TW201940778A - 角質汙垢清潔劑、及角質汙垢分解能力之評估方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種對角質污垢之清潔力較高之清潔劑、及評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法。本發明係一種以M23A亞家族蛋白酶作為有效成分之角質污垢清潔劑。本發明係一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法。該方法包括：獲取受驗酵素或包含其之組合物對基準肽及一種以上之受質肽之分解活性；及基於受驗酵素或包含其之組合物對該基準肽及受質肽之分解活性，評估該受驗酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力；且該基準肽為GGGGG或GGGG，該一種以上之受質肽選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群，X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基。

Description

角質汙垢清潔劑、及角質汙垢分解能力之評估方法

本發明係關於一種角質污垢清潔劑及使用其之清潔方法、以及評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法。

於皮膚中，在基底層分裂之細胞隨著朝向外層移動而分化，於最外層脫核後層疊，由此形成角質層。皮膚之角質層發揮作為皮膚之重要功能之一之屏障的功能。該角質層之代謝回轉在人體約為28天，結束使命之角質層或其成分成為垢。

附著於衣物之污垢之中，白襯衫等之衣領或袖口等上產生之呈黑～棕色之著色之污垢稱為「衣領袖口污垢」、「黑色污垢」等，係非常難去除之污垢。該等污垢係因皮膚表層之角質細胞或其成分附著於衣物而產生。報告有衣領袖口污垢之成分中包含源自角質層之蛋白質兜甲蛋白及角蛋白10(非專利文獻1、2)。又，認為衣領袖口污垢之中特別不易去除之污垢係源自角質層之角蛋白(非專利文獻3)。角蛋白10之兩端及兜甲蛋白係具有稱為甘胺酸富集區之甘胺酸比率較高之區域的蛋白質(非專利文獻4)。

先前，開發出以此種所謂衣領袖口污垢等由源自角質層細胞之蛋白質所產生之污垢(以下亦稱為「角質污垢」)為目標的清潔劑或清潔方法。於專利文獻1中，揭示有一種清潔劑組合物，其以特定比率調配有特定之非離子界面活性劑、磺酸化合物、及聚乙二醇。於專利文獻2中，揭示有一種使被清潔物接觸於包含螯合劑及水之液體後，與包含界面活性劑、水及酵素之液體接觸的方法。於專利文獻3中，揭示有一種清潔劑組合物，其含有特定之非離子性界面活性劑、金屬離子捕捉劑、蛋白酶、烷醇胺、(甲基)丙烯酸/(甲基)丙烯酸酯共聚物、及溶解助劑。

近年來，提供包含蛋白酶等於蛋白質分解方面優異之酵素的清潔劑(例如專利文獻3～5)。認為蛋白酶對衣領袖口污垢之清潔亦有用(專利文獻3～4)。然而，先前之清潔劑對角質污垢之清潔力尚不充分。為了利用先前之清潔劑有效地去除衣領袖口污垢，必須將清潔劑不如通常般用水稀釋而直接塗佈於污垢，或進而進行搓洗。期望開發出對衣領袖口污垢等角質污垢之清潔力更高之清潔劑及蛋白酶。又，期望不使用源自人體之角質的簡易之蛋白酶之角質污垢分解能力之評估方法。

另一方面，於蛋白質分解方面優異之蛋白酶有因分解動物性纖維而損傷衣物之情況。報告有一種抑制了對羊毛或蠶絲之損傷性之蛋白酶(專利文獻5)。又，近年來，隨著人們衛生意識之提高，對衣物之氣味或菌之除去之關心亦提高。已知衣物上附著有皮膚常在菌或環境中存在之各種菌並繁殖，作為皮膚常在菌，已知有金黃色葡萄球菌或微球菌屬菌等革蘭氏陽性菌(專利文獻6～7)。此前報告有藉由使用具有對金黃色葡萄球菌之殺菌效果之酵素溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)，可減輕來自洗滌物之惡臭(專利文獻6)。

(專利文獻1)日本專利特開平11-279600號公報 (專利文獻2)日本專利特開2003-41479號公報 (專利文獻3)日本專利特開2005-132898號公報 (專利文獻4)日本專利特開2015-120849號公報 (專利文獻5)日本專利特表平10-501577號公報 (專利文獻6)日本專利特表2004-527603號公報 (專利文獻7)日本專利特開2017-095610號公報 (非專利文獻1)纖維製品消費科學，19(3)，106-115，1978 (非專利文獻2) Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6, 328-340, 2005 (非專利文獻3) J. Jpn. Oil Chem. Soc. (YUKAGAKU), 42 (1), p2-9, 1993 (非專利文獻4)蛋白質核酸酵素 38(16)p2711-2722，1993

於一態樣中，本發明提供一種角質污垢清潔劑，其以M23A亞家族蛋白酶作為有效成分。 於另一態樣中，本發明提供一種角質污垢之清潔方法，其使用該角質污垢清潔劑。 於進而另一態樣中，本發明提供一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法，其包括： 測定受驗酵素或包含其之組合物對基準肽及一種以上之受質肽之分解活性； 求出對該一種以上之受質肽之各分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值；及 選擇該基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上且針對任一種以上之該受質肽之該相對值為0.5以上、或具有相當於此之對該基準肽及受質肽之分解活性的受驗酵素或包含其之組合物；且 該基準肽為GGGGG或GGGG，該一種以上之受質肽選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群，且X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基。

期望開發出對角質污垢之清潔力更高之清潔劑。本發明係關於一種對角質污垢之清潔力較高之清潔劑、及使用其之角質污垢之清潔方法。本發明者發現M23A亞家族蛋白酶分解角質污垢之能力較高。由本發明所提供之酵素M23A亞家族蛋白酶分解角質污垢(例如衣領袖口污垢)之能力優異。藉由將該酵素調配於清潔劑中，能夠獲得對角質污垢之清潔力較高之清潔劑。

又，本發明係關於一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法。由於作為角質層之主成分的角蛋白及兜甲蛋白具有甘胺酸富集區(非專利文獻4)，故而推測出若為能夠分解Gly-Gly鍵之蛋白酶，則有可能可清潔角質污垢。於是，本發明者等人確認了作為能夠分解Gly-Gly鍵之蛋白酶之屬於M23家族之蛋白酶的角質污垢分解能力(下述實施例2)。其結果，預料外地判明：即便為能夠分解Gly-Gly鍵之蛋白酶，亦存在不呈現角質污垢分解能力之蛋白酶與顯示角質污垢分解能力之蛋白酶。於是本發明者等人對該等酵素之受質特異性進行調查，結果發現：顯示角質污垢分解能力之蛋白酶與不顯示角質污垢分解能力之蛋白酶對特定之肽之活性不同。根據該等結果，本發明者等人發現：能夠以酵素對於該特定之肽之分解活性為基準來評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力。根據本發明，能夠利用簡便之方法來評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力。因此，本發明能夠用於開發角質污垢分解能力較高之酵素及酵素組合物、或角質污垢清潔力較高之清潔劑。

於本說明書中，胺基酸殘基亦以下述縮寫來記載：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩醯胺(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)、纈胺酸(Val或V)；及任意胺基酸殘基(Xaa或X)。又，於本說明書中，肽之胺基酸序列係依據慣例，以胺基末端(以下稱為N末端)位於左側、羧基末端(以下稱為C末端)位於右側之方式進行記載。

於本說明書中，關於核苷酸序列或胺基酸序列之「至少80%之同一性」係指80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、進而更佳為97%以上、再佳為98%以上、進而再佳為99%以上之同一性。

於本說明書中，核苷酸序列或胺基酸序列間之同一性可藉由李普曼-皮爾森法(Lipman-Pearson法；Science, 1985, 227: 1435-41)進行計算。具體而言，可藉由使用遺傳資訊處理軟體Genetyx-Win(Ver.5.1.1；軟體開發)之同源性分析(Search homology)程式，將待比較單位大小(Unit size to compare)(ktup)設為2進行分析而算出。

於本說明書中，胺基酸序列及核苷酸序列上之「對應之位置」可藉由將目標序列與參照序列(例如序列編號2所示之胺基酸序列)以對各胺基酸序列或核苷酸序列中所存在之保守胺基酸殘基或核苷酸賦予最大同源性之方式進行排列(比對)而決定。比對可使用公知之演算法執行，其程序為業者所公知。例如，比對可藉由於預設設定中使用Clustal W多序列比對程式(Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680)進行。或者亦可使用Clustal W之修訂版Clustal W2或Clustal omega。Clustal W、Clustal W2及Clustal omega例如可在歐州生物信息研究所(European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html])、或日本國立遺傳學研究所運營之日本DNA資料庫(DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])之網站上使用。

藉由上述比對而對準與參照序列之任意位置相對應之位置的目標序列之胺基酸殘基或核苷酸之位置係視作與該任意之位置「對應之位置」。目標序列上之該「對應之位置」之胺基酸殘基與在參照序列上相同時，將其視作與參照序列之胺基酸殘基「對應之胺基酸殘基」。例如，於目標序列上，若與序列編號2之胺基酸序列之H22對應之位置之胺基酸殘基為H，則其係與序列編號2之胺基酸序列之H22對應之胺基酸殘基。

於本說明書中，所謂將目標基因與控制區「可作動地連結」係指以藉由控制區控制基因表現之功能作用於目標基因之方式，在DNA上配置控制區與目標基因。作為將目標基因與控制區可作動地連結之方法，可列舉將該目標基因連結於該控制區之下游之方法。

於本說明書中，「角質污垢」係指因皮膚表層之角質細胞或其成分附著於衣物或布製品而產生之該衣物或布製品之污垢。又，於本說明書中，「衣領袖口污垢」係「角質污垢」之一種，係指由衣物之衣領或袖口與皮膚之接觸及摩擦而於該衣領或袖口產生之呈現黑～棕色之著色的污垢，亦稱為「黑色污垢」或「衣領袖口污垢」。本說明書中之「角質污垢」常見於衣物之衣領或袖口，因此，多數情況下為「衣領袖口污垢」。但是本說明書中之「角質污垢」不應限定於衣物之衣領或袖口之污垢地解釋。

角質污垢之主要之原因物質係皮膚之角質(即蛋白質)，因此，先前係將包含蛋白酶之清潔劑用於角質污垢之清潔。已知角質層之主成分為角蛋白及兜甲蛋白。進而，提示於衣領袖口污垢之成分中包含蛋白質兜甲蛋白及角蛋白10(非專利文獻1、2)。因此，本說明書中之「角質污垢」可換稱為「包含源自皮膚或角質層之兜甲蛋白及角蛋白10之污垢」。又，本說明書中之「衣領袖口污垢」可換稱為「衣物之衣領或袖口上之包含源自皮膚或角質層之兜甲蛋白及角蛋白10之污垢」。

於本說明書中，所謂甘胺酸富集區，係指分子量25,000以上之蛋白質中之包含任意連續之20個胺基酸之區域中，具有連續存在至少2個以上之甘胺酸之序列(-Gly-Gly-)，且具有10個以上之甘胺酸的區域。

於本說明書中，「動物性纖維」係指由動物獲得之纖維、線、布、布料、衣物等。作為動物性纖維之例，可列舉羊毛、蠶絲、羊絨、羽毛等，較佳為羊毛。

所謂M23A亞家族蛋白酶及M23B亞家族蛋白酶，分別係指在MEROPS資料庫[http://merops.sanger.ac.uk]所記載之蛋白質分解酵素家族中，屬於M23家族蛋白酶之M23A亞家族及M23B亞家族之蛋白酶。於MEROPS資料庫中，將酵素基於以下論文所記載之方法分類至家族或亞家族(Nucleic Acids Res, 1999, 27: 325-331、J Struct Biol, 2001, 134: 95-102、Nucleic Acids Res, 2016, 44: D343-D350)。M23家族蛋白酶包含分解細菌之細胞壁肽聚糖，顯示溶菌活性之肽鏈內切酶。又，M23家族蛋白酶包含能夠分解Gly-Gly鍵之蛋白酶(The Journal of Biochemistry, 124(2), 332-339, 1998、日本細菌學雜誌，52(2), 461-473, 1997、The Journal of Biological Chemistry, 268(10), 7503-7508, 1993、The Journal of Biological Chemistry, 268(12), 9071-9078, 1993、The Journal of Biological Chemistry, 281(1), 549-558, 2006)。

於MEROPS資料庫之發佈版11.0中，M23A亞家族中，以正模標本(Holotype)之形式存在β-裂解金屬蛋白酶(beta-lytic metallopeptidase；BLP)(MEROPS ID：M23.001)、亦稱為葡萄球菌溶血素(Staphylolysin)之LasA蛋白(Las A protein；LasA或LAS)(MEROPS ID：M23.002)、及亦稱為Mername-AA291肽酶之嗜水氣單胞菌蛋白酶(Aeromonas hydrophila proteinase；AhP)(MEROPS ID：M23.003)3種蛋白酶。BLP、LasA及AhP係分別包含序列編號2、序列編號4及序列編號6所示之胺基酸序列之多肽。另一方面，M23B亞家族中存在ALE-1甘胺醯甘胺酸肽鏈內切酶(ALE-1 glycylglycine endopeptidase)(ALE-1)(MEROPS ID：M23.012)及溶葡萄球菌酶(MEROPS ID：M23.004)等複數種蛋白酶。ALE-1為包含序列編號8所表示之胺基酸序列之多肽。

較佳為本說明書中之M23A亞家族蛋白酶係指選自由β-裂解金屬蛋白酶(BLP)、LasA蛋白(LasA或LAS)、及嗜水氣單胞菌蛋白酶(AhP)所組成之群中之至少一種。於本發明中，可使用BLP、LasA及AhP之任一種，亦可以任兩種或三種之組合使用。較佳為本發明中使用之M23A亞家族蛋白酶包含BLP，更佳為BLP。

