CN101522878A - 洗涤剂组合物及其中酶组合的使用 - Google Patents

洗涤剂组合物及其中酶组合的使用 Download PDF

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CN101522878A CNA2007800375284A CN200780037528A CN101522878A CN 101522878 A CN101522878 A CN 101522878A CN A2007800375284 A CNA2007800375284 A CN A2007800375284A CN 200780037528 A CN200780037528 A CN 200780037528A CN 101522878 A CN101522878 A CN 101522878A
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Abstract

本发明披露了新的洗涤剂组合物及其中酶组合的使用。对于所述组合物中存在的非蛋白酶酶类，该组合物具有增强的非蛋白酶酶类稳定性。

Description

洗涤剂组合物及其中酶组合的使用
本发明涉及包含特定酶组合的水性液体或凝胶型洗涤剂(detergent)组合物。所述洗涤剂组合物可以进一步包含硼酸或能够在所述组合物中形成硼酸的硼化合物、多羟基化合物(优选丙二醇)、和相对高水平的钙离子(用以使蛋白酶和其它酶类的选定组合稳定化)的组合。本发明还涉及用于在蛋白酶与其它酶的组合中于液体或凝胶洗涤剂组合物中增强非蛋白酶酶类的稳定性的方法(enhancing stability of the non protease enzymes in combination of a proteaseenzyme with other enzymes in a liquid or gel detergent composition)。本发明进一步涉及特定的蛋白酶酶类及它们在洗涤剂组合物中的用途。
发明背景
蛋白酶用于洗涤剂组合物已经有大约50年了，而且在过去的10年里通过许多前体蛋白酶的蛋白质工程开发了许多此类蛋白酶。
市场上最成功的前体蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶309，或称作
Figure A200780037528D0004135631QIETU
。Savinase的蛋白质工程最初披露于1989年的WO 89/06279。随后，该申请人和其它公司如Genencor International，Inc.、Procter & Gamble、Unilever NV等提交了为数众多涉及Savinase的蛋白质工程的专利申请。还有，Novozymes A/S和Genencor International，Inc出售多种Savinase变体。
包含修饰Y167A+R170S+A194P的特定Savinase变体披露于WO98/20115。在本申请中，我们将此变体称作枯草杆菌蛋白酶KL。
含有酶(包括蛋白酶)的水性液体和凝胶洗涤剂组合物是本领域公知的。此类组合物所遇到的主要问题在于确保酶在组合物中具有足够的贮存稳定性。在存在蛋白酶的情况下使淀粉酶保持稳定是特别困难的，因为蛋白酶不仅能容易地降解水性液体或凝胶洗涤剂组合物中的淀粉酶，而且蛋白酶常常会降解其它酶，如脂肪酶、纤维素酶等。
高碱性淀粉酶如α-淀粉酶记载于英国说明书No.1,296,839。包含硼酸或碱金属硼酸盐与钙离子及优选与多元醇的混合物的酶稳定系统之用途披露于美国专利4,537,706，Severson。提供改进的清洁处理(cleaning)和染料清除的某些α-淀粉酶披露于WO97/32961，Baeck等、WO 96/23873和美国专利6,093,562。
发明内容
本发明涉及洗涤剂组合物，其包含与至少一种其它酶组合的枯草杆菌蛋白酶KL和/或其变体，所述其它酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶(carbohydrase)；纤维素酶；果胶酶；果胶酸裂合酶(pectate lyase)；半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶；氧化酶例如漆酶；和/或过氧化物酶。
本发明的洗涤剂组合物中所使用的淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的淀粉酶和其它淀粉酶，如WO 2001/066712、WO 2006/002643、WO 2000/60060中披露的那些。
本发明的洗涤剂组合物中所使用的纤维素酶是如WO 1995/024471、WO91/17244、WO 2002/099091中披露的那些。
本发明的洗涤剂组合物中所使用的脂肪酶是如WO 2000/060063中披露的那些。
本发明的洗涤剂组合物中所使用的甘露聚糖酶是如WO 99/64619中披露的那些，例如SEQ ID NO：2。
本发明的洗涤剂组合物中所使用的内切葡聚糖酶是如WO 91/17244中披露的那些。
本发明的枯草杆菌蛋白酶KL变体是如WO 98/20115中指明的那些，尤其是表1中指出的那些。
表1：枯草杆菌蛋白酶KL中的突变
无
*36D
P14T
N18K
N62D
V83L
A133P
E136Q
E136R
E136K
N140R
N140K
S141E
S141N
S141Y
S141R
T143R
T143K
S153R
S156R
A160R
S162R
S162K
I165R
I165K
Y171R
Y171K
A172R
A172K
A174R
N173R
N173K
A174K
N76D
Y176R
Y176K
A187R
A187K
S188P
S190P
Q191R
Y192R
Y192R
Q191P
Y192A
Y192P
D197N
D197R
D197E
D197K
D197G
A228V
A230V
T260R
T260K
G264R
G264K
S265T
S265R
S265K
N218S
M222S
M222A
M222G
M222T
M222V
M222S
N243R
V244R
N248R
K251R
N252R
N261R
组合
S9R+A15T+T22A+N218S+K251R
S9R+A15T+T22A+V84I+N218S
V30I+V139L+N218S
V84I+V139L+N218S
N76D+N218S
N76D+A228V
N76D+A230V
N76D+N218S+A230V
N76D+A228V+A230V
N218S+R247Q
N218S+R247H
N218S+R247E
N218S+R247K
D181N+N218S
N218S+A230V
K251R+S265K
P14T+N18K
T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH+*275dH＝
T274H+R275HHHHH
T274H+R275H+*275aH+*275bH+*275cH＝T274H+R275HHHH
S87N+S101G，V104N
*36D+N76D+H120D+G195E+K235L
A133P+M222S
插入及与其的组合
*96aA
*96aA+A98T
*96aA+A133P
*96aA+A98T+A133P
*96aA+A98T+N218S
*97aP+A98T+N218S
*98aT，
*98aT+S99N+N218S
G97D+*98aT+N218S
*99aE＝S99SE
*99aD＝S99SD
*99aD+M222S＝S99SD+M222S
N76D+s99A+*99aE＝N76D+S99AE
N76D+*99aD+A230V＝N76D+S99SD+A230V
S99A+*99aD＝S99AD
