ES2593412T3 - Agente de lavado o detergente líquidos estables al almacenamiento, que contienen proteasa y amilasa - Google Patents

Agente de lavado o detergente líquidos estables al almacenamiento, que contienen proteasa y amilasa Download PDF

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Abstract

Uso de una proteasa para el mejoramiento de la estabilidad al almacenamiento de una amilasa en un agente de lavado o un detergente líquidos que contienen una proteasa y una amilasa, en donde la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 % a la secuencia indicada en SEQ ID NO. 1 y que en la posición 99 en la numeración según SEQ ID NO. 1 exhibe el aminoácido ácido glutámico (E).

Description

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La proteasa es usada en el agente de lavado en una concentración de 0,001-0,1 %, preferiblemente de 0,01 a 0,06 %, referida a la proteína activa.
Al comienzo del almacenamiento los dos agentes que se van a comparar exhiben la misma actividad amilolítica inicial, contienen la proteasa en la misma concentración referida a la enzima activa, y ambos agentes son tratados del mismo modo y forma. La actividad proteolítica en los agentes es determinada en cada caso mediante la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) desde el sustrato suc-AAPF-pNA, y su actividad amilolítica es determinada en cada caso como se indicó anteriormente.
Las actividades iniciales para la proteasa y la amilasa en los respectivos agentes no son iguales a cero.
Mediante el uso en cada caso de la misma actividad de amilasa y el uso de la misma concentración de proteasas, referidas a la proteína activa, se asegura que también para una eventual brecha de la relación de sustancia activa a proteína total (los valores de la actividad específica) se comparan las propiedades enzimáticas reales presentes.
En el marco de la presente invención, en tanto no se indique de otro modo, en cada caso se hace referencia al peso del agente de lavado líquido, es decir los datos se refieren a su peso.
Numerosas proteasas y en particular subtilisinas son formadas como denominadas preproteínas, por consiguiente junto con un propéptido y un péptido de señal, en las que la función del péptido de señal comúnmente consiste en la transferencia al exterior de la proteasa desde la célula que la produce, al periplasma o al medio circundante de la célula, y el propéptido es comúnmente necesario para el correcto pliegue de la proteasa. Por regla general el péptido de señal y el propéptido son la parte terminal en N de la preproteína. Bajo condiciones naturales, el péptido de señal es escindido por una señalpeptidasa de la otra proteasa. A continuación ocurre el pliegue correcto final de la proteasa promovido por el propéptido. La proteasa está entonces en su forma activa y escinde el propéptido en sí mismo. Después de la decisión del propéptido ejerce la proteasa entonces madura (madura), en particular subtilisina, su actividad catalítica sin los aminoácidos terminales en N originalmente presentes. Para aplicaciones técnicas, en general y en particular en el marco de esta invención, se prefieren las proteasas maduras (maduras), es decir las enzimas procesadas después de su producción, frente a las preproteínas. Las proteasas pueden además ser modificadas de las células que las producen después de la producción de la cadena de polipéptidos, por ejemplo mediante el enlace de moléculas de azúcar, adición del grupo formilo, adición de grupo amino, etc. Tales modificaciones son modificaciones postranslacionales y pueden, sin embargo no tienen que, ejercer una influencia en la función de la proteasa.
Además, también la proteasa madura puede acortarse en sus extremos terminales en N y/o terminales en C, de modo que en el agente de lavado o detergente de acuerdo con la invención está presente una proteasa corta, por consiguiente un fragmento, respecto a SEQ ID NO. 1 o bien SEQ ID NO. 2. Todos los datos de identidad se refieren en ese caso a los ámbitos en los cuales el respectivo fragmento está asignado en una alineación con SEQ ID NO. 1. El respectivo fragmento comprende en cada caso la posición, que está asignada a la posición 99 en una alineación con SEQ ID NO. 1, y exhibe en esta posición un aminoácido correspondiente. Ventajosamente comprende también una o varias de las otras posiciones anteriormente descritas y exhibe allí un aminoácido correspondiente. Además, un fragmento así es proteolíticamente activo. Un fragmento más preferido a este respecto comprende una secuencia de aminoácidos que en una longitud de por lo menos 50 o por lo menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 o 268 posiciones de aminoácidos conectados coincide con SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 bajo consideración de los aminoácidos previamente mencionados para la posición 99 y opcionalmente además para las posiciones 3 y/o 4 y/o 61 y/o 154 y/o 188 y/o 193 y/o 199 y/o 211. Preferido de modo particular, el poder de limpieza y/o estabilidad al almacenamiento de un agente de lavado o detergente líquido acuerdo con la invención con un fragmento así, corresponde por lo menos al de un agente de lavado o detergente que contiene una proteasa la cual incluye una secuencia de aminoácidos, que corresponde a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 2, determinada en cada caso como se indicó previamente.
