CN103348006B - 储存稳定的含有蛋白酶和淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，在包含蛋白酶和淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂中待改善淀粉分解活性方面的储存稳定性。这是通过使用这样的蛋白酶实现的，所述蛋白酶包含与SEQ ID NO.1所述氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，且在根据SEQ ID No.1计数的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)、或氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。
Description
本发明属于液体洗涤剂和清洁剂的领域。本发明尤其涉及液体的，含有酶的洗涤剂(washing agent)和清洁剂(cleaning agent)，其包含定义的蛋白酶与淀粉酶的组合，此外，本发明还提供使用这类物质(agent)的方法。本发明还涉及定义的蛋白酶在包含淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂中的用途。
枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶是优选用于洗涤剂和清洁剂中的。现有技术中已知掺入到洗涤剂或清洁剂中的蛋白酶或者初始起源于微生物，例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)或假单胞菌属(Pseudomonas)，和/或是使用合适的微生物，根据已知的生物技术方法生产的，例如通过芽孢杆菌属或丝状真菌的转基因表达宿主。
现代的液体洗涤剂尤其日益增加的包括添加的酶，其中尤其是淀粉酶。淀粉酶是催化(尤其是在多糖例如淀粉中)糖苷键水解的酶。在淀粉酶中，水解直链淀粉的α(1-4)-糖苷键的α-淀粉酶经常被掺入到洗涤剂和清洁剂中。在酶的EC分类(酶的数字分类系统)中，α-淀粉酶具有EC号(“酶学委员会编号”)3.2.1.1，因此属于6大类酶中的第3类——水解酶(E.C.3.-.-.-)下的糖基化酶(E.C.3.2.-.-)下的糖苷酶(E.C.3.2.1.-)，即，水解O-和/或S-糖基化合物的酶。通过α-淀粉酶降解淀粉提供了糊精以及之后麦芽糖、葡萄糖和支链寡糖。因此，淀粉酶特别有效地针对洗涤中含淀粉的残余物，并催化其水解。
在国际专利申请WO95/23221中，公开了来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM5483的枯草杆菌蛋白酶型蛋白酶或蛋白酶变体，其适用于洗涤剂或清洁剂。在这些蛋白酶中，一种可以具有氨基酸改变R99E、A、S或G。还公开了洗涤剂可以包括其他的酶，其中也有淀粉酶。洗涤剂可以是固体或液体。然而，该文献没有直接或明确的公开包含淀粉酶与蛋白酶的组合的液体洗涤剂，所述蛋白酶在第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)或氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。对于欧洲专利申请EP1921147也是同样的情况。
现有技术中含蛋白酶-和含淀粉酶-的液体洗涤剂和清洁剂的缺点是不能够足够稳定的储存，因此即使在短时间后，也会丢失相当量的淀粉分解和/或蛋白水解活性，尤其是淀粉分解活性。蛋白酶的存在通常导致淀粉分解活性的丢失，因为蛋白酶失活淀粉酶。之后，洗涤剂或清洁剂不能表现出最佳的清洁能力。
本发明基于克服上述缺点，并提供含蛋白酶-和含淀粉酶-的液体洗涤剂或清洁剂的目的，所述液体洗涤剂或清洁剂可以足够或更好的稳定储存，特别是相对于其淀粉分解活性而言。
因此，本发明的主题是液体洗涤剂或清洁剂，含有
(a1)含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，且在根据SEQ ID NO：1计数的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)的蛋白酶，或
(a2)含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，且在根据SEQ ID NO：1计数的第99位具有氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)的蛋白酶，或
(a3)含有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，且在根据SEQ ID NO：1计数的第99位具有氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)的蛋白酶，和
(b)淀粉酶。
令人惊讶的发现，包含上述蛋白酶和淀粉酶组合的液体洗涤剂或清洁剂是有利的能够稳定储存的。特别是在储存之后，相比仅在相应物质中存在的蛋白酶与本发明物质有区别的洗涤剂或清洁剂，本发明的洗涤剂或清洁剂表现出更高的淀粉分解活性，其中，在开始储存时，相对于活性酶，比较时在所述物质中蛋白酶以相同浓度存在。因此，本发明上下文中提供的蛋白酶导致降低的淀粉酶失活。但是，本发明上下文中提供的蛋白酶对淀粉酶降低的失活作用不是由于不够的蛋白酶活性。
在这一方面，对于蛋白酶敏感型污渍，根据本发明的物质具有并优选的仍然具有良好的(尤其是有利的)清洁能力。尤其在低温时，例如10℃至50℃，优选10℃至40℃，或20℃至40℃，该类型对于至少一种蛋白酶敏感型污渍的清洁能力也存在。因此，这类物质能够充分或改良的去除织物和/或硬表面(例如盘碟)上的至少一种，优选多种蛋白酶敏感型污渍。
关于在导言中提及的国际专利申请WO95/23221，本发明因此涉及特别有利的选择，所述选择提供了高生产且稳定储存的液体洗涤剂，特别是关于所述物质的蛋白水解和/或淀粉分解活性，或所述物质在储存后的剩余活性。
在本发明的上下文中，清洁能力理解为意指使一种或多种污渍变淡的能力，尤其是洗涤污渍。这类污垢的例子是棉上的血-乳/墨水、棉上的全卵/色素、棉上的巧克力-乳/墨水、聚酯/棉上的花生油-色素/墨水、棉上的草或棉上的可可，尤其是下文列举的类型。在本发明的上下文中，不仅含有蛋白酶和淀粉酶的洗涤剂或清洁剂、或由该物质形成的洗涤液或清洁液，而且蛋白酶或淀粉酶本身，都具有特定的清洁能力。因此，酶的清洁能力有助于所述物质和由所述物质形成的洗涤液或清洁液的清洁能力。优选如下所示确定清洁能力。
“洗涤液或清洁液”理解为意指这样的溶液，所述溶液包含作用于纺织品或织物(洗涤液)或硬表面(清洁液)上的洗涤剂或清洁剂，从而与存在于纺织品和/或织物或硬表面上的污垢接触。洗涤液或清洁液通常形成于开始洗涤或清洁过程以及用水溶解或稀释洗涤剂或清洁剂时，例如在洗衣机或另一合适的容器中。
在本发明的上下文中，如果在储存后，根据本发明的洗涤剂或清洁剂表现出比对照组合物更高的淀粉酶活性，则存在储存稳定性，所述对照组合物仅在包含于对照组合物中的蛋白酶上不同于根据本发明的洗涤剂或清洁剂。因此，在储存后，根据本发明的洗涤剂或清洁剂表现出比对照更高的剩余淀粉酶活性。因此，在开始储存时，待比较的两种物质表现出相同的淀粉酶量或浓度和/或初始淀粉分解活性。此外，在开始储存时，基于活性酶，两种物质具有相同的蛋白酶浓度，并且两种物质都以相同的方式处理，特别是储存条件和酶活性测定。储存按递增的优先度发生至少24小时、48小时、72小时、5天、1周、2周、3周、4周或8周。此外，储存优选发生在20℃、25℃或30℃，特别优选30℃的温度下。
在这一方面，可以使用与特定酶类型匹配的标准方法，确定酶活性。用于确定酶活性的方法是酶技术领域的技术人员普遍已知的并常规使用的。例如，用于测量蛋白酶活性的方法公开在Tenside，第7卷(1970)，第125-132页。还可以根据从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯酰胺(suc-AAPF-pNA)释放的生色团对硝基苯胺(pNA)，确定蛋白水解活性。蛋白酶切割底物并释放pNA。释放的pNA导致410nm的消光增加；消光的改变作为时间的函数是酶活性的测量(参见Del Mar等人，1979)。测量在温度25℃、pH6和410nm波长下进行。测量时间是5分钟，测量间隔是20s至60s。蛋白酶活性优选按PU(蛋白酶单位)给出。
