KR20160138227A - 물 경도 내성이 증진된 프로테아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물 경도 내성이 증진된 프로테아제, 및 프로테아제 함유 세척제 및 세정제에 관한 것이다.

Description

물 경도 내성이 증진된 프로테아제 {PROTEASES WITH ENHANCED WATER HARDNESS TOLERANCE}

본 발명은 물 경도 내성이 증진된 프로테아제, 및 프로테아제 함유 세척제 또는 세정제에 관한 것이다.

세척제 또는 세정제, 특히, 식기 세척기용 및 직물 세탁용 세척제 또는 세정제는 일반적으로 빌더 및 계면활성제 이외에도 추가의 세정-활성 성분으로서 하나 이상의 효소를 함유한다.

프로테아제, 및 그 아래의 특히 세린 프로테아제 (서브틸라제 또한 포함)는 최장 기간 확립되어 온 효소이며, 이는 사실상 거의 모든 최신식의 효과적인 세척제 또는 세정제에 함유되어 있다. 이는 물품 상의 단백질 함유 얼룩을 분해하여 세정되도록 한다. 이에 의거하여, 결과적으로, 촉매적으로 활성인 아미노산이기 때문에 세린 프로테아제로 분류되는 서브틸리신 유형의 프로테아제 (서브틸라제, 서브틸로펩티다제, EC 3.4.21.62)는 특히 중요하다. 이는 비특이적인 엔도펩티다제로서 작용하고, 즉, 펩티드 또는 단백질 내부에 위치하는 임의의 산-아미드 결합을 가수분해한다. 그의 최적의 pH는 일반적으로 명백하게 알칼리성 범위에 있다. 상기 패밀리에 관한 개요는 예를 들어, 논문 ["Subtilases: Subtilisin-like Proteases" by R. Siezen, pages 75-95 in "Subtilisin enzymes"] ([R. Bott and C. Betzel, New York, 1996]에 의해 공개)에 제공되어 있다. 물론, 서브틸라제는 미생물에 의해 형성되고; 이에 의거하여, 특히, 바실러스(Bacillus) 종에 의해 형성되고, 분비되는 서브틸리신은 서브틸라제 중에서 가장 중요한 군으로서 언급되어야 한다.

바람직하게, 세척제 또는 세정제에서 사용되는 서브틸리신 유형의 프로테아제의 예로는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아제 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실러스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의, 더욱 특히, 바실러스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제, 서브틸리신 DY, 및 효소 써미타제, 프로테이나제 K, 및 프로테아제 TW3 및 TW7 (이는 서브틸라제로서 분류되어야 하며, 이제는 더 이상 더 좁은 의미로 서브틸리신으로서 분류되지 않아야 한다)이 있다. 상품명이 BLAP^®인 프로테아제 변이체는 바실러스 렌투스 DSM 5483으로부터의 프로테아제로부터 유도된 것이다. 추가의 이용가능한 프로테아제로는 예를 들어, 상표명 듀라짐(Durazym)^®, 렐라제(Relase)^®, 에버라제(Everlase)^®, 나피짐(Nafizym), 나탈라제(Natalase)^®, 칸나제(Kannase)^®, 및 오보자임(Ovozyme)^®하에 노보자임스(Novozymes)로부터 이용가능한 효소, 상표명 퓨라펙트(Purafect)^®, 퓨라펙트^® OxP, 퓨라펙트 프라임(Purafect Prime)^®, 및 프로페라제(Properase)^®하에 제넨코르(Genencor)로부터 이용가능한 효소, 상표명 프로토솔(Protosol)^®하에 어드밴스드 바이오케미칼즈 리미티드(Advanced Biochemicals Ltd.: 인도 탄네)로부터 이용가능한 효소, 상표명 욱시(Wuxi)^®하에 욱시 스나이더 바이오프로덕츠 리미티드(Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.: 중국)로부터 이용가능한 효소, 상표명 프로리더(Proleather)^® 및 프로테아제(Protease) P^®하에 아마노 파마슈티칼즈 리미티드(Amano Pharmaceuticals Ltd.: 일본 나고야)로부터 이용가능한 효소, 및 상품명 프로테이나제(Proteinase) K-16하에 카오 코포레이션(Kao Corp.: 일본 도쿄)으로부터 이용가능한 효소가 있다.

일반적으로, 세척제의 세척 성능은 물 경도가 증가함에 따라 감소하게 된다. 유사하게, 세척제 프로테아제의 경우, 물 경도가 증가함에 따라 성능이 손실되는 것을 관찰할 수 있다. 물 경도를 감소시키는 물질, 예컨대, 포스포네이트 및 시트레이트를 혼입시킴으로써 성능 손실을 감소시킬 수 있지만, 이는 추가의 제제 복잡성을 의미한다.

각종 다가음이온성 물질, 예컨대, 폴리아크릴레이트 및 폴리-g-글루타메이트에 대한 세척제 프로테아제에 미치는 성능 증가 효과는 기술되어 있다. 그러나, 프로테아제 이외에도, 상응하는 중합체가 제제 내로 혼입되어야 하는데, 이는 특히 복잡성 및 비용상의 원인이 된다.

그러므로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 물 경도 증가와 연관된 세척제 프로테아제 성능의 손실을 막거나, 또는 적어도 그를 감소시키는, 제제화가 간단한 시스템을 제공하는 것이다.

상기 문제는 다가음이온의 공유 부착에 의해 개질된 세척제 프로테아제인, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 제공함으로써 본 발명에 따라 해결된다.

본 발명에 따른 개질은 프로테아제 이외에 추가 성분은 변형시킬 필요 없이, 출발 분자에 비하여 물 경도 내성을 증진시킨다.

원칙적으로, 세척제 또는 세정제에서 사용될 수 있는 모든 단백질 분해 효소, 특히, 서브틸라제, 바람직하게는, 그의 세척 또는 세정 성능이 적어도 사비나제(Savinase) (서열식별번호(SEQ ID NO): 2) 또는 BPN' (서열식별번호: 3)의 것에 매칭되는 것인 서브틸라제는 본 발명에 따라 개질될 수 있는 프로테아제이고, 여기서, 세정 성능은 세척액 및 프로테아제 1 ℓ당 4.5 내지 7.0 g의 용량으로 세척제를 함유하는 세척 시스템에서 측정되고, 여기서, 비교하고자 하는 프로테아제는 (활성 단백질 대비) 동일 농도로 사용되고, 면직물 상의 혈액 얼룩에 관한, 더욱 특히, 아이드게노쉬 마트리알- 운트 프루판스탈트 (EMPA) 테스트마트리알리언 아게(Eidgenoessische Material- und Pruefanstalt (EMPA) Testmaterialien AG: 스위스 갈렌 스트리트)로부터 이용가능한 제품 번호 111인 면직물 상의 혈액 얼룩에 관한 세정 성능은 세척된 직물의 백색도를 측정함으로써 측정되고, 세척 공정은 40℃ 온도에서 70분 동안 진행되고, 물의 물 경도는 15.5 내지 16.5 dGH (독일 경도: degrees of German hardness)이다. 상기 세척 시스템에 대해 명시된 세척제 중의 프로테아제의 농도는 활성 단백질에 대비하여 0.001-0.15 wt%, 바람직하게, 0.0015-0.1 wt%, 특히 바람직하게, 0.01 내지 0.075 wt%이다.

상기 세척 시스템에 바람직한 액체 세척제는 하기와 같이 구성된다 (모든 명세 사항은 중량%이다): 0.3-0.5% 크산탄 검, 0.2-0.4% 소포제, 6-7% 글리세롤, 0.3-0.5% 에탄올, 4-7% FAEOS (지방 알콜 에테르 술페이트), 24-28% 비이온성 계면활성제, 1% 붕산, 1-2% 시트르산나트륨 (이수화물), 2-4% 소다, 14-16% 코코넛 지방산, 0.5% HEDP (1-히드록시에탄-(1,1-디포스폰산)), 0-0.4% PVP (폴리비닐피롤리돈), 0-0.05% 광학 증백제, 0-0.001% 염료, 나머지: 탈염수. 액체 세척제의 용량은 바람직하게, 세척액 1 ℓ당 4.5 내지 6.0 g, 예를 들어, 세척액 1 ℓ당 4.7, 4.9, 또는 5.9 g이다. 세척은 바람직하게, pH 8 내지 pH 10.5, 바람직하게, pH 8 내지 pH 9인 pH 값 범위에서 수행된다.

상기 세척 시스템에 바람직한 분말형 세척제는 하기와 같이 구성된다 (모든 명세 사항은 중량%이다): 10% 선형 알킬벤젠 술포네이트 (나트륨 염), 1.5% C12-C18 지방 알콜 술페이트 (나트륨 염), 2.0% 7개의 EO 단위를 가지는 C12-C18 지방 알콜, 20% 탄산나트륨, 6.5% 탄산수소나트륨, 4.0% 비정질 이규산나트륨, 17% 과탄산나트륨, 4.0% TAED, 3.0% 폴리아크릴레이트, 1.0% 카르복시메틸 셀룰로스, 1.0% 포스포네이트, 27% 황산나트륨, 나머지: 소포제, 광학 증백제, 향료. 분말형 세척제의 용량은 예를 들어, 바람직하게, 세척액 1 ℓ당 4.5 내지 7.0 g, 및 특히 바람직하게, 세척액 1 ℓ당 4.7 g, 또는 세척액 1 ℓ당 5.5, 5.9, 또는 6.7 g이다. 세척은 바람직하게, pH 9 내지 pH 11인 pH 값 범위에서 수행된다.

본 발명과 관련하여, 세정 성능은 상기 명시된 바와 같은 액체 세척제를 사용함으로써 40℃에서 측정되고, 여기서, 세척 공정은 바람직하게 70분 동안 진행된다.

백색도, 즉, 얼룩의 증백성은 세정 성능의 척도로서 바람직하게, 광학 측정 방법에 의해, 바람직하게, 광도계로 측정된다. 상기에 적합한 장치는 예를 들어, 미놀타(Minolta) CM508d 분광광도계이다. 전형적으로, 상기 측정에 사용되는 장치는 백색 표준, 바람직하게, 포함된 백색 표준에 의해 사전에 보정된다.

