BRPI0617392A2 - uso e produÇço de metaloprotease neutra estÁvel sob armazenamento - Google Patents

Abstract

<B>USO E PRODUÇçO DE METALOPROTEASE NEUTRA ESTÁVEL SOB ARMAZENAMENTO <D>A presente invenção refere-se a métodos e composições compreendendo pelo menos uma enzima de metaloprotease neutra que tem estabilidade sob armazenamento melhorada. Em algumas modalidades, a metaloprotease neutra encontra uso em limpeza e outras aplicações. Emalgumas modalidades particularmente preferidas, a presente invenção fornece métodos e composições compreendendo metaloprotease(s) neutra(s) obtida(s) de Bacilius sp. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, a metaloprotease neutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em ainda outras modalidades preferidas, a metaloprotease neutra é uma variante da metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens. Em ainda modalidades adicionais, a metaloprotease neutra é um homólogo da metaloprotease neutra de B. amylollquefaciens. A presente invenção encontra uso particular em aplicações incluindo, mas não limitadas a limpeza, alvejamento e desinfecção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO E PRO-DUÇÃO DE METALOPROTEASE NEUTRA ESTÁVEL SOB ARMAZENA-MENTO".

O presente pedido de patente reivindica prioridade para o Pedi-do Pendente Provisório U. S. No. 60/726.448, depositado em 12 de outubrode 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições compre-endendo pelo menos uma enzima de metaloprotease neutra que tem estabi-lidade sob armazenamento melhorada. Em algumas modalidades, a metalo-protease neutra encontra uso em limpeza e outras aplicações. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, a presente invenção fornece méto-dos e composições compreendendo metaloprotease(s) neutra(s) obtida(s)de Bacillus sp. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, ametaloprotease neutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em ainda outrasmodalidades preferidas, a metaloprotease neutra é uma variante da metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens. Em ainda modalidades adicionais,a metaloprotease neutra é um homólogo da metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens. A presente invenção encontra uso particular em aplica-ções incluindo, mas não limitadas à limpeza, alvejamento e desinfecção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Detergente e outras composições de limpeza tipicamente inclu-em uma combinação complexa de componentes ativos. Por exemplo, amaioria dos produtos de limpeza inclui um sistema de tensoativo, enzimaspara limpeza, agentes alvejantes, builders, supressores de espumas, agen-tes suspensores de sujeira, agentes de liberação de sujeira, abrilhantadoresópticos, agentes amaciantes, dispersantes, compostos de inibição de trans-ferência de tintura, abrasivos, bactericidas, e perfumes. Apesar da comple-xidade dos detergentes atuais, há muitas manchas que são difíceis de re-mover por completo. Além disso, há freqüentemente formação de resíduosque resulta em descoloração (por exemplo, amarelamento) e estética dimi-nuída devido à limpeza incompleta. Estes problemas são compostos pelouso aumentado de temperaturas de lavagem baixas (por exemplo, água fria)e ciclos de lavagem mais curtos. Além disso, muitas manchas são compos-tas de misturas complexas de material fibroso, principalmente incorporandocarboidratos e derivados de carboidrato, fibra, e componentes da paredecelular (por exemplo, material de planta, madeira, sujeira com base em la-ma/argila, e fruta). Estas manchas propõem desafios difíceis à formulação euso de composições de limpeza.

Além disso, artigos de vestuário coloridos tendem a se desgas-tar e mostrar perdas na aparência. Uma porção desta perda de cor é devidoà abrasão no processo de lavagem, particularmente em máquinas automáti-cas de lavagem e secagem. Além disso, perda de resistência à tração dotecido parece ser um resultado inevitável da ação mecânica e química devi-do a uso, desgaste, e/ou lavagem e secagem. Desse modo, um meio paraeficiente e eficazmente lavar os artigos de vestuário coloridos de forma queestas perdas de aparência sejam minimizadas, é necessário.

Em suma, apesar das melhorias nas capacidades das composi-ções de limpeza, continua uma necessidade na técnica por detergentes queremovam as manchas, mantenham a cor e aparência do tecido, e impeçama transferência de tintura. Além disso, continua uma necessidade por com-posições de detergente e/ou de cuidado de tecido que forneçam e/ou resta-beleçam resistência à tração, como também forneçam propriedades de anti-ruga, antiformação de bola, e/ou de antiencolhimento para tecidos, comotambém forneçam controle estático, suavidade de tecido, mantenham a apa-rência de cor desejada, e propriedades de tecido antidesgaste e benefícios.Em particular, continua uma necessidade pela inclusão de composições quesejam capazes de remover os componentes coloridos de manchas, que fre-qüentemente permanecem presos ao tecido sendo lavado. Além disso, con-tinua uma necessidade por métodos e composições melhorados adequadospara alvejamento têxtil.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições compre-endendo pelo menos uma enzima de metaloprotease neutra que tem estabi-Iidade sob armazenamento melhorada. Em algumas modalidades, a metalo-protease neutra encontra uso em limpeza e outras aplicações. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, a presente invenção fornece méto-dos e composições compreendendo metaloprotease(s) neutra(s) obtida(s)de Bacillus sp. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, ametaloprotease neutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em ainda outrasmodalidades preferidas, a metaloprotease neutra é uma variante da metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens. Em ainda modalidades adicionais,a metaloprotease neutra é um homólogo da metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens. A presente invenção encontra uso particular em aplica-ções incluindo, mas não limitadas à limpeza, alvejamento e desinfecção.

A presente invenção fornece metaloproteases neutras novas,material genético novo que codifica as enzimas de metaloprotease neutra, eproteínas de metaloprotease neutra obtidas de Bacillus sp., em particular, B.amyloliquefaciens, e proteínas variantes desenvolvidas das mesmas. Emparticular, a presente invenção fornece composições de metaloproteaseneutra obtidas de Bacillus sp., particularmente B. amyloliquefaciens, DNAcodificando a protease, vetores que compreendem o DNA codificando a me-taloprotease neutra, células hospedeiras transformadas com o DNA de ve-tor, e uma enzima produzida pelas células hospedeiras. A presente invençãotambém fornece composições de limpeza (por exemplo, composições dedetergente), composições de alimentação de animais, e composições deprocessamento têxtil e de couro que compreendem metaloprotease(s) neu-tra(s) obtida(s) de uma espécie de Bacillus, em particular, B. amyloliquefaci-ens. Em modalidades alternativas, a presente invenção fornece meíãlopro-teases neutras mutantes (isto é, variantes) derivadas das metaloproteasesneutras do tipo selvagem descritas aqui. Estas metaloproteases neutras mu-tantes também encontram uso em numerosas aplicações.

A presente invenção fornece metaloproteases neutras isoladasobtidas de uma espécie de Bacillus, em particular, B. amyloliquefaciens. Emoutras modalidades, a metaloprotease neutra compreende a seqüência deaminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em modalidades adicio-nais, a presente invenção fornece metaloproteases neutras isoladas com-preendendo pelo menos 45% de identidade de aminoácido com a metalo-protease neutra compreendendo SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas mo-dalidades, as metaloproteases neutras isoladas compreendem pelo menos50% de identidade, preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmentepelo menos 60%, ainda mais preferivelmente pelo menos 65%, até mesmomais preferivelmente pêlo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos75%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente85%, ainda mais preferivelmente 90%, até mesmo mais preferivelmente pelomenos 95%, e o mais preferivelmente 99% de identidade com a metalopro-tease neutra compreendendo SEQ ID NO: 3, 4 ou 18.

A presente invenção também fornece metaloproteases neutrasisoladas que têm reatividade imunológica cruzada com a metaloproteaseobtida de B. amyloliquefaciens, como também composições compreendendoestas metaloproteases neutras. Em modalidades alternativas, as metalopro-teases neutras têm reatividade imunológica cruzada com as metaloprotea-ses neutras que compreendem a seqüência de aminoácido exposta nasSEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em ainda outras modalidades, as metaloproteasesneutras têm reatividade cruzada com fragmentos (isto é, porções) da meta-loprotease neutra de B. amyloliquefaciens, e/ou metaloprotease neutra quecompreende a seqüência de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou18. De fato, é intencionado que a presente invenção abranja fragmentos(por exemplo, epitopos) da metaloprotease de B. amyloliquefaciens que es-timulam uma resposta imune em animais (incluindo, mas não limitados aseres humanos) e/ou sejam reconhecidos por antidorpos de qualquer classe.

A presente invenção também abrange epitopos em metaloproteases quesão reativos cruzados com epitopos de metaloprotease de B. amyloliquefa-ciens. Em algumas modalidades, os epitopos de metaloprotease são reco-nhecidos através de anticorpos, mas não estimulam uma resposta imune emanimais (incluindo, mas não limitados a seres humanos), enquanto em ou-tras modalidades, os epitopos de metaloprotease estimulam uma respostaimune em pelo menos uma espécie animal (incluindo, mas não limitados aseres humanos) e são reconhecidos por anticorpos de qualquer classe. Apresente invenção também provê meios e composições para identificar eavaliar epitopos reativos cruzados.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece as se-qüências de aminoácido expostas nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em modali-dades alternativas, a seqüência compreende substituições em pelo menosuma posição de aminoácido nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas mo-dalidades alternativas particularmente preferidas, a seqüência compreendesubstituições em pelo menos uma posição de aminoácido na SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades preferidas, a presente invenção fornece vari-antes de metaloprotease neutra tendo uma seqüência de aminoácido com-preendendo pelo menos uma substituição de um aminoácido feita em umaposição equivalente a uma posição em uma metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens que compreende a seqüência de aminoácido exposta nasSEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades preferidas adicionais, apresente invenção fornece variantes de metaloprotease neutra tendo umaseqüência de aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição deum aminoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em umametaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens que compreende a seqüên-cia de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18. Em modalidades alternativas,a presente invenção fornece variantes de metaloprotease neutra tendo umaseqüência de aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição deum aminoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em umametaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens compreendendo pelo menosuma porção das SEQ ID NOS: 3f 4 ou 18. Ern algumas modalidades preferi-das alternativas, as metaloproteases neutras compreendem mutações múl-tiplas em pelo menos uma porção das SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algu-mas modalidades preferidas alternativas, as metaloproteases neutras com-preendem mutações múltiplas em pelo menos uma porção da SEQ ID NO:18.

Em ainda modalidades adicionais, a presente invenção fornecea seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18. Em modalidadesalternativas, a seqüência compreende substituições em pelo menos umaposição de aminoácido na SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades prefe-ridas, a presente invenção fornece variantes de metaloprotease neutra ten-do uma seqüência de aminoácido compreendendo pelo menos uma substi- tuição de um aminoácido feita em uma posição equivalente a uma posiçãoem uma metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens que compreende aseqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18. Em modalidades al-ternativas, a presente invenção fornece variantes de metaloprotease neutratendo uma seqüência de aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição de um aminoácido feita em uma posição equivalente a uma po-sição em uma metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens compreen-dendo pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 18. Em algumas modalida-des preferidas alternativas, as metaloproteases neutras compreendem mu-tações múltiplas em pelo menos uma porção da SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades particularmente preferidas, estas vari-antes têm desempenho melhorado quando comparadas à metaloproteaseneutra de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem. A presente invenção tam-bém fornece variantes de metaloprotease neutra tendo pelo menos umapropriedade melhorada quando comparada à metaloprotease neutra do tipo selvagem. Em algumas modalidades particularmente preferidas adicionais,estas variantes têm estabilidade melhorada quando comparadas à metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem. Em algumas ou-tras modalidades preferidas, estas variantes têm termoestabilidade melho-rada quando comparadas à metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem. Em aindf. modalidades preferidas adicionais, estas varian-tes têm desempenho melhorado sob condições de pH mais baixo ou maisalto, quando comparadas à metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciensdo tipo selvagem.

A presente invenção também fornece metaloproteases neutras que compreendem pelo menos uma porção da seqüência de aminoácidoexposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades, as se-qüências de nucleotídeo que codificam estas metaloproteases neutras com-preendem uma seqüência de nucleotídeo selecionada das SEQ ID NOS: 1,2, 12, e/ou 13. Em algumas modalidades, as metaloproteases neutras sãovariantes que têm seqüências de aminoácido que são similares que às ex-postas nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em ainda modalidades adicionais, asmetaloproteases neutras são variantes e/ou homólogos. Em ainda outrasmodalidades, as metaloproteases neutras são aquelas exposta em quais-quer das Figuras 3 a 5. Em outras modalidades, as metaloproteases neutrassão variantes daquelas expostas na Figura 3, 4 e/ou 5.

A presente invenção também fornece vetores de expressãocompreendendo uma seqüência de polinucleotídeo que codifica pelo menosuma porção da metaloprotease neutra exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18.A presente invenção também fornece vetores de expressão compreendendoumas seqüências de polinucleotídeo que codificam pelo menos uma varian-te de metaloprotease neutra que tem seqüência(s) de aminoácido compre-endendo pelo menos uma substituição de um aminoácido feita em uma po-sição equivalente a uma posição em uma metaloprotease neutra de Bacillusque compreende a seqüência de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4ou 18. Em outras modalidades, a presente invenção fornece células hospe-deiras que compreendem estes vetores de expressão. Em algumas modali-dades particularmente preferidas, as células hospedeiras são selecionadasdo grupo que consiste em Bacillus sp. A presente invenção também forneceas metaloproteases neutras produzidas pelas células hospedeiras.

A presente invenção também fornece composições compreen-dendo pelo menos uma porção de uma metaloprotease neutra isolada obti-da de ura Bacillus sp., particularmente, B. amyloliquefaciens, em que pelomenos uma porção da metaloprotease neutra é codificada por uma seqüên-cia de polinucleotídeo selecionada das SEQ ID NOS: 1, 2, 12 e/ou 13. Emoutras modalidades, a presente invenção fornece células hospedeiras quecompreendem estes vetores de expressão. Em algumas modalidades parti-cularmente preferidas, as células hospedeiras são Bacillus sp. A presenteinvenção também fornece as metaloproteases neutras produzidas pelas cé-lulas hospedeiras.A presente invenção também fornece metaloproteases neutrasvariantes, em que as metaloproteases neutras compreendem pelo menosuma substituição que corresponde às posições de aminoácido na SEQ IDNO: 3 e/ou SEQ ID NO: 18, e em que metaloproteases variantes têm de-sempenho melhor em pelo menos uma propriedade, quando comparada àmetaloprotease de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem. Em algumas mo-dalidades particularmente preferidas, a presente invenção também fornecemetaloproteases neutras variantes, em que as metaloproteases neutrascompreendem pelo menos uma substituição que corresponde às posiçõesde aminoácido na SEQ ID NO: 18, e em que metaloproteases variantes têmdesempenho melhor em pelo menos uma propriedade, quando comparada àmetaloprotease de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem.

A presente invenção também fornece aminoácidos variantes, emque as variantes compreendem pelo menos uma substituição de umaminoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em umametaloprotease neutra que compreende o aminoácido exposto na SEQ IDNO: 18, em que a(s) porção(ões) é ou são selecionada(s) de posições 1, 3,4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16,. 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46,47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86,87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111, 112, 113, 115,117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 146, 148,151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173, 178, 179, 180,181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205,210, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 228, 229,237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263Γ264, 265, 267,269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293,296, 297, e 299.

A presente invenção também fornece variantes demetaloprotease neutra isoladas tendo uma seqüência de aminoácidocompreendendo pelo menos uma substituição de um aminoácido feita emuma posição equivalente a uma posição em uma metaloprotease neutra quecompreende a seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18. Emalgumas modalidades, as variantes de metaloprotease neutra isoladas têmsubstituições que são feitas em posições equivalentes às posições 1·, 3, 4, 5,6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86, 87,88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 117,119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 146, 148, 151,152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 1^3, 178, 179, 180, 181,183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 210,211,214, 215, 216, 217, 218,219, 220, 221, 222, 223, 224, 228, 229, 237,239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263, 264, 265, 267, 269,270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 290, 292, 293, 296,297, e 299 de uma metaloprotease neutra compreendendo uma seqüênciade aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18.

Em modalidades adicionais, a variante de metaloproteaseneutral isolada compreende pelo menos uma mutação selecionada deT004C, T004E, T004H, T004I, T004K, T004L, T004M, T004N, T004P,T004R, T004S, T004V, T004W, T004Y, G012D, G012E, G012I, G012K,G012L, G012M, G012Q, G012R, G012T, G012V, G012W, K013A, K013C,K013D, K013E, K013F, K013G, K013H, K013I, K013L, K013M, K013N,K013Q, K013S, K013T, K013V, K013Y, T014F, T014G, T014H, T014I,T014K, T014L, T014M, T014P, T014Q, T014R, T014S, T014V, T014W,T014Y, S023A, S023D, S023F, S023G, S023I, S023K, S023L, S023M,S023N, S023P, S023Q, S023R, S023S, S023T, S023V, S023W, S023Y,G024A, G024D, G024F, G024G, G024H, G024I, G024K, G024L, G024M,G024N, G024P, G024R, G024S, G024T, G024V, G024W, G024Y, K033H,Q045C, Q045D, Q045E, Q045F, Q045H, Q045I, Q045K, Q045L, Q045M,Q045N, Q045P, Q045R, Q045T, Q045W, N046A, N046C, N046E, N046F,N046G, N046H, N046I, N046K, N046L, N046M, N046P, N046Q, N046R,N046S, N046T, N046V, N046W, N046Y, R047E, R047K, R047L, R047M,R47Q, R047S, R047T, Y049A, Y049C, Y049D, Y049E, Y049F, Y049H,Y049I, Y049K, Y049L, Y049N, Y049R, Y049S, Y049T, Y049V, Y049W,N050D, N050F, N050G, N050H, N050I, N050K, N050L, N050M, N050P,N050Q, N050R, N050W, Ν050Υ, T054C, T054D, Τ054Ε, T054F, T054G,Τ054Η, Τ054Ι, Τ054Κ, T054L, Τ054Μ, Τ054Ν, Τ054Ρ, T054Q, T054R,T054S, T054V, T054W, Τ054Υ, S058D, S058H, S058I, S058L, S058N,S058P, S058Q, Τ059Α, T059C, Τ059Ε, T059G, Τ059Η, Τ059Ι, Τ059Κ,T059L, Τ059Μ, Τ059Ν, Τ059Ρ, T059Q, T059R, T059S, T059V, T059W,T060D, T060F, Τ060Ι, Τ060Κ, T060L, Τ060Ν, T060Q, T060R, T060V,T060W, Τ060Υ, T065C, Τ065Ε, T065F, Τ065Η, Τ065Ι, Τ065Κ, T065L,Τ065Μ, Τ065Ρ, T065Q, T065R, T065V, Τ065Υ, S066C, S066D, S066E,S066F, S066H, S066I, S066K, S066L, S066N, S066P, S066Q, S066R,S066T, S066V, S066W, S066Y, Q087A, Q087D, Q087E, Q087H, Q087I,Q087K, Q087L, Q087M, Q087N, Q087R, Q087S, Q087T, Q087V, Q087W,N090C, N090D, Ν090Ε, N090F, N090G, Ν090Η, Ν090Κ, N090L, N090R,Ν090Τ, N096G, Ν096Η, Ν096Κ, N096R, Κ097Η, K097Q, K097W, Κ100Α,K100D, Κ100Ε, K100F, Κ100Η, Κ100Ν, Κ100Ρ, K100Q, K100R, K100S,K100V, Κ100Υ, R110A, R110C, R110E, R110H, R110K, R110L, R110M,R110N, R110Q, R110S, R110Y, D119E, D119H, D119I, D119L, D119Q,D119R, D119S, D119T, D119V, D119W, G128C, G128F, G128H, G128K,G128L, G128M, G128N, G128Q, G128R, G128W, G128Y, S129A, S129C,S129D, S129F, S129G, S129H, S129I, S129K, S129L, S129M, S129Q,S129R, S129T, S129V, S129W, S129Y, F130I, F130K, F130L, F130M,F130Q, F130R, F130T, F130V, F130Y, S135P, G136I, G136L, G136P,G136V, G136W, G136Y, S137A, Μ138Ι, Μ138Κ, M138L, M138Q, M138V,D139A, D139C, D139E, D139G, D139H, D139I, D139K, D139L, D139M,D139P, D139R, D139S, D139V, D139W, D139Y, V140C, Q151I, Ε152Α,E152C, E152D, E152Ff E152G, EÍ52H, E152L, Ε152Μ, Ε152Ν, E152R,E152S, E152W, N155D, Ν155Κ, N155Q, N155R, D178A, D178C, D178G,D178H, D178K, D178L, D178M, D178N, D178P, D178Q, D178R, D178S,D178T, D178V, D178W, D178Y, Τ179Α, T179F, Τ179Η, Τ179Ι, Τ179Κ,T179L, Τ179Μ, Τ179Ν, Τ179Ρ, T179Q, T179R, T179S, T179V, T179W,Τ179Υ, Ε186Α, E186C, E186D, E186G, Ε186Η, Ε186Κ, E186L, Ε186Μ,Ε186Ν, Ε186Ρ, E186Q, E186R, E186S, Ε186Τ, E186V, E186W, Ε186Υ,V190H, V190I, V190K, V190L, V190Q, V190R, S191F, S191G, S191H,S1911, S191K, S191L, S191N, S191Q, S191R, S191W, L198M, L198V,S199C, S199D, S199E, S199F, S199I, S199K, S199L, S199N, S199Q,S199R, S199V, Υ204Η, Υ204Τ, G205F, G205H, G205L, G205M, G205N,G205R, G205S, G205Y, Κ211Α, K211C, K211D, K211G, Κ211Μ, Κ211Ν,K211Q, K211R, K211S, Κ211Τ, K211V, Κ214Α, K214C, Κ214Ε, Κ214Ι,K214L, Κ214Μ, Κ214Ν, K214Q, K214R, K214S, K214V, L216A, L216C,L216F, L216H, L216Q, L216R, L216S, L216Y, Ν218Κ, Ν218Ρ, T219D,D220A, D220E, D220H, D220K, D220N, D220P, A221D, Α221Ε, A221F,Α221Ι, Α221Κ, A221L, Α221Μ, Α221Ν, A221S, A221V, Α221Υ, G222C,G222H, G222N, G222R, Y224F, Υ224Η, Υ224Ν, Y224R, T243C, T243G,Τ243Η, Τ243Ι, Τ243Κ, T243L, T243Q, T243R, T243W, Τ243Υ, Κ244Α,K244C, K244D, Κ244Ε, K244F, K244G, K244L, Κ244Μ, Κ244Ν, K244Q,K244S, Κ244Τ, K244V, K244W, Κ244Υ, V260A, V260D, V260E, V260G,V260H, V260I, V260K, V260L, V260M, V260P, V260Q, V260R V260S,V260T, V260W, V260Y, Y261C, Y261F, Υ261Ι, Y261L, Τ263Ε, T263F,Τ263Η, Τ263Ι, T263L, Τ263Μ, T263Q, T263V, T263W, Τ263Υ, S265A,S265C, S265D, S265E, S265K, S265N, S265P, S265Q, S265R, S265T,S265V, S265W, Κ269Ε, K269F, K269G, Κ269Η, Κ269Ι, K269L, Κ269Μ,Κ269Ν, Κ269Ρ, K269Q, K269S, Κ269Τ, K269V, K269W, Κ269Υ, A273C,A273D, Α273Η, Α273Ι, Α273Κ, A273L, Α273Ν, A273Q, A273R, Α273Υ,R280A, R280C, R280D, R280E, R280F, R280G, R280H, R280K, R280L,R280M, R280S, R280T, R280V, R280W, R280Y, L282F, L282G, L282H,L282I, L282K, L282M, L282N, L282Q, L282R, L282V, L282Y, S285A,S285C, S285D, S285E, S285K, S285P, S285Q, S285R, S285W, Q286A,Q286D< Q286E, Q£86K, Q286P, Q286R, A289C, A289D, A289E, A289K,A289L, A289R, A293C, A293R, N296C, N296D, N296E, N296K, N296R,N296V, A297C, A297K, A297N, A297Q, A297R, e G299N.

