JPH04108387A - β―リティック プロテアーゼ遺伝子及びその遺伝子産物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はβ−リティック　プロテアーゼ（β−１ｙｔｉ
ｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　）をコードするＤＮＡをクロー
ニングし、それを使用してβ−リティック　プロテアー
ゼを遺伝子工学的手法を用いて効率よく生産する方法に
関する。

支米夏技先 これまで研究室および治療用途においては、溶菌のため
にはリゾチームが用いられてきたが、これらとは異な、
った作用機序を有する溶菌酵素が種々の細菌から得られ
たことが報告されている（Ｇｈｕｙｓｅｎ　、バクテロ
ロジー　レビ１−（Ｂａｃｔｅｒｏ、　Ｒｅｖ。

３２．４２５−４６２（１９６ｇ）；　Ｌａｅａ＋ｍ１
ｅｒｅジャーナルオブクリニックスオブマイクロバイオ
ロジー（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２
７，１６８２−１６８３（１９８９）；　Ｂｒ１ｔｏら
。

リサーチオブマイクロバイオロジー（Ｒｅｓ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、）セ１０，１２５−１３８（１９８９）
）　、これらの酵素はオートリシン（ａｕｔｏｌｙｓｉ
ｎ）　（Ｇｈｕｙｓｅｎ、同上（１９６８）　；Ｔｏ＋
ｍａｓｚ、エルセビーアサイエンスパブリッシャーズ、
アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（３−
１２）（１９８４）］と呼ばれ、細胞壁のペプチドグリ
カンにおける特定の結合を加水分解することができるも
のであるが、これらはその加水分解部位により３つのグ
ループに分けられる。即ち、１）ポリサッカライド鎖を
加水分解するグリコシダーゼ；２）ペプチド架橋結合を
切断するエンドペプチダーゼ；３）ポリサッカライドお
よびペプチドの間の結合を開裂させるＮ−アセチル−ム
ラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの３つである。オー
トリシンは細胞壁の折り重ね〔Ｋｏｃｈ及び［）ｏｅｌ
ｅ、ジャーナルオブセオリティ力ルバイオロジー　（Ｊ
、　Ｔｈｅｒｏ、　Ｂｉｏｌ、）１１７，１３７−１５
７（１９８５）、細胞分離［Ｆｅ１ｎ及びＲｏｇｅｒｓ
、ジャーナルオブバクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、）１２フ、１４２７−１４４２（１９７６）
）、遺伝子変換、鞭毛および胞子形成（Ｒｏｇｅｒｓら
、チャプマンアンドホール（Ｃｈａｐｍａｎａｎｄ　Ｈ
ａｌｌ）、１９８０１のような重要な生物学的作用工程
に関与していると考えられる。これらの分解性酵素は細
菌代謝におけるそれらの役割（Ｔｏａ＋ａｓｚ＋同上（
１９８４）　）のためだけではなく、その抗菌性（Ｂａ
ｎｋｓら、バイオテクノロジカルアプライドバイオケミ
ストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

（１９８６月の故にも興味のもたれるものである。特に
アクロモバクタ−リティカス（Ａｃｈｒｏ■ｏｂａｃｔ
ｏｒｌｙｔｉｃｕｓ）からの分解酵素の調製は、この酵
素がリゾチームとは異なった作用機序によってグラム陽
性細菌ばかりでなく成る種のダラム陰性細菌をも分解で
きるので、興味のもたれるものである。

アクロモバクタ−リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ
ｅｒｌｙｔｉｃｕｓ）Ｍ４９７−１菌が産生ずる菌体外
酵素トシて、アクロモバクタ−プロテアーゼＩおよび溶
菌酵素と呼ばれているアクロモペプチダーゼ（Ａｃｈｒ
ｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の２種が知られている。前
者のアクロモバクタ−プロテアーゼＩについては本発明
者等がそのＤＮＡをクローニングして、既に出願を行な
っている（特願平１−５９７２６号）。

一方、アクロモペプチダーゼについては、溶菌作用を有
していることは知られているものの、どのような構造を
もったものか等、詳しいことについては未だ解明が為さ
れていなかった。

が　　しようとする 上記の細菌溶解性酵素の特殊な作用機序を解明、ひいて
はそれを利用した薬剤を提供するために、このアクロモ
ペプチダーゼについてより詳しく知ることが、この分野
での課題の一つとなっていた。

ところで、このたび本発明者等はアクロモバクタ−リテ
ィカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｌｙｔｉｃｕｓ
）Ｍ４９７−１菌が産生する該アクロモペプチダーゼの
精製を行なってみたところ、従来のｔｉｔｓを覆して、
このアクロモペプチダーゼが２種類の溶菌酵素を含有す
ることを見出した。

そしてこの得られた２種類の溶菌酵素の夫々について、
そのＮ−末端２５残基のアミノ酸配列を決定したところ
、これらは意外にも、リソバクターエンザイモゲネス（
Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）が産
生ずる既知の酵素であるα−リティックプロテアーゼ及
びβ−リティックプロテアーゼのアミノ酸配列（Ｉｈｉ
ｔａｋｅｒら、カナディアンジャーナルオブバイオケミ
ストリ−［Ｃａｎａｄ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　４３，１９３５−１９５４（１９６５））と夫々一
致した。

