ES2419234T5

ES2419234T5 - Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas

Info

Publication number: ES2419234T5
Application number: ES07821004.4T
Authority: ES
Inventors: Mikael Mikkelsen; Niels Munk Ryom; Claus Ladefoged; Sandra Friis-Jensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2007-10-08
Publication date: 2017-05-05
Anticipated expiration: 2027-10-08
Also published as: EP2272943B1; CN101522878B; DK2074205T4; US8329632B2; EP2074205B2; DK2074205T3; EP2074205B1; US20100311636A1; CN101522878A; ES2419234T3; JP5497440B2; WO2008040818A1; JP2010505988A; EP2074205A1; US20080221008A1; EP2272943A1

Description

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Composiciones detergentes y uso de combinaciones de enzimas en las mismas.

[0001] La presente invencion se refiere a composiciones detergentes tipo gel o liquidas acuosas que comprenden combinaciones especfficas de enzimas. Las composiciones detergentes pueden comprender ademas una combinacion de acido borico o un compuesto de boro capaz de formar acido borico en la composicion, un compuesto polihidroxi, preferiblemente propanodiol, y un nivel relativamente alto de ion calcio para estabilizar una combinacion seleccionada de una enzima proteasa y otras enzimas. La invencion tambien se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinacion de una enzima proteasa con otras enzimas en una composicion detergente en gel o lfquida. La invencion ademas se refiere al uso de enzimas proteasas especfficas en composiciones detergentes

Estado de la tecnica

[0002] Proteasas han sido usadas en composiciones detergentes durante aproximadamente 50 anos y varias de estas proteasas han sido desarrolladas en los ultimos 10 anos por ingenierfa de protefnas de varias proteasas precursoras.

[0003] La proteasa precursora mas exitosa en el mercado es subtilisina 309 - o Savinase®. Ingenierfa de protefnas de Savinase fue primero descrita en 1989 en WO 89/06279. Posteriormente un gran numero de solicitudes de patente referentes a la ingenierfa de protefnas de Savinase ha sido solicitado por el solicitante y otras companfas, tales como Genencor international, Inc., Procter & Gamble, Unilever NV, etc. Tambien, varias variantes de Savinase han sido comercializadas por Novozymes A/S y Genencor international, Inc.

[0004] La variante especffica de Savinase comprendiendo las modificaciones Y167A+R170S+A194P fue descrita en WO 98/20115. En la presente solicitud hemos designado esta variante como subtilisina KL.

[0005] Composiciones detergentes en gel y liquidas acuosas que contienen enzimas, incluyendo proteasas, se conocen en la tecnica. El mayor problema encontrado con tales composiciones es el de asegurar una estabilidad de almacenamiento suficiente de las enzimas en las composiciones. Es particularmente diffcil estabilizar amilasas en presencia de proteasas, que pueden degradar facilmente amilasas en composiciones detergentes en gel o liquidas acuosas pero tambien otras enzimas, tales como lipasas, celulasas, etc. son frecuentemente degradadas por las proteasas.

[0006] Amilasas de alto nivel alcalino tales como alfa amilasas son descritas en la especificacion britanica No. 1,296,839. El uso de un sistema estabilizador de enzimas que comprende una mezcla de acido borico o un borato de metal alcalino con ion calcio, y preferiblemente con un poliol, se describe en la patente EEUU 4,537,706, Severson. Ciertas a-amilasas que proporcionan limpieza y eliminacion de manchas mejoradas estan descritas en WO97/32961, Baeck et al., y en WO 96/23873 y patente EEUU 6,093,562.

[0007] US2003/180933 describe composiciones detergentes en gel o liquidas que comprenden una variante de subtilasa comprendiendo las mutaciones A167A + R170S + A194P en combinacion con otras enzimas.

Descripcion de la invencion

[0008] La presente invencion se refiere a una composicion lfquida o en gel que comprende subtilisina KL y/o sus variantes en combinacion con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o, mananasa, donde la proporcion en peso entre el contenido de subtilisina KL o sus variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a 10, especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3, donde la variante de subtilisina KL es una del grupo definido en la reivindicacion 1. En una forma de realizacion particular el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0,001 a 5 % en peso y si estan presentes el contenido de cada una de la siguiente lipasa, amilasa, celulasa, o mananasa, es del 0,001 al 5 % en peso.

[0009] Otra forma de realizacion de la invencion se refiere al uso de subtilisina KL o sus variantes en combinacion con al menos una, lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparacion de composiciones detergentes tipo gel o liquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas, donde la variante de subtilisina KL es una del grupo definido en la reivindicacion 6.

[0010] Otra forma de realizacion de la invencion se refiere a un proceso para aumentar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinacion de una enzima proteasa con otras enzimas en una composicion detergente en gel o lfquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composicion detergente en gel o lfquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa y donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa y donde la variante de subtilisina KL es una del grupo definido en la reivindicacion 7.

[0011] En una forma de realizacion particular de la invencion concierne

[0012] Las amilasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invencion son la amilasa de B. licheniformis y otras amilasas, tales como aquellas descritas en WO 2001/066712, WO 2006/002643, WO 2000/60060.

[0013] Las celulasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invencion son tales como aquellas 5 descritas en WO 1995/024471, WO 91/17244, WO 2002/099091.

[0014] Las lipasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invencion son tales como aquellas descritas en WO 2000/060063.

10 [0015] Las mananasas para ser usadas en las composiciones detergentes de la invencion son tales como aquellas

descritas en WO 99/64619, por ejemplo SEQ ID n°: 2.