S99A+*99aD+M222S＝S99AD+M222S
S99A+*99aD+N218S＝S99AD+N218S
S99A+*99aE+A230V＝S99AE+A230V
A228V+A230V
*130aL+P194A
出人意料地发现枯草杆菌蛋白酶KL及其变体显示与液体洗涤剂组合物中所使用的其它酶(如脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶/氧化酶和半纤维素酶)的显著相容性。这种特性导致与枯草杆菌蛋白酶KL及其变体组合的这些酶的残余活性与存在其它蛋白酶时的残余活性相比显著升高，即使在长期贮存后也是如此。最后，结果是洗涤剂组合物的性能得到改善，或者，可以降低酶量但获得相似的结果。
变体名称的命名法和规则
在描述根据本发明产生或预期的各种枯草杆菌蛋白酶KL酶变体时，采用以下命名法和规则以便于引用：首先，通过比对亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)来限定参照系。
可以通过9.1版GCG软件包的GAP程序来获得比对，其中使用以下参数来给予变体数目：缺口创建罚分＝8，缺口延伸罚分＝8，而所有其它参数保持其缺省值。
另一种方法是使用已知的、公认的枯草蛋白酶(subtilase)之间的比对，如WO 91/00345中指明的比对。在大多数情况中，差异是根本不重要的。
由此，可以相对于BASBPN(SEQ ID NO.1)限定出许多删除和插入。关于在多肽中通过基因操作而引入的修饰的命名法的详细说明，参考WO00/71691第7-12页，在此通过提及来并入。
氨基酸位置/残基的编号方式。如果没有提到其它内容，那么本申请中所使用的氨基酸编号方式对应于枯草蛋白酶BPN’(BASBPN)序列的编号方式。关于BPN’序列的进一步说明，见Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737。
“
Figure A200780037528D0010140142QIETU
”
Figure A200780037528D0010140148QIETU
由Novozymes A/S销售。它是来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草杆菌蛋白酶309。
枯草杆菌蛋白酶KL变体的修饰。术语“修饰”在用于本申请时定义为包括对编码枯草杆菌蛋白酶KL的DNA的化学修饰以及遗传操作。修饰可以是感兴趣氨基酸中的或感兴趣氨基酸处的氨基酸侧链替换、替代、删除和/或插入。
枯草蛋白酶变体。在本发明的语境中，术语枯草蛋白酶变体或突变型枯草蛋白酶意指由表达衍生自亲本微生物的突变型基因的生物体生成的枯草蛋白酶，所述亲本微生物具有原始或亲本基因且产生相应的亲本酶，所述亲本基因得到了突变以产生突变型基因，所述突变型基因在合适的宿主中表达时产生所述突变型枯草蛋白酶蛋白酶。
同源枯草蛋白酶序列。两条氨基酸序列之间的同源性在此语境中通过参数“同一性”来描述。为了确定两种枯草蛋白酶之间的同一性程度，可以使用相同的设置来应用9.1版GCG软件包的GAP程序(见下文)。在氨基酸比对之外，来自该程序的输出是两条序列之间“百分比同一性”的计算结果。基于此说明，鉴定可以根据本发明修饰的合适的同源枯草蛋白酶对于本领域技术人员而言是常规的。
分离的多核苷酸。术语“分离的”当用于多核苷酸时意味着该多核苷酸已经自其天然遗传环境中取出且因此不含其它外来的或不想要的编码序列，而且是适合于在遗传工程蛋白质产生系统内使用的形式。此类分离的分子是那些与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。分离的本发明DNA分子不含通常与其相连的其它基因，但是可以包括天然存在的5′和3′非翻译区，如启动子和终止子。相连区域的鉴定对于本领域普通技术人员是显而易见的(参见例如Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”也可以称作“克隆的多核苷酸”。
分离的蛋白质。在用于蛋白质时，术语“分离的”指该蛋白质已经自其天然环境中取出。在一种优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。分离的蛋白质是超过10％纯的，优选超过20％纯的，更优选超过30％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。而且，优选以高度纯化的形式来提供蛋白质，即超过40％纯的、超过60％纯的、超过80％纯的、更优选超过95％纯的、且最优选超过99％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。术语“分离的蛋白质”也可以称作“纯化的蛋白质”。
同源杂质。术语“同源杂质”意指源自同源细胞的任何杂质(例如与本发明枯草蛋白酶不同的多肽)，即本发明的枯草蛋白酶最初就是源自该同源细胞的。
得自。术语“得自”在本申请中与特定微生物来源相连使用时意指该多核苷酸和/或枯草蛋白酶由该特定来源产生或者由其中插入有来自该来源的基因的细胞产生。
底物。术语“底物”在本申请中与蛋白酶的底物相连使用时应当解释为其最宽的形式，即包括含有至少一个对枯草杆菌蛋白酶蛋白酶的水解作用易感的肽(酰胺)键的化合物。
产物。术语“产物”在本发明的语境中与衍生自蛋白酶酶促反应的产物相连使用时应当解释为包括涉及枯草蛋白酶蛋白酶的水解反应的产物。产物可以是后续水解反应的底物。
洗涤性能。在本发明的语境中，术语“洗涤性能”用作在例如洗涤或硬表面清洁过程中酶去除有待清洁的物体上存在的蛋白质或有机污迹的能力。
本发明的洗涤剂组合物可以配制成例如手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适合于玷污织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或者配制成供普通家庭硬表面清洁操作使用的洗涤剂组合物，或者配制成供手洗或机洗碗碟清洗操作使用。
在一个具体的方面，本发明提供了包含本发明的酶的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及所述洗涤剂组合物包含至少一种其它酶，如蛋白酶、脂肪酶；角质酶；淀粉酶；糖酶；纤维素酶；果胶酶；果胶酸裂合酶；半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶；氧化酶例如漆酶；和/或过氧化物酶。
一般而言，所选酶的性质应当与所选洗涤剂相容(即最适pH、与其它酶和非酶组分的相容性等)，而且所述酶应当以有效量存在。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(Humicola)(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如来自特异腐质霉(H.insolens)(记载于WO 96/13580)的脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)的脂肪酶，或芽孢杆菌属(Bacillus)的脂肪酶(披露于WO 2000/060063)。
其它例子有脂肪酶变体，如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中记载的那些。优选的商业上使用的脂肪酶包括
Figure A200780037528D00121
Lipolase 
Figure A200780037528D00122
和
Figure A200780037528D00123