α−リティックプロテアーゼは哺乳類型のセリンプロテ
アーゼであり、僅かに疎水性のアミノ酸のカルボキシル
側のペプチド結合を主に加水分解しくＷｈｉｔａｋｅｒ
ら、カナディアンジャーナルオブバイオケミストリ−（
Ｃａｎａｄ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４３
．１９３５−１９５４（１９６５））、酵素的方法（Ｂ
ａｕｅｒら、ユーロピアンジャーナルオブパイオケミス
トリ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１２０，
２８９−２９４（１９８１）　）、Ｘ線結晶写真法（Ｂ
ｒａｙｅｒら、ジャーナルオブそレキュラーバイオロジ
ー（Ｊ、Ｍ。１．　Ｂｉｏｌ、）１３１，７４３−７７
５（１９７９）　；　Ｆｕｊｉｎａｇａら、ジャーナル
オブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、）１８３．４７９５０２（１９８５）　ｓ　Ｂｏ
ｎｅら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）２６．７６０９−７６１４　（１９８７））および
ＮＭＲ分析法（Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎら、ジャーナルオ
ブアメリカンケミカルソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ
ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）１００゜８０４１−８０９４　（
１９７８）　、　１９８１　、１９８５．１９８６））
によって広汎に研究されている。更に、このα−リティ
ックプロテアーゼをコードする遺伝子が最近、エルエン
ザイモゲネス（Ｌ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）　（Ｓｉ
ｌｅｎら、ジーン（Ｇｅｎｅ）６９，２３７−２４４（
１９８８）；　Ｅｐｓｔｅｉｎ　ら、ジャーナルオブバ
イオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ａｐ、）２６３，１６５８６−１６５９０（１９８８）
　）からクローニングされた。

しかしながら、β−リティック　プロテアーゼの基質特
異性、活性部位および三次構造についてはほとんど知ら
れていない（Ｗｈｉｔａｋｅｒら、同上（１９６５）の
が現状であり、それらの解明が課題となった。

課題を解決するための手 そこで本発明者らはこのようにα−リティックプロテア
ーゼと異なり詳細な研究が進んでいないβ−リティック
　プロテアーゼに着目し、まずこの酵素の構造および機
能の関係、そして分解作用機序を遺伝子工学技術を用い
て解明すべく鋭意研究の結果、アクロモバクタ−リティ
カス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ　ｌｙｔｉｃｕｓ）
Ｍ４９７−１菌からβ−リティック　プロテアーゼ遺伝
子をクローニングすること、即ち、β−リティック　プ
ロテアーゼのアミノ酸配列を利用してアクロモバクタ−
リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｌｙｔｉｃ
ｕｓ）Ｍ４９７−１菌が産生ずる溶菌酵素の遺伝子のク
ローニングを行ない、次いでこのクローニングした遺伝
子の塩基配列を決定することに成功し、本発明に到達し
たものである。

すなわち本発明は、（ｉ）β−リティックプロテアーゼ
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（ｉｉ）該ＤＮ
Ａを発現用ベクターに、β−リティック　プロテアーゼ
を発現させるように構築した組み換えＤＮＡ、（ｎｉ）
該組み換えＤＮＡを保持する形質転換体、および（神）
該形質転換体を培養し、培養物中にβ−リティックプロ
テアーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするβ−リティックプロテアーゼの製造法に関するも
のである。

本発明者はβ−リティックプロテアーゼをクローニング
するに当って第１図に示す１〜１５２６位のＤＮＡ配列
のものを得たが、この内、３１９〜９０３位が蛋白質発
現部位（プレプロ体）（このうち、３１９〜３９０位が
シグナル配列と推定される。）、９０４〜１４４０位が
成熟蛋白質部位である。そして今回の遺伝子工学的手法
によるβ−リティックプロテアーゼの生産における発現
系の構築に当っては、３１９〜１４４０位の塩基配列を
組み込んでいるが、この塩基配列に包含されるこれより
短いものであっても、β−リティック　プロテアーゼを
発現し得るものであれば用いることができる。

このＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を第１図に
併せて示しているが、このアミノ酸配列において、１〜
１７９位が成熟蛋白質部位、−１９５位〜１７９位が同
様の活性を有するが、またはβ−リティックプロテアー
ゼの前駆体である広義の成熟蛋白質部位に相当し、また
−１９５位から一１位が蛋白質発現部位（プレプロ体）
に相当するものである。

本発明においては、このアミノ酸配列の１〜１７９位の
成熟蛋白質部位（β−リティックプロテアーゼ）および
このアミノ酸配列の一１９５〜１７９位に相当する広義
の成熟蛋白質部位を含めてβ−リティックプロテアーゼ
と総称する。

本発明におけるβ−リティック　プロテアーゼをコード
する塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベクター
は、例えば、（ｉ）β−リティックプロテアーゼ産生細
胞、例えばアクロモバクタ−リティカス　Ｍ４９７−１
からの全ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、（ｉｉ）該
ＤＮＡ断片をファージまたはプラスミドに組み込み、（
市）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主
を形質転換し、（ｉｖ）得られた形質転換体を培養後、
形質転換体から適当な方法、例えばβ−リティック　プ
ロテアーゼの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイ
ブリダイゼーションにより目的とするＤＮＡを含有する
ファージあるいはプラスミドを単離し、（ｖ）その組み
換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し
、（ｖｉ）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベ
クター中のプロモーターの下流に連結する、ことにより
製造することができる。

β−リティック　プロテアーゼをコードするＤＮＡにつ
いては、全合成あるいは半合成によっても製造すること
ができ、この際、第１図に示したような配列に基いて合
成することができる。

β−リティックプロテアーゼの全ゲノムＤＮＡの制限酵
素による消化に当っては、Ｅｃｏ　　Ｒ１、Ｓａｌ　　
１．Ｂａｍ　Ｈｌ等の制限酵素が用いられる。

消化されて得られたＤＮＡ断片を組み込むプラスミドと
しては、たとえば大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡ
ｃＹｃ１８４．ｐＵＣ８，ｐＵＣ９、ｐ　Ｂ　Ｒ３２２
、’　ｐ　Ｉ　Ｎ　ｍ　Ａ　１　、　ｐ　Ｋ　Ｋ　２３
３−２などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またＤ　Ｎ　Ａ断片を組み込むファー
ジベクターとしては、たとえばＭ１３１３フアージ９．
Ｍ１３１３フアージＰ　８　ｒ　λｇｔ１１．λＥＭＢ
Ｌ３．Ｃｈａ　ｒｏｎ４などが挙げられるが、その他の
ものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いる
ことができる。

ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドまたはファージベク
ターは適当な宿主たとえばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ）属菌（大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属菌（枯草菌）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌（放線菌）、サツカロマイセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ）属菌（酵母菌）、およ
び動物細胞たるｍｏｎｋｅｙ　ＣＯＳ　ｃｅｌｌなどに
導入する。

上記エシェリキア属菌の例としては、Ｅ、ｃ。

１ｉ　ＵＴ４８１株、ＪＭ１０３株、ＪＭ８３株。

ＪＭ１０９株、ＮＭ５２２株、ＭＶＩ、３０４株、バチ
ルス属菌の例としてはバチルスズブティリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属
菌の例としてはストレプトマイセスコエリカラ−（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、サツ
カロマイセス属菌の例としてはサツ力ロマイセスセレビ
シｚ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｗ＊ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）などが挙げられる。

このようにして得られた形質転換体から、目的とするＤ
ＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する
方法としては、例えばβ−リティック　プロテアーゼの
一部をコードするオリゴヌクレオチドをプローブとして
用いたコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイ
ブリダイゼーション等によるハイブリダイゼーションに
より行われる。

単離されたファージあるいはプラスミドから目的とする
クローン化ＤＮＡを切り出し、β−リティックプロテア
ーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、適当な制限サイ
トがある場合はそれを利用して、ない場合はＤＮａｓｅ
　　Ｉを用いた欠除体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ体）を、ｌ！
Ｊ！Ｉｉ！Ｌ、Ｍ１３ファージを用いたダイデオキシ法
によるなどして、決定する。このダイデオキシ法で決定
したＤＮＡの塩基配列と、その塩基配列から判明したア
ミノ酸配列を第１図に示す。

上記のようにしてクローン化されたβ−リティック　プ
ロテアーゼをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素で消化して使用することが出
来る。

クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。

該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成りＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。

ベクターとしては、上記のエシェリキア属菌由来のプラ
スミド（例、ｐＡｃＹｃ１８４．ｐＵｃ９、ｐＫＫ２３
３−２．ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ
８，ｐＢＲ３２２’、ｐＩＮＩ［ＩＡｌ）、バチルス属
菌由来のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ、サツカロマイ
セス属苗由来のプラスミドｐＢＴＩ−１．ストレプトマ
イセス属菌のプラスミドＰ　Ｉ　Ｊ　６１　、　ｍｏｎ
ｋｅｙ　Ｃｏ　Ｓ　ｃｅｌｌのプラスミドｐＳＶＬなど
が挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
ｌ　ａ　Ｃ＋　ｔ　ａ　Ｃｒ　ｊ　ｒ　Ｐ　＋　　ｌ　
Ｐ　Ｐ’　＋　Ｐ　ｈｏＡ等のプロモーター、バチルス
属菌の場合は５Ｐ０２．α−アミラーゼ等のプロモータ
ー、サツカロマイセス属菌の場合はＰＡｏＤｌ（アルコ
ールデヒドロゲナーゼプロモーター）−Ｐｃｙｃ”チト
クロームＣプロモーター）　、　ｍｏｎｋｅｙ　ＣＯＳ
　ｃｅｌｌの場合はＳ’Ｖ４０アーリーおよびレイトプ
ロモーターなどが、その例として挙げられる。

このようにして構築されたβ−リティック　プロテアー
ゼをコ゛−ドするＤＮＡを含有するベクターを用いて、
形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、ストレプトマイセス属菌、サツカロマイセス属菌、
ｍｏｎｋｅｙ　ＣＯＳ　ｃｅｌｌなどが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌、ストレプトマイ
セス属菌、サツカロマイセス属菌、ｍｏｎｋ６ｙ　ＣＯ
８ｃｅｌｌの具体例としては、前記したものと同様のも
のが挙げられる。

このようにして、β−リティック　プロテアーゼをコー
ドするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された
形質転換体が得られる。

本発明において形質転換体を培養する際、培養に使用さ
れる培地としては、通常のものでよいが、ＬＢ培地、Ｍ
９培地、Ｔ培地などが挙げられる。

培地のｐＨは約６〜９、好ましくは７前後である。

培養時間、温度、培養方法等は適宜選択できるが、振盪
培養、培養温度２５℃前後、好ましくは２５℃より若干
低めがよく、特に好ましい組合せとしては、２５℃、２
４時間、ＩＰＴＧｌｍＭを含むＬＢ培地（ｐＨ７，２）
での振盪培養が挙げられる。

上記培養物からβ−リティックプロテアーゼを分離精製
するには、例えば下記の方法により行なうことができる
。

β−リティックプロテアーゼを培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波
、オスモティック　ショック、リゾチームおよび／また
は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過によりβ−リティック　プロテアー
ゼの前駆体たんばくや成熟ペプチドの粗抽出液を得る方
法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニ
ジンなどのたんばく変性剤や、トリトンｘ−ｔｏｏなど
の界面活性剤が含まれていてもよい。

培養液中に前駆体たんばくや成熟ペプチドが分泌される
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このように
して得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる前
駆体たんばくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが挙げられる。

作月工（象 本発明で得られたβ−リティックプロテアーゼをコード
するＤＮＡは新規なものであり、このＤＮＡでＤＮＡ感
染または形質転換した菌体や細胞では、天然物からでは
困難であった純粋な、汚染されていないβ−リティック
プロテアーゼ前駆体たんばくや成熟たんばくを大量に生
産、精製することができる。