[0016] La endoglucanasa para ser usada en las composiciones detergentes de la invencion son tales como aquellas descritas en WO 91/17244

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[0017] Las variantes de subtilisina KL de la presente invencion son tales como aquellas indicadas en la Tabla 1, que tambien estan indicadas en la WO 98/20115:

______________________________________Tabla 1

Mutaciones en la subtilisina KL_________________

Ninguna_____________________________________

*36D________________________________________

P14T_______________________________________

N18K_______________________________________

N62D

V83L________________________________________

A133P______________________________________

E136Q______________________________________

E136R______________________________________

E136K______________________________________

N140R______________________________________

N140K______________________________________

S141E

S141N

S141Y______________________________________

S141R

T143R______________________________________

T143K______________________________________

S153R______________________________________

S156R______________________________________

A160R______________________________________

S162R

S162K

I165R_______________________________________

I165K_______________________________________

Y171R______________________________________

Y171K______________________________________

A172R______________________________________

A172K______________________________________

A174R______________________________________

N173R______________________________________

N173K______________________________________

A174K______________________________________

N76D

Y176R______________________________________

Y176K______________________________________

A187R______________________________________

A187K______________________________________

S188P______________________________________

S190P______________________________________

Q191R______________________________________

Y192R______________________________________

Q191P______________________________________

Y192P_____________________________________________

D197N____________________________________________

D197R____________________________________________

D197E____________________________________________

D197K____________________________________________

D197G____________________________________________

A228V____________________________________________

A230V____________________________________________

T260R_____________________________________________

T260K_____________________________________________

G264R____________________________________________

G264K____________________________________________

S265T_____________________________________________

S265R____________________________________________

S265K____________________________________________

N218S____________________________________________

M222S____________________________________________

M222A____________________________________________

M222G____________________________________________

M222T____________________________________________

M222V____________________________________________

M222S____________________________________________

N243R____________________________________________

V244R____________________________________________

N248R____________________________________________

K251R____________________________________________

N252R____________________________________________

N261R____________________________________________

Combinaciones_____________________________________

S9R+A15T+T22A+N218S+K251R_______________________

S9R+A15T+T22A+V841+N218S________________________

V30I+V139L+N218S_________________________________

V84I+V139L+N218S_________________________________

N76D+N218S_______________________________________

N76D+A228V_______________________________________

N76D+A230V_______________________________________

N76D+N218S+A230V________________________________

N76D+A228V+A230V________________________________

N218S+R247Q______________________________________

N218S+R247H______________________________________

N218S+R247E______________________________________

N218S+R247K______________________________________

D181N+N218S______________________________________

N218S+A230V______________________________________

K251R+S265K______________________________________

P14T+N18K________________________________________

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH=_________

T274H+R275HHHHH_________________________________

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH

S87N+S101G,V104N_________________________________

*36D+N76D+H120D+G195E+K235L_____________________

A133P+M222S______________________________________

Inserciones y combinaciones con las mismas______________

*96aA_____________________________________________

*96aA+A98T________________________________________

*96aA+A133P_______________________________________

*96aA+A98T+A133P_________________________________

*96aA+A98T+N218S_________________________________

*97aP+A98T+N218S_________________________________

*98aT,_____________________________________________

*98aT+S99N+N218S_________________________________

G97D+*98aT+N218S

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*99aD=S99SD________________________

*99aD+M222S=S99SD+M222S___________

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE________

N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V

S99A+*99aD=S99AD___________________

S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S

S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S

S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V

A228V+A230V________________________

*130aL+P194A

[0018] Se ha descubierto sorprendentemente que la subtilisina KL y sus variantes anteriores muestran una compatibilidad destacable para otras enzimas usadas en composiciones detergentes liquidas tales como lipasas, amilasas, celulasas, peroxidasas/oxidasas y hemicelulasas. Esta propiedad produce un aumento sustancial en la actividad residual de estas enzimas en combinacion con la subtilisina KL y sus variantes anteriores en comparacion con la actividad residual en presencia de otras proteasas, incluso despues de perfodos largos de almacenamiento. Al fin y al cabo el resultado es un rendimiento mejorado de la composicion detergente o que se pueden obtener resultados similares con cantidades reducidas de enzima

Nomenclatura y convenciones para designacion de variantes

[0019] Al describir las distintas variantes de la enzima subtilisina KL contempladas o producidas segun la invencion, las siguientes nomeclaturas y convenciones han sido adaptadas para facilidad de referencia: un marco de referencia es primero definido alineando la enzima progenitora con subtilisina BPN' (BASBPN).

[0020] La alineacion se puede obtener por la rutina de GAP del paquete GCG version 9.1 para numerar las variantes que usan los siguientes parametros: penalizacion de creacion de gap = 8 y penalizacion de extension de gap = 8 y todos los demas parametros mantenidos en sus valores por defecto.

[0021] Otro metodo es usar alineamientos reconocidos conocidos entre subtilasas, como la alineacion indicada en WO 91/00345. En la mayorfa de los casos las diferencias no seran de ninguna importancia.

[0022] Asf varias deleciones e inserciones seran definidas en relacion con BASBPN (SEQ ID NO.1). Para una descripcion detallada de la nomenclatura de modificaciones introducidas en un polipeptido por manipulacion genetica nos referimos a WO 00/71691 pagina 7-12.

[0023] Numeracion de posiciones/residuos de aminoacidos si no se menciona nada mas la numeracion de aminoacidos usada aquf corresponde a aquella de la secuencia de subtilasa BPN' (BASBPN). Para descripcion adicional de la secuencia de BPN', vease Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

[0024] "SAVINASE®" Savinase® esta comercializada por Novozymes A/S. Es la subtilisina 309 de B. Lentus.

[0025] Modificacion(es) de una variante de subtilisina KL. El termino "modificacion(es)" usado aquf se define para incluir modificacion qufmica al igual que la manipulacion genetica del ADN que codifica la subtilisina KL. La(s) modificacion(es) puede(n) ser sustitucion(es) de la(s) cadena(s) lateral(es) de aminoacidos, sustitucion(es), delecion(es) y/o inserciones en o al aminoacido(s) de interes.