β-裂解金屬蛋白酶(BLP)、LasA蛋白(LasA或LAS)、嗜水氣單胞菌蛋白酶(AhP)係具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵之分解活性的酵素。作為BLP之較佳之例，可列舉包含序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽。作為BLP之另一例，可列舉如下多肽，其包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性、較佳為具有與序列編號2所表示之胺基酸序列之H22、D36、H121及H123對應之胺基酸殘基的胺基酸序列，且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性。作為LasA之較佳之例，可列舉包含序列編號4所表示之胺基酸序列之多肽。作為LasA之另一例，可列舉如下多肽，其包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性、較佳為具有與序列編號4所表示之胺基酸序列之H23、D36、H120及H122對應之胺基酸殘基的胺基酸序列，且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性。作為AhP之較佳之例，可列舉包含序列編號6所表示之胺基酸序列之多肽。作為AhP之另一例，可列舉如下多肽，其包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性、較佳為具有與序列編號6所表示之胺基酸序列之H21、D34、H118及H120對應之胺基酸殘基的胺基酸序列，且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性。

上述中列舉之M23A亞家族蛋白酶可自生產其之微生物或其培養物萃取或製備。例如，BLP可自溶桿菌屬(Lysobacter sp.)(NBRC 12725或NBRC 12726)、水解無色桿菌(Achromobacter lyticus)M497-1、溶桿菌屬IB-9374、膠狀溶桿菌(Lysobacter gummosus) DSMZ 6980等或其培養物萃取或製備，LasA可自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA01、銅綠假單胞菌ATCC 10145、銅綠假單胞菌FRD1等或其培養物萃取或製備，AhP可自嗜水氣單胞菌嗜水亞種(Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila) ATCC 7966、嗜水氣單胞菌(Chester) Stanier (ATCC 51307)等或其培養物萃取或製備。上述微生物可自公開微生物保存機構購買。生產該M23A亞家族蛋白酶之微生物只要使用包含能夠同化之碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基於適當之條件下進行培養即可。可自如此獲得之微生物或培養液藉由一般之方法進行酵素之採集、製備，進而藉由冷凍乾燥、噴霧乾燥、結晶等而獲得所需之酵素形態。例如，可使用通常之方法自培養物回收及製備酵素，如藉由離心分離或過濾而進行微生物之分離、將上清液或濾液中之酵素藉由添加硫酸銨等鹽而進行沈澱或藉由添加乙醇等有機溶劑而進行沈澱、使用超濾膜等進行濃縮或脫鹽、使用離子交換或凝膠過濾等各種層析法進行純化等。

或者，該M23A亞家族蛋白酶可利用上述胺基酸序列，藉由化學合成或生物學方法製造。例如，藉由培養基於胺基酸序列而化學合成之以表現M23A亞家族蛋白酶基因之方式轉形的微生物，並自微生物或培養物製備目標酵素，可獲得M23A亞家族蛋白酶。作為此種轉形微生物，例如可列舉將可作動地連結於控制區之M23A亞家族蛋白酶基因導入至宿主細胞之基因組中或質體中而獲得之微生物、於合適之位置導入了組入有目標基因之表現載體之微生物等。作為M23A亞家族蛋白酶基因之例，可列舉包含序列編號1之序列或與其具有至少80%之同一性之序列且編碼上述BLP之基因、包含序列編號3之序列或與其具有至少80%之同一性之序列且編碼上述LasA之基因、包含序列編號5之序列或與其具有至少80%之同一性之序列且編碼上述AhP之基因等。

於本說明書中，基因之「控制區」係指具有控制該區域之下游之基因於細胞內之表現之功能，較佳為具有使下游基因組成性表現或高表現之功能的區域。具體而言，可定義為存在於該基因中之編碼區之上游，具有RNA聚合酶相互作用而控制該基因之轉錄之功能的區域。較佳為本說明書中之基因之控制區係指該基因中之編碼區之上游200～600個核苷酸左右之區域。控制區包含基因之轉錄起始控制區及/或轉譯起始控制區、或者自轉錄起始控制區至轉譯起始控制區之區域。轉錄起始控制區係包含啟動子及轉錄起始點之區域，轉譯起始控制區係與起始密碼子一起形成核糖體結合部位之相當於夏因-達爾加諾(SD，Shine-Dalgarno)序列之部位(Shine, J., Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1974, 71: 1342-1346)。

包含M23A亞家族蛋白酶基因之表現載體可藉由在可穩定地保持該基因，能夠於宿主微生物內複製、維持，且使該M23A亞家族蛋白酶穩定地表現的載體中組入M23A亞家族蛋白酶基因而製作。作為該載體，於將大腸桿菌作為宿主之情形時，可列舉pUC18、pBR322、pHY300PLK等，於將枯草桿菌作為宿主之情形時，可列舉pUB110、pHSP64(Sumitomo等人，Biosci. Biotechnol. Biocem., 1995, 59: 2172-2175)或者pHY300PLK(TAKARA BIO)等。

宿主微生物之轉形可使用原生質體法、勝任細胞法、電穿孔法等進行。作為宿主微生物，並無特別限制，可列舉芽孢桿菌(Bacillus)屬(例如枯草桿菌)等革蘭氏陽性菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌、鏈黴菌(Streptomyces)屬、酵母菌(Saccharomyces)屬(酵母)、麴菌屬(Aspergillus)屬(黴)等真菌等。較佳之宿主為與供導入至該宿主之M23A亞家族蛋白酶基因之來源菌同種或同屬之微生物、大腸桿菌、或者芽孢桿菌屬細菌，更佳為芽孢桿菌屬細菌。

所獲得之轉形體只要使用包含能夠同化之碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基於適當之條件下進行培養即可。可自如此獲得之微生物或培養液藉由一般之方法進行酵素之採集、製備，進而藉由冷凍乾燥、噴霧乾燥、結晶等而獲得所需之酵素形態。例如，可使用通常之方法自培養物回收及製備酵素，如藉由離心分離或過濾而進行重組微生物之分離、將上清液或濾液中之酵素藉由添加硫酸銨等鹽而進行沈澱或藉由添加乙醇等有機溶劑而進行沈澱、使用超濾膜等進行濃縮或脫鹽、使用離子交換或凝膠過濾等各種層析法進行純化等。

或者，該M23A亞家族蛋白酶可由包含其之酵素組合物等製備。例如，BLP可自無色肽酶製備。無色肽酶係源自產酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)之溶菌酵素，含有BLP。無色肽酶係由和光純藥工業(股)等市售。

以下，一面示出具體之實施形態，一面更詳細地說明本發明。

(A.評估角質污垢分解能力之方法) 作為角質層之主成分的角蛋白及兜甲蛋白具有甘胺酸富集區(非專利文獻4、以及圖7及圖10)。本發明者等人推測出，若為能夠分解該甘胺酸富集區之Gly-Gly鍵之蛋白酶，則有可能可清潔角質污垢。於是，本發明者等人調查了作為能夠分解Gly-Gly鍵之蛋白酶而為人所知之M23家族蛋白酶BLP、LasA、AhP、ALE-1及溶葡萄球菌酶之角質污垢清潔力(實施例2)。其結果，預料外地，即便為能夠分解Gly-Gly鍵之M23家族蛋白酶，屬於M23B亞家族蛋白酶之ALE-1及溶葡萄球菌酶亦未確認到角質污垢清潔力，另一方面，屬於M23A亞家族蛋白酶之BLP、LasA及AhP確認到角質污垢清潔力。進而，本發明者等人確認到BLP、LasA及AhP之角蛋白分解活性(實施例4、5)、以及BLP之兜甲蛋白分解活性(實施例8)。根據該等結果推測出，BLP、LasA及AhP藉由分解角質之蛋白質而發揮角質污垢清潔力。

繼而，本發明者等人為了查明造成M23A亞家族蛋白酶與M23B亞家族蛋白酶之角質污垢分解能力(清潔力)之差異的機制，調查了該等蛋白酶對具有甘胺酸-甘胺酸鍵之各種肽之分解活性。其結果，角質污垢分解能力較高之M23A亞家族蛋白酶對所調查之所有具有甘胺酸-甘胺酸鍵之肽確認到分解活性(實施例9)。另一方面，未確認到角質污垢分解能力之屬於M23B亞家族之蛋白酶雖然對具有五甘胺酸(GGGGG)序列之肽顯示較弱之活性，但是對具有甘胺酸-甘胺酸鍵但亦具有甘胺酸以外之胺基酸之肽未顯示有意義之活性。根據該等結果，推測出酵素為了分解角質污垢，除了分解Gly-Gly鍵之能力以外，亦需要能夠分解甘胺酸之比率雖然高但亦包含甘胺酸以外之胺基酸之肽的能力。因此，判斷對具有甘胺酸-甘胺酸鍵之各種肽之分解活性之等級成為酵素之角質污垢分解能力(清潔力)之指標。

因此，於一態樣中，本發明提供一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法。本發明之方法包括：測定受驗酵素或包含其之組合物對具有GGGGG或GGGG之肽(以下，於本說明書中亦簡稱為「基準肽」)、及具有甘胺酸-甘胺酸鍵且於甘胺酸間具有甘胺酸以外之胺基酸之肽(以下，於本說明書中亦簡稱為「受質肽」)的分解活性。

本發明之方法中使用之基準肽較佳為選自由GGGGG(序列編號30)及GGGG(序列編號31)所組成之群中之一種以上，更佳為GGGGG或GGGG，進而較佳為GGGGG。本發明之方法中使用之受質肽較佳為選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群中之一種以上，更佳為GGGXG(X表示甘胺酸以外之任意胺基酸殘基)。較佳為該受質肽中之X選自S、Y、L及F。進而較佳為該受質肽係選自由GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG(序列編號32～35)所組成之群中之一種以上。進而較佳為該受質肽至少包含GGGSG及GGGYG。於一實施形態中，該受質肽為GGGSG及GGGYG。於另一實施形態中，該受質肽為GGGSG、GGGYG及GGGFG。進而較佳為該受質肽為GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG。於本發明之方法中，測定受驗酵素或包含其之組合物對該等基準肽與受質肽各者之分解活性。

利用本發明之方法評估之受驗酵素之種類及來源生物之物種並無特別限定。該受驗酵素可為天然存在之酵素，亦可為其人工變異體。較佳為該受驗酵素為蛋白酶。

又，作為利用本發明之方法評估之包含受驗酵素之組合物之例，可列舉包含受驗酵素在內之兩種以上之酵素之組合，或含有包含受驗酵素在內之一種或兩種以上之酵素與該酵素以外之其他成分的組合物等。較佳為該受驗酵素為蛋白酶。

該組合物亦可含有該受驗酵素以外之其他酵素。作為該其他酵素之例，可列舉選自由與受驗酵素不同之蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、過氧化酶、漆酶、澱粉酶(α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶等)、角質酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質酶、聚三葡萄糖酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙醯酯酶、聚半乳糖醛酶、鼠李半乳糖醛酶、果膠裂解酶、甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、及轉麩醯胺酸酶等水解酵素所組成之群中之一種或兩種以上。其中，較佳為與受驗酵素不同之蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、脂酶、或該等之一種或兩種以上之組合。作為與受驗酵素不同之蛋白酶之例，可列舉與受驗酵素不同之鹼性蛋白酶，但不限於此。

作為可包含於該組合物中之酵素以外之其他成分之例，可列舉通常用於洗劑組合物之成分。例如，作為該其他成分，可包含水、界面活性劑、螯合劑、水溶性聚合物、水溶混性有機溶劑、鹼劑、有機酸或其鹽、酵素穩定劑、螢光劑、再污染防止劑、分散劑、防移染劑、整理劑、過氧化氫等漂白劑、抗氧化劑、助溶劑、pH值調製劑、緩衝劑、防腐劑、香料、鹽、醇、糖類等。作為界面活性劑，可使用陰離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、及陽離子性界面活性劑等任意之界面活性劑之一種或組合兩種以上使用。

因此，作為本發明之方法中使用之包含受驗酵素之組合物之進而一例，可列舉包含受驗酵素之洗劑組合物。該洗劑組合物可為粉末等固形組合物，亦可為液體組合物，較佳為液體洗劑組合物。該洗劑組合物較佳為洗滌用洗劑組合物，更佳為洗滌用液體洗劑組合物。再者，於本說明書中，有時亦將本發明之方法中使用之受驗酵素或包含其之組合物統稱為「受驗物」。

該受驗酵素或包含其之組合物對該基準肽或受質肽之分解活性可藉由使該受驗酵素或包含其之組合物與該基準肽或該受質肽接觸，繼而測量該基準肽或該受質肽之分解量而測定。作為測量肽之分解量之方法，可列舉FRET(fluorescence energy transfer，螢光能量轉移)分析、氣相層析法、液相層析法、薄層層析法等。其中，較佳為FRET分析。

於藉由FRET分析而定量該基準肽或受質肽之分解之情形時，較佳為準備於螢光基與消光基之間配置有該基準肽或受質肽之FRET受質。若FRET受質所含之該基準肽或受質肽藉由與酵素接觸而分解，則螢光基與消光基之距離變化，自螢光基發出之螢光之強度變化。藉由測定該自螢光基之螢光強度之變化，可定量該基準肽或受質肽之分解。作為FRET受質中之螢光基與消光基之組合之例，可列舉[螢光基]：Nma：2-(N-甲基胺基)苯甲醯基、[消光基]：Lys(Dnp)：側鏈具有2,4-二硝基苯基(Dnp)之離胺酸(Lys)殘基。具有該等螢光基及消光基與特定之肽之FRET受質、或用於使用該受質之FRET反應之試劑及溶劑有市售，例如可自PH Japan股份有限公司等購買。

