JP6126086B2 - プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド Download PDFInfo
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Description
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、ポリペプチドを生成し、用いる方法に関する。
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明は:
(a)少なくとも60%の配列同一性を配列番号2もしくは4の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)中度−高度の緊縮条件下で、(i)配列番号1もしくは3の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1もしくは3の成熟型ポリペプチドコード配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号1もしくは3の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)配列番号2もしくは4の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
(a)少なくとも60%配列同一性を配列番号2のアミノ酸150〜413に対して有する触媒ドメイン;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号1のヌクレオチド729〜1520、(ii)配列番号1の触媒ドメインをコードするcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号1の触媒ドメインに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン;
(d)配列番号2の触媒ドメインの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む触媒ドメインの変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)の触媒ドメインの断片
からなる群から選択される触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)
(ここで、Xaaはいずれかの天然アミノ酸であり、および、(Xaa)6は6つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得、
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の8個のアミノ酸の中に1つもしくは2つの置換を含む。)
プロテアーゼ活性:「プロテアーゼ活性」という用語は、ポリペプチド鎖中でアミン酸を結合するペプチド結合の加水分解によって、アミド結合またはタンパク質の加水分解を触媒するタンパク質分解活性(EC3.4.21.)を意味する。プロテアーゼ活性を判定するための数々のアッセイが技術分野において利用可能である。本発明の目的のために、プロテアーゼ活性は、Protazyme AK錠剤(架橋され、染色されたカゼイン;Megazyme製)を用いて、または、本出願の実施例の項において記載されているSuc−AAPF−pNAアッセイにおいて判定され得る。
(同等の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
(同等のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
本発明は、プロテアーゼが、低温で高い洗浄力性能を有し、および、安定性が強キレート剤の存在によって影響されないことを特徴とする、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
(a)少なくとも60%の配列同一性を配列番号2の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列を含むcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)配列番号2の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
(a)少なくとも60%の配列同一性を配列番号4の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列を含むcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)配列番号4の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチドの断片
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
(a)少なくとも60%の配列同一性を配列番号2のアミノ酸150〜413に対して有する触媒ドメイン;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号1のヌクレオチド729〜1520、(ii)配列番号1の触媒ドメインを含むゲノムDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号1の触媒ドメインに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン;
(d)配列番号2の触媒ドメインの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む触媒ドメインの変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)の触媒ドメインの断片
からなる群から選択される触媒ドメインを含む単離されたポリペプチドに関する。
BPN’ HGTHVAGTVAALNNSIGVL
Alcalase HGTHVAGTVAALDNTTGVL
Savinase HGTHVAGTIAALNNSIGVL
配列番号2 HGTHVAGTIASYG−−−SVS
配列番号4 HGTHVAGTIASYG−−−SVS
配列番号6 HGTHVAGTIASYG−−−SVS
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)
ここで、Xaaはいずれかの天然アミノ酸であり、および、(Xaa)6は6つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得、
または、対応するモチーフは、モチーフ中の最後の8個のアミノ酸の中に1つもしくは2つの置換を含む。特に本発明は、プロテアーゼ活性を有し:
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Xaa Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号14);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Xaa Gly Ser Val Ser Gly(配列番号15);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Xaa Ser Val Ser Gly(配列番号16);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Gly Xaa Val Ser Gly(配列番号17);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Gly Ser Xaa Ser Gly(配列番号18);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Gly Ser Val Xaa Gly(配列番号19);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Gly Ser Val Ser Xaa(配列番号20);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Xaa Gly Ser Val Ser Gly(配列番号21);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Xaa