[0026] Variante de subtilasa. En el contexto de esta invencion, el termino variante de subtilasa o subtilasa mutada significa una subtilasa que ha sido producida por un organismo que esta expresando un gen mutante derivado de un microorganismo progenitor que posefa un gen original o progenitor y que produjo una enzima progenitora correspondiente, el gen progenitor habiendo sido mutado para producir el gen mutante donde dicha proteasa de la subtilasa mutada se produce cuando se expresa en un huesped adecuado.

[0027] Secuencias de subtilasa homologas. La homologfa entre dos secuencias de aminoacidos esta en este contexto descrita por el parametro "identidad". Para determinar el grado de identidad entre dos subtilasas la rutina GAP del paquete GCG version 9.1 se puede aplicar (infra) usando los mismos ajustes. La produccion a partir de la rutina es ademas de la alineacion de aminoacidos el calculo del "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias. Basado en esta descripcion es rutina para un experto en la tecnica identificar subtilasas homologas adecuadas, que se pueden modificar segun la invencion.

[0028] Polinucleotido aislado. El termino "aislado", cuando se aplica a un polinucleotido, denota que el polinucleotido ha sido eliminado de su ambiente genetico natural y por tanto esta libre de otras secuencias de codificacion indeseadas o extranas, y esta en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de produccion de protefnas creadas geneticamente. Tales moleculas aisladas son aquellas que son separadas de su entorno natural e incluyen ADNc y

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clones genomicos. Moleculas de ADN aisladas de la presente invencion estan libres de otros genes con los cuales estas estan comunmente asociadas, pero pueden incluir regiones 5' y 3' no traducidas de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificacion de regiones asociadas sera evidente para un experto en la materia (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78,1985). El termino "un polinucleotido aislado" puede ser denominado de forma alternativa "un polinucleotido clonado".

[0029] Protefna aislada. Cuando se aplica a una protefna, el termino "aislado" indica que la protefna ha sido eliminada de su entorno nativo. En una forma preferida, la protefna aislada esta sustancialmente libre de otras protefnas, particularmente otras protefnas homologas (es decir, "impurezas homologas (vease mas abajo)). Una protefna aislada tiene mas del 10% de pureza, preferiblemente mas del 20% de pureza, mas preferiblemente mas del 30% de pureza, segun esta determinado por SDS-PAGE. Ademas se prefiere proporcionar la protefna en una forma altamente purificada, es decir, mas del 40% pureza, mas del 60% de pureza, mas del 80% de pureza, mas preferiblemente mas del 95% de pureza, y de la forma mas preferible mas del 99% de pureza, segun esta determinado por SDS-PAGE. El termino "protefna aislada" puede ser denominado de forma alternativa "protefna purificada".

[0030] Impurezas homologas. El termino "impurezas homologas" significa cualquier impureza (p. ej. otro polipeptido distinto de la subtilasa de la invencion), que se origina de la celula homologa de la cual se obtiene originalmente la subtilasa de la invencion.

[0031] Obtenido de. El termino "obtenido de" como se utiliza en este caso en relacion con una fuente microbiana especffica, significa que el polinucleotido y/o subtilasa producido por la fuente especffica, o por una celula en la que un gen de la fuente ha sido insertado.

[0032] Sustrato. El termino "sustrato" usado en conexion con un sustrato para una proteasa deberfa ser interpretado en su forma mas general como que comprende un compuesto que contiene al menos un enlace peptfdico (amida) susceptible de hidrolisis por una proteasa de subtilisina.

[0033] Producto. El termino "producto" usado en conexion con un producto derivado de una reaccion enzimatica de proteasa deberfa, en el contexto de la presente invencion, ser interpretado para incluir los productos de una reaccion de hidrolisis que implican una proteasa de subtilasa. Un producto puede ser el sustrato en una reaccion de hidrolisis posterior.

[0034] Rendimiento de lavado. En el presente contexto el termino "rendimiento de lavado" se usa como una capacidad enzimatica para eliminar cepas proteinaceas u organicas presentes en el objeto que debe ser limpiado durante por ejemplo el lavado o limpieza de superficies duras.

[0035] La composicion detergente de la invencion puede por ejemplo ser formulada como una composicion detergente para ropa a mano o a maquina que incluye una composicion de aditivo para el lavado de la ropa adecuado para el pretratamiento de tejidos manchados y una composicion de suavizante adicionada al enjuague, o ser formulada como una composicion detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a maquina.

[0036] En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberfan ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH-optimo, compatibilidad con otros ingredientes no enzimaticos y enzimaticos, etc.), y la enzima(s) deberfa estar presente en cantidades eficaces.

[0037] Lipasas: lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen fungico o bacteriano. Mutantes de protefnas creados geneticamente o modificados qufmicamente estan incluidos. Ejemplos de lipasas utiles incluyen lipasas de Humicola (sinonimo de Thermomyces), por ejemplo de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de una cepa SD 705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), o una lipasa de Bacillus como se describe en wO 2000/060063.

[0038] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Enzimas lipasas usadas preferidas comercialmente incluyen Lipolase®, Lipolase Ultra® y Lipex® (Novozymes A/S).

[0039] Amilasas: amilasas adecuadas (a y/o p) incluyen aquellas de origen fungico o bacteriano. Mutantes de protefnas creados geneticamente o qufmicamente modificados estan incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus. Ejemplos de amilasas utiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, WO 2000/60060, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o mas de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Amilasas comercialmente usadas son Duramyl®, Termamyl®, Stainzym®, Stainzyme Plus®, Stainzyme ultra®, Fungamyl® y BAN® (Novozymes A/S), RapidaseTM, PurastarTM y Purastar OxAmTM (de Genencor International Inc.).