Em ainda outras modalidades a presente invenção fornecemetaloproteases neutras variantes isoladas, em que as metaloproteasescompreendem mutações múltiplas selecionadas de S023W/G024M,T004V/S023W/G024W, S023W/G024Y/A288V, T004US023W/G024Y,N046Q/N050F/T054L, N050Y/T059R/S129Q, S023W/G024W,A273H/S285P/E292G, S023Y/G024Y, S023Y/G024W,

T004S/S023Y/ G024W, N046Q/T054K, S023W/G024Y, T004V/S023W,T059K/S066N, N046Q/N050W/T054l-m 53Α, T004V/S023W/G024Y,L282M/Q286P/A289R, N046Q/R047K/N050Y/T054K,

L044Q/T263W/S285R, T004US023W/G024W, R047K/N050F/T054K,A273H/S285R, N050Y/T059K/S066Q, T054K/Q192K, N046Q/N050W,L282M/Q286K, T059K/S066Q, T004S/S023W,

L282M/Q286R/A289R/K011 Ν, L282M/A289R, N046Q/N050W/T054H,T059K/S129Q, T004S/S023N/G024Y/F210L, T004V/S023W/G024M/A289V,L282M/Q286K/A289R/S132Τ, N050W/T054H, L282M/Q286R,

L282F/Q286K/A289R, T059R/S066Q, R047K/N050W/T054H,

S265P/L282M/Q286K/A289R, L282M/Q286R/T229S, L282F/Q286K,T263W/S285R, S265P/L282M/Q286K, T263H/A273H/S285R,

T059R/S129V, S03277T263H/A273H/S285R, T059R/S066Q/S129Q,T004S/G024W, T004V/S023W/G024M, T059K/S066Q/S129Q,

L282M/Q286K/A289R/I253V, T004V/S023Y/G024W, T059R/S066N/S129Q,N050F/T054L, T004S/S023N/G024W, T059R/S066N, T059R/S066N/S129V,Q286R/A289R, N046Q/R047K/N050F/T054K, S265P/L282M/Q286P/A289R,S265P/L282M/Q286R/A289R Q062K/S066Q/S129I, S023N/G024W,N046Q/R047K/N050W/T054H, R047K/T054K, T004UG024W,

Τ014M/T059R/S129V, T059R/S066Q/N092S/S129I, R047K/N050W/T054K,T004V/G024W, N047K/N050F/T054K, S265P/L282F/Q286K/N061Y,L282F/Q286K/E159V, T004V/S023Y/G024M, S265P/L282F/A289R/T065S,T059K/F063L/S066N/S129V, T004L7S023W, N050F/T054H,

T059R/S066Q/S129V,'Λ/190I/D220E/S265W/L282F, T004S/S023Y/G024M,T004L/S023N/G024Y, T059K/S066N/S129I, T059R/S066N/S129I,L282M/Q286R/A289R/P162S, N046Q/N050F/T179N, T059K/Y082C/S129V,T059K/S129I, Ν050Υ/Τ054Κ, T059K/S066Q/V102A/S129Q,

T059R/S066Q/S1291, T059W/S066N/S129V/S290R, T059R/S129I,T059K/S066Q/S129Ι, T059K/S066Q/S129V,

S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T004V/S023N/G024W,

S265P/Q286K, S265P/L282F/A289R, D220P/S265W,L055F/T059W/S129V, T059R/S129Q/S191R1 N050W/T054K,

T004S/S023W/G024M, R047K/N050F/T054H, T059K/S066N/K088E,

T059K/S066Q/S129I/V291L, L282M/Q286R/A289R,

T059R/S066N/F085S/S129I, L282F/Q286P/A289R, L282F/Q286R/A289R,

G099D/S265P/L282F/Q286K/A289R, N046Q/N050F,

N050Y/T059W/S066N/S129V, T009I/D220P/S265N, V190F/D220P/S265W,

N157Y/T263W/A273H/S285R, T263W/A273H/S285R, T263W/S285W,

T004V/S023Y, N046Q/R047K/N050W, N050W/T054L,

N200Y/S265P/L282F/Q286P/A289R, T059R/S066Q/P264Q, T004V/G024Y,

T004UG024Y, N050Y/S191I, N050Y/T054L, T004US023W/G024Y/N155K,

F169I/L282F/Q286R/A289R, L282M/Q286K/A289R,

F130UM138L7E152W/D183N, N046Q/R047K/N050Y/T054H,

T004V/G024M, N050Y/T059W/S066Q/S129V, S023N/G024Y,

T054H/P162Q, T004S/S023W/G024Y, N050Y/T054H,

L282F/Q286R/A289R/F169I, R047K/N050W, V190F/D220P, L282M/F173Y,

T004L/S023Y, N050W/A288D, V190I/D220P/S265Q,

S265P/L282F/Q286P/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R,

N046Q/N050Y/T054K, T059W/S066Q, T263W/A273H/S285W

T263W/A273H/S285P, S023Y/G024M, T004L/S023N/G024W,

T004V/S023N/G024Y, T059W/S066N/S129Q, T004S/S023Y,

T004S/S023N/G024M, T059W/S066N/A070T, T059W/S066Q/S129Q,

T263W/A273H, A273H/285P, N046Q/R047K/N050Y/T054L,

N046Q/R047K/N050Y, R047K/N050Y, T263H/S285W, R047K/N050F,

N046Q/R047K/N050F/T054H, S023N/G024M, T004S/G024Y,

R047K/N050Y/T054H, T059W/S066N/S129I, ' R047K/T054L,

T004S/S023W/G024W, M138LyE152F/T146S, D220P/S265N,

T004S/G024M, T004V/S023N, N046Q/N050F/T054K,

N046Q/N050Y/T054H, . Q062H/S066Q/S129Q, T059W/S129Q,

T059W/S129V, N050F/T054K, R047K/N050F/T054L, V190I/D220P/S265W,

N112I/T263H/A273H/S285R, T059W/S066N/S129V, T059W/S066Q/S129I,

T059W/S129I, T263W/S285P, V190I/D220P, A289V/T263H/A273H,

T263H/A273H/S285P, N90S/A273H/S285P, R047K/N050Y/T054L,T004S/S023N, T059R/S129Q, N046Q/R047K/T054H,

T059W/S066Q/S129V, E152W/T179P, N050Y/S066Q/S129V,

T202S/T263W/A273H, T263W/A273H/S285P, M138UE152W/T179P,N046Q/R047K, N046Q/T054H/F176L, T004L/G024M, T004S/L282M,Τ263Η/Α273Η, T263H/A273H/S285W, T004L/S023Y/G024M,L282F/Q286P, T004V/S023Y/G024Y, V190F/S265W, M138L/E152F,V190F/D220E/S265W, N046Q/N050F/T054H, N157Y/S285W,T004F/S023Y/G024M, T004V/S023N/G024M, L198I/D220E/S265Q,N046Q/N050Y/T054K/A154Τ, S016UD220E/S265W, D220E/S265W,D220E/A237S/S265W, S066Q/S129Q, V190F/D220E/S265Q/T267I,L282M/F173Υ/Τ219S, E152F/T179P, V190I/S265W, M138L7S066Q,M138L./E152W, T059W/S066Q/A070T/S129I, V190F/D220E/S265N,V190F/S265N, N046Q/N050Y, e M138UE152F/T179P.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção fornecemetaloproteases neutras variantes isoladas, em que as metaloproteasescomrpeedem mutações múltiplas selecionadas de V190I/D220P,V190I/D220P/S265Q, V190UD220E, V190I/D220E/S265Q,

V190I/D220E/S265W/L282F, V190L7D220E/S265Q, V190I/D220B3265W,V190L/D220E/S265N, T059R/S066Q/S129I, V190I/D220E/S265N,V190L/D220E/S265W, V190I/D220E, T059W/S066N/S129V,T059K/S066Q/S129V, T059K/Y082C/S129V, T059R/S066N/S129I,S066Q/S129V, T059R/S066Q/S129V, T059R/S129I,N050Y/T059W/S066N/S129V, D220P/S265N, S066Q/S129I,

T059W/S066Q/S129V, T059K/S066Q/S129I, T059R/S129V,N050Y/S066Q/S129V, T059W/S06SQ/S129I, h.jOSOY/TOSgW/SOeeQ/SI 29V,T059K/S129I, D220P/S265W, F130LyM138L/T179P, S066N/S129I,T059R/S066N/S129V, F130I/M138L7T179P, T059R/S066Q/N092S/S129I,S066N/S129V, D220E/S265Q, F130L/M138L/E152W/T179P,

T059W/S129V, S265P/L282M/Q286R/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R,T059W/S066N/S129I, V190I/D220P/S265W, F130L7E152W/T179P,F130I-/M138L/E152F/T179P, Q062K/S066Q/S129I, T059K/S066N/S129I,E152H/T179P, S265P/L282M/Q286K/A289R, F130L7M138L7E152Hn"179P,<table>table see original document page 16</column></row><table>L198I/D220E/S265Q, V190I/S265L, T263H/S285W, S265P/L282F/A289R,M138L/S066Q, F130I/E152F, N90S/A273H/S285P,S032T/T263H/A273H/S285R, L282F/Q286P/A289R,N157Y/T263W/A273H/S285R, V105A/S129V, T263H/A273H/S285P,S129Q/L282H, T059W/S066Q, F130V/E152H, S023W/G024Y,T004V/S023N, T059R/S066Q, N050W/T054L, L282M/Q286P/A289R,A115V/V190L/S265W, L282M/Q286K, T059R/S066N, L282F/Q286P,T004V/S023W/G024Μ, S265P/L282F/Q286R/L78H, L282F/Q286K,T004V/S023W/G024Y, S023W/G024M, T059R/R256S, F130V/E152F,T004V/G024W, N050W/T054K, S023Y/G024M, T004V/S023Y,T004V/S023Y/G024M, Ν050Υ/Τ054Η, S023W/G024W,T004V/S023Y/G024Y, T004V/S023N/G024W,F130L/M138L/E152F/T179P/V2911, N050Y/T059K/S066Q,T004V/S023Y/G024W, T059K/S066N, T004V/S023N/G024Y,S023Y/G024W, N050F/7054L, R047K/T054K, S023N/G024W,L282M/A289R, S023Y/G024Y, T004V/G024M, R047K/N050F/T054K,N050F/T054K, T059K/S066Q, S023N/G024M, S023N/G024Y,T004L/S023N, R047K/N050W/T054H, T004LyS023W/G024Y,T004S/S023W, N046Q/N050W/T054H/A142T, T004L/S023Y,T004V/S023W, N050W/T054H, T004S/S023N, T004S/L282M,T004US023W, N050F/T054H, N050Y/T054L, e R047K/N050W/T054K.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção fornecemetaloproteases neutras isoladas que compreendeem mutações múltiplasselecionadas de S066Q/S129V, S066Q/S129I, N050Y/S066Q/S129V,"S066N/S12J9I, T059K/S066Q/S129V, S066N/S129V, F130LyE152W/T179P,S265P/L282M/Q286R/A289R, F130UE152V/T179P, T059K/S066Q/S129I,T263W/S285P, T059K/S066N/S129I, T263W/A273H/S285P,S265P/L282F/Q286R/A289R, F130V/E152W/T179P, T263W/A273H/S285R,V190I/D220P/S265W, F130UE152H, S066N/S129Q,S265P/L282M/Q286K/A289R, V190I/D220E, T059R/S066N/S129I,V190I/D220E/S265W, T059K/S129I, T059R/S066Q/S129I,F130I/M138L/E152H/T179P, F130I/T179P, T263W/A273H/S285W,S016LVD220E/S265W, S066Q/S129Q, V190I/D220E/S265Q,T059R/S066Q/S129V, D220E/S265N, V190UD220E, D220E/S265W,V190I/D220P, V190UD220E/S265N, L044Q/T263W/S285R,S265P/L282M/Q286P/A289R, F130LyM138LyE152H/T179P, T263W/S285R,L282M/Q286R/A289R, T263W/S285W, F130I/E152H/T179P,V190I/D220E/S265N, V190LyD220E/S265W, V190I/D220P/S265Q,T059R/S066N/S129V, V190LyD220E/S265Q, ( E152H/T179P,F130L/M138L/E152F/T179P, Q062H/S066Q/S129Q, T059R/S129V,V190I/D220E/S265W/L282F, V190I/S265Q, F130UE152F/T179P,D220E/S265Q, E152W/T179P, T059K/S066Q/S129Q, F130L7M138L/T179P,F130I/M138L7E152F/T179P, F130L/M138L/E152W/T179P,N050Y/T059W/S066Q/S129V, S265P/L282M/Q286K, T059R/S129I,F130V/E152H/T179P, D220P/S265N, S265P/L282M/Q286P, F130I/E152H,T059R/S066Q/N092S/S129I, F130L7T179P,G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R, T263W/A273H, V190I/S265N,D220P/S265W, F130L7E152W, F130I_/M138L/E152H, S265P/L282M,V190I/S265Q, F130L7E152F, T059K/S129Q, Q286R/A289R,M138L7E152VV/T179P, F130l/M138LyE152H, D220P/S265Q, V190I7S265N,F130I/M138UE152W, S265P/Q286K, V190L/S265Q, V190I/S265W,F130L/M138L/E152F, F130V/E152H, E152F/T179P,N050Y/T059W/S066N/S129V, T059R/S066N/S129Q, F130I/E152W,F130V/E152W, T059R/S066Q/S129Q, T263H/A273H/S285P,N90S/A273H/S285P, V190L7D220E/S265N/V2911, T059R/S129Q,A273H/S285P, F130I/M138L7E152W/T179P, F130V/M138UE152F,N050Y/T059R/S129Q, T059W/S066Q/S129I, F130V/Mf38L/T179P.,_F130V/M138L./E152W/T179P, V190US265W, F130V/M138L/E152W,T059W/S066Q/S129V, V190I/S265Q, F130V/M138L/E152H, F130I/E152F,N157Y/T263W/A273H/S285R, T263H/S285W, M138UE152F/T179P,A115V/V190L/S265W, M138L/E152M, T263H/A273H/S285W,F130L/M138L/E152W, T059K/S066N/K088E, F130I/M138UE152F,F130I/M138L/T179P, T004V/S023N, T059K/S066Q/V102A/S129Q,F130L/M138L, N047K/N050F/T054K, T263H/A273H/S285R,F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H, M138L/E152H, M138LyS066Q,L282M/Q286R/A289R/P162S, L282F/Q286R/A289R, Q062K/S066Q/S129I,A273H/S285R, S265P/L282F/Q286P, S265P/L282F/Q286P/A289R,S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T059W/S066N/S129I,V190I/S265L, T059W/S066N/S129V, F130I/M138L,L282M/Q286K/A289R/I253V, R047K/N050F/T054K, M138UE152F,N050W/T054K, L198I/D220E/S265Q, L282F/Q286K/A289R, N050F/T054K,L282M/Q286R, M138L/E152W, S265P/L282F, F130V/E152F,T059W/S066N/S129Q, F130V/M138L, T263H/A273H,L282M/Q286K/A289R, N046Q/N050W/T054H/A142T,T059W/S066Q/S129Q, S265P/L282F/A289R/T065S, N050F/T054H,S129Q/L282H, L282M/Q286K/A289R/S132T, L282M/Q286R/A289R/K11N,T059K/S066N, R047K/N050Wn"054K, T059K/S066Q, T004V/S023Y,T059W/S066N/S129V/S290R, N050Y/T059K/S066Q, e R047K/N050Y.

A presente invenção também fornece polinucleotídeos isoladoscompreendendo uma seqüência de nucleotídeo (i) tendo pelo menos 70%de identidade às SEQ ID NOS: 1, 2, 12 e/ou 13, ou (ii) sendo capazes dehibridar com a uma sonda derivada de qualquer um das seqüências de nu-cleotídeo expostas aqui, incluindo as seqüências de iniciador fornecidas nosExemplos, sob condições de severidade intermediária a alta, ou (iíi) sendocomplementares à seqüência de nucleotídeo exposta nas SEQ ID NOS: 1,2, 12, e/ou 13. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece veto-res de expressão que codificam pelo menos um tal polinucleotídeo. Em ou-tras modalidades, a presente invenção fornece células hospedeiras quecompreendem estes vetores de expressão. Etn algumas modalidades parti-cularmente preferidas, as células hospedeiras são Bacillus sp. A presenteinvenção também fornece as metaloproteases neutras produzidas pelas cé-lulas hospedeiras. Em outras modalidades, a presente invenção fornece po-linucleotídeos que são complementares a pelo menos uma porção da se-qüência exposta nas SEQ ID NOS: 1,2, 12, e/ou 13.

A presente invenção também fornece métodos de produzir umaenzima tendo atividade de metaloprotease neutra, compreendendo: trans-formar uma célula hospedeira com um vetor de expressão compreendendoum polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência àSEQ ID NO: 1, 2, 12 e/ou 13; cultivar a célula hospedeira transformada sobcondições adequadas para a célula hospedeira. Em algumas modalidadespreferidas, a célula hospedeira é uma espécie de Bacillus.

A presente invenção também fornece sondas que compreendemseqüência de 4 a 150 nucleotídeos substancialmente idêntica a um fragmen-to correspondente das SEQ ID NOS: 1,2, 12, e/ou 13, em que a sonda éusada para detectar uma seqüência de ácido nucléico que codifica para umaenzima tendo atividade metaloproteolítica. Em algumas modalidades, a se-qüência de ácido nucléico é obtida de um Bacillus sp.

A presente invenção também fornece composições de limpezaque compreendem pelo menos uma metaloprotease neutra obtida de umBacillus sp. Em algumas modalidades, pelo menos uma metaloproteaseneutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em algumas modalidades particu-larmente preferidas, pelo menos uma metaloprotease neutra compreende aseqüência de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18. Em al-gumas outras modalidades, a presente invenção fornece metaloproteasesneutras isoladas compreendendo pelo menos 45% de identidade de amino-ácido com metaloprotease neutra compreendendo SEQ ID NOS: 3, 4 e/ou18. Em algumas modalidades, as metaloproteases neutras isoladas com-preendem pelo menos 50% de identidade, preferivelmente pelo menos 55%,mais preferivelmente pelo menos 60%, ainda mais preferivelmente pelo me-nos 65%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferi-velmente pelo menos 75%, ^ainda mais, preferivelmente pelo menos 80%,mais preferivelmente 85%, ainda mais preferivelmente 90%, até mesmomais preferivelmente pelo menos 95%, e o mais preferivelmente 99% deidentidade com SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18.

A presente invenção também fornece composições de limpezaque compreendem pelo menos uma metaloprotease neutra, em que pelomenos uma das metaloproteases neutras tem reatividade imunológica cru-zada com a metaloprotease neutra obtida de um Bacillus sp. Em algumasmodalidades preferidas, as metaloproteases neutras têm reatividade imuno-lógica cruzada com metaloprotease neutra obtida de B. amyloliquefaciens.Em modalidades alternativas, as metaloproteases neutras têm reatividadeimunológica cruzada com metaloprotease neutra que compreende a se-qüência de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 e/ou 18. Em aindaoutras modalidades, as metaloproteases neutras têm reatividade cruzadacom fragmentos (isto é, porções) de uma metaloprotease neutra de Bacillussp. e/ou a metaloprotease neutra que compreende a seqüência de aminoá-cido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18.

A presente invenção também fornece composições de limpezaque compreendem pelo menos uma metaloprotease neutra, em que a meta-loprotease neutra é uma metaloprotease neutra variante tendo uma seqüên-cia de aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição de um a -minoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em uma meta-loprotease neutra de Bacillus sp. tendo uma seqüência de aminoácido ex-posta nas SEQ ID NOS: 3, 4 e/ou 18, particularmente metaloprotease neutrade B. amyloliquefaciens. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, a presente invenção também fornece composições de limpeza quecompreendem pelo menos uma metaloprotease neutra, em que a metalo-protease neutra é uma metaloprotease neutra variante tendo uma seqüênciade aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição de um amino-ácido feita em uma posição equivalente a uma posição em uma metalopro-tease neutra de Bacillus sp. tendo uma seqüência de aminoácido exposta naSEQ ID NO: 18, particularmente metaloprotease neutra de B. amyloliquefa-ciens.

Em ainda modalidades adicionais, as composições de limpezacontêm pelo menos uma metaloprotease neutra compreendendo um conjun-to de mutações nas SEQ ID NOS: 3, 4 e/ou 18. Em algumas modalidadesparticularmente preferidas, as metaloproteases neutras variantes compre-endem pelo menos uma substituição que corresponde às posições de ami-noácido nas SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18, e em que as metaloproteases neu-tras variantes têm desempenho melhor em pelo menos uma propriedade,quando comparada à metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens do tiposelvagem.

A presente invenção também fornece composições de limpezacompreendendo uma quantidade eficaz de limpeza de pelo menos uma en-zima metaloproteolítica, a enzima compreendendo uma seqüência de ami-noácido tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência às SEQ IDNOS: 3, 4, e/ou 18, e uma formulação de limpeza adequada. Em algumasmodalidades preferidas, as composições de limpeza também compreendemuma ou mais enzimas adicionais ou derivados de enzimas selecionadas dogrupo que consiste em proteases, amilases, lipases, mananases, pectina-ses, cutinases, oxidorreductases, hemicelulases e celulases.

A presente invenção também fornece composições compreen-dendo pelo menos uma metaloprotease neutra obtida de um Bacillus sp., emparticular B. amyloliquefaciens, em que as composições também compreen-dem pelo menos um estabilizante. Em algumas modalidades, o estabilizanteé selecionado de bórax, glicerol, íons de zinco, íons de cálcio, e formato decálcio. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece inibidorescompetitivos adequados para estabilizar a enzima da presente invenção pa-ra tensoativos aniônicos. Em algumas modalidades, pelo menos uma meta-Ioprotease neutra é obtida de um Bacillus sp. Em algumas modalidades par-ticularmente preferidas, a pelo menos uma metaloprotease neutra é obtidade B. amyloliquefaciens. Em algumas modalidades particularmente preferi-das, a pelo menos uma metaloprotease neutra compreende a seqüência deaminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18.

A presente invenção também fornece composições compreen-dendo pelo menos uma metaloprotease neutra obtida de um Bacillus sp., emque a metaloprotease neutra é uma variante autoliticamente estável. Emalgumas modalidades, pelo menos uma metaloprotease neutra variante éobtida de B. amyloliquefaciens. Em algumas modalidades particularmentepreferidas, a pelo menos uma metaloprotease neutra variante compreende aseqüência de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4, e/ou 18.

A presente invenção também fornece composições de limpezaque compreendem pelo menos 0,0001 por cento em peso da metaloprotea-se neutra da presente invenção, e opcionalmente, um componente adjunto.Em algumas modalidades, a composição compreende um componente ad-junto. Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende umaquantidade suficiente de um modificador de pH para fornecer a composiçãocom um pH puro de cerca de 3 a cerca de 5, a composição sendo essenci-almente livre de materiais que se hidrolisam em um pH de cerca de 3 a cer-ca de 5. Em algumas modalidades particularmente preferidas, os materiaisque se hidrolisam compreendem um material de tensoativo. Em modalida-des adicionais, a composição de limpeza é uma composição líquida, em ou-tras modalidades, a composição de limpeza é uma composição sólida e emainda outras modalidades, a composição de limpeza é um gel. De fato, nãoé intencionado que a presente invenção seja limitada a qualquer formulaçãoe/ou composição particular, visto que várias formulações e/ou composiçõesencontram uso na presente invenção. Em outras modalidades, o material detensoativo compreende um tensoativo de alquil sulfato de sódio compreen-dendo uma porção de óxido de etileno.

A presente invenção adicionalmente fornece composições delimpeza que além de pelo menos uma metaloprotease neutra da presenteinvenção, também compreende pelo menos uma enzima estável em ácido, acomposição de limpeza compreendendo uma quantidade suficiente de ummodificador de pH para fornecer a composição um pH puro de cerca de 3 acerca de 5, a composição sendo essencialmente livre de materiais que sehidrolisam em um pH de cerca de 3 a cerca de 5. Em outras modalidades,os materiais que se hidrolisam compreendem um material de tensoativo. Emalgumas modalidades preferidas, a composição de limpeza sendo umacomposição líquida. Em ainda modalidades adicionais, o material de tensoa-tivo compreende um tensoativo de alquil sulfato de sódio compreendendouma porção de óxido de etileno. Em algumas modalidades, a composiçãode limpeza compreende um componente adjunto adequado. Em algumasmodalidades adicionais, a composição compreende um componente adjuntoadequado. Em algumas modalidades preferidas, a composição compreendede cerca de 0,001 a cerca de 0,5 peso % de metaloprotease neutra.

Em algumas modalidades alternativamente preferidas, a compo-sição compreende de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 por cento em peso demetaloprotease neutra.

A presente invenção também fornece métodos de limpar, com-preendendo as etapas de: a) contatar uma superfície e/ou um artigo com-preendendo um tecido com a composição de limpeza que compreende ametaloprotease neutra da presente invenção a uma concentração apropria-da; e b) opcionalmente lavar e/ou enxaguar a superfície ou material. Emmodalidades alternativas, qualquer composição adequada fornecida aquiencontra uso nestes métodos. Em algumas modalidades, o tecido compre-ende pelo menos uma mancha de grama. Em algumas modalidades particu-larmente preferidas, as composições de limpeza da presente invenção en-contram uso em remover manchas de grama e outras dos tecidos.

A presente invenção também fornece alimentação de animaiscompreendendo pelo menos uma metaloprotease neutra obtida de um Bacil-Ius sp. Em algumas modalidades, pelo menos uma metaloprotease neutra éobtida de B. amyloliquefaciens. Em algumas modalidades particularmentepreferidas, pelo menos uma metaloprotease neutra compreende a seqüên-cia de aminoácido exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas moda-lidades alternativas particularmente preferidas, pelo menos uma metalopro-tease neutra compreende a seqüência de aminoácido exposta na SEQ IDNO: 18.

A presente invenção fornece um polipeptídeo isolado tendo ati-vidade metaloproteolítica, (por exempla, üma metaJoprotease neutra) tendoa seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18. Em algumas moda-lidades, a presente invenção fornece polipeptídeos isolados tendo cerca de40% a 98% de identidade com a seqüência exposta na SEQ ID NO: 18. Emalgumas modalidades preferidas, os polipeptídeos têm cerca de 50% a 95%de identidade com a seqüência exposta na SEQ ID NO: 18. Em algumasmodalidades preferidas adicionais, os polipeptídeos têm cerca de 60% a90% de identidade com a seqüência exposta na SEQ ID NO: 18. Em aindamodalidades adicionais, os polipeptídeos têm cerca de 65% a 85% de iden-tidade com a seqüência exposta na SEQ ID NOS: 3, 4, ou 18. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, os polipeptídeos têm cerca de 90%a 95% de identidade com a seqüência exposta nas SEQ ID NOS: 3, 4, ou18.

A presente invenção também fornece polinucleotídeos isoladosque codificam metaloproteases neutras compreendendo uma seqüência deaminoácido compreendendo pelo menos 40% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4, ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 50% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 e/ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 60% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 70% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 80% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 90% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. Em algumas modalidades, asmetaloproteases neutras têm pelo menos 95% de identidade de seqüênciade aminoácido às SEQ ID NOS: 3, 4 ou 18. A presente invenção tambémfornece vetores de expressão que compreendem qualquer um dos polinu-cleotídeos fornecidos acima.

A presente invenção também fornece células hospedeiras trans-formadas com os vetores de exp/essão da presente invenção, de modo quepelo menos uma metaloprotease neutra seja expressada pelas células hos-pedeiras. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são bactérias,enquanto em outras modalidades, as células hospedeiras são fungos.

A presente invenção também fornece polinucleotídeos isoladoscompreendendo uma seqüência de nucleotídeo (i) tendo pelo menos 70%de identidade à SEQ ID NO: 1,2, 12 e/ou 13, ou (ii) sendo capaz de hibridarcom a uma sonda derivada da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1,2, 12, e/ou 13, sob condições de severidade média a alta, ou (iii) sendocomplementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 12, e/ou 13.Em algumas modalidades, a presente invenção fornece vetores compreen-dendo tal polinucleotídeo. Em outras modalidades, a presente invenção for-nece células hospedeiras transformadas com tais vetores.

A presente invenção também provê métodos para produzir pelomenos uma enzima tendo atividade de metaloprotease neutra, compreen-dendo: as etapas de transformar uma célula hospedeira com um vetor deexpressão compreendendo um polinucleotídeo compreendendo pelo menos70% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 1, 2, 12, e/ou 13, cultivar acélula hospedeira transformada sob condições adequadas para a célulahospedeira produzir a metaloprotease neutra; e restabelecer a metaloprote-ase neutra. Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira é umBacillus sp, enquanto em algumas modalidades alternativas, a célula hospe-deira é B. amyloliquefaciens.

A presente invenção também fornece fragmentos (isto é, por-ções) do DNA codificando as metaloproteases neutras fornecidas aqui. Es-tes fragmentos encontram uso em ob.ter fragmentos de DNA de comprimen-to parcial capazes de serem usados para isolar ou identificar polinucleotí-deos codificando enzima de metaloprotease neutra madura descrita aqui deB. amyloliquefaciens, ou um segmento dos mesmos tendo atividade proteolí-tica. Em algumas modalidades, porções do DNA fornecidas na SEQ ID NO:2 encontram uso em obter fragmentos homólogos de DNA de outras espé-cies que codificam uma metaloprotease neutra ou porção da mesma tendoatividade metalqproteolítica.

A presente invenção também fornece pelo menos uma sondacompreendendo um polinucleotídeo substancialmente idêntico a um frag-mento das SEQ ID NOS: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, e/ou qual-quer seqüência de iniciador exposta aqui, em que a sonda é usada para de-tectar uma seqüência de ácido nucléico que codifica para uma enzima tendoatividade metaloproteolítica, e em que a seqüência de ácido nucléico é obti-da de uma fonte bacteriana. Em algumas modalidades, a fonte bacteriana éum Bacillus sp. Em algumas modalidades preferidas, a fonte bacteriana é B.amyloliquefaciens.

A presente invenção também fornece composições compreen-dendo pelo menos uma das metaloproteases neutras fornecidas aqui. Emalgumas modalidades preferidas, as composições são composições de lim-peza. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composiçõesde limpeza compreendendo uma quantidade eficaz de limpeza de pelo me-nos uma metaloprotease neutra compreendendo uma seqüência de amino-ácido tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 18pelo menos 90% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 18, e/ou tendouma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 18. Em algumas modalida-des, as composições de limpeza também compreende pelo menos um ad-junto de limpeza adequado. Em algumas modalidades, a metaloproteaseneutra é derivado de um Bacillus sp. Em algumas modalidades preferidas, oBacillus sp., é B. amyloliquefaciens.