Ser Val Ser Gly(配列番号22);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Gly Xaa Val Ser Gly(配列番号23);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Gly Ser Xaa Ser Gly(配列番号24);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Gly Ser Val Xaa Gly(配列番号25);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Gly Ser Val Ser Xaa(配列番号26);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Xaa Ser Val Ser Gly(配列番号27);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Gly Xaa Val Ser Gly(配列番号28);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Gly Ser Xaa Ser Gly(配列番号29);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Gly Ser Val Xaa Gly(配列番号30);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Gly Ser Val Ser Xaa(配列番号31);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Xaa Xaa Val Ser Gly(配列番号32);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Xaa Ser Xaa Ser Gly(配列番号33);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Xaa Ser Val Xaa Gly(配列番号34);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Xaa Ser Val Ser Xaa(配列番号35);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Xaa Xaa Ser Gly(配列番号36);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Xaa Val Xaa Gly(配列番号37);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Xaa Val Ser Xaa(配列番号38);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Xaa Xaa Gly(配列番号39):
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Xaa Ser Xaa(配列番号40);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Val Xaa Xaa(配列番号41);
His Gly Thr−(Xaa)6−Xaa Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号42);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Xaa Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号43);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Xaa Gly Ser Val Ser Gly(配列番号44);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Xaa Ser Val Ser Gly(配列番号45);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Xaa Val Ser Gly(配列番号46);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Xaa Ser Gly(配列番号47);
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Val Xaa Gly(配列番号48);または
His Gly Thr−(Xaa)6−Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Xaa(配列番号49)
から選択されるモチーフを含む単離されたポリペプチドに関する。
(a)例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%といった少なくとも60%の配列同一性を配列番号2の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%といった少なくとも60%の配列同一性を配列番号2のアミノ酸150−413に対して有する触媒ドメインを含むポリペプチド;
(c)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列を含むcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)少なくとも60%の配列同一性を配列番号1の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(e)配列番号2の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(f)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)、(d)または(e)のポリペプチドの断片
からなる群から選択され;
ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを含む。
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)
ここで、Xaaはいずれかの天然アミノ酸であり、および、(Xaa)6は6つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
(a)例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%といった少なくとも60%の配列同一性を配列番号4の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列を含むcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号3の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)配列番号4の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチドの断片
からなる群から選択され、ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを有する。
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)
ここで、Xaaはいずれかの天然アミノ酸であり、および、(Xaa)6は6つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
(a)例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%といった少なくとも60%の配列同一性を配列番号6の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号5の成熟型ポリペプチドコード配列、(ii)配列番号5の成熟型ポリペプチドコード配列を含むcDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(c)少なくとも60%の配列同一性を配列番号5の成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