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[0040] Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fungico o bacteriano. Mutantes creados geneticamente de protemas o modificados qmmicamente estan incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas del genero Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las celulasas fungicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas neutras o alcalinas con beneficios de cuidado del color y de mantenimiento de blancura. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los descritos en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Celulasas usadas comercialmente incluyen Renozyme®, Celluzyme®, Celluclean®, Endolase® y Carezyme® (Novozymes A/S), Clazynase™, y Puradax HA™ (Genencor Int. Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[0041] Peroxidasas/oxidasas: peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, fungico o bacteriano. Mutantes creados geneticamente de protemas o qmmicamente modificados son incluidos. Ejemplos de peroxidasas utiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus, y sus variantes como aquellas descritas en WO 93/24618, Wo 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas comercialmente usadas incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[0042] Hemicelulasas: hemicelulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fungico o bacteriano. Mutantes creados geneticamente de protema o qmmicamente modificados estan incluidos. Hemicelulasas adecuadas incluyen mananasa, liqueninasa, xilanasa, arabinasa, galactanasa, actetil xilano esterasa, glucorunidasa, esterasa de acido ferulico, esterasa de acido cumarico y arabinofuranosidasa como se describe en WO 95/35362. Mananasas adecuadas son descritas en WO 99/64619. Hemicelulasas comercialmente usadas incluyen Mannaway® (Novozymes A/S).

[0043] La(s) enzima(s) detergente(s) se puede(n) incluir en una composicion detergente anadiendo aditivos separados que contienen una o mas enzimas, o por adicion de un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo detergente de la invencion, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular por ejemplo como un gel, un lfquido, un lodo, etc. Formulaciones de aditivo de detergente preferidas son lfquidos, en particular lfquidos estabilizados, o lodos.

[0044] Preparaciones enzimaticas lfquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas anadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azucar o alcohol de azucar, acido lactico o acido borico segun metodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar segun el metodo descrito en EP 238.216.

[0045] La composicion detergente de la invencion esta en forma de un gel o un lfquido. Un detergente lfquido puede ser acuoso, tfpicamente conteniendo hasta 70 % de agua y 0-30 % de solvente organico, o no acuoso.

[0046] La composicion detergente comprende uno o mas tensioactivos, que pueden ser no ionicos incluyendo semipolares y/o anionicos y/o zwitterionicos y/o cationicos. Los tensioactivos estan tfpicamente presentes a un nivel del 0,1 % al 60% en peso.

[0047] Cuando se incluye en la misma el detergente normalmente contendra de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante anionico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcoholico, alcanosulfonato secundario, ester metflico de acido alfa-sulfo graso, acido alquil- o alquenilsuccmico o jabon.

[0048] Cuando se incluye en la misma el detergente normalmente contendra de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% de un surfactante no ionico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglicosido, oxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de acido graso etoxilado, monoetanolamida de acido graso, amida de acido polihidroxi alquil graso, o derivados de N-acil/N-alquil glucosamina ("glucamidas").

[0049] El detergente puede contener 0-65 % de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, acido nitrilotriacetico, acido etilenodiaminatetraacetico, acido dietilenotriaminopentaacetico, acido alquil- o alquenilsuccmico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

[0050] El detergente puede comprender uno o mas polfmeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-oxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolfmeros de acido maleico/acnlico y copolfmeros de lauril metacrilato/acido acnlico.

[0051] El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formacion de peracido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxiacidos de por ejemplo el tipo amida, imida, o sulfona.

[0052] La(s) enzima(s) de la composicion detergente de la invencion se puede(n) estabilizar usando agentes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenoglicol, dictilenoglicol, metilpropanodiol, o glicerol, un azucar o alcohol de azucar, acido lactico, acido borico, o un derivado de acido borico, por ejemplo, un ester de borato aromatico, o un derivado de acido fenil boronico tal como acido 4-formilfenil boronico o mono- o trietanolamina, y la composicion se puede formular como se describe en por ejemplo WO 92/19709, WO 92/19708, US 5,972,873 o EP 0832174.

[0053] El detergente tambien puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como por ejemplo acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes supensores de suciedad, agentes antiredeposicion de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores opticos, hidrotropos, inhibidores de decoloracion, o perfumes.

[0054] Es actualmente contemplado que en las composiciones detergentes cualquier enzima, en particular la enzima de la invencion, se puede adicionar en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de protefna enzimatica por litro de solucion de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de protefna enzimatica por litro de solucion de lavado, en particular 0,1-1 mg de protefna enzimatica por litro de solucion de lavado.

[0055] Variaciones en condiciones regionales y locales, tales como dureza del agua y temperatura de lavado demandan composiciones detergentes regionales. Los Ejemplos 1 de detergente proporcionan gamas para la composicion de un detergente lfquido.

Materiales y metodos

Enzimas

[0056] En los ejemplos a continuacion las siguientes enzimas disponibles comerciales son usadas. Alcalase® y Savinase® se usan como estandares para comparacion:

Nombre: Tipo de enzima Derivado de o descrito en

Alcalase®: Proteasa, subtilisina Carlsberg B. licheniformis

Savinase®: Proteasa, subtilisina 309 B. lentus

Termamyl®: amilasa B. licheniformis

Novozym 342®: H. Insolens

Amylase A: amilasa La variante de amilasa D183*+G184*+R118K+N195F+R458K. WO 01/66712

Mannan A: Mananasa WO 99/64619

Lipase A: Lipasa variante T231 R+N233R de lipasa T. lanoginosus , WO00/60063

Celulase A: Celulasa H. Insolens, WO 91/17244

Tambien se usa la proteasa designada subtilisina KL y sus variantes. Subtilisina KL es una variante Y167A+R170S+A194P de Savinase (usando numeracion de BPN' )

Ensayos

Compatibilidad de proteasa:

[0057] La compatibilidad de proteasa de las enzimas se determina por preparacion de las composiciones detergentes como se indica en cada Ejemplo y por medicion de la actividad residual de las otras actividades enzimaticas despues de los perfodos indicados en los Ejemplos.