본 발명에 따라 개질될 수 있는, 특히 바람직한 프로테아제는 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5에 명시된 아미노산 서열 중 한 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5에 명시된 상기 아미노산 서열 중 한 아미노산 서열과 80% 이상, 및 더욱 바람직하게, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 및 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

서열식별번호: 1은 서열식별번호: 1에 따라 계수하였을 때, 99번 위치에 아미노산 글루탐산 (E)을 가지는, 바실러스 렌투스로부터의 성숙한 알칼리성 프로테아제의 서열이다.

핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 측정된다. 이러한 서열 비교는 선행 관련 기술분야에서 확립된, 통상 사용되는 BLAST 알고리즘에 기초하고 (예를 들어, 문헌 [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410], 및 [Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp. 3389-3402] 참조), 이는 기본적으로 핵산 또는 아미노산 서열 중 뉴클레오티드 또는 아미노산의 유사 서열들을 서로 연관시킴으로써 수행된다. 해당 위치를 표 방식으로 연관시킨 것을 정렬로 명명한다. 선행 관련 기술분야에서 이용가능한 추가의 알고리즘은 FASTA 알고리즘이다. 서열 비교 (정렬), 특히, 다중 서열 비교는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 생성된다. 예를 들어, 클러스탈(Clustal) 시리즈 (예를 들어, 문헌 [Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-커피(Coffee) (예를 들어, 문헌 [예를 들어, Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조), 또는 상기 프로그램 또는 알고리즘에 기반한 프로그램이 빈번하게 사용된다. 본 특허 출원에서, 모든 서열 비교 (정렬)은, 서열 비교를 위한 그의 얼라인X(AlignX) 모듈이 클러스탈W(ClustalW)에 기반하는 것인, 지정된 표준 파라미터와 함께 컴퓨터 프로그램 벡터 NTI^® 스위트 10.3(Vector NTI^® Suite 10.3) (인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 패러데이 애비뉴 1600))에 의해 작성되었다.

또한 상기와 같은 비교를 통해 서로 비교되는 서열의 유사성에 대한 언급이 이루어질 수 있다. 이러한 유사성은 보통 동일성(%), 즉, 정렬되었을 때 같은 위치에 또는 서로 상응하는 위치에 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 위치하는 백분율로 제시된다. 더욱 광범위하게 해석되는 상동성이라는 개념 또한 아미노산 서열의 경우, 보존되는 아미노산 교환, 즉, 화학 활성이 유사한 아미노산을 고려하는데, 이는 일반적으로 그가 단백질 내에서 유사한 화학 활성을 가지기 때문이다. 그러므로, 비교되는 서열의 유사성은 또한 상동성(%) 또는 유사성(%)으로 언급될 수 있다. 동일성 및/또는 상동성은 전체 폴리펩티드 또는 유전자에 걸쳐, 또는 오직 개별 범위에만 걸쳐서 언급될 수 있다. 그러므로, 상이한 핵산 또는 아미노산 상동체 또는 동일 범위는 상기 서열의 상동성에 의해 정의된다. 상기 범위는 대개 동일한 작용을 한다. 이는 작을 수 있거나, 또는 단지 소수의 뉴클레오티드 또는 아미노산만을 포함할 수 있다. 상기 작은 범위는 대개 단백질의 전반적인 활성에 필수적인 작용을 한다. 그러므로, 서열 상동성을 오직 개별, 가능하게는, 작은 범위에 결부시키는 것이 적당할 수 있다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 동일성 또는 상동성이라고 언급하는 것은 명시된 핵산 또는 아미노산 서열 전장에 관한 것이다.

본 발명에 따라 프로테아제를 개질시키는 데 사용가능한 다가음이온 (다가음이온성 중합체)은 바람직하게, 폴리아미노산으로부터 구축된 생체중합체, 더욱 특히, 완전히 또는 우세하게 산성 아미노산 (Asp, Glu)으로 구축되고, 순 음전하 (형식 전하)를 바람직하게는 약 pH 7.5 범위로 가지는 생체중합체이다. 형식 전하는 생체중합체의 산성 (음으로 하전된) 아미노산을 계수하고, 그로부터 염기성 (양으로 하전된) 아미노산의 개수를 감산함으로써 측정된다. 따라서, 본 발명에 따라 사용가능한 다가음이온은 배타적으로 산성 아미노산으로만 이루어질 수도 있지만, 이는 또한 순전하가 음으로 그대로 유지되는 한, 중성 또는 염기성 아미노산도 포함할 수 있다. 사용가능한 다가음이온은 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는, 적어도 80%, 및 특히, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 산성 아미노산으로 구성된다.

다가음이온은 프로테아제에 N- 또는 C-말단에 결합될 수 있거나, 또는 프로테아제 분자의 루프 대신 프로테아제 분자 내로 삽입될 수 있고, 여기서, C-말단 결합이 매우 특히 바람직하다. 펩티드 결합에 의한 공유 부착이 바람직하다. 다가음이온은 바람직하게, 10 내지 1,000개, 더욱 특히, 10 내지 500개, 바람직하게, 10 내지 100개, 특히 바람직하게, 20 내지 50개, 매우 특히 바람직하게, 25 내지 40개, 및 가장 바람직하게, 대략 30개의 아미노산 잔기, 더욱 특히, 아스파르테이트 및/또는 글루타메이트 잔기 길이를 갖는다.

본 발명에 따라, 다가음이온은 프로테아제와 함께 공동 발현될 수 있거나, 또는 프로테아제가 발현된 이후에 프로테아제에 부착될 수 있다. 추후 기술되는 바와 같이, 프로테아제 및 다가음이온의 공동 발현이 바람직한데, 그 이유는 후속 부착의 경우, 추가 단계가 요구되기 때문이다.

그러므로, 본 발명에 따른, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질은 다가음이온의 공유 부착에 의해 개질된 프로테아제이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 개질된 프로테아제를 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산을 함유하는 벡터, 더욱 특히, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 관한 것이다.

이는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이는 단일 가닥으로서, 상기 단일 가닥에 상보적인 단일 가닥으로서, 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. 특히, DNA 분자인 경우, 두 상보적인 가닥 모두의 서열은 3개의 가능한 모든 리딩 프레임으로 고려되어야 한다. 추가로, 상이한 코돈, 즉, 염기 트리플렛이 같은 아미노산을 코딩할 수 있으며, 그러므로, 수개의 상이한 핵산이 특정 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 이러한 유전자 코드의 축중성 때문에, 상기 기술된 프로테아제 중 하나를 코딩할 수 있는 모든 핵산 서열이 본 발명의 상기 대상에 포함된다. 유전자 코드의 축중성에도 불구하고, 정의된 아미노산이 개별 코돈과 연관될 수 있기 때문에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 핵산 서열을 확실하게 알아낼 수 있다. 그러므로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산 서열에 기초하여 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 쉽게 알아낼 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 핵산에서, 하나 이상의 코돈은 동의적 코돈에 의해 대체될 수 있다. 이러한 측면은 특히 본 발명에 따른 효소의 이종성 발현에 관한 것이다. 모든 유기체, 예를 들어, 생산 균주의 숙주 세포는 특정 코돈 사용 빈도를 가진다. "코돈 사용 빈도"란 특정 유기체에 의한 유전자 코드의 아미노산으로의 번역으로 이해된다. 단백질 생합성에서 병목 현상은 유기체에서 핵산 상에 위치하는 코돈이 비교적 소수의 하전된 tRNA 분자를 동반하는 경우에 발생할 수 있다. 이로써, 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하는 것이어도, 그 코돈이 유기체에서 동일한 아미노산을 코딩하는 동의적 코돈보다 덜 효율적으로 번역되는 결과를 얻게 된다. 동의적 코돈에 대하여 더 많은 개수의 tRNA 분자가 존재하기 때문에, 동의적 코돈이 유기체에서 더욱 효율적으로 번역될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 오늘날 널리 공지되어 있는 방법, 예컨대, 화학적 합성법 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 분자 생물학 또는 단백질 화학의 표준 방법과 함께 조합하여 사용함으로써 공지된 DNA 서열 및/또는 아미노산 서열에 기초하여 상응하는 핵산을 최대 완전한 유전자까지 제조할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press]로부터 알려진 것이다.

본 발명의 의미 내에서, "벡터"라는 용어는 핵산으로 이루어지고, 본 발명의 핵산을 특징적인 핵산 영역으로서 함유하는 요소를 의미한다. 벡터는 수 세대에 걸쳐 또는 세포 분열에 걸쳐 종 또는 세포주에서 본 발명에 따른 상기 핵산을 안정적인 유전적 요소로서 확립할 수 있다. 특히, 박테리아에서 사용되는 경우, 벡터는 특수 플라스미드, 즉, 고리형 유전적 요소이다. 본 발명과 관련하여, 본 발명에 따른 핵산은 벡터로 클로닝된다. 벡터는 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 바이러스, 또는 박테리오파지로부터 기원하는 것, 또는 주로 합성 벡터, 또는 매우 다양한 기원의 요소를 가지는 플라스미드를 포함한다. 존재하는 추가의 유전적 요소에 의해, 벡터는 수 세대에 걸쳐 해당 숙주 세포에서 그 자신을 안정적인 단위로서 확립할 수 있다. 이는 별개의 단위로서 염색체외 형태로 존재할 수 있거나, 또는 염색체 내로 또는 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.

