoben. Die Unterschiede sind
jeweils auf ein verändertes
Nukleotid in den Positionen 213 und 300 zurückzuführen.
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3:
Genort von prfB in B. licheniformis
Man erkennt, daß in der
secA-Region auch das Gen prfB liegt und eine zusammenhängende mRNA
gebildet wird, so daß auch
von einem secA/prfB-Operon gesprochen werden kann.
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4:
Restriktionskarte des Genorts von prfB in B. licheniformis
Wie
in Beispiel 1 dargestellt befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft
zu secA das Gen prfB und ein orf auf einem ca. 5,5 kB großen Fragment,
das durch Restriktion mit Mun1 aus der genomischen DNA von B. licheniformis
erhalten werden kann.
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5:
Schematische Darstellung des Translations/Translokations-Apparats
grampositiver Bakterien.
Sinngemäß nach van Wely, K.H., Swaving,
J., Freudl, R., Driessen, A.J. (2001); "Translocation of proteins across the
cell envelope of Gram-positive bacteria", FEMS Microbiol Rev. 2001, Band 25(4),
Seite 437–54; PrfB
wurde hinzugefügt.
PrfB
wirkt, wie über
einen Pfeil dargestellt ist, auf die Ablösung des gerade gebildeten
Proteins vom Ribosom.
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6:
Der Vektor pCU3Ery-prfB
Dieser Vektor bewirkt, wie in Beispiel
3 beschrieben ist, über
die konstitutive Expression des Gens prfB eine Steigerung der Proteinbildungsrate.
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