Otro objetivo de la invención es un agente de lavado o detergente líquido que comprende
(a)
una proteasa, que es elegida de entre el grupo consistente en
a.
Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO. 2;
b.
Proteasa, que comprende una secuencia de aminoácidos modificada en por lo menos una posición respecto a SEQ ID NO. 2, en la que el cambio de la numeración según SEQ ID NO. 1 es elegida de entre el grupo consistente en:
i.
Treonina en la posición 3 (3T),
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ii. isoleucina en la posición 4 (41),
iii. alanina, treonina o arginina en la posición 61 (61A, 61T o 61 R),
iv.
ácido asparagínico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E),
v.
prolina en la posición 188 (188P),
vi. metionina en la posición 193 (193M),
vii. isoleucina en la posición 199 (1991),
viii. ácido asparagínico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211 E o 211G),
ix. combinaciones de los aminoácidos (i) a (viii); y
(b) una amilasa.
Estas proteasas son usadas de modo muy particularmente preferido en un agente de lavado o detergente líquido de acuerdo con la invención. Ellas son obtenidas partiendo de SEQ ID NO. 1 mediante la sustitución del aminoácido arginina en la posición 99 por el aminoácido ácido glutámico (E) en la numeración según SEQ ID NO.
1. Esta secuencia de aminoácidos es indicada en el protocolo de secuencia como SEQ ID NO. 2. Además, estas proteasas, adicionalmente al aminoácido previsto para la posición 99, pueden exhibir uno o varios de los aminoácidos explicados anteriormente, en las posiciones 3, 4, 61, 154,.188, 193, 199 y 211, asignarse en una alineación con SEQ ID NO. 1 y con ello con la numeración según SEQ ID NO. 1. Los aminoácidos mencionados para estas posiciones causan también en estas proteasas otras propiedades ventajosas y/o fortalecen aún propiedades ya existentes. En particular causan una elevación de la actividad proteolítica y/o la estabilidad de la proteasa en un agente de lavado o detergente líquido o bien en el licor de lavado formado por este agente de lavado o detergente. Todas las realizaciones anteriores -en tanto sean aplicables -son válidas de modo correspondiente para estas proteasas preferidas de modo particular.
Un agente de acuerdo con la invención contiene la proteasa de modo creciente preferiblemente en una cantidad de 1 x 10-8-5 % en peso, de 0,0001-1 % en peso, de 0,0005-0,5 % en peso, de 0,001 a 0,1 % en peso y preferido de modo particular de 0,001 a 0,06 % en peso, referido a la proteína activa. Un agente de acuerdo con la invención contiene la amilasa de manera creciente preferiblemente en una cantidad de 1 x 10-8-5 % en peso, de 0,00001-1 % en peso, de 0,00005-0,5 % en peso, de 0,0001 a 0,1 % en peso y preferido de modo particular de 0,0001 a 0,05 % en peso, referido a la proteína activa. La concentración de proteína puede ser determinada con ayuda de métodos conocidos, por ejemplo el método BCA (ácido bicincónico; ácido 2,2’-biquinolil-4,4’-dicarboxílico) o el método del Biuret (A. G. Gornall, C. S. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). La determinación de la concentración de proteína activa ocurrió respecto a esto mediante una titulación de los centros activos usando un inhibidor irreversible adecuado (para proteasas por ejemplo fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)) y determinación de la actividad residual (véase M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913).
Además, la proteasa y/o la amilasa pueden estar adsorbidas en sustancias soporte y/o incorporadas en sustancias de envoltura, para protegerlas contra la inactivación prematura. En el licor de lavado, por consiguiente bajo condiciones de uso, se libera entonces la enzima y puede desarrollar su efecto catalítico.
En otra forma de realización de la invención, el agente de lavado o detergente se caracteriza porque incluye además un componente que es elegido de entre
i. sustancia aniónica y/o polianiónica, y/o
ii. sustancia catiónica y/o policatiónica, y/o
iii. sustancia que exhibe grupo(s) hidroxilo y/o polihidroxilo.
Se determinó que la adición de tales sustancias mejora adicionalmente el poder de limpieza de los agentes de lavado y detergentes, en particular de agentes de lavado o detergentes líquidos que contienen proteasas y amilasas, en particular aquellos descritos anteriormente, en particular a temperaturas comparativamente bajas, en particular entre 10 °C y 50 °C, entre 10 °C y 40 °C, entre 10 °C y 30 °C y/o entre 20 °C y 40 °C. En particular en combinación con una proteasa que va a ser usada de acuerdo con la invención ocurre un efecto sinérgico, sobre todo respecto a la eliminación de por lo menos un ensuciamiento sensible a proteasa, en particular uno tal como se indicó anteriormente.