Em ainda outras modalidades, a composição de limpeza tam-bém compreende pelo menos umas enzimas adicionais ou derivados de en-zimas selecionadas do grupo que consiste em proteases, amilases, lipases,mananases, e celulases.

A presente invenção também fornece metaloproteases neutrasde ocorrência natural isoladas compreendendo uma seqüência de aminoá-cido tendo pelo menos 45% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 18,pelo menos 60% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 18, pelo menos75% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 18, pelo menos 90% de i-4 dentidade de seqüência à SEQ ID NO: 18, pelo menos 95% de idèntidadede seqüência à SEQ ID NO: 18, e/ou tendo a seqüência SEQ ID NO: 18, ametaloprotease neutra sendo isolada de um Bacillus sp. Em algumas moda-lidades, a metaloprotease neutra é isolada de B. amyloliquefaciens.

Em modalidades adicionais, a presente invenção fornece varian-tes criadas das metaloproteases neutras da presente invenção. Em algumasmodalidades, as variantes criadas geneticamente são modificadas usandotecnologias de DNA recombinante, enquanto em outras modalidades, asvariantes são de ocorrência natural. A presente invenção também abrangevariantes criadas de enzimas homólogas, como também homólogos de en-zima isolada. Em algumas modalidades, as metaloproteases neutras homó-logas variantes criadas são geneticamente modificados usando tecnologiasde DNA recombinante, enquanto em outras modalidades, as metaloprotea-ses neutras homólogas variantes são de ocorrência natural.

A presente invenção também provê métodos para produzir me-taloproteases neutras, compreendendo: (a) transformar uma célula hospe-deira com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tendopelo menos 70% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 2, pelo menos95% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 2, e/ou tendo uma seqüên-cia de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 2; (b) cultivar a célula hospedeiratransformada sob condições adequadas para a célula hospedeira produzir ametaloprotease neutra; e (c) restabelecer a metaloprotease neutra. Em al-gumas modalidades, a célula hospedeira é uma espécie de Bacillus (porexemplo, B. subtilis, B. clausii, ou B. licheniformis). Em modalidades alterna-tivas, a célula hospedeira é um B. amyloliquefaciens.

Em outras modalidades, a presente invenção fornece meios pa-ra produzir células hospedeiras que são capazes de produzir as metalopro-teases neutras da presente invenção em quantidades relativamente gran-des. Em modalidades particularmente preferidas, a presente invenção for-nece meios de produzir metaloprotease neutra com várias aplicações co-merciais onde degradação ou síntese de polipeptídeos são desejadas, inclu-indo composições de limpeza, como também componentes alimentícios e/oude alimentação, processamento têxtil, acabameníí) de couro.orocessamen-to de grão, processamento de carne, limpeza, preparação de hidrolisados deproteína, auxiliares digestivos, composições microbicidas, composições bac-teriostáticas, composições fungistáticas, produtos de cuidado pessoal (porexemplo, cuidado oral, cuidado de cabelo, e/ou cuidado de pele).

A presente invenção também fornece metaloproteases neutrasvariantes tendo desempenho melhorado quando comparada à metaloprote-ase neutra de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem. Em algumas modali-dades preferidas, o desempenho melhorado compreende termoestabilidademelhorada, quando comparada à metaloprotease neutra de B. amyloliquefa-ciens do tipo selvagem. Em modalidades preferidas alternativas, o desem-penho melhorado compreende desempenho melhorado sob condições depH mais baixo ou mais alto, quando comparada à metaloprotease neutra deB. amyloliquefaciens do tipo selvagem. Em modalidades preferidas adicio-nais, o desempenho melhorado compreende estabilidade autolítica melho-rada, quando comparada à metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciensdo tipo selvagem. Em algumas modalidades particularmente preferidas, ascomposições de enzima da presente invenção têm desempenho de lavagemcomparável ou melhorado, quando comparada às metaloproteases neutraspresentemente usadas. Outros objetivos e vantagens da presente invençãosão evidentes aqui.

DESCRIÇÃO PAS FIGURAS

Figura 1 fornece um gráfico que mostra os resultados da deter-minação das constantes de afinidade de proteína de ligação neutra deMULTIFECT® purificada para cátions de zinco e de cálcio usando as tintu-ras fluorescentes Fluo-Zn3 e Fluo-3, respectivamente.

Figura 2 fornece um gráfico que mostra inibição da atividade deprotease de 0,36 mg/ml de nprE de B. amyloliquefaciens recombinante for-mulado por Sulfonato de Alquilbenzeno Linear (LAS) ensaiado usando o en-saio de protease de QuantiCleave®.

Figura 3 fornece um alinhamento de seqüência de vários homó-logos de metaloprotease (SEQ ID NOS: 173-181) que encontram uso napresente invenção.

Figura 4 fornece um alinhamento de seqüência de vários homó-logos de metaloprotease (SEQ ID NOS: 182-191) que encontram uso napresente invenção. Nesta Figura, a numeração é para termolisina (B. ther-moroteolyticus). Como na Figura 3, o "*" indica resíduos conservados, ":"indica resíduos de modo conservador substituídos, e "." indica resíduos simi-lares.

Figura 5 fornece um alinhamento de seqüência de vários homó-logos de metaloprotease (SEQ ID NOS: 192-195) identificados através demodelagem de homologia.

Figura 6 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01905.

Figura 7 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01906.

Figura 8 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01907.

Figura 9 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01908.

Figura 10 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01909.

Figura 11 fornece um mapa de plasmídeo pJ4:G01938.

Figura 12 fornece um mapa de plasmídeo pJHT.

Figura 13 fornece um mapa de plasmídeo pAC.

Figura 14 fornece um mapa de pUBnprE.

Figura 15 fornece um esquemático mostrando a amplificação dopromotor de aprE e fragmentos de gene de nprE de B. subtilis.

Figura 16 fornece um mapa de plasmídeo pEL501.

Figura 17 fornece um esquemático mostrando a amplificação dopromotor de aprE e fragmentos de gene de nprB B. subtilis.

Figura 18 fornece um mapa de plasmídeo pEL508.

Figura 19 fornece um esquemático mostrando a amplificação dopromotor de aprE e fragmentos de gene de nprT de B. stearothermophilus,usados na produção da cepa EL560.

Figura 20 fornece um diagrama exibindo a construção da cepaEL560.

Figura 21 fornece um esquemático mostrando a amplificação dopromotor de aprE e fragmentos de gene de npr de B. caldolyticus, usadosna produção da cepa EL5fj51.

Figura 22 fornece um diagrama exibindo a construção da cepaEL561.

Figura 23 fornece um esquemático mostrando a amplificação dopromotor de aprE e fragmentos de gene de nprB de B. thuringiensis.

Figura 24 fornece um mapa de plasmídeo pEL568.

Figura 25 fornece um gráfico que mostra resultados de experi-mentos projetados para determinar o armazenamento a longo prazo de 0,36mg/ml concentrado de UF de metaloprotease neutra (nprE) em material ba-se de TIDE® 2005 na presença de íons de zinco e cálcio a 32-C. Para pro-pósitos comparativos, resultados obtidos são fornecidos para testagem semsal e cálcio em excesso.

Figura 26 fornece dados de teste de desempenho de lavagemusando Terg-O-Tometer (TOM) e substratos sujos variados. Painel A forne-ce resultados que mostram a remoção de sujeira delta (%) de subtilisina(BPN' Y217L) e MULTIFECT® Neutral purificado em EMPA 116 (fixo e soltoem algodão) após lavagem a 15°C em detergente líquido de TIDE®-2005.Painel B fornece resultados que mostram a remoção de sujeira delta (%) desubtilisina (BPN1 Y217L) e MULTIFECT® Neutral purificoado em meio degrama de Equest® sujado em algodão após lavagem a 15°C em detergentelíquido de TIDE®-2005. Painel C fornece resultados que mostram a remo-ção de sujeira delta (%) de subtilisina (BPN1 Y217L) e MULTIFECT® Neutralpurificado em CFT C-10 (pigmento, óleo, leite em algodão) após lavagem a15°C em detergente líquido de TIDE®-2005.

Figura 27 fornece um gráfico que mostra os resultados das var-reduras de DSC para NprE e variantes a 440 ppm obtidas usando a VP-CapDSC (MicroCal®).

Figura 28 fornece um gráfico que mostra os resultados para var-reduras de DSC para NprE e variantes a 440 ppm na presença de 130 mMde citrato obtidas usando VP-Cap DSC (MicroCal®).

Figura 29 fornece um gráfico que mostra os pontos de fundiçãotérmica para NprE a 440 ppm na presença de vários aditivos e obtidos u-sando VP-Cap DSC (MicroCal®). Nesta Figura, a linha horizontal representa ''a Tm para NprE do tipo selvagem sem aditivos.

Figura 30 fornece um gráfico que mostra a atividade restante denprE e homólogos de nprE em 25% de TIDE® a 25eC, após 90 minutos.

Figura 31 fornece um gráfico que mostra o desempenho de la-vagem de BMI de nprE e homólogos de nprE.

Figura 32 fornece um gráfico que mostra os resultados das me-dições de estabilidade de NprE em várias misturas de formulação.Figura 33 fornece gráficos (Painéis A, B e C que mostram a taxade inativação de NprE com diferentes % de concentrações de DTPA a umaconcentração de formato de cálcio fixa.

Figura 34 fornece gráficos (Painéis A, B e C) mostrando que osoftware de análise de DOE gerou perfis de predição de uma composiçãode DTPA e de formato de cálcio com base na meta da resposta (taxa dequeda).

Figura 35 fornece as seqüências de aminoácido (SEQ ID NOS:222-226) para os fragmentos autolíticos induzidos por citrato de NprE real-çando os sítios de autólise. Fragmentos 1 e 2 são o primeiro ligador, Frag-mentos 3-5 representam o segundo ligador. As letras grifadas representamos términos N seqüenciados e as letras em negrito realçam os peptídeosque foram identificados da digestão em gel dos respectivos fragmentos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições compre-endendo pelo menos uma enzima de metaloprotease neutra que tem estabi-lidade sob armazenamento melhorada. Em algumas modalidades, a metalo-protease neutra encontra uso em limpeza e outras aplicações. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, a presente invenção fornece méto-dos e composições compreendendo metaloprotease(s) neutra(s) obtida(s)de Bacillus sp. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, ametaloprotease neutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em ainda outrasmodalidades preferidas, a metaloprotease neutra é uma variante da metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens. Em ainda modalidades adicionais,a metaloprotease neutra é um homólogo da metaloprotease neutra d£ B.amyloliquefaciens. A presente invenção encontra uso particular em aplica-ções incluindo, mas não limitadas à limpeza, alvejamento e desinfecção.

A menos que do contrário indicado, a prática da presente inven-ção envolve técnicas convencionais comumente usadas em biologia molecu-lar, microbiologia, purificação de proteína, criação de proteína, seqüenciaçãode proteína e de DNA, e campos de DNA recombinante que estão dentro dahabilidade da técnica. Tais técnicas são conhecidas àqueles de habilidadena técnica e são descritas em numerosos textos e trabalhos de referência(Vide por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual", Segunda Edição (Cold Spring Harbor), [1989]); e Ausubel et al., "Cur-rent Protocols in Molecular Biology" [1987]). Todas as patentes, pedidos depatente, artigos e publicações mencionados aqui, supra e infra, são por estemeio expressamente aqui incorporados por referência.

Além disso, os títulos fornecidos aqui não são limitações dosvários aspectos ou modalidades da invenção, que podem ser tidos em refe-rência ao relatório descritivo como um todo. Conseqüentemente, os termosdefinidos imediatamente abaixo são completamente definidos em referênciaao relatório descritivo como um todo. No entanto para facilitar o entendimen-to da invenção, vários termos são definidos abaixo.

DEFINIÇÕES

A menos que do contrário definido aqui, todos termos técnicos ecientíficos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendidopor alguém de habilidade usual na técnica ao qual esta invenção pertence.Por exemplo, Singleton e Sa\r\sbury, Dictionary of Microbiology and Molecu-lar Biology, 2ã Ed., John Wiley e Sons, NY (1994); e Hale e Marham, TheHarper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) provê à-queles de habilidade na técnica uns dicionários gerais de muitos dos termosaqui usados. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen-tes àqueles descritos aqui encontrem uso na prática da presente invenção,os métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Conseqüentemente,os termos definidos imediatamente abaixo são descritos mais completamen-te em referência ao Relatório Descritivo como um todo. Também, como aquiusado, os termos singulares "um", "uma", e "o/a" incluem a referência plurala menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que docontrário indicado, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direitaem orientação 5' para 3'; seqüências de aminoácido são escritas da esquer-da para a direita em orientação amino para carbóxi, respectivamente. É paraser entendido que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, ereagentes particulares descritos, visto que estes podem variar, dependendodo contexto que eles forem usados por aqueles de habilidade na técnica.

É intencionado que toda limitação numérica máxima dada aolongo deste relatório descritivo inclui toda limitação numérica mais baixa,como se tais limitações numéricas mais baixas fossem escritas expressa-mente aqui. Toda limitação numérica mínima dada ao longo deste relatóriodescritivo incluirá toda limitação numérica mais alta, como se tais limitaçõesnuméricas mais altas fossem escritas expressamente aqui. Toda faixa nu-mérica dada ao longo deste relatório descritivo incluirá toda faixa numéricamais restrita que caia dentro de tal faixa numérica mais vasta, como se taisfaixas numéricas mais restritas fossem expressamente todas escritas aqui.

Todos os documentos citados são, em parte relevante, incorpo-rados aqui por referência; a citação de qualquer documento não será inter-pretada como uma admissão que é técnica anterior com respeito à presenteinvenção.

Como aqui usado, o termo "alvejamento" refere-se ao tratamen-to de um material (por exemplo, tecido, lavagem de roupa, polpa, etc.) ousuperfície para um comprimento suficiente de tempo e sob condições de pHe de temperatura apropriadas para realizar um clarearnento (isto é, bran-queamento) e/ou limpeza do material. Exemplos de químicas adequadaspara alvejamento incluem, mas não são limitadas a CIO2, H2O2, perácidos,NO2, etc.

Como aqui usado, o termo "desinfecção" refere-se à remoção decontaminantes das superfícies, como também a inibição ou morte de micró-bios nas superfícies dos itens. Não é intencionado que a presente invençãoseja limitada a qualquer superfície «particular, item, ou contaminante(s) oumicróbios a ser(em) removido(s).

Como aqui usado, o termo "multímero" refere-se a duas ou maisproteínas ou peptídeos que estão covalente ou não-covalentemente associ-ados e existem como um complexo em solução. Um "dímero" é um multíme-ro contendo duas proteínas ou peptídeos; um "trímero" contém três proteí-nas ou peptídeos etc. Como aqui usado, "octâmero" refere-se a um multíme-ro das oito proteínas ou peptídeos.Como aqui usado, "produtos de cuidado pessoal" significa pro-dutos usados na limpeza, alvejamento e/ou desinfecção de cabelo, pele,couro cabeludo, e dentes, incluindo, mas não limitados a xampus, loções decorpo, géis de banho, hidratantes tópicos, pasta de dentes, e/ou outros lim-padores tópicos. Em algumas modalidades particularmente preferidas, estesprodutos são utilizados em seres humanos, enquanto em outras modalida-des, estes produtos encontram uso com animais não-humanos (por exem-plo, em aplicações veterinárias).

Como aqui usado, "composições de limpeza" e "formulações delimpeza", a menos que do contrário indicado, referem-se às composiçõesque encontram uso na remoção de compostos indesejados de itens a seremlimpos, tais como tecido, pratos, lentes de contato, outros substratos sólidos,cabelo (xampus), pele (sabões e cremes), dentes (líquidos para limpeza bu-cal, pastas de dente) etc. O termo abrange quaisquer materiais/compostosselecionados para o tipo particular de composição de limpeza desejada e aforma do produto (por exemplo, líquido, gel, grânulo, ou composição de pul-verização), contanto que a composição seja compatível com a metaloprote-ase neutra e outra(s) enzima(s) usada(s) na composição. A seleção especí-fica dos materiais de composição de limpeza é facilmente feita considerandoa superfície, item ou tecido ser limpo, e a forma desejada da composiçãopara as condições de limpeza durante o uso.

Os termos também se referem a qualquer composição sendoadequada para limpar, alvejar, desinfetar, e/ou esterilizar qualquer objetoe/ou superfície. É intencionado que os termos incluam, mas não sejam Iimi-tados.-a composições de detergente (por exemplo, detergentes de lavagemde roupa líquidos e/ou sólidos e detergentes de tecidos finos; formulaçõesde limpeza de superfícies duras, tais como para vidro, madeira, cerâmica ebalcões e janelas de metal; limpadores de tapete; limpadores de forno; puri-ficadores de tecido; amaciantes de tecido; e pré-removedores de manchastêxteis e de lavagem de roupa, como também detergentes para pratos).

De fato, o termo "composição de limpeza" como aqui usado, in-clui a menos que do contrário indicado, agentes de lavagem para todos pro-pósito granulares ou em forma de pó ou agentes de lavagem industriais, es-pecialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem para todos propó-sitos em forma líquida, gel ou de pasta, especialmente os tipos assim cha-mados tipos de líquido industrial (HDL); detergentes líquidos para tecido fi-no; agentes de lavagem de pratos à mão ou agentes de lavagem de pratosde sujeira leve, especialmente aqueles do tipo alto-espumante; agentes delavagem de pratos à máquina, incluindo os vários tabletes, granulares, líqui-dos e tipos auxiliares de enxágüe pra uso doméstico ou institucional; agen-tes de limpeza ou desinfecção líquidos, incluindo tipos antibacterianos paralavar as mãos, barras de limpeza, líquidos para limpeza bucal, limpadoresde dentadura, xampus de carro ou tapete, limpadores de banheiro; xampusde cabelo e cremes de enxágües para cabelo; géis de banho e banhos deespuma e limpadores de metal; como também auxiliares de limpeza taiscomo aditivos alvejantes e "bastão para mancha" ou tipos de pré-tratamento.

Como aqui usado, os termos "composição de detergente" e"formulação de detergente" são usados em referência às misturas que sãointencionadas para u,so em um meio de lavagem para a limpeza de objetossujos. Em algumas modalidades preferidas, o termo é usado em referênciaà lavagem de tecidos e/ou artigos de vestuário (por exemplo, "detergentesde lavagem de roupa"). Em modalidades alternativas, o termo refere-se aoutros detergentes, tais como aqueles usados para limpar pratos, talheresetc. (por exemplo, "detergentes de lavagem de pratos"). Não é intencionadoque a presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composiçãode detergente particular. De fato, é intencionado que além da metaloprotea-se neutra, o termo abranja detergentes contendo tensoativos, transferase(s),enzimas hidrolíticas, óxido reductases, builders, agentes alvejantes, ativado-res de alvejamento, agentes de anil e tinturas fluorescentes, inibidores desolidificação, agentes de mascaramento, ativadores de enzima, antioxidan-tes, e solubilizantes.

Como aqui usado, "Enzima da Requerente" refere-se às metalo-proteases neutras da presente invenção.Como aqui usado, "desempenho intensificado" em um detergen-te é definido como aumentar a limpeza de manchas sensíveis ao alvejamen-to (por exemplo, grama, chá, vinho, sangue, encardido etc.), como determi-nado por avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão. Em modalida-des particulares, a metaloprotease neutra da presente invenção fornece de-sempenho intensificado na remoção de manchas coloridas e sujeiras. Emoutras modalidades, a enzima da presente invenção fornece desempenhointensificado na remoção e/ou descoloração de manchas.

Como aqui usado o termo "composição de limpeza de superfí-cies duras", refere-se às composições de detergente para limpar superfíciesduras tais como chãos, paredes, azulejo, instalações de banheiro e cozinhae similares. Tais composições são fornecidas em qualquer forma, incluindomas não limitadas a sólidos, líquidos, emulsões etc.

Como aqui usado, "composição de lavagem de pratos" refere-sea todas as formas para composições para limpar pratos, incluindo mas nãolimitadas às formas granulares e líquidas.

Como aqui usado, "composição de limpeza de tecido" refere-sea todas as formas de composições de detergente para limpar tecidos, inclu-indo mas não limitadas às formas granulares, líquidas e de barra.

Como aqui usado, "têxtil" refere-se a tecidos tecidos, como tam-bém fibras e filamentos de algodão adequados para conversão ou uso comoestames, tecidos tecidos, em malha, e não-tecidos. O termo abrange esta-mes feitos de fibras naturais, como também sintéticas (por exemplo, fabrica-das).

Como aqui usado, "materiais têxteis" é Iim termo garal para fi-bras, intermediários de estame, estame, tecidos, e produtos feitos de tecidos(por exemplo, artigos de vestuário e outros artigos).

Como aqui usado, "tecido" abrange qualquer material têxtil.Desse modo, é intencionado que o termo abranja artigos de vestuário, comotambém tecidos, estames, fibras, materiais não-tecidos, materiais naturais,materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtil.

Como aqui usado, o termo "compatível", significa que os materi-ais de composição de limpeza não reduzem a atividade enzimática da meta-Ioprotease neutra a uma tal extensão que a metaloprotease neutra não sejaeficaz conforme desejado durante as situações de uso normal. Doravantemateriais de composição de limpeza específicos são exemplificados em de-talhes.

Como aqui usado, "quantidade eficaz de enzima" refere-se àquantidade de enzima necessária para alcançar a atividade enzimática re-querida na aplicação específica (por exemplo, produto de cuidado pessoal,composição de limpeza etc.). Tais quantidades eficazes são facilmente ave-riguadas pelo versado na técnica e são com base em muitos fatores, taiscomo a variante de enzima particular usada, a aplicação de limpeza, a com-posição específica da composição de limpeza, e quer uma composição lí-quida ou seca (por exemplo, granular, barra) é requerida e similares.

Como aqui usado, "composições de limpeza de não-tecido" a-brange composições de limpeza de superfícies duras, composições de lava-gem de pratos, composições de limpeza de cuidado pessoal (por exemplo,composições de limpeza orais, composições de limpeza de dentadura, com-posições de limpeza pessoais etc.), e composições adequadas pasi uso naindústria de polpa e de papel.

Como aqui usado, "composições de limpeza orais" refere-se adentifrícios, pastas de dentes, géis de dentes, pós de dentes, líquidos paralimpeza bucal, pulverizações de boca, géis de boca, chicletes, pastilhas, sa-chês, comprimidos, biogéis, pastas de profilaxia, soluções de tratamentodental e similares.

Como aqui usado, o termo "transfe/ase" refere-se a umá enzimaque catalisa a transferência de compostos funcionais para uma faixa desubstratos.

Como aqui usado, "grupo de partida" refere-se ao nucleófilo queé clivado do doador de acila em substituição por outro nucleófilo.

Como aqui usado, o termo "conversão enzimática" refere-se àmodificação de um substrato para um intermediário ou a modificação de umintermediário para um produto final contatando o substrato ou intermediáriocom uma enzima. Em algumas modalidades, contato é estabelecido expon-do o substrato ou intermediário diretamente à enzima apropriada. Em outrasmodalidades, contato compreende expor o substrato ou intermediário a umorganismo que expressa e/ou excreta a enzima, e/ou metaboliza o substratodesejado e/ou intermediário para o intermediário desejado e/ou produto fi-nal, respectivamente.

Como aqui usado, a expressão "estabilidade de detergente" re-fere-se à estabilidade de uma composição de detergente. Em algumas mo-dalidades, a estabilidade é avaliada durante o uso do detergente, enquantoem outras modalidades, o termo refere-se à estabilidade de uma composi-ção de detergente durante armazenamento.

Como aqui usado, a expressão, "estabilidade à proteólise" refe-re-se à habilidade de uma proteína (por exemplo, uma enzima) de suportarproteólise. Não é intencionado que o termo seja limitado ao uso de qualquerprotease particular para avaliar a estabilidade de uma proteína.

Como aqui usado, "estabilidade oxidativa" refere-se à habilidadede uma proteína para funcionar sob condições oxidativas. Em particular, otermo refere-se à habilidade de uma proteína para funcionar na presença devárias concentrações de H2O2 e/ou perácido. Estabilidade sob várias condi-ções oxidativas ou pode ser medida por procedimentos-padrão conhecidosàqueles versados na técnica e/ou pelos métodos descritos aqui. Uma altera-ção substancial em estabilidade oxidativa é comprovada por pelo menoscerca de um aumento ou diminuição de 5% ou mais (na maioria das modali-dades, é preferivelmente um aumento) na meia-vida da atividade enzimáti-ca, quando comparada à atividade enzimática presente na ausência decompostos oxidativos.

Como aqui usado, "estabilidade de pH" refere-se à habilidade deuma proteína para funcionar em um pH particular. Em geral, a maioria dasenzimas tem uma faixa de pH finita na qual elas funcionarão. Além das en-zimas que funcionam em pHs de faixa média (isto é, ao redor de pH 7), háenzimas que são capazes de funcionar sob condições com pHs muito altosou muito baixos. Estabilidade em vários pHs ou pode ser medida por proce-dimentos-padrão conhecidos àqueles versados na técnica e/ou pelos méto-dos descritos aqui. Uma alteração substancial em estabilidade de pH écomprovada por pelo menos cerca de 5% ou mais de aumento ou diminui-ção (na maioria das modalidades, é preferivelmente um aumento) na meia-vida da atividade enzimática, quando comparada à atividade enzimática nopH ótimo da enzima. Porém, não é intencionado que a presente invençãoseja limitada a qualquer nível de estabilidade de pH nem faixa de pH.

Como aqui usado, "estabilidade térmica" refere-se à habilidadede uma proteína para funcionar em uma temperatura particular. Em geral, amaioria das enzimas tem uma faixa finita de temperaturas nas quais elasfuncionarão. Além das enzimas que trabalham em temperaturas de faixamédia (por exemplo, temperatura ambiente), há enzimas que são capazesde funcionar em temperaturas muito altas ou muito baixas. Estabilidade tér-mica ou pode ser medida através de procedimentos conhecidos ou pelosmétodos descritos aqui. Uma alteração substancial em estabilidade térmicaé comprovada por pelo menos cerca de 5% ou mais de aumento ou diminui-ção (na maioria das modalidades, é preferivelmente um aumento) na meia-vida da atividade catalítica de um mutante quando exposto a uma tempera-tura diferente (isto é, mais alta ou mais baixa) que a temperatura ótima paraa atividade enzimática. Porém, não é intencionado que a presente invençãoseja limitada a qualquer nível de estabilidade de temperatura nem faixa detemperatura.

Como aqui usado, o termo "estabilidade química" refere-se àestabilidade de uma proteína (por exemplo, uma enzima) para químicas queadversamente afetam sua atividade. Em algumas modalidades, tais quími-cas incluem, mas não são limitadas a peróxido de hidrogênio, perácidos,detergentes aniônicos, detergentes catiônicos, detergentes não-iônicos, que-lantes, etc. Porém, não é intencionado que a presente invenção seja limita-da a qualquer nível de estabilidade química particular nem faixa de estabili-dade química.