Actividad enzimatica:

[0058] Actividades enzimaticas son medidas usando los bien conocidos metodos estandares reconocidos . Composiciones detergentes

[0059] Las composiciones de detergente usadas en los ejemplos son bien un detergente modelo segun las composiciones proporcionadas a continuacion o detergentes lfquidos comerciales para ropa por ejemplo Tide, Era, Gain, Cheer, Wisk, All, Purex, Arm & Hammer, Sun, Great Value, Ariel, Persil, Total, Skip, Dash, Dixan, Ava o cualquier otra extension de marca o versiones concentradas del detergente lfquido. Si el detergente para ropa comercial usado comprende enzimas estas son inactivadas antes del uso calentando el detergente en un horno de microondas a 85°C durante 5 minutos. Composicion A detergente modelo - ejemplo detergente 1

Grupo: Subnombre Contenido

Tensioactivos: 5-60%

: Sulfonatos 0-30%

: Sulfatos 0-15%

: Jabones 0-15%

: No ionicos 0-15%

: Cationicos 0-15%

: Oxidos de amina 0-10%

: FAGA 0-10%

Solventes: 5-35%

: Etanol 0-10%

: MPG - monopropilenoglicol 0-20%

: DEG - Dietilenoglicol 0-15%

: MPD - metilpropanodiol 0-15%

: MEA - monoetanolamina 0-10%

: TEA - trietanolamina 0-10%

: Hidrotropos como SXS, SCS, etc

: Cumeno sulfonato de sodio

: Xileno sulfonatos de sodio 0-10%

: Otros solventes 0-10%

Constructores: 0-20%

: Citrato de Na 0-15%

: Otros constructores 0-15%

Otros: 0-20%

: Polfmeros 0-5%

: Enzimas 0-10%

: Acido borico y sus derivados 0-5%

Constructores: 0-20%

: Reguladores de espuma 0-10%

: Otros 0-10%

Se anade agua hasta el equilibrio del 100%

Ejemplo 1

5 [0060] A un detergente liquido comercial para ropa se le anadieron proteasas comerciales, amilasas, lipasa, y celulasas

segun estan catalogadas a continuacion (si el detergente ya contiene enzimas entonces estas se pueden inactivar calentando el detergente en un horno microondas hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparacion con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

10 [0061] La estabilidad de las enzimas segun se determina por % de actividad enzimatica residual despues del

almacenamiento a 20°C durante 1, 2 y 4 semanas se muestra en tabla 2-5.

[0062] Condiciones de almacenamiento: 20°C durante 1, 2, 4 semanas en los vasos de vidrio cerrados 15 Tabla 2 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Termamyl 300L: 93 92 89 87

Subtilisina KL

0.3% Termamyl 300 L: 96 98 95 92

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Amylase A 12L: 34 16 10 7

Subtilisina KL

0.3% Amylase A 12 L: 90 86 82 78

Tabla 3 Actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Lipase A 100 L: 12 11 8 9

Subtilisina KL

0.3% Lipase A 100 L: 72 54 46 38

5

10

15

20

25

30

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Cellulase A 5000 L: 85 76 68

Subtilisina KL

0.3% Celulase A 5000 L: 99 87 88

Tabla 5 Actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Celulase A 5000 L: 86 64 57 50

Subtilisina KL

0.3% Celulase A 5000 L: 84 74 65 56

[0063] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimatica de la presente invencion es claramente mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimatica de celulase A 5000L, Lipase A 100L, Termamyl 300L y Amilasa A 12L despues 1, 2, 3 y 4 semanas a 30°C es claramente mejorada si la subtilisina KL es la proteasa. La proteasa de subtilisina KL es tan estable como la proteasa de referencia, Alcalase 2.5L, usada.

Ejemplo 2

[0064] Al detergente lfquido comercial para ropa de Ejemplo 1 se le anadieron proteasas comerciales, amilasas, lipasa, y celulasas como se cataloga a continuacion (si el detergente ya contiene enzimas luego estas son inactivadas calentando el detergente en un microhorno hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparacion con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

[0065] La estabilidad de las enzimas como determinado por % de actividad enzimatica residual despues almacenamiento a 30°C durante 1, 2 y 4 semanas se muestra en la tabla 6-9.

Tabla 6 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Termamyl 300L: 85 78 71 66

Subtilisina KL

0.3% Termamyl 300 L: 93 87 83 73

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Amylase A 12L: 10 5 4 4

Subtilisina KL

0.3% Amylase A 12 L: 81 74 63 59

Tabla 7 Actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Lipase A 100 L: 9 8 5 6

Subtilisina KL

0.3% Lipase A 100 L: 35 17 11 6

Tabla 8 Actividad de celulasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L

0.3% Celulase A 5000 L: 47 24 16 13

Subtilisina KL

0.3% Celulase A 5000 L: 67 66 55 55

Tabla 9 Actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3 4

0.5% Alcalase Ultra 2.5 L: 57 36 29 21

Subtilisina KL: 55 36 24 16

[0066] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimatica de la presente invencion es claramente mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimatica de Cellulase A 5000L, Lipase A 100L, Termamyl 300L y Amylase A 12L despues de 1, 2, 3 y 4 semanas a 30°C es claramente mejorada si subtilisina KL se selecciona como proteasa. La proteasa subtilisina KL es justo tan estable como la

proteasa de referencia, Alcalase 2.5L, usada.