β−リティックプロテアーゼは先に述べたように、グラ
ム陽性細菌ばかりでなく成る種のダラム陰性細菌をも分
解できる酵素と考えられ、治療上極めて有用な薬剤を提
供できる可能性があり、極めて有用である。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ　Ｂ　　Ｃｏ
ｗｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　ＢｉｏｃｈｅｓＩｉｃａｌ
　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ　：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 Ｇ１．ＶまたはＧ　ニゲリシン ＡｌａまたはＡ　：アラニン ＶａｌまたはＶ　：バリン ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン １１ｅまたはＩ　：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ　：セリン ＴｈｒまたはＴ　：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ　：メチオニン ＧｌｕまたはＥ　：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ　＝アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ　：リジン ＡｒｇまたはＲ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ　：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
　：チロシン ＴｒｐまたはＷ　ニトリブトファン ＰｒｏまたはＰ　ニブロリン ＡｓｎまたはＮ　：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ　：グルタミン なお、本発明のβ−リティックプロテアーゼをコードす
る遺伝子においては、各アミノ酸に対応する数種のコド
ンの中での選択が許容されるものであり、β−リティッ
クプロテアーゼ活性を有するものが生産される限り、そ
の一部が修飾（付加、除去、その他のＤＮＡへの置換な
ど）されていてもよい。

宜１虜− 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例において、用いられた材料、操作は以下の
通りである。

この実験で用いられている全ての酵素及び試薬は市販さ
れている。アクロモペプチダーゼ（アセトン末）、ＸＧ
ａ　ｌ、ＩＰＴＧ、アンピシリンおよびアガロース粉末
は和光純薬工業株式会社から購入された。全ての制限酵
素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント〔
エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　）　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩのラージフラグメント
〕、低ゲル化温度アガロース（ＬＯ３タカラ）および７
−デアザ配列解析キットは宝酒造株式会社から購入した
。シーンクリーン（登録商標）はＢＩｏ　　１０１株式
会社から購入した。ニック−トランスレーションキット
はニツポンジーン株式会社から購入した。α−３２Ｐ　
ｄ　ＣＴ　Ｐ　（＞４００Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌもしくは３
０００Ｃｉ／ｍｍｏ１．　）はアマージャム社から購入
した。セファロースＣＬ−４ＢおよびセファデックスＧ
−７５はファルマシア社から購入した。バクトートリプ
トンおよびバクトー酵母抽出物はデイフコ　ラボラトリ
ーズから購入した。アクロモバクタ−リティカス（Ａｃ
ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　１ｙｔｉｃｕｓ　）　Ｍ　４
９７−１は茨城大学正木武治博士から供与を受けたもの
である。ＪＭ１０９がｐＵｃ、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ
　ｌ　３　ｍ　ｐ　１９の宿主として用いられた［　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、３３，１０３
　（１９８５）〕。ＸＧａ１およびＩＰＴＧを、適当な
時期にＹＴ　（Ｍｉｌｌｅｒ、エクスペリメンツインモ
レキュラージエネテイクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　
ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（１９
７２）　）に加えた。ＪＭ１０９の形質転換（ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）をカルシウムクロライド法で
行った（Ｈｅｒｓｈｆｉｌｅｄら、プロシージングスオ
ブナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７１
．３４５５−３４５９（１９７４）　）。

実施例 １　アクロモペプチダーゼの精 アクロモペプチダーゼ粗調製液（アセトン末）を適当量
の０．０１Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　（Ｐ　Ｈ８
，０）に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したセファロース
ＣＬ−４Ｂ　　カラム（１，５Ｘ３０ｃｍ）を用いて、
濃度０から０．４ＭのＮａＣＱ直線勾配で溶出を行った
。この活性画分を回収、濃縮して、Ｏ，ＯＩＭ　Ｔｒ　
ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　（ｐＨ８，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−７５カラム（１，５Ｘ　８０ｃｍ）により
ゲル濾過を行い、溶出された活性蛋白質を凍結乾燥した
。次いでこれを、０．Ｏ１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
で平衡化したＣ４逆相カラム（μボンズスフィア、１５
μ、３００Ａ、３．９　ｍｍＸ３０　ｃｍ、ウォーター
ズ）を装着したＨＰＬＣを用いて、０．０８％ＴＦＡ　
（０−８０％、４０分）含有アセトニトリル直線勾配用
い、流出速度：　１ｍ　Ｑ　／分の条件で処理して、最
終精製物とした。

上記（１）のようにしてアクロモバクタ−リティカス（
Ａ、１ｙｔｉｃｕｓ）の培養ブロスからＨＰＬＣにより
精製した２種類の細菌溶解酵素の純度を、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥによりチエツクした。

２５残基までのＮ−末端アミノ酸配列を各酵素について
決定したところ、以下に示すように２つの膵素のＮ−末
端配列が、エルエンザイモゲネス（Ｌ、ｅｎｚｙｍｏｇ
ｅｎｅｓ）からのβ−およびα−リティックプロテアー
ゼの配列と実質的に同一であった。

α−リティックプロテアーゼ Ａ、１ｙｔｉｃｕｓ　　　ＡＮＩＶＧＧＩＥＹＳＩＮＮ
ＡＳＩＸＳＺＧＦＳＶＴＲＬ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ
　　ＡＮＩＶＧＧＩＥＹＳＩＮＮＡＳＩＣ５ＺＧＦＳＶ
ＴＲ”・β−リティックプロテアーゼ Ａ、１ｙｔｉｃｕｓ　　　５ＰＮＧＬＬＱＦＰＦＲＧＡ
ＳＷＨＶＧＧＡＧＴＮＴＬ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ　
　５ＰＮＧＬＬＱＦＰＦＲＧＡＳＩｉｌｆｌＶＧＧＡＧ
ＴＮＴ・・・２つの酵素のアミノ酸組成は各々β−およ
びα−リティックプロテアーゼの組成と実験誤差の範囲
内で同じであった（第１表）。