Como aqui usado, a expressão "melhoria de atividade de meta-Ioprotease neutra" refere-se à melhoria relativa da atividade de metaloprote-ase neutra, comparada com uma enzima-padrão. Em algumas modalidades,o termo refere-se a uma taxa melhorada de formação de produto, enquantoem outras modalidades, o termo abrange composições que produzem me-nos produto de hidrólise. Em modalidades adicionais, o termo refere-se àscomposições de metaloprotease neutra com especificidade de substrato al-terada.

Como aqui usada, a expressão "alteração em especificidade desubstrato" refere-se às alterações na especificidade de substrato de umaenzima. Em algumas modalidades, uma alteração em especificidade desubstrato é definida como uma diferença entre a razão de Kcat/Km observadacom uma enzima comparada às variantes de enzima ou outras composiçõesde enzima. Especificidades de substrato de enzima variam, dependendo dosubstrato testado. A especificidade de substrato de uma enzima é determi-nada comparando as eficiências cataiíticas que ela apresenta com substra-tos diferentes. Estas determinações encontram uso particular na avaliaçãoda eficiência de enzimas mutantes, como é em geral desejado para produzirenzimas variantes que exibem maiores razões para substratos particularesde interesse,, Porém, não é intencionado que a presente invenção seja limi-tada a qualquer composição de substrato particular nem qualquer especifici-dade de substrato específica.

Como aqui usada, "propriedade de superfície" é usada em refe-rência a uma carga eletrostática, como também propriedades tais como ahidrofobicidade e/ou hidrofilicidade apresentadas pela superfície de umaproteína.

Corho aqui usada, a expressão "é independentemente selecio-nado do grupo que consiste em ..." significa que as porções ou elementosque são selecionados do grupo de Markush referido podem ser os mesmos,diferentes ou qualquer mistura de elementos como indicado no exemplo aseguir:

Uma molécula que tem 3 grupos R em que cada grupo R é in-dependentemente selecionado do grupo que consiste em A, B e C. Aqui ostrês grupos R podem ser: AAA1 BBB1 CCC1 AAB, AAC, BBA1 BBC, CCA,CCB, ou ABC.

Em referência às composições químicas, o termo "substituído"como aqui usado, significa que a composição orgânica ou radical ao qual otermo é aplicado é:

(a) feito insaturado pela eliminação de pelo menos um elementoou radical; ou

(b) pelo menos um hidrogênio no composto ou o radical é substi-tuído com uma porção contendo um ou mais (i) átomos de carbono, (ii) oxi-gênio, (iii) enxofre, (iv) nitrogênio ou (v) de halogênio; ou

(c) tanto (a) quanto (b).

Porções que podem substituir hidrogênio como descritas em (b)imediatamente acima, que contêm apenas átomos de carbono e hidrogênio,são porções de hidrocarboneto incluindo, mas não limitadas a, grupos alqui-la, alquenila, alquimia, alquildienila, cicloalquila, fenila, alquil fenila, naftila,antrila, fenantrila, fluorila, esteróide, e combinações destes grupos entre si ecom grupos hidrocarboneto polivalentes tais como grupos alquileno, alquili-deno e alquilidina. Porções contendo átomos de oxigênio que podem substi-tuir hidrogênio como descritas em (b) imediatamente acima incluem, masnão são limitadas a, hidróxi, acila ou ceto, grupos contendo éter, epóxi, car-bóxi, e éster. Porções contendo átomos de enxofre que podem substituirhidrogênio como descritas em (b) imediatamente acima incluem, mas nãosão limitadas a, os ácidos contendo enxofre e grupos éster de ácido, grupostioéter, grupos mercapto e grupos tioceto. Porções contendo átomos de ni-trogênio que podem substituir hidrogênio como descritas em (b) imediata-mente acima incluem, mas não são limitadas a, grupos ,amino, grupo nitro, fgrupos azo, grupos amônio, grupos amida, grupos azido, grupos isocianato,grupos ciano e grupos nitrila. Porções contendo átomos de halogênio quepodem substituir hidrogênio como descrito em (b) imediatamente acima in-cluem grupos cloro, bromo, flúor, iodo e quaisquer das porções previamentedescritas onde um hidrogênio ou um grupo alquila pendente é substituídopor um grupo halo para formar uma porção substituída estável.

É entendido que qualquer uma das porções acima (b)(i) a (b)(v)podem ser substituídas umas pelas outras em uma substituição monovalen-te ou por perda de hidrogênio em uma substituição polivalente para formaroutra porção monovalente que pode substituir hidrogênio no composto orgâ-nico ou radical.

Como aqui usado, os termos "purificado" e "isolado" referem-seà remoção de contaminantes de uma amostra. Por exemplo, metaloproteaseneutra é purificada por remoção de proteínas contaminantes e outros com-postos dentro de uma solução ou preparação que não sejam metaloprotea-se neutra. Em algumas modalidades, metaloprotease neutra recombinante éexpressa em células hospedeiras bacterianas ou fúngicas e estas metalo-proteases neutras recombinantes são purificadas pela remoção de outrosconstituintes da célula hospedeira; o percentual de polipeptídeos de metalo-protease neutra recombinante é assim aumentado na amostra. Em modali-dades particularmente preferidas, a metaloprotease da presente invenção ésubstancialmente purificada para um nível de pelo menos cerca de 99% docomponente de proteína, como determinado por SDS-PAGE ou outros mé-todos-padrão conhecidos na técnica. Em modalidades preferidas alternati-vas, a metaloprotease da presente invenção compreende pelo menos cercade 99% do componente de protease das composições. Em ainda modalida-des alternativas, a metaloprotease está presente em uma faixa de cerca depelo menos 90-95% da proteína total e/ou protease.

Como aqui usado, "proteína de interesse", refere-se a uma pro-teína (por exemplo, uma enzima ou "enzima de interesse") que está sendoanalisada, identificada e/ou modificada. Proteínas de ocorrência natural,como também recombinaníes, encontram uso na presente invenção.

Como aqui usado, "proteína" refere-se a qualquer composiçãode aminoácidos compreendida e reconhecida como uma proteína por aque-les de habilidade na técnica. Os termos "proteína", "peptídeo" e polipeptídeosão usados alternadamente aqui. Em que um peptídeo é uma porção deuma proteína, aqueles versados na técnica entenderão o uso do termo nocontexto.

Como aqui usado, proteínas funcional e/ou estruturalmente simi-lares são consideradas ser "proteínas relacionadas". Em algumas modalida-des, estas proteínas são derivadas de um gênero e/ou espécie diferente,incluindo diferenças entre as classes de organismos (por exemplo, uma pro-teína bacteriana e uma proteína fúngica). Em algumas modalidades, estasproteínas são derivadas de um gênero diferente e/ou espécies, incluindodiferenças entre as classes de organismos (por exemplo, uma enzima bacte-riana e uma enzima fúngica). Em modalidades adicionais, proteínas relacio-nadas das mesmas espécies são fornecidas. De fato, não é intencionadoque a presente invenção seja limitada às proteínas relacionadas de qual-quer/quaisquer fonte(s) particular(es). Além disso, o termo "proteínas rela-cionadas" abrange homólogos estruturais terciários e homólogos de se-qüência primária (por exemplo, a metaloprotease neutra da presente inven-ção). Por exemplo, a presente invenção abrange tais homólogos como a-queles fornecidos nas Figuras 3-5. Homólogos adicionais são contemplados,incluindo mas não limitados a enzimas de metaloprotease obtidas de B. ce-reus, B. cereus E33L, B. caldolyticus, B. pumulis, B. megaterium, Bsubtilisamyiosacchariticus, Brevibacillus brevis, Paenibacillus polymyxa (Bacilluspolymyxa), B. stearothermophilus, B. thuripgiensis, B. subtilis e S. aureus,como também aureolisina, elastase extracelular, e protease neutra B. Emoutras modalidades, o termo abrange proteínas que são imunologicamentereativas cruzadas.

Como aqui usado, o termo "derivado" refere-se a uma proteínaque é derivada de uma proteína por adição de um ou mais aminoácidos pa-ra qualquer um ou ambos términos CeN, substituição de um ou mais ami-noácidos .em um ou yários sítios diferentes na seqüência de aminoácido,e/ou deleção de um ou mais aminoácidos em qualquer uma ou ambas asextremidades da proteína ou em um ou mais sítios na seqüência de amino-ácido, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios naseqüência de aminoácido. A preparação de um derivado de proteína é prefe-rivelmente alcançada modificando uma seqüência de DNA codificando paraa proteína nativa, transformação desta seqüência de DNA em um hospedei-ro adequado, e expressão da seqüência de DNA modificada para formar aproteína de derivado.

Proteínas (e derivado referidas compreendem "proteínas vari-antes". Em algumas modalidades preferidas, proteínas variantes diferem deuma proteína de origem e uma para a outra por um número pequeno de re-síduos de aminoácido. O número de resíduos de aminoácido divergentespode ser um ou mais, preferivelmente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, oumais resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades preferidas, o núme-ro de aminoácidos diferentes entre as variantes é entre 1 e 10. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, as proteínas relacionadas e particu-larmente proteínas variantes compreendem pelo menos 35%, 40%, 45%,50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99%de identidade de seqüência de aminoácido. Adicionalmente, uma proteínarelacionada ou uma proteína variante como aqui usada, refere-se a umaproteína que difere de outra proteína relacionada ou uma proteína de origemno número de regiões proeminentes. Por exemplo, em algumas modalida-des, proteínas variantes têm 1, 2, 3, 4, 5, ou 10 regiões proeminentes cor-respondentes que diferem da proteína de origem.

Vários métodos são conhecidos na técnica que são adequadospara gerar variantes das enzimas da presente invenção, incluindo mas nãolimitados à mutagênese de loco-saturação, mutagênese de varredura, muta-gênese insercional, mutagênese aleatória, mutagênese dirigida, e evoluçãodirigida, como também vários outros métodos recombinatórios.

Caracterização das proteínas do tipo selvagem e mutante é rea-lizada por meio de quaisquer meios adequados e é preferivelmente com ba-se na avaliação das propriedades de interesse. Por exemplo, pH e/ou tetn-peratura, como também detergente e/ou estabilidade oxidativa é/são deter-minado^) em algumas modalidades da presente invenção. De fato, é con-templado que as enzimas que têm vários graus de estabilidade em uma oumais destas características (pH, temperatura, estabilidade proteolítica, esta-bilidade de detergente, e/ou estabilidade oxidativa) encontrarão uso.

Como aqui usado, "vetor de expressão" refere-se a uma cons-trução de DNA contendo uma seqüência de DNA que é operavelmente liga-da a uma seqüência de controle adequada capaz de realizar a expressão doDNA em um hospedeiro adequado. Tais seqüências de controle incluem umpromotor para realizar transcrição, uma seqüência de operador opcional pa-ra controlar tal transcrição, uma seqüência que codifica sítios de ligação deribossoma de mRNA adequados e seqüências que controlam terminação detranscrição e translação. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula defago, ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez trans-formado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar in-dependentemente do genoma hospedeiro, ou pode, em algumas circunstân-cias, integrar no próprio genoma. No relatório descritivo presente, "plasmí-deo", "plasmídeo de expressão", e "vetor" são freqüentemente usados deforma alternada uma vez que o plasmídeo é a forma comumente usada devetor no momento. Porém, é intencionado que a invenção inclua tais outrasformas de vetores de expressão que servem funções equivalentes e quesão, ou se tornam, conhecidas na técnica.

Em algumas modalidades preferidas, o gene de metaloproteaseneutra é ligado em um plasmídeo de expressão apropriado. O gene de me-taloprotease neutra clonado é depois usado para transformar ou transfec-cionar uma célula hospedeira para expressar o gene de metaloproteaseneutra. Este plasmídeo pode replicar-se em hospedeiros no sentido de con-ter os elementos bem-conhecidos necessários para a replicação de plasmí-deo ou o plasmídeo pode ser projetado para integrar-se no cromossomohospedeiro. Os elementos necessários são providos para expressão de ge-ne eficiente (por exemplo, um promotor operavelmente ligado ao gene deinteresse). Em algumas modalidades, estes elementos necessários^são for-necidos como o próprio promotor homólogo do gene se for reconhecido, (is-to é, transcrito, pelo hospedeiro), um terminador de transcrição (uma regiãode poliadenilação para células hospedeiras eucarióticas) que é exógeno oué provido pela região de terminador endógena do gene de metaloproteaseneutra. Em algumas modalidades, um gene de seleção é tal como um genede resistência a antibióticos que permite manutenção cultural contínua dascélulas hospedeiras infetadas com plasmídeo através de crescimento emmeios contendo antimicróbicos, está também incluso.

O método de mutagênese de cassete a seguir pode ser usadopara facilitar a construção das variantes de metaloprotease neutra da pre-sente invenção, embora outros métodos possam ser usados. Primeiro, comodescrito aqui, um gene de ocorrência natural que codifica a metaloproteaseneutra é obtido e seqüenciado em todo ou em parte. Depois, a seqüência évarrida para um ponto no que se desejou fazer uma mutação (deleção, in-serção ou substituição) de um ou mais aminoácidos na metaloprotease neu-tra codificada. As seqüências flanqueando neste ponto são avaliadas para apresença de sítios de restrição para substituir um segmento curto do genecom um fundo geral de oligonucleotídeo que quando expresso codificarávários mutantes. Tais sítios de restrição são preferivelmente sítios únicosdentro do gene de proteína para facilitar a substituição do segmento de ge-ne. Porém, qualquer sítio de restrição conveniente que não é demais redun-dante no gene de metaloprotease neutra pode ser usado, desde que osfragmentos de gene gerados por digestão de restrição possam ser reajunta-dos na seqüência apropriada. Se os sítios de restrição não estiverem pre-sentes nas localizações dentro de uma distância conveniente do ponto sele-cionado (de 10 a 15 nucleotídeos), tais sítios são gerados substituindo nu-cleotídeos no gene em um tal maneira que nem a estrutura de leitura nemos aminoácidos codificados na construção final são alterados. Mutação dogene para alterar sua seqüência para conformar à seqüência desejada érealizada através de extensão de iniciador de M13 de acordo com os méto-dos em geral conhecidos. A tarefa de localizar regiões de flanqueamentoadequadas e avaliar as alterações ^necessária? para chegar às duas se-qüências de sítio de restrição convenientes é feita de forma rotineira pelaredundância do código genético, um mapa da enzima de restrição do gene eo número grande de enzimas de restrição diferentes. Observe que se umsítio de restrição de flanqueamento conveniente estiver disponível, o métodonecessita ser usado apenas com relação à região de flanqueamento quenão contém um sítio.

Uma vez o DNA de ocorrência natural e/ou o DNA sintéticoé/são clonado(s), os sítios de restrição flanqueando as posições a ser muta-das são digeridos com as enzimas de restrição de cognato e uma pluralida-de de cassetes de oligonucleotídeos complementares de términos finais éligado ao gene. A mutagênese é simplificada por este método porque todosos oligonucleotídeos podem ser sintetizados para terem os mesmos sítiosde restrição, e nenhum Iigador sintético é necessário para criar os sítios derestrição.

Como aqui usado, "correspondente", refere-se a um resíduo naposição enumerada em uma proteína ou peptídeo, ou um resíduo que éanálogo, homólogo, ou equivalente a um resíduo enumerado em uma prote-ína ou peptídeo.

Como aqui usado, "região correspondente", em geral refere-se auma posição análoga ao longo de proteínas relacionadas ou uma proteínade origem.

Os termos "molécula de ácido nucléico codificando", "seqüênciade ácido nucléico codificando", "seqüência de DNA codificando", e "DNAcodificando" referem-se à ordem ou seqüência de desoxirribonucleotídeosao longo de um filamento de ácido desoxirribonucléipo. A ordem destes de-soxirribonucleotídeos determina a ordem dos aminoácidos ao longo da ca-deia polipeptídica (proteína). A seqüência de DNA desse modo codifica paraa seqüência de aminoácido.

Como aqui usado, o termo "seqüência análoga" refere-se a umaseqüência dentro de uma proteína que fornece função similar, estrutura ter-ciária, e/ou resíduos conservados como a proteína de interesse (isto é, tipi-camente a proteína^original de interesse). Por exemplo, em regiões de epi-topo contendo uma hélice alfa ou uma estrutura de folha beta, os aminoáci-dos de substituição na seqüência análoga preferivelmente mantêm a mesmaestrutura específica. O termo também se refere às seqüências de nucleotí-deo, como também seqüências de aminoácido. Em algumas modalidades,seqüências análogas são desenvolvidas de modo que os aminoácidos desubstituição resultem em uma enzima variante que mostra uma função simi-lar ou melhorada. Em algumas modalidades preferidas, a estrutura terciáriae/ou resíduos dos aminoácidos conservados na proteína de interesse fi-ca(m) localizado(s) no ou próximo do segmento ou fragmento de interesse.Desse modo, onde o segmento ou fragmento de interesse contiver, por e-xemplo, uma estrutura de alfa-hélice ou de beta-folha, os aminoácidos desubstituição preferivelmente mantêm aquela estrutura específica.

Como aqui usado, "proteína homóloga" refere-se a uma proteína(por exemplo, metaloprotease neutra) que tem ação e/ou estrutura simi-lar(es), como uma proteína de interesse (por exemplo, uma metaloproteaseneutra de outra fonte). Não é intencionado que os homólogos (também refe-ridos aqui como "homólogos") sejam necessariamente relacionados evolu-cionariamente. Desse modo, é intencionado que o termo abranja a(s) mes-ma(s) enzima(s) ou similar(es) (isto é, em termos de estrutura e função) ob-tida(s) de espécies diferentes. Em algumas modalidades preferidas, é dese-jável identificar um homólogo tendo uma estrutura quaternária, terciária e/ouprimária similar à proteína de interesse, como substituição pelo segmento oufragmento na proteína de interesse com um segmento análogo do homólogoreduzirá a ruptura da alteração.

Como aqui usado, "genes homólogos" refere-se a pelo menosum par de genes de espécies diferentes, cujos genes correspondem entre sie são idênticos ou bem-parecidos um com o outro. O termo abrange genesque são separados através de especiação (isto é, o desenvolvimento de es-pécies novas) (por exemplo, genes ortólogos), como também genes que fo-ram separados através de duplicação genética (por exemplo, genes parólo-gos). Estes genes codificam "proteínas homólogas".

Cqmo aqui usado, "ortólógo" e "genes ortólogos" referem-se agenes em espécies diferentes que evoluíram de um gene ancestral comum(isto é, um gene homólogo) através de especiação. Tipicamente, ortólogosretêm a mesma função durante o curso de evolução. Identificação de ortólo-gos encontra uso na predição segura da função de gene em genomas re-centemente seqüenciados.

Como aqui usado, "parólogo" e "genes parólogos" referem-se agenes que estão relacionados através de duplicação dentro de um genoma.Embora ortólogos retenham a mesma função através do curso de evolução,parólogos evoluem para funções novas, embora algumas funções sejamfreqüentemente relacionadas ao original. Exemplos de genes parólogos in-cluem, mas não são limitados a genes que codificam tripsina, quimiotripsina,elastase, e trombina, que são todas as serina proteinases e ocorrem juntasdentro das mesmas espécies.

Como aqui usado, proteínas "do tipo selyagem" e "nativas" sãoaquelas encontradas na natureza. Os termos "seqüência do tipo selvagem",e "gene do tipo selvagem" são usados alternadamente aqui, e referem-se auma seqüência que é nativa ou de ocorrência natural em uma célula hospe-deira. Em algumas modalidades, a seqüência do tipo selvagem refere-se auma seqüência de interesse que é o ponto de partida de um projeto de cria-ção de proteína. Os genes que codificam a proteína de ocorrência naturalpodem ser obtidos de acordo com os métodos gerais conhecidos àquelesversados na técnica. Os métodos em geral compreendem sintetizando son-das marcadas tendo regiões de codificação de seqüências putativas da pro-teína de interesse, preparando bibliotecas genômicas de organismos queexpressam a proteína, e triando as bibliotecas para o gene de interesse porhibridação para as sondas. Clones positivamente hibridados são depois ma-peados e seqüenciados.

O termo "molécula de DNA recombinante" como aqui usado re-fere-se a uma molécula de DNA que é compreendida de segmentos de DNAunidos por meio de técnicas biológicas moleculares.

O termo "oligonucleotídeo recombinante" refere-se a um oligo-nucleotídeo criado usando manipulações biológicas moleculares/incluindomas não limitadas à ligação de duas ou mais seqüências de oligonucleotí-deo geradas por digestão de enzima de restrição de uma seqüência de poli-nucleotídeo, a síntese de oligonucleotídeos (por exemplo, a síntese de inici-adores ou oligonucleotídeos) e similares.

O grau de homologia entre as seqüências pode ser determinadousando qualquer método adequado conhecido na técnica (Vide por exem-plo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman eWunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson e Lipman1 Proc. Natl. Acad.Sei. USA 85:2444 [1988]; programas tais como GAP, BESTFIT, FASTA, eTFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics (Genetics ComputerGroup, Madison, Wl); e Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]).

Por exemplo, PILEUP é um programa útil para determinar níveisde homologia de seqüência. PILEUP cria um alinhamento de seqüência múl-tiplo de um grupo de seqüências relacionadas usando alinhamentos pro-gressivos, em pares. Pode-se também representar em diagrama uma árvoremostrando as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento.PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo deFeng e Doolittie, (Feng e Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). O mé-todo é similar àquele descrito por Higgins e Sharp (Higgins e Sharp, CABIOS5:151-153 [1989]). Parâmetros de PILEUP úteis incluindo um peso de inter-valo predefinido de 3,00, um peso de comprimento de intervalo predefinido15 de 0,10, e intervalos finais em peso. Outro exemplo de um algoritmo útil é oalgoritmo de BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol.,215:403-410, [1990]; e Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 [1993]). Um programa de BLAST particularmente útil é o programa deWU-BLAST-2 (Vide, Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]).20 Parâmetros "W", "T", e "X" determinam a sensibilidade e velocidade do ali-nhamento. O programa de BLAST usa como predefinições um comprimentode palavra (W) de 11, a matriz de classificação de BLOSUM62 (Vide, Heni-koff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 [1989]) alinhamentos(B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N'-4, e uma comparação de ambos osfilamentos.

Como aqui usado, "por cento (%) de identidade de seqüência deácido nucléico" é definido como a porcentagem de resíduos de nucleotídeoem uma seqüência candidato que é idêntica com os resíduos de nucleotídeoda seqüência.

Como aqui usado, o termo "hibridação" refere-se ao processopelo qual um filamento de ácido nucléico une-se a um filamento complemen-tar através de emparelhamento de material base, como conhecido na técni-ca.

Como aqui usado, a expressão "condições de hibridação" refe-re-se às condições sob as quais as reações de hibridação é conduzida. Es-tas condições são tipicamente classificadas através do grau de "severidade"das condições sob as quais hibridação é medida. O grau de severidade po-de ser com base, por exemplo, na temperatura de fundição (Tm) do comple-xo de ligação de ácido nucléico ou sonda. Por exemplo, "severidade máxi-ma" tipicamente ocorre em cerca de Tm-5°C (5o abaixo do Tm da sonda);"severidade alta" em cerca de 5-102 abaixo da Tm; "severidade intermediá-ria" a cerca de 10-20® abaixo da Tm da sonda; e "baixa severidade" em cer-ca de 20-25® abaixo da Tm. Alternativamente, ou além disso, condições dehibridação podem ser com base no sal ou condições de resistência iônica dehibridação e/ou um ou mais lavagens de severidade. Por exemplo, 6 χ SSC= severidade muito baixa; 3 χ SSC = severidade baixa a média; 1 χ SSC =severidade média; e 0,5 χ SSC = severidade alta. Funcionalmente, condi-ções de severidade máxima podem ser usadas para identificar seqüênciasde ácido nucléico tendo identidade rígida ou identidade próxima de rígidacom a sonda de hibridação; enquanto condições de severidade alta são u-sadas para identificar seqüências de ácido nucléico tendo cerca de 80% oumais de identidade de seqüência com a sonda.

Para aplicações que requerem seletividade alta, é tipicamentedesejável usar condições relativamente rigorosas para formar os híbridos(por exemplo, condições de sal relativamente baixas e/ou de temperaturaaltas são usadas).

As expressões "substancialmente similares è "substancialmenteidênticos" no contexto de pelo menos dois ácidos nucléicos ou polipeptídeostipicamente significa que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreendeuma seqüência tendo pelo menos cerca de 40% de identidade, mais preferí-vel pelo menos cerca de 50% de identidade, ainda mais preferivelmente pe-lo menos cerca de 60% de identidade, preferivelmente pelo menos cerca de75% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de iden-tidade, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, ainda maispreferivelmente cerca de 95%, o mais preferivelmente cerca de 97% de i-dentidade, às vezes tanto quanto cerca de 98% e cerca de 99% de identida-de de seqüência, comparada à seqüência de referência (isto é, do tipo sel-vagem). Identidade de seqüência pode ser determinada usando programasconhecidos tais como BLAST, ALIGN, e CLUSTAL usando parâmetros pa-drões. (Vide por exemplo, Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990];Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 [1989]; Karin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; e Higgins et al., Gene 73:237 -244 [1988]). Software para executar análises de BLAST estão publicamentedisponíveis através do National Genter for Biotechnology. Também, basesde dados podem ser pesquisadas usando FASTA (Pearson et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 85:2444-2448 [1988]). Uma indicação que dois polipeptí-deos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imuno-Iogicamente reativo cruzado com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, poli-peptídeos que diferem por substituições de aminoácido conservadoras sãoimunologicamente reativos cruzados. Desse modo, um polipeptídeo é subs-tancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os doispeptídeos diferirem apenas em uma, .substituição conservadora. Outra indi-cação que duas seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênti-cas é que as duas moléculas hibridam-se entre si sob condições rigorosas(por exemplo, dentro de uma faixa de severidade média a alta).

Como aqui usado, "resíduos equivalentes" referem-se às proteí-nas que compartilham resíduos de aminoácido particulares. Por exemplo,resíduos equivalentes podem ser identificados determinando a homologia nonível de estrutura terciária para uma proteína (por exemplo, metaloproteaseneutra) cuja estrutura terciária foi determinada através de cristalografia deraio X. Resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais ascoordenadas atômicas de dois ou mais dos átomos de cadeia principal deum resíduo de aminoácido particular da proteína tendo resíduos equivalen-tes putativos e da proteína de interesse (N em N, CA em CA, C em C e Oem O) estão dentro de 0,13 nm e preferivelmente 0,1 nm após o alinhamen-to. Alinhamento é alcançado após o melhor modelo ter sido orientado e po-sicionado para dar a sobreposição máximo de coordenadas atômicas deátomos de proteína de não-hidrogênio das proteínas analisadas. O modelopreferido é o modelo cristalográfico que dá o fator R mais baixo para dadosde difração experimentais na resolução mais alta disponível, determinadousando métodos conhecidos àqueles versados na técnica de cristalografia ecaracterização/análise de proteína.