Ejemplo 3

5 [0067] A un detergente liquido comercial para ropa se le anadieron proteasas comerciales, amilasas, y lipasas segun

esta catalogado a continuacion (si el detergente ya contiene enzimas entonces estas se pueden inactivar calentando el detergente en un microondas hasta 85°C durante 5 minutos). Cuando la subtilisina KL fue usada en comparacion con proteasa comercial, la misma cantidad de unidades de actividad fue usada.

10 [0068] La estabilidad de las enzimas segun esta determinado por % de actividad enzimatica residual despues del

almacenamiento a 30°C durante 1, 2, 4 y 8 semanas se muestra en tabla 10-11.

Tabla 10 Actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 4 8

0.4% Alcalase 2.5 L

0.4% Amylase A 12 L: 42 36 19 9

0.4% Savinase 16 L

0.4% Amylase A 12 L: 48 41 24 9

Subtilisina KL

0.4% Amylase A: 77 73 63 42

0.4% Amylase A 12 L

(sin proteasa): 88 89 82 62

15 _____Tabla 11 Actividad de lipasa residual

Semanas: 1 2

0.4% Alcalase 2.5 L

0.4% Lipase A 100 L: 9 8

Subtilisina KL

0.4% Lipase A 100 L: 33 22

0.4% Lipase A 100 L

(sin proteasa): 86 81

[0069] Como se puede observar arriba la compatibilidad enzimatica de la presente invencion es claramente mejorada cuando la subtilisina KL se selecciona como la proteasa en vez de Savinase 16L y Alcalase 2.5L. La estabilidad enzimatica de Lipase A 100L y Amylase A 12L despues 2 y 8 semanas se mejora significativamente si se selecciona 20 subtilisina KL como la proteasa preferida.

Ejemplo 4

25

[0070] Un detergente liquido con la siguiente formulacion como se muestra en la tabla 13 es preparada.

Tabla 13 Formulacion de detergente

Subnombre: Contenido

Cloruro de calcio: 0,1%

LAS-sal de sodio: 11. 81%

Acido sebacico de soja - sal de sodio: 5,94%

Propilenoglicol: 5,05%

C-13-Oxoalcohol etoxilato, 8EO: 9,45%

Fosfonato: 1,00%

Acido sebacico de coco - sal de trietanolamina: 6,50%

Citrato sodico: 1,00%

Etanol: 4,63%

Opacificante: 0,12%

Perfume: 0,35%

Color: -

Agua hasta 100%

Enzimas usadas

30 [0071]

5

10

15

20

25

Proteasa:: Savinase 16L

: Alcalase 2.5L

: Subtilisina KL

: Subtilisina KL M222S

: Subtilisina KL *36D

: Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V

: Subtilisina KL S162R

: Subtilisina KL S99SE+N76D

: Subtilisina KL N76D

: Subtilisina KL A228V

: Subtilisina KL A230V

: Subtilisina KL A228V+A230V

Lipasa:: Lipase A 100L

Amilasa:: Termamyl 300L

Manasa:: Mannan A4,0L

Confiquracion de prueba I

[0072]

Adicion de enzimas:: I) Savinase 16L (0,17mg EP/q)

: II) Subtilisina KL (0,17mq EP/q)

: III) Alcalase 2,5L(0,17mq EP/q)

Amilasa:: Termamyl 300L (0,4%)

Las cantidades de proteasa se dan en la protema enzimatica (activa) por gramos [EP/g].

[0073] Las formulaciones deterqentes se almacenan en 2, y 4 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. Despues del almacenamiento, las actividades de la proteasa residual y de amilasa son determinadas.

Tabla 14 % de actividad de proteasa residual

Semanas: 2 4

0,17mq Savinase 16L + 0,4% Termamyl 300L: 21 15

0,17mq Alcalase 2,5L + 0,4% Termamyl 300L: 23 16

0,17mq Subtilisina KL + 0,4% Termamyl 300L: 16 10

Tabla 15 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 2 4

0,17mq Savinase 16L + 0,4% Termamyl 300L: 90 92

0,17mq Alcalase 2,5L + 0,4% Termamyl 300L: 94 95

0,17mq Subtilisina KL + 0,4% Termamyl 300L: 97 97

Confiquracion de prueba II

[0074]

Adicion de enzimas:: I) Savinase 16L (0,07mq EP/q)

: II) Subtilisina KL (0,07mq EP/q)

: III) Alcalase 2,5L (0,07mq EP/q)

: IV) Subtilisina 2,5KL M222S (0,07mq EP/q)

: V) Subtilisina 2,5KL *36D (0,07mq EP/q)

: VI) Subtilisina KL N76D+S99SE, A230V

Lipasa:: Lipase A 100L (0,2%)

Amilasa:: Termamyl 300L (0,2%)

Manasa:: Mannan A 4,0L (0,2%)

[0075] Las formulaciones deterqentes se almacenan en 2, y 4 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. Despues del almacenamiento las actividades de la proteasa residual, lipasa (Lip.), manasa (Man.) y amilasa (Ter.) son determinadas.

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 21 13

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 24 22

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 18 13

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 50 50

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 59 19

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 84 77

Tabla 17 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 96

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 87 89

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 97

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 101

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 98

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 98

5 ____________Tabla 18 % de actividad de lipasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 5 5

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 5 5

0,07mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 4 4

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 20 15

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 6 6

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 22 17

Tabla 19 % de actividad de manasa residual

Semanas: 2 4

0,07mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 38 25

0,07mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 14 13

0,07mg de Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 62 48

0,07mg Subtilisina KL M222S 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 84

0,07mg Subtilisina KL *36D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 63 54

0,07mg Subtilisina KL N76D+S99SE+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 95

Confiauracion de prueba III

Adicion de enzimas:: I) Savinase 16L (0,05mg EP/g det.)

: II) Subtilisina KL (0,05mg EP/g det.)

: III) Alcalase 2,5L (0,05mg EP/g det.)