使用标准方法测量淀粉酶活性。优选如下确定淀粉酶活性。淀粉酶将淀粉转化为葡萄糖。用0.67％淀粉(可溶，根据Zulowsky预处理(用甘油在190℃处理))孵育测试下的样品，在定义的反应条件下(tris-马来酸盐缓冲液，pH6.5，50℃，15min)。通过添加二硝基水杨酸和在碱性条件下加热至100℃，用葡萄糖将酸还原并且另外将糖还原以提供橙-红染料，其在反应结束时在540nm被光度法测量。与显色相对应的释放的糖量是酶活性的量度(参见Sumner等人，J.Biol.Chem.，1921，47&1924，62)。
在本发明的上下文中，使用在30℃的温度下储存了8周的含蛋白酶-和含淀粉酶-的液体洗涤剂或清洁剂，如上所述特别优选确定酶稳定性的存在，其中根据从底物suc-AAPF-pNA释放的对硝基苯胺生色团(pNA)确定蛋白水解活性，并且如上所述确定淀粉分解活性。
包含在根据本发明的洗涤剂或清洁剂中的蛋白酶含有与SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，并在根据SEQ ID NO：1计数的第99位上具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)或氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。按递增的优先度，氨基酸序列与SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一，相当特别优选是99％同一。SEQ ID NO：1是迟缓芽孢杆菌DSM5483的成熟碱性蛋白酶的序列，公开在国际专利申请WO92/21760中，本文中明确的涉及其公开内容。
本发明证实：通过向包含淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂添加这类蛋白酶，获得了特别稳定储存的液体洗涤剂，尤其是对于储存后的剩余淀粉分解活性，尤其是按递增的优先度储存至少24小时、48小时、72小时、5天、1周、2周、3周、4周或8周的时期之后。
包含在根据本发明的洗涤剂或清洁剂中的蛋白酶表现出蛋白水解活性，即，能够水解多肽或蛋白质的肽键。因此其是催化肽键水解，并且因此能够切割肽或蛋白质的酶。特别地，其是枯草杆菌酶(subtilase)，特别优选的是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)。
淀粉酶是导言中描述的酶。可以使用淀粉酶的同义术语，例如1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶或糖原酶。本发明的可适用(conditionable)淀粉酶优选是α-淀粉酶。在本发明的上下文中，酶是否是α-淀粉酶的决定性因子是其水解直链淀粉中的α(1-4)-糖苷键的能力。
根据本发明可适用的实例是来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或来自嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶，以及特别是它们用于洗涤剂或清洁剂的改善的其它改进体(development)。来自地衣芽孢杆菌的酶可以从Novozymes公司在商标名和从Danisco/Genencor公司在名称下获得。该α-淀粉酶的其它改进产品可以从Novozyme公司在商标名和下获得，以及从Danisco/Genencor公司在名称下获得，以及从Daiwa SeikoInc.，Tokyo，Japan作为获得。来自解淀粉芽胞杆菌的α-淀粉酶是通过Novozymes公司在名称下商品化，并且来自嗜热脂肪芽胞杆菌的α-淀粉酶的衍生变体在商标名和下，也来自Novozymes公司。此外，为该目的，尝试来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp)A7-7(DSM12368)的α-淀粉酶和来自Bacillusagaradherens(DSM9948)的环糊精葡聚糖基转移酶(CGTase)。也可以使用所有上述分子的融合产物。此外，来自黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(A.oryzae)的α-淀粉酶的其它改进物体(从Novozymes公司获得，商标名)是适合的。可以有利地使用的其它可商购的产品例如是和或Stainzyme或Stainzyme最后一个也来自Novozymes公司。通过点突变获得的这些酶的变体也可以被本发明掺入。特别优选的淀粉酶公开在国际申请WO00/60060、WO03/002711、WO03/054177和WO07/079938，因此明确引用上述申请的公开内容参考，或在该领域中，因此它们公开的内容明确掺入到本专利申请中。
在本发明的另一个实施方案中，洗涤剂或清洁剂中的蛋白酶还包含根据SEQ IDNO：1计数的至少一个下列氨基酸：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
(i)氨基酸(a)至(h)的多种组合。
因此，除上述第99位的所述氨基酸之一外，蛋白酶还具有一个或多个位于相应位置上的上述氨基酸。这些氨基酸可以产生其他有利特性，和/或甚至强化已经存在的特性。特别的是，上述氨基酸产生液体洗涤剂或清洁剂中或由该洗涤剂或清洁剂形成的洗涤液中的蛋白水解活性和/或蛋白酶稳定性的增加。通过向包含淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂中添加这类蛋白酶，可能获得储存特别稳定的液体洗涤剂或清洁剂，尤其是在储存后的其剩余淀粉分解活性方面，还优选的在储存后的其剩余蛋白水解活性方面，尤其是按递增的优先度，储存至少24小时、48小时、72小时、5天、1周、2周、3周、4周或8周后。这类物质还表现出对蛋白酶-敏感型和/或淀粉酶-敏感型污渍改善的清洁能力。
从而通过比对将要添加的蛋白酶的氨基酸序列与迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的氨基酸序列(如SEQ ID NO：1列出的)，定义氨基酸位置。因为迟缓芽孢杆菌的蛋白酶代表了现有技术中描述蛋白酶和氨基酸修饰的重要参照分子，因此在说明氨基酸位置时，有利的参照迟缓芽孢杆菌的蛋白酶(SEQ ID NO：1)计数。此外，计数与成熟的蛋白质相符合。即使要加入的蛋白酶的氨基酸序列含有比根据SEQ ID NO：1的迟缓芽孢杆菌蛋白酶更大数量的氨基酸残基，也应当使用该分类。
从迟缓芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸序列的所述位置起，要被本发明加入的蛋白酶的氨基酸位置是在比对中归为这些相同位置的那些位置。
除第99位之外，特别有利的位置因而是在与SEQ ID NO：1的比对中认定的第3、4、61、154、188、193、199和211位，因此是根据SEQ ID NO：1计数的。在所述位置上发现了迟缓芽孢杆菌蛋白酶的野生型分子中的下列氨基酸残基：S3、V4、G61、S154、A188、V193、V199和L211。氨基酸3T、4I、61A、154D、154E、211D、211G和211E是特别优选的，只要待被本发明加入的蛋白酶的相应位置尚未被上述优选的氨基酸之一占据。例如，取代3T和4I使分子产生稳定化效应，导致蛋白酶改善的储存稳定性和清洁能力，因而也导致包含所述蛋白酶的本发明的液体洗涤剂或清洁剂改善的清洁能力。
如果在相应位置上认识到一个或多个上述氨基酸，那么除第99位，与SEQ ID NO：1的其他序列差异跟着发生，因为SEQ ID NO：1在相应位置上具有另一个氨基酸。根据与SEQID NO：1的序列差异的数目，导致本发明要添加的蛋白酶可以与SEQ ID NO：1具有不同的最大同一性值，即使在所有其他氨基酸上与SEQ ID NO：1一致。在每种情形下，都需要考虑对于每种可能的假定氨基酸组合的这一情况，此外该情况还取决于蛋白酶的氨基酸序列长度。例如，对于长度为269个氨基酸的氨基酸序列而言，具有1、2、3、4、5、6、7、8或9处序列修饰的最大同一性是99.63％、99.26％、98.88％、98.51％、98.14％、97.77％、97.40％、97.03％或96.65％，而对于长度为275个氨基酸的氨基酸序列而言，是99.64％、99.27％、98.91％、98.55％、98.18％、97.82％、97.45％、97.09％或96.73％。