於該基準肽或受質肽之分解量之測量所使用之反應溶液中，該受驗酵素之濃度以蛋白質質量計，較佳為0.01～50 μg/mL，該基準肽或該受質肽之濃度較佳為1～3000 μM，但不限定於該等。反應溫度及pH值可為該受驗酵素之最適條件，或者亦可為設想將該受驗酵素應用於角質污垢分解之情形之條件。為了於測量時間中酵素反應不結束而能夠經時地檢測該基準肽或受質肽之由酵素分解所引起之螢光強度之變化，理想為使該受驗酵素與基準肽或受質肽接觸後迅速地開始測量，及充分提高反應溶液中之該基準肽或受質肽之濃度。反應時間並無特別限制，於FRET分析之情形時較佳為0.1～10分鐘左右，於層析法之情形時較佳為數分鐘～數小時左右。

基於FRET分析中測得之螢光強度而測定受驗物對基準肽或受質肽之分解活性。較佳為該分解活性係基於校準曲線而求出。該校準曲線例如可藉由於與受驗物之分析相同之反應條件下測定標準溶液之螢光強度而製作。作為該標準溶液之例，可列舉與受驗物之分析所使用之反應溶液相比，不含該受驗酵素且包含利用二甲基亞碸溶解之FRETS-25-STD1(PEPTIDE INSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGXG的溶液。該受驗物之分解活性亦可表示為比活性(該受驗物之蛋白質質量每1 mg之活性U；U/mg)。受驗物之蛋白質質量可利用DC蛋白質分析套組(Bio-Rad)等市售之套組或公知之方法(例如Lowry法、Bradfrod法)求出。

較佳為該受驗物對基準肽及受質肽之分解活性係藉由以下方法測定：作為受質，使用Nma與Lys(Dnp)之間為GGGXG(X為G、S、Y、L、F之任一者)之FRET受質[以下稱為FRET-GGGXG]。於該FRET受質中，Nma結合於GGGXG之N末端側，Lys(Dnp)結合於GGGXG之C末端側。向96孔分析板添加含有受驗酵素或包含其之組合物之酵素溶液(受驗酵素、20 mM Tris-HCl(pH值7.5))190 μL，進而添加FRET-GGGXG溶液(1 mM FRET-GGGXG、100 mM Tris-HCl(pH值7.5))10 μL而製備反應液。使用螢光讀板儀於溫度30℃、激發波長340 nm、測定波長440 nm下經時測定反應液之螢光強度。另一方面，於與上述相同之反應條件下，使用20 mM Tris-HCl pH值7.5液代替酵素溶液、使用利用二甲基亞碸溶解之FRETS-25-STD1(PEPTIDE INSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGXG，測定該反應液之螢光強度，製作校準曲線。1單位(U)之活性係設為顯示相當於每1分鐘由1 nmol之FRETS-25-STD1所產生之螢光強度的螢光強度之變化所需之酵素量。算出該受驗物之基準肽或受質肽之分解之比活性(該受驗物之蛋白質質量每1 mg之活性；U/mg)。受驗物之蛋白質質量可利用DC蛋白質分析套組(Bio-Rad)求出。再者，上述程序為一例，在藉由本發明進行之受驗物之分解活性之測定中，可根據使用之受驗物之種類等適當決定測定條件。

較佳為於本發明之方法中，針對該受驗酵素或包含其之組合物對角質污垢之分解能力，基於該受驗酵素或包含其之組合物對該基準肽及受質肽各者之分解活性之等級進行評估。關於對該基準肽之分解活性之等級，較佳為基於其比活性進行評估。另一方面，關於對各受質肽之分解活性之等級，較佳為基於對各受質肽之分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值(即相對分解活性)進行評估。較佳為於本發明之方法中，求出該受驗酵素或包含其之組合物對上述基準肽及受質肽各者之分解活性之比活性。繼而，針對求出之對各受質肽之該比活性各者，求出相對於對基準肽之該比活性之相對值。對該基準肽及受質肽之該比活性可藉由上述程序求出。

因此，較佳為於本發明之方法中，於受驗酵素或包含其之組合物之該基準肽之分解之比活性為特定值以上，且針對任一種受質肽之上述相對分解活性為特定值以上的情形時，將該受驗酵素或包含其之組合物選作具有對角質污垢之分解能力者。例如，於本發明之方法中，於受驗酵素或包含其之組合物之該基準肽之分解之比活性為10(U/mg)以上，且針對任一種以上之受質肽之上述中求出之相對分解活性為0.5以上的情形時(例如將該受驗酵素或包含其之組合物對基準肽之比活性設為1時，該受驗酵素或包含其之組合物對任一種以上之受質肽之比活性為0.5以上的情形時)，選擇該受驗酵素或包含其之組合物。更佳為於受驗酵素或包含其之組合物之該基準肽之分解之比活性為10(U/mg)以上，且針對任兩種以上之受質肽之該相對分解活性為0.5以上的情形時，選擇該受驗酵素或包含其之組合物。進而較佳為於受驗酵素或包含其之組合物之該基準肽之分解之比活性為10(U/mg)以上，且針對使用之所有種類之受質肽之該相對分解活性為0.5以上的情形時，選擇該受驗酵素或包含其之組合物。選擇之受驗酵素或包含其之組合物評估為具有對角質污垢之分解能力。另一方面，受驗酵素對基準肽之比活性未達10(U/mg)之受驗酵素或包含其之組合物、或針對任一受質肽之該相對分解活性均未達0.5之受驗酵素或包含其之組合物不評估為具有對角質污垢之分解能力。

或者，於本發明中，亦可利用上述受驗酵素蛋白質質量每1 mg之比活性以外之基準來評估該受驗酵素或包含其之組合物對該基準肽及受質肽之分解活性。例如，使用發光、螢光、比色反應、吸光度、或其他用於定量酵素分解物之通常之方法來測定由該受驗酵素或包含其之組合物所致之該基準肽及受質肽之分解量。可根據該基準肽及受質肽之分解量之測定值，求出對各受質肽之分解活性相對於基準肽之相對值，進而基於預先製作之校準曲線或預先設定之基準值，根據獲得之測定值是否相當於上述比活性10 U/mg以上而進行判斷。

利用以上之程序而選擇出之評估為具有對角質污垢之分解能力的受驗酵素或包含其之組合物可進而選作角質污垢分解酵素或者角質污垢分解用組合物、或該等之候選物質。因此，本發明之方法之一實施形態係一種角質污垢分解酵素或角質污垢分解用組合物、或該等之候選物質之選擇方法。

利用上述程序藉由本發明之方法而選擇出之受驗酵素或包含其之組合物可視需要進一步加以評估，而選作目標角質污垢分解酵素或角質污垢分解用組合物。作為該進一步之評估，並無特別限定，例如可列舉實際之衣領袖口污垢之分解能力之評估、或角質樣品或由此萃取之角蛋白或兜甲蛋白之分解能力之評估等。

藉由本發明之方法而評估為具有對角質污垢之分解能力的酵素或包含其之組合物由於對包含大量甘胺酸之受質之比活性較高，故而推測係對甘胺酸富集區之選擇性較高之酵素。實際上，由具有對上述受質肽之分解活性之M23A亞家族蛋白酶所產生之具有甘胺酸富集區之角蛋白之分解反應產物中未鑑定到甘胺酸富集區，而殘留甘胺酸富集區以外之區域(實施例6、9)。另一方面，推測羊毛角蛋白由於不具有甘胺酸富集區，故而不易被藉由本發明之方法而選擇出之酵素或包含其之組合物分解[UniProt Knowledgebase_P02534、UniProt Knowledgebase_P25691]。因此，藉由本發明之方法而選擇出之酵素或包含其之組合物很有可能係具有角質污垢分解能力，另一方面，對羊毛角蛋白等動物性纖維之分解能力較低之酵素或其組合物。即，期待藉由本發明之方法而評估為具有對角質污垢之分解能力之酵素係對羊毛等動物性纖維之分解能力(或對動物性纖維之損傷性)較低之酵素。

因此，本發明之方法之另一實施形態可為除了酵素或包含其之組合物對角質污垢之分解能力之評估以外，亦評估其對動物性纖維之分解能力(或對動物性纖維之損傷性)的方法。於該方法中，受驗酵素或包含其之組合物可視需要進而進行對動物性纖維之分解能力之評估、或對角質污垢與動物性纖維之分解能力之評估，而選作具有角質污垢分解能力且對動物性纖維之分解能力(或對動物性纖維之損傷性)較低的酵素或組合物之候選。較佳為於該方法中，對利用上述程序而選作具有角質污垢分解能力之酵素或組合物的受驗酵素或包含其之組合物進而進行對動物性纖維之分解能力之評估、或對角質污垢與動物性纖維之分解能力之評估。

作為受驗酵素或包含其之組合物對動物性纖維之分解能力之評估方法，例如可列舉測定該受驗酵素或包含其之組合物對動物性纖維或角蛋白之分解活性、分析由該受驗酵素或包含其之組合物所產生之動物性纖維或角蛋白之分解產物等。作為該動物性纖維或角蛋白，較佳為源自動物性纖維之角蛋白，更佳為羊毛角蛋白，進而較佳為源自羊毛之天青角蛋白。又，結合有色素、螢光物質等之動物性纖維或角蛋白亦由於可藉由測定反應液之離心上清液之吸光度或螢光強度而容易地評估分解能力，故而作為用於該分解能力評估之受質而言較佳。

作為受驗酵素或包含其之組合物對角質污垢與動物性纖維之分解能力之評估方法，例如可列舉測定該受驗酵素或包含其之組合物對角蛋白之分解活性、分析由該受驗酵素或包含其之組合物所產生之角蛋白之分解產物等。作為該角蛋白，較佳為分子量為35,000以上之具有甘胺酸富集區之角蛋白，更佳為角蛋白1或10，進而較佳為角蛋白10。角蛋白10例如可藉由如下方式獲得：自人之腳跟削出角質，添加助溶液(100 mM Tris-HCl(pH值8.5)、2%SDS、25 mM DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)、5 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸))，以100℃加熱10分鐘後，進行離心分離，將上清液於透析緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、0.1%SDS)中透析一晩。

受驗酵素或包含其之組合物之角蛋白分解活性可藉由如下方式測定：使該受驗酵素或包含其之組合物與該角蛋白接觸，繼而測量作為藉由酵素反應而生成之分解產物的角蛋白片段之分子量。使酵素與角蛋白接觸時，酵素之濃度以蛋白質質量計，較佳為0.001～100000 μg/mL，更佳為0.01～10000 μg/mL，進而較佳為0.1～1000 μg/mL，另一方面，角蛋白之濃度以蛋白質質量計，較佳為0.001～10000 g/L，更佳為0.1～100 g/L，進而較佳為0.1～10 g/L，但不限於該等。反應溫度及pH值可為該受驗酵素之最適條件，或者亦可為設想將該受驗酵素應用於角質污垢分解之情形之條件。反應時間並無特別限制，較佳為1～3000分鐘，更佳為60～1500分鐘，進而較佳為60～600分鐘。

作為測量角蛋白片段之分子量之方法，可列舉電泳法(例如SDS-PAGE)、凝膠過濾層析法、動態光散射法等。其中，較佳為SDS-PAGE。因此，本說明書中之角蛋白或其片段之分子量較佳為藉由SDS-PAGE測得之分子量。將藉由SDS-PAGE進行分子量測定之程序之例記載於以下：將包含角蛋白片段之試樣溶液與包含50 mM二硫蘇糖醇之2×Laemmli樣品緩衝液進行等量混合，並以100℃加熱5分鐘，藉此製備泳動樣品。將該泳動樣品使用Any kD^TM Mini-PROTEAN(註冊商標)TGX^TM 預製膠及電泳用緩衝液(25 mM Trsi、192 mM甘胺酸、0.1%(w/v)SDS、pH值8.3)進行電泳。此時，分子量標記物係使用Precision Plus Protein^TM 雙色標準品。泳動後之凝膠係進行CBB(Coomassie brilliant blue，考馬斯亮藍)染色或Ruby染色。於可根據分子量標記物之分子量與遷移率而製成之校準曲線之式中代入目標蛋白質或多肽之遷移率，將藉此獲得之值設為該目標蛋白質或多肽之分子量。此處，樣品之遷移率(Rf值)係設為將該樣品流過之泳道中之自凝膠之上端(或應用有樣品之位置)至示蹤色素(溴酚藍)之距離設為1時，該凝膠之上端(或應用有樣品之位置)至該樣品之條帶的距離之相對值。再者，上述藉由SDS-PAGE進行分子量測定之程序係藉由本發明進行之角蛋白片段分子量之測量程序之一例，可根據使用之角蛋白片段或分解物之分子量而適當決定測定條件，並選擇標記物等。

於本發明之方法中，於上述中求出之角蛋白片段之分子量為與該受驗酵素或包含其之組合物接觸前之角蛋白(例如全長角蛋白)之分子量之50%以上且97%以下之情形時，該受驗酵素或包含其之組合物評估為具有對角質污垢之分解能力，進而對動物性纖維之分解能力較低。此種受驗酵素或組合物係選作動物性纖維之損傷性較低之角質污垢分解酵素或角質污垢分解用組合物。

另一方面，於上述中求出之角蛋白片段之分子量大於全長角蛋白之分子量之97%(未確認到角蛋白之分解)之情形時，該受驗酵素或包含其之組合物評估為對角質污垢之分解能力較低。或者，於上述中求出之角蛋白片段之分子量未達全長角蛋白之分子量之50%之情形時，該受驗酵素或包含其之組合物係評估為對動物性纖維之分解能力較高。此種受驗酵素或組合物對動物性纖維之損傷性較高。

