ES2639114T3

ES2639114T3 - Procedimiento de expresión con una proteasa auxiliar

Info

Publication number: ES2639114T3
Application number: ES12713714.9T
Authority: ES
Inventors: Lukas MAKSYM; Ramona KNAB; Stefan Evers; Karl-Heinz Maurer; Johannes Bongaerts
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2017-10-25
Anticipated expiration: 2032-04-05
Also published as: EP2697376A1; DE102011007313A1; KR20140019436A; JP2017079768A; CA2831473A1; MX348766B; DK2697376T3; RU2013150276A; JP6099627B2; PL2697376T3; US20140220628A1; WO2012139964A1; MX2013011816A; CN103608457A; RU2642324C2; BR112013025951A2; JP2014511702A; US9663798B2; EP2697376B1

Abstract

Procedimiento para la producción de una proteína por medio de un microorganismo, que comprende los pasos de procedimiento (a) introducción en un microorganismo de una primera construcción de expresión que codifica la proteína; (b) introducción en el microorganismo de una segunda construcción de expresión que codifica una proteasa auxiliar que difiere de la proteína y que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 65 % de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 1, presentando la proteasa auxiliar una actividad proteolítica y sustituyendo en el microorganismo al menos a una proteasa codificada por el cromosoma; (c) expresión de la proteína y de la proteasa auxiliar en el microorganismo, siendo la proteína una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, manasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, [beta]-glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o una lipasa.

Description

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moléculas precursoras necesarias, en particular aminoácidos, para la síntesis de la proteína.

Esta circunstancia se determina mediante la frecuencia de transcripción de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína y su traducción a la proteína deseada, es decir mediante el número de proteínas generadas por unidad de tiempo. El paso de la traducción se incluye en la determinación de la expresión. Como comparación sirve un procedimiento que difiere del procedimiento de acuerdo con la invención en la presencia de la proteasa auxiliar. Esta comparación se efectúa de acuerdo con la invención en microorganismos del mismo tipo y en las mismas condiciones para garantizar la comparabilidad de las mediciones.

De acuerdo con la invención, el procedimiento se caracteriza porque la proteína es una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, manasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, -glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o lipasa. En el caso de la proteína se trata con muy especial preferencia de una proteasa. Al mismo tiempo, la proteasa que se ha de producir (= proteasa objetivo) también participa en la hidrólisis del sustrato proteico, y ventajosamente puede mejorar aún más la digestión de la proteína del sustrato.

Con un procedimiento de acuerdo con la invención se pueden producir ventajosamente, por ejemplo, las enzimas mencionadas a continuación.

Entre las proteasas se prefieren las subtilisinas. Ejemplos son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa alcalina de Bacillus lentus, la subtilisina DY y las enzimas termitasa, proteinasa K y las proteasas TW3 y TW7, clasificadas como subtilisinas aunque no como subtilisinas en el sentido más estricto. La subtilisina Carlsberg está disponible, en una forma perfeccionada, bajo el nombre comercial Alcalasa®, de la empresa Novozymes A/S, Bagsvrerd, Dinamarca. Las subtilisinas 147 y 309 son comercializadas por la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Esperasa® y Savinasa®, respectivamente.

De la proteasa de Bacillus lentus DSM 5483 derivan las variantes de proteasa vendidas bajo el nombre BLAP®. Otras proteasas preferidas son, por ejemplo, las enzimas vendidas bajo el nombre PUR. Otras proteasas son asimismo las enzimas que se pueden adquirir de la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym®, Natalase®, Kannase® y Ovozyme®, de la empresa Genencor bajo los nombres comerciales Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime, Excellase® y Properase®, de la empresa Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, bajo el nombre comercial Protosol®, de la empresa Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, bajo el nombre comercial Wuxi®, de la empresa Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoy, Japón, bajo los nombres comerciales Proleather® y Protease P® y de la empresa Kao Corp., Tokio, Japón, bajo el nombre Proteinasa K-16. Asimismo se prefieren las proteasas de Bacillus gibsonii y Bacillus pumilus, que se dan a conocer en las solicitudes de patente internacional WO 2008/086916 y WO 2007/131656.