: VII) Subtilisina 2,5KL S162R (0,05mg EP/g det.)

: VIII) Subtilisina KL S99SE+N76D (0,05mg EP/g det.)

: IX) Subtilisina KL N76D (0,05mg EP/g det.)

: X) Subtilisina KL A228V (0,05mg EP/g det.)

: XI) Subtilisina KL A230V (0,05mg EP/g det.)

: XII) Subtilisina KL A228V, A230V (0,05mg EP/g det.)

: EP = protefna enzimatica

: det = detergente

Lipasa:: Lipase A 100L (0,2%)

Amilasa:: Termamyl 300L (0,2%)

Manasa:: Mannan A 4,0L (0,2%)

5

[0077] Las formulaciones detergentes se almacenan en 1, 2 y 3 semanas a 30°C en vasos de vidrio cerrados. Despues del almacenamiento las actividades de proteasa residual, lipasa (Lip.), manasa (Man.) y amilasa (Ter.) son determinadas.

Tabla 20 % de actividad de proteasa residual

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 20 12

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 85 37 37

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 70 17 17

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 45 12 12

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 75 77

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 94 95 89

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 85 83 78

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 87 80

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 89

Tabla 21 % de actividad de amilasa residual

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 96

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 96 97

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 98 97

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 97 97

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 99 98 98

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisinaa KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 100 100 100

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 30 5 5

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 10 6 6

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 59 8 5

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 82 14 6

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 81 15 20

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 49 49 57

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 53 52 47

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 65 59 52

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 61 55 48

Tabla 23 % de actividad residual de Manasa

Semanas: 1 2 3

0,05mg Savinase 16L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 93 44 27

0,05mg Alcalase 2,5L 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 81 29 24

0,05mg Subtilisina KL 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 71 58

0,05mg Subtilisina KL S162R 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 105 77 73

0,05mg Subtilisina KL S99SE+N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 98 98 100

0,05mg Subtilisina KL N76D 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 89 96 90

0,05mg Subtilisina KL A228V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 95 96 92

0,05mg Subtilisina KL A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 107 90 89

0,05mg Subtilisina KL A228V+A230V 0,2% Ter., 0,2% Lip. y 0,2% Man.: 97 88 84

5 Referencias citadas en la descripcion

[0078] Esta lista de referencias citada por el solicitante solo es por conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. A pesar de que se ha tenido mucho cuidado en la compilacion de las referencias, los errores u omisiones no pueden ser excluidos y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este sentido.

10

Documentos de Patentes citados en la descripcion

[0079]

• WO8906279A100031

15 • WO9820115A 100041 100171

• GB1296839A r00061

• US4537706A TO0061

• WO9732961 r00061

• WO9623873A 100061 100391

20 • US6093562A r00061

• US2003180933A r00071

• WO2001066712A r00121

• WO2006002643A r00121

• WO200060060A r00121 r00391

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

• WO1995024471A r00131

• WO9117244A 100131 100161 10056!

• WO2002099091A r0013l

• W02000060063A r0014l [00371

• W09964619A 100151 100421 100561

• W09100345A100211

• W00071691A100221

• W09613580A100371

• W09506720A100371

• W09627002A100371

• W09612012A100371

• W09205249A r00381

• W09401541A r00381

• EP407225A r00381

• EP260105A r00381

• W09535381A r00381

• W09600292A r00381

• W09530744A r00381

• W09425578A100381

• W09514783A r00381

• W09522615A r00381

• W09704079A r00381

• W09707202A r00381

• W09402597A r00391

• W09418314A r00391

• W09743424A r00391

• US5648263A r00401

• US5691178A r00401

• US5776757A r00401

• W08909259A r00401

• EP0531372A r00401

• W09611262A r00401

• W09629397A r00401

• W09808940A r00401

• W09407998A r00401

• EP0531315A r00401

• US5457046A r00401

• US5686593A r00401

• US5763254A r00401

• W09524471A r00401

• W09812307A r00401

• DK9800299W r00401

• W09324618A r00411

• W09510602A100411

• W09815257A r00411

• W09535362A r00421

• EP238216A r00441

• W09219709A [00521

• W09219708A [00521

• US5972873A [00521

• EP0832174A [00521

• W00166712A [00561

• W00060063A [00561

Literatura citada en la descripcion, que no es de patentes

• SIEZEN et al. Protein Engng., 1991, vol. 4, 719-737 100231

• DYNANTIJAN Nature, 1985, vol. 316, 774-78 100281

Claims

5

10

15

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25

30

35

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65

1. Composicion de detergente en gel o liquida que comprende subtilisina KL o sus variantes en combinacion con al

menos una lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, donde la proporcion en peso entre el contenido de subtilisina KL o sus

variantes al contenido de lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 100, preferiblemente de 0,01 a 10,

especialmente de 0,5 a 5, especialmente de 1 a 3 y

donde la variante de subtilisina KL es una del grupo que consiste en

*36D

P14T

N18K

N62D

V83L

A133P

E136Q

E136R

E136K

N140R

N140K

S141E

S141N

S141Y

S141R

T143R

T143K

S153R

S156R

A160R

S162R

S162K

I165R

I165K

Y171R

Y171K

A172R

A172K

A174R

N173R

N173K

A174K

N76D

Y176R

Y176K

A187R

A187K

S188P

S190P

Q191R

Y192R

Y192R

Q191P

Y192A

Y192P

D197N

D197R

D197E

D197K

D197G

A228V

A230V

T260R

T260K

G264R

G264K

S265T

S265R

S265K

5

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N218S

M222S

M222A

M222G

M222T

M222V

M222S

N243R

V244R

N248R

K251R N252R N261R

S9R+A15T+T22A+N218S+K251R

S9R+A15T+T22A+V841+N218S

V30I+V139L+N218S

V84I+V139L+N218S

N76D+N218S

N76D+A228V

N76D+A230V

N76D+N218S+A230V

N76D+A228V+A230V

N218S+R247Q

N218S+R247H

N218S+R247E

N218S+R247K

D181N+N218S

N218S+A230V

K251R+S265K

P14T+N18K

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH=

T274H+R275HHHHH

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH

S87N+S101G,V104N

*36D+N76D+H120D+G195E+K235L

A133P+M222S

*96aA

*96aA+A98T *96aA+A133P *96aA+A98T+A133P *96aA+A98T +N218S *97aP+A98T+N218S *98aT,