(B.角質污垢清潔劑) 於上述藉由本發明之評估角質污垢分解能力之方法中，發現M23家族蛋白酶之中，尤其是BLP、LasA及AhP等M23A亞家族蛋白酶具有角質污垢清潔力。因此，於進而一態樣中，本發明提供一種角質污垢清潔劑。本發明之角質污垢清潔劑含有M23A亞家族蛋白酶作為有效成分。於另一態樣中，本發明提供一種M23A亞家族蛋白酶之用途，其用於製造角質污垢清潔劑。於又一態樣中，本發明提供一種M23A亞家族蛋白酶之用途，其用於清潔角質污垢。於本發明中，該角質污垢較佳為衣領袖口污垢。於一實施形態中，該清潔係浸漬放置清潔，本發明之清潔劑係浸漬放置清潔用之清潔劑。然而，藉由本發明之清潔之種類及本發明之清潔劑之形態不限於該等。

於本發明中，M23A亞家族蛋白酶係用作用以清潔角質污垢之有效成分。本發明中使用之M23A亞家族蛋白酶可為在上述藉由本發明之評估角質污垢分解能力之方法中評估為具有對角質污垢之分解能力者。更詳細而言，本發明中使用之M23A亞家族蛋白酶可具有基準肽之分解之比活性為10(U/mg)以上，且對一種以上之受質肽之分解活性相對於對該基準肽之分解活性之相對值為0.5以上的性質。該基準肽為GGGGG(序列編號30)或GGGG(序列編號31)，較佳為GGGGG。該受質肽為選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群中之一種以上，較佳為GGGXG(X表示甘胺酸以外之任意胺基酸殘基)，更佳為選自由GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG(序列編號32～35)所組成之群中之一種以上。較佳為該M23A亞家族蛋白酶之GGGGG之分解之比活性為10(U/mg)以上，且於將GGGGG之分解之比活性設為1時，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG之分解之相對比活性為0.5以上。該M23A亞家族蛋白酶對該基準肽及受質肽之分解之比活性可根據按下述參考例2及3所記載之方法測得之酵素之活性與蛋白質質量而算出。

於較佳之實施形態中，本發明中所使用之M23A亞家族蛋白酶可為選自由BLP、LasA及AhP所組成之群中之至少一種。於更佳之實施形態中，本發明中使用之M23A亞家族蛋白酶為BLP。

於本發明中，可使用含有該M23A亞家族蛋白酶之酵素組合物作為用於清潔角質污垢之有效成分。較佳為該酵素組合物含有選自由BLP、LasA及AhP所組成之群中之至少一種。更佳為該酵素組合物含有BLP。作為該酵素組合物之較佳之例，可列舉無色肽酶。

於一實施形態中，該本發明之角質污垢清潔劑本質上可由上述M23A亞家族蛋白酶或含有其之酵素組合物構成。於較佳之實施形態中，該本發明之角質污垢清潔劑係包含上述M23A亞家族蛋白酶或含有其之酵素組合物的組合物。換言之，本發明中用作有效成分之M23A亞家族蛋白酶或含有其之酵素組合物可以包含其之組合物之形態使用。

如下述實施例1所示，M23A亞家族蛋白酶具有對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革蘭氏陽性菌之殺菌性。因此，於本發明中，M23A亞家族蛋白酶或含有其之組合物可用作不僅用於角質污垢清潔，亦用於革蘭氏陽性菌之殺菌之成分。因此，於一實施形態中，本發明之角質污垢清潔劑具有對革蘭氏陽性菌之殺菌性。

如上所述，「角質污垢」中包含兜甲蛋白及角蛋白，另一方面，於本發明之評估方法中評估為具有對角質污垢之分解能力之M23A亞家族蛋白酶具有角蛋白分解活性(實施例4、5)及兜甲蛋白分解活性(實施例8)。因此，於一實施形態中，本發明之角質污垢清潔劑係包含角蛋白或兜甲蛋白之污垢之清潔劑。較佳為該角蛋白為角蛋白1或角蛋白10，更佳為角蛋白10。

如上所述，於本發明之評估方法中評估為具有對角質污垢之分解能力之M23A亞家族蛋白酶與蛋白酶K相比，對羊毛角蛋白等動物性纖維之分解能力(或對動物性纖維之損傷性)較低(實施例7)。較佳為該M23A亞家族蛋白酶為將具有甘胺酸富集區且分子量為35,000以上之角蛋白、較佳為角蛋白10以其分子量維持為50%以上且97%以下之方式分解。因此，本發明之角質污垢清潔劑係對動物性纖維之損傷性較低之角質污垢清潔劑。更詳細而言，本發明之角質污垢清潔劑與除代替其有效成分M23A亞家族蛋白酶而包含蛋白酶K以外具有相同組成的清潔劑相比，動物性纖維、較佳為羊毛角蛋白之分解能力較低。

作為包含該M23A亞家族蛋白酶或含有其之酵素組合物的組合物之例，可列舉洗劑組合物，較佳為列舉洗滌用洗劑組合物。該洗劑組合物可為粉末等固形組合物，亦可為液體組合物，較佳為液體洗劑組合物。更佳為該洗劑組合物為洗滌用液體洗劑組合物。

本發明之洗劑組合物中之M23A亞家族蛋白酶之含量只要為該蛋白酶顯示活性之量，則並無特別限制，相對於洗劑組合物每1 kg，較佳為0.001～80000 mg，更佳為0.01～10000 mg，進而較佳為0.1～3000 mg。

本發明之洗劑組合物除M23A亞家族蛋白酶以外，含有界面活性劑及水。作為界面活性劑，可使用陰離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、及陽離子性界面活性劑等任意之界面活性劑之一種或將兩種以上組合使用。本發明之洗劑組合物中之該界面活性劑之含量較佳為10～80質量%，更佳為30～70質量%。

作為非離子性界面活性劑，只要為一般調配於液體洗劑之具有C8～C22之烴基且加成有數莫耳以上之C2氧伸烷基的非離子性界面活性劑即可，例如可列舉以下： R₁ O-(AO)m-H(R₁ ＝C8-C22烴、AO＝C2-C5氧伸烷基、m＝16～35)[日本專利特開2010-275468號公報]； R₁ O-(EO)l-(AO)m-(EO)n-H(R₁ ＝C8-C18烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、l＝3～30、m＝1～5、l＋n＝14～50)[日本專利特開2010-265445號公報、日本專利特開2011-63784號公報]； R₁ O-(EO)m/(AO)n-H(R₁ ＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、m＝10～30、n＝0～5、EO及AO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-189551號公報]； R₁ (CO)lO-(EO)m/(AO)n-R₂ (R₁ ＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、l＝0～1、m＝14～50、n＝1～5、R₂ ＝氫(l＝0)或C1-C3烷基、EO及AO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-229385號公報]； R₁ O-(EO)m-(AO)n-H(R₁ ＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、m＝15～30、n＝1～5)[日本專利特開2010-229387號公報]； R₁ O-(AO)m/(Gly)n-H及/或R₂ -COO-(AO)p/(Gly)q-H(R₁ ＝C8-C22烴基、R₂ ＝C7-C21烴基、AO＝C2-C3氧伸烷基、Gly＝甘油基、m＝0～5、n＝2～10、p＝0～5、q＝2～10、AO及Gly為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-254881號公報]； R₁ -COO-(PO)m/(EO)n-R₂ (R₁ ＝C7-C21烴基，COO＝羰氧基、R₂ ＝C1-C3烷基、PO＝氧伸丙基、EO＝氧伸乙基、m＝0.3～5、n＝8～25、PO及EO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-265333號公報]； R₁ O-(EO)l-(PO)m-(EO)n-H(R₁ ＝C8-C20烴、EO＝C2氧伸烷基、PO＝氧伸丙基、l＞＝1、n＞＝1、0＜m＜l＋n、EO及PO為嵌段鍵結)[WO98/24865]； R₁ O-(EO)m-(PO)n-H(R₁ ＝C10-C16之烷基或烯基、EO＝環氧乙烷基、PO＝環氧丙烷基、m＝5～15、n＝1～3)[日本專利特開平8-157867號公報]； R₁ (CO)-(EO)m-OR₂ (R₁ ＝C11-C13直鏈或支鏈狀烷基或烯基、R₂ ＝C1-C3烷基、EO＝環氧乙烷基、m＝10～20)[日本專利特開2008-7706號公報、日本專利特開2009-7451號公報、日本專利特開2009-155594號公報、日本專利特開2009-155606號公報]； R₁ (CO)-(AO)m-OR₂ (R₁ ＝C9-C13直鏈或支鏈狀烷基或烯基、AO＝C2-C4氧伸烷基、R₂ ＝C1-C3烷基、m＝5～30)[日本專利特開2009-144002號公報、日本專利特開2009-173858號公報、日本專利特開2010-189612號公報]； R^1c -O-(A'O)m-H(R^1c 為碳數8以上且18以下之脂肪族烴基，A'O為選自碳數2之伸烷氧基及碳數3之伸烷氧基之伸烷氧基，m為A'O之平均加成莫耳數，且為3以上且50以下之數)[日本專利特開2017-071664號公報]；以及 脂肪酸烷醇醯胺、脂肪酸烷醇葡糖醯胺、烷基聚葡萄糖苷等。

作為陰離子界面活性劑，例如可列舉羧酸酯型陰離子界面活性劑、磺酸型或硫酸酯型陰離子界面活性劑、非皂系陰離子界面活性劑、直鏈烷基苯磺酸、苯磺酸或其鹽、聚氧苯磺酸或其鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鹽、聚氧伸烷基烷基醚硫酸酯鹽、α-烯烴磺酸鹽、內部烯烴磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、α-磺基脂肪酸鹽、脂肪酸皂、磷酸酯鹽系界面活性劑、醯基丙胺酸鹽、醯基牛磺酸鹽、烷基醚羧酸、醇硫酸酯等。

作為陽離子界面活性劑，例如可列舉具有長鏈烷基之四級銨鹽、具有1個長鏈烷基之三級胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基吡啶鎓鹽等。較佳可列舉具有1個碳數8～22之長鏈烷基之四級銨型界面活性劑、具有1個碳數8～22之長鏈烷基之三級胺。

作為兩性離子活性劑，例如可列舉烷基乙酸甜菜鹼、烷醇醯胺丙基乙酸甜菜鹼、烷基咪唑啉、烷基丙胺酸等、烷基甜菜鹼型、烷基醯胺甜菜鹼型、咪唑啉型、烷基胺基碸型、烷基胺基羧酸型、烷基醯胺羧酸型、醯胺胺基酸型或磷酸型之兩性界面活性劑等。較佳可列舉具有碳數10～18之烷基之磺基甜菜鹼或羰基甜菜鹼。

本發明之洗劑組合物可進而含有通常用於洗劑組合物之成分、例如螯合劑、水溶性聚合物、水溶混性有機溶劑、鹼劑、有機酸或其鹽、M23A亞家族蛋白酶以外之其他酵素、酵素穩定劑、螢光劑、再污染防止劑、分散劑、防移染劑、整理劑、過氧化氫等漂白劑、抗氧化劑、助溶劑、pH值調製劑、緩衝劑、防腐劑、香料、鹽、醇、糖類等。

作為螯合劑，例如可列舉氮基三乙酸、亞胺基二乙酸、乙二胺乙酸、二乙三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸、羥乙基亞胺基二乙酸、三乙四胺六乙酸、金龜胺酸等胺基多乙酸或該等之鹽，二甘醇酸、羥基二琥珀酸、羧甲基羥基琥珀酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、羥基二琥珀酸、葡萄糖酸、羧甲基琥珀酸、羧甲基酒石酸等有機酸及該等之鹽，以及胺基三(亞甲基膦酸)、1-羥基亞乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)、二乙三胺五(亞甲基膦酸)、及該等之鹼金屬或低級胺鹽等。作為本發明之洗劑組合物中之螯合劑之例，如上述所列舉。本發明之洗劑組合物中之該螯合劑之含量較佳為0.1～5質量%，更佳為0.1～4質量%。

作為水溶性聚合物，例如可列舉如下具有接枝結構之高分子化合物，其具有：(i)包含源自碳數2～5之環氧化物之聚合單元而構成之聚醚鏈部分與(ii)包含源自選自丙烯酸、甲基丙烯酸及馬來酸中之一種以上之不飽和羧酸單體之聚合單元而構成之聚合物鏈部分，且(i)或(ii)之任一者成為主幹鏈，另一者成為分枝鏈(日本專利特開2010-275468號公報、日本專利特開平10-060496號公報)；具有對苯二甲酸烷二酯單元及/或間苯二甲酸烷二酯單元與氧伸烷基單元及/或聚氧伸烷基單元之水溶性聚合物(日本專利特開2009-155606號公報)等。本發明之洗劑組合物中之該水溶性聚合物之含量較佳為0.2～10質量%，更佳為0.4～5質量%。

作為水溶混性有機溶劑，例如較佳為烷醇類之伸烷基二醇類或甘油、聚伸烷基二醇類、(聚)伸烷基二醇(單或二)烷基醚類、烷基甘油醚類、(聚)伸烷基二醇之芳香族醚類。較佳為乙二醇、丙二醇、丁二醇、或己二醇等碳數2～6之伸烷基二醇類、或者甘油、或聚乙二醇單苯醚、乙二醇單苄醚、二乙二醇單苄醚等。本發明之洗劑組合物中之該水溶混性有機溶劑之含量較佳為1～40質量%，更佳為1～35質量%。

關於鹼劑，例如作為具有1～3個C2-C4之烷醇之烷醇胺，可列舉單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧伸烷基胺、二甲胺基丙基胺等。較佳為單乙醇胺、三乙醇胺。本發明之洗劑組合物中之該鹼劑之含量較佳為0～20質量%，更佳為0～10質量%。