Como aqui usado, os termos "metaloproteases neutras híbridas"e "metaloproteases neutras de fusão" referem-se às proteínas das quais sãocriadas pelo menos duas proteínas diferentes ou "parentais". Em modalida-des preferidas, estas proteínas parentais são homólogas uma da outra. Porexemplo, em algumas modalidades, uma metaloprotease neutra híbrida pre-ferida ou proteína de fusão contém o término N de uma proteína e o términoC de um homólogo da proteína. Em alguma modalidade preferida, as duasextremidades terminais são combinadas para corresponder à proteína ativade comprimento total.

O termo "elemento regulador" como aqui usado refere-se a umelemento genético que controla algum aspecto da expressão das seqüên-cias de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é um elemento reguladorque facilita a iniciação de transcrição de uma região de codificação opera-velmente ligada. Elementos reguladores adicionais incluem sinais de encai-xe, sinais de poliadenilação e sinais de terminação.

Como aqui usado, "células hospedeiras" são em geral hospedei-ros procarióticos ou eucarióticos que são transformados ou transfeccionadoscom vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante conhecidasna técnica. Células hospedeiras transformadas são capazes de reptícar ve-tores codificando as variantes de proteína ou expressar a variante de proteí-na desejada. No caso de vetores que codificam a pré- ou prepro-forma davariante de proteína, tais variantes, quando expressas, são tipicamente se-gregadas da célula hospedeira no meio de célula hospedeira.

O termo "introduzido" no contexto de inserir uma seqüência deácido nucléico em uma célula, significa transformação, transdução ou trans-fecção. Meios de transformação incluem transformação de protoplasto, pre-cipitação de cloreto de cálcio, eletroporação, DNA descoberto e outros comoconhecido na técnica. (Vide, Chang e Cohen, Mol. Gen. Genet., 168:111 -115 [1979]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986]; e o artigo derevisão por Ferrari et al., em Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corpora-tion.pp. 57-72 [1989]).

O termo "promotor/intensificador" denota um segmento de DNAcontendo as seqüências capazes de fornecer funções de promotor e intensi-ficador (por exemplo, as repetições terminais longas de retrovírus contêmfunções tanto de promotor como de intensificador). O intensificador/promotorpode ser "endógeno" ou "exógeno" ou "heterólogo". Um intensifica-dor/promotor endógeno é um que está naturalmente ligado com um genedado no genoma. Um intensificador/promotor exógeno (heterólogo) é umque é colocado em justaposição a um gene por meio de manipulação gené-tica (isto é, técnicas biológicas moleculares).

A presença de "sinais de junção" em um vetor de expressão fre-qüentemente resulta em níveis mais altos de expressão da transcrição re-combinante. Sinais de junção medeiam a remoção de íntrons da transcriçãode. RNA primária e consistem em um doador de encaixe e sítio de aceitante(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., Cold S-pring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque [1989], pp. 16.7-16.8). Um sítiode doador e de aceitante de encaixe comumente usado é a junção de en-caixe do 16S RNA de SV40.

O termo "transfecção estável" ou "estavelmente transfecciona-do" refere-se à introdução e integração de DNA estranho no genoma da cé-Iuia transfeccionada. O termo "transfectante estável" refere-se <a uma célulatendo DNA estavelmente estranho ou exógeno integrado no DNA genômicoda célula transfeccionada.

Os termos "marcador selecionável" ou "produto de gene sele-cionável" como aqui usados referem-se ao uso de um gene que codificauma atividade enzimática que confere resistência a um antibiótico ou fárma-co na célula no qual o marcador selecionável é expressado.

Como aqui usado, os termos "amplificação" e "amplificação degene" referem-se a um processo pelo qual as seqüências de DNA específi-cas são desproporcionalmente replicadas de modo que o gene amplificadoestá presente em um número de cópia mais alto do que estava inicialmentepresente no genoma. Em algumas modalidades, seleção das células porcrescimento na presença de um fármaco (por exemplo, um inibidor de umaenzima capaz de ser inibida) resulta na amplificação ou do gene endógenoque codifica o produto de gene requerido para crescimento na presença dofármaco ou por amplificação de seqüências exógenas (isto é, entrada) quecodificam este produto de gene, ou ambos. Seleção de células por cresci-mento na presença de um fármaco (por exemplo, um inibidor de uma enzi-ma capaz de ser inibida) pode resultar na amplificação ou do gene endóge-no que codifica o produto de gene requerido para crescimento na presençado fármaco ou por amplificação de seqüências exógenas (isto é, entrada)que codificam este produto de gene, ou ambos.

"Amplificação" é um caso especial de replicação de ácido nu-cléico que envolve especificidade de modelo. É para ser contrastada comreplicação de modelo não-específico (isto é, replicação que é dependentedo modelo mas não dependente em um modelo específico). Especificidadede modelo é aqui distinguida de fidelidade de replicação (isto é, síntese daseqüência de polinucleotídeo apropriada) e especificidade para (ribo- ou de-soxirribo-) nucleotídeo. Especificidade de modelo freqüentemente é descritaem termos de especificidade "alvo". Seqüências-alvo são "alvos" no sentidoque elas são buscadas ser classificadas fora de outro ácido nucléico. Técni-cas de amplificação foram projetadas primariamente para esta classificação.

Como aqui usado, o fèrmo "co-an?plificação" refere-se à introdu-ção em uma célula simples de um marcador amplificável junto com outrasseqüências de gene (isto é, compreendendo um ou mais genes não-selecionáveis tais como aqueles contidos dentro de um vetor de expressão)e à aplicação de pressão seletiva apropriada de modo que a célula amplificao marcador amplificável e as outras seqüências de gene não-selecionávéis.O marcador amplificável pode ser fisicamente ligado às outras seqüênciasde gene ou alternativamente dois pedaços separados de DNA, um contendoo marcador amplificável e o outro contendo o marcador não-selecionável,podem ser introduzidos na mesma célula.

Como aqui usado, os termos "marcador amplificável", "geneamplificável", e "vetor de amplificação" referem-se a um marcador, gene ouum vetor que codifica um gene que permite a amplificação daquele genesob condições de crescimento apropriadas.

Como aqui usado, o termo "ácido nucléico amplificável" refere-se aos ácidos nucléicos que podem ser amplificados por qualquer métodode amplificação. É contemplado que "ácido nucléico amplificável" usualmen-te compreenderá "modelo de amostra".

Como aqui usado, o termo "modelo de amostra" refere-se aoácido nucléico que origina de uma amostra que é analisada para a presençade "alvo" (definido abaixo). Em contraste, "modelo base" é usado em refe-rência ao ácido nucléico diferente do modelo de amostra que pode ou nãoestar presente em uma amostra. Modelo base é mais freqüentemente inad-vertido. Ele pode ser o resultado de transporte, ou pode ser devido à pre-sença de contaminantes de ácido nucléico buscado ser purificado longe daamostra. Por exemplo, ácidos nucléicos de organismos diferentes daquelesa serem detectados podem estar presentes como bases em uma amostrade teste.

"Especificidade de modelo" é alcançada na maioria das técnicasde amplificação pela escolha da enzima. Enzimas de amplificação são en-zimas que, sob condições que elas são usadas, processará apenas seqüên-cias específicas de ácido nucléico em uma mistura heterogênea de ácidonucléico. Por e'xemplo, no caso de QB-replicasé, RNA de MDV-1 específicoao modelo é para a replicase (Vide por exemplo, Kacian et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 69:3038 [1972]). Outros ácidos nucléicos não são replicadospor esta enzima de amplificação. Similarmente, no caso de RNA 17 polime-rase, esta enzima de amplificação tem uma especificidade rigorosa paraseus próprios promotores (Vide, Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970]).No caso de DNA T4 ligase, a enzima não ligada aos dois oligonucleotídeosou polinucleotídeos onde há uma disparidade entre o substrato de oligonu-cleotídeo ou de polinucleotídeo e o modelo na junção de ligação (Vide, Wu eWallace, Genomics 4:560 [1989]). Por fim, Taq e Pfu polimerases, em virtu-de de sua habilidade para funcionar em temperatura alta, são observadasexibir especificidade alta para as seqüências ligadas e desse modo definidaspelos iniciadores; a temperatura alta resulta em condições termodinâmicasque favorecem a hibridação do iniciador com as seqüências-alvo e não hi-bridação com seqüências não-alvo. f

Como aqui usado, o termo "iniciador" refere-se a um oligonucle-otídeo, quer de ocorrência natural como em um digesto de restrição purifica-do quer produzido sinteticamente, que é capaz de atuam como um ponto deiniciação de síntese quando colocado sob condições em que a síntese deum produto de extensão de iniciador é que complementar a um filamento deácido nucléico é induzida, (isto é, na presença de nucleotídeos e um agenteindutor tal como DNA polimerase e em uma temperatura e pH adequados).O iniciador é preferivelmente unifilamentar para eficiência máxima em ampli-ficação, mas pode ser alternativamente bifilamentar. Se bifilamentar, o inici-ador é primeiro tratado para separar seus filamentos antes de ser usado pa-ra preparar os produtos de extensão. Preferivelmente, o iniciador é um oli-godesoxirribonucleotídeo. O iniciador deve ser suficientemente longo parapreparar a síntese de produtos de extensão na presença do agente indutor.Os comprimentos exatos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, in-cluindo temperatura, fonte de iniciador e o uso do método.

Como aqui usado, o termo "sonda" refere-se a um oligonucleotí-deo (isto é, uma seqüência de nucleotídeos), quer de ocorrência natural co-mo em uri digesto de restrição purificado quer produzido sinteticamente, demodo recombinante ou por amplificação de PCR que é capaz de hibridarcom o outro oligonucleotídeo de interesse. Uma sonda pode ser unifilamen-tar ou bifilamentar. Sondas são úteis na detecção, identificação e isolamentode seqüências de gene particulares. É contemplado que qualquer sondausada na presente invenção será marcada com qualquer "molécula repór-ter", de forma que seja detectável em qualquer sistema de detecção, inclu-indo, mas não limitados a enzima (por exemplo, ELISA, como também en-saios histoquímicos com base em enzima), sistemas fluorescentes, radioati-vos, e luminescentes. Não é intencionado que a presente invenção seja limi-tada a qualquer sistema de detecção ou marcação particular.

Como aqui usado, o termo "alvo", quando usado em referênciaaos métodos de amplificação (por exemplo, a reação em cadeia de polime-rase), refere-se à região ligada de ácido nucléico pelos iniciadores usadospara reação em cadeia de polimerase. Desse modo, o "alvo" é buscado serclassificado de outras seqüências de ácido nucléico. Um "segmento" é defi-nido como uma região de ácido nucléico dentro da seqüência-alvo.

Como aqui usado, o termo "reação em cadeia de polimerase"("PCR") refere-se aos métodos das patentes U. S. Nos. 4.683.195,4.683.202, e 4.965.188, incorporados por este meio por referência incluindométodos para aumentar a concentração de um segmento de uma seqüên-cia-alvo em uma mistura de DNA genômico sem clonagem ou purificação.Este processo para amplificar a seqüência-alvo consiste em introduzir umexcesso grande de dois iniciadores de oligonucleotídeo à mistura de DNAcontendo a seqüência-alvo desejada, seguido por uma seqüência precisa deciclismo térmico na presença de uma DNA polimerase. Os dois iniciadoressão complementares a seus respectivos filamentos da seqüência-alvo bifi-lamentar. Para realizar amplificação, a mistura é desnaturada e os iniciado-res depois anelados em suas seqüências complementares dentro da molé-cula-alvo. Seguindo anelamento, os iniciadores são estendidos com umapolimerase para formar um par novo de filamentos complementares. As eta-pas de desnaturação, anelamento de iniciador e extensão de polimerase podem ser repetidas muitas vezes (isto é, desnaturação, artelamento e ex-tensão constituem um "ciclo"; pode haver numerosos "ciclos") para obteruma concentração alta de um segmento amplificado da seqüência-alvo de-sejada. O comprimento do segmento amplificado da seqüência-alvo deseja-da é determinado pelas posições relativas dos iniciadores com respeito umao outro, e portanto, este comprimento é um parâmetro controlável. Em vir-tude do aspecto de repetição do processo, o método é referido como a "rea-ção em cadeia de polimerase" (doravante "PCR"). Porque os segmentosamplificados desejados da seqüência-alvo se tornam as seqüências predo-minantes (em termos de concentração) na mistura, eles são ditos ser "ampli-ficados por PCR".

Como aqui usado, o termo "reagentes de amplificação" refere-seàqueles reagentes (trifosfatos de desoxirribonucleotídeo, tampão etc.), ne-cessários para amplificação com exceção de iniciadores, modelo de ácidonucléico e a enzima de amplificação. Tipicamente, reagentes de amplifica-ção são colocados juntamente com outros componentes de reação e conti-dos em um vaso de reação (tubo de teste, micropoço etc.).

Com PCR, é possível amplificar uma cópia simples de uma se-qüência-alvo específica em DNA genômico para um nível detectável atravésde várias metodologias diferentes (por exemplo, hibridação com uma sondamarcada; incorporação de iniciadores biotinilados seguido por detecção deavidina-enzima conjugada; incorporação de trifosfatos de deoxinucleotídeomarcado com 32P, tal como dCTP ou dATP, no segmento amplificado). Alémdo DNA genômico, qualquer seqüência de oligonucleotídeo ou de polinucle-otídeo pode ser amplificada com o conjunto apropriado de moléculas de ini-ciador. Em particular, os segmentos amplificados criados pelo próprio pro>cesso de PCR são, em si, modelos eficientes para amplificações de PCRsubseqüentes.

Como aqui usado, os termos "produto de PCR", "fragmento dePCR", e "produto de amplificação" referem-se à mistura resultante dos com-postos após dois ou mais ciclos das etapas de PCR de desnaturação, ane-Iamento e extensão serem concluídos. Estes termos abrangem o caso ondehouve amplificação de um ou mais segmentos de uma ou mais seqüências-alvo.

Como aqui usado, os termos "endonucleases de restrição" e"enzimas de restrição" referem-se às enzimas bacterianas, cada uma destascorta o DNA bifilamentar em ou próxima de uma seqüência de nucleotídeoespecífica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições compre-endendo pelo menos uma enzima de metaloprotease neutra que tem estabi-lidade sob armazenamento melhorada. Em algumas modalidades, a metalo-protease neutra encontra uso em limpeza e outras aplicações. Em algumasmodalidades particularmente preferidas, a presente invenção fornece méto-dos e composições compreendendo metaloprotease(s) neutra(s) obtida(s)de Bacillus sp. Em algumas modalidades mais particularmente preferidas, ametaloprotease neutra é obtida de B. amyloliquefaciens. Em ainda outrasmodalidades preferidas, a metaloprotease neutra é uma variante da metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens. Em ainda modalidades adicionais,a metaloprotease neutra é um homólogo da metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens. A presente invenção encontra uso particular em aplica-ções incluindo, mas não limitadas a limpeza, alvejamento e desinfecção.

Também como descrito em mais detalhe nos Exemplos abaixo,a presente invenção provê muitas vantagens para limpeza de uma gamaextensiva de objetos, incluindo mas não limitados a roupa, tecidos, dispositi-vos médicos etc. Além disso, a presente invenção fornece composições quesão eficazes em limpeza, alvejamento, e desinfecção, em uma faixa de tem-peraturas de lavagem e pHs.

Em geral, proteases hidrolisam ligações de amida de proteínaspor meio de adição de uma molécula de água à(s) ligação(ões) de peptídeo.Clivagem ocorre no grupo carbonila da ligação de peptídeo. Em espéciesbacterianas tais como Bacillus, há duas classes principais de proteases ex-tracelulares a saber, serina proteases alcalinas e metaloproteases neutras.

Metaloendopeptidases neutras (isto é, metaloproteases neutras)(EC 3.4.24.4) pertencem -ãuma classe de protease que teni um requerimen-to absoluto para íons de zinco para atividade catalítica. Estas enzimas sãootimamente ativas em pH neutro e estão na faixa de tamanho de 30 a 40kDa. Metaloproteases neutras ligam entre dois e quatro íons de cálcio quecontribuem para a estabilidade estrutural da proteína. O íon de metal ligadono sítio ativo das metaloproteases é uma característica essencial que permi-te a ativação de uma molécula de água. A molécula de água depois funcio-na como o nucleófilo e cliva o grupo carbonila da ligação de peptídeo.A família de metaloprotease de ligação de zinco neutra inclui atermolisina de enzima bacteriano, e proteases semelhantes à termolisina("TLPs"), como também carboxipeptidase A (uma enzima digestiva), e asmetaloproteases de matriz catalisando as reações em remodelagem e de-gradação de tecido. A única bem caracterizada destas proteases, com res-peito à estabilidade e função, são termolisina e suas variantes (TLPs). Defato, muita pesquisa foi focalizada na engenharia de ,proteases neutras deBacillus subtilis para aumentar a estabilidade térmica da enzima (Vide porexemplo, Vriend et al., Em, Tweel et al. (eds), Stability and Stabilization ofenzymes, Elsevier, pp. 93-99 [1993]).

A maioria dos esforços vem sendo focalizada em aumentar aestabilidade da protease alterando os determinantes estruturais identificadosatravés do uso de modelagem molecular sugerido impedir os processos dedesdobramento local que resultariam em autólise da proteína e fariam a pro-tease neutra desnaturar em temperaturas altas (Vide por exemplo, van denBurg et al., em Hopsu-Havu et al., (eds), Proteolysis in Cell Functions Mani-pulating the Autolytic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical and HealthResearch Vol. 13, IOS Press [1997] p. 576).

As composições e métodos são fornecidos para criar metalopro-teases neutras com características melhoradas aqui. Como indicado aqui, osíons de cálcio foram relatados para outras proteases, tais como termolisina,para impedir autólise. A protease neutra de B. stearothermophilus foi estabi-lizada contra autólise e degradação proteolítica mediante adição de cálcio(Vide, Dürrschmidt et al., FEBS J. 272:1523-1534 [2005]).

De fato;/ a. presente invençãó provê composições e métodos a-dequados para a engenharia de metaloproteases neutras que são indepen-dentes de cálcio para manter sua estabilidade estrutural. Em algumas moda-lidades, criação impede o desdobramento local em um elemento estruturalsecundário particular que pode impedir proteólise.

Proteases naturais e criadas, tais como subtilisina, são freqüen-temente expressas em Bacillus subtilis e várias formulações de detergenteforam aplicadas em remover manchas proteináceas. Outras foram aplicadaspor exemplo na indústria de cozimento (por exemplo, termolisina de Bacillusthermoproteolyticus; Vide por exemplo, Galante e Formantici, Curr. OrganicChem., 7, 1399-1422 [2003]). Em geral, as serina proteases foram utilizadasmais amplamente em detergentes, pelo menos parcialmente devido à facili-dade relativa com que estas proteases podem ser estabilizadas.

De fato, metaloproteases são freqüentemente usadas em indús-tria, e particularmente na indústria de detergente por várias razões. Estasenzimas envolvem sistemas de proteína mais complexos, uma vez que asenzimas têm o requerimento absoluto por íons de cálcio e de zinco para es-tabilidade e função, respectivamente. Também, a solução de detergentecomo também a água usada no processo de lavagem de roupa freqüente-mente contêm componentes que freqüentemente interferem com a ligaçãodos íons pela enzima ou realizam quelação destes íons, resultando em umadiminuição ou perda de função proteolítica e desestabilização da protease.

Em contraste com os sistemas de enzima de metaloproteasecorrentemente usados, a presente invenção fornece metaloproteases neu-tras que são suficientemente estabilizadas para facilitar o armazenamentode prateleira a longo prazo em composições de detergente de lavagem deroupa líquidas. Em modalidades particularmente preferidas, a estabilidade eatividade da metaloprotease são preservadas complexando a enzima comsua molécula de zinco de sítio ativo obrigatória. Importantemente, a combi-nação de íons de cálcio e zinco não tem um efeito deletério na função daenzima. Em algumas modalidades, a metaloprotease neutra estabilizada é ametaloprotease do tipo selvagem de Bacillus amyloliquefaciens (por exem-pb, MULTIFECT® Neütral purificado; "PMN"). Em modalidades preferidasalternativas, a metaloprotease neutra recombinante (por exemplo, metalo-protease neutra de Bacillus amyloliquefaciens clonada em Bacillus subtilis("nprE")). Em modalidades adicionais, metaloproteases com estabilidadejpelhorada abrangem enzimas com afinidade aumentada por um ou maisdos sítios de ligação de cálcio da enzima. Em modalidades preferidas, asmetaloproteases neutras da presente invenção encontram uso em aplica-ções de detergente gerais, incluindo mas não limitadas às temperaturas deágua fria, manchas de grama e/ou condições de pH baixo.

A presente invenção fornece condições que estabilizam metalo-protease neutra de ligação de zinco para estabilidade sob armazenamentoaumentada em material base e/ou composições de detergente. Em modali-dades preferidas, as composições de detergente compreendem pelo menosuma metaloprotease (por exemplo, qualquer metaloprotease neutra de Baeil-lus) que é estabilizada contra autólise e desdobramento, pela inclusão den-tro da formulação de detergente dos íons de zinco e/ou cálcio essencial. Emalgumas modalidades particularmente preferidas, a metaloprotease neutrade Bacillus amyloliquefaciens (PMN) e a forma recombinante expressa emBacillus subtilis (nprE) que liga íon de zinco com afinidade 10 vezes maisalta que o íon de cálcio encontra uso na presente invenção. A protease es-tabilizada na presença de íons de zinco essenciais tem estabilidade melho-rada contra proteólise quando comparada às mesmas proteases na ausên-cia de íons.

Embora alguns resultados experimentais indicaram que nprEperde alguma atividade proteolítica (~ 20%) após uma hora de adição domaterial base de detergente, nprE incubado a 32eC na presença de íons dezinco mostrou estabilização significativa nas condições de teste sem sais ouíons de cálcio adicionais. A presença de íons de cálcio e zinco não mostrouum efeito aditivo. As concentrações de íon de zinco inferior a 15 mM de me-taloprotease neutra são suficientemente estáveis durante cerca de 4 sema-nas. Desse modo, a presente invenção fornece composições compreenden-do a adição de zinco para aumentar a vida de armazenamento de metalo-protease neutra na presença de coníponentes d£ detergente.

Além disso, em modalidades alternativas, o cátion de zinco ésubstituído com Co2+, Mn2+ ou Fe2+, uma vez que todos destes íons forammostrados ligar e restabelecer a atividade de protease das metaloproteasesneutras. Porém, determinou-se que Mn2+ e Fe2+ não restabelecem toda aatividade nativa. Embora Co2+ restabeleça a porcentagem mais alta da ativi-dade, ele é aparentemente menos firmemente ligado a Zn2+. O cátion dezinco é uma característica essencial no sítio ativo de todas as metaloprotea-ses neutras, como é conhecido representar um papel em ligação de substra-to e catálise de enzima (Vide por exemplo, Holmquist e Vallee, J. Biol.Chem., 249:4601-4607 [1974]). A afinidade relativamente apertada da meta-Ioprotease neutra para o cátion de zinco (faixa de ~ μΜ) e a afinidade decerca de 10 vezes mais alta para este íon com relação a cálcio, sugeremque o zinco funcione como um estabilizante, assim impedindo autólise, pro-teólise e desdobramento. Porém, não é intencionado que a presente inven-ção seja limitada a qualquer mecanismo particular.

A presente invenção provê oportunidades extremamente benéfi-cas para aplicação na produção e desenvolvimento de detergentes industri-ais. Muitos detergentes estão disponíveis com especificidade alta para aremoção de manchas de proteína, amido e de gordura. Em particular, o de-sempenho de lavagem melhor de PMN ou metaloprotease neutra de B. am-yloliquefaciens em Equest Grass (Warwick) indica que as metaloproteasesneutras da presente invenção em um material base de detergente, que tam-bém contém zinco, encontram uso nas composições de detergente melho-radas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMULAÇÕES,DE LIMPEZA E DETER-GENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

A menos que do contrário observado, todos os níveis de com-ponente ou de composição fornecidos aqui são feitos em referência ao nívelativo daquele componente ou composição, e são exclusivos de impurezas,por exemplo, solventes residuais ou subprodutos que podem estar presen-tes nas fontes comercialmente disponíveis.

Pesos de componentes de enzima são com base em proteínaativa total.

Todas as porcentagens e razões são calculadas em peso a me-nos que do contrário indicado. Todas as porcentagens e razões são calcula-das com base na composição total a menos que do contrário indicado.

Nas composições de detergente exemplificadas, os níveis deenzimas são expressos por enzima pura em peso da composição total e amenos que do contrário especificado, os componentes de detergente sãoexpressos em peso das composições totais.

COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA COMPREENDENDO METALOPROTEASENEUTRA

As metaloproteases neutras estabilizadas da presente invençãosão úteis em formular várias composições de detergente. A composição delimpeza da presente invenção pode ser vantajosamente empregada por e-xemplo, em aplicações de lavagem de roupa, limpeza de superfície dura,aplicações de lavagem de pratos automáticas, como também aplicaçõescosméticas tais como dentaduras, dentes, cabelo e pele. Porém, devido àsvantagens únicas de eficácia aumentada nas soluções de temperatura maisbaixas e o perfil de segurança de cor superior, as enzimas da presente in-venção são idealmente adequadas para aplicações de lavagem de roupatais como alvejamento de tecidos. Além disso, as enzimas da presente in-venção encontram uso em composições granulares e líquidas.

As enzimas da presente invenção também encontram uso emprodutos aditivos de limpeza. Um produto aditivo de limpeza incluindo pelomenos uma enzima da presente invenção é idealmente adequado para in-clusão em um processo de lavargem quando eficácia e alvejamento adicio-nais forem desejados. Tais circunstâncias incluem, mas não são limitadasàs aplicações de limpeza de solução de temperatura baixa. O produto aditi-vo pode ser, em sua forma mais simples, uma ou mais enzima de metalo-protease neutra como fornecida pela presente invenção. Em algumas moda-lidades, o aditivo é empacotado em forma de dosagem para adição a umprocesso de limpeza onde uma fonte de peroxigênio for empregada e eficá-cia de alvejamento aumentada for desejado. Em algumas modalidades, aforma de dosagem simples compreende uma pílula, comprimido, cápsulaem gel ou outra unidade de dosagem simples incluindo líquidos pós e/oupré-medidos. Em algumas modalidades, material(is) enchedor e/ou veículoé/são incluído(s) para aumentar o volume de tal composição. Materiais en-chedor ou veículo adequados incluem, mas não são limitados a, vários saisde sulfato, carbonato e silicato como também talco, argila e outros. Em al-gumas modalidades, materiais enchedor e/ou de veículo para composiçõeslíquidas incluem água e/ou alcoóis primários e secundários de peso molecu-lar baixo incluindo polióis e dióis. Exemplos de tais alcoóis incluem, mas nãosão limitados a, metanol, etanol, propanol e isopropanol. Em algumas moda-lidades, as composições compreendem de cerca de 5% a cerca de 90% detais materiais. Em modalidades adicionais, enchedores acídicos são usadospara reduzir o pH da composição. Em algumas modalidades alternativas, oaditivo de limpeza inclui pelo menos uma fonte de peroxigênio ativada comodescritos abaixo e/ou componentes adjuntos como completamente descritasabaixo.