(Novozymes A/S)。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括例如得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶。有用淀粉酶的例子有WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO2000/60060、和WO 97/43424中记载的变体，尤其是在一个或多个以下位置具有替代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。商业性使用的淀粉酶有
Figure A200780037528D00124
Stainzyme 和
Figure A200780037528D00126
(Novozymes A/S)、RapidaseTM、PurastarTM和Purastar OxAmTM(Genencor International Inc.)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中披露的，由特异腐质酶、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有色彩维护(colour care)和白度维持(whiteness maintenance)益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的例子有EP 0 531 372、WO96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中记载的纤维素酶。其它例子有纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中记载的那些。商业性使用的纤维素酶包括
Figure A200780037528D00131
Figure A200780037528D00132
和
Figure A200780037528D00133
(Novozymes A/S)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(Genencor Int.Inc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中记载的那些。商业性使用的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
半纤维素酶：合适的半纤维素酶包括那些细菌或真菌起源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的半纤维素酶包括甘露聚糖酶、地衣聚糖酶(lichenase)、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶(glucorunidase)、阿魏酸(ferulic acid)酯酶、香豆素(coumaricacid)酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidase)(如WO 95/35362中所记载的)。合适的甘露聚糖酶记载于WO 99/64619。商业性使用的半纤维素酶包括
Figure A200780037528D0013140416QIETU
(Novozymes A/S)。
可以通过添加分开的、含有一种或多种酶的添加剂或通过添加组合的、含有所有这些酶的添加剂将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如凝胶、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制物是液体，特别是经过稳定化的液体(stabilized liquid)、或浆体。
可以根据已确立的方法例如通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来使液体酶制备物稳定化。受到保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如糊剂、凝胶或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有多至70％的水和0-30％的有机溶剂，或者是非水性的。
洗涤剂组合物可以含有一种或多种表面活性剂，其可以是非离子型的(包括半极性的)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％的水平存在。
在包含阴离子表面活性剂的情况中，洗涤剂通常会含有约1％-约40％的阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐(linear alkylbenzenesulfonate)、α-烯烃磺酸盐(alpha-olefinsulfonate)、烷基硫酸酯盐(alkyl sulfate)(脂肪醇硫酸酯盐(fatty alcohol sulfate))、醇乙氧基硫酸酯盐(alcohol ethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯盐(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯(alpha-sulfo fatty acidmethyl ester)、烷基或烯基琥珀酸(alkyl-or alkenylsuccinic acid)或皂(soap)。
在包含非子表面活性剂的情况中，洗涤剂通常会含有约0.2％-约40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物(alcohol ethoxylate)、壬基酚乙氧基化物(nonylphenol ethoxylate)、烷基多糖苷(alkylpoly-glycoside)、烷基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acidmonoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺(fatty acid monoethanolamide)、多羟基烷基脂肪酸酰胺(polyhydroxy alkyl fatty acid amide)、或葡糖胺的N-酰基N-烃基衍生物(N-acyl N-alkyl derivatives of glucosamine)(“葡糖酰胺”(glucamides))。
洗涤剂可以含有0-65％的洗涤剂增清剂(builder)或络合剂(complexingagent)如沸石(zeolite)、二磷酸盐(diphosphate)、三磷酸盐(triphosphate)、膦酸盐(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、柠檬酸盐(citrate)、氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid)、烷基或烯基琥珀酸(alkyl-or alkenylsuccinic acid)、可溶性硅酸盐(soluble silicate)或层状硅酸盐(layeredsilicates)(例如Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白系统，其可以包含H2O2源，如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。或者，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。
本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规稳定剂来实现稳定，例如多元醇如丙二醇、二乙二醇、甲基丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸或单或三乙醇胺，而且可以如例如WO 92/19709、WO 92/19708、US 5,972,873或EP0832174中所述配制所述组合物。
洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调节剂(fabricconditioners)(包括粘土(clays))、增泡剂(foam boosters)、抑泡剂(sudssuppressors)、抗腐蚀剂(anti-corrosion agents)、悬污剂(soil-suspending agents)、抗污物再沉积剂(anti-soil redeposition agents)、染料(dyes)、杀细菌剂(bactericides)、光学增亮剂(optical brighteners)、助水溶剂(hydrotropes)、晦暗抑制剂(tarnish inhibitors)或香料(perfumes)。
在洗涤剂组合物中，可以以对应于0.01-100mg酶蛋白质每升洗涤液、优选0.05-5mg酶蛋白质每升洗涤液、特别是0.1-1mg酶蛋白质每升洗涤液的量添加任何酶，特别是本发明的酶。
地方性和地区性条件(如水硬度和洗涤温度)的变异要求地区性洗涤剂组合物。洗涤剂实例1提供了液体洗涤剂的组合物的范围。
材料和方法
酶
在下文实施例中使用以下商品化酶。使用
Figure A200780037528D0015140550QIETU
和
Figure A200780037528D0015140554QIETU
作为比较的标准：
Figure A200780037528D00151
还使用了称作枯草杆菌蛋白酶KL的蛋白酶及其变体。
枯草杆菌蛋白酶KL是Savinase的Y167A+R170S+A194P变体(使用BPN’编号方式)。
测定法
蛋白酶相容性：
酶的蛋白酶相容性通过如下测定：如每个实施例中所示制备洗涤剂组合物，并在该实施例中所指示的时间段后测量其它酶活性的残余活性。
酶活性：
酶活性使用公知的、公认的标准方法来测量。
洗涤剂组合物
实施例中所使用的洗涤剂组合物或是根据下文所提供的组合物的模式洗涤剂，或是商品化液体洗衣洗涤剂(例如Tide、Era、Gain、Cheer、Wisk、All、Purex、Arm & Hammer、Sun、Great Value、Ariel、Persil、Total、Skip、Dash、Dixan、Ava或任何其它品牌外延)或液体洗涤剂的浓缩型式。如果所使用的商品化洗衣洗涤剂包含酶，那么在使用前通过将洗涤剂在微波炉中于85℃加热5分钟来灭活这些酶。
模式洗涤剂组合物A-洗涤剂实施例1
Figure A200780037528D00161
Figure A200780037528D00171
添加水至100％的余额。
实施例1
向一种用于洗衣的商品化液体洗涤剂中添加如下文所列的商品化蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、和纤维素酶(如果该洗涤剂已经含有酶，那么可以通过将洗涤剂在微波炉中于高至85℃加热5分钟来灭活这些酶)。在使用枯草杆菌蛋白酶KL与商品化蛋白酶进行比较时，使用相同量的活性单位。
表2-5显示了酶的稳定性，其是通过于20℃贮存1、2和4周后的％残余酶活性来测定的。
贮存条件：20℃，1、2、4周，在密闭玻璃容器中。
表2：残余淀粉酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Termamyl 300L    93 92 89 87
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Termamyl 300L 96 98 95 92
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Amylase A 12L     34 16 10 7
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Amylase A 12L  90 86 82 78
表3：残余脂肪酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Lipase A 100L    12 11 8 9
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Lipase A 100L 72 54 46 38
表4：残余纤维素酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Cellulase A 5000L   85 76 68
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Cellulase A 5000L 99 87 88
表5：残余蛋白酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Cellulase A 5000L   86 64 57 50
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Cellulase A 5000L 84 74 65 56
从上文中可以看出，在选择枯草杆菌蛋白酶KL作为蛋白酶以替代Alcalase 2.5L时，本发明的酶相容性显然得到了改善。如果蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶KL的话，Cellulase A 5000L、Lipase A 100L、Termamyl 300L和Amylase A 12L于30℃贮存1、2、3和4周后的酶稳定性显然得到了改善。枯草杆菌蛋白酶KL蛋白酶就像所使用的参照蛋白酶Alcalase 2.5L一样稳定。
实施例2
向实施例1的用于衣物的商品化液体洗涤剂中添加如下文所列的商品化蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶(如果该洗涤剂已经含有酶，那么可以通过将洗涤剂在微波炉中于高至85℃加热5分钟来灭活这些酶)。在使用枯草杆菌蛋白酶KL与商品化蛋白酶进行比较时，使用相同量的活性单位。
表6-9显示了酶的稳定性，其是通过于30℃贮存1、2和4周后的％残余酶活性来测定的。
表6：残余淀粉酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Termamyl 300L    85 78 71 66
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Termamyl 300L 93 87 83 73
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Amylase A 12L      10 5 4 4
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Amylase A 12L  81 74 63 59
表7：残余脂肪酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Lipase A 100L     9 8 5 6
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Lipase A 100L 35 17 11 6
表8：残余纤维素酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L0.3％ Cellulase A 5000L    47 24 16 13
枯草杆菌蛋白酶KL0.3％ Cellulase A 5000L 67 66 55 55
表9：残余蛋白酶活性
 