作為有機酸或其鹽，例如可列舉：飽和脂肪酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、或該等之鹽等多元羧酸類；檸檬酸、蘋果、乙醇酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸或該等之鹽等羥基羧酸類等；其中，較佳為檸檬酸或其鹽。本發明之洗劑組合物中之該有機酸或其鹽之含量較佳為0～5質量%，更佳為0～3質量%。

作為再污染防止劑及分散劑，例如可列舉聚丙烯酸、聚馬來酸、羧甲基纖維素、重量平均分子量5000以上之聚乙二醇、馬來酸酐-二異丁烯共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯醚共聚物、馬來酸酐-乙酸乙烯酯共聚物、萘磺酸鹽福馬林縮合物、及日本專利特開昭59-62614號公報之請求項1～21(第1頁第3欄第5行～第3頁第4欄第14行)記載之聚合物等再污染防止劑及分散劑，但不適於調配之情形亦可不包含。

作為防移染劑，例如可列舉聚乙烯吡咯啶酮，含量較佳為0.01～10質量%。

作為漂白劑，例如較佳為於該洗劑組合物中含有過氧化氫、過碳酸鹽、過硼酸鹽等漂白劑1～10質量%。於使用漂白劑時，可於該洗劑組合物中含有四乙醯基乙二胺(TAED)或日本專利特開平6-316700號公報記載等之漂白活化劑(activator)0.01～10質量%。

作為螢光劑，例如可列舉聯苯型螢光劑(Tinopal CBS-X等)或茋型螢光劑(DM型螢光染料等)。本發明之洗劑組合物中之該螢光劑之含量較佳為0.001～2質量。

作為M23A亞家族蛋白酶以外之其他酵素，例如可列舉其他蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、過氧化酶、漆酶、澱粉酶、角質酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質酶、聚三葡萄糖酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙醯酯酶、聚半乳糖醛酶、鼠李半乳糖醛酶、果膠裂解酶、甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、及轉麩醯胺酸酶等水解酵素、以及該等之兩種以上之混合物。其中，較佳為其他蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、及脂酶、或該等之兩種以上之組合。

作為澱粉酶，可列舉α-澱粉酶、葡萄糖澱粉酶等。作為其他蛋白酶，可列舉先前以來用作洗劑用之蛋白酶(例如日本專利特開2012-45000號公報所記載者)。作為該其他蛋白酶，較佳為於清潔時之pH值附近具有最適pH值的蛋白酶。例如於本發明之組合物為鹼性之洗劑之情形時，作為該其他蛋白酶，較佳為最適pH值存在於較中性靠鹼性側之蛋白酶(即鹼性蛋白酶)。作為鹼性蛋白酶之例，較佳為源自芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)之枯草桿菌蛋白酶(subtilisin protease)，其中，可列舉源自嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus halodurans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)等之枯草桿菌蛋白酶、市售之鹼性蛋白酶等。作為市售之鹼性蛋白酶，可列舉可自Novozymes Japan公司獲取之Alcalase(註冊商標)、Savinase(註冊商標)、Everlase(註冊商標)、Esperase、Kannase(註冊商標)、Ovozyme(註冊商標)、及可自Genencor International公司獲取之Purafect(註冊商標)、Properase等。又，亦可良好地使用日本專利特開2013-233141號公報所記載之蛋白酶(KSM-KP43；序列編號26)、或日本專利第4348047號公報所記載之蛋白酶(K-16；序列編號27)。

作為該鹼性蛋白酶之較佳之例，可列舉KSM-KP43(序列編號26)及K-16(序列編號27)。進而，作為KSM-KP43之變異體的鹼性蛋白酶、包含與序列編號26所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、作為K-16之變異體的鹼性蛋白酶、及包含與序列編號27所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶亦又可列舉作為本發明中可使用之較佳之鹼性蛋白酶之例。於本發明之組合物中，可使用該等鹼性蛋白酶之任一種或兩種以上之組合。

於本發明之組合物中，M23A亞家族蛋白酶相對於該鹼性蛋白酶之質量比較佳為1/20以上，更佳為1/3～20，進而較佳為1～5，進而更佳為2～3。

作為酵素穩定劑，例如可列舉硼化合物、鈣離子源(鈣離子供給化合物)、羥基化合物、甲酸等，作為抗氧化劑，可列舉丁基羥基甲苯、二苯乙烯化甲酚、亞硫酸鈉及亞硫酸氫鈉等，作為助溶劑，可列舉對甲苯磺酸、異丙苯磺酸、間二甲苯磺酸、苯甲酸鹽(亦有作為防腐劑之效果)等。進而，本發明之洗劑組合物亦可含有辛烷、癸烷、十二烷、十三烷等鏈烷類、癸烯、十二碳烯等烯烴類、二氯甲烷、1,1,1-三氯乙烷等鹵化烷基類、D-檸檬烯等萜烯類等水不溶混性有機溶劑、色素、香料、抗菌防腐劑、聚矽氧等消泡劑等。

或者可藉由在既存之洗劑組合物中調配M23A亞家族蛋白酶而製造本發明之洗劑組合物。作為可調配M23A亞家族蛋白酶之洗劑組合物之較佳例，可列舉日本專利特開2010-265333號公報、日本專利特開2014-141662號公報、日本專利特開2009-191128號公報、日本專利特開2012-224652號公報、日本專利特表2013-503950號公報、日本專利特表平11-512768號公報之實施例所記載之液體洗劑組合物。例如，可藉由在日本專利特開2014-141662號公報之實施例4所記載之液體洗劑組合物[調配界面活性劑30%(陰離子界面活性劑20%、非離子界面活性劑10%)、檸檬酸3%、具有羥基之有機溶劑(二乙二醇單丁醚)18%、將組合物之pH值設為8.0所需之鹼劑(單乙醇胺)、離子交換水、及香料等而成之組合物]中調配M23A亞家族蛋白酶而製備本發明之洗劑組合物。

本發明之洗劑組合物較佳為用於衣物、或布製品(床單、毛毯、枕套、沙發套、毛巾等)之清潔，但並無特別限定。更佳為本發明之洗劑組合物係衣料用之洗滌洗劑組合物。較佳為本發明之洗劑組合物係用於清潔具有衣領或袖口、或接觸於脖子周圍之衣物(例如襯衣、白襯衫、毛衣、夾克、外套、領巾、圍巾等)。較佳為本發明之洗劑組合物係角質污垢清潔用之洗滌洗劑組合物、較佳為衣領袖口污垢清潔用之洗滌洗劑組合物。

於進而一態樣中，本發明提供一種使用M23A亞家族蛋白酶之角質污垢之清潔方法。於該方法中，作為M23A亞家族蛋白酶，亦可使用含有其之酵素組合物。於一實施形態中，該本發明之方法可為使用上述本發明之角質污垢清潔劑之角質污垢之清潔方法。較佳為該藉由本發明之角質污垢之清潔方法包括使必須去除角質污垢之被清潔物與M23A亞家族蛋白酶(或本發明之角質污垢清潔劑)接觸。較佳為於該本發明之方法中，該角質污垢為衣領袖口污垢。

於本發明之方法中，於使必須去除角質污垢之被清潔物(例如具有角質污垢之衣物或布製品)與M23A亞家族蛋白酶或本發明之角質污垢清潔劑接觸時，可於溶解有該M23A亞家族蛋白酶、本發明之角質污垢清潔劑、或含有該等之洗劑組合物之水中浸漬放置該被清潔物，又，亦可將該M23A亞家族蛋白酶、本發明之角質污垢清潔劑、或含有該等之洗劑組合物直接塗佈於該被清潔物之角質污垢之部位。於本發明之方法中，亦可進而對該浸漬放置或塗佈洗劑組合物後之被清潔物進行手洗、或利用洗衣機等清洗，但未必有此需要。

本發明又包含以下之物質、製造方法、用途、方法等作為例示之實施形態。但本發明並不限定於該等實施形態。

[1]一種角質污垢清潔劑，其以M23A亞家族蛋白酶作為有效成分。 [2]如[1]記載之清潔劑，其中較佳為上述角質污垢為衣領袖口污垢。 [3]如[1]或[2]記載之清潔劑，其較佳為以含有上述M23A亞家族蛋白酶之酵素組合物作為有效成分。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之清潔劑，其中關於上述M23A亞家族蛋白酶， 較佳為基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上，且對一種以上之受質肽之分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值為0.5以上(此處，該基準肽為GGGGG或GGGG，該受質肽為選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群中之一種以上，X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基)； 更佳為GGGGG之分解之比活性為10 U/mg以上，且於將GGGGG之分解之比活性設為1時，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG之分解之相對比活性為0.5以上； 進而較佳為選自由β-裂解金屬蛋白酶、LasA蛋白、及嗜水氣單胞菌蛋白酶所組成之群中之至少一種。 [5]如[4]記載之清潔劑，其中較佳為上述β-裂解金屬蛋白酶係選自由：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [6]如[4]或[5]記載之清潔劑，其中較佳為上述LasA蛋白係選自由：包含序列編號4所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [7]如[4]至[6]中任一項記載之清潔劑，其中較佳為上述嗜水氣單胞菌蛋白酶係選自由：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [8]如[3]記載之清潔劑，其中較佳為上述酵素組合物為無色肽酶。 [9]如[3]至[8]中任一項記載之清潔劑，其中較佳為上述酵素組合物進而含有選自由上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、及脂酶所組成之群中之至少一種。 [10]如[9]記載之清潔劑，其中較佳為上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶為鹼性蛋白酶。 [11]如[10]記載之清潔劑，其中關於上述鹼性蛋白酶， 較佳為源自芽孢桿菌屬細菌之鹼性蛋白酶； 更佳為選自由：包含序列編號26所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、及包含序列編號27所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、所組成之群中之至少一種。 [12]如[10]或[11]記載之清潔劑，其中上述M23A亞家族蛋白酶相對於上述鹼性蛋白酶之質量比較佳為1/20以上、更佳為1/3～20、進而較佳為1～5、進而更佳為2～3。 [13]如[1]至[12]中任一項記載之清潔劑，其較佳為浸漬放置清潔用之清潔劑。 [14]如[1]至[13]中任一項記載之清潔劑，其較佳為具有對革蘭氏陽性菌之殺菌性。

[15]一種角質污垢清潔方法，其使用如[1]至[14]中任一項記載之清潔劑。 [16]如[15]記載之清潔方法，其較佳為衣領袖口污垢清潔方法。 [17]如[15]或[16]記載之清潔方法，其較佳為包括將被清潔物於上述清潔劑中進行浸漬放置。 [18]如[15]至[17]中任一項記載之方法，其較佳為用於角質污垢清潔及革蘭氏陽性菌殺菌之方法。

[19]一種M23A亞家族蛋白酶或含有其之組合物之用途，其用於製造角質污垢清潔劑。 [20]一種M23A亞家族蛋白酶或含有其之組合物之用途，其用於角質污垢清潔。 [21]如[19]或[20]記載之用途，其中較佳為上述角質污垢為衣領袖口污垢。 [22]如[19]至[21]中任一項記載之用途，其中關於上述M23A亞家族蛋白酶， 較佳為基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上，且對一種以上之受質肽之分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值為0.5以上(此處，該基準肽為GGGGG或GGGG，該受質肽為選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群中之一種以上，X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基)； 更佳為GGGGG之分解之比活性為10 U/mg以上，且於將GGGGG之分解之比活性設為1時，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG之分解之相對比活性為0.5以上； 進而較佳為選自由β-裂解金屬蛋白酶、LasA蛋白、及嗜水氣單胞菌蛋白酶所組成之群中之至少一種。 [23]如[22]記載之用途，其中較佳為上述β-裂解金屬蛋白酶係選自由：包含序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [24]如[23]記載之用途，其中較佳為包含與上述序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽具有與序列編號2所表示之胺基酸序列之H22、D36、H121及H123對應的胺基酸殘基。 [25]如[22]至[24]中任一項記載之用途，其中較佳為上述LasA蛋白係選自由：包含序列編號4所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號4所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [26]如[25]記載之用途，其中較佳為包含與上述序列編號4所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽具有與序列編號4所表示之胺基酸序列之H23、D36、H120及H122對應的胺基酸殘基。 [27]如[22]至[26]中任一項記載之用途，其中較佳為上述嗜水氣單胞菌蛋白酶係選自由：包含序列編號6所表示之胺基酸序列之多肽、及包含與序列編號6所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽、所組成之群中之至少一種。 [28]如[27]記載之用途，其中較佳為包含與上述序列編號6所表示之胺基酸序列具有至少80%之同一性之胺基酸序列且具有肽序列中之甘胺酸-甘胺酸鍵分解活性的多肽具有與序列編號6所表示之胺基酸序列之H21、D34、H118及H120對應的胺基酸殘基。 [29]如[19]至[21]中任一項記載之用途，其中較佳為上述組合物為無色肽酶。 [30]如[19]至[29]中任一項記載之用途，其中較佳為上述組合物進而含有選自由上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、及脂酶所組成之群中之至少一種。 [31]如[30]記載之用途，其中較佳為上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶為鹼性蛋白酶。 [32]如[31]記載之用途，其中關於上述鹼性蛋白酶， 較佳為源自芽孢桿菌屬細菌之鹼性蛋白酶； 更佳為選自由包含序列編號26所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、及包含序列編號27所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、所組成之群中之至少一種。 [33]如[31]或[32]記載之用途，其中上述組合物中之上述M23A亞家族蛋白酶相對於上述鹼性蛋白酶之質量比較佳為1/20以上，更佳為1/3～20，進而較佳為1～5，進而更佳為2～3。 [34]如[19]、[21]至[33]中任一項記載之用途，其中較佳為上述角質污垢清潔劑為浸漬放置清潔用之清潔劑。 [35]如[19]、[21]至[34]中任一項記載之用途，其中較佳為上述角質污垢清潔劑具有對革蘭氏陽性菌之殺菌性。 [36]如[20]至[33]中任一項記載之用途，其較佳為用於利用浸漬放置清潔而進行之角質污垢清潔。 [37]如[20]至[33]、[36]中任一項記載之用途，其較佳為用於角質污垢清潔及革蘭氏陽性菌殺菌。