As composições de limpeza e aditivos de limpeza da presenteinvenção requerem uma quantidade eficaz de enzima de metaloproteaseneutra como fornecida na presente invenção. Em algumas modalidades, onível requerido de enzima é alcançado pela adição de uma ou mais espé-cies de metaloprotease neutra fornecidas pela presente invenção. Tipica-mente, as composições de limpeza da presente invenção compreendempelo menos 0,0001 por cento em peso, de cerca de 0,0001 a cerca de 1, decerca de 0,001 a cerca de 0,5, ou até mesmo de cerca de 0,01 a cerca de0,1 por cento em peso de pelo menos uma metaloprotease neutra fornecidapela presente invenção.

Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpe-za fornecidas aqui são tipicamente formuladas de modo que, durante o usoem operações de limpeza aquosa, a água de lavagem tenha um pH de cer-ca de 5,0 a cerca de 11,5, ou em modalidades alternativas, até mesmo decerca de 6,0 a cerca de 10,5. Em algumas modalidades preferidas, as for-mulações de produto líquidas são tipicamente formuladas para4er um pHpuro de cerca de 3,0 a cerca de 9,0, enquanto em algumas modalidadesalternativas a formulação tem um pH puro de cerca de 3 a cerca de 5. Emalgumas modalidades preferidas, os produtos de lavagem de roupa granula-res são tipicamente formulados para ter um pH de cerca de 8 a cerca de 11.Técnicas para controlar os níveis de pH de uso recomendados incluem ouso de tampões, álcalis, ácidos, etc., e são bem-conhecidos àqueles versa-dos na técnica.Em algumas modalidades particularmente preferidas, quandopelo menos uma metaloprotease neutra for empregada em uma composiçãogranular ou líquida, a metaloprotease neutra é na forma de uma partículaencapsulada para proteger a enzima de outros componentes da composiçãogranular durante o armazenamento. Além disso, encapsulação também for-nece um meio de controlar a disponibilidade da(s) metaloprotease(s) neu-tra(s) durante o processo de limpeza e pode intensificar o desempenhoda(s) metaloprotease(s) neutra(s). É contemplado que as metaloproteasesneutras encapsuladas da presente invenção encontrarão uso em vários ce-nários. É também intencionado que a metaloprotease neutra seja encapsu-lada usando qualquer/quaisquer material(is) de encapsulação adequado(s) emétodo(s) conhecido(s) na técnica.

Em algumas modalidades preferidas, o material de encapsula-ção tipicamente encapsula pelo menos parte do catalisador de metaloprote-ase neutra. Em algumas modalidades, o material de encapsulação é solúvelem água e/ou dispersável em água. Em algumas modalidades adicionais, omaterial de encapsulação tem uma temperatura de transição vítrea (Tg) de0-C ou mais alta (Vide por exemplo, WO 97/11151, particularmente de pági-na 6, linha 25 à página 7, linha 2, para mais informação com relação àstemperaturas de transição vítrea).

Em algumas modalidades, o material de encapsulação é sele-cionado do grupo que consiste em carboidratos, gomas naturais ou sintéti-cas, quitina e quitosana, celulose e derivados de celulose, silicatos, fosfato,borato, álcool polivinílico, polietileno glicol, ceras de parafina e combinaçõesdos mesmos. Em algumas modalidades em qire o materiai.de encapsulaçãoé um carboidrato, é selecionado do grupo que consiste em monossacarí-deos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e combinações dos mesmos. Emalgumas modalidades preferidas, o material de encapsulação é um amido(Vide por exemplo, EP 0 922 499; US 4.977.252. US 5.354.559, e US5.935.826, para descrições de alguns amidos adequados exemplares).

Em modalidades adicionais, o material de encapsulação com-preende uma microesfera feita de plástico (e.g., termoplásticos, acrilonitrila,metacrilonitrila, poliacrilonitrila, polimetacrilonitrila e misturas dos mesmos;microesferas comercialmente disponíveis que encontram uso incluem, masnão são limitadas a, EXPANCEL® [Casco Products, Estocolmo, Suécia], PM6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, e Q-CEL® [PQCorp., Valley Forge, PA], LUXSIL® e SPHERICELI® [Potters Industries, Inc.,Carlstadt, NJ e Valjey Forge, PA]).

PROCESSOS DE FABRICAÇÃO E USO DA COMPOSIÇÃO DE LIMPEZADOS REQUERENTES

Em algumas modalidades preferidas, as composições de limpe-za da presente invenção são formuladas em qualquer forma adequada epreparadas por qualquer processo selecionado pelo formulador, (Vide porexemplo, U. S. 5.879.584, U. S. 5.691.297, U. S. 5.574.005, U. S. 5.569.645,U. S. 5.565.422, U. S. 5.516.448, U. S. 5.489.392, e U. S. 5.486.303, paraalguns exemplos não-limitativos). Em algumas modalidades em que umacomposição de limpeza de pH baixo for desejado, o pH de tal composição éajustado por meio da adição de um material acídico tal como HCI.

MATERIAIS ADJUNTOS

Embora não essencial para o propósito da presente invenção,em algumas modalidades, a lista não-limitativa de adjuntos descritos aqui éadequada para o uso nas composições de limpeza da presente invenção.De fato, em algumas modalidades, adjuntos são incorporados nas composi-ções de limpeza da presente invenção. Em algumas modalidades, materiaisadjuntos auxiliam e/ou intensificam o desempenho de limpeza, tratam osubstrato a ser limpo, e/ou modificam a estética da composição de limpeza(por exemplo, perfumes, corantes, tinturas, etc.). É entendido que tais adjun-tos estão além das metaloproteases neutras da presente invenção. A natu-reza precisa destes componentes adicionais, e níveis de incorporação dosmesmos, depende da forma física da composição e da natureza da opera-ção de limpeza para a qual será usada. Materiais adjuntos adequados inclu-em, mas não são limitados a, tensoativos, builders, agentes quelantes, a-gentes inibidores de transferência de tintura, auxiliares de deposição, dis-persantes, enzimas adicionais, e estabilizantes de enzima, materiais catalíti-cos, ativadores de alvejamento, intensificadores de alvejamento, peróxido dehidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agen-tes dispersantes poliméricos, agentes de remoção de sujeira/anti-redeposição de argila, abrilhantadores, supressores de espumas, tinturas, perfumes, agentes elasticizantes de estrutura, amaciantes de tecido, veícu-los, hidrótropos, auxiliares de processamento e/ou pigmentos. Além daque-les explicitamente fornecidos aqui, exemplos adicionais são conhecidos natécnica (Vide por exemplo, Patentes U. S. NsS 5.576.282, 6.306.812 B1 e6.326.348 B1). Em algumas modalidades, os componentes adjuntos acimamencionados constituem o equilíbrio das composições de limpeza da pre-sente invenção.

TENSOATIVOS - Em algumas modalidades, as composições delimpeza da presente invenção compreendem pelo menos um tensoativo ousistema de tensoativo, em que o tensoativo é selecionado de tensoativosnão-iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfo-líticos, tensoativos zuiteriônicos, tensoativos não-iônicos semipolares, e mis-turas dos mesmos. Em algumas modalidades de composição de limpeza depH baixo (por exemplo, composições tendo, um pH líquido de cerca de 3 acerca de 5), a composição tipicamente não contém nenhum sulfato etoxiladode alquila, como é acreditado que tal tensoativo possa ser hidrolisado portais composições com os teores acídicos.

Em algumas modalidades, o tensoativo está presente a um nívelde cerca de 0,1% a cerca de 60%, enquanto em modalidades alternativas, onível é de cerca de 1% a cerca de 50%, enquanto em ainda outras modali-dades, o nível é de ce/ca de 5% a cerca dê 40%, em peso da composiçãode limpeza.

BUILDERS - Em algumas modalidades, as composições de lim-peza da presente invenção compreendem um ou mais builders de detergen-te ou sistemas de builder. Em algumas modalidades que incorporam pelomenos um builder, as composições de limpeza compreendem pelo menoscerca de 1%, de cerca de 3% a cerca de 60% ou até mesmo de cerca de5% a cerca de 40% em peso de builder da composição de limpeza.Builders incluem, mas não são limitados, aos sais de metal alca-Iino1 de amônio e de alcanolamônio de polifosfatos, silicatos de metal alcali-no, carbonato de metal alcalino e alcalino-terroso, builders de aluminossilica-to compostos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímerosde anidrido maléico com éter de metila de etileno ou de vinila, ácido 1,3,5-triidróxi benzeno-2,4,6-trissulfônico, e ácido carboximetiloxissuccínico, osvários sais de metal alcalino, de amônio e de amônio.substituídos de ácidospoliacéticos tais como ácido etilenodiamino tetraacético e ácido nitrilotriacé-tico, como também policarboxilatos tais como ácido melítico, ácido succíni-co, ácido cítrico, ácido oxidissuccínico, ácido polimaléico, ácido benzeno1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxissuccínico, e sais solúveis dosmesmos. De fato, é contemplado que qualquer builder adequado encontraráuso em várias modalidades da presente invenção.

AGENTES QUELANTES - Em algumas modalidades, as com-posições de limpeza da presente invenção contêm pelo menos um agentequelante. Agentes quelantes adequados incluem, mas não são limitados a,agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês e misturas dos mesmos.Em modalidades em que pelo menos um. agente quelante é usado, as com-posições de limpeza da presente invenção compreendem de cerca de 0,1%a cerca de 15% ou até mesmo de cerca de 3,0% a cerca de 10% em pesode agente quelante da composição de limpeza em questão.

AUXILIAR DE DEPOSIÇÃO - Em algumas modalidades, ascomposições de limpeza da presente invenção incluem pelo menos umaajuda de deposição. Auxiliares de deposição adequados incluem, mas nãosão limitados a, polietileno-glicol, polipropileno glicol, policarboxilato, políme-ros de liberação de sujeira tais como ácido politeleftálico, argila tal como ca-olinita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita, e misturas dasmesmas.

AGENTES INBIDORES DE TRANSFERÊNCIA DE TINTURA -Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente inven-ção incluem um ou mais agentes inibidores de transferência de tintura. A-gentes inibidores de transferência de tintura polimérica adequados incluem,mas não são limitados a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poli-viniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou misturas dos mesmos.

Em modalidades em que pelo menos um agente de inibição detransferência de tintura é usado, as composições de limpeza da presenteinvenção compreendem de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de0,01% a cerca de 5%, ou até mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% empeso da composição de limpeza.

DISPERSANTES - Em algumas modalidades, as composiçõesde limpeza da presente invenção contêm pelo menos um dispersante. Mate-riais orgânicos solúveis em água adequados incluem, mas não são limitadosa ácidos homo- ou co-poliméricos ou seus sais em que o ácido policarboxíli-co compreende pelo menos dois radicais de carboxila separados um do ou-tro por não mais de dois átomos de carbono.

ENZIMAS - Em algumas modalidades, as composições de lim-peza da presente invenção compreendem uma ou mais enzimas de deter-gente que fornecem desempenho de limpeza e/ou benefícios de cuidado detecido. ,Exemplos de enzimas adequadas incluem, mas não são limitados a,hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfoli-pases, esterases, cutinases, pectinases, ceratinases, reductases, oxidases,fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosana-ses, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase,lacase, e amilases, ou misturas das mesmas. Em algumas modalidades,uma combinação das enzimas é usada (isto é, um "coquetel") compreen-dendo enzimas aplicáveis convencionais como proteaáe, lipase, oytinasee/ou celulase junto com amilase é usada.

ESTABILIZANTES DE ENZIMA - Em algumas modalidades dapresente invenção, as enzimas usadas nas formulações de detergente dapresente invenção são estabilizadas. É contemplado que várias técnicaspara estabilização da enzima encontrarão uso na presente invenção. Porexemplo, em algumas modalidades, as enzimas aqui empregadas são esta-bilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II),cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que fornecem taisíons às enzimas, também. Outros íons de metal (por exemplo, bário (II), es-cândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), estanho (II), cobalto (II),cobre (II), Níquel (II), e oxovanádio (IV)).

COMPLEXOS DE METAL CATALÍTICO - Em algumas modali-dades, as composições de limpeza da presente invenção contêm um oumais complexos de metal catalítico. Em algumas modalidades, um catalisa-dor alvejante contendo metal encontra uso. Em algumas modalidades prefe-ridas, o catalisador alvejante de metal compreende um sistema de catalisa-dor compreendendo um cátion de metal de transição de atividade catalíticaalvejante definida, (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio,tungstênio, molibdênio, ou manganês), um cátion de metal auxiliar tendopouca ou nenhuma atividade catalítica alvejante (por exemplo, cátions dezinco ou de alumínio), e um seqüestre tendo constantes de estabilidade de-finidas para os cátions de metal catalítico e auxiliares, particularmente ácidoetilenodiaminotetraacético, ácido etilenodiaminotetra (metilenofosfônico) esais solúveis em água dos mesmos são usados (Vide por exemplo, U. S.4.430.243).

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da pre-sente invenção são catalisadas por meio de um composto de manganês.Tais compostos e níveis de uso são bem-conhecidos na técnica (Vide porexemplo, U. S. 5.576.282).

Em modalidades adicionais, catalisadores alvejantes de cobaltoencontram uso nas composições de limpeza da presente invenção. Várioscatalisadores alvejantes de cobalto são conhecidos .,na técnica (Vide pore-xemplo, U. S. 5.597.936, e U. S. 5.595.967). Tais catalisadores de cobaltosão facilmente preparados através de procedimentos conhecidos (Vide porexemplo, U. S. 5.597.936, e U. S. 5.595.967).

Em modalidades adicionais, as composições de limpeza da pre-sente invenção incluem um metal de transição complexo de um ligando ma-cropolicíclico rígido ("MRL"). Como de costume, e não por via de limitação,em algumas modalidades, as composições e processos de limpeza forneci-dos pela presente invenção são ajustados para fornecer na ordem de pelomenos uma parte por cem milhões das espécies de MRL ativas no meio delavagem aquoso, e em algumas modalidades preferidas, fornecer de cercade 0,005 ppm a cerca de 25 ppm, mais preferivelmente de cerca de 0,05ppm a cerca de 10 ppm, e mais preferivelmente de cerca de 0,1 ppm a cer-ca de 5 ppm, do MRL no licor de lavagem.

Metais de transição preferidos no catalisador de alvejamento demetal de transição incluem, mas não são limitados a manganês, ferro ecromo. MRLs preferidos também incluem, mas não são limitados a Iigandosultra-rígidos especiais que são reticulados (por exemplo, 5,12-dietil-1,5,8,12-tetraazabiciclo[6.6.2]hexadecano). MRLs de metal de transição adequadossão facilmente preparados através de procedimentos conhecidos (Vide porexemplo, WO 00/32601, e U. S. 6.225.464).

PROCESSOS DE FAZER E USAR AS COMPOSIÇÕES DE LIMPEZA

As composições de limpeza da presente invenção são formula-das em qualquer forma adequada e preparadas por qualquer processo ade-quado selecionado pelo formulador, (Vide por exemplo, U. S. 5.879.584, U.S. 5.691.297, U. S. 5.574.005, U. S. 5.569.645, U.S. 5.565.422, U. S.5.516.448, U. S. 5.489.392, U. S. 5.486.303, U. S. 4.515.705, U. S.4.537.706, U. S. 4.515.707, U. S. 4.550.862, U. S. 4.561.998, U. S.4.597.898, U. S. 4.968.451, U. S. 5.565.145, U. S. 5.929.022, U. S.6.294.514, e U. S. 6.376.445 todas estas são incorporadas aqui por referên-cia para alguns exemplos não-limitativos).

MÉTODO DE USO

Em modalidades preteridas, as composições de limpeza da pre-sente invenção encontram uso em limpar superfícies e/ou tecidos. Em al-gumas modalidades, pelo menos uma porção da superfície e/ou tecido écontatada com pelo menos uma modalidade das composições de limpezada presente invenção, em forma pura ou diluída em um licor de lavagem, edepois a superfície e/ou tecido é/são opcionalmente lavado(s) e/ou enxa-güado(s). Para propósitos da presente invenção, "lavagem" inclui, mas nãoé limitada a, esfrega, e agitação mecânica. Em algumas modalidades, o te-cido compreende qualquer tecido capaz de ser lavado em condições de usode consumidor normais. Em modalidades preferidas, as composições delimpeza da presente invenção são usadas em concentrações de cerca de500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. Em algumas modalidades emque o solvente de lavagem é água, a temperatura da água tipicamente variade cerca de 5eC a cerca de 909C. Em algumas modalidades preferidas paralimpar tecido, a razão dê água para massa de tecido é tipicamente de cercade 1:1 a cerca de 30:1.

EXEMPLO EXPERIMENTAL

Os exemplos a seguir são providos para demonstrar e tambémilustrar certas modalidades preferidas e aspectos da presente invenção enão são para ser interpretados como limitando o escopo da mesma.

Na descrição experimental que segue, as abreviações a seguirse aplicam: 9C (graus Centígrados); rpm (revoluções por minuto); H2O (á-gua); HCI (ácido clorídrico); aa e AA (aminoácido); bp (par de base); kb (parde quilobase); kD (quilodaltons); gm (gramas); pg e ug (microgramas); mg(miligramas); ng (nanogramas); μΙ e ul (microlitros); ml (mililitros); mm (milí-metros); nm (nanômetros); pm e um,.(micrômetro); M (molar); mM (millimo-lar); μΜ e uM (micromolar); U (unidades); V (volts); PM (peso molecular);seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); h(s) (hora/horas); MgCI2 (cloretode magnésio); NaCI (cloreto de sódio); OD28O (densidade óptica a 280 nm);OD405 (densidade óptica a 405 nm); OD6oo (densidade óptica a 600 nm);PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida); EtOH (etanol); PBS (soluçãosalina tamponada de fosfato [150 mM de NaCI, 10 mM de tampão de fosfatode sódio, pH 7,2]); LAS (lauril sulfonato de sódio); SDS (dodecil sulfato desódio); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); TAED (Ν,Ν,Ν'Ν'-tetraacetiletilenodiamina); BES (poliestersulfona); MES (ácido 2-morfolinoetanossulfônico, monoidrato; f.w. 195,24; Sigma N- M-3671); CaCI2(cloreto de cálcio, anidro; f.w. 110,99; Sigma Ne C-4901); DMF (N,N-dimetilformamida, f.w. 73,09, d = 0,95); Abz-AGLA-Nba (2-Aminobenzoil-L-alanilglicil-L-leucil-L-alanino-4-nitrobenzilamida, f.w. 583,65; Bachem Ne H-6675, catálogo VWR N2 100040-598); SBG1% ("Super Broth With Glycose";6 g Soytone [Difco], 3 g extrato de levedura, 6 g NaCI, 6 g glicose); o pH foiajustado em 7,1 com NaOH antes de esterilização usando métodos conhe-cidos na técnica; p/v (peso por volume); v/v (volume por volume); Npr e npr(metaloprotease neutra); SEQUEST® (programa de pesquisa de base dedados SEQUEST, Universidade de Washington); Npr e npr (gene de meta-loprotease neutra); nprE e NprE (metaloprotease neutra de B. amyloliquefa-ciens)·, PMN (metaloprotease purificada de MULTIFECT®); MS (espectros-copia de massa); SRI (índice de Remoção de Mancha); TIGR (The Instituteof Genomic Research, Rockville, MD); Amersham (Amersham Life Science,Inc. Arlington Heights, IL); Corning (Corning International, Corning, NY); ICN(ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology,Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc., Flintshire,UK); EMPA (Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt, St.Gallen, Suíça); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, Países Baixos);Amicon (Amicon, Inc., Beverly1 MA); ATCC (American Type Culture Collec-tion, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, LincolnPark1 NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer1 Wellesley1 MA); Rainin (Rainin In-strument, LLC1 VVoburn1 MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg1 Ale-manha); Waters (Waters, Inc., Milford, MA); Geneart (Geneart GmbH, Re-gensburg, Alemanha); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems1 Ram-sey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes1 Eugene1 OR); BioRad (Bio-Rad1 Richmond1 CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA);Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis1 MN); Difco (Difco Laboratories, Detroit, Ml);GIBCO BRL or Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg1 MD); NewBrunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoe-Iectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech1 GmbH,Offenburg, Alemanha); Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Áustria);Novagen (Novagen, Inc., Madison, Wl); Novex (Novex1 San Diego1 CA);Finnzymes (Finnzymes OY, Finlândia) Qiagen (Qiagen, Inc., Valência, CA);Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St.Louis1 MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medicai Instrumen-tation ou GMI (Global Medicai lnstrumentation; Ramsey1 MN); MJ Research(MJ Research, Waltham, MA); Infors (lnfors AG, Bottmingen, Suíça);Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla1 CA); Roche (HoffmannLa Roche1 Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); S-Matrix (S-Matrix Corp., Eureka, CA); US Testing (United States Testing Co.,Hoboken, NY); West Coast Analytical Services (West Coast Analytical Ser-vices, Inc., Santa Fe Springs, CA); Ion Beam Analysis Laboratory (lon BeanAnalysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford,UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG,Bubendorf, Suíça); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale,CA); Corning (Corning International, Corning, NY); MicroCaI (Microcal, Inc.,Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp.,Montreal, Canadá); NCBI (National Center for Biotechnology Information);Argo Bioanalytica (Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey); Vydac (Grace Vydac,Hesperia, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); e Zeiss (Carl Zeiss,Inc., Thomwood, NY).

Nestes experimentos, um espectrofotômetro foi usado para me-dir a absorbância dos produtos formados após a conclusão das reações. Umrefletômetro foi usado para medir a refletância das amostras de tecido. Amenos que do contrário indicado, concentrações de proteína foram estima-das por Coomassie Plus (Pierce), usando BSA como o padrão.

Os ensaios a seguir foram usados nos Exemplos descritos abai-xo.

A. ENSAIO DE BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE TEOR DE PRO-TEÍNA EM PLACAS DE MICROTITULACÃO DE 96 CAVIDADES (MTPs)

Nestes ensaios, o ensaio de reagerHe de tintura de Bradford(Quick Start) foi usado para determinar a concentração de proteína em a-mostras de NprE protease em escala de MTP.

Neste sistema de ensaio, as soluções químicas e de reagenteusadas foram:

Reagente de Tintura de Bradford Quick Star BIO-RAD, N 500-0205Tampão de diluição 10 mM NaCI1 0,1 mM de CaCl2, 0,005% TWEEN®-O equipamento usado era um Biomek FX Robot (Beckman) euma leitora de MTP SpectraMAX (tipo 340); os MTPs foram de Costar (tipo9017).

No teste, 200 μΙ de Reagente de Tintura de Bradford foram pipe-tados em cada cavidade, seguido por 15 μΙ de tampão de diluição. Por fim10 μΙ do meio de cultura filtrado foram adicionados às cavidades.

Após mistura completa, os MTPs foram incubados por pelo me-nos 10 minutos em temperatura ambiente. As possíveis bolhas de ar foramsopradas e as ODs das cavidades foram lidas a 595 nm.

Para determinar a concentração de proteína, a leitura base (istoé, de cavidades não-inoculadas) foi subtraída das leituras de amostra. Osvalores de OD5g5 obtidos fornecem uma medida relativa do teor de proteínanas amostras. A linearidade das linhas de calibração de NprE entre 0 a 5 μgpermitiu o uso de valores de OD595 nm como uma medida relativa para oteor de proteína. Como o teor esperado de NprE no sobrenadante foi 200-300 μg/ml, o volume de 10 μΙ de amostra usado no teste contém menos que5 μg de proteína, fornecendo valores na faixa linear.

B. ENSAIO DE MICROAMOSTRA DE TECIDO PARA TESTAR DESEMPE-NHO DE PROTEASE

Os detergentes usados neste ensaio não continham enzimas. Oequipamento usado era um Biomek FX Robot (Beckman) e uma leitora deMTP SpectraMAX (tipo 340); os MTPs foram de Costar (tipo 9017).

Preparação do detergente (detergente líquido em água fria; con-dições norte-americanas):

Água de Milli-Q foi ajustada em 6 gpg de dureza de água(Ca/Mg=3/1), e 0,78 g/l de TIDE® 2007-2x detergente foi adicionado. A so-lução de detergente foi agitada vigorosamente por pelo menos 15 minutos.Depois, 5 mM de HEPES (ácido livre) foram adicionados e o pH ajustado em8,2.

MICROAMOSTRAS DE TECIDO

Microamostras de tecido de 0,63 cm (!4") de diâmetro circularforam obtidas de CFT. Antes de cortar as amostras de tecido, o tecido (EM-PA 116) foi lavado com água. Duas microamostras de tecido foram coloca-das em cada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades ver-ticalmente para expor a área de superfície inteira (isto é, não achatadas nofundo da cavidade).

MÉTODO DO TESTE

A incubadora foi ajustada em 20-C. As amostras do meio de cul-tura filtradas foram testadas a uma concentração apropriada por diluiçãocom uma mistura de 10 mM de NaCI, 0,1 mM de CaCI2 e 0,005% de soluçãode TWEEN®-80. A solução detergente desejada foi preparada como descri-ta acima. Depois, 190 μl de solução de detergente foram adicionados a cadacavidade do MTP, contendo microamostras de tecido. A esta mistura, 10 μlda solução de enzima diluída foram adicionados (para fornecer um volumetotal de 200 μl/cavidade). O MTP foi vedado com fita e colocado na incuba-dora durante 30 minutos, com agitação a 1400 rpm. Seguindo incubaçãosob as condições apropriadas, 100 μl de solução de cada cavidade foramremovidos e colocados em um MTP fresco. O MTP novo contendo 100 μl desolução/cavidade é lido a 405 nm em uma leitora de MTP. Controles embranco, como também um controle contendo duas microamostras de tecidoe detergente mas nenhuma enzima foram também inclusos.

CÁLCULO DO DESEMPENHO DE BMI:

O valor de absorbância obtido foi corrigido para o valor em bran-co (isto é, obtido após incubação de microamostras de tecido na ausênciade enzima). A absorbância resultante foi uma medida para a atividade hidro-lítica. Para cada amostra (por exemplo, nprE óu variante) o índice de de-sempenho foi calculado. O índice de desempenho comparado ao desempe-nho da variante (valor real) e da enzima-padrão (valor teórico) na mesmaconcentração de proteína. Além disso, os valores teóricos foram calculados,usando os parâmetros da equação de Langmuir da enzima-padrão. Um índi-ce de desempenho (PI) que é maior que 1 (Pl>1) identificou uma variantemelhor (quando comparado ao padrão [por exemplo, do tipo selvagem]),enquanto um PI de 1 (Pl=1) identificou uma variante que se desempenhouigual ao padrão, e um Pl que é menos que 1 (PI < 1) identificou uma varian-te que se desempenhou pior que o padrão. Desse modo, o Pl identificou osvencedores, como também variantes que são menos desejáveis para o usosob certas circunstâncias.