(d)配列番号6の成熟型ポリペプチドの1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体;ならびに
(e)プロテアーゼ活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチドの断片
からなる群から選択され、ここで、単離されたポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、以下のモチーフを含む。
His Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)
ここで、Xaaはいずれかの天然アミノ酸であり、および、(Xaa)6は6つの連続するアミノ酸を意味し、ここで、各アミノ酸はいずれかの天然アミノ酸であり得る。
本発明のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドがソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味することとする。一態様において、所与のソースから入手されるポリペプチドは細胞外に分泌される。
本発明はまた、触媒ドメインに作動可能にリンクしたプロペプチド結合ドメインを含む単離されたポリペプチドに関しており、ここで、結合ドメインは:
(a)少なくとも60%の配列同一性を、配列番号2のアミノ酸1〜143、配列番号4のアミノ酸−131〜−1または配列番号6のアミノ酸−128〜−1に対して有するプロペプチド;
(b)中度の緊縮条件下で、(i)配列番号1のヌクレオチド282〜710または配列番号3のヌクレオチド188〜580、(ii)配列番号1のヌクレオチド282〜710もしくは配列番号3のヌクレオチド188〜580を含むゲノムDNA配列、または、(iii)(i)もしくは(ii)の完全長相補ストランドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるプロペプチド;
(c)少なくとも60%配列同一性を、配列番号1のヌクレオチド282〜710または配列番号3のヌクレオチド188〜580に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるプロペプチド;ならびに
(d)配列番号2のアミノ酸1〜143、配列番号4のアミノ酸−131〜−1または配列番号6のアミノ酸−128〜−1の1つまたは複数(いくつか)のアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を含む変異体
からなる群から選択される。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる1つまたは複数(いくつか)の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために1つまたは複数(いくつか)の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたは配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成をもたらす1つまたは複数(いくつか)の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
本発明はまた:(a)ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、野生型形態でポリペプチドを生成する細胞を培養するステップ;および、(b)ポリペプチドを回収するステップを含む本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。好ましい態様において、細胞はバチルス属(Bacillus)のものである。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、このようなポリペプチドが富化されている。「富化」という用語は、組成物のプロテアーゼ活性が、例えば少なくとも1.1の富化因子で高められることを示す。
一実施形態において、本発明は、本発明の酵素を1種または複数種の追加のクリーニング組成成分と共に含む洗剤組成物に関する。
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、洗浄液1リットル当たり、0.01〜100mgのタンパク質、好ましくは0.005〜50mgのタンパク質、より好ましくは0.01〜25mgのタンパク質、さらにより好ましくは0.05〜10mgのタンパク質、最も好ましくは0.05〜5mgのタンパク質、最も好ましくは0.02〜2mgのタンパク質、および、さらに最も好ましくは0.01〜1mgのタンパク質などの0.001〜100mgのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加され得る。
洗剤組成物は、アニオン性および/またはカチオン性および/またはノニオン性および/または半極性および/または両イオン性またはこれらの混合物であり得る1種または複数種の界面活性剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、1種または複数種のノニオン性界面活性剤および1種または複数種のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約1%〜約40%または約3%〜約20%または約3%〜約10%などの約0.1%〜60重量%のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含む。ランドリー洗剤に用いられ得る技術分野において公知であるいずれかのランドリー界面活性剤が利用され得る。
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液(または、反対に、極性物質を非極性環境)中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する(いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性)が;しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Hodgdon and Kaler(2007),Current Opinion in Colloid & Interface Science 12:121−128による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物(水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり)が可能となる。
洗剤組成物は、約5%〜約50%などの約0〜65重量%の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含有し得る。皿洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には40〜65%、特に50〜65%である。ビルダーおよび/またはコビルダーは特に、CaおよびMgと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリー洗剤に用いられる技術分野において公知であるいずれかのビルダーおよび/またはコビルダーが利用され得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩(ピロリン酸塩)、三リン酸ナトリウム(STPまたはSTPP)などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩(例えば、Hoechst製SKS−6)、2−アミノエタン−1−オール(MEA)、イミノジエタノール(DEA)および2,2’、2”−ニトリロトリエタノール(TEA)などのエタノールアミン、および、カルボキシメチルイヌリン(CMI)、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
