JP2019123803A

JP2019123803A - 角質汚れ洗浄剤

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Publication number: JP2019123803A
Application number: JP2018005193A
Authority: JP
Inventors: 大智山下; Daichi Yamashita; 貴大日置; Takahiro Hioki; 正敏東畑; Masatoshi Tohata
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2019-07-25
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: JP7057140B2

Abstract

【課題】角質汚れに対する洗浄力の高い洗浄剤の提供。【解決手段】Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とする、角質汚れ洗浄剤。【選択図】なし

Description

本発明は、角質汚れ洗浄剤及びそれを用いた洗浄方法に関する。

皮膚においては、基底層にて分裂した細胞は、外層への移行と共に分化し、最外層にて脱核化した後、重層化することにより角質層を形成する。皮膚の角質層は、皮膚の重要な機能の一つであるバリアとして機能している。この角質層のターンオーバーはヒトでは約２８日であり、役割を終えた角質層又はその成分は垢となる。

衣類に付着する汚れの中で、ワイシャツ等の襟や袖口などに生じる黒〜茶色の着色を呈する汚れは、「襟袖汚れ」、「黒ずみ汚れ」などと称され、非常に落としにくい汚れである。これらの汚れは、皮膚表層の角質細胞又はその成分が衣類に付着することにより生じる。襟袖汚れのうち特に落としにくい汚れは、角質層由来のケラチンタンパクであると考えられている（非特許文献１）。

このような、いわゆる襟袖汚れをターゲットとした洗浄剤又は洗浄方法が従来開発されている。特許文献１には、特定の非イオン界面活性剤とスルホン酸化合物とポリエチレングリコールとを特定比率で配合した洗浄剤組成物が開示されている。特許文献２には、被洗浄物を、キレート剤及び水を含む液と接触させた後、界面活性剤、水及び酵素を含む液と接触させる方法が開示されている。特許文献３には、特定のノニオン性界面活性剤、金属イオン捕捉剤、プロテアーゼ、アルカノールアミン、（メタ）アクリル酸／（メタ）アクリル酸エステル共重合体、及びハイドロトロープ剤を含有する洗浄剤組成物が開示されている。

近年、プロテアーゼなどのタンパク質分解に優れた酵素を含む洗浄剤が提供されている（例えば特許文献３〜５）。プロテアーゼは、襟袖汚れの洗浄にも有用と考えられる（特許文献３〜４）。しかし、従来の洗浄剤で襟袖汚れを効果的に落とすためには、洗浄剤を、通常のように水で希釈せず、直接汚れに塗布したり、さらにもみ洗いしたりすることが必要である。襟袖汚れに対する洗浄力のより高い洗浄剤の開発が望まれる。また近年、生活者の衛生意識の高まりに伴い、衣類のにおいや菌の除去に対する関心も高まってきている。衣類には皮膚常在菌や環境中に存在する様々な菌が付着し繁殖していることが知られており、皮膚常在菌としては黄色ブドウ球菌やマイクロコッカス属菌などのグラム陽性菌が知られている（特許文献５〜６）。これまでに黄色ブドウ球菌への殺菌効果のある酵素Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（リソスタフィン）を用いることで洗濯物からの悪臭を削減できることが報告されている（特許文献５）。

特開平１１−２７９６００号公報特開２００３−４１４７９号公報特開２００５−１３２８９８号公報特開２０１５−１２０８４９号公報特表２００４−５２７６０３号公報特開２０１７−０９５６１０号公報

Ｍ．Ｍｕｒａｔａｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｊｐｎ．ＯｉｌＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ＹＵＫＡＧＡＫＵ），Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１（１９９３），ｐ２−９

本発明は、角質汚れに対する洗浄力の高い洗浄剤、及びそれを用いた角質汚れの洗浄方法に関する。

本発明者は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼが、角質汚れを分解する能力が高いことを見出した。

したがって、本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とする、角質汚れ洗浄剤を提供する。
また本発明は、該角質汚れ洗浄剤を用いる、角質汚れの洗浄方法を提供する。

本発明により提供される酵素Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、角質汚れ（例えば襟袖汚れ）を分解する能力に優れている。当該酵素を洗浄剤に配合することによって、角質汚れに対する洗浄力の高い洗浄剤を得ることができる。

黄色ブドウ球菌に対する酵素の殺菌力。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝３）襟袖汚れに対する酵素の洗浄力。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝３）。ＢＬＰとアルカリプロテアーゼとの併用による襟袖汚れに対する洗浄力の増強。エラーバー＝標準偏差（ｎ＝４）。

本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。

本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。

本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌＷ２やＣｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａを使用することもできる。ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＣｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。

上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。目的配列上の該「相当する位置」のアミノ酸残基が参照配列とで同じであるとき、それは参照配列のアミノ酸残基に「相当するアミノ酸残基」とみなされる。例えば、目的配列上で、配列番号２のアミノ酸配列のＨ２２に相当する位置のアミノ酸残基がＨであれば、それは、配列番号２のアミノ酸配列のＨ２２に相当するアミノ酸残基である。