C. ENSAIO DE ESTABILIDADE DE CITRATO PARA PROTEASE DE NprE.

Estabilidade de citrato foi medida após incubação de NprE dotipo selvagem e variantes na presença de 50 mM de citrato. A atividade ini-cial e residual foi determinada usando o ensaio de hidrólise de DMC. Nestesistema de ensaio, as soluções químicas e de reagente usadas foram:

<table>table see original document page 80</column></row><table>

As concentrações destes tampões de diluição estão indicadascomo concentrações finais. A concentração inicial foi proporcionalmentemais alta e dependente da taxa de diluição. A concentração inicial foi pro-porcionalmente mais alta e dependente da taxa de diluição. Em experimen-tos alternativos, HEPES encontra uso em troca de Tris. O equipamento usa-do era um Biomek FX Robot (Beckman), e um incubador/agitador (Innova,tipo 4230; Brunswick Nova). O tampão de PIPES foi ajustado em pH 5,8com HCI a 4 N (concentração final de 55 mM). O tampão de Tris foi ajustadoem pH 8,2 com HCl a 4 N (concentração final de 25 mM). Os 50 mM de ci-trato/25 mM de tampão de Tris foram ajustados em pH 8,2 com NaOH a 4N.

O tampão de HEPES foi ajustado em pH 8,2 com NaOH a 4N (concentraçãofinal de 25 mM). Os 50 mM de citrato/25 mM de tampão de HEPES foramajustados em pH 8,2 com NaOH a 4N.

DETERMINAÇÃO DA PROTEÍNA

Para estabelecer a taxa de diluição desejada no ensaio de esta-bilidade de citrato a concentração de protease dos controles de NprE do tiposelvagem para cada placa foi determinada com o ensaio de TCA. Neste mé-todo, 25 μl de meio de cultura filtrado foram adicionados a 200 μl de16,875% (p/v) TCA. Após incubação durante 10 a 15 minutos em temperatu-ra ambiente, a difração/absorbância de luz a 405 nm foi determinada. Aconcentração de proteína foi determinada usando uma linha de calibração,construída com NprE purificado.

MÉTODO DO TESTE

A taxa de diluição do meio de cultura filtrado foi determinadausando o ensaio de TCA, como descrito acima.

CONDIÇÕES DE TENSÃO:

O meio de cultura filtrado foi diluído com tampão de diluição 2. OMTP foi coberto com fita, agitado durante alguns segundos e colocado naincubadora a 25°C durante 60 minutos a 200 rpm. Após incisóação, 20 μl damistura foram tirados de cada cavidade e transferidos para um MTP novo,contendo 180 μl de 1% de solução de substrato de DMC preaquecida (osubstrato foi preaquecido a 25°C). O MTP foi colocado diretamente no incu-bador/agitador e incubado a 25°C durante 30 minutos a agitação de 200rpm. A atividade de protease residual foi determinada usando o ensaio dehidrólise de dimetilcaseína, descrito abaixo.

CONDIÇÕES SEM TENSÃOO meio de cultura filtrado foi diluído com tampão de diluição 1.Imediatamente, 20 μΙ da mistura foram tirados de cada cavidade e transferi-dos para um MTP novo, contendo 180 μΙ de 1% de solução de substrato deDMC preaquecida (o substrato foi preaquecido a 25°C). O MTP foi colocadodiretamente no incubador/agitador e incubado por 25°C durante 30 minutosem agitação de 200 rpm. A atividade de protease inicial foi determinada comTNBS, usando o ensaio de hidrólise de dimetilcaseína, descrito abaixo.

Todos os valores de atividade residual (determinados com o en-saio de hidrólise de dimetilcaseína) foram calculados usando a equação aseguir.

% de Atividade residual = valor de OD6O min * 100/valor de OD0o min

D. ENSAIO DE HIDRÓLISE DE DIMETILCASEÍNA

Neste sistema de ensaio, as químicas e soluções de reagenteusadas foram:

DimetiIcaseina(DMC) Sigma C-9801

TWEEN®-80 Sigma P-8074

Tampão de PIPES (ácido livre) Sigma P-1851; 15,1 g dissolvidos emcerca de 960 ml de água; pH ajustacbem 6,0 com NaOH a 4N, 1 ml de 5% deTWEEN®-80 adicionado e o volume le-vado 1000 ml. Concentração final dePIPES e TWEEN®-80: 50 mM e0,005% respectivamente.Ácido picrilsulfônico (TNBS) Sigma P-2297 (5% de solução em á-gua)

Reagente A45,4 g de Na2B4O7-IO H2O (Merck 6308) e 15 ml de NaOH a 4Ndissolvidos juntos a um volume final de1000 ml (aquecendo, se necessário)Reagente B35.2 g de NaH2PO4-IH2O (Merck 6346) e 0,6 g de Na2SO3(Merck 6657) dissolvidos junto para umvolume final de 1000 ml.

MÉTODOPara preparar o substrato, 4 g de dimetilcaseína foram dissolvi-dos em 400 ml de tampão de PIPES. Os sobrenadantes de cultura filtradosforam diluídos com tampão de PIPES. Depois, 10 pl de cada sobrenadantediluído foram adicionados a 200 μΙ de substrato nas cavidades de um MTP.

O MTP foi coberto com fita, agitado durante alguns segundos e colocadosem um forno a 25°C durante 30 minutos sem agitação. Cerca de 15 minutosantes da remoção da Ii placa do forno, o reagente cje TNBS foi preparadomisturando 1 ml de solução de TNBS por 50 ml de Reagente A. MTPs foramenchidos com 60 μΙ de Reagente A de TNBS por cavidade. As placas incu-badas foram agitadas durante alguns segundos após os quais 10 μΙ foramtransferidos para os MTPs com Reagente A de TNBS. As placas foram co-bertas com fita e agitadas durante 20 minutos em um agitador de bancada(BMG Thermostar) em temperatura ambiente e 500 rpm. Por fim, 200 μΙ deReagente B foram adicionados às cavidades, misturados durante 1 minutoem um agitador, e a absorbância a 405 nm foi determinada usando uma lei-tora de MTP.

O valor de absorbância obtido foi corrigido para o valor em bran-co (isto é, substrato sem enzima). A absorbância resultante era uma medidada atividade hidrolítica. A atividade específica (arbitrário) de uma amostra foicalculada dividindo a absorbância e a concentração de proteína determina-da.

E. ENSAIO DE ESTABILIDADE DE TIDE®

A estabilidade de NprE e variantes foi medida após uma etapade incubação na presença de 25% de Detergente de pó-compactó de Tl-DE®. A atividade inicial ^a residual foi determinada usando o ensaio de A-GLA descrito abaixo. O equipamento usado era um Biomek FX Robot(Beckman), um medidor de fluorescência (FLUOstar Optima; BMG), um in-cubador/agitador (iEMS; Thermoelectron) e um incubador/agitador (Innova;Brunswick Nova (tipo 4230)); os MTPs foram de Costar (tipo 9017) e deGreiner (placas pretas, tipo 655076).

QUÍMICAS E REAGENTES:

Neste sistema de ensaio, as soluções químicas e de reagenteusadas foram:

Detergente De pó-compacto de TIDE® Com e sem DTPASolução de detergente de pó-compacto de TIDE® 125 g de Pó-compacto de

TIDE® dissolvidos em uma mistura de 50 gde 50 mM de HEPES pH 8,2 e 275 ml deágua; concentração de TIDE® foi 27,7%,após diluição, com sobrenadante 25%

Tampão de diluição de MES 52,6 mM de MES/NaOH, 2,6 mM de CaCI2,0,005% de TWEEN®-80, pH 6,5

Substrato de AGLA BaChem, cat no. H-6675 ou American Pepti-de Company, cat no. 81-0-31

Solução de substrato de AGLA 451 mg de AGLA dissolvidos em 16 ml deΝ,Ν-dimetilformamida; esta solução foi verti-da em 304 ml de tampão de MEs (52,6 mMde MES/NaOH, 2,6 mM de CaCI2, 0,005% deTWEEN®-80, pH 6,5) com agitação

MÉTODO TESTE:

CONDIÇÕES NÃO-ESTRESSADAS: ^

Primeiro, 20 μl de meio de cultura filtrado foram diluídos com180 μl de tampão de diluição de MES. Depois, 20 μΙ deste meio de culturadiluído foram diluídos com 180 μΙ de tampão de diluição de MES. Depois, 10μl desta diluição foram diluídos com 190 μΙ de solução de substrato de A-GLA em uma placa preaquecida a 25°C. Qualquer bolha de ar presente foisoprada e a placa foi medida de acordo com o AGLA protocolo de ensaio deprotease.

CONDIÇÕES DE TENSÃO:

Primeiro, 20 μl meio de cultura filtrado foram diluídos com 180 μlde solução de detergente de pó-compacto de TIDE® sem DTPA e após pré-mistura no agitador de iEMS durante 5 minutos, foram incubados tambémno agitador de Innova. A placa foi incubada para um total de 60 minutos a32-C, a 200 rpm. Além disso, 20 ul de meio de cultura filtrado foram diluídoscom 180 ul de solução de detergente de pó-compacto de TIDE® com DTPAe após pré-mistura no agitador de iEMS durante 5 minutos, foram incubadostambém no agitador de Innova. A placa foi incubada para um total de 40 mi-nutos a 209C, a 200 rpm. Depois, 20 μΙ de qualquer uma destas soluçõesforam diluídos com 180 μΙ de tampão de diluição de MES e 10 μΙ desta dilui-ção foram diluídos com 190 μΙ de solução de substrato de AGLA em umaplaca preaquecida a 25°C. Qualquer bolha de ar presente foi soprada e aplaca foi medida de acordo com o protocolo de ensaiOjde protease deAGLA.

CÁLCULOS:

Medições de fluorescência foram tiradas em excitação de 350nm e emissão de 415 nm. O software de espectrofluorômetro calculou astaxas de reação do aumento em fluorescência para cada cavidade para umalinha linearmente regressa de milli-RFU / min:

<formula>formula see original document page 85</formula>

F. ENSAIO DE 2-AMINOBENZOIL-L-ALANILGLICIL-L-LEUCIL-L-ALANINO-4-NITROBENZILAMIDA PROTEASE (Abz-AGLA-Nba)

O método descrito abaixo fornece um grau de detalhe técnicoque rende dados de ensaio de protease reprodutíveis independente do tem-po e lugar. Embora o ensaio possa ser adaptado a uma condição de labora-tório dada, quaisquer dados obtidos devem ser reconciliados através de umprocedimento modificado com resultados produzidos pelo método original.Metaloproteases neutras clivam a ligação de peptídeo entre glicina e Ieucinade 2-aminobenzoil-L-alanilglicil-L-leucil-L-alanino-4-nitrobenzilamida (Abz-AGLA-Nba). 2-aminobenzoil-L-alanilglicina livre (Abz-AG) em solução temuçna emissão de fluoreiscência máxima a 415 nm com uma excitação máxi-ma de 340 nm. Fluorescência de Abz-AG é extinta através de nitrobenzila-mida na molécula de Abz-AGLA-Nba intacta.

Nestes experimentos, a liberação de Abz-AG por clivagem deprotease de Abz-AGLA-Nba foi monitorada através de espectroscopia defluorescência (Ex. 340 / Em. 415). A taxa de aparência de Abz-AG foi umamedida da atividade proteolítica. Ensaios foram executados sob condiçõesde taxa iniciais não-limitadas ao substrato.Um misturador de microplaea com controle de temperatura (porexemplo, Eppendorf Thermomixer) foi requerido para os resultados de en-saio reprodutíveis. As soluções de ensaio foram incubadas na temperaturadesejada (por exemplo, 259C) no misturador de microplaca antes da adiçãoda enzima. As soluções de enzima foram adicionadas à placa no misturador,misturadas vigorosamente e rapidamente transferidas para a leitora de placa.

Um espectrofluorômetro com capacidade de análise de regres-são linear de registro de dados contínua e com controle de temperatura foirequerido (por exemplo, SpectraMax M5, Gemini EM, Molecular Devices). Aleitora sempre foi mantida na temperatura desejada (por exemplo, 25eC). Aleitora foi fixa para detecção de fluorescência lida de cima e a excitação foiajustada a 350 nm e emissão a 415 nm sem o uso de um filtro de expansão.

O PMT foi ajustado em sensibilidade média e 5 leituras por cavidade. Auto-calibração foi ativada, mas apenas calibrar antes da primeira leitura. O en-saio foi medido durante 3 minutos com o intervalo de leitura minimizado deacordo com o número de cavidades selecionadas a serem monitoradas. Aleitora foi ajustada para calcular a taxa de milli-RFU/min (milhares de unida-des de fluorescência relativa por minuto). O número de leituras usado paracalcular a taxa (pontos de Vmax) foi ajustado ao número equivalente a 2 mi-nutos, como determinado pelo intervalo de leitura (por exemplo, uma leituraa cada 10 segundos usariam 12 pontos para calcular a taxa). O RFU max foiajustado em 50.000.

Toda pipetação das soluções de enzima e de matéria-prima desubstrato foi feita com pipetas de deslocamento positivo (Rainiri Mcroman).Soluções de trabalho de tampão, ensaio, e enzima foram pipetadas por pi-petas simples ou de deslocamento de ar de multicanal (Rainin LTS) de tu-bos, reservatórios de reagente ou microplaca de matéria-prima. Uma pipetade repetidor (Eppendorf) encontra uso na transferência da solução de en-saio para cavidades de microplaca quando poucas cavidades forem usados,para minimizar perda de reagente. Instrumentos de pipetação automatiza-dos tais como Beckman FX ou Cybio Cybi-wells também encontram uso emtransferir as soluções de enzima de uma microplaca de matéria-prima defuncionamento para a microplaca de ensaio para iniciar uma microplaca in-teiro de uma vez.

REAGENTES E SOLUÇÕES:

52,6 mM de MES/NaOH, 2,6 mM de CaCI2, pH 6,5 - TAMPÃODE MES

Ácido de MES (10,28 g) e 292 mg CaCI2i anidro foram dissolvi-dos em cerca de 900 mL de água purificada. A solução foi titulada com Na-OH para pH 6,5 (a 25eC ou com sonda de pH de ajuste de temperatura). Otampão com pH ajustado foi composto em volume total de 1L. A soluçãofinal foi filtrada através de um filtro estéril de 0,22 pm e mantida em tempe-ratura ambiente.

48 mM de Abz-AGLA-Nba em DMF - MATÉRIA-PRIMA DE Abz-AGLA-Nba

Cerca de 28 mg de Abz-AGLA-Nba foram colocados em um tu-bo pequeno. Foram dissolvidos em ml de DMF (volume variará, dependendode Abz-AGLA-Nba em massa) e submetidos à vórtice durante vários minu-tos. A solução foi parada em temperatura ambiente protegida de luz..«

50 mM de MES, 2,5 mM de CaCI2, 5% DMF, 2,4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6,5 - SOLUÇÃO DE ENSAIO

Um ml de matéria-prima de Abz-AGLA-Nba foi adicionado a 19ml de tampão de MES e submetidos a vórtice. A solução foi parada em tem-peratura ambiente protegida de luz.

50 mM de MES, 2,5 mM de CaCI2, pH 6,5 - TAMPÃO DE DILU-IÇÃO DE ENZIMA "

Este tampão foi produzido adicionando 5 ml de água purificada a95 ml de tampão de MES.

50 mM de MES, 2,5 mM de CaCI2, 5% DMF, pH 6,5 - TAMPÃODE DILUIÇÃO DE SUBSTRATO

Cinco ml de DMF puro foram adicionados a 95 ml de tampão deMES. Este tampão foi usado para determinar os parâmetros cinéticos.SOLUÇÕES DE ENZIMAAs soluções de matéria-prima de enzima foram diluídas comtampão de diluição de enzima a uma concentração de cerca de 1 ppm (1ug/mL). Protease neutra de MULTIFECT® (NprE do tipo selvagem) foi diluí-da em concentrações abaixo de 6 ppm (6 ug/mL). Diluições seriais forampreferidas. Soluções foram estáveis em temperatura ambiente durante 1hora, mas para período de armazenamento mais longo, as soluções forammantidas em gelo.

PROCEDIMENTO

Primeiro todos os tampões, matéria-prima, e soluções de fun-cionamento foram preparados. Cada diluição de enzima foi ensaiada emtriplicata, a menos que do contrário indicado. Quando não completamenteenchida, a microplaca de matéria-prima de solução de trabalho de enzimafoi disposta em colunas verticais cheias a partir da esquerda da placa (paraacomodar a leitora de placa). A placa de ensaio correspondente foi similar-mente fixada para cima. O espectrofluorômetro da microplaca foi previamen-te fixado para cima como descrito.

Primeiro, uma alíquota de 200 uL de solução de ensaio foi colo-cada nas cavidades de uma microplaca de 96 cavidades. A placa foi incu-bada por 10 min a 25eC em um misturador de microplaca de temperaturacontrolada, protegido de luz. O ensaio foi iniciado transferindo 10 uL dassoluções de enzima de funcionamento da microplaca de matéria-prima paraa microplaca de ensaio no misturador. Otimamente, cabeça de pipetaçãodas 96 cavidades encontra uso, ou uma pipeta de multicanal de 8 cavidadesfoi usada para transferir primeiro da coluna mais à esquerda. As soluçõesforam vigorosamente misturadas durante 15 segundos (900 rpm em Eppen-dorf Thermomixer). Imediatamente, a microplaca de ensaio foi transferidapara o espectrofluorômetro de microplaca e o registro das medições de fluo-rescência à excitação de 350 nm e emissão de 415 nm foi iniciado. O soft-ware de espectrofluorômetro calculou as taxas de reação do aumento emfluorescência para cada cavidade para uma linha linearmente regressa demilli-RFU / min. Em alguns experimentos, uma segunda placa foi colocadano misturador de microplaca para equilibração de temperatura enquanto aprimeira placa foi sendo lida.

As velocidades iniciais de taxa foram lineares com respeito àconcentração do produto (isto é, fluorescência de 2-aminobenzoíla liberada)até 0,3 mM de produto que correspondeu a cerca de 50.000 de RFU emuma solução iniciando a 2,3 mM de Abz-AGLA-Nba com fluorescência debase de cerca de 22.000 de RFU. Abz-AGLA-Nba foi dissolvido em DMF efoi usado no dia que foi preparado.

COMPOSIÇÕES DETERGENTE:

Nas composições detergente exemplificadas, os níveis de enzi-mas são expressos por enzima pura em peso da composição total e a me-nos que do contrário especificado, os componentes detergente são expres-sos em peso das composições totais. As identificações dos componentesabreviados têm os significados a seguir nisso:

Abreviação Componente

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>

EXEMPLO 1

CLONAGEM DO GENE DE METALOPROTEASE NEUTRA DE B. amvloli-guefaciens.

Neste Exemplo, métodos usados para clonar o gene de metalo-protease neutra de B. amyloliquefaciens são descritos. A metaloproteaseneutra de codificação de gene foi clonada de B. amyloliquefaciens usandométodos bem estabelecidos nesta técnica. A cepa não-isenta (isto é, a cepaque carrega DNA extragenérico (além do marcador selecionável cloranfeni-col que é permitido em uma cepa isenta), especificamente nas seqüênciasde plasmídeo pJM102) BC91504 (aprE/nprE-pJM102 em BG3594::comK)carrega a seqüência de promotor e sinal de aprE de B. subtilis fundida nopropeptídeo/gene madura de nprE de B. amyloliquefaciens integrando oplasmídeo pJM102.

As duas seqüências seguintes (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2)de B. subtilis e B. amyloliquefaciens foram geradas por meio de PCR com osiniciadores de oligonucleotídeo que correspondem às seqüências sublinha-das.

Sítio de restrição de EcoRI cromossômico de B. subtilis (GA-ATTC) e codón de início de aprE (GTG) e códon de ,parada de nprE de B.amyloliquefaciens é mostrado nas seqüências a seguir em negrito comotambém um sítio de restrição de HindlW sinteticamente introduzido (A-AGCTT) projetado no iniciador Ns 4.

A seqüência a montante de 5' de aprE de B. amyloliquefaciensregião de codificação de seqüência de promotor e sinal são mostradas naseqüência a seguir (SEQ ID NO: 1). Iniciador 1 (apr-f; GAGCTGGGTAA-AGCCTATGAAT; SEQ ID NO: 5) é mostrado sublinhado, no começo da se-qüência, enquanto a porção de aprE dos iniciadores 2 e 3 (npr-f e npr-r;GTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCT; SEQ ID NO: 6) é mostrada comsublinhado duplo no término da seqüência.

GAGCTGGGTAAAGCCTATGAATTCTCCATTTTCTTCTGCTATC.AAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTÇTATAAAATTCCCGATATTGGTTAAACAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATRTTATTCCATCTA,TTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGT6AGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCT (SEQ ID NO: 1)

A seqüência do propeptídeo de B. amyloliquefaciens eseqüência de codificação de nprE madura e terminador de transcrição sãofornecidas na seqüência abaixo. Nesta seqüência, a porção de nprE dosiniciadores 2 e 3 é sublinhada

(GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG; SEQ ID NO: 7), enquanto a(GGCTTCACCATGATCATATATGTCAAGCTTGGGGGG; SEQ ID NO: 8) émostrada com sublinhado duplo.

GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTCTGTCAGTCACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTTCTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGTAACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTACGACTC TTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTC TTCTG AAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAACCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCACCACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATTTCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGATACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTC TTC TCACCTC TTTCCGGTTC AATGGACGTAACCGC TCATG AAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACÀGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGCCGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTACAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTTACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCGTCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTC AATC TGCGCGGGAÇCTTTACGGCTC TC AAGATGCTGC AAGCGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAAACAAGAAAAGAGACCGGAAATCCGGTC TC TTTTTTATATCTAAAAACATTTCACAGTGGCTTCACCATGATCATATATGTCAAGCTTGGGGGG (SEO ID NO: 2)

A seqüência de aminoácido do NprE de comprimento total (pré-,

pró-e seqüência madura) é fornecida abaixo:

MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVOAAENPOLKENLTNFVPKHSLVOSELPSVSDKAIKOYLKONGKVKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPWNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPE^VSNGTOAl^NKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWE^/TVDAETGKILKKQNKVEHAATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTOIITYDLONREYNLPGTLVSSTTNOFTTSSORAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKaayntitkigvnkaeqiyyraltvyltpsstfkdakaaliqsardlygsqdaasveaawnavgl (seq id no: 3)

Em algumas modalidades alternativas, a seqüência de NprE aseguir encontra uso na presente invenção.

Vrskklwisllfaltliftmafsnmsaqaaenpqlkenltnfvpkhslvqselpsvsdkaikqylkqngkvfkgnpserlklidqttddlgykhfryvpvvngvpvkdsqviihvdksn1wyaingelnndvsaktanskklsanqaldhaykaigk s peavsngtvanknkaelkaaatkdgk yrlaydvtiryiepe panwevtvdaetgkilkkqnkvehaattgtgttlkgkwslnissesgkyvlrdlskptgtqiitydlqnreynlpgtlvssttnqfttssqraavdahynlgkvydyfyqkfnrnsydnkggkivssvhygsrynnaawigdqmiygdgdgsffsplsgsmdvtahemthgvtqetanlnyenqpgalnesfsdvfgyfndtedwdigeditvsqpalrslsnptkygqpdnfknyknlpntdagdyggvhtnsgipnkaayntitkigvnkaeqiyyraltvyltpsstfkdakaaliqsardlygsqdaa sveaa wnavgl (seq id no: 4)

As seqüências de iniciador usadas nestes experimentos de PCRsão fornecidas abaixo:

<table>table see original document page 95</column></row><table>

Iniciadores 2 e 3 são complementos inversos um do outro ecorrespondem aos filamentos de não-codificação ( N2 2) ou codificação ( Ne3) dos DNAs cromossômicos. Para o filamento de codificação, elescorrespondem aos últimos 25 pares de base da seqüência sinal de aprE eos primeiros 30 pares de base do propeptídeo de nprE. Iniciador Ne 4 é ocomplemento inverso à seqüência sublinhada, compreendendo 24 pares debase de 3' do códon de parada de nprEe terminador com um sítio de HindlWintroduzido precedido por seis resíduos de dCTP, para fornecer um assim-chamado "grampo", permitindo clivagem mais eficiente com endonucleasede restrição de HindiW, visto que algumas enzimas de restrição clivamineficientemente se sua seqüência de reconhecimento estiver localizadabem nas extremidades dos fragmentos de DNA.

Os dois fragmentos de PCR foram gerados com o protocolo aseguir e reagentes (exceto modelo de DNA e iniciadores deoligonucleotídeo) de rTTH DNA polimerase de Applied Biosystem, Kit XL:

40,6 μlΗ20

30 μl 3,3x rTth tampão de PCR

10 μl 2 mM mistura de dNTP

4,4 μl 25 mM acetato de Mg

5 μl 50 μΜ iniciador Ns 1 ou Ne 3 (iniciadores diretos)

5 μl 50 μΜ iniciador N9 2 ou N9 4 (iniciadores inversos)

2 μl DNA cromossômico de B. subtilis ou B. amyloliquefaciens

2 μl r Tth polimerase

1 μl Pfu Turbo polimerase

100 μl volume de reação total

As condições de PCR usadas nestes experimentos foram (959C,30 seg. / 589C, 30 seg./689C, 1 min.) χ 30 ciclos seguidos esfriando rápidopara 49C. As reações foram operadas em 1,2% géis de agarose/TBEpreparativos, os fragmentos de tamnho apropriado excisados e purificadosusando o Kit de Extração de Gel QIAGEN®. Em uma segunda fusão,reações de PCR foram conduzidas em que os D^IAs cromossômicos foramsubstituídos por 1 ul cada um dos dois fragmentos separados e apenasiniciadores de fora N9 s 1 e Ne 2 foram usados. As mesmas condições dePCR como descritas acima foram usadas. Devido às extremidadescomplementares formadas nos dois fragmentos do uso de iniciadorescomplementares 2 e 3 entre as primeiras PCRs, os dois fragmentos foramprecisamente fundidos.

O fragmento de fusão foi digerido com EcoRI e Hind/// e gelpurificado como descrito acima. O plasmídeo pJM102 de integração foitambém digerido com EcoRI e HindlII, e o plasmídeo linear foi depoispurificado em gel e ligado através de técnicas padrão ao fragmento de fusãode apr/npr digerido. Esta reação de ligação foi subseqüentemente usadapara diretamente transformar uma cepa de B. subtilis induzida por xilose.

Após purificação, os dois fragmentos foram gerados por PCRcom iniciadores 1 e 2 dé DNA cromossômico de B. subtilis do tipo selvagem,e com iniciadores 3 e 4 de DNA cromossômico de uma cepa de B.amyloliquefaciens. Este fragmento foi purificado novamente como descritoacima, seguido por corte com EcoRI e HindlW como na mesma digestão doplasmídeo pJM102 integrante e ligação subseqüente do fragmento de fusãoao plasmídeo. Vários transformantes tiveram a fusão sequenciada docromossomo para verificar a ausência de qualquer mutação derivada porPCR. Um destes foi depois amplificado em etapas de 5 - 25 mg/ml decloranfenicol, o marcador selecionável em pJM102, para co-amplificar ocassete de expressão ligado.

O transformante verificado da seqüência selecionada foi obtidoatravés de seleção para o marcador de resistência a cloranfenicol depJM102 (CMP) em placas de LB/agar contendo 5 mg/ml CMP. Este foidepois inoculado em meio de cultura de LB a 10 mg/ml CMP durante a noitea 37eC, com agitação a 250 RPM. Esta cultura foi depois listrada sobreplacas de LB/agar com 10 mg/ml CMP para isolar colônias simples. Umacolônia foi depois inoculada em meio de cultura de LB a 25 mg/ml CMPdurante a noite a 379C, com agitação a 250 RPM. Esta cultura foi depoislistrada em placas de LB/agar com 25 mg/ml CMP pará isolar as colôniassimples. Estas colônias foram còihidas e armazenadas em glicerol a -709Caté o uso, como conhecido na técnica.