발현 벡터는 그를 함유하는 숙주 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 박테리아에서 그의 복제가 이루어질 수 있고, 그 안에 함유되어 있는 핵산의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 발현은 특히 전사를 조절하는 하나 이상의 프로모터에 의해 영향을 받는다. 원칙적으로, 발현은 원래 발현시키고자 하는 핵산 앞에 위치하는 천연 프로모터에 의해 수행될 수 있을 뿐만 아니라, 발현 벡터 상에 제공된 숙주 세포 프로모터에 의해, 또는 상이한 유기체 또는 상이한 숙주 세포의 개질된 또는 완전히 다른 프로모터에 의해서도 수행될 수 있다. 본 경우에서, 본 발명에 따른 핵산의 발현을 위해 1개 이상의 프로모터가 제공되고, 상기 핵산의 발현을 위해 사용된다. 추가로, 발현 벡터는 예를 들어, 배양 조건을 변화시킴으로써, 또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포가 특정 세포 밀도에 도달하였을 때, 또는 특정 물질, 특히 유전자 발현의 활성제의 첨가에 의해 제어될 수 있다. 상기 물질의 한 예로는 박테리아 락토스 오페론 (lac 오페론)의 활성제로서 사용되는, 갈락토스 유도체인 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)가 있다. 발현 벡터와 달리, 클로닝 벡터내 함유된 핵산은 발현되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하거나, 또는 본 발명에 따른 개질된 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포, 더욱 특히, 숙주 세포 주변 배지로 프로테아제를 분비하는 비-인간 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 형질전환 공정으로 미생물 내로 도입되고, 이어서, 미생물은 본 발명에 따른 숙주 세포가 된다. 대안적으로, 개별 성분, 즉, 본 발명에 따른 핵산의 핵산 부분 또는 핵산 단편은 또한, 생성된 숙주 세포가 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하도록 하는 방식으로 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 방법은, 숙주 세포가 이미 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터의 하나 이상의 성분을 함유하고 있고, 이어서, 추가 성분이 그에 따라 첨가되는 경우에 특히 적합하다. 세포 형질전환 방법은 확립된 선행 관련 기술분야이고, 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 원칙적으로, 모든 세포, 즉, 원핵 및 진핵 세포는 숙주 세포로서 적합하다. 이롭게는 예를 들어, 핵산 또는 벡터, 및 그의 안정적인 확립물에 의한 형질전환과 관련하여 유전적으로 취급될 수 있는 숙주 세포, 예를 들어, 단세포 진균 또는 박테리아가 바람직하다. 추가로, 바람직한 숙주 세포는 미생물학상 및 생명공학상 관리 용이성이 우수하다는 점이 특징이다. 이는 예를 들어, 배양 용이, 높은 성장률, 발효 배지에 있어서 낮은 요건, 및 외래 단백질에 대한 우수한 생산율 및 분비율에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 (유전자 도입적으로) 발현된 단백질을 숙주 세포 주변 배지 내로 분비한다. 추가로, 프로테아제는 프로테아제 생산 후, 그를 생산하는 세포에 의해, 예를 들어, 당 분자의 부착, 포르밀화, 아미노화에 의해 개질될 수 있다. 상기와 같은 번역 후 개질은 프로테아제에 기능적으로 영향을 줄 수 있다.

추가의 바람직한 실시양태는 예를 들어, 벡터 상에 제공되기도 하지만, 최초에 상기 세포에 존재할 수 있는 유전적 조절 요소에 기초하여 그의 활성이 제어될 수 있는 숙주 세포이다. 그의 발현은 예를 들어, 활성제로서 작용하는 화학 화합물의 제어 첨가에 의해, 배양 조건을 변화시킴으로써, 또는 특정 세포 밀도에 도달하였을 때 유도될 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 단백질은 경제적으로 제조될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 이러한 화합물의 예로는 IPTG가 있다.

바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 박테리아 세포이다. 박테리아는 세대 기간이 짧고, 배양 조건과 관련하여 요건이 낮다는 점이 주목할 만하다. 따라서, 경제적인 배양 방법 또는 제조 방법이 확립될 수 있다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발효 기술에서 박테리아와 관련하여 자유롭게 이용할 수 있는 풍부한 경험을 가지고 있다. 예컨대, 영양 공급원, 생성물 형성률, 시간 요건 등 각 개별 경우에서 실험적으로 결정되는 광범위한 이유에서 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아가 특정 제조에 적합할 수 있다.

그람-음성 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 다수의 단백질이 주변세포질 공간으로, 따라서, 세포를 에워 싸고 있는 2개 막 사이의 구획 내로 분비된다. 이는 특정 적용에 이로울 수 있다. 추가로, 그람-음성 박테리아는 또한 발현된 단백질을 주변세포질 공간 뿐만 아니라, 박테리아 주변의 배지로 방출하도록 하는 방식으로 디자인될 수 있다. 그에 반해, 그람-양성 박테리아, 예컨대, 바실러스(Bacilli) 또는 악티노마이세테스(actinomycetes), 또는 악티노마이세탈레스(Actinomycetales)의 다른 대표적인 박테리아에는 외부 막이 없고, 그러므로, 분비된 단백질은 박테리아 주변의 배지로, 일반적으로, 영양 배지로 직접 방출되며, 발현된 단백질은 상기 배지로부터 정제될 수 있다. 이는 배지로부터 직접 단리될 수 있거나, 또는 추가로 프로세싱될 수 있다. 추가로, 그람-양성 박테리아는 기술상 중요한 효소에 대한 기원이 되는 대부분의 유기체와 관련이 있거나, 또는 동일한 것이고, 이는 일반적으로 그 스스로 유사한 효소를 형성하며, 그러므로, 이는 유사한 코돈 사용 빈도를 가지며, 그의 단백질 합성 기구는 당연히 그에 맞춰 유도된다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 배양 조건에 대한 그의 요건과 관련하여 변이될 수 있고, 다른 또는 추가의 선별가능한 마커를 가질 수 있거나, 또는 다른 또는 추가의 단백질을 발현할 수 있다. 특히, 상기 숙주 세포는 또한 특히 트랜스제닉 기법에 의해 수개의 단백질 또는 효소를 발현하는 숙주 세포일 수 있다.

원칙적으로, 본 발명은 모든 미생물에, 특히, 발효 가능한 모든 미생물에, 특히 바람직하게, 바실러스 속의 것에 적용될 수 있고, 본 발명에 따른 단백질은 상기 미생물은 사용하여 제조될 수 있다는 결과를 가진다. 이어서, 상기 미생물은 본 발명의 의미 내에 포함된 숙주 세포이다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게, 에스케리키아(Escheichia) 속, 클레브시엘라(Klebsiella) 속, 바실러스 속, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아트로박터Arthrobacter) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속을 포함하는 그들로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아, 더욱 바람직하게, 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실러스 깁소니이(Bacillus gibsonii), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)를 포함하는 군으로부터 선택되는 박테리아를 특징으로 한다.

그러나, 숙주 세포는 또한 세포 핵을 가지는 것을 특징으로 하는 진핵 세포일 수 있다. 그러므로, 본 발명은 세포 핵을 가지는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵 세포와 달리, 진핵 세포는 형성된 단백질을 번역 후에 개질시킬 수 있다. 예로는 진균, 예컨대, 악티노마이세테스 또는 효모, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)가 있다. 이는 특히 예를 들어, 단백질이 그의 합성과 관련하여 상기 시스템에 의해 이루어질 수 있는 특이적인 개질을 거쳐야 하는 경우에 이로울 수 있다. 진핵 시스템이 수행하는 개질, 특히 단백질 합성과 관련된 것으로는 예를 들어, 저분자량 화합물, 예컨대, 막 앵커 또는 올리고당의 결합을 포함한다. 이러한 종류의 올리고당 개질은 예를 들어, 발현된 단백질의 알레르기 발현성을 저하시키기 위해서 바람직할 수 있다. 상기 세포에 의해 천연적으로 형성된 효소, 예를 들어, 셀룰라제 또는 리파제와의 공동 발현 또한 이로울 수 있다. 추가로, 예를 들어, 고온성 진균 발현 시스템은 온도-저항성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 전형적인 방식으로, 예를 들어, 불연속 또는 연속 시스템에서 배양 및 발효된다. 전자의 경우, 적합한 영양 배지에 숙주 세포를 접종하고, 실험적으로 결정된 시간이 경과한 후에 생성물을 배지로부터 수거한다. 연속 발효는 비교적 장기간 동안에 걸쳐 일부 세포는 사멸하지만, 새 세포가 또한 성장하고, 형성된 단백질은 배지로부터 동시에 제거될 수 있는 것인 동적 평형을 달성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게 본 발명에 따른 개질된 프로테아제를 제조하는 데 사용된다. 그러므로, 본 발명은 또한

a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계,

b) 프로테아제를 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 단리시키는 단계를 포함하는, 프로테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 대상은 바람직하게 발효 방법을 포함한다. 발효 방법은 그 자체가 선행 기술로부터 공지되어 있고, 일반적으로는 계속해서 제조된 생성물, 예를 들어, 본 발명에 따른 프로테아제를 정제하는 적합한 방법으로 이어지는, 실제 대규모 제조 단계이다. 본 발명에 따른 프로테아제를 제조하는 데 상응하는 방법에 기반한 모든 발효 방법이 본 발명의 상기 대상의 실시양태이다.

발효가 공급 방식을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 방법이 특히 고려된다. 이러한 경우, 연속 배양에 의해 소비되는 배지 성분이 첨가된다. 세포 밀도 및 세포 매스 또는 건조 매스, 둘 모두 및/또는 관심 프로테아제의 활성의 상당한 증가가 이러한 방식으로 달성될 수 있다. 추가로, 발효는 또한 바람직하지 못한 대사 생성물은 여과되거나, 완충제 또는 적합한 카운터이온의 첨가에 의해 중화되도록 디자인될 수 있다.

제조된 프로테아제는 발효 배지로부터 수거될 수 있다. 상기 발효 방법은 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리시키는 것보다, 즉, 세포 매스 (건조 매스)로부터 생성물을 프로세싱하는 것보다 바람직하지만, 적합한 숙주 세포 또는 하나 이상의 적합한 분비 마커 또는 분비 기전 및/또는 수송 시스템의 제공을 필요로 하며, 이로써, 숙주 세포는 프로테아제를 발효 배지 내로 분비한다. 대안적으로, 분비 없이, 프로테아제는 예를 들어, 황산암모늄 또는 에탄올을 사용하는 침전에 의해 또는 크로마토그래피 정제에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있으며, 즉, 세포 매스로부터 정제될 수 있다.