通过序列比较确定核酸或氨基酸序列的同一性。这一比较是通过相互比对核苷酸序列或氨基酸序列中的相似序列进行的。该序列比较优选是基于现有技术中确立和经常使用的BLAST算法进行的(参见例如Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，DJ.(1990)″Basic local alignment search tool.″J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul，Stephan F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，HhengZhang，Webb Miller，和David J.Lipman(1997)：″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs″；Nucleic Acids Res.，25，第3389-3402页)，原则上是通过相互比对核苷酸序列或氨基酸序列中的相似核苷酸或氨基酸序列进行。位置的列表式排列被称为比对。现有技术中可获得的另一种算法是FASTA算法。序列比对，特别是多重序列比对，通常是用计算机程序生成的。通常使用Clustal系列(参见例如Chenna等人(2003)：Multiple sequence alignment with the Clustal series ofprograms，Nucleic Acid Research31，3497-3500)、T-Coffee(参见例如Notredame等人(2000)：T-Coffee：A novel method for multiple sequencealignments.J.Mol.Biol.302，205-217)或基于上述程序或算法的程序。在本发明的上下文中，优选使用计算机程序VectorSuite10.3(Invitrogen Corporation，1600FaradayAvenue，Carlsbad，California，USA)和标准的默认参数生成序列比较和比对。
该类型的比较允许对比较序列相互之间的相似性进行说明。通常以百分比同一性表示，即，在自身或相互比对中，相应位置上的相同核苷酸或氨基酸基团的分数。广义术语氨基酸序列的“同源性”考虑了保守氨基酸改变，即，具有相似化学活性的氨基酸，因为所述氨基酸在蛋白质内行使绝大部分相似的活性或功能。因此，比较序列的相似性也可以表示为百分比同源性或百分比相似性。可以收集对于完整的多肽或基因、或仅对于单个区域的同一性和/或同源性数据。因此，通过匹配序列，定义各个核酸或氨基酸序列的同源或相同区域。它们通常具有相同或相似的功能。它们可以是小的区域，仅包括若干个核苷酸或氨基酸。通常是这样的情况，即，这些小的区域执行对于蛋白质总活性而言关键的功能。因此，获得仅对于单个区域，任选的小区域的序列匹配，是有价值的。然而，当不另外说明时，本申请中的同一性或同源性数据涉及相关的列举核酸或氨基酸序列的总长度。
在本发明主题的另一个实施方案中，洗涤剂或清洁剂中的蛋白酶含有与上述SEQID NO：1列出的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且是通过一个或多个保守氨基酸取代从根据SEQ ID NO：1的蛋白酶获得或能够获得的，其中蛋白酶的第99位仍然具有上述对于该位置指定的氨基酸之一。术语“保守氨基酸取代”意指一个氨基酸残基被改变(取代)为另一个氨基酸残基，其中该取代不导致被改变氨基酸位置上的极性或电荷变化，例如，非极性氨基酸残基取代另一个非极性氨基酸残基。在本发明的上下文中，保守氨基酸取代包括例如：G＝A＝S、I＝V＝L＝M、D＝E、N＝Q、K＝R、Y＝F、S＝T、G＝A＝I＝V＝L＝M＝Y＝F＝W＝P＝S＝T。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂或清洁剂是其中其清洁能力还至少与包括这样的蛋白酶的洗涤剂或清洁剂相当，所述蛋白酶含有与SEQ ID NO：2或SEQID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，特别优选的是SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列对应的氨基酸序列。在包含剂量在2.0至9.0克/升洗涤液的含淀粉酶-洗涤剂以及蛋白酶的洗涤系统中，确定清洁能力，其中加入了相同浓度的待比较的蛋白酶(基于活性蛋白质)，并针对一种或多种污渍棉上的血-乳/墨水、棉上的全蛋/色素、聚酯/棉上的花生油-色素/墨水和棉上的草渍，尤其是针对一种或多种下述污渍，确定清洁能力：
-棉上的血-乳/墨水：可获得自CFT(Center For Testmaterials)B.V.Vlaardingen，Netherlands的产品No.C-05
-棉上的全蛋/色素(全蛋/烟灰)：可获得自公司wfk Testgewebe GmbH；Brüggen-Bracht，Germany的产品No.10N，或可获得自CFT(Center For Testmaterials)B.V.Vlaardingen，Netherlands的产品C-S-37
-聚酯/棉上的花生油-色素/墨水：可获得自CFT(Center For Testmaterials)B.V.Vlaardingen，Netherlands的产品No.PC-10
-棉上的草渍：可获得自Material-und Prüfanstalt(EMPA)Testmaterialien AG，St.Gallen(Switzerland)的产品No.164，
这是通过测量洗涤织物上的白度，其中洗涤过程持续至少30分钟，任选60分钟，温度20℃，水的水硬度在15.5至16.5(德国硬度)之间。
洗涤系统的洗涤剂是液体洗涤剂，配制如下(所有数值都是重量百分比)：0.3-0.5％苍耳烷(xanthane)、0.2-0.4％消泡剂、6-7％甘油、0.3-0.5％乙醇、4-7％FAEOS(脂肪醇醚硫酸盐)、24-28％非离子型表面活性剂、1％硼酸、1-2％柠檬酸钠(二水合物)、2-4％苏打、14-16％椰子脂肪酸、0.5％HEDP(1-羟基乙烷-(1，1-二膦酸))、0-0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0-0.5％荧光增白剂、0-0.001％着色剂、0.0001-0.04％淀粉酶(活性蛋白质)，优选(Novozymes公司的淀粉酶制品)、其余是软化水。洗涤剂中掺入的蛋白酶浓度是0.001-0.1％，优选0.01至0.06％，基于活性蛋白质。液体洗涤剂优选的剂量在2.0至9.0之间，优选3.0至8.2，4.0至7.5之间，特别优选4.7克/升洗涤液。
优选在pH8至pH10.5，优选pH8至pH9之间的pH范围进行洗涤。在开始洗涤时，洗涤液中的蛋白酶活性和淀粉酶活性都不等于0。
用光学测量方法，优选光度法确定白度，即，作为清洁能力量度的污渍的增亮。用于其中的合适装置是例如Minolta CM508d分光计。通常用白色标准，优选用随装置的白色标准校正用于测量的装置。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂或清洁剂的储存稳定性还至少与包括蛋白酶的洗涤剂或清洁剂的储存稳定性相当，所述蛋白酶含有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，特别优选SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列对应的氨基酸序列。当在30℃储存8周后，本发明的洗涤剂或清洁剂表现出与用于比较的洗涤剂或清洁剂相等或更高的淀粉酶活性，则存在上述储存稳定性，其中本发明的物质与用于比较的洗涤剂或清洁剂仅在所含蛋白酶上有区别。
比较的材料涉及特别优选的液体洗涤剂，其具有下列组成(所有数据以重量百分比)：
掺入在洗涤剂中的蛋白酶浓度为0.001-0.1％，优选0.01至0.06％，基于活性蛋白质。
在开始储存时，所比较的两种物质都表现出相同的初始淀粉分解活性，包含相对于活性酶而言相同浓度的蛋白酶，且以相同的方式处理两种物质。基于从底物suc-AAPF-pNA释放的生色团对硝基苯胺(pNA)，确定物质的蛋白水解活性，如前所述确定其淀粉分解活性。
每种物质的蛋白酶和淀粉酶的初始活性都不等于0。
相对于活性蛋白质，添加相等活性的淀粉酶和相等浓度的蛋白酶，确保了即使在活性物质(substance)与总蛋白质比例(比活值)任何可能的偏差条件下，也比较真实的酶特性。
除非另外说明，在本发明的上下文中，参照都是针对液体洗涤剂的重量的，即，数据是基于其重量的。
多种蛋白酶，尤其是枯草杆菌蛋白酶都以所谓的前蛋白质的形式形成，即与原肽和信号肽一起，其中，信号肽的功能通常在于确保从生产蛋白酶的细胞中排除蛋白酶至周质或细胞周围的培养基中，原肽通常是蛋白酶的正确折叠所需的。信号肽和原肽一般位于前蛋白质的N-端部分。在天然条件下，通过信号肽酶将信号肽从剩余的蛋白酶上切割下来。然后，原肽支持发生蛋白酶的正确最终折叠。然后，蛋白酶处于自身的活性形式，并切割原肽本身。在切割原肽后，成熟的蛋白酶(尤其是枯草杆菌蛋白酶)在缺少原始存在的N-端氨基酸的条件下实施其催化活性。为了一般性的尤其是在本发明的上下文中的技术应用，成熟的蛋白酶，即，在其生产后加工过的酶，比前蛋白质更优选。此外，可以在生产多肽链后，在生产蛋白酶的细胞中修饰蛋白酶，例如通过连接糖分子、通过甲酰化、氨基化等。这类修饰是翻译后修饰，可以但不必然对蛋白酶功能产生影响。