洗剤は、約1%〜約5%などの0〜10重量の漂白系を含有し得る。ランドリー洗剤において用いられるいずれかの技術分野において公知である漂白系が利用され得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン(R)、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸(通常は一水和物または四水和物)、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。本明細書において漂白活性化剤とは、ペルオキシド漂白剤様過酸化水素と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含み、好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)、ナトリウム3,5,5トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、4−(ドデカノイルオキシ)ベンゼンスルホネート(LOBS)、4−(デカノイルオキシ)ベンゼンスルホネート、4−(デカノイルオキシ)安息香酸塩(DOBS)、4−(3,5,5−トリメチルヘキサノイルオキシ)ベンゼンスルホネート(ISONOBS)、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)および4−(ノナノイルオキシ)ベンゼンスルホネート(NOBS)、および/または、国際公開第98/17767号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第624154号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート(ATC)が特に好ましいファミリーである。ATCまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、最終的にはクエン酸およびアルコールに分解されるために、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管に際して生成物中における良好な加水分解安定性を有しており、これは効果的な漂白活性化剤である。最後に、ATCは、ランドリー添加剤に対して良好な補助能を提供する。または、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、6−(フタロイルアミノ)過カプロン酸(PAP)などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒:
洗剤は、0.5〜5%、2〜5%、0.5〜2%または0.2〜1%などの0〜10重量%のポリマーを含有する。洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのポリマーが利用され得る。ポリマーは、上記のとおりコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止、油脂クリーニングおよび/または消泡特性をもたらし得る。いくつかのポリマーは、上記の特性を2つ以上および/または下記のモチーフを2つ以上有している場合がある。例示的なポリマーとしては、(カルボキシメチル)セルロース(CMC)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(エチレングリコール)またはポリ(エチレンオキシド)(PEG)、エトキシル化ポリ(エチレンイミン)、カルボキシメチルイヌリン(CMI)、および、PAAなどのポリカルボキシレート、PAA/PMA、ポリ−アスパラギン酸、および、ラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマー、疎水性修飾CMC(HM−CMC)およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマー系グリコールとのコポリマー、ポリエチレンテレフタレートとポリオキシエテンテレフタレートとのコポリマー(PET−POET)、PVP、ポリ(ビニルイミダゾール)(PVI)、ポリ(ビニルピリジン−N−オキシド)(PVPOまたはPVPNO)、ならびに、ポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール(PVPVI)が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド(PEO−PPO)およびジクアタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーは、例えば、国際公開第2006/130575号パンフレットに開示されている。上記のポリマーの塩もまた予期される。
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収/反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第2005/03274号パンフレット、国際公開第2005/03275号パンフレット、国際公開第2005/03276号パンフレットおよび欧州特許第1876226号明細書(本明細書において参照により援用される)に記載されている、Direct Blue、Direct Red、Direct Violet、Acid Blue、Acid Red、Acid Violet、Basic Blue、Basic VioletおよびBasic Red、または、これらの混合物の染料索引(C.I.)分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約0.00003重量%〜約0.2重量%、約0.00008重量%〜約0.05重量%またはさらには約0.0001重量%〜約0.04重量%の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、0.0001重量%〜0.2重量%の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第2007/087257号パンフレット、国際公開第2007/087243号パンフレットに開示されている。
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、例えばラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼといった、タンパク分解酵素、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼなどの1種または複数種[追加]の酵素を含み得る。
ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。他の任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤/分解剤、染料、酵素安定化剤(ホウ酸、ホウ酸塩、CMC、および/または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む)、クレイを含む布地コンディショナ、充填材/加工助剤、蛍光性白色化剤/光学増白剤、起泡増進剤、起泡(セッケンの泡)調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、セッケン泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの処方成分が利用され得る。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質な錠剤、2つ以上の層を有する錠剤、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の圧縮もしくは濃縮液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。
単位用量にない液体またはゲル洗剤は、水性であり得、典型的には、最大で約70%の水、最大で約65%の水、最大で約55%の水、最大で約45%の水、最大で約35%の水などの少なくとも20重量%および最大で95%の水を含有し得る。特に限定されないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他のタイプの液体が、水性液体またはゲル中に含まれていてもよい。水性液体またはゲル洗剤は0〜30%の有機溶剤を含有していてもよい。