상기 제시된 사실들은 모두 본 발명에 따른 개질된 프로테아제를 제조하는 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명은 또한 작용제가 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 개질된 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 것인 작용제에 관한 것이다. 작용제는 바람직하게, 세척제 또는 세정제이다. 본 발명에 따른 개질된 프로테아제는 특히, 혈액을 함유하는 얼룩에 대하여 유익한 세정 성능을 가지고, 작용제는 상기 얼룩을 제거하는 데 특히 적합하고, 유익하다.

본 발명의 상기 대상은 상업 규모로, 세척기에서, 또는 수동으로 세척 또는 세정할 때 사용하기 위한, 농축물 및 희석되지 않은 상태로 사용되는 작용제 둘 모두인, 모든 가능한 유형의 세척제 또는 세정제를 포함한다. 예를 들어, 그에 대해 "세척제"라는 용어가 사용되는, 직물용, 카펫용, 또는 천연 섬유용 세척제가 포함된다. 이는 또한 예를 들어, 그에 대해 "세정제"라는 용어가 사용되는, 식기 세척기용 식기 세척제, 또는 수동식 식기 세척제 또는 하드 표면, 예컨대, 금속, 유리, 자기, 세라믹, 타일, 돌, 도색된 표면, 플라스틱, 목재, 또는 가죽용 클리너, 즉, 수동식 및 기계식 식기 세척제 이외에도, 예를 들어, 또한 정련제, 유리 클리너, 걸이형 방향 변기용 세정제도 포함한다. 본 발명과 관련하여 세척제 및 세정제는 세척 보조제를 또한 포함하며, 이는 추가 작용을 달성하기 위해 수동으로 또는 기계에 의해 직물 세척시에 실제 세척제에 첨가된다. 추가로, 본 발명과 관련하여 세척제 및 세정제는 직물 전처리제 및 후처리제, 즉, 예를 들어, 달라붙어 떨어지지 오물을 느슨하게 풀어지게 하기 위해 실제 세탁 이전에 세탁물과 접촉시키는 작용제, 및 실제 직물 세척 이후의 단계에서 세척되는 세탁물에 추가로 바람직한 특성, 예컨대, 쾌적한 질감, 구김 제거, 또는 낮은 정전하를 제공하는 작용제를 또한 포함한다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 본 발명에 따른 프로테아제의 활성 단백질 관련 중량%는 바람직하게, 0.005 내지 1.0 wt%, 바람직하게, 0.01 내지 0.5 wt%, 및 특히, 0.02 내지 0.2 wt%이다. 단백질 농도는 공지 방법, 예를 들어, BCA 방법 (비신코닌산; 2,2'-디퀴놀릴-4,4'-디카르복실산) 또는 비우렛(Biuret) 방법에 의해 측정될 수 있다 (A. G. Gornall, C. S. Bardawill, and M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). 이와 관련하여 활성 단백질 농도는 적합한 비가역성 억제제 (프로테아제인 경우, 예를 들어, 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF))를 사용하여 활성 중심을 적정하고, 잔류 활성을 측정함으로써 측정된다 (문헌 [M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913] 참조).

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 추가 효소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 리파제 또는 큐티나제는 특히, 그의 트리글리세리드 절단 활성 뿐만 아니라, 계내에서 적합한 전구체로부터 과산을 생성하기 위해 추가 효소로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 원래 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) (써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus))로부터 이용가능한 리파제, 또는 추가로 개발된 것, 특히, 아미노산 교환 D96L을 가지는 것을 포함한다. 이는 예를 들어, 원래 후미콜라 라누기노사 (써모마이세스 라누기노수스)로부터 이용가능한 리파제, 또는 추가로 개발된 것, 특히, 언급된 리파제로부터 출발하는, 위치 D96L, T213R, 및/또는 N233R, 특히 바람직하게, T213R 및 N233R에서 하나 이상의 아미노산 교환을 가지는 것을 포함한다. 추가로, 예를 들어, 원래 푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi) 및 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)로부터 단리된 큐티나제가 사용될 수 있다. 그의 출발 효소가 원래 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) 및 푸사리움 솔라니이(Fusarium solanii)로부터 단리된 것인 리파제 또는 큐티나제 또한 사용가능하다.

본 발명에 따른 작용제는 또한 셀룰라제 또는 헤미셀룰라제, 예컨대, 만나나제, 크산탄 리아제, 펙틴 리아제 (= 펙티나제), 펙틴에스테라제, 펙테이트 리아제, 크실로글루카나제 (= 크실라나제), 풀루라나제, 또는 β-글루카나제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따라, 표백 작용을 증가시키기 위해 옥시도리덕타제, 예를 들어, 옥시다제, 옥시게나제, 카탈라제, 퍼옥시다제, 예컨대, 할로퍼옥시다제, 클로로퍼옥시다제, 브로모퍼옥시다제, 리그닌 퍼옥시다제, 글루코스 퍼옥시다제, 또는 망간 퍼옥시다제, 디옥시게나제, 또는 락카제 (페놀 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제)가 사용될 수 있다. 바람직하게, 해당 옥시도리덕타제의 활성을 강화시키기 위해 (증진제) 또는 산화 효소와 얼룩 사이에 산화 환원 전위가 크기 차이가 나는 경우에 전자 흐름을 확실히 하기 위해 (매개 인자) 효소와 상호작용하는 유기, 특히 바람직하게, 방향족 화합물이 유리하게 추가로 첨가된다.

아밀라제 또한 추가 효소로서 사용될 수 있다. 아밀라제에 대한 동의어, 예를 들어, 1,4-알파-D-글루칸 글루카노히드롤라제 또는 글리코게나제가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 아밀라제는 α-아밀라제이다. 본 발명의 의미에서 효소가 α-아밀라제인지 여부를 결정짓는 것은 전분의 아밀로스 중 α(1-4) 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 효소의 능력이다.

아밀라제의 예로는 바실러스 리체니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 α-아밀라제, 및 특히, 세척제 또는 세정제에서의 용도로 증진된 그의 추가 개발물이 있다. 바실러스 리체니포르미스로부터의 효소는 노보자임스(Novozymes)로부터 테르마밀(Termamyl)^®이라는 상품명하에 및 다니스코(Danisco)/제넨코르(Genencor)로부터 퓨라스타(Purastar)^® ST라는 상품명하에 이용가능하다. 상기 α-아밀라제의 추가 개발물 제품은 노보자임스로부터 듀라밀(Duramyl)^® 및 테르마밀(Termamyl)^® 울트라라는 상표명하에, 다니스코/제넨코르로부터 퓨라스타^® OxAm이라는 상품명하에, 및 다이와 세이코 인크.(Daiwa Seiko Inc.: 일본 도쿄)로부터 케이스타제(Keistase)^®로서 이용가능하다. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로부터의 α-아밀라제는 노보자임스에 의해 BAN^®이라는 상품명하에 시판되고 있고, 바실러스 스테아로써모필러스로부터의 α-아밀라제의 유도된 변이체는 유사하게 노보자임스에 의해 BSG^® 및 노바밀(Novamyl)^®이라는 상품명하에 시판되고 있다. 추가로, 본 목적을 위해 바실러스 종(Bacillus sp .) A 7-7 (DSM 12368)로부터의 α-아밀라제 및 바실러스 아가어드헤렌스(Bacillus agaradherens) (DSM 9948)로부터의 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 (CGT아제)가 강조될 수 있다. 유사하게, 언급된 모든 분자들의 융합 생성물이 사용될 수 있다. 추가로, 노보자임스로부터 풍가밀(Fungamyl)^®이라는 상표명하에 이용가능한, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 및 A. 오리자에(A. oryzae)로부터의 α-아밀라제의 추가 개발물이 적합하다. 유리하게 이용가능한 추가의 사용가능한 상업적 제품으로는 예를 들어, 아밀라제-LT^® 및 스테인자임(Stainzyme)^® 또는 스테인자임 울트라(Stainzyme ultra)^® 또는 스테인자임 플러스(Stainzyme plus)^®가 있으며; 후자의 것으로 유사하게 노보자임스로부터 입수가능한 것이다. 점 돌연변이에 의해 수득할 수 있는 상기 효소의 변이체 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특히 바람직한 아밀라제는 공개된 국제 출원 WO 00/60060, WO 03/002711, WO 03/054177, 및 WO07/079938에 개시되어 있고, 그러므로, 상기 출원의 개시내용은 본 출원에서 명백하게 참조되거나, 또는 그의 개시내용의 내용은 본 출원에 명백하게 포함된다.

바람직한 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 추가 효소의 활성 단백질 관련 중량%는 바람직하게, 0.0005 내지 1.0 wt%, 바람직하게, 0.001 내지 0.5 wt%, 및 특히, 0.002 내지 0.2 wt%이다.

세척제 또는 세정제는 상기 기술된 성분 이외에도, 세정 활성 물질을 함유할 수 있고, 여기서, 계면활성제, 빌더, 중합체, 유리 부식 억제제, 부식 억제제, 향료, 및 방향제 캐리어를 포함하는 군으로부터 선택되는 물질이 바람직하다. 상기 바람직한 성분은 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 바람직한 구성 성분은 비이온성 계면활성제이고, 여기서, 일반 화학식 R¹-CH(OH)CH₂O-(AO)_w-(A'O)_x-(A"O)_y-(A"'O)_z-R²의 비이온성 계면활성제가 바람직하고, 여기서,

- R¹은 직쇄 또는 분지형의 포화되거나 또는 단일 또는 다가불포화된 C_6-24 알킬 또는 알케닐 잔기를 나타내고;

- R²는 2 내지 26개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기를 나타내고;

- A, A', A", 및 A"'는 서로 독립적으로 -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂-CH₂, -CH₂-CH(CH₃), -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂, -CH₂-CH(CH₃)-CH₂-, -CH₂-CH(CH₂-CH₃) 군으로부터의 잔기를 나타내고;

- w, x, y, 및 z는 0.5 내지 120인 값을 나타내고, 여기서, x, y, 및/또는 z는 또한 0일 수 있다.