周 1 2 3 4
0.5％ Alcalase Ultra 2.5L 57 36 29 21
枯草杆菌蛋白酶KL 55 36 24 16
从上文中可以看出，在选择枯草杆菌蛋白酶KL作为蛋白酶以替代Alcalase 2.5L时，本发明的酶相容性显然得到了改善。如果选择枯草杆菌蛋白酶KL作为蛋白酶的话，Cellulase A 5000L、Lipase A 100L、Termamyl 300L和Amylase A 12L于30℃贮存1、2、3和4周后的酶稳定性显然得到了改善。枯草杆菌蛋白酶KL蛋白酶就像所使用的参照蛋白酶Alcalase 2.5L一样稳定。
实施例3
向一种用于衣物的商品化液体洗涤剂中添加如下文所列的商品化蛋白酶、淀粉酶、和脂肪酶(如果该洗涤剂已经含有酶，那么可以通过将洗涤剂在微波炉中于高至85℃加热5分钟来灭活这些酶)。在使用枯草杆菌蛋白酶KL与商品化蛋白酶进行比较时，使用相同量的活性单位。
表10-11显示了酶的稳定性，其是通过于30℃贮存1、2、4和8周后的％残余酶活性来测定的。
表10：残余淀粉酶活性
 
周 1 2 4 8
0.4％ Alcalase 2.5L0.4％ Amylase A 12L 42 36 19 9
0.4％ Savinase 16L0.4％ Amylase A 12L   48 41 24 9
枯草杆菌蛋白酶KL0.4％ Amylase A     77 73 63 42
0.4％ Amylase A 12L(无蛋白酶)      88 89 82 62
表11：残余脂肪酶活性
 