粒状洗剤は、国際公開第09/092699号パンフレット、欧州特許第1705241号明細書、欧州特許第1382668号明細書、国際公開第07/001262号パンフレット、米国特許第6472364号明細書、国際公開第04/074419号パンフレットまたは国際公開第09/102854号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。他の有用な洗剤配合物が、国際公開第09/124162号パンフレット、国際公開第09/124163号パンフレット、国際公開第09/117340号パンフレット、国際公開第09/117341号パンフレット、国際公開第09/117342号パンフレット、国際公開第09/072069号パンフレット、国際公開第09/063355号パンフレット、国際公開第09/132870号パンフレット、国際公開第09/121757号パンフレット、国際公開第09/112296号パンフレット、国際公開第09/112298号パンフレット、国際公開第09/103822号パンフレット、国際公開第09/087033号パンフレット、国際公開第09/050026号パンフレット、国際公開第09/047125号パンフレット、国際公開第09/047126号パンフレット、国際公開第09/047127号パンフレット、国際公開第09/047128号パンフレット、国際公開第09/021784号パンフレット、国際公開第09/010375号パンフレット、国際公開第09/000605号パンフレット、国際公開第09/122125号パンフレット、国際公開第09/095645号パンフレット、国際公開第09/040544号パンフレット、国際公開第09/040545号パンフレット、国際公開第09/024780号パンフレット、国際公開第09/004295号パンフレット、国際公開第09/004294号パンフレット、国際公開第09/121725号パンフレット、国際公開第09/115391号パンフレット、国際公開第09/115392号パンフレット、国際公開第09/074398号パンフレット、国際公開第09/074403号パンフレット、国際公開第09/068501号パンフレット、国際公開第09/065770号パンフレット、国際公開第09/021813号パンフレット、国際公開第09/030632号パンフレット、および、国際公開第09/015951号パンフレット、国際公開第2011025615号パンフレット、国際公開第2011016958号パンフレット、国際公開第2011005803号パンフレット、国際公開第2011005623号パンフレット、国際公開第2011005730号パンフレット、国際公開第2011005844号パンフレット、国際公開第2011005904号パンフレット、国際公開第2011005630号パンフレット、国際公開第2011005830号パンフレット、国際公開第2011005912号パンフレット、国際公開第2011005905号パンフレット、国際公開第2011005910号パンフレット、国際公開第2011005813号パンフレット、国際公開第2010135238号パンフレット、国際公開第2010120863号パンフレット、国際公開第2010108002号パンフレット、国際公開第2010111365号パンフレット、国際公開第2010108000号パンフレット、国際公開第2010107635号パンフレット、国際公開第2010090915号パンフレット、国際公開第2010033976号パンフレット、国際公開第2010033746号パンフレット、国際公開第2010033747号パンフレット、国際公開第2010033897号パンフレット、国際公開第2010033979号パンフレット、国際公開第2010030540号パンフレット、国際公開第2010030541号パンフレット、国際公開第2010030539号パンフレット、国際公開第2010024467号パンフレット、国際公開第2010024469号パンフレット、国際公開第2010024470号パンフレット、国際公開第2010025161号パンフレット、国際公開第2010014395号パンフレット、国際公開第2010044905号パンフレット、国際公開第2010145887号パンフレット、国際公開第2010142503号パンフレット、国際公開第2010122051号パンフレット、国際公開第2010102861号パンフレット、国際公開第2010099997号パンフレット、国際公開第2010084039号パンフレット、国際公開第2010076292号パンフレット、国際公開第2010069742号パンフレット、国際公開第2010069718号パンフレット、国際公開第2010069957号パンフレット、国際公開第2010057784号パンフレット、国際公開第2010054986号パンフレット、国際公開第2010018043号パンフレット、国際公開第2010003783号パンフレット、国際公開第2010003792号パンフレット、国際公開第2011023716号パンフレット、国際公開第2010142539号パンフレット、国際公開第2010118959号パンフレット、国際公開第2010115813号パンフレット、国際公開第2010105942号パンフレット、国際公開第2010105961号パンフレット、国際公開第2010105962号パンフレット、国際公開第2010094356号パンフレット、国際公開第2010084203号パンフレット、国際公開第2010078979号パンフレット、国際公開第2010072456号パンフレット、国際公開第2010069905号パンフレット、国際公開第2010076165号パンフレット、国際公開第2010072603号パンフレット、国際公開第2010066486号パンフレット、国際公開第2010066631号パンフレット、国際公開第2010066632号パンフレット、国際公開第2010063689号パンフレット、国際公開第2010060821号パンフレット、国際公開第2010049187号パンフレット、国際公開第2010031607号パンフレット、国際公開第2010000636号パンフレットに記載されている。
本発明はまた、家庭用ランドリーの洗濯および産業用ランドリーの洗濯などの、生地および布地のランドリーにおいてその組成物を使用する方法に関する。
洗剤配合剤に対して重要な汚染物および汚れは多くの異なる物質から組成されており、そのすべてが異なる基質特異性を有する一連の異なる酵素が、ランドリー、および、食器洗いなどの硬質面クリーニングの両方に関連する洗剤において用いられるよう開発されてきている。酵素を伴わない同一のプロセスと比して、適用されたクリーニングプロセスにおける汚れ除去性を特異的に改善するために、これらの酵素は酵素洗浄力有益性をもたらすと考えられる。技術分野において公知である汚れ除去酵素としては、カルボヒドラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼおよびペクチナーゼなどの酵素が挙げられる。
本発明の洗剤組成物は、理想的には、ランドリー用途における使用に好適である。従って、本発明は布地を洗濯する方法を含む。この方法は、選択される布地に本発明による洗剤組成物を含むクリーニングランドリー溶液を接触させるステップを含む。布地は、通常の消費者が用いる条件において洗濯されることが可能であるいずれかの布地を含み得る。この溶液は、約5.5〜約8のpHを有することが好ましい。組成物は、溶液中で約100ppm、好ましくは500ppm〜約15,000ppmの濃度で利用され得る。水温は、典型的には、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃および約90℃を含む約5℃〜約90℃の範囲である。水対布地の比は、典型的には約1:1〜約30:1である。
本発明のプロテアーゼが、実際に、以下の実施例において記載されているAMSAにおけるテストで、例えば約60℃以上といった高温よりも例えば約40℃以下の温度といった低い温度で相対的に良好に機能することが意外にも見出された。
本発明はまた、配列番号2のアミノ酸−26〜−1または配列番号4のアミノ酸−160〜−132を含むか、これから構成されるシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、配列番号2のアミノ酸1〜143または配列番号4のアミノ酸−131〜−1を含むか、これから構成されるプロペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、配列番号2のアミノ酸−26〜143または配列番号4のアミノ酸−160〜−1を含むか、これから構成されるシグナルペプチドおよびプロペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドおよび/またはプロペプチドに作動可能にリンクするタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。タンパク質は、シグナルペプチドおよび/またはプロペプチドに対して外来性のものであることが好ましい。