本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。

本明細書において、「角質汚れ」とは皮膚表層の角質細胞またはその成分が衣類又は布製品に付着することにより生ずる該衣類又は布製品の汚れをいう。また本明細書において、「襟袖汚れ」とは、「角質汚れ」の１種であり、衣類の襟又は袖口と皮膚との接触及び擦れに起因してその襟又は袖口に生じる黒〜茶色の着色を呈する汚れであり、「黒ずみ汚れ」又は「襟袖口汚れ」とも称される。本明細書における「角質汚れ」は、衣類の襟又は袖口においてよく見られ、したがって多くの場合「襟袖汚れ」である。しかし、本明細書における「角質汚れ」は、衣類の襟や袖口の汚れに限定されて解釈されるべきではない。

角質汚れの主な原因物質は、皮膚の角質（すなわちタンパク質）であり、そのため従来、プロテアーゼを含む洗浄剤が角質汚れの洗浄のために使用されてきた。角質層の主成分がケラチンおよびロリクリンであることが知られている。さらに襟袖汚れの成分に、タンパク質ロリクリン及びケラチン１０が含まれることが示唆されている（繊維製品消費科学１９（３），１０６−１１５，１９７８、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ６，３２８−３４０，２００５）。したがって、本明細書における「角質汚れ」は、「皮膚又は角質層由来のロリクリン及びケラチン１０を含む汚れ」と言い換えることができる。また本明細書における「襟袖汚れ」は、「衣類の襟又は袖口における、皮膚又は角質層由来のロリクリン及びケラチン１０を含む汚れ」と言い換えることができる。

Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、ＭＥＲＯＰＳデータベース[ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ]に記載されるタンパク質分解酵素ファミリーにおいて、Ｍ２３ファミリーに属するメタロプロテアーゼのサブファミリーである、Ｍ２３Ａサブファミリーに属するプロテアーゼをいう。ＭＥＲＯＰＳデータベースでは、酵素を以下の論文に記載の方法に基づいてファミリーまたはサブファミリーにまで分類している：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９９，２７：３２５−３３１、ＪＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ，２００１，１３４：９５−１０２、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０１６，４４：Ｄ３４３−Ｄ３５０。ＭＥＲＯＰＳデータベースのリリース１１．０においては、Ｍ２３Ａサブファミリーには、β−リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）（MEROPS ID：M23.001）、Staphylolysinとも呼ばれるＬａｓＡタンパク質（Las A protein；ＬＡＳ）（MEROPS ID：M23.002）、及びMername-AA291 peptidaseとも呼ばれるアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（Aeromonas hydrophila proteinase；ＡｈＰ）（MEROPS ID：M23.003）の３つのプロテアーゼがＨｏｌｏｔｙｐｅとして存在している。

好ましくは、本明細書におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、β−リティックメタロプロテアーゼ（ＢＬＰ）、ＬａｓＡタンパク質（ＬａｓＡ又はＬＡＳ）、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（ＡｈＰ）からなる群より選択される少なくとも１種をいう。本発明において、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰは、いずれか１種が使用されてもよく、いずれか２種又は３種の組み合わせで使用されてもよい。好ましくは、本発明において使用されるＭ２３ＡサブファミリープロテアーゼはＢＬＰを含み、より好ましくはＢＬＰである。

β−リティックメタロプロテアーゼ（ＢＬＰ）、ＬａｓＡタンパク質（ＬａｓＡ又はＬＡＳ）、アエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（ＡｈＰ）は、ペプチド配列中のグリシン−グリシン結合の分解活性を有する酵素である。ＢＬＰの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＢＬＰの別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２２、Ｄ３６、Ｈ１２１及びＨ１２３に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＬＡＳの好ましい例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＬＡＳの別の例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸配列のＨ２３、Ｄ３６、Ｈ１２０及びＨ１２２に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＡｈＰの好ましい例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ＡｈＰの別の例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号６で示されるアミノ酸配列のＨ２１、Ｄ３４、Ｈ１１８及びＨ１２０に相当するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。

上記に挙げたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、それを生産する微生物又はその培養物から抽出又は調製することができる。例えば、ＢＬＰは、Lysobacter sp. (NBRC 12725又はNBRC 12726)、Achromobacter lyticus M497-1、Lysobacter sp. IB-9374、Lysobacter gummosus DSMZ 6980等、又はその培養物から抽出又は調製することができ、ＬＡＳは、Pseudomonas aeruginosa PA01、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145、Pseudomonas aeruginosa FRD1等、又はその培養物から抽出又は調製することができ、ＡｈＰは、Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966、Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier (ATCC 51307)等、又はその培養物から抽出又は調製することができる。上記微生物は公的微生物保存機関より購入することができる。当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを生産する微生物は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた微生物又は培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による微生物の分離、上清又はろ液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法を用いて行うことができる。

あるいは、当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、上述したアミノ酸配列を利用して、化学合成又は生物学的手法により製造することができる。例えば、アミノ酸配列に基づき化学合成したＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を発現するように形質転換した微生物を培養し、微生物又は培養物から目的の酵素を調製することで、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを得ることができる。そのような形質転換微生物としては、例えば、制御領域と作動可能に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を、宿主細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入して得られた微生物、適切な位置に目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターを導入した微生物、などが挙げられる。