하기에서 "히드록시 혼합 에테르"로도 또한 지칭되는, 일반 화학식 R¹-CH(OH)CH₂O-(AO)_w-(A'O)_x-(A"O)_y-(A"'O)_z-R²의 상기 언급된 비이온성 계면활성제를 첨가함으로써, 본 발명에 따른 효소 함유 제제의 세정 성능을 유의적으로 증진시킬 수 있고, 즉, 계면활성제 무함유 시스템과 비교하였을 때, 및 예를 들어, 폴리알콕시화된 지방 알콜 군으로부터의 것과 같은, 대체 비이온성 계면활성제를 함유하는 시스템과 비교하였을 때, 이 둘 모두의 경우, 유의적으로 증진시킬 수 있다.

한쪽 또는 양쪽 말단 알킬 잔기 상에 하나 이상의 유리 히드록실 기를 포함하는 상기 비이온성 계면활성제를 사용함으로써, 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제 제제 중에 함유되어 있는 효소의 안정성을 유의적으로 증진시킬 수 있다.

특히, 화학식 R¹O[CH₂CH₂O]_xCH₂CH(OH)R²에 따라, 2 내지 30개의 탄소 원자, 바람직하게, 4 내지 22개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 포화 또는 불포화된 지방족 또는 방향족 탄화수소 잔기를 나타내는 잔기 R¹ 이외에도, 1 내지 30개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 포화 또는 불포화된 지방족 또는 방향족 탄화수소 잔기 R²가 또한 포함하고, 여기서, x는 1 내지 90인 값, 바람직하게, 30 내지 80인 값, 및 특히, 30 내지 60인 값을 나타내는 것인, 단부 캡핑된 폴리(옥시알킬화된) 비이온성 계면활성제가 바람직하다.

R¹이 4 내지 18개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소 잔기 또는 그의 혼합물을 나타내고, R²가 2 내지 26개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기 또는 그의 혼합물을 나타내고, x가 0.5 내지 1.5인 값을 나타내고, y가 15 이상인 값을 나타내는 것인, 화학식 R¹O[CH₂CH(CH₃)O]_x[CH₂CH₂O]_yCH₂CH(OH)R²의 계면활성제가 특히 바람직하다.

상기 비이온성 계면활성제의 군은 예를 들어, C_2-26 지방 알콜 (PO)₁-(EO)_15-40-2-히드록시알킬에테르, 특히, 또한 C_8-10 지방 알콜 (PO)₁-(EO)₂₂-2-히드록시데실에테르를 포함한다.

추가로, R¹ 및 R²가 서로 독립적으로 2 내지 26개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 포화되거나 또는 단일 또는 다가불포화된 탄화수소 잔기를 나타내고, R³이 각 경우에 독립적으로 -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂-CH₃, -CH(CH₃)₂로부터 선택되지만, 바람직하게는, -CH₃을 나타내고, x 및 y가 서로 독립적으로 1 내지 32인 값을 나타내는 것인, 화학식 R¹O[CH₂CH₂O]_x[CH₂CH(R³)O]_yCH₂CH(OH)R²의 단부 캡핑된 폴리(옥시알킬화된) 비이온성 계면활성제가 특히 바람직하고, 여기서, R³ = -CH₃이고, x는 15 내지 32인 값이고, y는 0.5 내지 1.5인 값인 비이온성 계면활성제가 매우 특히 바람직하다.

바람직하게 사용될 수 있는 추가의 비이온성 계면활성제는, R¹ 및 R²가 1 내지 30개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 포화 또는 불포화된 지방족 또는 방향족 탄화수소 잔기를 나타내고, R³이 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2-부틸, 또는 2-메틸-2-부틸 잔기를 나타내고, x가 1 내지 30인 값을 나타내고, k 및 j가 1 내지 12, 바람직하게, 1 내지 5인 값을 나타내는 것인, 화학식 R¹O[CH₂CH(R³)O]_x[CH₂]_kCH(OH)[CH₂]_jOR²의 단부 캡핑된 폴리(옥시알킬화된) 비이온성 계면활성제이다. x 값이 ≥ 2일 경우, 상기 화학식 R¹O[CH₂CH(R³)O]_x[CH₂]_kCH(OH)[CH₂]_jOR²에서 각각의 R³은 상이할 수 있다. R¹ 및 R²는 바람직하게, 6 내지 22개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 포화 또는 불포화된 지방족 또는 방향족 탄화수소 잔기이고, 여기서, 8 내지 18개의 C 원자를 가지는 잔기가 특히 바람직하다. 잔기 R³의 경우, H, -CH₃, 또는 -CH₂CH₃인 것이 특히 바람직하다. x에 대해 특히 바람직한 값은 1 내지 20, 특히, 6 내지 15 범위에 있는 값이다.

상기 기술된 바와 같이, x가 ≥ 2일 경우, 상기 화학식에서 각각의 R³은 상이할 수 있다. 이로써, 꺾쇠 괄호 안의 알킬렌 옥시드 단위는 달라질 수 있다. x가 3을 나타낼 경우, 예를 들어, 잔기 R³은 에틸렌 옥시드 단위 (R³ = H) 또는 프로필렌 옥시드 단위 (R³ = CH₃)를 형성하기 위해 선택될 수 있고, 이는 예를 들어 (EO)(PO)(EO), (EO)(EO)(PO), (EO)(EO)(EO), (PO)(EO)(PO), (PO)(PO)(EO), 및 (PO)(PO)(PO)와 같이 임의 순서로 서로 연결될 수 있다. 한 예로서 x는 3인 값으로 선택되었고, 확실하게 그보다 클 수 있으며, 여기서, 변동 범위는 x 값이 증가함에 따라 증가하고, 예를 들어, 적은 개수의 (PO) 기와 조합된 다수의 (EO) 기, 또는 그와 반대인 경우를 포함한다.

상기 화학식의 특히 바람직한 단부 캡핑된 폴리(옥시알킬화된) 알콜은 k = 1 및 j = 1인 값을 가지며, 따라서, 상기 화학식은 R¹O[CH₂CH(R³)O]_xCH₂CH(OH)CH₂OR²로 간단화된다. 마지막으로 언급된 화학식에서, R¹, R², 및 R³은 상기에 정의된 바와 같고, x는 1 내지 30, 바람직하게, 1 내지 20, 및 특히, 6 내지 18인 수치를 나타낸다. 잔기 R¹ 및 R²가 9 내지 14개의 C 원자를 가지고, R³이 H를 나타내고, x가 6 내지 15인 값이라고 할 때, 이 경우의 계면활성제가 특히 바람직하다.

마지막으로,

- R¹이 직쇄 또는 분지형의 포화되거나 또는 단일 또는 다가불포화된 C_6-24 알킬 또는 알케닐 잔기를 나타내고;

- R²가 2 내지 26개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기를 나타내고;

- A가 CH₂CH₂, -CH₂CH₂-CH₂, -CH₂-CH(CH₃) 군으로부터의 잔기를 나타내고;

- w가 1 내지 120, 바람직하게, 10 내지 80, 특히, 20 내지 40인 값을 나타내는 것인, 일반 화학식 R¹-CH(OH)CH₂O-(AO)_w-R²의 비이온성 계면활성제가 특히 효과적인 것으로 입증되었다.

상기 비이온성 계면활성제 군은 예를 들어, C_4-22 지방 알콜 (EO)_10-80-2-히드록시알킬에테르, 또한, 특히 C_8-10 지방 알콜 (EO)₂₂-2-히드록시데실에테르 및 C_4-22 지방 알콜 (EO)_40-80-2-히드록시알킬에테르를 포함한다.

바람직한 세척제 또는 세정제는, 세척제 또는 세정제가 1종 이상의 비이온성 계면활성제, 바람직하게, 히드록시 혼합 에테르로 이루어진 군으로부터의 1종의 비이온성 계면활성제를 함유하고, 여기서, 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 비이온성 계면활성제의 중량%는 바람직하게, 0.2 내지 10 wt%, 바람직하게, 0.4 내지 7.0 wt%, 및 특히, 0.6 내지 6.0 wt%인 것을 특징으로 한다.

기계식 식기 세척 방법에서 사용하는 데 바람직한 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 앞서 기술된 비이온성 계면활성제 이외에도 추가의 계면활성제, 특히, 양쪽성 계면활성제를 함유한다. 그러나, 상기 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 음이온 계면활성제의 비율은 바람직하게는 제한된다. 따라서, 바람직한 기계식 식기 세척제는 그의 총 중량에 대비하여 5.0 wt% 미만, 바람직하게, 3.0 wt% 미만, 특히 바람직하게, 2.0 wt% 미만의 음이온 계면활성제를 함유하는 것을 특징으로 한다. 특히 과도한 기포 형성을 피하기 위해 더 많은 양의 음이온 계면활성제를 사용하는 것이 미리 예측된다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 추가의 바람직한 구성 성분은 착물화제이다. 특히 바람직한 착물화제는 포스포네이트이다. 착물화 포스포네이트는 1-히드록시에탄-1,1-디포스폰산 이외에도 상이한 화합물 시리즈, 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산) (DTPMP)을 포함한다. 특히, 본 출원에서는 히드록시알칸포스포네이트 및 아미노알칸포스포네이트가 바람직하다. 히드록시알칸포스포네이트 중에서, 1-히드록시에탄-1,1-디포스포네이트 (HEDP)가 코-빌더로서 특히 중요하다. 이는 바람직하게는 나트륨 염으로서 사용되며, 여기서, 디나트륨 염은 중성 방식으로 반응하고, 테트라나트륨 염은 알칼리성 방식으로 (pH 9) 반응한다. 바람직하게 에틸렌디아민 테트라메틸렌 포스포네이트 (EDTMP), 디에틸렌트리아민 펜타메틸렌 포스포네이트 (DTPMP), 및 그의 고급 동족체가 아미노알칸포스포네이트로 간주된다. 이는 예컨대, EDTMP의 헥사나트륨 염으로서, 또는 DTPMP의 헵타 및 옥타나트륨 염과 같이, 중성 방식으로 반응하는 나트륨 염 형태로 사용된다. 포스포네이트 부류로부터, 바람직하게, HEDP는 빌더로서 사용된다. 아미노알칸포스포네이트는 명백한 중금속 결합능을 추가로 가진다. 따라서, 특히 작용제가 표백제 또한 함유할 경우, 아미노알칸포스포네이트, 특히, DTPMP, 또는 언급된 포스포네이트의 혼합물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