バチルス属の一種(Bacillus sp.)18132を、米国で採集した環境中の砂サンプルから単離した。バチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)を、インドの汚染物サンプルから単離した。公開配列パエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)系統は、German culture collection(DSMZ,Braunschweig,Germany)から系統DSM18844として入手した。
洗浄アッセイ
ランドリー用自動機械式応力アッセイ(AMSA)
ランドリーにおける洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ(AMSA)を用いて洗濯実験を実施する。AMSAでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。AMSAプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地をすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第02/42740号パンフレット、特に第23〜24頁の段落「Special method embodiments」を参照のこと。
洗浄性能は、汚染された生地をテスト溶液に連続的に上げ下げし、その後にすすぐ試験法である、小型洗浄アッセイを用いてランドリー洗浄実験において評価する。
1)Suc−AAPF−pNAアッセイ:
pNA基質:Suc−AAPF−pNA(Bachem L−1400)。
温度:室温(25℃)
アッセイ緩衝剤:100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01%Triton X−100(HClまたはNaOHでpH値2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0および11.0に調節)。
以下を含むアッセイ緩衝剤
1mM EDTA:100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM EDTA、150mM KCl、0.01%Triton X−100、pH7.0。
基質:Protazyme AK錠剤(架橋され、染色されたカゼイン;Megazyme製)
温度:制御した(アッセイ温度)。
アッセイ緩衝剤:100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01%Triton X−100、pH7.0。
遺伝子をコードするプロテアーゼの同定
好アルカリバクテリアであるバチルス属の一種(Bacillus sp.)18132は、カゼインを基質として含有する寒天プレートで陽性の反応を示すことを見出した。プロテアーゼ遺伝子を発見するために、バチルス属の一種(Bacillus sp.)18132のゲノムDNAを配列決定し、配列番号1の配列を有するセリンS8ファミリープロテアーゼ遺伝子を、当業者に公知である技術である公開タンパク質データベースにおける相同性サーチにより発見した。配列番号2を有するコード化したプロテアーゼは、受入番号SWISSPROT:D0EVD2を有するパエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)由来の公開タンパク質配列に最も近く関連していることが見出された。パエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)プロテアーゼの酵素特性は現時点では未知であり、ここでは、バチルス属の一種(Bacillus sp.)18132の酵素特性を開示する。
国際公開第99/43835号パンフレット(本明細書において参照により援用されている)に記載のSOE PCR融合により、B.クラウシイ(B.clausii)(aprH)由来のアルカリ性プロテアーゼからのシグナルペプチドをフレーム中で、プロテアーゼをコードするDNAに融合した。コードDNAを増幅するために、バチルス属の一種(Bacillus sp.)18132のゲノムDNAを鋳型として用い、オリゴマーC15U1fおよびC15U1rを用いて遺伝子をPCRにより増幅した。
GTTCATCGATCGCATCGGCTGATGATATGAAGAAAGAAGACTATATTG(配列番号7)
C6224f:
CCAAGGCCGGTTTTTTATGTTTTATTGTAATCGAAAAGATGTTGTT(配列番号8)
CTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTTCGAAAGGTAAAAATAACGGT(配列番号9)
プライマーC57J6r:
CCAAGGCCGGTTTTTTATGTTTTAGTTTATGACAAAGCTCGT(配列番号10)
および、得られたPCR生成物を発現カセット要素に融合した。バチルス属の一種(Bacillus sp.)18132およびバチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)由来のプロテアーゼ遺伝子を、安定化配列を含む、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)α−アミラーゼ遺伝子(amyQ)およびバチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIAプロモータ由来のプロモータから構成される三重プロモータ系の制御により発現させた。発現カセットは国際公開第99/43835号パンフレットに記載されている。しかも、発現カセットは、ターミネータ(用語)配列、および、選択マーカーとした用いたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cam)をコードする遺伝子((Diderichsen et al.,1993,Plasmid 30:312−315)において枯草菌(B.subtilis)について記載されているとおり)を含有していた。
バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132からのS8Aプロテアーゼの精製
培養液体培地を遠心分離(20000×g、20分間)し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをNalgene0.2μmろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属(Bacillus)宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを0.2μm濾液に添加して最終的に1.5M(NH4)2SO4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液はわずかに混濁し、これを再度Nalgene0.2μmろ過ユニットを通してろ過した。清透な濾液を、20mMのHEPES、2mMのCaCl2、1.5M(NH4)2SO4、pH7.0で平衡化したPhenyl−sepharose FF(high sub)カラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および20mMのHEPES、2mMのCaCl2、pH7.0、25%(v/v)2−プロパノールのカラム体積の3倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)。プロテアーゼピークをプールし、プールを、G25 Sephadex カラム(GE Healthcare製)の100mMのH3BO3、10mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.0に移した。G25 sephadexに移した酵素を、100mMのH3BO3、10mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.0で平衡化したSP−セファロースFFカラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアNaCl勾配(0→0.5M)で、カラム体積の5倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)、活性画分をSDS−PAGEによりさらに分析した。クーマシーで染色したSDS−PAGEゲル上にバンドが1つしか見られなかった画分を精製調製物としてプールし、これをさらなる特徴づけに用いた。