本明細書において、遺伝子の「制御領域」とは、該領域の下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。

Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を含む発現ベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを安定に発現させることができるベクターに、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子を組込むことで作製することができる。かかるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｅｍ．，１９９５，５９：２１７２−２１７５）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）等が挙げられる。

宿主微生物の形質転換は、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主微生物としては、特に制限されないが、Bacillus属（例えば枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、Streptomyces属、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌などが挙げられる。好ましい宿主は、該宿主に導入するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ遺伝子の由来菌と同種もしくは同属の微生物、大腸菌、またはバチルス属細菌であり、より好ましくはバチルス属細菌である。さらに、導入したＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼの生産が少ないバチルス属細菌が好ましい。好ましくは、枯草菌のａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株、より好ましくは、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの８個の遺伝子を欠失した８重欠失株が挙げられる。

得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた微生物又は培養物から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又はろ液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法を用いて行うことができる。

あるいは、当該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、それを含む酵素組成物等から調製することができる。例えば、ＢＬＰは、アクロモペプチダーゼから調製することができる。アクロモペプチダーゼは、Lysobacter enzymogenes由来の溶菌酵素であり、ＢＬＰを含有する。アクロモペプチダーゼは、和光純薬工業（株）等から市販されている。

一態様において、本発明は、角質汚れ洗浄剤を提供する。本発明の角質汚れ洗浄剤は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分として含有する。別の一態様において、本発明は、角質汚れ洗浄剤の製造におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの使用を提供する。また別の一態様において、本発明は、角質汚れ洗浄のためのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの使用を提供する。本発明において、当該角質汚れは好ましくは襟袖汚れである。一実施形態において、当該洗浄は漬け置き洗浄であり、本発明の洗浄剤は漬け置き洗浄用の洗浄剤である。しかしながら、本発明による洗浄の種類及び本発明の洗浄剤の形態は、これらに限定されない。

本発明において、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、角質汚れの洗浄のための有効成分として使用される。好ましい実施形態において、本発明で用いられるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰからなる群より選択される少なくとも１種である。より好ましい実施形態において、本発明で用いられるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ＢＬＰである。

本発明においては、角質汚れの洗浄のための有効成分として、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を使用することができる。好ましくは、当該酵素組成物は、ＢＬＰ、ＬＡＳ及びＡｈＰからなる群より選択される少なくとも１種を含有する。より好ましくは、当該酵素組成物は、ＢＬＰを含有する。当該酵素組成物の好ましい例としては、アクロモペプチダーゼが挙げられる。

一実施形態において、当該本発明の角質汚れ洗浄剤は、上記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する酵素組成物から本質的に構成され得る。好ましい実施形態において、当該本発明の角質汚れ洗浄剤は、上記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する酵素組成物を含む組成物である。言い換えると、本発明で有効成分として用いられるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する酵素組成物は、それを含む組成物の形態で使用され得る。

後述の実施例１に示すとおり、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）等のグラム陽性菌に対する殺菌性を有する。したがって、本発明において、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する組成物は、角質汚れ洗浄だけでなく、グラム陽性菌の殺菌のための成分として使用され得る。したがって、一実施形態において、本発明の角質汚れ洗浄剤は、グラム陽性菌への殺菌性を有する。

該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する酵素組成物を含む組成物の例としては、洗剤組成物が挙げられ、好ましくは洗濯用洗剤組成物が挙げられる。該洗剤組成物は、粉末等の固形組成物であっても液体組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物である。より好ましくは、該洗剤組成物は、洗濯用液体洗剤組成物である。

本発明の洗剤組成物におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの含有量は、該プロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．００１〜８００００ｍｇが好ましく、０．０１〜１００００ｍｇがより好ましく、０．１〜３０００ｍｇがさらに好ましい。

本発明の洗剤組成物は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の洗剤組成物における当該界面活性剤の含有量は、好ましくは１０〜８０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。

非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８〜Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ₂＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ₂−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ₂＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ₁−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；
Ｒ^1c−Ｏ−（Ａ’Ｏ）ｍ−Ｈ（Ｒ^1cは炭素数８以上１８以下の脂肪族炭化水素基であり、Ａ’Ｏは、炭素数２のアルキレンオキシ基及び炭素数３のアルキレンオキシ基から選ばれるアルキレンオキシ基、ｍは、Ａ’Ｏの平均付加モル数であり、３以上５０以下の数）〔特開２０１７−０７１６６４号公報〕；ならびに、
脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。

陰イオン界面活性剤としては、例えばカルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。

陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。

両性イオン活性剤としては、例えばアルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。

本発明の洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物に通常使用される成分、例えば、キレート剤、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。

キレート剤としては、例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸及びこれらの塩、ならびにアミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、及びこれらのアルカリ金属又は低級アミン塩、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物におけるキレート剤の例としては、上記に挙げたとおりである。本発明の洗剤組成物における当該キレート剤の含有量は、好ましくは０．１〜５質量％、より好ましくは０．１〜４質量％である。