본 출원과 관련하여 바람직한 세척제 또는 세정제는

a) 아미노트리스(메틸렌포스폰산) (ATMP) 및/또는 그의 염;

b) 에틸렌디아민 테트라(메틸렌 포스폰산) (EDTMP) 및/또는 그의 염;

c) 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산) (DTPMP) 및/또는 그의 염;

d) 1-히드록시에탄-1,1-디포스폰산 (HEDP) 및/또는 그의 염;

e) 2-포스포노부탄-1,2,4-트리카르복실산 (PBTC) 및/또는 그의 염;

f) 헥사메틸렌디아민 테트라(메틸렌 포스폰산) (HDTMP) 및/또는 그의 염;

g) 니트릴로트리스(메틸렌 포스폰산) (NTMP) 및/또는 그의 염을 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 포스포네이트를 함유한다.

포스포네이트로서 1-히드록시에탄-1,1-디포스폰산 (HEDP) 또는 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산) (DTPMP)을 함유하는 세척제 또는 세정제가 특히 바람직하다. 물론, 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 2종 이상의 상이한 포스포네이트를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 세척제 또는 세정제는, 세척제 또는 세정제가 포스포네이트, 바람직하게, 1-히드록시에탄-1,1-디포스포네이트로 이루어진 군으로부터의 1종 이상의 착물화제를 함유하고, 여기서, 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 포스포네이트의 중량%는 바람직하게, 0.1 및 8.0 wt%, 바람직하게, 0.2 및 5.0 wt%, 및 특히, 0.5 및 3.0 wt%인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 바람직하게 빌더를 또한 함유한다. 빌더는 특히, 실리케이트, 카르보네이트, 유기 코-빌더, 및 그의 사용에 대한 생태학상의 속단이 없는 경우, 포스페이트를 또한 포함한다.

다수의 상업적으로 이용가능한 포스페이트 중에서, 알칼리 금속 포스페이트가 본 발명에 따른 작용제에 가장 중요하고, 펜타소듐 트리포스페이트, Na₅P₃O₁₀ (소듐 트리폴리포스페이트), 또는 펜타포타슘 트리포스페이트, K₅P₃O₁₀ (포타슘 트리폴리포스페이트)이 특히 바람직하다. 포스페이트가 본 출원과 관련하여 세척제 또는 세정제 중 세정 활성 물질로서 사용될 경우, 바람직한 작용제는 이러한/이들 포스페이트(들), 바람직하게, 펜타포타슘 트리포스페이트를 함유하고, 여기서, 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 포스페이트의 중량%는 바람직하게, 5.0 및 40 wt%, 바람직하게, 10 및 30 wt%, 및 특히, 12 및 25 wt%이다.

특히, 폴리카르복실레이트/폴리카르복실산, 중합성 폴리카르복실레이트, 아스파르트산, 폴리아세탈, 덱스트린, 추가의 유기 코-빌더, 및 포스포네이트는 유기 코-빌더로서 언급되어야 한다. 이들 물질 부류는 하기에서 기술된다.

사용가능한 유기 빌더 물질은 예를 들어, 폴리카르복실산이고, 이는 유리산의 형태로 및/또는 그의 나트륨 염의 형태로 사용될 수 있고, 여기서, 폴리카르복실산은 1 초과의 산 기능을 보유하는 카르복실산을 포함하는 것으로 이해된다. 이는 예를 들어, 시트르산, 아디프산, 숙신산, 글루타르산, 말산, 타르타르산, 말레산, 푸마르산, 당산, 아미노 카르복실산, 생태학적 이유로 그의 이용에 대해 항의가 없다면, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 및 그의 혼합물이다. 그의 빌더 효과 이외에도, 유리산은 전형적으로 산성화 성분의 특징 또한 가지며, 따라서, 이는 세척제 또는 세정제의 더 낮은 pH 및 더 약한 pH 값을 맞추는 역할을 한다. 특히, 이와 관련하여 시트르산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 글루콘산, 및 그의 임의의 혼합물이 언급되어야 한다. 시트르산 또는 시트르산의 염이 특히 바람직하게 빌더 물질로서 사용된다. 추가로 특히 바람직한 빌더 물질은 메틸 글리신 디아세트산 (MGDA), 글루탐산 디아세테이트 (GLDA), 아스파르트산 디아세테이트 (ASDA), 히드록시에틸 이미노디아세테이트 (HEIDA), 이미노디숙시네이트 (IDS), 및 에틸렌디아민 디숙시네이트 (EDDS), 카르복시메틸 이눌린, 및 폴리아스파르테이트로부터 선택된다.

추가의 중합체성 폴리카르복실레이트가 빌더로서 적합하다. 이는 예를 들어, 폴리아크릴산의, 또는 폴리메타크릴산의 알칼리 금속 염, 예컨대, 상대 분자 질량이 500 내지 70,000 g/mol인 것이다.

본 명세서의 의미 내에서, 중합체성 폴리카르복실레이트에 대해 언급된 몰 질량은 산 형태의 중량-평균 몰 질량 M_w이고, 이는 일반적으로 UV 검출기를 사용하는 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 측정되었다. 시험되는 중합체와의 폴리아크릴산의 구조적 관계 때문에, 실제 분자량 값을 제공한 외부 폴리아크릴산 표준에 대조하여 측정을 수행하였다. 이들 데이터는 폴리스티렌 술폰산을 표준물로 사용한 분자량 데이터로부터 상당히 벗어난다. 폴리스티렌 술폰산에 대조하여 측정된 몰 질량은 일반적으로 본 명세서에서 언급된 몰 질량보다 상당히 더 높다.

적합한 중합체는 특히, 바람직하게는 분자 질량이 2,000 내지 20,000 g/mol인 폴리아크릴레이트이다. 결국, 몰 질량이 2,000 내지 10,000 g/mol, 및 특히 바람직하게, 3,000 내지 5,000 g/mol인 단쇄 폴리아크릴레이트는 그의 용해도가 우수한 바, 이에 상기 군 중에서 바람직할 수 있다.

공중합체성 폴리카르복실레이트, 특히, 메타크릴산과 아크릴산의, 및 말레산과 아크릴산 또는 메타크릴산의 공중합체가 또한 적합하다. 50 내지 90 wt%의 아크릴산 및 50 내지 10 wt%의 말레산을 함유하는, 말레산과 아크릴산의 공중합체가 특히 적합한 것으로 입증되었다. 유리산에 대비하여 상대 분자 질량은 일반적으로 2,000 내지 70,000 g/mol, 바람직하게, 20,000 내지 50,000 g/mol, 및 특히, 30,000 내지 40,000 g/mol이다.

옥시디숙시네이트 및 디숙시네이트의 다른 유도체, 바람직하게, 에틸렌디아민 디숙시네이트는 추가의 적합한 코-빌더이다. 에틸렌디아민-N,N'-디숙시네이트 (EDDS)는 바람직하게는 그의 나트륨 또는 마그네슘 염의 형태로 사용된다. 이와 관련하여 글리세롤 디숙시네이트 및 글리세롤 트리숙시네이트가 또한 바람직하다.

세정 성능을 개선시키기 위해 및/또는 점도를 설정하기 위해, 바람직한 세척제 또는 세정제는 1종 이상의 소수성으로 개질된 중합체, 바람직하게, 소수성으로 개질된 카르복실산-기 함유 중합체를 함유하고, 여기서, 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 소수성으로 개질된 중합체의 중량%는 바람직하게, 0.1 내지 10 wt%, 바람직하게, 0.2 내지 8.0 wt%, 및 특히, 0.4 내지 6.0 wt%이다.

앞서 기술된 빌더 이외에도, 세정-활성 중합체가 세척제 또는 세정제에 함유될 수 있다. 본 발명에 따른 기계용 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 세정-활성 중합체의 중량%는 바람직하게, 0.1 내지 20 wt%, 바람직하게, 1.0 내지 15 wt%, 및 특히, 2.0 내지 12 wt%이다.

바람직하게 술폰산-기 함유 중합체, 특히, 공중합체성 폴리술포네이트로 이루어진 군으로부터의 것이 세정-활성 중합체로서 사용된다. 이러한 공중합체성 폴리술포네이트는 술폰산-기 함유 단량체(들) 이외에도 불포화 카르복실산으로 이루어진 군으로부터의 1종 이상의 단량체를 함유한다.

R¹ 내지 R³이 서로 독립적으로 -H, -CH₃, 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형 포화 알킬 잔기, 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형의 단일 또는 다가불포화된 알케닐 잔기, -NH₂, -OH, 또는 -COOH로 치환된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 알케닐 잔기, 또는 -COOH 또는 -COOR⁴ (여기서, R⁴는 1 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 포화 또는 불포화의, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기이다)를 나타내는 것인, 화학식 R¹(R²)C=C(R³)COOH의 불포화 카르복실산이 불포화 카르복실산(들)으로서 특히 바람직하다.

특히 바람직한 불포화 카르복실산은 아크릴산, 메타크릴산, 에타크릴산, α-클로로아크릴산, α-시아노아크릴산, 크로톤산, α-페닐아크릴산, 말레산, 말레산 무수물, 푸마르산, 이타콘산, 시트라콘산, 메틸렌말론산, 소르브산, 신남산, 또는 그의 혼합물이다. 물론, 불포화 디카르복실산이 또한 사용될 수 있다.