此外，成熟的蛋白酶的N-端和/或C-端也可以被截短，使得根据本发明的洗涤剂或清洁剂中包含比SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8截短的蛋白酶(即，片段)。在此情况下，所有的同一性数据都涉及这样的区域，在所述区域中，所讨论的片段在比对SEQ ID NO：1中是匹配的。然而，在各种情况下，所讨论的片段都含有与SEQ ID NO：1比对中的第99位匹配的位置，并在该位置具有相应的氨基酸。
有利的，还含有一个或多个其他上述位置，并在该处具有相应的氨基酸。此外，这类片段是蛋白水解活性的。在这一方面，其他优选的片段含有这样的氨基酸序列，所述序列在长度为至少50个，或至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265、266、267或268个相连的氨基酸位置上，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8匹配，条件是对于第99位，以及还任选的对于第3和/或4和/或61和/或154和/或188和/或193和/或199和/或211位有上述氨基酸。具有这类片段的本发明的洗涤剂或清洁剂的清洁能力和/或储存稳定性，至少与包括这样的蛋白酶的洗涤剂或清洁剂相当，所述蛋白酶含有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8列出的氨基酸序列对应的氨基酸序列，所有序列均如上文所确定。
本发明的另一个主题是液体洗涤剂或清洁剂，含有
(a)选自下列的蛋白酶
a.含有根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的蛋白酶；
b.在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的至少一个位置上含有改变的氨基酸序列的蛋白酶，其中根据SEQ ID NO：1计数的改变选自：
i.第3位的苏氨酸(3T)，
ii.第4位的异亮氨酸(4I)，
iii.第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
iv.第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
v.第188位的脯氨酸(188P)，
vi.第193位的甲硫氨酸(193M)，
vii.第199位的异亮氨酸(199I)，
viii.第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
ix.氨基酸(i)至(viii)的多种组合；
(b)淀粉酶。
这些蛋白酶尤其特别优选掺入到本发明的液体洗涤剂或清洁剂中。所述蛋白酶从SEQ ID NO：1开始，是通过用氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)或氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)或氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)取代在根据SEQ ID NO：1计数的第99位上的氨基酸精氨酸而获得的。这些氨基酸序列列出在如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列录中。此外，除为第99位提供的氨基酸外，这些蛋白酶可以具有一个或多个第3、4、61、154、188、193、199和211位的上述氨基酸，与SEQ ID NO：1的比对匹配和并且因此根据SEQ ID NO：1计数。这些位置的所述氨基酸还产生其他有利的特性，和/或甚至强化了这些蛋白酶已存在的特性。特别是在液体洗涤剂或清洁剂或通过该洗涤剂或清洁剂形成的洗涤液中，它们产生蛋白酶的蛋白水解活性和/或稳定性的增加。(如果可行)所有上述实施方案都相应的应用这些特别优选的蛋白酶。
本发明的物质按递增的优先度包含基于活性蛋白质的1x10-8至5wt％、0.0001至1wt％、0.0005至0.5wt％、0.001至0.1wt％和特别优选的0.001至0.06wt％的量的蛋白酶。本发明的物质按递增的优先度包含基于活性蛋白的1x10-8至5wt％、0.00001至1wt％、0.00005至0.5wt％、0.0001至0.1wt％和特别优选的0.0001至0.05wt％的量的淀粉酶。可以使用已知的方法确定蛋白质浓度，例如BCA法(双金鸡宁酸；2，2′-联喹啉-4，4′-二羧酸)或双缩脲法(A.G.Gornall，C.S.Bardawill和M.M.David，J.Biol.Chem.，177(1948)，第751-766页)。在这一方面，通过在存在合适的不可逆抑制剂的条件下(对于蛋白酶，是例如苯甲基磺酰氟化物(PMSF))滴定活性中心并测量剩余活性(参见M.Bender等人，J.Am.Chem.Soc.88，24(1966)，第5890-5913页)，确定活性蛋白质浓度。
蛋白酶和/或淀粉酶还可以吸附在载体上和/或包埋在密封剂中，从而保护其免受过早分解。在洗涤液中，即，在使用条件下，酶随后释放并产生催化活性。
在本发明的另一个实施方案中，洗涤剂或清洁剂另外包括选自以下的组分：
i.阴离子型和/或多聚阴离子型物质，和/或
ii.阳离子型和/或多聚阳离子型物质，和/或
iii.具有羟基和/或多羟基的物质。
已确定，添加这类物质进一步改善了洗涤剂和清洁剂的清洁能力，特别是包含蛋白酶和淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂，尤其是上文所述的那些，特别是在比较低的温度下，尤其是在10℃至50℃之间，10℃至40℃之间，10℃至30℃之间，和/或20℃至40℃之间。特别是当与本发明的可掺入的蛋白酶组合时，产生协同效应，首先是对于去除至少一种蛋白酶-敏感型污渍，尤其是例如上文列举的污渍。
在上文i中列出的物质涉及阴离子型或多聚阴离子型物质，即，这些物质携带至少一个，优选复数个负电荷。它们优选涉及含有至少一个带负电荷单体，优选复数个带负电荷单体的聚合物。相应的，本发明优选的聚合物是带负电荷的聚合物。示例性优选的是有机酸或其盐的聚合物，尤其是聚丙烯酸酯和/或多糖酸和/或聚丙烯酸酯共聚物和/或多糖共聚物。在这一方面，其他优选的化合物是聚丙烯酸磺酸酯或聚羧酸酯及其盐、共聚物或共聚物的盐。
示例性的特别优选添加的物质是Acusol587D(聚丙烯酸磺酸酯；Rohm & Haas/DowChemical)、Acusol445N(聚羧酸酯钠盐；Rohm & Haas/Dow Chemical)、Acusol590(聚丙烯酸酯共聚物；Rohm & Haas/Dow Chemical)、Acusol916(聚丙烯酸酯钠盐；Rohm &Haas/DowChemical)、Sokalan CP42(修饰的聚羧酸酯钠盐；BASF)、Sokalan PA30CL(聚羧酸酯钠盐；BASF)、Dequest P9000(聚马来酸；Thermphos)、褐藻酸、聚-2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、聚-4-苯乙烯磺酸共-马来酸钠盐、聚丙烯酰胺共-丙烯酸钠盐、聚甲基丙烯酸钠盐、聚甲基乙烯基醚-alt-马来酸或聚乙烯磺酸钠盐。
ii中列出的物质涉及阳离子型或多聚阳离子型物质，即，这些物质携带有至少一个，优选复数个正电荷。它们优选涉及含有至少一个带正电荷单体，优选复数个带正电荷单体的聚合物。因此，本发明优选的聚合物是带正电荷的聚合物。在这一方面，示例性优选化合物是聚胺的盐、聚乙烯亚胺或其共聚物、聚烯丙胺的盐、聚二烯丙基二甲基铵化合物或聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵)化合物的盐。
iii中列出的物质涉及携带有至少一个羟基和/或多羟基，优选具有复数个羟基和/或多羟基的物质。在这一方面，例如聚乙烯醇是优选的，例如可以商标名Mowiol获得的(Kremer Pigmente GmbH & Co.KG)那些。
就这一点而言，明确的指出实际的物质可以属于上述组i至iii中的一个或多个。例如可以涉及具有一个或多个羟基和/或多羟基的阴离子型聚合物。该类型的物质因此属于组i和iii。同样的，具有一个或多个羟基和/或多羟基的阳离子型聚合物属于组ii.和iii。