第１表 α−およびβ−リティックプロテアーゼアミノ酸組成ア
ミノ酸　　　α−１ｙｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　　　
　　　β−１ｙｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ＾シへに四　
し・卵□□□！萱押〉　Δ・放り９ミ　（・（社）塁！
萱狙竪Ａｓｐ　　　１５．６（１６） Ｔｈｒ　　　１６．９（１７） Ｓｅｔ　　　１８．２（１８） Ｇｌｕ　　　１２．９（１３） Ｐｒｏ　　　４．３（４） Ｇｌｙ　　　３０．７（３１） Ａｌａ　　　２３３（２３） １／２　Ｃｙｓ　　　Ｏ，０（０） Ｖａｌ　　　１６．９（１７） Ｎｅｔ　　　　１　ｇ（２） １１ｅ　　　７．１（７） Ｌｅｕ　　　１０１（１０） Ｔｙｒ５．８（６） Ｐｈｅ　　　５．２（５） Ｌｙｓ　　　２．２（２） ）ｔｉｓ　　　　１．７（２） Ａｒｇ　　１１．２（１１） Ｔｒｐ　　　１．０（１） （１５）”’　　２２．７（２３） （１８）　　　　　１３．９（１４） （２０）　　　　　２０．４（２０） （１３）　　　　　１２．２（１２） （４）　　　　　９．２（９） （２４）　　　　　１４．５（１４） （１９）　　、　　　　５８（６） （２）　　　　　３．４（４） （８）　　　　　４．５（５） （４）　　　　　１２．６（１３） （６）　　　　　６．２（６） （２）　　　　　３．２（３） （１）　　　　　７．８（８） （１２）　　　　　５．８（６） （２）　　　　　２．２（２） （２３）”　　（２２）ｂ ａ：公開された配列から計算 ｂ：クローン化された遺伝子から推定された配列から計
算したがってアクロモペプチダーゼは、エルニンザイモ
ゲネス（Ｌ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）からのα−およ
びβ−リティック　プロテアーゼとおそらく同一である
２つの細菌溶解酵素の混合物であるとの結論が出された
。

（３）β−リティック　プロテアーゼ　伝子のクローニ
ング β−リティックプロテアーゼ遺伝子を効率的にクローニ
ングするために、遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）法を適用し
た〔サイキら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９，
４８７−４９１（１９８８））。β−リティックプロテ
アーゼのアミノ酸配列における残基４６−５’２および
１６７−１７４に相当する３種類のオリゴヌクレチドを
ＰＣＨのプライマーとして使用した（第２図）。使用コ
ドンはアクロモバクタ−プロテアーゼＩ遺伝子〔オハラ
ら、ジャーナルオブバイロジカルケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６４，２０６２５−２０６
３１（１９８９））のコドン使用に基いて選択された。

ＰＣＲ法については以下のようにして行なった。

次の添加物を含有する総量０．１ｍＱ中でＰＣＲを行っ
た：１μｇのアクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ　）染色体ＤＮＡ、　１００ｐ　ｍ　ｏ　Ｑの各
プライマー、ｄＮＴＰｓ（最終濃度２００μＭ）、２．
５ユニツトのＴ’ａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１０μ
Ｑの１０×緩衝剤［１６６ｒｎＭ　（ＮＨ，）２ＳＯ４
−６７０ｒｎＭ　Ｔｒｉ　５−ＨＣＱ、ｐＨ８，８，６
７ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　２＋　１００ｍＭ　　β−メル
カプトエタノール、６７μＭ　ＥＤＴＡ）。

増幅は２５サイクルで行われ、各サイクルは１分間の９
４℃でのＩ）ＮＡ変性、４０℃もしくは５５℃での２分
間のＤＮＡ再結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）および７２℃
での２分間のポリメラーゼ反応から成っていた。

２５サイクルのＰＣＲ後１、約４００ｂｐの断片を使用
条件の下、増幅し、Ｍ１３ｍｐ１９　　Ｓｍａ■部分に
結合させ、配列を分析した。第３図はＰＣＲ生成物のア
ガロースゲル電気泳動図である。

各レーンはプライマーのセットと共にＰＣＲ生成物を示
している。レーン１はプライマー（１）および（２）、
レーン２は−プライマー（１）および（３）、レーン３
はプライマー（１）および（３）で４０℃でアニーリン
グしたものである。決定されたヌクレオチド配列から予
測されるアミノ酸配列は、第４図に示すように第５６位
残基を除き、また１０４．１０５および１２３残基の置
換を除き、Ｌ　、　ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓのβ−リテ
ィック　プロテアーゼのアミノ酸配列と一致した。

このようにして得られた４００ｂｐ断片は、適当な制限
酵素でのアクロモバクタ−染色体Ｄ　Ｎ　Ａ消化物のサ
ザンハイプリダイゼーションのためのプローブとして使
用された。

サザンハイプリダイゼーションは次のようにして行なっ
た、 ハイブリダ・イゼーションのためのプローブとして使用
されたＤＮＡ断片はα−３２Ｐ　　ｄＣＴＰ　（＞３０
００Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌ）によりニックトランスレーショ
ンにより標識化を行った。

サザンハイプリダイゼーションは、約１０μｇのアクロ
モバクタ−染色体ＤＮＡを好適な制限酵素で消化した後
、０．７％アガロースゲル電気泳動により分離した。こ
のゲルを３０分間変性溶液（０゜５Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ／
１．５Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ　）で処理、次いで中性化溶液
（０，５Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＱ　、　ｐ　Ｈ７
，５／３ＭＮａＣＱ）で２回処理した後、ＤＮＡをニト
ロセルロースフィルター上に転写した。このフィルター
を空気乾燥し１次いで２時間８０℃で処理して、フィル
ター上にＤＮＡを固定した。この処理を行ったフィルタ
ーを、０．５％ＳＤＳ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ試薬お
よび１００μｇ／ｍＱの変性鮭精子ＤＮＡを含有する８
ｍＡの６ＸＳＳＣ中で予備ハイブリダイズさせた。続い
て”Ｐ標識化したプローブを添加し、同溶液中６０℃で
２４時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーショ
ン後、このフィルターを次の溶液で連続して洗浄した二
０．５％　ＳＤＳを含有する２ＸＳＳＣで室温で５分間
、０．１％　ＳＤＳ含有２ｘｓｓｃで１５分間を２回、
次ｕＮｔ’ｏ、１％　ＳＤＳ含有（７）０．ＩＸ　Ｓ　
Ｓ　Ｃ１？６０℃、２時間を２回行った。このフィルタ
ーをＦｕｊｉ　Ｘ線フィルム上で感光させた。