水溶性ポリマーとしては、例えば、（i）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（i）又は（ii）のいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報、特開平１０−０６０４９６号公報）；アルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該水溶性ポリマーの含有量は、好ましくは０．２〜１０質量％、より好ましくは０．４〜５質量％である。

水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは１〜３５質量％である。

アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、好ましくは０〜２０質量％、より好ましくは０〜１０質量％である。

有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの塩等の多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類、などが挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、好ましくは０〜５質量％、より好ましくは０〜３質量％である。

再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。

色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。

漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤を、当該洗剤組成物中１〜１０質量％含有させることが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を、当該洗剤組成物中０．０１〜１０質量％含有させることができる。

蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該蛍光剤の含有量は０．００１〜２質量が好ましい。

Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素、ならびにそれらの２種以上の混合物が挙げられる。このうち、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼ、又はそれらの２種以上の組み合わせが好ましい。

アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ等が挙げられる。他のプロテアーゼとしては、従来から洗剤用として用いられているプロテアーゼが挙げられる（例えば、特開２０１２-４５０００号公報に記載のもの）。当該他のプロテアーゼとしては、洗浄時のｐＨ付近に至適ｐＨのあるプロテアーゼが好ましい。例えば本発明の組成物がアルカリ性の洗剤の場合、当該他のプロテアーゼとしては、中性よりもアルカリ側に至適ｐＨが存在するプロテアーゼ（すなわちアルカリプロテアーゼ）が好ましい。アルカリプロテアーゼの例としては、Bacillus sp.に由来するズブチリシンプロテアーゼが好ましく、中でも、Bacillus halodurans、Bacillus clausiiなどに由来するズブチリシンプロテアーゼ、市販のアルカリプロテアーゼなどを挙げることができる。市販のアルカリプロテアーゼとしては、ノボザイムズジャパン社から入手できるアルカラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、エスペラーゼ、カンナーゼ、オボザイム、及びジェネンコア・インターナショナル社から入手できるプラフェクト、プロペラーゼなどが挙げられる。また、特開２０１３−２３３１４１号公報に記載されたプロテアーゼ（ＫＳＭ−ＫＰ４３；配列番号２６）、又は特許第４３４８０４７号公報に記載のプロテアーゼ（Ｋ−１６；配列番号２７）も好適に使用できる。

当該アルカリプロテアーゼの好ましい例としては、ＫＳＭ−ＫＰ４３（配列番号２６）及びＫ−１６（配列番号２７）が挙げられる。さらに、ＫＳＭ−ＫＰ４３の変異体であるアルカリプロテアーゼ、配列番号２６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、Ｋ−１６の変異体であるアルカリプロテアーゼ、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼもまた、本発明で用いられる好ましいアルカリプロテアーゼの例として挙げられる。本発明の組成物においては、これらのアルカリプロテアーゼのいずれか１種又は２種以上の組み合わせを使用することができる。

本発明の組成物において、当該アルカリプロテアーゼに対するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの質量比は、好ましくは１／２０以上、より好ましくは１／３〜２０、さらに好ましくは１〜５、よりさらに好ましくは２〜３である。

酵素安定化剤としては、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ヒドロキシ化合物、蟻酸などが挙げられ、酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられ、可溶化剤としては、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などが挙げられる。さらに、本発明の洗剤組成物は、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤などを含有していてもよい。

あるいは、既存の洗剤組成物にＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼを配合することによって、本発明の洗剤組成物を製造することができる。Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを配合することができる洗剤組成物の好ましい例としては、特開２０１０−２６５３３３号公報、特開２０１４−１４１６６２号公報、特開２００９−１９１１２８号公報、特開２０１２−２２４６５２号公報、特表２０１３−５０３９５０号公報、特表平１１−５１２７６８号公報の実施例に記載の液体洗剤組成物が挙げられる。例えば、特開２０１４−１４１６６２号公報の実施例４に記載される液体洗剤組成物〔界面活性剤を３０％（陰イオン界面活性剤を２０％、非イオン界面活性剤１０％）、クエン酸３％、水酸基を有する有機溶剤（ジエチレングリコールモノブチルエーテル）を１８％、組成物のｐＨを８．０にするのに必要なアルカリ剤（モノエタノールアミン）、イオン交換水、及び香料等を配合した組成物〕にＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼを配合することにより、本発明の洗剤組成物を調製することができる。

本発明の洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣類、又は布製品（シーツ、毛布、枕カバー、ソファーカバー、タオル等）の洗浄用のものである。より好ましくは、本発明の洗剤組成物は、衣料用の洗濯洗剤組成物である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、襟や袖口を有するか、又は首回りに接する衣類（例えば、シャツ、ワイシャツ、セーター、ジャケット、コート、スカーフ、マフラーなど）の洗浄に使用される。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、角質汚れ洗浄用の洗濯洗剤組成物、好ましくは襟袖汚れ洗浄用の洗濯洗剤組成物である。

さらなる一態様において、本発明は、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを用いた角質汚れの洗浄方法を提供する。当該方法においては、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとして、それを含有する酵素組成物を用いてもよい。一実施形態において、当該本発明の方法は、上述した本発明の角質汚れ洗浄剤を用いる角質汚れの洗浄方法であり得る。好ましくは、当該本発明による角質汚れの洗浄方法は、角質汚れの除去を必要とする被洗浄物と、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ（又は本発明の角質汚れ洗浄剤）とを接触させることを含む。好ましくは、当該本発明の方法において、当該角質汚れは襟袖汚れである。