[38]一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法，其包括： 測定受驗酵素或包含其之組合物對基準肽及一種以上之受質肽之分解活性； 求出對該一種以上之受質肽之各分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值；及 選擇該基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上且針對任一種以上之該受質肽之該相對值為0.5以上、或具有相當於此之對該基準肽及受質肽之分解活性的受驗酵素或包含其之組合物；且 該基準肽為GGGGG或GGGG，該一種以上之受質肽選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群，X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基。 [39]如[38]記載之方法，其中較佳為上述基準肽為GGGGG。 [40]如[38]或[39]記載之方法，其中較佳為上述受質肽中之X係選自S、Y、L及F。 [41]如[38]至[40]中任一項記載之方法，其中關於上述受質肽， 較佳為GGGXG， 更佳為選自由GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG所組成之群中之一種以上， 進而較佳為GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG。 [42]如[38]至[41]中任一項記載之方法，其中較佳為上述受驗酵素為蛋白酶。 [43]如[38]至[42]中任一項記載之方法，其中較佳為上述分解活性之測定包括使上述受驗酵素或包含其之組合物與上述基準肽或上述受質肽接觸，繼而測量該基準肽或該受質肽之分解量。 [44]如[43]記載之方法，其中較佳為上述基準肽或上述受質肽之分解量之測量係藉由FRET分析、氣相層析法、液相層析法、或薄層層析法進行。 [45]如[38]至[44]中任一項記載之方法，其中較佳為上述分解活性之測定進而包括求出比活性。 [46]如[38]至[45]中任一項記載之方法，其中較佳為將上述選擇之受驗酵素或包含其之組合物選作角質污垢分解酵素或角質污垢分解用組合物之候選物質。

[47]如[38]至[46]中任一項記載之方法，其較佳為評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力、及對動物性纖維之損傷性之方法。 [48]如[47]記載之方法，其較佳為將上述選擇之受驗酵素或包含其之組合物選作具有角質污垢分解能力且動物性纖維之損傷性較低之酵素或組合物。 [49]如[48]記載之方法，其較佳為進而包括評估上述受驗酵素或包含其之組合物對動物性纖維之分解能力。 [50]如[49]記載之方法，其較佳為進而包括使上述選擇之受驗酵素或包含其之組合物與角蛋白接觸，並測量生成之角蛋白片段之分子量。 [51]如[50]記載之方法，其較佳為進而包括於測量所得之角蛋白片段之分子量為與上述受驗酵素或包含其之組合物接觸前之角蛋白之分子量之50%以上且97%以下的情形時，將該受驗酵素或包含其之組合物選作具有角質污垢分解能力且動物性纖維之損傷性較低之酵素或包含其之組合物。 [52]如[50]或[51]記載之方法，其中較佳為上述角蛋白為分子量35,000以上之角蛋白。 [53]如[50]或[51]記載之方法，其中較佳為上述角蛋白為角蛋白10。 [54]如[50]或[51]記載之方法，其中較佳為上述角蛋白為天青角蛋白。 [55]如[47]至[54]中任一項記載之方法，其中較佳為上述動物性纖維為羊毛。 [56]如[38]至[55]中任一項記載之方法，其中較佳為上述角質污垢為衣領袖口污垢。 [57]如[38]至[56]中任一項記載之方法，其中較佳為上述包含受驗酵素之組合物為洗劑組合物。 [實施例]

以下，使用實施例對本發明進而具體地進行說明。但本發明之技術範圍並不受該等實施例限定。

將本實施例中使用之引子之一覽示於表1。

[表1]

參考例1 蛋白酶之製備 (1)包含BLP之培養上清液之製備 (1-1)表現載體之製作 利用GenScript公司之人工基因合成服務製作將BLP基因(序列編號1)插入至質體pUC57而成者(BLP/pUC57)。以BLP/pUC57為模板，使用引子對BLP_S237signal_F/BLP_S237signal_R(序列編號9及10)及PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)進行PCR反應(polymerase chain reaction，聚合酶鏈鎖反應)。以WO2006/068148 A1之實施例7所記載之質體pHY-S237作為模板，使用引子對vector-F/vector-sig-R(序列編號11及12)同樣地進行PCR反應。對各PCR產物利用DpnI(New England Biolabs)進行DpnI處理。繼而依據In-Fusion，HD選殖套組(Clontech)之操作說明進行In-Fusion反應。

使用In-Fusion反應液將ECOS^TM Competent E. coli DH5 α(NIPPON GENE、310-06236)轉形。將經轉形處理之細胞塗抹於含有安比西林之LB培養板，於37℃下培養一晩。將形成於培養板上之菌落植菌至包含安比西林之LB培養基，培養一晩後，回收菌體，使用高純度質體分離套組(High Pure Plasmid Isolation Kit)(Roche)萃取質體(BLP/pHY)。將萃取之BLP/pHY作為模板，使用引子對ΔS237N_fw/ΔS237N_rv(序列編號13及14)進行PCR反應。將該PCR產物轉形至E. coli HST08 Premium Competent Cells(TAKARA BIO)。將經轉形處理之細胞塗抹於含有安比西林之LB培養板，於37℃下培養一晩。將培養板上形成之菌落植菌至包含安比西林之LB培養基，培養一晩後，回收菌體，使用高純度質體分離套組(Roche)萃取質體(BLP2/pHY)。

(1-2)酵素產生轉形株之製作 於1 mL之LB培養基中植菌枯草桿菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株：Nature, 390, 1997, p.249)，於30℃下以200 rpm振盪培養一晩。於1 mL之新LB培養基中將該培養液植菌10 μL，於37℃下以200 rpm培養3小時。將該培養液進行離心分離，並回收顆粒。向顆粒添加包含4 mg/mL之溶菌酶(SIGMA)之SMMP[0.5 M蔗糖、20 mM馬來酸二鈉、20 mM氯化鎂六水合物、35%(w/v)抗生素培養基(Antibiotic Medium)3(Difco)]500 μL，於37℃下保溫1小時。其次，藉由離心分離而回收顆粒，懸浮於400 μL之SMMP中。將懸浮液13 μL、(1-1)中獲得之質體BLP2/pHY溶液(10 mM Tris-HCl pH值8.5、34.2 ng/μL)2 μL、SMMP 20 μL混合，進而添加100 μL之40%PEG並加以攪拌，進而添加350 μL之SMMP後，於30℃下振盪1小時。將該液體200 μL塗抹於包含四環素(15 μg/mL、SIGMA)之DM3再生瓊脂培養基[0.8%瓊脂(和光純藥)、0.5%琥珀酸二鈉六水合物、0.5%酪蛋白胺基酸技術型(Difco)、0.5%酵母萃取液、0.35%磷酸一鉀、0.15%磷酸二鉀、0.5%葡萄糖、0.4%氯化鎂六水合物、0.01%牛血清白蛋白(SIGMA)、0.5%羧甲基纖維素、0.005%錐蟲藍(Merck)及胺基酸混液(色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸各10 μg/mL)；%為(w/v)%]，並於30℃下保溫3天，獲取形成之菌落。

(1-3)藉由轉形株培養進行之酵素製造 於LB培養基中以最終濃度成為15 ppm之方式添加四環素。於該培養基5 mL中植菌(1-2)中所獲得之枯草桿菌轉形體菌落後，於30℃下以250 rpm培養一晩。第二天，將該培養液400 μL植菌至2×L-麥芽糖培養基(2%胰蛋白腖、1%酵母萃取液、1%NaCl、7.5%麥芽糖、7.5 ppm硫酸錳五水合物、15 ppm四環素、6ppm硫酸鋅七水合物；%為(w/v)%)20 mL，於32℃下以230 rpm培養2天後，藉由離心分離回收包含由菌體產生之酵素之培養上清液。

(2)包含LasA之培養上清液之製備 利用GenScript公司之人工基因合成服務製作將LasA基因(序列編號3)插入至質體pUC57而成者(LasA/pUC57)。將LasA/pUC57作為模板，使用引子對LasA_F/LasA_CR(序列編號15及16)，依據PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)之操作說明進行PCR反應。將WO2006/068148 A1之實施例7所記載之質體pHY-S237作為模板，使用引子對pHY_just_F/pHY_just_R_NEW(序列編號17及18)，同樣地進行PCR反應。對各PCR產物利用DpnI(New England Biolabs)進行DpnI處理。繼而，依據In-Fusion HD選殖套組(Clontech)之操作說明進行In-Fusion反應，藉此獲得質體(LasA/pHY)溶液。

使用獲得之質體(LasA/pHY)溶液，利用與上述(1-2)相同之程序進行枯草桿菌prsA基因表現強化株(日本專利特開2007-49986號公報之實施例1中製作之prsA-Kc株)之轉形，獲取枯草桿菌轉形體菌落。於2×L液體培養基中以最終濃度成為15 ppm之方式添加四環素。於該培養基5 mL中植菌枯草桿菌轉形體菌落後，於30℃下以250 rpm培養一晩。自培養液回收顆粒，自顆粒萃取質體LasA/pHY。將萃取之質體LasA/pHY作為模板，使用引子對LasA_Chis_n_F/LasA_Chis_n_R(序列編號19及20)、以及KOD-Plus-突變套組(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)(TOYOBO)，進行PCR反應、由Dpn I引起之質體之消化、及接合(ligation)，獲得質體(LasA2/pHY)。

使用獲得之質體(LasA2/pHY)，利用與上述(1-2)相同之方法進行轉形。此時，作為宿主，使用枯草桿菌prsA基因表現強化株(日本專利特開2007-49986號公報之實施例1中製作之prsA-Kc株)。繼而，將獲得之轉形株利用與(1-3)相同之程序進行培養，並回收包含由菌體產生之酵素之培養上清液。

(3)包含AhP之培養上清液之製備 利用GenScript公司之人工基因合成服務製作將AhP基因(序列編號5)插入至質體pUC57而成者(AhP/pUC57)。將AhP/pUC57作為模板，使用引子對2F/2R_bacillus-Chis(序列編號21及22)，依據PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)之操作說明進行PCR反應。將WO2006/068148 A1之實施例7所記載之質體pHY-S237作為模板，使用引子對vector-F/vector-R(序列編號11及23)，同樣地進行PCR反應。對各PCR產物利用DpnI(New England Biolabs)進行DpnI處理。繼而，依據In-Fusion，HD選殖套組(Clontech)之操作說明進行In-Fusion反應，藉此獲得質體(AhP/pHY)溶液。

使用獲得之質體(AhP/pHY)，利用與上述(1-2)相同之方法進行轉形。此時，作為宿主，使用枯草桿菌168株。繼而，將獲得之轉形株利用與(1-3)相同之程序進行培養，並回收包含由菌體產生之酵素之培養上清液。

(4)包含ALE-1之培養上清液之製備 製備作為M23B亞家族蛋白酶之ALE-1甘胺醯甘胺酸肽鏈內切酶(ALE-1)(MEROPS ID：M23.012；序列編號8)。利用GenScript公司之人工基因合成服務製作將ALE1基因(序列編號7)插入至質體pUC57而成者(ALE1/pUC57)。將ALE1/pUC57作為模板，使用引子對pHY-like6-just-F/pHY-like6-just-CHisR(序列編號24及25)及PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)進行PCR反應。將WO2006/068148 A1之實施例7所記載之質體pHY-S237作為模板，使用引子對pHY_just_F/pHY_just_R_NEW(序列編號17及18)同樣地進行PCR反應。對各PCR產物利用DpnI(New England Biolabs)進行DpnI處理。繼而，依據In-Fusion，HD選殖套組(Clontech)之操作說明進行In-Fusion反應，藉此獲得質體(ALE1/pHY)溶液。

使用獲得之質體(ALE1/pHY)，利用與上述(1-2)相同之方法進行枯草桿菌168株之轉形，獲得枯草桿菌轉形體菌落。於2×L液體培養基中以最終濃度成為15 ppm之方式添加四環素。於該培養基5 mL中植菌枯草桿菌轉形體菌落後，於30℃下以250 rpm培養一晩。自培養液回收顆粒，自顆粒萃取質體ALE1/pHY。使用萃取之質體(ALE1/pHY)，利用與上述(1-2)相同之方法進行轉形。此時，作為宿主，使用枯草桿菌Dpr9株(日本專利特開2006-174707號公報之實施例1～5中製作之Kao9株)。將獲得之轉形株利用與(1-3)相同之程序進行培養，回收包含由菌體產生之酵素之培養上清液。

(5)自培養上清液之蛋白酶製備 自(1)～(4)中獲得之培養上清液製備目標蛋白酶。對培養上清液使用Amicon Ultra區分分子量10K(Merck Millipore)以緩衝液A進行緩衝液更換。由緩衝液更換後之液體使用AKTA explorer 10S(GE Healthcare)製備酵素。首先使該經緩衝液更換所獲得之液體通入至管柱1，繼而使用緩衝液B使管柱1之吸附成分溶出。回收溶出組分中確認到FRET-GGGGG(參考例2)之分解活性之組分液。繼而，對回收之組分液使用利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、200 mM NaCl之溶液而經平衡化之管柱2進行粒徑篩析層析(Size Exclusion Chromatography)，回收確認到FRET-GGGGG之分解活性之組分液。對回收之組分液使用Amicon Ultra區分分子量10K以20 mM Tris-HCl(pH值7.5)溶液進行緩衝液更換，獲得包含目標蛋白酶之酵素溶液。用於各培養上清液之緩衝液A、緩衝液B、管柱1、及管柱2設為如表2所示。