周 1 2
0.4％ Alcalase 2.5L0.4％ Lipase A 100L 9 8
枯草杆菌蛋白酶KL0.4％ Lipase A 100L 33 22
0.4％ Lipase A 100L(无蛋白酶)       86 81
从上文中可以看出，在选择枯草杆菌蛋白酶KL作为蛋白酶以替代Savinase 16L和Alcalase 2.5L时，本发明的酶相容性显然得到了改善。如果选择枯草杆菌蛋白酶KL作为优选蛋白酶的话，Lipase A 100L和Amylase A 12L贮存2和8周后的酶稳定性显然得到了显著改善。
实施例4
制备具有表13所示如下配方的液体洗涤剂。
表13：洗涤剂配方
 
子名 含量
氯化钙 0.1％
LAS-钠盐 11.81％
大豆癸二酸-钠盐 5.94％
丙二醇 5.05％
C-13-氧醇乙氧基化物(C-13-Oxoalcohol ethoxylat)，8EO 9.45％
膦酸盐 1.00％
椰子癸二酸-三乙醇胺盐 6.50％
柠檬酸钠 1.00％
乙醇 4.63％
遮光剂(Opacifier) 0.12％
香料 0.35％
颜料(Colour)
水，至100％
所使用的酶
蛋白酶：Savinase 16L
        Alcalase 2.5L
        枯草杆菌蛋白酶KL
        枯草杆菌蛋白酶KL M222S
        枯草杆菌蛋白酶KL*36D
        枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE+A230V
        枯草杆菌蛋白酶KL S162R
        枯草杆菌蛋白酶KL S99SE+N76D
        枯草杆菌蛋白酶KL N76D
        枯草杆菌蛋白酶KL A228V
        枯草杆菌蛋白酶KL A230V
        枯草杆菌蛋白酶KL A228V+A230V
脂肪酶：Lipase A 100L
淀粉酶：Termamyl 300L
甘露聚糖酶：Mannan A 4.0L
测试设置I
添加酶：I)Savinase 16L(0.17mg EP/g)
II)枯草杆菌蛋白酶KL(0.17mg EP/g)
III)Alcalase 2.5L(0.17mg EP/g)
淀粉酶：Termamyl 300L(0.4％)
蛋白酶的量以酶蛋白质(有活性的)每克[EP/g]给出。
将洗涤剂配制物在密闭玻璃容器中于30℃贮存2和4周。贮存后，测定残余蛋白酶和淀粉酶活性。
表14：％残余蛋白酶活性
 