コロニーハイブリダイゼーションは、寒天プレート上の
コロニーを、寒天プレートの表面上にニトロセルロース
フィルターを置くことにより、該フィルター上に移した
。フィルターへのＤ　Ｎ　Ａの結合および標識化プロー
ブを用いたハイブリダイゼーションは、上記のサザンハ
イプリダイゼーションと同一の方法で行った。

第５図は５ｃａｌ　　（レーンｌ）、Ｐｓｔｌ　　（レ
ーン２）　、ＥｃｏＲＩ　　（レーン３）およびＢａｍ
ＨＩ　　（レーン４）で消化された染色体Ｄ　Ｎ　Ａへ
のニックトランスレートされた４００ｂｐ　　ＰＣＲ断
片のハイブリダイゼーションを示す。その結果、２Ｏ−
ｋｂのＳ　ｃ　ａ　Ｉ　、　４００−　ｂ　ｐのＰｓｔ
ｌ、１．８ｋｂのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩおよび１０−　ｋ　
ｂのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ断片がこのプローブとハイブリダ
イズした。この１．８ｋｂ　　ＥｃｏＲＩを続いてゲル
スライスから溶出させ、ｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位に
結合させ、このプローブとのコロニーハイブリダイゼー
ションにより選別を行った。３つの陽性クローンが得ら
れ、これら３つのクローンからのＥｃｏＲＩ断片をＭ　
１３　ｍ　ｐ　１９中に再クローン化して配列の分析を
行い、このものがβ−リティックプロテアーゼをコード
する遺伝子を有していることを確認した。

第６図はβ−リティックプロテアーゼ遺伝子の配列解析
法および部分制限地図を示している。

この遺伝子のヌクレオチド解析にあたっては、β−リテ
ィック　プロテアーゼ構造遺伝子の二重鎖の配列を、α
−”ＰｄＣＴＰを用いたジテオキシ鎖終止法〔サンガー
ら、プロシージングスオブナショナルアカデミーオブサ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ
ｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７４．５４６３−５４６７（
１９７７）　）で解析した。その２次構造をとりやすい
配列の故に生じる配列読み取りの誤りを少なくするため
に、タカラフ−デアザｄ　ＧＴＰ　（Ｂａｒｒら、バイ
オテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　４：
４２８−４３２（１９８６）　）配列キットを使用し、
展開反応を４２°Ｃで行った。

アミノ酸および蛋白質配列の分析については。

蛋白質配列の分析を４７ＯＡアプライドバイオシステム
ズ蛋白質分析機で行い、ＰＴＨ−アミノ酸を改良イソク
ラチック分析系（ツナサワら、１９８５）により溶出し
た。アミノ酸組成を日立Ｌ８５００Ｓ自動アミノ酸分析
機で決定した。過ギ酸で酸化した蛋白質（Ｈｉｒｓ、　
１９７６）を排気管中１１０℃、２４時間、常沸ＨＣ（
１（５，７Ｎ　）中で加水分解した。

このヌクレオチド配列は３７４ア・ミノ酸をコードする
１１２２ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム
を含有しく第１図）、この推測された蛋白質のカルボキ
シル側の部分は、残基４３．４４．５９．１０４，１０
５および１２３部位におけるわずかな違いがあるだけで
、公開されているβ−リティックプロテアーゼ配列と一
致した（第４図）。これらの残基に相当するヌクレオチ
ド配列は、この配列解析を数回行うことによって立証さ
れた。終止コドン（ＴＧＡ）はβ−リティックプロテア
ーゼのＣ−末端アミノ酸（Ａｓｎ）のコドンに続いた。

転写終止シグナルはまたこの終止コドンの下流に見出さ
れた。一方、翻訳開始部位はβ−リティックプロテアー
ゼのＮ−末端アミノ酸（Ｓｅｔ）からかなり上流にある
３２０位（ＤＮＡ配列で）のＭｅｔであると推定された
。

というのは、潜在的ＳＤ配列［５ｈｉｎｅおよびＤａｌ
ｇａｒｎｏ、プロシージングスオブナショナルアカデミ
ーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　５ｃｉｅｎｃｅ）　ＵＳＡ、　７１．１３４２−１
３４６（１９７４）　］　（Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　）および
可能性のあるシグナルペプチト配列が、正に開始Ｍｅｔ
コドンの各々上流および下流に見出されたからである。

この事は、β−リティックプロテアーゼが前駆体蛋白質
（３７４アミノ酸）として合成され、それからＮ−末端
１９５アミノ酸範囲が遊離されることにより１７９アミ
ノ酸の成熟蛋白質が製造されることを示している。

推定上のプロモーターの−３５および一１０領域は各々
２６位および５０位に位置している（第１図）。これら
の領域は通常の場合と異なり開始のＭｅｔコドンから離
れており、こういった事はアクロモバクタ−プロテアー
ゼ■遺伝子の場合にも見られた。転写と翻訳部位の間の
長い領域はこの遺伝子の転写の規制に重要な役割を果た
しているのかもしれない。β−リティック　プ口テア−
ゼの推定されるシグナルペプチドは細菌シグナルペプチ
ド類の典型的なものである。このペプチドは開始のＭｅ
ｔに続く正に荷電した残基の核をもち、この核に続く疎
水性ペプチド鎖およびシグナルペプチターゼ消化のため
の推定上の切断部位（Ａｌａ−Ａｌａ）を有す。