Las sustancias indicadas anteriormente bajo i. son sustancias aniónicas o polianiónicas, es decir estas sustancias portan por lo menos una y preferiblemente varias cargas negativas. Preferiblemente es un polímero con por lo
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N(SO2-alquiloC1-2)2, -(CHR1)n-C(O)(CHR1)-NHR1, -(CHR1)n-C(S)(CHR1)-NHR1, -(CH2)nO(CH2)nCH3, -CF3, acilo-C2-C5, -(CHR1)nOH, -(CHR1)nCO2R1, alquilo-(CHR1)n-O, alquilo-(CHR1)n-O-(CH2)n-O, alquilo-(CHR1)n-S-, alquilo(CHR1)n-S(O), alquilo-(CHR1)n-S(O2), -(CHR1)n-S(O2)-NHR3, -(CHR3)n-N3, -(CHR3)nNHR4, una cadena C2 a C8 cadena de alqueno con 1 a 5 dobles enlaces, una cadena C2 a C8 cadena de alquino con 1 a 5 enlaces triples, heterociclo -(CHR3)n sustituido o no sustituido, cicloalquilo -(CHR3)n sustituido o no sustituido saturado o no saturado; en los que n es un número mayor a 1 y R1 y R3 pueden ser iguales o diferentes;
-R3 es H, -OH, -CN, alquilo sustituido, alquenilo -C2 a C8, cicloalquilo sustituido o no sustituido, -N(R1)R2, heterociclo o heterobiciclo C5 a C7 saturado o no saturado de 4 a 7 átomos de C, -NR1, -NR2, -NR1R2 consistente en un heterociclo o heterobiciclo saturado o no saturado de 4 a 7 átomos de C;
-R4 es H, -(CH2)nOH, -C(O)OR5, -C(O)SR5, -(CH2)n C(O)NR6R7, -O-C(O)-O-R6, un aminoácido o un péptido; en los que n es un número entre 0 y 4; -R5 es H,
-R6 es -C(R7)-(CH2)n-O-C(O)-R8, -(CH2)n-C(R7)-O-C(O)R8, -(CH2)n-C(R7)-O-C(O)-O-R8, o -C(R7)-(CH2)n-OC(O)-O-R8; en los que n es un número entre 0 y 4; y
-R7 y R8 son en cada caso H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, o alquilo CH2CO2 en los que R7 y R8 puede ser iguales o diferentes.
De acuerdo con la invención, es factible además usar todas las combinaciones posibles de las sustancias previamente mencionadas como correspondientes a i., ii. o iii. y/o sus derivados.
Un agente de lavado o detergente líquido de acuerdo con la invención puede ser usado como tal o después de dilución con agua, para la limpieza de textiles y/o superficies duras. Una dilución así puede ser hecha fácilmente, en lo cual se diluye una cantidad medida del agente en otra cantidad de agua, en relaciones determinadas en peso de agente: agua y opcionalmente se sacude esta dilución, para asegurar una distribución homogénea del agente en el agua. Son posibles relaciones en peso o volumen de la dilución de 1:0 agente: agua a 1:10.000 o 1:20.000 agente: agua, preferiblemente de 1:10 a 1:2.000 agente: agua.
Como agente de lavado o detergente líquidos pueden servir para esto todas las formas de administración líquida o bien capaces de fluir. En el sentido el presente documento "capaces de fluir" son al respecto agentes que pueden ser vertidos y pueden exhibir viscosidades de hasta varios 10.000 mPas. La viscosidad puede ser medida con métodos estándar comunes (por ejemplo viscosímetro de Brookfield LVT-II a 20 rpm y 20 °C, aguja 3) y está preferiblemente en el intervalo de 5 a 10.000 mPas. Los agentes preferidos viscosidades de 10 a 8.000 mPas, en las que se prefieren de modo particular valores entre 120 a 3.000 mPas. En el marco de la presente invención, un agente de lavado o detergente líquido puede por ello estar en forma de gel o de pasta, puede estar presente como solución o suspensión homogénea, así como por ejemplo puede poder ser atomizado o estar preparado en otras formas comunes de administración. Entre los agentes de lavado se cuentan todos los tipos de agentes de lavado imaginables, en particular agentes de lavado para textiles, alfombras o fibras naturales.