周 2 4
0.17mg Savinase 16L+0.4％ Termamyl 300L   21 15
0.17mg Alcalase 2.5L+0.4％ Termamyl 300L  23 16
0.17mg枯草杆菌蛋白酶KL+0.4％ Termamyl 300L        16 10
表15：％残余淀粉酶活性
 
周 2 4
0.17mg Savinase 16L+0.4％ Termamyl 300L   90 92
0.17mg Alcalase 2.5L+0.4％ Termamyl 300L  94 95
0.17mg枯草杆菌蛋白酶KL+0.4％ Termamyl 300L        97 97
测试设置II
添加酶：I)Savinase 16L(0.07mg EP/g)
        II)枯草杆菌蛋白酶KL(0.07mg EP/g)
        III)Alcalase 2.5L(0.07mg EP/g)
        IV)枯草杆菌蛋白酶2.5KL M222S(0.07mg EP/g)
        V)枯草杆菌蛋白酶2.5KL*36D(0.07mg EP/g)
        VI)枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE，A230V
脂肪酶：Lipase A 100L(0.2％)
淀粉酶：Termamyl 300L(0.2％)
甘露聚糖酶：Mannan A 4.0L(0.2％)
将洗涤剂配制物在密闭玻璃容器中于30℃贮存2和4周。贮存后，测定残余蛋白酶、脂肪酶(Lip.)、甘露聚糖酶(Man.)和淀粉酶(Ter.)活性。
表16：％残余蛋白酶活性
 
周 2 4
0.07mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 21 13
0.07mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 24 22
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 18 13
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL M222S0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 50 50
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL*36D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 59 19
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.        84 77
表17：％残余淀粉酶活性
 
周 2 4
0.07mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 97 96
0.07mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 87 89
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 97 97
 
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL M222S0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 98 101
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL*36D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 97 98
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.        98 98
表18：％残余脂肪酶活性
 
周 2 4
0.07mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 5 5
0.07mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 5 5
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 4 4
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL M222S0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 20 15
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL*36D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 6 6
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.        22 17
表19：％残余甘露聚糖酶活性
 
周 2 4
0.07mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 38 25
0.07mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 14 13
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 62 48
 
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL M222S0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 89 84
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL*36D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 63 54
0.07mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D+S99SE+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.        99 95
测试设置III
添加酶：I)Savinase 16L(0.05mg EP/g det.)
        II)枯草杆菌蛋白酶KL(0.05mg EP/g det.)
        III)Alcalase 2.5L(0.05mg EP/gdet.)
        VII)枯草杆菌蛋白酶2.5KL S162R(0.05mg EP/g det.)
        VIII)枯草杆菌蛋白酶KL S99SE+N76D(0.05mg EP/g det.)
        IX)枯草杆菌蛋白酶KL N76D(0.05mg EP/gdet.)
        X)枯草杆菌蛋白酶KL A228V(0.05mg EP/g det.)
        XI)枯草杆菌蛋白酶KL A230V(0.05mg EP/gdet.)
        XII)枯草杆菌蛋白酶KL A228V，A230V(0.05mg EP/g det.)
        EP≡酶蛋白质
        det≡洗涤剂
脂肪酶：Lipase A 100L(0.2％)
淀粉酶：Termamyl 300L(0.2％)
甘露聚糖酶：Mannan A 4.0L(0.2％)
将洗涤剂配制物在密闭玻璃容器中于30℃贮存1、2和3周。贮存后，测定残余蛋白酶、脂肪酶(Lip.)、甘露聚糖酶(Man.)和淀粉酶(Ter.)活性。
表20：％残余蛋白酶活性
 