술폰산-기 함유 단량체 중, R⁵ 내지 R⁷이 서로 독립적으로 -H, -CH₃, 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형 포화 알킬 잔기, 2 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형의 단일 또는 다가불포화된 알케닐 잔기, -NH₂, -OH, 또는 -COOH로 치환된 알킬 또는 알케닐 잔기, 또는 -COOH 또는 -COOR⁴ (여기서, R⁴가 1 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기이다)를 나타내고, X는 -(CH₂)_n- (여기서, n = 0 내지 4이다), -COO-(CH₂)_k- (여기서, k = 1 내지 6이다), -C(O)-NH-C(CH₃)₂-, -C(O)-NH-C(CH₃)₂-CH₂-, 및 -C(O)-NH-CH(CH₂CH₃)-으로부터 선택되는 임의적으로 존재하는 스페이서 기를 나타내는 것인, 화학식 R⁵(R⁶)C=C(R⁷)-X-SO₃H의 것이 바람직하다.

상기 단량체 중, R⁶ 및 R⁷이 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃, -CH(CH₃)₂로부터 선택되고, X는 -(CH₂)_n- (여기서, n = 0 내지 4이다), -COO-(CH₂)_k- (여기서, k = 1 내지 6이다), -C(O)-NH-C(CH₃)₂-, -C(O)-NH-C(CH₃)₂-CH₂-, 및 -C(O)-NH-CH(CH₂CH₃)-으로부터 선택되는 임의적으로 존재하는 스페이서 기를 나타내는 것인, 화학식 H₂C=CH-X-SO₃H, H₂C=C(CH₃)-X-SO₃H 및 HO₃S-X-(R⁶)C=C(R⁷)-X-SO₃H의 것이 바람직하다.

특히 바람직한 술폰산-기 함유 단량체는 1-아크릴아미도-1-프로판술폰산, 2-아크릴아미도-2-프로판술폰산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 술폰산, 2-메타크릴아미도-2-메틸-1-프로판 술폰산, 3-메타크릴아미도-2-히드록시-프로판 술폰산, 알릴 술폰산, 메트알릴 술폰산, 알릴옥시 벤젠 술폰산, 메트알릴옥시 벤젠 술폰산, 2-히드록시-3-(2-프로페닐옥시)프로판 술폰산, 2-메틸-2-프로펜-1-술폰산, 스티렌 술폰산, 비닐술폰산, 3-술포프로필 아크릴레이트, 3-술포프로필 메타크릴레이트, 술포메타크릴아미드, 술포메틸메타크릴아미드, 상기 언급된 산의 혼합물, 또는 상기 언급된 산의 수용성 염이다.

술폰산 기는 중합체에서 완전하게 또는 부분적으로 중화된 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 부분적으로 또는 완전히 중화된 술폰산-기 함유 공중합체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 술포-공중합체의 몰 질량은 바람직하게 원하는 용도에 맞게 중합체의 특성을 적합화시키기 위해 달라질 수 있다. 바람직한 기계식 식기 세척제는 공중합체의 몰 질량이 2,000 내지 200,000 gmol^-1, 바람직하게, 4,000 내지 25,000 gmol^-1, 및 특히, 5,000 내지 15,000 gmol^-1인 것을 특징으로 한다.

추가의 바람직한 실시양태에서, 공중합체는 카르복실-기 함유 단량체 및 술폰산-기 함유 단량체 이외에도 1종 이상의 비이온성, 바람직하게, 소수성 단량체를 포함한다. 상기 소수성으로 개질된 중합체를 사용함으로써, 특히 본 발명에 따른 기계식 식기 세척제의 세정 성능을 개선시킬 수 있었다.

본 발명에 따라,

i) 카르복실산-기 함유 단량체(들)

ii) 술폰산-기 함유 단량체(들)

iii) 비이온성 단량체(들)를 포함하는 공중합체를 함유하는 세척제 또는 세정제가 바람직하다. 상기 삼원공중합체를 사용함으로써, 비이온성 단량체 첨가 없이 술포-중합체를 함유하는 비교용 식기 세척제보다 우수하게 본 발명에 따른 기계식 식기 세척제의 세정 성능을 개선시킬 수 있었다.

바람직하게, R¹ 내지 R³이 서로 독립적으로 -H, -CH₃, 또는 -C₂H₅를 나타내고, X는, -CH₂-, -C(O)O-, 및 -C(O)-NH-로부터 선택되는 임의적으로 존재하는 스페이서 기를 나타내고, R⁴는 2 내지 22개의 탄소 원자를 가지는 직쇄 또는 분지형 포화 알킬 잔기, 또는 6 내지 22개의 탄소 원자를 가지는 불포화, 바람직하게, 방향족 잔기를 나타내는 것인, 일반 화학식 R¹(R²)C=C(R³)-X-R⁴의 단량체가 비이온성 단량체로서 사용된다.

특히 바람직한 비이온성 단량체는 부텐, 이소부텐, 펜텐, 3-메틸부텐, 2-메틸부텐, 시클로펜텐, 헥센, 헥센-1, 2-메틸펜텐-1, 3-메틸펜텐-1, 시클로헥센, 메틸시클로펜텐, 시클로헵텐, 메틸시클로헥센, 2,4,4-트리메틸펜텐-1, 2,4,4-트리메틸펜텐-2, 2,3-디메틸헥센-1, 2,4-디메틸헥센-1, 2,5-디메틸헥센-1, 3,5-디메틸헥센-1, 4,4-디메틸헥산-1, 에틸시클로헥신, 1-옥텐, 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 α-올레핀, 예컨대, 1-데센, 1-도데센, 1-헥사데센, 1-옥타데센, 및 C22-α-올레핀, 2-스티렌, α-메틸스티렌, 3-메틸스티렌, 4-프로필스티렌, 4-시클로헥실스티렌, 4-도데실스티렌, 2-에틸-4-벤질스티렌, 1-비닐나프탈렌, 2-비닐나프탈렌, 아크릴산 메틸 에스테르, 아크릴산 에틸 에스테르, 아크릴산 프로필 에스테르, 아크릴산 부틸 에스테르, 아크릴산 펜틸 에스테르, 아크릴산 헥실 에스테르, 메타크릴산 메틸 에스테르, N-(메틸)아크릴아미드, 아크릴산 2-에틸헥실 에스테르, 메타크릴산 2-에틸헥실 에스테르, N-(2-에틸헥실)아크릴아미드, 아크릴산 옥틸 에스테르, 메타크릴산 옥틸 에스테르, N-(옥틸) 아크릴아미드, 아크릴산 라우릴 에스테르, 메타크릴산 라우릴 에스테르, N-(라우릴) 아크릴아미드, 아크릴산 스테아릴 에스테르, 메타크릴산 스테아릴 에스테르, N-(스테아릴) 아크릴아미드, 아크릴산 베헤닐 에스테르, 및 N-(베헤닐) 아크릴아미드, 또는 그의 혼합물이다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 술폰산-기 함유 공중합체의 중량%는 바람직하게, 0.1 내지 15 wt%, 바람직하게, 1.0 내지 12 wt%, 및 특히, 2.0 내지 10 wt%이다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 공지된 제제 형태로, 즉, 예를 들어, 고체 또는 액체 형태로, 또는 고체 및 액체 제제 형태의 조합으로서 존재할 수 있다. 특히, 분제, 과립성 물질, 압출물 또는 압착된 생성물, 특히, 정제가 고체 제제 형태로서 적합하다. 물 및/또는 유기 용매 기반의 액체 제제 형태는 증점된 형태, 겔 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 바람직하게는 액체 형태로 존재한다. 바람직한 세척제 또는 세정제는 그의 총 중량에 대비하여 40% 초과, 바람직하게, 50 내지 90 wt%, 및 특히, 60 내지 80 wt%의 물을 함유한다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 추가 구성 성분으로서 유기 용매를 함유할 수 있다. 유기 용매를 첨가하는 것이 본 작용제의 효소 안정성 및 세정 성능에 유익한 영향을 미친다. 바람직한 유기 용매는 1가 또는 다가 알콜, 알카놀아민, 또는 글리콜 에테르로 이루어진 군으로부터의 것이다. 용매는 바람직하게 에탄올, n- 또는 i-프로판올, 부탄올, 글리콜, 프로판- 또는 부탄디올, 글리세롤, 디글리콜, 프로필- 또는 부틸디글리콜, 헥실렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 에틸렌 글리콜 에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 프로필 에테르, 에틸렌 글리콜 모노-n-부틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 에틸 에테르, 프로필렌 글리콜 메틸, 에틸, 또는 프로필 에테르, 디프로필렌 글리콜 메틸 또는 에틸 에테르, 메톡시-, 에톡시-, 또는 부톡시트리글리콜, 1-부톡시에톡시-2-프로판올, 3-메틸-3-메톡시부탄올, 프로필렌 글리콜 t-부틸 에테르, 및 상기 용매의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 이들 유기 용매의 중량%는 바람직하게, 0.1 내지 10 wt%, 바람직하게, 0.2 내지 8.0 wt%, 및 특히, 0.5 내지 5.0 wt%이다. 세척제 또는 세정제의 안정화와 관련하여 특히 효과적인 글리세롤 및 1,2-프로필렌 글리콜이 특히 바람직한 유기 용매이다. 1종 이상의 폴리올, 바람직하게, 글리세롤 및 1,2-프로필렌 글리콜로 이루어진 군으로부터의 폴리올을 함유하고, 여기서, 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 폴리올의 중량%가 바람직하게, 0.1 및 10 wt%, 바람직하게, 0.2 및 8.0 wt%, 및 특히, 0.5 및 5.0 wt%인 것인 액체 세척제 또는 세정제가 본 발명에 따라 바람직하다.