本発明の方法において、角質汚れの除去を必要とする被洗浄物（例えば角質汚れを有する衣類又は布製品）とＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又は本発明の角質汚れ洗浄剤とを接触させるには、該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ、本発明の角質汚れ洗浄剤、又はこれらを含有する洗剤組成物を溶かした水に、該被洗浄物を漬け置きしてもよく、また該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ、本発明の角質汚れ洗浄剤、又はこれらを含有する洗剤組成物を、該被洗浄物の角質汚れの部位に直接塗布してもよい。本発明の方法においては、該漬け置き又は洗剤組成物の塗布後の被洗浄物をさらに手洗い、洗濯機などで洗ってもよいが、必ずしもその必要はない。

本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とする、角質汚れ洗浄剤。
〔２〕好ましくは、前記角質汚れが襟袖汚れである、〔１〕記載の洗浄剤。
〔３〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を有効成分とする、〔１〕又は〔２〕記載の洗浄剤。
〔４〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の洗浄剤。
〔５〕好ましくは、前記β−リティックメタロプロテアーゼが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔４〕記載の洗浄剤。
〔６〕好ましくは、前記ＬａｓＡタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔４〕又は〔５〕記載の洗浄剤。
〔７〕好ましくは、前記アエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼが、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔４〕〜〔６〕のいずれか１項記載の洗浄剤。
〔８〕好ましくは、前記酵素組成物がアクロモペプチダーゼである、〔３〕記載の洗浄剤。
〔９〕好ましくは、前記酵素組成物がさらに、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、〔３〕〜〔８〕のいずれか１項記載の洗浄剤。
〔１０〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼがアルカリプロテアーゼである、〔９〕記載の洗浄剤。
〔１１〕前記アルカリプロテアーゼが、
好ましくはバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１０〕記載の洗浄剤。
〔１２〕前記アルカリプロテアーゼに対する前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの質量比が、好ましくは１／２０以上、より好ましくは１／３〜２０、さらに好ましくは１〜５、よりさらに好ましくは２〜３である、〔１０〕又は〔１１〕記載の洗浄剤。
〔１３〕好ましくは漬け置き洗浄用の洗浄剤である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載の洗浄剤。
〔１４〕好ましくはグラム陽性菌への殺菌性を有する、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の洗浄剤。

〔１５〕〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の洗浄剤を用いた、角質汚れ洗浄方法。
〔１６〕好ましくは襟袖汚れ洗浄方法である、〔１５〕記載の洗浄方法。
〔１７〕好ましくは、前記洗浄剤に被洗浄物を漬け置きすることを含む、〔１５〕又は〔１６〕記載の洗浄方法。
〔１８〕好ましくは、角質汚れ洗浄及びグラム陽性菌殺菌のための方法である、〔１５〕〜〔１７〕のいずれか１項記載の方法。

〔１９〕角質汚れ洗浄剤の製造のためのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する組成物の使用。
〔２０〕角質汚れ洗浄のための、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ又はそれを含有する組成物の使用。
〔２１〕好ましくは前記角質汚れが襟袖汚れである、〔１９〕又は〔２０〕記載の使用。
〔２２〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１９〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の使用。
〔２３〕好ましくは、前記β−リティックメタロプロテアーゼが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔２２〕記載の使用。
〔２４〕好ましくは、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２２、Ｄ３６、Ｈ１２１及びＨ１２３に相当するアミノ酸残基を有する、〔２３〕記載の使用。
〔２５〕好ましくは、前記ＬａｓＡタンパク質が、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔２２〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の使用。
〔２６〕好ましくは、前記配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＨ２３、Ｄ３６、Ｈ１２０及びＨ１２２に相当するアミノ酸残基を有する、〔２５〕記載の使用。
〔２７〕好ましくは、前記アエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼが、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である、〔２２〕〜〔２６〕のいずれか１項記載の使用。
〔２８〕好ましくは、前記配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン−グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＨ２１、Ｄ３４、Ｈ１１８及びＨ１２０に相当するアミノ酸残基を有する、〔２７〕記載の使用。
〔２９〕好ましくは、前記組成物がアクロモペプチダーゼである、〔１９〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の使用。
〔３０〕好ましくは、前記組成物がさらに、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、〔１９〕〜〔２９〕のいずれか１項記載の使用。
〔３１〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼがアルカリプロテアーゼである、〔３０〕記載の使用。
〔３２〕前記アルカリプロテアーゼが、
好ましくはバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔３１〕記載の使用。
〔３３〕前記アルカリプロテアーゼに対する前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの質量比が、好ましくは１／２０以上、より好ましくは１／３〜２０、さらに好ましくは１〜５、よりさらに好ましくは２〜３である、〔３１〕又は〔３２〕記載の使用。
〔３４〕好ましくは、前記角質汚れ洗浄剤が漬け置き洗浄用の洗浄剤である、〔１９〕、〔２１〕〜〔３３〕のいずれか１項記載の使用。
〔３５〕好ましくは、前記角質汚れ洗浄剤がグラム陽性菌への殺菌性を有する、〔１９〕、〔２１〕〜〔３４〕のいずれか１項記載の使用。
〔３６〕好ましくは、漬け置き洗浄による角質汚れ洗浄のための使用である、〔２０〕〜〔３３〕のいずれか１項記載の使用。
〔３７〕好ましくは、角質汚れ洗浄及びグラム陽性菌殺菌のための使用である、〔２０〕〜〔３３〕、〔３６〕のいずれか１項記載の使用。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