培養液体培地を遠心分離(20000×g、20分間)し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをNalgene0.2μmろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属(Bacillus)宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを0.2μm濾液に添加して最終的に1.2M(NH4)2SO4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液を、20mMのHEPES、2mMのCaCl2、1.2M(NH4)2SO4、pH7.0で平衡化したSOURCE Phenylカラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および20mMのHEPES、2mMのCaCl2、pH7.0、25%(v/v)2−プロパノールのカラム体積の8倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)。プロテアーゼピークをプールし、プールを、G25 Sephadex カラム(GE Healthcare製)の20mMのコハク酸/NaOH、2mMのCaCl2、pH5.0に移した。G25 sephadexに移した酵素を20mMのコハク酸/NaOH、2mMのCaCl2、pH5.0で平衡化したSP−sepharose FFカラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアNaCl勾配(0→0.5M)で、カラム体積の5倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)、活性画分をSDS−PAGEによりさらに分析した。クーマシーで染色したSDS−PAGEゲル上に1つの主に優勢なバンドが見られた画分をプールし、プールを、G25 Sephadex カラム(GE Healthcare製)の20mMのHEPES、2mMのCaCl2、pH7.0に移した。G25 sephadexに移したプロテアーゼは精製調製物であり、これをさらなる特徴づけに用いた。
培養液体培地を遠心分離(20000×g、20分間)し、上澄みを沈殿物から注意深く傾瀉した。上澄みをNalgene0.2μmろ過ユニットを通してろ過して残りのバチルス属(Bacillus)宿主細胞を除去した。固体硫酸アンモニウムを0.2μm濾液に添加して最終的に2.0M(NH4)2SO4の硫酸アンモニウム濃度とした。溶液はわずかに混濁し、これを再度Nalgene0.2μmろ過ユニットを通してろ過した。清透な濾液を、20mMのHEPES、2mMのCaCl2、2.0M(NH4)2SO4、pH7.0で平衡化したSOURCE Phenylカラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、平衡緩衝剤および20mMのHEPES、2mMのCaCl2、pH7.0、25%(v/v)2−プロパノールのカラム体積の8倍量のリニア勾配で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析した(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)。プロテアーゼピークをプールし、プールを、G25 Sephadex カラム(GE Healthcare製)の100mMのH3BO3、10mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.0に移した。G25 sephadexに移した酵素を、100mMのH3BO3、10mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.0で平衡化したSP−セファロースFFカラム(GE Healthcare製)に加えた。カラムを平衡緩衝剤で完全に洗浄した後、プロテアーゼを、同一の緩衝剤中のリニアNaCl勾配(0→0.5M)で、カラム体積の5倍量で溶出した。カラムからの画分をプロテアーゼ活性について分析し(pH9でのSuc−AAPF−pNAアッセイを用いて)、活性画分をSDS−PAGEによりさらに分析した。クーマシーで染色したSDS−PAGEゲル上に1つの主に優勢なバンドが見られた画分をプールし、プールを、G25 Sephadex カラム(GE Healthcare製)の100mMのH3BO3、10mMのMES、2mMのCaCl2、pH6.0に移した。G25 sephadexに移したプロテアーゼは精製調製物であり、これをさらなる特徴づけに用いた。
Suc−AAPF−pNAアッセイを用いて、pH−活性プロファイルおよびpH−安定性プロファイル(明示したpH値での2時間後の残存活性)を得た。pH−安定性プロファイルに関して、プロテアーゼを異なるアッセイ緩衝剤で20倍に希釈してこれらの緩衝剤のpH値とし、次いで、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、pH9.0アッセイ緩衝剤での希釈により、残存活性に係るアッセイの前にプロテアーゼインキュベートのpHを同一のpH値に移行させた。Protazyme AKアッセイを用いて、pH7.0での温度−活性プロファイルを得た。Suc−AAPF−pNAアッセイを用いて、アッセイ緩衝剤中に、pH7.0で、および、アッセイ緩衝剤中に、pH7.0での温度−安定性プロファイルを得、ここでは、1mMのCaCl2を1mMのEDTAで置き換えた。温度−安定性プロファイルに関して、プロテアーゼを、アッセイ緩衝剤で、pH7.0で、または、アッセイ緩衝剤と1mMのEDTAで、pH7.0で10倍に希釈し、次いで、明示の温度で15分間インキュベーション後、サンプル中の残存活性を計測した(Savinaseを温度−安定性実験における基準として含めた)。
バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132、パエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)およびバチルスボゴリエンシス(Bacillus bogoriensis)由来のS8AプロテアーゼをPMSFにより阻害した。
プロテアーゼを約1mg/mlに希釈し、100μlを33μlの50%TCA溶液と混合し、氷上で5分間インキュベートした。沈殿物を5分間の14.000gの遠心分離により収穫し、これを、100μlの2×サンプル緩衝剤、50μlの4×NuPAGE LDSサンプル緩衝剤(Invitrogen)+125μlの水および25μlの15%DTTの混合物中に再度懸濁させた。混合物を95℃で5分間加熱し、20μlを4〜20%トリス−グリシンゲル(NuPAGE4〜12%、MES緩衝剤、Bis−Trin(Invitrogen))に仕込み、ゲルを200V、100mAで35分間作動させ、Comassie Blue染料を用いて展開させた。プロテアーゼはおよそ28kDaの分子量を有していることが見出された。プロテアーゼバンドをPVDFメンブランにブロットし、製造業者の説明書に従ってApplied Biosystems Procise Protein Sequencerを用いてN末端配列を判定した。バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132由来のペプチドのN末端配列は:配列番号2中の位置144〜150におけるアミノ酸に対応するMHNNQRWであると判定した。それ故、成熟型プロテアーゼのN末端は、配列番号2の位置144に対応する。
分子量を、Bruker microTOF focus質量分析器を備えたAgilent 1100HPLCを用いて構成されるLC−MSによる質量分光法を用いてさらに判定した。製造業者の説明書に従ってBio Rad Micro Bi−Spinh 6クロマトグラフィカラム、カタログ番号732−6221を用いてサンプルを脱塩し、70μlを、Waters MassPREP On−Line Desalting 2.1×10mmカラム、部品番号186002785に仕込んだ。サンプルを80%Can 0.05%TFAのステップ溶出で溶出した。