周 1 2 3
0.05mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 89 20 12
 
0.05mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 85 37 37
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 70 17 17
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S162R0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 45 12 12
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S99SE+N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.  100 75 77
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 94 95 89
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 85 83 78
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 99 87 80
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.   100 98 89
表21：％残余淀粉酶活性
 
周 1 2 3
0.05mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 98 96
0.05mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 96 97
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 98 97
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S162R0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 99 97 97
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S99SE+N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.  99 98 98
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KLN76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 100 100
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 100 100
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 100 100 100
 
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.    100 100 100
表22：％残余脂肪酶活性
 
周 1 2 3
0.05mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 30 5 5
0.05mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 10 6 6
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ LiD.和0.2％ Man. 59 8 5
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S162R0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 82 14 6
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S99SE+N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.  81 15 20
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 49 49 57
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 53 52 47
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 65 59 52
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.   61 55 48
表23：％残余甘露聚糖酶活性
 
周 1 2 3
0.05mg Savinase 16L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 93 44 27
0.05mg Alcalase 2.5L0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 81 29 24
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 98 71 58
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL S162R0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 105 77 73
 
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KLS 99SE+N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.   98 98 100
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL N76D0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 89 96 90
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 95 96 92
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man. 107 90 89
0.05mg枯草杆菌蛋白酶KL A228V+A230V0.2％ Ter.，0.2％ Lip.和0.2％ Man.    97 88 84

Claims (10)

1.一种洗涤剂组合物，其包含与下列的至少一种酶组合的枯草杆菌蛋白酶KL或其变体：蛋白酶；脂肪酶；角质酶；淀粉酶；糖酶；纤维素酶；果胶酶；果胶酸裂合酶，半纤维素酶，例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶；氧化酶，例如漆酶，或过氧化物酶。
2.根据权利要求1的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶选自下组：来自腐质霉属(Humicola)(嗜热霉属(Thermomyces))的脂肪酶，例如来自疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))或来自特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)的脂肪酶，芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)的脂肪酶，及它们的化学或蛋白质工程变体。
3.根据权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述枯草杆菌蛋白酶KL或其变体与下列的至少一种酶组合：糖酶；果胶酶；果胶酸裂合酶或半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶。
4.根据权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述淀粉酶选自下组：来自芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的淀粉酶。
5.根据权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述纤维素酶选自下组：来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、毁丝霉属(Myceliophthora)、腐质霉属、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)例如来自特异腐质酶、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)的纤维素酶。
6.根据权利要求1-5任一项的洗涤剂组合物，其中枯草杆菌蛋白酶KL或其变体的含量与脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、或过氧化物酶的含量之间的重量比为0.001至100，优选0.01至10，尤其是0.5至5，尤其是1至3。
7.根据权利要求1-5任一项的洗涤剂组合物，其中枯草杆菌蛋白酶KL或其变体的含量为0.001-5重量％且如果存在的话，下列每种的含量为0.001-5重量％：脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、半纤维素酶，例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、或过氧化物酶。
8.与下列的至少一种酶组合的枯草杆菌蛋白酶KL或其变体用于制备水性液体或凝胶型洗涤剂组合物的用途：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、或过氧化物酶，所述水性液体或凝胶型洗涤剂组合物具有增强的非蛋白酶酶类稳定性。
9.用于在蛋白酶与其它酶的组合中于包含蛋白酶和至少一种非蛋白酶酶类的液体或凝胶洗涤剂组合物中增强非蛋白酶酶类的稳定性的方法，其中所述液体或凝胶洗涤剂组合物是使用枯草杆菌蛋白酶KL或其变体作为蛋白酶制备的。
10.根据权利要求8的方法，其中所述至少一种非蛋白酶酶类选自脂肪酶，角质酶，淀粉酶，糖酶，纤维素酶，果胶酶，果胶酸裂合酶，半纤维素酶例如甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶，氧化酶例如漆酶、或过氧化物酶。
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