[表2]

參考例2 酵素活性之測定 作為受質，使用螢光基Nma與消光基Lys(Dnp)之間為五甘胺酸之FRET受質[以下稱為FRET-GGGGG](於PH Japan進行下單生產)。此處，Nma係指2-(N-甲基胺基)苯甲醯基(Nma)。又，Lys(Dnp)係指於離胺酸(Lys)之側鏈具有2,4-二硝基苯基(Dnp)者。於96孔之分析板(AGC Techno Glass、3881-096)中添加參考例1(5)中獲得之酵素溶液(酵素、20 mM Tris-HCl(pH值7.5))190 μL，進而添加FRET-GGGGG溶液(1 mM FRET-GGGGG、100 mM Tris-HCl(pH值7.5))10 μL而製備反應液。使用infinite M200(TECAN)於溫度30℃、激發波長340 nm、測定波長440 nm下經時地測定反應液之螢光強度。於相同之反應條件下，使用20 mM Tris-HCl pH值7.5液代替酵素溶液、並使用經二甲基亞碸溶解之FRETS-25-STD1(PEPTIDE INSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGGG，測定該反應液之螢光強度，製作校準曲線。1單位(U)之活性係設為顯示相當於每1分鐘由1 nmol之FRETS-25-STD1所產生之螢光強度的螢光強度之變化所需之酵素量。

參考例3 酵素溶液之濃度測定 酵素溶液之濃度測定係使用DC蛋白質分析套組(Bio-Rad)。用以算出蛋白質質量之標準液係使用BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)標準溶液(Standard Solution)(WAKO)。

參考例4 SDS-PAGE 將包含50 mM二硫蘇糖醇(Thermo Fisher Scientific)之2×Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad、#161-0737)與試樣溶液等量混合，並以100℃加熱5分鐘，藉此製備泳動樣品。將該泳動樣品使用Any kD^TM Mini-PROTEAN(註冊商標)TGX^TM 預製膠(Bio-Rad)及經10倍稀釋之10×Trsi/甘胺酸/SDS(Bio-Rad、1610732)進行電泳。分子量標記物係使用Precision Plus Protein^TM 雙色標準品(Bio-Rad、#161-0374)。泳動後之凝膠係進行CBB染色或Ruby染色。CBB染色係使用Bio-Safe CBB G-250染料(Bio-Rad、161-0786)。Ruby染色係使用一步法(One-step)Ruby(APRO life Science、SP-4040)。於可根據分子量標記物之分子量與遷移率製作之校準曲線之式中代入目標蛋白質或多肽之遷移率，將藉此獲得之值設為該目標蛋白質或多肽之分子量。關於樣品之遷移率(Rf值)，係測量將該樣品流過之泳道中之自凝膠之上端(應用有樣品之位置)至示蹤色素(溴酚藍)之距離設為1時，自該凝膠之上端至該樣品之條帶之距離之相對值。

參考例5 西方墨點法 對角蛋白溶液以參考例4所記載之程序進行SDS-PAGE(未染色)後，將凝膠使用Trans-Blot Turbo^TM 系統(Bio-Rad)與Trans-Blot Turbo^TM 微型PVDF(polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯)轉印包(Bio-Rad、#170-4156)，轉印至PVDF膜。抗體反應係使用Ibind西方墨點法設備(Ibind Western Device)(Thermo Fisher Scientific)。作為1次抗體，使用KRT10單株抗體(M01)、clone 1H6(Abnova)，作為2次抗體，使用穩定過氧化物酶結合山羊抗小鼠(H+L)(Stabilized Peroxidase Conjugated Goat Anti-Mouse(H+L))(Thermo Fisher Scientific、#32430)，作為檢測試劑，使用ECL Select西方墨點法偵測試劑(ECL Select Western Blotting Detection Reagent)(GE Healthcare)。

實施例1 對金黃色葡萄球菌之酵素殺菌力之評估 (酵素) 關於酵素，作為鹼性蛋白酶，使用KP43蛋白酶變異體(以下亦稱為KP43蛋白酶變異體、或KP43、及Savinase(註冊商標)(SIGMA、P3111)，作為M23A亞家族蛋白酶，使用參考例1中製備之BLP、LasA、及AhP，並且作為M23B亞家族蛋白酶，使用參考例1中調整之ALE-1、及溶葡萄球菌酶(Wako、#120-04313)。關於KP43蛋白酶變異體，係將日本專利特開2013-233141號公報中以序列編號250記載之鹼性蛋白酶參考該公報所記載之製造方法進行製備並使用。

(殺菌力評估) 將金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)植菌至1 mL之SCD(Soybean-Casein Digest，大豆酪蛋白消化)液體培養基(日本製藥、393-00185)中，於37℃下振盪培養一晩。回收菌體，利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)清洗後，利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)製備成OD600＝0.5(10⁸ cfu/mL)。相對於試驗液(20 mM Tris-HCl(pH值7.5)＋1 μg/mL各酵素)495 μL，添加菌液5 μL，於30℃下靜置30分鐘。將靜置後之液體利用LP稀釋液(日本製藥、397-00281)進行梯度稀釋，並向SCD瓊脂培養基(日本製藥、396-00175)塗佈100 μL。數出於37℃下培養一晩後之菌落數。 生菌數係根據以下之式算出。 生菌數(cfu/mL)＝稀釋倍數*菌落數*10

將殺菌力之評估結果示於圖1。KP43蛋白酶變異體、Savinase(註冊商標)未確認到對金黃色葡萄球菌之殺菌性。另一方面，BLP、LasA、AhP、ALE-1及溶葡萄球菌酶確認到對金黃色葡萄球菌之殺菌性。

實施例2 對角質污垢之酵素清潔力之評估 (衣領袖口污垢之製作) 準備於白襯衫之衣領之區域縫合布(組成：聚酯65%、棉35%)之襯衫。令成年男性在3天內白天穿著該襯衫。其後，回收縫合至衣領之布，以成為1邊6 mm之正方形之方式裁剪，用作具有衣領袖口污垢之樣品布。

(清潔力評估) 清潔液之組成：酵素、20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(鈣/鎂＝4/1(莫耳比))、0.1(w/v)%聚氧乙烯月桂醚硫酸鈉(Emal(註冊商標)20C、花王(股)製造、有效分換算)。作為酵素，使用實施例1中確認到對金黃色葡萄球菌之殺菌性的酵素BLP、LasA、AhP、ALE-1、及溶葡萄球菌酶(Wako、120-04313)。各酵素係以最終濃度成為150 U/L之方式添加。作為對照，使用相同組成且未添加酵素之清潔液。

使用掃描儀GT-X970(EPSON)獲取樣品布之圖像。其後，將該樣品布浸漬於500 μL之清潔液中，於30℃下靜置5小時。將靜置後之樣品布利用硬度10°DH水沖洗後加以乾燥，再次使用掃描儀GT-X970獲取圖像。根據獲取之圖像，使用圖像分析軟體ImageJ，測定清潔前後之樣品布之平均灰度值(Mean Gray Value)。同樣地獲取污垢附著前之原布之圖像，測定平均灰度值。將獲得之平均灰度值代入以下之式，藉此算出清潔率。 清潔率(%)＝(G2－G1)/(G0－G1)*100 G0：樣品布之原布之平均灰度值 G1：清潔前之樣品布之平均灰度值 G2：清潔後之樣品布之平均灰度值

將清潔率之測定結果示於圖2。M23A亞家族蛋白酶BLP、LasA、及AhP具有對衣領袖口污垢之清潔力。另一方面，M23B亞家族蛋白酶ALE-1及溶葡萄球菌酶未檢測到對衣領袖口污垢之清潔力。

實施例3 藉由BLP與鹼性蛋白酶之併用而獲得之清潔力之增強 調查藉由BLP與鹼性蛋白酶之併用而獲得之衣領袖口污垢清潔力。 (BLP之製備) 利用下述方法製備源自無色肽酶之β-裂解蛋白酶(A-BLP)。將無色肽酶(和光純藥工業、014-09661)溶解於10 mM檸檬酸緩衝液(pH值6.0)，將其通入利用相同緩衝液平衡化之陽離子交換管柱TOYOPEARL GigaCap CM-650M(Tosoh)，以濃度0至500 mM之NaCl梯度溶出。回收溶出液中可見FRET-GGGGG之分解活性之組分液。對獲得之組分液使用利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、及200 mM NaCl經平衡化之管柱TSKgel G4000SWXL(Tosoh)進行粒徑篩析層析，回收可見FRET-GGGGG之分解活性之組分液。將回收之組分液使用Amicon Ultra區分分子量10K以20 mM Tris-HCl(pH值7.5)溶液進行緩衝液更換，製備A-BLP溶液。

以最終濃度成為25 mM之方式使二硫蘇糖醇(Thermo Fisher Scientific)與2×Laemmli樣品緩衝液(Bio-Rad、#161-0737)混合，並與等量之上述A-BLP溶液混合。將獲得之混合液以100℃加熱5分鐘，繼而使用Any kD^TM Mini-PROTEAN(註冊商標)TGX^TM 預製膠(Bio-Rad)進行SDS-PAGE。標記物係使用Precision Plus Protein^TM 雙色標準品(Bio-Rad、#161-0374)。將SDS-PAGE後之凝膠使用Trans-Blot Turbo^TM 系統(Bio-Rad)與Trans-Blot Turbo^TM 微型PVDF轉印包(Bio-Rad、#170-4156)轉印至PVDF膜。利用Bio-Safe CBB G-250染料(Bio-Rad、#161-0786)將膜染色，利用50%甲醇液進行脫色，切出獲得之條帶之區域。將切出之薄膜之N末端胺基酸序列之分析委託給Leave a Nest股份有限公司之N末端胺基酸序列分析服務。分析之結果，判明N末端胺基酸序列為SPNGLLQFPF。該序列與β-裂解金屬肽酶[UniProt Knowledgebase_P00801]所公開之BLP之成熟區(序列編號2)之N末端序列一致。

(鹼性蛋白酶) 作為鹼性蛋白酶，將日本專利特開2013-233141號公報中以序列編號250所記載之鹼性蛋白酶(KP43蛋白酶變異體、或KP43)參考該公報所記載之製造方法進行製備並使用。

(清潔力評估) 清潔液之組成：酵素1 μg/mL、20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(鈣/鎂＝4/1(莫耳比))、0.1(w/v)%聚氧乙烯月桂醚硫酸鈉(Emal(註冊商標)20C、花王(股)製造、有效分換算)。作為酵素，使用上述A-BLP、KP43蛋白酶變異體、或該等之混合物(KP43：A-BLP(質量比)＝10：0、7.5：2.5、2.5：7.5、0：10)。於將酵素加以併用之情形時，以酵素濃度之合計成為1 μg/mL之方式調整。

以與實施例2相同之程序測定由清潔液所獲得之衣領袖口污垢之清潔率。將結果示於圖3。相較於單獨之鹼性蛋白酶或BLP，將鹼性蛋白酶與BLP併用之情形時，可獲得更高之衣領袖口污垢清潔力。進而，隨著BLP相對於鹼性蛋白酶之混合比自1/3(KP43：A-BLP＝7.5：2.5)上升至3(KP43：A-BLP＝2.5：7.5)，清潔力進一步提高。

實施例4 由酵素所獲得之角蛋白分解活性之評估 (1)角蛋白溶液之製備 自人腳跟使用Dr. Scholl電動去角質機Diamond(Reckitt Benckiser)削出角質。相對於腳跟角質5 mg，添加1 mL之助溶液(100 mM Tris-HCl(pH值8.5)、2%SDS、25 mM DTT、5 mM EDTA)，以100℃加熱10分鐘後，進行離心分離並回收上清液。將回收之上清液使用微型透析套組8kDa截止(Mini Dialysis kit 8kDa cut-off)2 mL(GE Healthcare、#80-6484-32)於透析緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、0.1%SDS)中透析一晩，獲得角蛋白溶液。

(2)利用酵素進行之角蛋白分解 將(1)中獲得之角蛋白溶液利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)稀釋20倍。相對於該稀釋溶液30 μL，添加酵素溶液1 μL。作為酵素，使用參考例1中製備之BLP、LasA、AhP及ALE-1、以及溶葡萄球菌酶(Wako、#120-04313)、Savinase(註冊商標)(SIGMA、P3111)、Alcalase(註冊商標)(SIGMA、P4860)、蛋白酶K(關東化學、34076-92)。關於酵素之最終濃度，以BLP、Savinase(註冊商標)、Alcalase(註冊商標)、蛋白酶K成為1 μg/mL、LasA、AhP、ALE-1及溶葡萄球菌酶成為10 μg/mL之方式進行調整。將反應液於30℃下靜置15小時後，依據參考例4之程序利用SDS-PAGE(CBB染色)進評估。

將結果示於圖4。添加有M23A亞家族之酵素BLP、LasA、AhP之溶液在分子量37,000標記物與分子量50,000標記物之間檢測到條帶，表示該等酵素分解了角蛋白。另一方面，添加有M23B亞家族之酵素ALE-1或溶葡萄球菌酶之溶液未見到角蛋白之分解。即，表示M23家族之中僅有M23A亞家族之酵素會分解角蛋白。又，添加有Savinase(註冊商標)、Alcalase(註冊商標)、蛋白酶K之溶液中，主要之條帶消失。認為該等酵素未檢測到角蛋白片段之條帶之原因在於：由於角蛋白分解成各種分子量之片段，故而成為檢測極限以下，或由於片段低分子化，故而流出至凝膠之外。