在本发明的上下文中，同样也可以添加属于上述i、ii.或iii的物质的衍生物。在本申请的上下文中，衍生物被理解为意指自上述物质之一开始，通过例如侧链转化或在物质上共价结合另一种化合物而化学修饰的物质。这类化合物可以涉及例如低分子量化合物，例如脂类或单糖、寡糖或多糖、或胺类或胺化合物。此外，物质可以被糖酵解、水解、氧化、N-甲基化、N-甲酰化、N-乙酰化，或包括甲基、甲酰基、乙基、乙酰基、叔丁基、茴香基、苯甲基、三氟乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺、叔丁氧羰基、苯甲酰基、4-甲基苯甲基、thioanicyl、thiocresyl、苯甲基氧基甲基、4-硝基苯基、苯甲基氧基羰基、2-硝基苯甲酰基、2-硝基苯基氧硫基(2-nitrophenylsulfenyl)、4-甲苯磺酰基、五氟苯基、二苯甲基、2-氯苯甲基氧基羰基、2，4，5-三氯苯基、2-溴苯甲基氧基羰基、9-芴甲氧羰基、三苯基甲基、2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基。
同样的，衍生物被理解为意指与大分子载体的共价或非共价键合的物质，也正如合适的大分子笼状结构内的非共价内含物。也可以进行与其他大分子化合物例如聚乙二醇的偶联。其他优选的化学修饰是一个或多个化学基团-COOH、-OH、＝NH、-NH2-SH成为-COOR、-OR、-NHR、-NR2、-NHR、-NR、-SR的修饰；其中：
R是-CH＝CH-R2、-C＝C-R2、-C(R2)＝CH2、-C(R2)＝C(R3)、-CH＝NR2、-C(R2)＝N-R3、有或无取代的4-7元碳环体系、有或无取代的4-7元氮杂环，或具有选自R1、R2或R3的取代的含1至5个双键或三键的C2至C8碳链，其中
-R1是H、-R、-NO2、-CN、卤素取代基、-N3、-C1-8烷基、-(CH2)nCO2R2、-C2-8烯基-CO2R2、-O(CH2)nCO2R2、-C(O)NR2R3、-P(O)(OR2)2、烷基取代四唑-5-基、-(CH2)nO(CH2)n芳基、-NR2R3、-(CH2)nOR2、-(CH2)nSR2、-N(R2)C(O)R3、-S(O2)NR2R3、-N(R2)S(O2)R3、-(CHR2)nNR2R3、-C(O)R3、(CH2)nN(R3)C(O)R3、-N(R2)CR2R3、取代或未取代的(CH2)n-环烷基、取代或未取代的(CH2)n-苯基或-环；其中n是大于1的数；
-R2是H、卤素取代基、-烷基、-卤代烷基、-(CH2)n-苯基、-(CH2)1-3-二苯基、-(CH2)1-4-Ph-N(SO2-C1-2-烷基)2、-CO(CHR1)n-OR1、-(CHR1)n-杂环、-(CHR1)n-NH-CO-R1、-(CHR1)n-NH-SO2R1、-(CHR1)n-Ph-N(SO2-C1-2-烷基)2、-(CHR1)n-C(O)(CHR1)-NHR1、-(CHR1)n-C(S)(CHR1)-NHR1、-(CH2)nO(CH2)nCH3、-CF3、-C2-C5酰基、-(CHR1)nOH、-(CHR1)nCO2R1、-(CHR1)n-O-烷基、-(CHR1)n-O-(CH2)n-O-烷基、-(CHR1)n-S-烷基、-(CHR1)n-S(O)-烷基、-(CHR1)n-S(O2)-烷基、-(CHR1)n-S(O2)-NHR3、-(CHR3)n-N3、-(CHR3)nNHR4、具有1至5个双键的C2至C8链烯烃链、具有1至5个三键的C2至C8链炔烃链、取代或未取代的-(CHR3)n杂环、取代或未取代的饱和或不饱和-(CHR3)n环烷基；其中n是大于1的数，R1和R3可以相同或不同；
-R3是H、-OH、-CN、取代烷基、-C2至C8烯基、取代或未取代的环烷基、-N(R1)R2、饱和或不饱和的C5至C7杂环或4至7个碳原子的杂二环、由饱和或不饱和的杂环或4至7个碳原子的杂二环组成的-NR1、-NR2、-NR1R2；
-R4是H、-(CH2)nOH、-C(O)OR5、-C(O)SR5、-(CH2)nC(O)NR6R7、-O-C(O)-O-R6、氨基酸或肽；其中n是0至4之间的数；
-R5是H，
-R6是-C(R7)-(CH2)n-O-C(O)-R8、-(CH2)n-C(R7)-O-C(O)R8、-(CH2)n-C(R7)-O-C(O)-O-R8、或-C(R7)-(CH2)n-O-C(O)-O-R8；其中n是0至4之间的数；和
-R7和R8分别是H、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、杂环、取代杂环、烷基芳基、取代烷基芳基、环烷基、取代环烷基或CH2CO2烷基，其中R7和R8可以相同或不同。
本发明还可以应用上述属于i.、ii.或iii.和/或其衍生物的物质所有可能的组合。
根据本发明的液体洗涤剂或清洁剂可直接使用，或在用水稀释后使用，尤其是用于清洁织物和/或硬表面。这类稀释可以轻易的产生，只要按定义的物质∶水的重量比，将测定的物质量稀释在额外量的水中，为了确保物质在水中的均匀分布，任选伴有振荡。用于稀释的可能的重量或体积比是1∶0物质∶水至1∶10000或1∶20000物质∶水，优选从1∶10至1∶2000物质∶水。
所有的液体或自由流动的剂型都可用作液体洗涤剂或清洁剂。
在本申请的上下文中，“自由流动”理解为意指是可倾倒的制品，并可具有高达若干10000mPas的粘度。可以使用标准方法测量粘度(例如使用Brookfield-ViscosimeterLVT-II，20rpm和20℃，spindle3)，优选处于5至10000mPas的范围内。优选的物质具有10至8000mPas，特别优选120至3000mPas的粘度。在本发明的上下文中，液体洗涤剂或清洁剂因此也可以是凝胶形式或糊状形式，可以是均质溶液或悬浮液，可以是例如可喷雾的或包装在其他常见剂量形式中。洗涤剂包括所有可以想到的洗涤剂类型，尤其是用于织物、毯子或天然纤维的洗涤剂。其可供手工和/或自动化用途。洗涤剂还包括洗涤助剂，其在手工或自动化织物洗涤过程中按计量加入到实际的洗涤剂中，从而实现另一种效应。清洁剂包括所有的物质，同时是任何所述剂量形式，用于清洁和/或消毒硬表面，手工和自动化洗碗机去垢剂、毯子清洁剂、冲刷剂(scouring agent)、玻璃清洁剂、WC-芳香清洗剂等。在织物前-和后-调节剂一方面是在实际洗涤前与洗涤剂接触的那些材料，从而例如部分溶解顽固型污渍，另一方面是在实际的织物洗涤之后的步骤中使洗涤产生其他理想特性的材料，例如愉悦的触感、没有皱痕或低静电荷残余。后一提及的物质尤其包括织物软化剂等。消毒剂是例如手消毒剂、表面消毒剂和设备消毒剂，也都可以是任何上述剂量形式。
在本发明的另一个优选的实施方案中，洗涤剂或清洁剂含有至少一种其他成分，特别是选自膦酸盐/酯、表面活性剂、助洗剂、非水性溶剂、酸、水溶性盐、增稠剂及其组合的成分。
膦酸盐/酯是膦酸的盐和有机化合物，尤其是酯。盐作为一级膦酸盐(M′H2PO3或HP(O)(OH)(OM′))和二级膦酸盐(M′2HPO3或HP(O)(OM′)2)存在，其中M′代表单价金属。这些无机膦酸盐也被称为一级亚膦酸盐或二级亚膦酸盐。无机膦酸盐是通过例如膦酸HP(O)(OH)2，特别是稳定的互变异构形态的亚磷酸，与一(一级)或二(二级)当量的碱(例如碱金属氢氧化物)反应获得的。在本发明的上下文中，具有磷-碳键的有机P-取代膦酸酯是优选的(有机磷化合物)。其通式结构为
R1P(O)(OR2)2(R1和/或R2＝烷基、芳基或H)，其中烷基或芳基是进一步取代的，或者可以携带其他的化学基团。例如通过Michaelis-Arbusov反应，形成有机P-取代膦酸酯。许多这类膦酸酯是可溶于水的。一些工业上重要的膦酸酯携带了NR-(CH2)x-PO(OH)2(R＝烷基，芳基或H)类型的额外氨基。一些这类氨基膦酸酯与配位剂(如EDTA、NTA或DTPA)是结构上相似的，并具有相似的功能。在本发明的上下文中，特别优选的膦酸酯尤其包括有机膦酸酯，例如1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(HEDP)、氨基三(甲叉膦酸)(ATMP，也被称为氨基-tris(甲叉膦酸)或硝基三(甲叉膦酸)(NTMP))、二乙烯三胺五(甲叉膦酸)(DTPMP或DETPMP或DTPNT)、乙烯二胺四(甲叉膦酸)(EDTMP，也被称为乙烯二胺四(甲叉膦酸))和2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸(PBS-AM，也被称为2-膦酰基丁烷-1，2，4-三羧酸或3-羧基-3-膦酰基己二酸)，它们主要是以其铵盐或碱金属盐的形式添加。二乙烯三胺五(甲叉膦酸)钠盐是特别优选的。这类膦酸盐可获得自例如商标名2066(Thermphos公司)。
包含在洗涤剂或清洁剂中的膦酸盐/酯的量优选是0.01至2.5wt％，按递增的优先度依次是0.02至2wt％、0.03至1.5wt％，特别是0.05至1wt％.