*98aT+S99N+N218S

G97D+*98aT+N218S

*99aE=S99SE

*99aD=S99SD

*99aD+M222S=S99SD+M222S

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE

N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V

S99A+*99aD=S99AD

S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S

S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S

S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V

A228V+A230V

*130aL+P194A
2. Composicion detergente en gel o liquida segun la reivindicacion 1, donde la lipasa es seleccionada del grupo que comprende lipasas de Humicola (Thermomyces), por ejemplo de H. lanuginosa (T. Lanuginosus) o de H. insolens, lipasas de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes, P. cepacia, P. stutzeri, P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp., P. wisconsinensis, lipasas de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis, B. stearothermophilus o B. pumilus y sus variantes creadas qufmicamente o geneticamente.
3. Composicion detergente en gel o liquida segun la reivindicacion 1 o 2, donde la amilasa es seleccionada del grupo que comprende amilasas de Bacillus, por ejemplo B. Ilchemiformis.
4. Composicion detergente en gel o liquida segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la celulasa es

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65

seleccionada del genero Bacillus, Pseudomonas, Myceliophthora, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum.
5. Composicion detergente en gel o lfquida segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el contenido de subtilisina KL o sus variantes es de 0,001 a 5 % en peso y si estan presentes el contenido de cada una de las siguientes lipasa, amilasa, celulasa o mananasa es de 0,001 a 5 % en peso.
6. Uso de subtilisina KL o sus variantes en combinacion con al menos una lipasa, amilasa, celulasa o mananasa, para la preparacion de composiciones detergentes de tipo gel o lfquidas acuosas con estabilidad mejorada de las enzimas no proteasas

donde la variante de subtilisina KL es una del grupo que consiste en

*36D

P14T

N18K

N62D

V83L

A133P

E136Q

E136R

E136K

N140R

N140K

S141E

S141N

S141Y

S141R

T143R

T143K

S153R

S156R

A160R

S162R

S162K

I165R

I165K

Y171R

Y171 K

A172R

A172K

A174R

N173R

N173K

A174K

N76D

Y176R

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A187R

A187K

S188P

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Q191R

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Q191P

Y192A

Y192P

D197N

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A228V

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G264R

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N218S

M222S

M222A

M222G

M222T

M222V

M222S

N243R

V244R

N248R

K251R

N252R

N261R

S9R+A15T+T22A+N218S+K251R

S9R+A15T+T22A+V841+N218S

V30I+V139L+N218S

V84I+V139L+N218S

N76D+N218S

N76D+A228V

N76D+A230V

N76D+N218S+A230V

N76D+A228V+A230V

N218S+R247Q

N218S+R247H

N218S+R247E

N218S+R247K

D181N+N218S

N218S+A230V

K251R+S265K

P14T+N18K

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH=

T274H+R275HHHHH

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH

S87N+S101G,V104N

*36D+N76D+H120D+G195E+K235L

A133P+M222S

*96aA

*96aA+A98T *96aA+A133P *96aA+A98T+A133P *96aA+A98T +N218S *97aP+A98T+N218S *98aT,

*98aT+S99N+N218S

G97D+*98aT+N218S

*99aE=S99SE

*99aD=S99SD

*99aD+M222S=S99SD+M222S

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE

N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V

S99A+*99aD=S99AD

S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S

S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S

S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V

A228V+A230V

*130aL+P194A
7. Proceso para mejorar la estabilidad de las enzimas no proteasas en combinacion de una enzima proteasa con otras enzimas en una composicion detergente en gel o liquida que comprende una proteasa y al menos una enzima no proteasa, donde la composicion detergente en gel o liquida es preparada usando la subtilisina KL o una variante de la misma como la enzima proteasa, donde al menos una enzima no proteasa es seleccionada entre lipasa, amilasa, celulasa o mananasa y donde la variante de subtilisina KL es una del grupo que consiste en.

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I165R

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Y171R

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A228V

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N243R V244R N248R K251R N252R N261 R

S9R+A15T+T22A+N218S+K251R

S9R+A15T+T22A+V841+N218S

V30I+V139L+N218S

V84I+V139L+N218S

N76D+N218S

N76D+A228V

N76D+A230V

N76D+N218S+A230V

N76D+A228V+A230V

N218S+R247Q

N218S+R247H

N218S+R247E

N218S+R247K

D181N+N218S

N218S+A230V

K251R+S265K

P14T+N18K

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH=

T274H+R275HHHHH

T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH=T274H+R275HHHH

S87N+S101G,V104N

*36D+N76D+H120D+G195E+K235L

A133P+M222S

*96aA

*96aA+A98T *96aA+A133P *96aA+A98T+A133P *96aA+A98T +N218S *97aP+A98T+N218S *98aT,

*98aT+S99N+N218S

G97D+*98aT+N218S

*99aE=S99SE

*99aD=S99SD

*99aD+M222S=S99SD+M222S

N76D+s99A+*99aE=N76D+S99AE

N76D+*99aD+A230V=N76D+S99SD+A230V

S99A+*99aD=S99AD

S99A+*99aD+M222S=S99AD+M222S

S99A+*99aD+N218S=S99AD+N218S

S99A+*99aE+A230V=S99AE+A230V

A228V+A230V

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