Ellos pueden ser previstos para uso manual y/o también en máquina. Entre los agentes de lavado se cuentan además agentes auxiliares para el lavado, que pueden ser dosificados al verdadero agente de lavado para el lavado de textiles manual o en máquina, para alcanzar otros efectos. Entre los detergentes se cuentan los agentes para la limpieza y/o desinfección de superficies duras, agentes de enjuague manual y en máquina de vajillas, limpiadores de alfombra, agentes para fregar, limpiadores de vidrio, enjuagues aromáticos para sanitarios, etc., así mismo que ocurren en todas las formas de administración conjunta mencionadas. Finalmente los agentes para el tratamiento previo y posterior de textiles son por un lado aquellos agentes con los cuales es puesta en contacto la pieza que se va a lavar, antes del verdadero lavado, por ejemplo para disolver ensuciamientos duros pertinaces, y por otro lado aquellos que en una etapa subsiguiente del verdadero lavado de textiles imparten a un material que se está lavando otras propiedades deseables como sensación agradable al tacto, ausencia de arrugas o baja carga estática. Entre estos últimos agentes mencionados se cuentan entre otros los suavizantes. Son agentes de desinfección por ejemplo desinfectantes de manos, desinfectantes de recipientes y desinfectantes de instrumentos que así mismo ocurren en las formas mencionadas de administración.
En otra forma preferida de realización de la invención, el agente de lavado o detergente se caracteriza porque incluye por lo menos otro ingrediente, en particular uno que es elegido de entre el grupo consistente en fosfonato, surfactante, material estructural (relleno), solvente no acuoso, ácido, sal soluble en agua, agente espesante así como combinaciones de ellos.
Los fosfonatos son sales y compuestos orgánicos, en particular ésteres, del ácido fosfónico. Como sales existen fosfonatos primarios (M’H2PO3 o bien HP(O)(OH)(OM’)) y secundarios (M’2HPO3 o bien HP(O)(OM’)2), en los que M’ representa un metal monovalente. Éstos fosfonatos inorgánicos son denominados también fosfitos primarios o
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uso precedente.
En una forma preferida de realización, el método se caracteriza porque la amilasa en el licor de lavado está presente en una concentración de 0,0000003 a 0,0004 % en peso, preferiblemente de 0,0000005 a 0,0003 % en peso, y/o porque la proteasa en el licor de lavado está presente en una concentración de 0,00009 a 0,0005 % en peso, preferiblemente de 0,00015 a 0,00035 % en peso, en la que los datos están referidos sobre proteína activa. En otra forma preferida de realización, el método se caracteriza porque es ejecutado a una temperatura entre 10 °C y 50 °C, preferiblemente entre 10 °C y 40 °C y preferido de modo particular entre 20 °C y 40 °C.
Las proteasas usadas en los agentes de acuerdo con la invención, son utilizables de modo correspondiente con las realizaciones precedentes de manera ventajosa en agentes de lavado y detergentes de acuerdo con la invención así como en métodos, en particular métodos de lavado y limpieza. Ellas pueden ser usadas por consiguiente de manera ventajosa para poner a disposición una actividad proteolítica en agentes correspondientes.
Por ello otro objetivo de la divulgación forma el uso de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos 80 % a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 1 y que en la posición 99 en la numeración según SEQ ID NO. 1 exhibe el aminoácido ácido glutámico (E), para la preparación de una actividad proteolítica en un agente de lavado o detergente líquido, el cual comprende además una amilasa.
En otra forma de realización, esta aplicación se caracteriza porque la proteasa exhibe además en la numeración según SEQ ID NO. 1 por lo menos uno de los siguientes aminoácidos:
(a)
Treonina en la posición 3 (3T),
(b)
isoleucina en la posición 4 (41),
(c)
Alanina, Treonina o Arginina en la posición 61 (61A, 61T o 61 R),
(d)
ácido asparagínico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E),
(e)
prolina en la posición 188 (188P),
(f)
metionina en la posición 193 (193M),
(g)
isoleucina en la posición 199 (1991),
(h)
ácido asparagínico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211 E o 211 G),
(i)
combinaciones de los aminoácidos (a) a (h). Así mismo se divulga el uso de una proteasa, que es elegida de entre el grupo consistente en
a.
proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO. 2;
b.
proteasa, que comprende una secuencia de aminoácidos modificada en por lo menos una posición respecto a SEQ ID NO. 2, en la que el cambio en la numeración según SEQ ID NO. 1 es elegido de entre el grupo que consiste en:
i.
Treonina en la posición 3 (3T),
ii. isoleucina en la posición 4 (41),
iii. alanina, treonina o arginina en la posición 61 (61A, 61T o 61 R),
iv.
ácido asparagínico o ácido glutámico en la posición 154 (154D o 154E),
v.
prolina en la posición 188 (188P),
vi. metionina en la posición 193 (193M),
vii. isoleucina en la posición 199 (1991),
viii. ácido asparagínico, ácido glutámico o glicina en la posición 211 (211D, 211 E o 211 G),
ix. combinaciones de los aminoácidos (i) a (viii); para la preparación de una actividad proteolítica en un agente de lavado o detergente líquido, el cual comprende
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Claims (1)

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