阴离子型、非离子型、两性离子型和/或两性表面活性剂可以作为表面活性剂添加。从工业应用的观点来看，阴离子型和非离子型表面活性剂的混合物是优选的。液体洗涤剂或清洁剂的总表面活性剂含量优选低于60wt％，特别优选低于45wt％，基于总液体洗涤剂或清洁剂。
合适的非离子型表面活性剂包括烷氧基化脂肪醇、烷氧基化脂肪酸烷基酯、脂肪酸酰胺、烷氧基化脂肪酸酰胺、聚羟基脂肪酸酰胺、烷基苯酚聚乙二醇醚、氧化胺、烷基聚葡萄糖苷及其混合物。
优选的非离子型表面活性剂是烷氧基化的，有利的乙氧基化的，特别是伯醇，其优选含有8至18个碳原子，每摩尔醇含平均1至12摩尔环氧乙烷(EO)，其中醇基可以是线性的，或优选在2-位甲基-分支的，或者可以以通常存在于Oxo醇残渣中的混合物的形式含有例如线性和甲基-分支基团。然而特别的是，具有天然来源的线性醇基(有12至18个碳原子)的醇乙氧基化物，例如源自可可醇、棕榈醇、动物脂醇或油醇，平均2至8EO/摩尔醇是优选的。示例性的优选的乙氧基化醇包括具有3EO或4EO的C12-14醇、具有7EO的C9-11醇、具有3EO、5EO、7EO或8EO的C13-15醇、具有3EO、5EO或7EO的C12-18醇，及其混合物，例如具有3EO的C12-14醇与具有5EO的C12-18醇的混合物。对于特定产品而言，上述乙氧基化程度构成可以是整数或分数的统计学平均值。优选的醇乙氧基化物具有狭窄的同源物分布(窄范围乙氧基化物，NRE)。除上述非离子型表面活性剂外，也可以使用具有超过12EO的脂肪醇。其实例是具有14EO、25EO、30EO或40EO的动物脂脂肪醇(tallow fatty alcohol)。分子中同时包含EO和PO基的非离子型表面活性剂也可根据本发明使用。其他合适的还有(高)分支的乙氧基化脂肪醇和线性乙氧基化脂肪醇的混合物，例如具有7EO的C16-18脂肪醇和具有7EO的2-丙基庚醇的混合物。洗涤剂、清洁剂、后处理剂或洗涤助剂特别优选的包含具有7EO的C12-18脂肪醇，或具有7EO的C13-15Oxo醇作为非离子型表面活性剂。
洗涤剂或清洁剂中的非离子型表面活性剂的含量优选是3至40wt％，有利的5至30wt％，特别是7至20wt％，在各种情况下都基于总洗涤剂或清洁剂。
除非离子型表面活性剂外，洗涤剂或清洁剂还可以包含阴离子型表面活性剂。磺酸盐、硫酸盐、皂类、烷基磷酸盐、阴离子型硅-表面活性剂，及其混合物优选作为阴离子型表面活性剂使用。
磺酸盐类的合适的表面活性剂有利的是C9-13烷基苯磺酸盐、烯属磺酸盐，即烯烃和羟基烷烃磺酸盐和二磺酸盐的混合物，获得自例如通过用气态三氧化硫对具有末端或内部双键的C12-18单烯烃的磺化作用，和之后磺化产物的碱水解或酸水解。C12-18烷基磺酸盐的酯和α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)同样也是合适的，例如氢化可可酸、棕榈仁酸(palm nut)或动物脂酸(tallow acid)的α-磺酸化甲基酯。
优选的烷基(烯基)硫酸盐是源自C12-C18脂肪醇的硫酸半酯的碱金属盐，尤其是钠盐，例如源自椰油醇(coconut butter alcohol)、动物脂醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇，或源自C10-C20Oxo醇的，和具有上述链长度的二级醇的半酯。就洗涤性能而言，C12-C16烷基硫酸盐、C12-C15烷基硫酸盐以及C14-C15烷基硫酸盐是优选的。2，3-烷基硫酸盐也是合适的阴离子型表面活性剂。
用1至6摩尔环氧乙烷乙氧基化的、源自直链或分支的C7-21醇的硫酸单酯也是合适的，例如具有平均3.5摩尔环氧乙烷(EO)的2-甲基-分支C9-11醇，或具有1至4EO的C12-18脂肪醇。
皂类也是优选的阴离子型表面活性剂。饱和和不饱和的脂肪酸皂类是合适的，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、(氢化)芥子酸和山嵛酸的盐，尤其是源自天然脂肪酸的皂类混合物，例如椰子油脂肪酸、棕榈仁油脂肪酸、橄榄油脂肪酸或动物脂脂肪酸。
阴离子型表面活性剂(包括皂类)可以以其钠盐、钾盐、镁盐或铵盐的形式存在。阴离子型表面活性剂优选以其钠盐的形式存在。阴离子型表面活性剂的其他优选的反荷离子还是质子化形式的胆碱(choline)、三乙胺或甲基乙基胺。
洗涤剂或清洁剂中的阴离子型表面活性剂的含量是1至40wt％，有利的是5至30wt％，尤其特别优选的是10至25wt％，在各种情况下都基于总洗涤剂或清洁剂。
可以特别提及硅酸盐、硅酸铝类(特别是沸石类)、碳酸盐、有机二羧酸和聚羧酸的盐，以及这些材料的混合物，作为包含在洗涤剂或清洁剂中的助洗剂。
可以存在于洗涤剂或清洁剂中的有机助洗剂是例如可以其钠盐形式使用的聚羧酸，在本上下文中的聚羧酸理解为具有一个以上酸官能团的羧酸。这些包括例如柠檬酸、己二酸、琥珀酸、戊二酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、富马酸、糖酸、氨基羧酸、氨三乙酸(NTA)、甲基甘氨酸乙酰乙酸(MGDA)，及其衍生物，及其混合物。优选的盐是聚羧酸的盐，所述聚羧酸例如柠檬酸、己二酸、琥珀酸、戊二酸、酒石酸、糖酸，及其混合物。
聚合型聚羧酸酯也适合作为助洗剂。它们是例如聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的碱金属盐，例如具有600至750000g/mol的相对分子量的那些。
特别合适的聚合物是聚丙烯酸酯，其优选具有1000至15000g/mol的分子量。鉴于其优秀的溶解性，该类型优选的代表例子再次可以是短链聚丙烯酸酯，其具有1000至10000g/mol，特别优选1000至5000g/mol的分子量。
其他合适的共聚型聚羧酸酯特别是丙烯酸与甲基丙烯酸的酯，和丙烯酸或甲基丙烯酸与马来酸的酯。为了改善水溶性，聚合物还可以包含烯丙基磺酸作为单体，例如烯丙氧基苯磺酸和甲代烯丙基磺酸。
然而，可溶性助剂是优选的，例如优选向液体洗涤剂或清洁剂中添加柠檬酸或分子量为1000至5000g/mol的丙烯酸聚合物。
在本说明书上下文中关于聚合的聚羧酸酯/盐所提及的分子量是特定酸类型的重量平均分子量Mw，是使用UV检测仪通过凝胶渗透色谱(GPC)的手段基础测定的。测量针对外部的聚丙烯酸标准进行，由于与所讨论的聚合物的结构相似性，所述聚丙烯酸标准提供了真实的分子量值。这些值与用聚苯乙烯磺酸作为标准测量的分子量显著不同。用聚苯乙烯磺酸测量的分子量一般显著高于本说明书中提及的分子量。
需要时，可以下述量包含这类型的有机助洗剂，所述量多达40wt％，特别是多达25wt％，优选1wt％至8wt％。优选在糊状或液体，特别是含水组合物中掺入接近所述上限的量。
本发明的洗涤剂或清洁剂是液体，优选包括水作为主要溶剂。此外，洗涤剂或清洁剂中可以添加非水性溶剂。合适的非水性溶剂包括一元醇或多元醇、烷醇胺或乙二醇醚，只要它们在定义的浓度范围内可与水混溶。溶剂优选的选自乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇丙醚、乙二醇单正丁醚、二乙二醇甲基醚、二乙二醇乙基醚、丙二醇甲基醚、丙二醇乙基醚、丙二醇丙基醚、二丙二醇单甲基醚、二丙二醇单乙基醚、二异丙二醇单甲基醚、二异丙二醇单乙基醚、甲氧基三甘醇、乙氧基三甘醇、丁氧基三甘醇、1-丁氧基乙氧基-2-丙醇、3-甲基-3-甲氧基丁醇、丙二醇叔丁醚、二正辛醚，以及上述溶剂的混合物。然而，洗涤剂或清洁剂优选的包括多元醇作为非水性溶剂。特别的是，多元醇可以包括丙三醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、二乙二醇和/或二丙二醇。洗涤剂或清洁剂特别优选包含多元醇和一元醇的混合物。洗涤剂或清洁剂中添加的非水性溶剂的量可以在0.5至15wt％之间，然而优选低于12wt％。