Ejemplos de amilasas son las -amilasas de Bacillus licheniformis, de Bacillus amyloliquefaciens o de Bacillus stearothemophilus, así como, en particular, sus perfeccionamientos mejorados para el uso en detergentes o productos de limpieza. La enzima de Bacillus licheniformis se puede adquirir de la empresa Novozymes bajo el nombre Termamyl® y de la empresa Danisco/Genencor bajo el nombre Purastar®ST. Se pueden adquirir productos perfeccionados de esta -amilasa de la empresa Novozymes bajo el nombre comercial Duramyl® y Termamyl®ultra, de la empresa Danisco/Genencor bajo el nombre Purastar®OxAm y de la empresa Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japón, como Keistase®. La -amilasa de Bacillus amyloliquefaciens es comercializada por la empresa Novozymes bajo el nombre BAN®, y las variantes derivadas de la -amilasa de Bacillus stearothemophilus, por la misma empresa Novozymes bajo los nombres BSG® y Novamyl®. Son de mencionar además la -amilasa de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) y la ciclodextrina-gluconotransferasa (CGTasa) de Bacillus agaradherens (DSM 9948). Igualmente se pueden usar productos de fusión de todas las moléculas mencionadas. Además son adecuados los perfeccionamientos de la -amilasa de Aspergillus nigerund A. oryzae, disponibles en la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Fungamyl®. Otros productos comerciales ventajosos son, por ejemplo, la amilasa Powerase® de la empresa Danisco/Genencor y las amilasas Amylase-LT®, Stainzyme® y Stainzyme plus®, estas últimas de la empresa Novozymes. También se pueden producir de acuerdo con la invención variantes de estas enzimas obtenibles por mutaciones puntuales. Otras amilasas preferidas se dan a conocer en las publicaciones para información de solicitud de patente internacional WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177 y WO 07/079938, a cuya divulgación se remite expresamente o cuya descripción a este respecto se incluye expresamente en la presente solicitud de patente. Las amilasas que se han de producir de acuerdo con la invención son preferentemente -amilasas.

Ejemplos de lipasas o cutinasas son las lipasas obtenibles originalmente o perfeccionadas de Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus), en especial las que presentan la sustitución de aminoácidos D96L. Se comercializan, por ejemplo, por la empresa Novozymes bajo los nombres comerciales Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® y Lipex®. Asimismo se pueden producir, por ejemplo, las cutinasas aisladas originalmente de Fusarium solani y Humicola insolens. Se pueden producir, por ejemplo, las lipasas o cutinasas de la empresa Danisco/Genencor cuyas enzimas de partida se han aislado originalmente de Pseudomonas mendocina y Fusarium solanii. Como productos comerciales importantes también son de mencionar los preparados M1 Lipase® y Lipomax®, comercializados originalmente por la empresa Gist-Brocades (ahora Danisco/Genencor) y las enzimas comercializadas por la empresa Meito Sangyo KK, Japón, bajo los nombres Lipase MY-30®, Lipase OF® y Lipase

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El microorganismo también puede ser una célula eucariota, caracterizada porque posee un núcleo celular. A diferencia de las células procariotas, las células eucariotas son capaces de modificar post-traduccionalmente la proteína formada. Ejemplos de ellas son hongos, como Actinomycetes, o levaduras, como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede resultar especialmente ventajoso, por ejemplo, cuando las proteínas deben experimentar, en relación con su síntesis, modificaciones específicas que permiten tales sistemas. Las modificaciones que realizan los sistemas eucariotas especialmente en relación con la síntesis de proteínas incluyen, por ejemplo, la unión de compuestos de bajo peso molecular, tales como anclajes de membrana u oligosacáridos. Estas modificaciones con oligosacáridos pueden ser deseables, por ejemplo, para reducir la alergenicidad de una proteína expresada. Asimismo puede ser ventajosa la coexpresión con las enzimas formadas de manera natural por este tipo de células, como, por ejemplo, celulasas o lipasas. También pueden ser adecuados, por ejemplo, los sistemas de expresión fúngicos termófilos, especialmente para la expresión de proteínas o variantes termorresistentes.

Los microorganismos que se han de usar de acuerdo con la invención pueden estar modificados en lo que respecta a sus requerimientos en relación con las condiciones de cultivo, presentar marcadores de selección diferentes o adicionales o expresar proteínas diferentes o adicionales. En particular, puede tratarse también de microorganismos que expresan transgénicamente varias proteínas objetivo. Preferentemente secretan la proteína (proteína objetivo) al medio que rodea al microorganismo.

Los microorganismos usados en los procedimientos de acuerdo con la invención se pueden cultivar y fermentar de manera habitual, por ejemplo en sistemas discontinuos o continuos. En el primer caso, se inocula un medio de cultivo adecuado con los microorganismos y se recoge la proteína del medio al cabo de un periodo de tiempo que se halla experimentalmente. Las fermentaciones continuas se caracterizan por alcanzar un equilibrio dinámico en el que, durante un periodo de tiempo relativamente largo, parte de las células mueren pero también se reproducen y, al mismo tiempo, se puede extraer del medio la proteína formada.

Los procedimientos de acuerdo con la invención son preferentemente procedimientos de fermentación. Los procedimientos de fermentación son conocidos en sí en el estado de la técnica y constituyen el paso de producción a gran escala propiamente dicho, seguido por lo general de un procedimiento de purificación adecuado para la proteína producida. Todos los procedimientos de fermentación basados en un procedimiento de acuerdo con la invención para la producción de una proteína constituyen formas de realización de este objeto de la invención.