(3)角蛋白組分之評估 將(1)中獲得之角蛋白溶液利用20 mM Tris-HCl(pH值7.5)稀釋20倍，依據與參考例4～5相同之程序，藉由SDS-PAGE(CBB染色)與西方墨點法進行評估。藉由SDS-PAGE與西方墨點法進行評估之結果，確認由腳跟角質製備之角蛋白溶液包含角蛋白10(圖5)。圖5中檢測到複數之條帶，認為該等除了單體之角蛋白10以外，為複合體化之角蛋白10、經修飾之角蛋白10、角蛋白1及其他種類之角蛋白等。

實施例5 利用M23A亞家族蛋白酶進行之源自角質細胞之不溶性角蛋白之分解 使用2 cm膠帶(Nichiban、CT-24)，藉由膠帶剝離而自人脖子獲取角質。對該角質添加助溶液(100 mM Tris-HCl(pH值8.5)、2%SDS、25 mM DTT、5 mM EDTA)，以100℃加熱10分鐘後，進行離心分離，去除上清液而獲得沈澱物。對沈澱物進而進行2次該助溶液之添加、加熱、離心分離之操作，藉此獲得源自角質細胞之不溶性成分。於獲得之不溶性成分中添加20 mM Tris-HCl(pH值7.5)40 μL，進而，添加酵素溶液1 μL。作為酵素，使用參考例1中製備之BLP、LasA、及AhP。關於酵素之最終濃度，將BLP調整為1 μg/mL，將LasA及AhP調整為10 μg/mL。將反應液於30℃下靜置15小時後，依據參考例4之程序，進行上清液之SDS-PAGE(Ruby染色)。將結果示於圖6。添加有BLP、LasA及AhP之溶液均在分子量37,000標記物與分子量50,000標記物之間檢測到條帶，表示該等酵素分解了角質之不溶性組分中之角蛋白。

實施例6 M23A亞家族蛋白酶之受質之分析 如圖4、6所示，於經M23A亞家族蛋白酶處理之角蛋白溶液之SDS-PAGE中，在分子量37,000標記物與分子量50,000標記物之間檢測到2條條帶。其中，對圖6所示之BLP處理溶液之SDS-PAGE樣品進行低分子側之條帶之質量分析。質量分析中，使用Leave a Nest股份有限公司之基質輔助雷射脫附飛行時間質譜(MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) Mass Spec Analysis)。質量分析之結果，判明該條帶區域所含之蛋白質為角蛋白10(ACCESSION_AAH34697)之片段。

於圖7中表示角蛋白10之胺基酸序列(序列編號28)。粗體字表示質量分析中鑑定出之來自酵素處理液之條帶中之肽序列。如圖7所示，於角蛋白10之兩末端存在甘胺酸富集區，另一方面，本實施例中之質量分析中檢測出之肽序列(粗體字)包含於中央區域。該質量分析中檢測出之肽序列均存在於角蛋白10之胺基酸序列之編號157至450之間。根據以上，判明BLP及其他M23A亞家族之酵素藉由切斷角蛋白10之胺基酸序列之兩末端、即第1～156號胺基酸區或第451～584號胺基酸區上的甘胺酸富集區，從而分解角質所含之全長角蛋白10。

實施例7 羊毛角蛋白之分解性評估 使用原料使用羊毛之天青角蛋白(SIGNA、K8500，批號：SLBM2921V)，評估酵素之羊毛角蛋白分解性(損傷性)。作為酵素，使用Savinase(註冊商標)(SIGMA、P3111)、Alcalase(註冊商標)(SIGMA、P4860)、及蛋白酶K(關東化學、34076-92)、以及參考例1中製備之BLP、LasA、AhP。將6 mg之天青角蛋白浸漬於1 mL之20 mM Tris-HCl、pH值7.5液中，添加調整成100 μg/mL之酵素溶液100 μL。於室溫下靜置72小時後，進行離心分離並回收上清液，使用infinite M200(TECAN)測定波長595 nm之吸光度。將自添加有酵素之溶液之上清液之吸光度減去未添加酵素之溶液之上清液之吸光度所得的值設為ΔA595。

將結果示於圖8。添加有Savinase(註冊商標)、Alcalase(註冊商標)、蛋白酶K之樣品相較於添加有BLP、LasA、AhP之樣品，確認到吸光度之增大。根據以上，判明Savinase(註冊商標)、Alcalase(註冊商標)、蛋白酶K相較於BLP、LasA、AhP，效率良好地分解源自羊毛之天青角蛋白、即羊毛損傷性較高。

於實施例2、4～6中，提示可分解角蛋白10之甘胺酸富集之區域之酵素具有對角質污垢之清潔力。進而，於實施例6～7中，判明分解角蛋白10之甘胺酸富集區但無法分解角蛋白10之中央區域的酵素對羊毛角蛋白之分解性較低。認為其原因在於，構成動物性纖維之蛋白質中不存在角蛋白10之甘胺酸富集區程度的甘胺酸富集之區域。因此，提示能夠以甘胺酸富集之區域之分解性為基準來評估酵素之角質污垢分解能力與動物性纖維之分解能力(損傷性)。

實施例8 BLP之兜甲蛋白分解活性 將融合有標籤序列之重組兜甲蛋白(Recombinant Human Loricrin protein；Abcam、ab114261)使用Amicon Ultra區分分子量10K(Merck Millipore)製備成反應液(20 mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(鈣/鎂＝4/1(莫耳比))、0.1(w/v)%聚氧乙烯月桂醚硫酸鈉)之溶液。於該溶液30 μL中添加參考例1中製備之BLP溶液(60 μg酵素/mL)1 μL，於30℃下靜置3小時。反應後之溶液藉由參考例4之程序進行SDS-PAGE(CBB染色)之結果為，檢測出3條主要之條帶(圖9、箭頭)。

將同樣地製備之SDS-PAGE(未染色)後之凝膠使用Trans-Blot Turbo^TM 系統(Bio-Rad)與Trans-Blot Turbo^TM 微型PVDF轉印包(Bio-Rad、#170-4156)轉印至PVDF膜。將轉印後之膜利用Bio-Safe CBB G-250染料(Bio-Rad、#161-0786)進行染色，並利用50%乙醇液進行脫色後，切出於與圖9相同之位置上出現之3條條帶之區域。將切出之條帶之N末端胺基酸序列之分析委託給Leave a Nest股份有限公司之N末端胺基酸序列分析服務。其結果，判明任一條帶之N末端胺基酸序列均不為兜甲蛋白序列，由此推測條帶係源自標籤序列。即，表示BLP分解了兜甲蛋白。

圖10中表示本實施例中使用之兜甲蛋白之胺基酸序列(序列編號29)。如圖10所示，兜甲蛋白為甘胺酸富集之蛋白質。另一方面，本實施例中使用之標籤序列(圖10中未示出)幾乎不存在甘胺酸富集之區域。因此，若結合本實施例之結果與實施例6之結果，則提示BLP藉由分解甘胺酸富集區而分解兜甲蛋白。

實施例9 角質污垢分解酵素之受質特異性 針對各種酵素調查由角質污垢分解能力所產生之受質特異性之差異。以與參考例2相同之程序，但是使用肽序列分別包含GGGGG、GGGSG、GGGYG、GGGLG、及GGGFG(序列編號30、32～35)之5種肽之FRET受質，調查蛋白酶對各種受質肽之分解活性。蛋白酶係使用參考例1中製備之BLP、LasA、AhP及ALE-1、以及溶葡萄球菌酶(Wako、120-04313)。另外，利用參考例5之方法測定各蛋白酶溶液之濃度。對於各蛋白酶求出酵素每1 mg之活性(比活性：U/mg)。

將結果示於表3。實施例2中分解了角質污垢之M23A亞家族蛋白酶(BLP、LasA及AhP)在GGGGG之FRET受質中比活性為10 U/mg以上。進而，在GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG之任一種以上之FRET受質中，相對於GGGGG之FRET受質之相對活性超過0.5。另一方面，實施例4中未分解角質污垢之M23B亞家族蛋白酶(ALE-1及溶葡萄球菌酶)於GGGGG之FRET受質中比活性未達10 U/mg。進而，於GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG之任一者之FRET受質中均未確認到活性，相對於GGGGG之FRET受質之相對活性未達0.5。

[表3]

根據以上之實施例之結果，確認到於將GGGGG作為基準肽，將GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG作為受質肽之情形時，具有角質污垢分解能力之酵素對基準肽具有10 U/mg以上之比活性，且對任一種以上之受質肽具有5 U/mg以上(相對活性為0.5以上)之分解活性。因此，提示能夠以酵素對各種甘胺酸富集之基準肽及受質肽之活性為基準，評估該酵素之角質污垢分解能力。進而，提示可藉由確認角蛋白分解行為，從而除角質污垢分解能力以外，評估對動物性纖維之損傷性。因此，藉由使用本發明之評估方法，能夠有效地篩選具有角質污垢分解能力之酵素，進而亦能夠有效地篩選具有角質污垢分解能力且對動物纖維之損傷性較低之酵素。

以上，雖然對本發明之實施形態進行了說明，但應理解該等並不意圖將本發明限定於所說明之特定之實施形態。業者知曉本發明之範圍內之各種其他變更及修正。本說明書中引用之文獻及專利申請係等同於完全記載於本說明書地作為參考援用。

圖1係酵素對金黃色葡萄球菌之殺菌力。誤差槓＝標準偏差(n＝3) 圖2係酵素對衣領袖口污垢之清潔力。誤差槓＝標準偏差(n＝3)。 圖3係併用BLP與鹼性蛋白酶對衣領袖口污垢之清潔力之增強。誤差槓＝標準偏差(n＝4)。 圖4係利用各種酵素進行過處理之角蛋白溶液之SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)圖像。 圖5係自腳跟角質萃取之角蛋白溶液之SDS-PAGE圖像與由西方墨點法所得之檢測圖像。 圖6係進行了酵素處理之角質不溶性組分之SDS-PAGE圖像。 圖7係角蛋白10之胺基酸序列。粗體字表示利用實施例6之質量分析所鑑定出之肽序列。 圖8係包含酵素與源自羊毛之天青角蛋白(Keratin azure)之反應液之上清液的ΔA595之值。 圖9係進行了BLP處理之標籤序列融合重組兜甲蛋白之SDS-PAGE圖像。 圖10係兜甲蛋白之胺基酸序列。

Claims (21)

1. 一種M23A亞家族蛋白酶或含有其之組合物之用途，其用於製造角質污垢清潔劑。
2. 如請求項1之用途，其中上述角質污垢為衣領袖口污垢。
3. 如請求項1之用途，其中上述M23A亞家族蛋白酶之基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上，且對一種以上之受質肽之分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值為0.5以上，此處，該基準肽為GGGGG或GGGG，該受質肽為選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群中之一種以上，X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基。
4. 如請求項1之用途，其中上述M23A亞家族蛋白酶為選自由β-裂解金屬蛋白酶、LasA蛋白、及嗜水氣單胞菌蛋白酶所組成之群中之至少一種。
5. 如請求項1之用途，其中上述組合物為無色肽酶。
6. 如請求項1之用途，其中上述組合物進而含有選自由上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、及脂酶所組成之群中之至少一種。
7. 如請求項6之用途，其中上述M23A亞家族蛋白酶以外之蛋白酶為鹼性蛋白酶。
8. 如請求項7之用途，其中上述鹼性蛋白酶為源自芽孢桿菌屬細菌之鹼性蛋白酶。
9. 如請求項8之用途，其中上述鹼性蛋白酶係選自由：包含序列編號26所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、及包含序列編號27所表示之胺基酸序列或與其具有至少80%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶、所組成之群中之至少一種。
10. 如請求項7之用途，其中上述組合物中之上述M23A亞家族蛋白酶相對於上述鹼性蛋白酶之質量比為1/20以上。
11. 如請求項1至10中任一項之用途，其中上述角質污垢清潔劑為浸漬放置清潔用之清潔劑。
12. 如請求項1至10中任一項之用途，其中上述角質污垢清潔劑具有對革蘭氏陽性菌之殺菌性。
13. 一種評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力之方法，其包括： 測定受驗酵素或包含其之組合物對基準肽及一種以上之受質肽之分解活性； 求出對該一種以上之受質肽之各分解活性相對於對該基準肽之分解活性的相對值；及 選擇該基準肽之分解之比活性為10 U/mg以上且針對任一種以上之該受質肽之該相對值為0.5以上、或具有相當於此之對該基準肽及受質肽之分解活性的受驗酵素或包含其之組合物；且 該基準肽為GGGGG或GGGG，該一種以上之受質肽選自由GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG所組成之群，且X為甘胺酸以外之任意胺基酸殘基。
14. 如請求項13之方法，其中上述一種以上之受質肽為選自由GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG所組成之群中之一種以上。
15. 如請求項13之方法，其中上述受驗酵素為蛋白酶。
16. 如請求項13之方法，其係評估酵素或包含其之組合物之角質污垢分解能力、及對動物性纖維之損傷性的方法。
17. 如請求項16之方法，其進而包括使上述選擇之受驗酵素或包含其之組合物與角蛋白接觸，繼而測量所生成之角蛋白片段之分子量。
18. 如請求項17之方法，其進而包括於測量所得之角蛋白片段之分子量為與上述受驗酵素或包含其之組合物接觸前之角蛋白之分子量之50%以上且97%以下的情形時，將該受驗酵素或包含其之組合物選作具有角質污垢分解能力且動物性纖維之損傷性較低的酵素或包含其之組合物。
19. 如請求項17或18之方法，其中上述角蛋白係具有甘胺酸富集區且分子量為35,000以上之角蛋白。
20. 如請求項17或18之方法，其中上述角蛋白為角蛋白10。
21. 如請求項16之方法，其中上述動物性纖維為羊毛。