本実施例で使用したプライマーの一覧を表１に示す

参考例１プロテアーゼの調製
（１）ＢＬＰを含む培養上清の調製
（１−１）発現ベクターの作製
ＢＬＰ遺伝子（配列番号１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ／ＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ（配列番号９及び１０）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−ｓｉｇ−Ｒ（配列番号１１及び１２）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。

Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いてＥＣＯＳ^TMＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ α（ニッポンジーン、３１０−０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈＰｕｒｅＰｌａｓｍｉｄＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ／ｐＨＹ）を抽出した。抽出したＢＬＰ／ｐＨＹを鋳型としてプライマーペアΔＳ２３７Ｎ＿ｆｗ／ΔＳ２３７Ｎ＿ｒｖ（配列番号１３及び１４）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８ＰｒｅｍｉｕｍＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してＨｉｇｈＰｕｒｅＰｌａｓｍｉｄＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミド（ＢＬＰ２／ｐＨＹ）を抽出した。

（１−２）酵素産生形質転換株の作製
１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株（ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭａｒｂｕｒｇＮｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１ｍＬの新たなＬＢ培地にこの培養液を１０μＬ植菌して３７℃、２００ｒｐｍで３時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＭｅｄｉｕｍ３（Ｄｉｆｃｏ）］を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液１３μＬ、（１−１）で得たプラスミドＢＬＰ２／ｐＨＹ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．５、３４．２ｎｇ／μＬ）２μＬ、ＳＭＭＰ２０μＬを混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。この液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％］に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。

（１−３）形質転換株培養による酵素製造
ＬＢ培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに（１−２）で得た枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。翌日この培養液４００μＬを２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン、６ｐｐｍ硫酸亜鉛七水和物；％は（ｗ／ｖ）％）２０ｍＬに植菌し、３２℃、２３０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。

（２）ＬａｓＡを含む培養上清の調製
ＬａｓＡ遺伝子（配列番号３）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿ＣＲ（配列番号１５及び１６）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＬａｓＡ／ｐＨＹ）溶液を用いて、上記（１−２）と同様の手順で枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミドＬａｓＡ／ｐＨＹを鋳型として、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｒ（配列番号１９及び２０）、ならびにＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して、ＰＣＲ反応、ＤｐｎＩによるプラスミドの消化、及びライゲーションを行い、プラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を得た。

得られたプラスミド（ＬａｓＡ２／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌ｐｒｓＡ遺伝子発現強化株（特開２００７−４９９８６号公報の実施例１において作製されたｐｒｓＡ−Ｋｃ株）を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（３）ＡｈＰを含む培養上清の調製
ＡｈＰ遺伝子（配列番号５）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡｈＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡｈＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペア２Ｆ／２Ｒ＿ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃｈｉｓ（配列番号２１及び２２）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ−Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ−Ｒ（配列番号１１及び２３）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＡｈＰ／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌１６８株を使用した。次いで、得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（４）ＡＬＥ−１を含む培養上清の調製
Ｍ２３ＢサブファミリープロテアーゼであるALE-1 glycylglycine endopeptidase（ＡＬＥ−１）（MEROPS ID：M23.012；配列番号８）を調製した。ＡＬＥ１遺伝子（配列番号７）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡＬＥ１／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−Ｆ／ｐＨＹ−ｌｉｋｅ６−ｊｕｓｔ−ＣＨｉｓＲ（配列番号２４及び２５）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘＰｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲ反応を行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。続いてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を行うことでプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）溶液を得た。

得られたプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で枯草菌１６８株の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。２×Ｌ液体培地に終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地５ｍＬに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドＡＬＥ１／ｐＨＹを抽出した。抽出したプラスミド（ＡＬＥ１／ｐＨＹ）を使用して、上記（１−２）と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌Ｄｐｒ９株（特開２００６−１７４７０７号公報の実施例１〜５において作製されたＫａｏ９株）を使用した。得られた形質転換株を（１−３）と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。

（５）培養上清からのプロテアーゼの調製
（１）〜（４）で得た培養上清から目的のプロテアーゼを調製した。培養上清をアミコンウルトラ分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いてＢｕｆｆｅｒＡでバッファー交換した。バッファー交換後の液から、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０Ｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて酵素を調製した。まず該バッファー交換で得られた液をカラム１に通し、次いでＢｕｆｆｅｒＢを使用してカラム１の吸着成分を溶出させた。溶出分画のうちＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ（参考例２）の分解活性が認められる分画液を回収した。続いて、回収した分画液を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣｌの溶液で平衡化したカラム２を用いてＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにかけ、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの分解活性が認められる分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ分画分子量１０Ｋを用いて２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液でバッファー交換し、目的のプロテアーゼを含む酵素溶液を得た。各培養上清に使用したＢｕｆｆｅｒＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ、カラム１、及びカラム２は、表２のとおりとした。