Se consideran especialmente los procedimientos de fermentación que se caracterizan porque la fermentación se realiza mediante una estrategia de alimentación. En este caso se alimentan los componentes del medio que se consumen durante el cultivo continuo. De este modo se pueden lograr incrementos considerables tanto en la densidad de células como en la masa celular o masa seca. La fermentación también se puede configurar de tal manera que los productos metabólicos no deseados se eliminen por filtración o se neutralicen con contraiones apropiados en cada caso.

La proteína producida se puede recoger del medio de fermentación. Este procedimiento de fermentación se prefiere frente al aislamiento de la proteína del microorganismo, es decir la preparación del producto a partir de la masa celular (masa seca). Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo a disposición microorganismos adecuados o uno o más marcadores o mecanismos de secreción adecuados y/o sistemas de transporte para que los microorganismos secreten la proteína al medio de fermentación. En caso de no producirse secreción, se puede realizar como alternativa el aislamiento de la proteína a partir de la célula huésped, es decir la purificación de la misma a partir de la masa celular, por ejemplo por precipitación con sulfato de amonio o etanol, o por purificación cromatográfica.

Otro objeto de la invención es un microorganismo que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende los pasos de procedimiento

(a): introducción en un microorganismo de una primera construcción de expresión que codifica una proteína, siendo la proteína una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, manasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, [beta]-glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o lipasa;

(b): introducción en el microorganismo de una segunda construcción de expresión que codifica una proteasa auxiliar que difiere de la proteína y que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 65% de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 1 (= Blap S), en la que la proteasa auxiliar presenta una actividad proteolítica y sustituye en el microorganismo al menos una proteasa codificada por el cromosoma.

Se trata, pues, de todos los microorganismos que pueden ser objeto de un procedimiento de acuerdo con la invención. Todas las circunstancias, objetos y formas de realización que se describen para los procedimientos de acuerdo con la invención también son aplicables a este objeto de la invención. Por tanto, en este punto se remite expresamente a la divulgación en el lugar correspondiente, indicando que esta divulgación también se aplica a los microorganismos de acuerdo con la invención.

Las formas de realización especialmente preferidas de los microorganismos de acuerdo con la invención se

caracterizan porque

(a): la proteína no está presente de forma natural en el microorganismo y/o

(b): la proteasa auxiliar no está presente de forma natural en el microorganismo y/o

(c): la proteasa auxiliar se expresa en el microorganismo además de las proteasas codificadas por el cromosoma y/o

5 (d) la expresión de la proteasa auxiliar intensifica la expresión de la proteína y/o

(e) el microorganismo es una bacteria, preferentemente una que se selecciona del grupo formado por los géneros

Escherichia, Klebsiella, Burkholderia, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas, Pseudomonas y Vibrio, con más preferencia una que se selecciona del grupo de Escherichia coli, Klebsiella planticola, Burkholderia glumae, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens,

10 Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Stenotrophomonas maltophilia y Vibrio metschnikovii. Se prefiere muy especialmente Bacillus licheniformis.

Los microorganismos de acuerdo con la invención se usan ventajosamente en los procedimientos de acuerdo con la invención para producir una proteína, siendo la proteína una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, manasa,

15 tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, [beta]-glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o lipasa.

Todas las circunstancias, objetos y formas de realización que se describen para los procedimientos o microorganismos de acuerdo con la invención también son aplicables a este objeto de la invención. Por tanto, en este punto se remite expresamente a la divulgación en el lugar correspondiente, indicando que esta divulgación

20 también se aplica a los usos de acuerdo con la invención.

EJEMPLOS

Todos los pasos de trabajo de biología molecular se realizan conforme a procedimientos convencionales, como los que se indican, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, 1989, u obras especializadas comparables. Las enzimas, los

25 conjuntos (kits) y los equipos se usaron según las instrucciones del fabricante correspondiente.

Ejemplo 1:

Sustitución del gen que codifica una proteasa según SEQ ID NO. 2 (aprE) por un gen que codifica una proteasa auxiliar según SEQ ID NO. 1 en Bacillus licheniformis.