为了调节混合常见组分后的pH至理想水平，物质可以包含与系统和环境相容的酸，特别是柠檬酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、琥珀酸、戊二酸和/或己二酸，以及矿物酸(特别是硫磺酸)或碱(特别是氢氧化铵或碱金属的氢氧化物)。包含在物质中的这些类型的pH调节剂的量优选不超过20wt％，特别是1.2wt％至17wt％。
在本发明的上下文中，物质可以额外的包含一种或多种水溶性盐，用于例如调节粘度。在这一方面，可以是无机或有机的盐。在本文中，可以掺入的无机盐优选选自下述组，所述组包括无色的水溶性卤化物、硫酸盐、亚硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐和/或碱金属的、碱土金属的、铝的和/或过渡金属的氧化物；此外，可以掺入铵盐。在这一方面，卤化物和碱金属的硫酸盐是特别优选的；因此，无机盐优选选自下述组，所述组包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾，及其混合物。可以掺入的示例性的有机盐是无色的水溶性碱金属、碱土金属、铵、铝和/或过渡金属的羧酸盐。盐优选选自下述组，所述组包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、草酸盐、乳酸盐，及其混合物。
根据本发明的物质可以包含一种或多种使其增稠的增稠剂。增稠剂优选的选自下述组，所述组包括黄原胶、瓜尔胶(guar)、角叉菜聚糖、琼脂、琼脂、gellan、果胶、刺槐豆粉(locust bean flours)及其混合物。在存在无机盐时，这些化合物也是有效的增稠剂。在特别优选的实施方案中，洗涤剂或清洁剂包含黄原胶作为增稠剂，因为即使在存在高盐浓度的条件下，黄原胶也可有效增稠，并阻止连续相的肉眼可见的分离。此外，增稠剂使连续的低表面活性剂相稳定，阻止肉眼可见的相分离。
可选的，(甲基)丙烯酸(共)聚合物也可以用作增稠剂。示例性的合适的丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物包括高分子量的丙烯酸同聚物，其与聚烯基聚醚，特别是与蔗糖、季戊四醇或丙烯的烯丙醚基交联(根据“化妆品、盥洗用品和香料协会(The Cosmetic，Toiletryand Fragrance Association(CTFA))”的“国际化妆品成分名录(InternationalDictionary of Cosmetic Ingredients)”的INCI名称：卡波姆(Carbomer))，也被称为羧基乙烯聚合物。该类型的多聚丙烯酸尤其可以商标名和等获得。此外，下列丙烯酸共聚物是合适的，例如：(i)两个或多个丙烯酸、甲基丙烯酸及其简单酯的基团的单体的共聚物，优选与C1-4链烷醇形成(INCI丙烯酸盐共聚物)，其可以商标名例如或聚合物获得；(ii)交联的高分子量丙烯酸共聚物，属于这类共聚物的是例如C10-30烷基丙烯酸盐与一个或多个丙烯酸、甲基丙烯酸及其简单酯的基团的单体的共聚物(优选与C1-4链烷醇形成)，与蔗糖或季戊四醇的烯丙基醚交联(INCI丙烯酸盐/C10-30烷基丙烯酸盐交联聚合物)，其可以商标名获得。其他合适的聚合物是型的(甲基)丙烯酸(共)聚合物。
本发明的洗涤剂或清洁剂优选的可包含(甲基)丙烯酸(共)聚合物与另一种增稠剂，优选黄原胶的组合。洗涤剂或清洁剂可以包含0.05至1.5wt％，优选0.1至1wt％增稠剂，分别基于总洗涤剂或清洁剂。在这一方面，添加的增稠剂的量取决于增稠剂的类型和需要的增稠程度。
一般通过简单的混合成分，制备在标准溶剂中溶液形式的液体或糊状的本发明物质，其可以直接添加或作为溶液添加到自动化混合器中。
本发明的洗涤剂或清洁剂可以专门包含上述蛋白酶和淀粉酶。可选的，它们还可以包含浓度适合物质活性的其他水解酶或其他酶。本发明的另一个主题由还含有一种或多种其他酶的物质所示例，其中原则上可以添加现有技术中发现的用于这类目的的所有酶。在根据本发明的物质中可以出现催化活性的所有酶都可以优选的作为其他酶掺入，特别是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶(xanthanase)、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、角叉菜聚糖酶(carrageenase)、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶，及其混合物。物质中包含的其他酶的总量基于活性蛋白质分别有利的是1x10-8至5wt％。根据本发明的物质中包含的各种其他酶的量按递增的优先度是基于活性蛋白质的1x10-7至3wt％、0.00001至1wt％、0.00005至0.5wt％、0.0001至0.1wt％，和特别优选的0.0001至0.05wt％。酶特别优选的对某些污渍或污垢表现出协同清洁能力，即，包含在物质组合物中的酶在其清洁能力上彼此相互支持。这类协同作用尤其特别优选的存在于本发明包含的蛋白酶和本发明物质的另一种酶之间，特别是在所述蛋白酶和淀粉酶和/或脂肪酶和/或甘露聚糖酶和/或纤维素酶和/或果胶酶之间。协同效应不仅可以出现在各种酶之间，而且也可以出现在一种或多种酶与本发明物质的其他成分之间。
本发明的另一个主题是由本发明物质的用途代表的，用于去除织物或硬表面上的污渍，特别是蛋白酶-敏感型和/或淀粉酶-敏感型污渍，即，用于清洁织物或硬表面。特别是由于包含蛋白酶和淀粉酶的组合，本发明的物质可以有利的用于该目的，从而从织物或硬表面上消除相应的污染物。通过手洗，从织物或硬表面上手工去除污垢，或与自动化方法关联的使用是本发明的这一主题的示例性的实施方案。关于本发明的洗涤剂或清洁剂描述的所有事实、主题和实施方案也可用于本发明的这一主题。因此，对于恰当位置提及的公开内容所明确引入在本文的参考，该公开内容对于根据本发明的前述用途也是有效的。
本发明的另一个主题是由清洁织物或硬表面的方法代表的，其中在至少一个工艺步骤中使用了本发明的洗涤剂或清洁剂。
这些方法包括手工和自动化的方法，自动化的方法是优选的，因其对于例如添加量和接触时间更精确的可控性。清洁织物的方法一般是在复数个工艺步骤中向待清洁的材料应用各种清洁-活性物质，在接触时间之后洗去，或用洗涤剂或该物质的溶液或稀释液以任何其他方式处理待清洁的材料。清洁织物以外的所有材料的方法也是如此，尤其是硬表面。可以在所有可想到的洗涤或清洁方法的至少一个工艺步骤中添加本发明的洗涤剂或清洁剂；相应的，这些方法也成为本发明的实施方案。关于本发明的洗涤剂或清洁剂描述的所有事实、主题和实施方案也可用于本发明的这一主题。因此，对于恰当位置提及的公开内容所明确引入在本文的参考，该公开内容对于根据本发明的前述用途也是有效的。
在优选的实施方案中，方法是其中洗涤液中存在的淀粉酶浓度是0.0000003至0.0004wt％，优选0.0000005至0.0003wt％，和/或洗涤液中存在的蛋白酶浓度是0.00009至0.0005wt％，优选0.00015至0.00035wt％，其中数据是基于洗涤液中的活性蛋白质的。在另一个优选的实施方案中，可以在10℃至50℃，优选10℃至40℃，特别优选20℃至40℃之间的温度下，进行根据本发明的方法。
与上述实施方案相对应，掺入在根据本发明的物质中的蛋白酶可以有利的用于根据本发明的洗涤剂或清洁剂中，以及方法中，尤其是洗涤和清洁方法中。因此可以有利的使用它们，从而为相应物质提供蛋白水解活性。
因此，所形成的另一个主题是蛋白酶的用途，所述蛋白酶
(a1)含有与SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，并在根据SEQ ID NO：1计数的第99位上具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，或
(a2)含有与SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，并在根据SEQ ID NO：1计数的第99位上具有氨基酸天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)，或