参考例２酵素活性の測定
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質[以下ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ]（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｎｐ）とは２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴のアッセイプレート（ＡＧＣテクノグラス、３８８１−０９６）に参考例１（５）で得た酵素溶液（酵素、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１９０μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５液、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの代わりにジメチルスルホキシドで溶かしたＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１（ペプチド研究所、３７２０−ｖ）を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１分間あたりに、１ｎｍｏｌのＦＲＥＴＳ−２５−ＳＴＤ１による蛍光強度に相当する蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。

参考例３酵素溶液の濃度測定
酵素溶液の濃度測定にはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはＢＳＡＳｔａｎｄａｒｄＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＷＡＫＯ）を用いた。

実施例１黄色ブドウ球菌に対する酵素殺菌力の評価
（酵素）
酵素には、アルカリプロテアーゼとしてＫＰ４３プロテアーゼ変異体（以下、ＫＰ４３プロテアーゼ変異体、又はＫＰ４３ともいう）、及びサビナーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ３１１１）を、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとして参考例１で調製したＢＬＰ、ＬａｓＡ、及びＡｈＰを、ならびにＭ２３Ｂサブファミリープロテアーゼとして参考例１で調整したＡＬＥ−１、及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、＃１２０−０４３１３）を使用した。ＫＰ４３プロテアーゼ変異体は、特開２０１３−２３３１４１号公報に配列番号２５０として記載されるアルカリプロテアーゼを、該公報に記載の製造方法を参考に調製して使用した。

（殺菌力評価）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ６５３８）を１ｍＬのＳＣＤ液体培地（日本製薬、３９３−００１８５）に植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。菌体を回収し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でＷａｓｈした後、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でＯＤ６００＝０．５（１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）に調製した。試験液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋１μｇ／ｍＬ各酵素）４９５μＬに対して菌液を５μＬ添加し、３０℃で３０分間静置した。静置後の液をＬＰ希釈液（日本製薬、３９７−００２８１）で段階希釈し、ＳＣＤ寒天培地（日本製薬、３９６−００１７５）に１００μＬ塗布した。３７℃で一晩培養した後のコロニー数を数えた。生菌数は以下の式から算出した。
生菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）＝希釈倍数＊コロニー数＊１０

殺菌力の評価の結果を図１に示す。ＫＰ４３プロテアーゼ変異体、サビナーゼでは黄色ブドウ球菌に対する殺菌性は認められなかった。一方、ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎでは黄色ブドウ球菌に対する殺菌性が認められた。

実施例２角質汚れに対する酵素洗浄力の評価
（襟袖汚れの作製）
ワイシャツの襟の領域に布（組成：ポリエステル６５％、綿３５％）を縫い合わせたものを準備した。このシャツを成人男性に３日間にわたって日中に着用させた。その後、襟に縫い合わせた布を回収し、１辺が６ｍｍの正方形となるように裁断して、襟袖汚れを有するサンプル布として用いた。

（洗浄力評価）
洗浄液の組成：酵素、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、硬度１０°ＤＨ（カルシウム／マグネシウム＝４／１（モル比））、０．１（ｗ／ｖ）％ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（エマール（登録商標）２０Ｃ、花王（株）製、有効分換算）。酵素としては、実施例１で黄色ブドウ球菌への殺菌性が確認された酵素であるＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＡＬＥ−１、及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ、１２０−０４３１３）を使用した。各酵素は最終濃度が１５０Ｕ／Ｌになるように添加した。対照として、同じ組成で酵素無添加の洗浄液を用いた。

スキャナーＧＴ−Ｘ９７０（ＥＰＳＯＮ）を用いてサンプル布の画像を取り込んだ。その後、該サンプル布を５００μＬの洗浄液に浸漬して３０℃で５時間静置した。静置後のサンプル布を硬度１０°ＤＨ水ですすいだ後に乾燥させ、再度スキャナーＧＴ−Ｘ９７０を用いて画像を取り込んだ。取り込んだ画像から、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて、洗浄前後のサンプル布のＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅを測定した。汚れが付着する前の原布の画像を同様に取得し、ＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅを測定した。得られたＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅを以下の式に代入することで洗浄率を算出した。
洗浄率（％）＝（Ｇ２−Ｇ１）／（Ｇ０−Ｇ１）＊１００
Ｇ０：サンプル布の原布のＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅ
Ｇ１：洗浄前のサンプル布のＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅ
Ｇ２：洗浄後のサンプル布のＭｅａｎＧｒａｙＶａｌｕｅ

洗浄率の測定結果を図２に示す。Ｍ２３ＡサブファミリープロテアーゼであるＢＬＰ、ＬａｓＡ、及びＡｈＰは、襟袖汚れに対する洗浄力を有していた。一方でＭ２３ＢサブファミリープロテアーゼであるＡＬＥ−１及びＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎでは、襟袖汚れに対する洗浄力は検出されなかった。