추가의 바람직한 유기 용매는 유기 아민 및 알카놀아민이다. 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 바람직하게, 각 경우에서 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 0.1 내지 10 wt%, 바람직하게, 0.2 내지 8.0 wt%, 및 특히, 0.5 내지 5.0 wt%의 양으로 이들 아민을 함유한다. 특히 바람직한 알카놀아민은 에탄올아민이다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제의 추가의 바람직한 구성 성분은 당 알콜 (알디톨)이다. 알디톨의 군은 화학식 HOCH₂[CH(OH)]_nCH₂OH의 비시클릭 폴리올을 포함한다. 알디톨로는 예를 들어, 만니트 (만닛톨), 이소말트, 락티톨, 글루시톨 (소르비톨), 및 크실리트 (크실리톨), 트레이톨, 에리트리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 소르비톨은 효소 안정성과 관련하여 특히 유익한 것으로 입증되었다. 세척제 또는 세정제의 총 중량에 대비하여 당 알콜의 중량%는 바람직하게, 1.0 내지 10 wt%, 바람직하게, 2.0 내지 8.0 wt%, 및 특히, 3.0 내지 6.0 wt%이다.

본 발명에 따른 액체 세척제 또는 세정제는 바람직하게, 다상 형태이며, 즉, 서로 분리되는, 2종 이상의 상이한 액체 세척제 또는 세정제를 조합함으로써 제제화된 형태로 존재한다. 이러한 유형의 제제화는 세척제 또는 세정제의 안정성을 증가시키고, 그의 세정 성능을 개선시킨다. 본 발명에 따라 바람직한 세척제 또는 세정제는 패키징 수단, 및 상기 패키징 수단에 함유되어 있고, 서로 분리되어 있는 것인 2개의 액체 세척제 또는 세정제 A 및 B를 포함하고, 여기서, 조성물 A는

a) 1종 이상의 본 발명에 따라 개질된 프로테아제;

b) 본 발명에 따른 프로테아제와 다른 1종 이상의 추가 효소;

c) 10 내지 84.9 wt%의 빌더(들);

d) 15 내지 89.9 wt%의 물을 함유하고;

조성물 B는

e) 10 내지 75 wt%의 빌더(들);

f) 25 내지 90 wt%의 물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

실시예:

하기 실시예는 본 발명을 예시하며, 본 발명을 그로 한정하지 않는다:

실시예 1: 폴리-Asp-Glu 태그를 가지는 프로테아제 제공

서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 가지는 참조 프로테아제를 기초로 하여, 참조 프로테아제를 또한 우수한 수율로 제조할 수 있는 것인 적합한 바실러스 생산 플라스미드에서 예컨대, Asp-Glu에 대한 GAAGAT와 같은, 교호 Glu 및 Asp 잔기를 코딩하는 코돈 서열을 프로테아제의 마지막 아미노산에 대한 코돈과 종결 코돈 사이의 코딩 영역의 3' 단부에 삽입함으로써 C-말단 폴리-Asp-Glu 신장부를 가지는 본 발명에 따른 프로테아제 변이체를 제조하였다. 바실러스 서브틸리스 DB 104의 형질전환 후, 검사를 위해 플라스미드를 제조하고, 해당 영역을 서열분석하였다. 하기 실시예를 위해 사용되는 프로테아제는 (Asp-Glu)₃₂의 C-말단 신장부를 가졌지만, (Asp-Glu)₁₂, (Asp-Glu)₁₆, (Asp-Glu)₂₈, (Asp-Glu)₃₄, (Asp-Glu)₄₆, (Asp-Glu)₆₈, (Asp-Glu)₉₄, (Asp-Glu)₅₀, 및 (Asp-Glu)₁₀₀을 가지는 프로테아제 또한 제조되었다.

상응하는 발현 벡터에 의해 바실러스 서브틸리스 DB 104를 형질전환시키고 (Kawamura and Doi (1984), J. Bacteriol., volume 160 (1), pp. 442-444), 이어서, 프로테아제 변이체를 발현하는 형질전환체를 배양함으로써 관련 기술분야에서 일반적인 방식으로 프로테아제 변이체를 발현시켰다. 추후 사용, 예컨대, 실시예 2를 위해 프로테아제 함유 배양물 상청액을 사용하였다.

실시예 2: 액체 효소 제제 제조

200 HPU/mL 이상의 활성으로 본 발명에 따른 프로테아제를 함유하는, 예컨대, 실시예 1로부터의 발현 시스템의 배양물의 상청액을 0.1 중량부의 1,2-프로판디올과 혼합하고, 4℃에서 보관한다. HPU (헨켈 프로테아제 단위(Henkel protease units))로 언급된 프로테아제 활성은 공개 문헌 ["Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivitaet in Enzymkonzentraten und enzymhaltigen Wasch-, Spuel- und Reinigungsmitteln" in Tenside (1970), volume 7, pp. 125-132]에 따라 반 라이(van Raay), 사란(Saran), 및 베어벡(Verbeek)에 따라서 측정하였다. 수일 동안에 걸쳐 보관하는 경우, 상기 활성을 사용 전에 다시 측정한다.

실시예 3: 세정 성능을 측정하는 미니 세척 검사:

시험하고자 하는 프로테아제의 세척 성능을, 동일한 조건하에서 동시에 제조된 공지의 참조 프로테아제와 비교하여 조사한다. 본 목적을 위해, (효소 무함유) 액체 세척제 제제 (실시예 5 참조, 본 시험을 위해 효소 없이 제조된 것)를 전형적인 농도로 (78 g/17 L) 다른 경도 (0-56 dGH)의 물에 용해시키고, 같은 활성 (10 HPU/mL)의 양으로 시험 프로테아제 및 참조 프로테아제를 혼합하였다. 축소형 세척 검사 (1 mL의 세척액, 뚜껑이 있는 48 웰 플레이트, Ø 1 cm의 얼룩)에서, (폴리에스테르) 면직물 상의 표준화된 상업적으로 이용가능한 얼룩 (EMPA164, CFT PC10, CTF 10N, CFT C03, EMPA122, CFT C05)을 회전시키면서, 40℃에서 60분 동안 상기 세척액 중에서 인큐베이션시킨다. 얼룩을 (수돗물로) 세정, 건조 및 고정한 후, 분광광도계 (코니카 미놀타(Konica Minolta) Cm700d))를 이용하여 측정하고, 각 샘플과 0 값의 상응하는 물 경도에서 효소 없이 유사하게 세척된 것 사이의 휘도차 ΔL*를 6개의 얼룩 모두에 걸쳐 합산하고, 세척 성능의 척도로서 평가한다.

실시예 4: 물 경도 내성 평가:

미니 세척 검사 (실시예 3)에서 참조 프로테아제와 비교하여 실시예 2로부터의 예시적인 프로테아제의 물 경도 내성을 측정한다. 참조 프로테아제는 실시예 1에서 언급된 참조 프로테아제이다.

예시적인 프로테아제의 경우, 실시예 3에 따라 세척 성능을 하기 표에 명시된 물 경도에서 측정한다. 0 dGH의 물 경도에서 휘도차의 총합 (즉, 세척 성능)을 100°로 설정하고, 더 높은 물 경도에서의 세척 성능은 그에 대한 상대적인 비율 (%)로 값을 매긴다.

물 경도 증가에 따라, 본 발명에 따른 예시적인 프로테아제의 세척 성능이 감소하는 정도는 참조 프로테아제의 경우에서보다 더 약하고, 따라서, 그의 물 경도 내성은 더 크다는 것을 하기 표 및 도 1로부터 명백하게 알 수 있다.

실시예 5: 경도 내성을 띠는 프로테아제를 포함하는 세척제 제제:

일부 바람직한 세척제 또는 세정제의 조성은 하기 표에서 알 수 있다 (달리 명시되지 않는 한, 명세 사항은 세척제 또는 세정제의 총 중량 대비 wt%이다).

본 발명은 세척제 또는 세정제의 물 경도 내성을 개선시키기 위한 본 발명에 따른 개질된 프로테아제의 용도에 관한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA. <120> Proteasen mit verbesserter Wasserh?tetoleranz <130> PT032252_PCT <150> DE 1020142060516 <151> 2014-03-31 <160> 5 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus lentus <220> <223> Seq 1 Bacillus lentus alkalische Protease R99E <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Glu Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 2 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus lentus <220> <223> Seq 2 Subtilisin 309 <400> 2 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 3 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <220> <223> Seq 3 BPN? <400> 3 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 4 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus lentus <220> <223> Seq 4 Subtilisin Carlsberg mature <400> 4 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala 260 265 270 Ala Gln <210> 5 <211> 269 <212> PRT <213> Bacillus lentus <220> <223> Seq 5 Bacillus lentus alkalische Protease WT <400> 8 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Asp Gly Arg Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Ser Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265

Claims (10)

1. a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 서열식별번호: 5에 명시된 아미노산 서열 중 한 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5에 명시된 상기 서열 중 하나와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제; 및
   b) 다가음이온을 함유하는, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 다가음이온이 10 내지 1,000개, 특히, 10 내지 500개, 바람직하게, 10 내지 100개, 특히 바람직하게, 20 내지 50개, 매우 특히 바람직하게, 25 내지 40개, 및 가장 바람직하게, 대략 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는 것을 특징으로 하는, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다가음이온이 완전히 또는 우세하게 아스파르테이트 및/또는 글루타메이트 잔기로 구축된 것을 특징으로 하는, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다가음이온이 프로테아제에 C-말단에 결합되는 것인, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
6. 제5항에 따른 핵산을 함유하는 벡터, 더욱 특히, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
7. 제5항에 따른 핵산 또는 제6항에 따른 벡터를 함유하거나, 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 함유하는 비-인간 숙주 세포이며, 상기 숙주 세포는 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 숙주 세포 주변의 배지로 분비하는 것인, 비-인간 숙주 세포.
8. a) 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
   b) 프로테아제를 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 단리시키는 단계를 포함하는, 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 제조하는 방법.
9. 1종 이상의, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-다가음이온 융합 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제, 더욱 특히, 세척제 또는 세정제.
10. 세척제 또는 세정제의 물 경도 내성을 개선시키기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제-다가음이온 융합 단백질의 용도.

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