A−溶剤=0.05%TFA
B−溶剤=Can,0.05%TFA
MS取得法:MassPresMS070529cmc
データ経路:0711aESIMS
質量分析器は、Tunemix fra Agilentで較正した。
実施例2において調製したプロテアーゼの洗浄性能を、汚染された生地をテスト溶液に連続的に上げ下げし、その後にすすぐ試験法である、小型洗浄アッセイを用いるランドリー洗浄実験において評価する。
洗剤中におけるバチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132由来のS8の安定性を、2種の異なる洗浄温度で、自動機械式応力アッセイを用いてプロテアーゼによる洗剤の洗浄性能を試験することによりテストした。以下の3種の異なる安定性条件をテストした。
プロテアーゼは、洗浄直前に洗剤組成物に添加;
プロテアーゼは、洗剤と共に、25℃で48時間プレインキュベート;および
洗浄液は、洗浄の開始前に40℃で30分間プレインキュベート。
S8プロテアーゼバチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132の洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、3種の異なる工業的汚れについて、3種の異なる水硬度および2種の異なる酵素濃度での液体洗剤を用いてテストした。実験を、表1に記載の洗剤組成物および布きれ、ならびに、以下の表13に記載されている実験条件を用いて、単サイクル洗浄法を用いるランドリー法に対するAMSAで記載のとおり実施した。
P.デンドリティ(P.dendriti)由来のS8プロテアーゼの洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、2種の異なる工業的汚れについて、2種の異なる洗浄温度でモデル液体洗剤および市販の液体洗剤を用いてテストした。
バチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)由来のS8プロテアーゼの洗浄性能を、自動機械式応力アッセイを用い、2種の異なる工業的汚れについて、2種の異なる洗浄温度でモデル液体洗剤および市販の液体洗剤を用いてテストした。
配列番号1は、バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132から単離されたS8プロテアーゼのDNA配列である。
配列番号2は、配列番号1から推定されるアミノ酸配列である。
配列番号3は、バチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)から単離されたS8プロテアーゼのDNA配列である。
配列番号4は、配列番号3から推定されるアミノ酸配列である。
配列番号5は、受入番号EMBL:GQ891986を有するパエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)のS8プロテアーゼのDNA配列である。
配列番号6は、受入番号SWISSPROT:D0EVD2を有するパエニバチルスデンドリチホルミス(Paenibacillus dendritiformis)プロテアーゼの公共のアミノ酸配列である。
配列番号7および8は、バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132を増幅するプライマーである。
配列番号9および10は、バチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)を増幅するプライマーである。
配列番号11は、バチルス属の一種(Bacillus sp.)NN018132の融合断片である。
配列番号12は、バチルスボルゴウニエンシス(Bacillus borgouniensis)の融合断片である。
配列番号13〜配列番号49はモチーフ配列である。
Claims (16)
- (a)少なくとも90%の配列同一性を配列番号2もしくは4の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチド;
(b)少なくとも90%の配列同一性を配列番号1もしくは3の前記成熟型ポリペプチドコード配列に対して有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;ならびに
(c)プロテアーゼ活性を有し、および配列番号14〜配列番号49から選択されたモチーフをさらに含む、(a)または(b)のポリペプチド
からなる群から選択されるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、当該成熟型ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸144〜418、または配列番号4のアミノ酸1〜275からなる、単離されたポリペプチド。 - 配列番号2もしくは4を含むか、またはこれから構成される、請求項1に記載のポリペプチド。
- S8セリンプロテアーゼドメインを含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 少なくとも90%の配列同一性を配列番号2または4の成熟型ポリペプチドに対して有するポリペプチドであって、モチーフHis Gly Thr(Xaa)6Ala Ser Tyr Gly Ser Val Ser Gly(配列番号13)を含み、プロテアーゼ活性を有し、前記成熟型ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸144〜418、または配列番号4のアミノ酸1〜275からなる、ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼが、40℃以下で洗浄性能を有し、および、安定性がEDTAの強キレート剤の存在によって影響されない、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- (a)少なくとも90%の配列同一性を配列番号2のアミノ酸144〜418に対して有する触媒ドメイン;
ならびに
(b)少なくとも90%の配列同一性を配列番号1の触媒ドメインをコードするヌクレオチドに対して有するポリヌクレオチドによりコードされる触媒ドメイン
からなる群から選択される触媒ドメインを含む、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
- 洗剤組成物である、請求項7に記載の組成物。
- 前記洗剤組成物が、ランドリーまたは自動食器洗浄用組成物である、請求項8に記載の組成物。
- プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、マンナナーゼまたはいずれかのこれらの混合物から選択される1種または複数種の追加の酵素をさらに含む、請求項7または8に記載の組成物。
- 界面活性剤およびビルダーから選択される1種または複数種の成分を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 発現宿主において前記ポリペプチドを生成させる1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクター。
- 前記ポリペプチドを生成させる1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
- (a)前記ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、前記ポリペプチドを生成する細胞を培養するステップ;および
(b)前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法。 - (a)前記ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、請求項14に記載の宿主細胞を培養するステップ;および
(b)前記ポリペプチドを回収するステップ
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法。
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