実施例３ＢＬＰとアルカリプロテアーゼとの併用による洗浄力の増強
ＢＬＰとアルカリプロテアーゼとの併用での襟袖汚れ洗浄力を調べた。
（ＢＬＰの調製）
下記方法にて、アクロモペプチダーゼ由来β−ｌｙｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａ−ＢＬＰ）を調製した。アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業、０１４−０９６６１）を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、これを同じ緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムＴＯＹＯＰＥＡＲＬＧｉｇａＣａｐＣＭ−６５０Ｍ（東ソー）に流し、濃度０から５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。溶出液のうちＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの分解活性が見られる分画液を回収した。得られた分画液を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、及び２００ｍＭＮａＣｌで平衡化したカラムＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬ（東ソー）を用いたＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにかけ、ＦＲＥＴ−ＧＧＧＧＧの分解活性が見られる分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ分画分子量１０Ｋを用いて２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液でバッファー交換してＡ−ＢＬＰ溶液を調製した。

終濃度が２５ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２×ＬａｅｍｍｌｉＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７３７）と混合し、等量の上記のＡ−ＢＬＰ溶液とを混合した。得られた混合液を、１００℃で５分間加熱し、次いでＡｎｙｋＤ^TMミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸ^TMプレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。マーカーにはプレシジョンＰｌｕｓプロテイン^TM２色スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０３７４）を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、トランスブロットＴｕｒｂｏ^TMシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏ^TMミニＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７０−４１５６）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。Ｂｉｏ−ＳａｆｅＣＢＢＧ−２５０ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６１−０７８６）で膜を染色し、５０％メタノール液で脱色して得られるバンドの領域を切り出した。切り出したメンブレンのＮ末端アミノ酸配列の解析を、株式会社リバネスのＮ末端アミノ酸配列解析サービスへ依頼した。解析の結果、Ｎ末端アミノ酸配列はＳＰＮＧＬＬＱＦＰＦであることが判明した。この配列は、ｂｅｔａ−ｌｙｔｉｃｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ［ＵｎｉＰｒｏｔＫｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ＿Ｐ００８０１］に公開されているＢＬＰのｍａｔｕｒｅ領域と一致した。

（アルカリプロテアーゼ）
アルカリプロテアーゼとしては、特開２０１３−２３３１４１号公報に配列番号２５０として記載されるアルカリプロテアーゼ（ＫＰ４３プロテアーゼ変異体、又はＫＰ４３）を、該公報に記載の製造方法を参考に調製し、使用した。

（洗浄力評価）
洗浄液の組成：酵素１μｇ／ｍＬ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、硬度１０°ＤＨ（カルシウム／マグネシウム＝４／１（モル比））、０．１（ｗ／ｖ）％ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（エマール（登録商標）２０Ｃ、花王（株）製、有効分換算）。酵素としては、上記Ａ−ＢＬＰ、ＫＰ４３プロテアーゼ変異体、又はそれらの混合物を用いた（ＫＰ４３：Ａ−ＢＬＰ（質量比）＝１０：０、７．５：２．５、２．５：７．５、０：１０）。酵素を併用する場合には酵素濃度の合計が１μｇ／ｍＬとなるように調整した。

実施例２と同様の手順で、洗浄液による襟袖汚れの洗浄率を測定した。結果を図３に示す。アルカリプロテアーゼ又はＢＬＰ単独よりも、アルカリプロテアーゼとＢＬＰを併用した場合により高い襟袖汚れ洗浄力が得られた。さらにアルカリプロテアーゼに対するＢＬＰの混合比が１／３（ＫＰ４３：Ａ−ＢＬＰ＝７．５：２．５）から３（ＫＰ４３：Ａ−ＢＬＰ＝２．５：７．５）まで上昇するに従って、洗浄力はより向上した。

以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

Claims

Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを有効成分とする、角質汚れ洗浄剤。
前記角質汚れが襟袖汚れである、請求項１記載の洗浄剤。
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを含有する酵素組成物を有効成分とする、請求項１又は２記載の洗浄剤。
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼがβ−リティックメタロプロテアーゼ、ＬａｓＡタンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の洗浄剤。
前記酵素組成物がアクロモペプチダーゼである、請求項３記載の洗浄剤。
前記酵素組成物がさらに、前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項３〜５のいずれか１項記載の洗浄剤。
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外のプロテアーゼがアルカリプロテアーゼである、請求項６記載の洗浄剤。
前記アルカリプロテアーゼがバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼである、請求項７記載の洗浄剤。
前記アルカリプロテアーゼが配列番号２６で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、及び配列番号２７で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８記載の洗浄剤。
前記アルカリプロテアーゼに対する前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの質量比が１／２０以上である、請求項７〜９のいずれか１項記載の洗浄剤。
漬け置き洗浄用の洗浄剤である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の洗浄剤。
請求項１〜１１のいずれか１項記載の洗浄剤を用いた、角質汚れ洗浄方法。
襟袖汚れ洗浄方法である、請求項１２記載の洗浄方法。
前記洗浄剤に被洗浄物を漬け置きすることを含む、請求項１２又は１３記載の洗浄方法。