β−リティック　プロテアーゼをコードするオープンリ
ーディングフレームのＧ＋Ｃ含有量は６７゜４％と計算
されたが、この数値はアクロモバクタ−プロテアーゼ■
遺伝子もしくはアクロモバクタ−ゲノムＤＮＡのいずれ
かのもののその数値〔Ｄｅｌｅｙ、エボルーショナリー
バイオロジー（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　ｖｏｌｌｌ、　１０３（１９６８））と大体同
一である。β−リティックプロテアーゼおよびアクロモ
バクタ−プロテアーゼＩ遺伝子のコード使用は、アクロ
モバクタ−ゲノムＤＮＡの高いＧ十Ｃ含有量は、第３の
不安定な位置でのＧもしくはＣの使用によるものである
ことを示している。

（５）以上の実験結果より次の事柄が判明した。

β−リティック　プロテアーゼは長いプレプローペプチ
ド鎖を有する前駆体蛋白質として生体内で合成されるこ
とが見出された。グラム陽性およびグラム陰性バクテリ
アから分泌される細胞外プロテアーゼのいくつかは、Ｎ
−末端もしくはＣ−末端または両末端に長いアミノ酸範
囲を有する前駆体として合成されることが報告されてい
る。エルエンザイモゲネス（Ｌ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅ
ｓ）、サブティリシンスからのα−リティックプロテア
ーゼ（Ｔｔｈａｌ及びＦｅｒｒａｒｉ、　１９８４）お
よび種々のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の中性プロ
テアーゼ（Ｙａｎｇら、ジャーナルオブバクテリオロジ
ー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６０．１５−２１
（１９８４）：シマダら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）２．７５−８５（
１９８５）　；タカギら、ジャーナルオブバクテリオロ
ジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１６３，８２４−８３１（１９
８５）　）はそのＮ−末端に長いアミノ酸範囲を有し、
ナイセリアゴノルホア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　［坦■匝
並）のＩｇＡプロテアーゼ（Ｐｏｈｌｎｅｒら、１９８
７）およびセラチアマルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　
ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からのプロテアーゼ（Ｙａｕａ
ｇｉｇａら、１９８６）はＣ−末端に長いアミノ酸範囲
を有している。アクロモバクタ−プロテアーゼ■〔オハ
ラら、前出（１９８９）　］およびサーマスアクアテイ
カス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ａｇｕａｔｉｃｕｓ）からのア
クアリシンｌ　（Ｋ−ｏｔ＋＋ｎら、ヨーロピアンジャ
ーナルオブバイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

）１７３，４９１−４９７（１９８８）　）はＮ−およ
びＣ−両末端に長い蛋白質銀を有している。明らかに、
これらの前駆体におけるプレーペプチド部分の機能（シ
グナルペプチド）は細胞質膜を通じての分泌蛋白質の輸
送であるが、プロペプチドのこの長い領域の正確な役割
は知られていない。いくつかの興味ある仮説が提案され
ている。即ち、このものはそれが連結しているプロテア
ーゼの活性を阻止する役割を果たしており、（Ｅｐｓｔ
ｅｉｎら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

）２６３，１６５８６−１６５９０（１９８８）　；　
Ｃａｒｍｏｎａら、ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１５゜６７５７
（１９８７）　）、またこのプロテアーゼがその活性態
を保持することを助けており（１，ｋｅｍｕｒａら、ジ
ャーナルオブバイオロジ力ルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６２，７８５９−７８６４（１
９８７）　；　５ｉｌｅｎら、ジャーナルオブバイオロ
ジカルケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）１７１．１３２０−１３２５
（１９８９）　）、もしくはダラム陰性細菌における外
膜を超えての働きを行う役割を果たしているというもの
である。β−リティック　プロテアーゼのプロ領域は通
常のものと異なりＡｒｇおよびＬｙｓといった塩基性ア
ミノ酸を高含量で有する。Ａｒｇ残基のいくつかの集団
（Ａｒｇ−ＡｒｇもしくはＡｒｇ−Ａｒｇ　−Ａｒｇ−
Ａｒｇ）がこの領域に存在することは特筆すべきである
。プロ領域の中でのかなりの同一性は見出されていない
が、塩基性アミノ酸の集団は、リソバクター（Ｌｙｓｏ
ｂａｃｔｅｒ）　ａ−リティックプロテアーゼ、アクロ
モバクタ−プロテアーゼ■およびサブティリシンのよう
な他の細菌性のプロテアーゼのプロペプチド領域中にも
見出されていた。このことは塩基性集団が、プロ領域と
成熟プロテアーゼの通過折たたみ状態（ｔｈｅ　ｔｒａ
ｎｓｉｔｆｏｌｄｅｉｎｇ　５ｔａｔｅ）との間のＰａ
ｐＤシャペロンのような特異的な親水性および疎水性領
域（）ｌｏ１ｍｇｒｅｎら、ネイチャー（〜ａｔｕｒｅ
）３４２．２４８−２５１　（１９８９月を形成するこ
とによる相互反応、あるいは正に荷電された塩基性アミ
ノ酸の集団と負に荷電された外膜のリン脂質との間の相
互作用により開始もしくは支持される外部膜（ダラム陰
性細菌に対して）を通じての成熟β−リティック　プロ
テアーゼの輸送に用いられている可能性もある。

アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）およ
びリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）は形態学的に
異なった属に分類されているが、両翼のある種の株はα
−リティックプロテアーゼ、β−リティックプロテアー
ゼおよびリジン−特定セリンプロテアーゼを分泌する。

アクロモバクタ−およびリソバクターとは形態学的に異
なった属のサイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）もま
たα−およびβ−リティック　プロテアーゼを細胞外に
分泌（産生）する（データは示されていない）。これら
３種の微生物は同一であるか非常に近い種であるようで
ある。