Como cebadores (indicados en la orientación 5'3') se usaron los siguientes oligonucleótidos:

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La sustitución se realizó con un paso intermedio en el que se sustituyó primero el gen aprE por el gen de resistencia a tetraciclina tet. Para la sustitución del gen aprE por el gen tet se amplificaron mediante los cebadores aprE1 y aprE2, así como los cebadores aprE3 y aprE4, segmentos de secuencia de 1033 pb y 1015 pb, respectivamente, en la dirección 5' y la dirección 3' del gen aprE (flancos A y B). Debido a los extremos sobresalientes correspondientes de los cebadores aprE2 y aprE3 se fusionaron los dos flancos a través de los cebadores exteriores aprE1 y aprE4 mediante la reacción de fusión en cadena de la polimerasa (PCR). El producto de la PCR de fusión de 2018 pb se clonó en los sitios de restricción Pstl y Xbal del vector pE194 (Horinouchi y Weisblum, J. Bacteriol. (150), p. 804 en adelante (1982)). El gen tet se amplificó mediante los cebadores tet5 y tet6 del plásmido pBC16 (Bernhard y col., J. Bateriol. (133), p. 897 en adelante (1978)) y se clonó en los sitios de restricción centrales BamHI y HindIII de los flancos de aprE fusionados (véase la figura 1). Se transformó Bacillus licheniformis con el plásmido pRK25 obtenido. La selección se llevó a cabo tanto con 5 µg/ml de eritromicina como con 15 µg/ml de tetraciclina a 30ºC. Tras el cultivo a 42ºC se identificaron los clones con vector integrado por crecimiento en 0,3 µg/ml de eritromicina. Tras un nuevo cultivo a 42ºC pero sin el uso de eritromicina, se obtuvieron clones que se seleccionaron en cuanto a resistencia a tetraciclina y, mediante PCR, en cuanto a la sustitución exitosa del gen aprE por el gen tet (Bacillus licheniformis aprE::tet, véase la figura 2).

Para la sustitución del gen tet por el gen que codifica una proteasa auxiliar según SEQ ID NO. 1 se amplificaron, mediante los cebadores aprE1 y aprE7, así como los cebadores aprE8 y aprE4, segmentos de secuencia de 1061 pb y 1058 pb, respectivamente, en la dirección 5' y la dirección 3' del gen aprE (flancos C y D). El gen que codifica una proteasa auxiliar según SEQ ID NO. 1 se amplificó mediante los cebadores ziel9 y ziel10 del plásmido pCB76R49CK. Debido a los extremos sobresalientes correspondientes de los cebadores aprE7 y ziel9, así como apr8 y ziel10, se fusionaron mediante PCR de fusión los dos flancos con el producto de PCR de la proteasa auxiliar a través de los cebadores exteriores aprE1 y aprE4. El producto de la PCR de fusión de 3704 pb se clonó en los sitios de restricción Pstl y Ndel del vector pRK25 (véase la figura 1). Se transformó Bacillus licheniformis aprEtet (véase anteriormente) con el plásmido pRK19 obtenido. La selección se llevó a cabo con 5 µg/ml de eritromicina a 30ºC. Tras el cultivo a 42ºC se identificaron los clones con vector integrado por crecimiento en 0,3 µg/ml de eritromicina. Tras un nuevo cultivo a 42ºC pero sin el uso de antibiótico, se obtuvieron clones que se seleccionaron mediante PCR en cuanto a la sustitución exitosa del gen tet por el gen que codifica una proteasa auxiliar según SEQ ID NO. 1(Bacillus licheniformis aprE::proteasa auxiliar, véase la figura 2).

Ejemplo 2:

Producción fermentativa de una proteasa (proteína objetivo) con la ayuda de la cepa de producción Bacillus licheniformis aprE::proteasa auxiliar.

La cepa de partida de Bacillus licheniformis, así como la mutante de sustitución aprE::proteasa auxiliar, se transformaron con un plásmido de producción para una proteasa (proteína objetivo). Las cepas de producción resultantes se usaron en un procedimiento de fermentación convencional y se determinaron las actividades proteasa obtenidas. En comparación con la cepa de partida, el rendimiento se incrementó un 65% en el fermentador de laboratorio de 2 l (véase la figura 3). Las actividades proteasa medidas se basan esencialmente en la actividad de la proteasa objetivo puesto que la expresión de la proteasa objetivo se ha incrementado notablemente. Esto se verificó mediante un análisis de secreción del sobrenadante de fermentación del cultivo de Bacillus licheniformis aprE::proteasa auxiliar/proteasa objetivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (véase la figura 4; t describe el tiempo de cultivo, AP103 es la proteasa auxiliar (dos bandas), AP217 es la proteasa objetivo). En comparación con la proteasa objetivo, el sobrenadante del cultivo solo presenta una cantidad muy pequeña de la proteasa auxiliar.

Descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de la construcción de los vectores pRK25 y pRK19 para la sustitución cromosómica del gen que codifica una proteasa según SEQ ID NO. 2 (aprE) por el gen de resistencia a tetraciclina tet o por el gen que codifica una proteasa auxiliar según SEQ ID NO. 1. Las flechas definen el marco de lectura de

Claims

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