(a3)含有与SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列，并在根据SEQ ID NO：1计数的第99位上具有氨基酸丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)，
用于为还含有淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂提供蛋白水解活性。
在另一个实施方案中，该用途是其中蛋白酶在根据SEQ ID NO：1计数时还包含至少一个下列氨基酸：
(a)第3位的苏氨酸(3T)，
(b)第4位的异亮氨酸(4I)，
(c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
(d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
(e)第188位的脯氨酸(188P)，
(f)第193位的甲硫氨酸(193M)，
(g)第199位的异亮氨酸(199I)，
(h)第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
(i)氨基酸(a)至(h)的多种组合。
本发明形成的另一个主题是由蛋白酶的用途形成的，所述蛋白酶选自
a.含有根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的蛋白酶；
b.在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的至少一个位置上含有改变的氨基酸序列的蛋白酶，其中根据SEQ ID NO：1计数的改变选自：
i.第3位的苏氨酸(3T)，
ii.第4位的异亮氨酸(4I)，
iii.第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)，
iv.第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)，
v.第188位的脯氨酸(188P)，
vi.第193位的甲硫氨酸(193M)，
vii.第199位的异亮氨酸(199I)，
viii.第211位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(211D、211E或211G)，
ix.(i)至(viii)的氨基酸的多种组合；
用于为还含有淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂提供蛋白水解活性。
关于本发明的洗涤剂或清洁剂所描述的所有事实、主题和实施方案也可用于所述用途。因此，对于恰当位置提及的公开内容所明确引入在本文的参考，该公开内容对于根据本发明的前述用途也是有效的。
实施例：确定根据本发明的液体洗涤剂的储存稳定性
洗涤剂基础配方是
a)下列组成的第一液体洗涤剂(所有数据都是wt％)：0.3-0.5％苍耳烷、0.2-0.4％消泡剂、6-7％甘油、0.3-0.5％乙醇、4-7％FAEOS(脂肪醇醚硫酸盐)、24-28％非离子型表面活性剂、1％硼酸、1-2％柠檬酸钠(二水合物)、2-4％苏打、14-16％椰子脂肪酸、0.5％HEDP(1-羟基乙烷-(1，1-二膦酸))、0-0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0-0.5％荧光增白剂、0-0.001％着色剂，其余是软化水。所包含的淀粉酶是0.44wt％12L(来自Novozymes公司的淀粉酶制品)。
b)下列组成的第二液体洗涤剂：
向洗涤剂基础配方中加入下列用于各种实验的蛋白酶，其中数据是基于活性蛋白质的：
方案1：根据WO95/23221来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶性能改善的变体F49(第99位为Arg(99R))：0.4mg/ml(0.04wt％)，加入到根据a)和b)的液体洗涤剂中。
方案2：公开在图2或国际专利申请WO03/057713的SEQ ID NO：3中的蛋白酶(第99位为Ser(99S)；与SEQ ID NO：1的同一性＜80％)：0.4mg/ml(0.04wt％)，加入到根据a)的液体洗涤剂中；0.3mg/ml(0.03wt％)，加入到根据b)的液体洗涤剂中。
方案3：含有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白酶(第99位为Glu(99E))：0.4mg/ml(0.04wt％)，加入到根据a)的液体洗涤剂中；0.3mg/ml(0.03wt％)，加入到根据b)的液体洗涤剂中。
测试根据方案1、2和3的各种洗涤剂的储存稳定性。将洗涤剂储存在30℃的温度下相关的时间，确定各自剩余的淀粉分解活性。用0.67％淀粉(可溶，根据Zulowsky预处理(用甘油在190℃处理))孵育测试下的样品，在定义的反应条件下(tris-马来酸盐缓冲液，pH6.5，50℃，15min)。通过添加二硝基水杨酸和在碱性条件下加热至100℃，用葡萄糖将酸还原并且另外将糖还原以提供橙-红染料，其在反应结束时在540nm被光度法测量。与显色相对应的释放的糖量是酶活性的量度(参见Sumner等人，J.Biol.Chem.，1921，47&1924，62)。下表1列出了所测量的剩余的淀粉分解活性(n.d.＝未测定)。
表1：
相比方案1和2的洗涤剂，本发明的洗涤剂明显表现出显著改善的剩余淀粉分解活性，以及因此改善的储存稳定性。
Claims (10)
1.蛋白酶用于改善包含蛋白酶和淀粉酶的液体洗涤剂或清洁剂中的淀粉酶的储存稳定性的用途，其中所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其中所述淀粉酶是α-淀粉酶。
2.根据权利要求1的用途，其中，包含的淀粉酶的量是基于活性蛋白质的0.0001wt％至5wt％，和/或包含的蛋白酶的量是基于活性蛋白质的0.0001wt％至5wt％。
3.根据权利要求1的用途，其中所述液体洗涤剂或清洁剂另外含有选自下述的组分：
i.阴离子型和/或多聚阴离子型物质，和/或
ii.阳离子型和/或多聚阳离子型物质，和/或
iii.具有一个或多个羟基的物质。
4.根据权利要求2的用途，其中所述液体洗涤剂或清洁剂另外含有选自下述的组分：
i.阴离子型和/或多聚阴离子型物质，和/或
ii.阳离子型和/或多聚阳离子型物质，和/或
iii.具有一个或多个羟基的物质。
5.根据权利要求1至4的任一项的用途，其中所述液体洗涤剂或清洁剂含有至少一种其他成分。
6.根据权利要求5的用途，其中所述至少一种其他成分选自膦酸盐/酯、表面活性剂、助洗剂、非水性溶剂、酸、水溶性盐、增稠剂及其组合。
7.根据权利要求1至4和6的任一项的用途，其中所述液体洗涤剂或清洁剂含有至少一种其他酶。
8.根据权利要求7的用途，其中所述至少一种其他酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、角叉菜聚糖酶、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶，及其混合物。
9.根据权利要求5的用途，其中所述液体洗涤剂或清洁剂含有至少一种其他酶。
10.根据权利要求9的用途，其中所述至少一种其他酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、角叉菜聚糖酶、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶，及其混合物。
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