β−リティック　プロテアーゼ構造遺伝子の一部である
４００−ｂｐＤＮＡ断片は第、２図に示されるプライマ
ーを使用するＰＣＲ法によりアクロモバクタ−染色体Ｄ
ＮＡから容易にまた迅速に増幅された、同じプライマー
を用いて、サイトファーガ染色体Ｄ　Ｎ　Ａから同じサ
イズの断片が増幅された（データは示されていない）。

また同様に関連するもしくは近縁の細菌における特定の
遺伝子の存在を検知するためにはＰＣＲ法を使用するの
が非常に便利である。このＰＣＲ法は原核微生物の同定
および分類においても非常に効率のよい技術である。

β−リティック　プロテアーゼはグラム陽性細菌ばかり
でなくある種のダラム陰性細菌を、α−リティックプロ
テアーゼと共同で溶解することができる。リソバクター
（印鉋匝妙藍）β−リティック　プロテアーゼがポリサ
ッカライドとペプチド部分の間の結合を加水分解すると
いうことは、この酵素がＮ−アセチル−ムラモイル−し
−アラニン−アミダーゼであることを意味しているが、
基質がインシュリンのβ鎖である場合はこのリティック
プロテアーゼはＧｌｙ’−Ｐｈｅおよび■ａｌ−Ｃｙｓ
結合を切断する（Ｗｈｉｔａｋｅｒ、前出（１９６５）
　）。このことはこのプロテアーゼがアクロモバクタ−
プロテアーゼＩおよびα−リティックプロテアーゼと同
様に自動触媒的に活性化され得ることを示している。事
実、プロ領域および成熟酵素の間のペプチド結合はＶａ
ｌ−８ｅｒ結合である。この基質特異性とプロ領域の機
能を解明するためには更に研究を行うことが必要である
。

触媒反応に必須の要件によれば、プロテアーゼは４つの
グループに分類することができる：即ちセリンプロテア
ーゼ、システィンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテ
アーゼおよびメタロプロテアーゼである。アミノ酸配列
の同一性および類似性の調査が、β−リティック　プロ
テアーゼの配列の確立のために行われた。しかしな力１
らＮＢＲＦ−ＰＩＲ−データベースを用いたものでは、
４つの群のプロテアーゼのいずれかとストレプトコッコ
エラ（鉦印立μｍ埠岨）からのＮ−アセチル−ムラモイ
ル−し−アラニンアミダーゼ（Ｇａｒｃｉａら、ジーン
（Ｇｅｎｅ）、４３，２６５−２７２（１９８６））と
の間には、何ら意味ある類似性は見出されなかった。リ
ソバクターβ−リティック　プロテアーゼはＺｎ”−酵
素である可能性があるので、金属イオンへの結合子が検
索された。既知のサーモリシン型亜鉛依存性プロテアー
ゼに共通しているＨ　ｉ　ｓ　−Ｇ　１　ｕ　−Ｘ　−
Ｘ　−Ｈｉ　ｓ　ＣＪｏｎｇｅｅｌら、レトルズ（ＬＥ
ＴＴＬＥＳ）　。

２４２．２１１−２１４（１９８９））に類似したＨｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ配列が１２２−１２４残基に存在し
ていることが見出された。　Ｈｉ　５−Ｘ−Ｈｌ　ｓ配
列におけるＺｎ２＋のための結合子であることが知られ
ている（Ｋａｎｎａｎら、プロシージングスオブザナシ
ョナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　
７２：５ｌ−５５（１９７５）。アクロモバクタ−β−
リティック　プロテアーゼにとってＺｎ　　　が必須で
あるかどうかは知られていない。β−リティック　プロ
テアーゼの分子クローニングおよび大腸菌内でその発現
は、このリティック　プロテアーゼ機能の分子的な基礎
を解明するために特定部位指向性変異実験を行うことを
近い将来可能にするものであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明でクローニングされたβ−リティック　
プロテアーゼのＤＮＡ配列およびそれから推定されるア
ミノ酸配列である。 第２図は本発明のβ−リティック　プロテアーゼ遺伝子
クローニングのために使用した、ＰＣＲ法用のプライマ
ーを示す図である。 第３図はＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動図であ
る。 第４図は本発明でクローニングされたβ−リティック　
プロテアーゼの推定されるアミノ酸配列とエルエンザイ
モゲネス（Ｌ、ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）からのβ−リ
ティックプロテアーゼとの配列を比較して示した図であ
る。 第５図は本発明のβ−リティック　プロテアーゼ遺伝子
クローニングの際に行ったサザンハイプリダイゼーショ
ンの結果を示す図である。 第６図はβ−リティックプロテアーゼ遺伝子の配列解析
法および部分制限地図を示した図である。 第５図 ２．０−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−リティックプロテアーゼをコードするＤＮＡ
   を含有するＤＮＡ。
2. （２）第１図の９０４位から１４４０位の塩基配列ある
   いはその一部を含有する請求項１記載のＤＮＡ。
3. （３）第１図の３１９位から１４４０位の塩基配列ある
   いはその一部を含有する請求項１記載のＤＮＡ。
4. （４）β−リティックプロテアーゼをコードするＤＮＡ
   がアクロモバクターリティカスＭ４９７−１の染色体Ｄ
   ＮＡ由来のＤＮＡである、請求項１、２または３記載の
   ＤＮＡ。
5. （５）請求項１、２、３または４記載のＤＮＡを、β−
   リティックプロテアーゼを発現させるように、発現用ベ
   クターに構築した組み換えＤＮＡ。
6. （６）請求項５記載のＤＮＡを保持する形質転換体。
7. （７）形質転換体の宿主が大腸菌である請求項６記載の
   形質転換体。
8. （８）請求項６または７記載の形質転換体を培養し、培
   養物中にβ−リティックプロテアーゼを生成蓄積せしめ
   、これを採取することを特徴とする、該β−リティック
   プロテアーゼの製造法。
9. （９）部位特異的変異により改変した請求項５記載の組
   み換えＤＮＡを用いる、請求項８記載のβ−リティック
   プロテアーゼの製造法。