A deleção das duas proteases dispensáveis presentes em B.subtilis (aprE e nprE), como também amilase, reduziu o nível de proteaseextracelular total durante a produção de metaloprotease. O DNA codificandoa metaloprotease neutra foi clonado em um hospedeiro deletado de amilase.O comK induzível para desenvolvimento de competência foi inserido nomeio do Iocus de amilase, fazendo a cepa "amy ". A secreção da proteínaexpressa foi assegurada por inserção dos nucleotídeos que codificam aseqüência sinal antes da seqüência de codificação do gene.

EXEMPLO 2

EXPRESSÃO E FERMENTAÇÃO DA METALOPROTEASE NEUTRA ERECOMBINANTE NEUTRA DE MULTIFECT® PURIFICADA (nprE).

O recombinante de Bacillus subtilis produzido como descrito noExemplo 1 foi cultivado através de fermentação de batelada convencionalem um meio nutriente como descrito abaixo. Um frasco de glicerol(preparado como descrito no Exemplo 1) de cultura de B. subtilis contendo ametaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens foi usado para inocular 600ml de meio de SBG1% contendo 200 mg/L de cloranfenicol. As culturasforam crescidas durante 48 horas a 37eC após cujo tempo, o fluido decultura foi restabelecido através de centrifugação a 12.000 rpm, comoconhecido na técnica. Este procedimento foi feito em duplicata. Asconcentrações de enzima finais obtidas foram na faixa de cerca de 1,4 e 2g/L.

EXEMPLO 3

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE METALOPROTEASE NEUTRA

Este Exemplo descreve os métodos usados para purificar ametaloprotease neutra expressa pelos organismos descritos no Exemplo 2.Após 36 horas de incubação a 37°C, o meio de cultura de fermentação foirestabelecido e centrifugado a 12 000 rpm (centrífuga de SORVALL®modelo RC5B). As metaloproteases neutras segregadas foram isoladas doflujdo de cultura e concentradas cerfca de 10 vezes usando um filtro desistema Amicoh 8400 com um corte de BES (polietersulfona) de 10 kDa.

O sobrenadante concentrado foi submetido à diálise durante anoite a 4eC junto de 25 mM de tampão de MES, pH 5,4, contendo 10 mM deNaCI. O dialisado foi depois carregado sobre uma coluna de permuta decátions HS2O Poroso (volume total - 83 ml; capacidade de ligação ~ 4,5 gproteína/mL de coluna; Waters) como descrito abaixo. A coluna foi pré-equilibrada com 25 mM de tampão de MES1 pH 5,4, contendo 10 mM deNaCI. Depois, cerca de 200-300 ml de amostra foram carregados sobre acoluna. A proteína ligada foi eluída usando um gradiente de pH de 5,4 a 6,2em volumes de coluna 10 de tampão de MES. Elução da proteína foi entrepH 5,82 e 6,0, e foi avaliada usando atividade proteolítica como descrita aquie 10% (p/v) de SDS-PAGE de NUPAGE® (Novex). As frações contendoprotease neutra foram depois agrupadas. Sais de cálcio e cloreto de zincoforam adicionados na razão de 3:1 antes do ajuste do pH em 5,8. ThePerceptive Biosystems BIOCAD® Vision (GMI) foi usado para purificação daproteína.

A proteína purificada, avaliada usando uns 10% (p/v) de SDS-PAGE de NUPAGE®, foi determinada para homogênea, com mais que 95%de pureza. Tipicamente, menos que 1% das preparações purificadasmostrou atividade de serina protease quando avaliadas usando o ensaio deprotease padrão com o substrato pequeno, suc-p-AAPF-pNA (N-succinil-L- Ala-L-Ala-L-pro-L-Phe-p-nitroanilida) (Sigma). Este ensaio foi executado emformato de placa de microtitulação (96 cavidades) usando um tampão de100 mM de Tris-HCI, pH 8,5, contendo 10 mM de CaCI2 e 0,005% deTWEEN®-80. O substrato (p-AAPF NA) foi preparado fazendo uns 160 mMde matéria-prima em DMSO (dimetilsulfóxido) (100 mg/ml) e diluindo 100vezes de matéria-prima com o tampão de Tris-HCI contendo CaCI2 e0,005% de TWEEN®-80. Depois, 10 uL de solução de protease diluída(diluições foram preparadas usando 100 mM de tampão de Tris-HCI, pH 8,5,contendo 10 mM de CaCI2 e 0,005% de TWEEN-80) foram adicionados a190 uL de 1 mg/ml de solução de p-AAPF. O ensaio foi misturado por 5 minutos e a alteração cinética a 410 nm foi lida mais de 2 a 5 minutos. O >.declive da resposta foi medido e usado como uma indicação da quantidadeda atividade de serina protease. A proteína foi formulada paraarmazenamento usando 25 mM de tampão de MES, pH 5,8, contendo 1 mMde cloreto de zinco, 4 mM de cloreto de cálcio, e 40% de propileno glicol.

EXEMPLO 4

AFINIDADE DE METALOPROTEASE NEUTRA DE MULTIFECT®

PURIFICADA (PMN) PARA CÁTIONS DE CÁLCIO E ZINCONeste Exemplo, métodos para determinar a afinidade dametaloprotease neutra (PMN) preparada como descrita nos Exemplos acimasão descritos. As afinidades de PMN foram executadas para íons de cálcio ezinco usando os indicadores fluorescentes Fluo-3 e FluoZin-3,respectivamente obtidos de Molecular Probes. Todas as medições defluorescência foram registradas em um espectrofotômetro de LuminescênciaLS50B (Perkin-Elmer). A ligação de Fluo-3 foi monitorada através deexcitação a 500 nm e os espectros de emissão foram registrados de 505 a550 nm. Similarmente, a ligação de FluoZin-3 foi monitorada através deexcitação a 495 nm e os espectros de emissão foi colhido de 500 a 550 nm.A largura da fenda de excitação e de emissão foi determinada em 2,5 nm.

Nestas determinações, 100 uM de metaloprotease neutra em 50mM de tampão de Tris-HCl, pH 8,4, foram titulados com quantidadescrescentes do indicador relevante. As curvas de titulação são mostradas naFigura 1. Nesta Figura, os triângulos representam os dados de ligação decurva obtidos para Zn2+, usando a tintura de Fluo-Zin3 monitorada a 516nm, enquanto os círculos representam os dados obtidos para Ca2+ usando atintura de Fluo-3 monitorada a 522 nm. As constantes de associação (Ka)para zinco e cálcio (assumindo um sítio de ligação simples) foramdeterminadas ser 0,401 nM e 0,037 nM, respectivamente. Estes resultadosindicam que metaloprotease neutra de MULTIFECT® purificada ligou ao íonde zinco com aproximadamente de 10 vezes mais afinidade que o íon decálcio. Com base na ligação mais fraca de cálcio, os experimentos decriação com base proteína inicial são projetados para envolver ou (i) projetarsítio(s) de ligação de cálcio mais apertado e/οι/(ii) eliminar* o requerimentode estabilidade estrutural para cálcio (por exemplo, estabilizar a proteínapara mais que 80%).

EXEMPLO 5

ESTABILIDADE SOB ARMAZENAMENTO

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar aestabilidade sob armazenamento de PMN e metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens recombinante expressa em B. subtilis são descritos.Proteólise destas preparações de metaloprotease neutra foram avaliadas napresença de soluções de LAS crescentes (lauril sulfato de sódio; Sigma)(0% até um incluindo 10%). Fragmentos proteolíticos gerados dametaloprotease neutra de MULTIFECT® purificada (PMN) foram observadosusando 10% (p/v) de SDS-PAGE de NUPAGE®.

A estabilidade sob armazenamento da metaloprotease neutrarecombinante de B. amyloliquefaciens expressa em B. subtilis produzidacomo descrito acima, foi sozinho determinada em tampão (50 mM detampão de Tris-HCI, pH 8,4) e na presença de material base de detergenteobtido de Procter & Gamble. O tampão e/ou material base de detergentecontinha(m) íons de zinco, íons de cálcio ou uma combinação dos mesmos.

A concentração dos íons de zinco e de cálcio foi variada de 0 a 25 mm.Estes resultados sempre foram comparados com aqueles para ametaloprotease neutra incubada sozinha em tampão.

ENSAIOS DE PROTEASE

ENSAIO DE AZO-CASEÍNA:

O ensaio de ponto terminal de azo-caseína foi usado paraavaliar a quantidade de proteólise que ocorreu sob certas condições. Nestesensaios, 75 uL de enzima foram incubados com cálcio ou zinco em excessoou ambos os íons adicionados a 250 μΙ de 1% (p/v) de azo-caseína (Sigma).

A reação prosseguiu para 309C durante 15 minutos após os quais 10% (p/v)de ácido tricloroacético foram adicionados para parar a reação. A proteínaprecipitada e a azo-caseína não-reagida foram removidas através decentrifugação durante 10 minutos a 14 000 rpm. A cor do grupo azo foidesenvolvida por adição de -750 μΙ de. 1 M hidróxido de sódio. Odesenvolvimento da cor prosseguiu durante 5 minutos após os quais areação foi parada e a absorbância foi medida a 440 nm.

ENSAIO DE CASEÍNA SUCCINILADA E TNBSA:

A atividade da metaloprotease neutra foi determinada usando oKit de Ensaio de Protease QuantiCleave® (Pierce). Este ensaio é com basena digestão de caseína succinilada pela enzima. Os grupos amino primárioformados são depois reagidos com ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBSA)e formam um complexo colorido tendo absorbância máxima a 450 rim. Oensaio é executado em formato de microtitulação de 96 cavidades. O ensaiorequer uma incubação de 15 minutos com a caseína succinilada e umareação de 15 minutos com o TNBSA. Durante ambas as incubações, asamostras são colocadas em um agitador. TPCK-tripsina (Pierce) é o padrãogeral usado para determinações da atividade de protease geral. Porém,condições ótimas para atividade para proteases específicas requerem o usoda protease de interesse. No caso dos ensaios executados nestesexperimentos, tripsina e a protease de interesse foram usadas para calibraro ensaio. A precisão do ensaio requer que as diluições padrões feitas de 0,5mg/ml de tripsina sempre resultem em valores de absorbância (a 450 nm)abaixo de 0,5.

Toda amostra foi medida relativo a um controle que não contémnenhuma caseína. A alteração relatada em absorbância (Mbs(450 nm))conta com a interferência dos grupos amino de caseína. Também, qualquerpossível interferência dos grupos amino primário no tampão e/ou outroscomponentes do detergente foi também corrigida desta maneira. A atividadede todas as amostras foi determinada com relação ao detergente semmetaloprotease neutra adicionada, como também para enzima incubada emtampão de borato de BupH® provido com o kit, para o mesmo período detempo e na mesma temperatura.

Este teste é um ensaio de ponto final em que 50 mM de tampãode borato, pH 8,5, foram usados a 32SC. Os ensaios de protease foramtipicamente executados em duplicata. Na maioria dos experimentos paradeterminar as medições de estabilidade, a proteína e o detergente foramdiluídos usando o tampão supracitado em 1:1000, embora em algunsexperimentos, as diluições foram também 1:500 ou 1:200 para obter leiturasonde a absorbância das amostras em branco foram menos que 0,5. Oespectrofotômetro de microtitulação usado nestes experimentos foi umSpectraMax250® (Molecular Devices) e todos os ensaios foram conduzidosem placas de 96 cavidades de ligação de proteína médias (Corning).

Os resultados para as amostras de proteína padrões (porexemplo, tripsina e metaloprotease purificada) obtidas nestes ensaiosindicaram que houve uma resposta não-linear (uma escala linear pode seradequada apenas em uma faixa de ensaio estreita). Conseqüentemente, acurva foi. provida para uma função quadrática onde f = yo+ax2 +bx; f éajustado para y (SigmaPlot® v. 9; SPSS, Inc.). Desse modo, se umaequação linear fosse usada para quantificar a quantidade de proteína, dadosinexatos seriam obtidos; a equação quadrática foi obsevada ser requeridapara obter resultados precisos. É observado que a inserção de kit dofabricante (Pierce) indica que os resultados podem ser providos com "x"sendo uma escala de log.

EXEMPLO 6

EFEITO DE PH E LAS EM ATIVIDADE DE METALOPROTEASE NEUTRA

O pH ótimo da atividade para 0,36 mg/ml de nprE formulado foitambém determinado. Os tampões investigados neste estudo foram 50 mMde acetato de sódio na faixa de pH 3,5-5,5 (pKa = 4,76), 50 mM de tampãode MES na faixa de pH 5,5 a 7,0 (pKa = 6,10), e 50 mM de tampão de Tris-HCI em pH 8,4. O pH ótimo para nprE formulado foi determinado estar entre5,5 e 6,0.

O efeito do componente de detergente LAS na atividade de 0,36mg/ml de nprE formulado foi investigado através de incubação com 0 a 1%(p/v) de LAS. Os resultados estão mostrados no gráfico fornecido na Figura2. Como estes resultados indicam, a protease é inativada significativamentepelo componente de detergente, assim necessitando um meio paraestabilizar a protease contra este efeito deletério.

Em alguns experimentos, a composição de detergente líquidcdèdensidade alta (HDL) designada como "TIDE® 2005", fornecida por Procter& Gamble foi usada. Como provido, este detergente continha todos oscomponentes necessários, com exceção da metaloprotease neutra dapresente invenção.

ESTABILIDADE SOB ARMAZENAMENTO EM MATERIAL BASE DEDETERGENTE LÍQUIDO COMO UMA FUNÇÃO DE TEMPO

O teste de estabilidade foi executado de uma maneira deminiarmazenamento. As condições a serem variadas e as váriasconcentrações de sais de cloreto de cálcio e de zinco a serem adicionadasforam avaliadas usando uma matriz projetada usando o software FusionPro®(S-matriz). A tabela a seguir resume as condições testadas para averiguar aestabilidade sob armazenamento a longo prazo de metaloprotease neutrade B. amyloliquefaciens.

<table>table see original document page 104</column></row><table>

O volume final de cada condição testada foi 1 ml. TIDE® 2005foi dosado com 0,36 mg de enzima/mL. Fluido de cultura formulado emetaloprotease recombinante purificada no material base foram incubadosTIDE® 2005 a 32-C em um período de cerca de 4 semanas. A estabilidadesob armazenamento da metaloprotease em detergente foi comparada àestabilidade da metaloprotease neutra em 50 mM de tampão de MES, pH5,8.

Antes de testar, as amostras foram diluídas 5 entre 1000 usandotampão de ensaio (50 mM de tampão de borato, pH 8,5). A atividaderesidual foi determinada e comparada com relação à metaloprotease neutraem tampão de ensaio. Todas as medições foram determinadas emduplicata. Cada amostra foi testada em paralelo com amostras em brancode controle apropriadas (isto é, o detergente, tampão e qualquer aditivonecessário sendo testado). As amostras foram depois ensaiadas comodescrito nas instruções fornecidas com o Kit de Ensaio de ProteaseQuantiCleave® (Pierce).

Os resultados destes testes de estabilidade conduzidos em umperíodo de 3-4 semanas são mostrados na Figura 22. Em TIDE® 2005, ametaloprotease neutra na ausência de íons (isto é, nenhum sal adicionado)rapidamente perdeu toda de sua atividade ρroteoIítica/hidroIítica junto àcaseína. De fato foi determinado que menos que 20% da atividadepermaneceram após menos de 1 hora de incubação. Em contraste,incubação de nprE em íons de zinco contendo TIDE® 2005 (até e incluindo15 mM) estabilizou a protease e impediu proteólise em um período de 7dias. Desse modo, a presença de íons de zinco nesta formulação fracionoubem em manter pelo menos 60% da atividade de protease. Igualmente, umaconcentração de 7,5 mM de íons de zinco resultou em um efeito deestabilização similar. Esta concentração de íons de zinco está excedendoabaixo e é contemplada encontrar uso em uma variedade de formulações dedetergente. Nestes experimentos, nenhum efeito adicionado foi fornecidopela inclusão de íons de cálcio. Além disso, a adição de íons de cálcio emexecesso de 15 mM, e até e incluindo 25 mM, induziu precipitação quandoacrescentou-se o material base de TIDE® 2005. Embora não sejaintencionado que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismoparticular, foi contemplado que a ausência de um efeito de íons de cálcioadicionados na estabilização de protease nestes experimentos foi oresultado da composição de detergente.

Para termolisina, que exibe 55% de identidade de seqüência deaminoácido com metaloprotease' neutra de B. amyloliquefàciens(alinhamento de seqüência executado usando CLUSTAL W, v. 1,82), foimostrado claramente que íons de zinco são essenciais para atividade,enquanto que os íons de cálcio e criação dos sítios de ligação de cálcioforam mostrados representar um papel de estabilização (Vide por exemplo,Mansfield., et ai, J. Biol. Chem., 272:11152-11156 [1997]; e Van den Berget al., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:35-40 [1999]).

Em modalidades alternativas, outros cátions (por exemplo, Co2+,Mn2+ e Fe2+) encontram uso na presente invenção para a estabilização demetaloprotease neutra de β. amyloliquefaciens. Isto está em contraste comos dados anteriores que indicaram que nenhum destes íons resultou em100% de restauração da atividade específica (Holmquist. e Vallee, J. Biol.Chem., 249:4601-4607 [1974]). É contemplado que estes íons afetarão aestabilidade impedindo o desdobramento e degradação proteolíticasubseqüente da metaloprotease. Porém, não é intencionado que a presenteinvenção seja limitada a qualquer mecanismo particular de ação.

EXEMPLO 7

PRODUÇÃO DE PROTEASE DE NPRE EM B. subtilis USANDO O VETORDE EXPRESSÃO DE nprE pUBnprE

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para produzirprotease de NprE em B. subtilis, em particular, os métodos usados natransformação do plasmídeo pUBnprE em B. subtilis são descritos.Transformação foi executada como conhecido na técnica (Vide por exemplo,WO 02/14490, incorporado aqui por referência). A seqüência de DNA (aseqüência de DNA madura líder de nprE, nprE pro e nprE de B.amyloliquefaciens) fornecida abaixo, codifica a proteína de precursor deNprE:

GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTC TGTTGC TGTC GCCGC TTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCGGGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTC TG TCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTTC TGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGATGTTTCCGCCAAAXCGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGTAACCGTTGATGCGGAAAÇAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCGGCCACAACCGGAACAGGTACGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAACCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCT6CAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCACCACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATTTCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGATACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGGTTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGCCGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTACAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTTACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCGTCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAGCGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAA (seq id no: 12)

Na seqüência acima, negrito indica o DNA codificando aprotease de NprE madura, fonte padrão indica a seqüência líder (líder denprE), e sublinhado indica as seqüências pro (nprE pro). A seqüência deaminoácido (a seqüência de NprE lider, nprE pro e DNA madura líder deNprE, NprE pro e NprE) (SEQ ID NO: 13) fornecidas abaixo, codifica aproteína de precursor de NprE. Nesta seqüência, sublinhado indica aseqüência pro e negrito indica a protease de NprE madura. SEQ ID NO: 17fornece a pro-seqüência de NprE separadamente da seqüência de NprEmadura e SEQ ID NO: 18 fornece a seqüência de NprE madura. Estaseqüência foi usada como a b^se para fazer as bibliotecas variantesdescritas aqui.

MglgkklsvavaasfmsltislpgvqaaenpqlkenltnfvpkhslivqselpsvsdkaikqylkqngkvfkgnpserlklidqttddlgykhfryvpvwgvpvkdsqviihvdksnnvyaingelnndvsaktanskklsanqaldhaykaigkspeavsngtvanknkaelkaaatkdgkyrlaydvtiryiepepanwevtvdaetgkilkkqnkvehaattgtgTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFHRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYIINAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANIjNYENaPGALNESFSDV^GYFNDTEDVTOIGEDXTVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL (seq idno: 13)aenpqlkenltnfvpkhslvqselpsvsdkaikqylkqngkvfkgnpserlklidqttddlgykhfryv pwngvpvkdsqviihvdksnnvyaingelnndvsaktanskklsanqaldhaykaigkspeavsngtvanknkaelkaaatkdgkyrlaydvtiryiepepanwevtvdaetgkilkkqnkveh (seq id no: 17)aattgtgttlkgktvslnissesgkyvlrdlskptgtqiitydlqnreynlpgtlvssttnqfttssqraavdahynlgkvydyfyqkfnrnsydnkggkivssvhygsrynnaawigdqmiygdgdgsffsplsgsmdvtahemthgvtqeTANLNY ENQ PGALNE SFS DVFGYFNDTEDWDIGEDITV SQ PALRSL SNPTK YGQ PDNFKNYKNL PNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNA VGL(SEQ ID NO: 18)

O vetor de expressão de pUBnprE foi construído amplificando ogene de nprE do DNA cromossômico de B. amyloliquefaciens por PCRusando dois iniciadores específicos:

Oligo AB1740: CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG (SEQ ID NO: 19)

Oligo AB1741: GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC (SEQ ID NO: 20)

PCR foi executada em um termociclizador com DNA polimerasede alta fidelidade Phusion (Finnzymes. A mistura de PCR continha 10 μΙ de5x tampão (Finnzymes Phusion), 1 μΙ de 10 mM dNTP, 1,5 μΙ de DMSO, 1 μΙde cada iniciador, 1 μΙ de DNA polimerase de Phusion de Finnzymes, 1 μΙ desolução de DNA cromossômico 50 ng/μΙ, 34,5 μΙ de água de MilliQ. Oprotocolo a seguir foi usado:

Protocolo de PCR:

1) 30 seg 98°C;

2) 10 seg 98°C;

3) 2Q_seg 55°C;

4) 1 min 72°C;

5) 25 ciclos das etapas 2 a 4; e

6) 5 min 72°C.

Isto resultou em um fragmento de DNA de 1,9 kb que foidigerido usando enzimas de restrição de DNA BgIH e BclI. O vetor multicópiade Bacillus pUB110 (Vide por exemplo, Gryczan, J. Bacteriol., 134:318-329[1978]) foi digerido com BamH\. O fragmento de PCR χ BgIW χ BclIioi depoisligado no vetor pUB110 χ BamHl para formar o vetor de expressão depUBnprE (Vide, Figura 14).

pUBnprE foi transformado em uma cepa de B. subtilis (AaprE,AnprE, oppA, AspollE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK).Transformação em B. subtilis foi executada como descrito em WO02/14490, incorporado aqui por referência. Crescimento seletivo detransformantes de B. subtilis que abrigam o vetor de pUBnprE foi executadoem frascos de agitação contendo 25 ml de meio de MBD (um meio definidocom base em MOPS), com 20 mg/L de neomicina. Meio de MBD foi feitoessencialmente como conhecido na técnica (Vide, Neidhardt et al., J.Bacteriol., 119: 736-747 [1974]), exceto que NH4CI2, FeSO4, e CaCI2 foramomitidos do meio de material base, 3 mM de K2HPO4 foram usados, e omeio de material base foi suplementado com 60 mM de uréia, 75 g/L deglicose, e 1% de soytona. Também, os micronutrientes foram feitos comouma matéria-prima de 10OX contendo em um litro, 400 mg de FeSO4JH2O,100 mg de MnSO4, H2O, 100 mg de ZnS04.7H20, 50 mg de CuCI2.2H20,100 mg de CoCI2.6H20, 100 mg de NaMo04.2H20, 100 mg deNa2B4O7-IOH2O, 10 ml de 1M de CaCI2, e 10 ml de 0,5 M de citrato desódio. A cultura foi incubada durante três dias a 379C em umincubador/agitador (Infors). Esta cultura resultou na produção de NprEprotease segregada com atividade proteolítica como demonstrado porensaios de protease. Análise em gel foi executada usando géis de NuPageNovex 10% Bis-Tris (Invitrogen, Cat, No. NP0301BOX). Para preparar asamostras para análise, 2 volumes de sobrenadante foram misturados com 1volume de 1M HCI, 1 volume de 4xLDS tampão de amostra (Invitrogen, Cat.No. NP0007), e 1% de PMSF (20 mg/ml) e subseqüentemente aquecidasdurante 10 minutos a 70°C. Depois, 25 μΙ de cada amostra foramcarregados sobre o gel, junto com 10 μΙ de SeeBIue mais 2 padrões deproteína pré-tingidos (Invitrogen, Cat. No.LC5925). Os resultadosdemonstraram claramente que a estratégia de clonagem de nprE descritaneste exemplo rende NprE ativo produzido por B. subtilis.

EXEMPLO 8

GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE AVALIAÇÃO DE SÍTIO DE nprE (SELs)

Neste Exemplo, métodos usados na construção de SELs denprE são descritos. O vetor de pUBnprE, contendo o cassete de expressãode nprE descrito acima, serviu como DNA modelo. Este vetor contém umsítio de restrição único de BglIl que foi utilizado na construção da bibliotecade avaliação do sítio.

O vetor de expressão de pUBnprE, iniciadores, sintetizados emInvitrogen (dessalgados, escala de 50 nmol) foi usado para gerar asbibliotecas. As seqüências dos iniciadores são fornecidas na Tabela 8-1.

Para construção de uma biblioteca de avaliação de sítio denprE, foram executadas três reações de PCR1 incluindo duas PCRs demutagênese para introduzir o códon mutado de interesse na seqüência deDNA madura de nprE e uma terceira PCR fundida com as duas PCRs demutagênese a fim de construir o vetor de expressão d(e pUBnprE incluindo ocódon mutado desejado na seqüência de nprE madura.

O método de mutagênese foi com base no método de mutaçãocódon-específico em que a criação de todas as possíveis mutações foiexecutada de uma vez em um tripleto de DNA específico usando uminiciador de oligonucleotídeo direto e reverso com um comprimento de 25 a45 nucleotídeos que incluem uma seqüência de DNA tripla projetadaespecífica NNS ((A, C, T ou G), (A, C, T ou G), (C ou G)) que correspondeucom a seqüência do códon a ser mutada e garantiu incorporação aleatóriade nucleotídeos naquele códon maduro específico de nprE. O númerolistado nos nomes de iniciador (Vide, Tabela 8-1) corresponde com aposição de códon maduro de nprE específica.

Dois iniciadores adicionais usados para construir as bibliotecasde avaliação de sítio continham o sítio de restrição de BgIW junto com umaparte da seqüência de DNA de pUBnprE flanqueando o sítio de restrição deBgl\\. Estes iniciadores foram produzidos por Invitrogen (escala de 50 nmole,dessalgados) e estão listados na Tabela 8-1.

Tabela 8-1. Seqüências de iniciador

<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table>Tabela 8-1. Seqüências de iniciador

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Construção de cada biblioteca de avaliação de sítio iniciou comduas amplificações de PCR primárias usando o iniciador bar-BglIl-FW e uminiciador de mutagênese reverso nprE-específico. Para a segunda PCR1 oiniciador de RV de bar-BglII e um iniciador de mujagênese direto nprE-específico (posições de códon maduro de nprE iguais para os iniciadores demutagênese diretos e reversos) foram usados.

A introdução das mutações na seqüência de nprE madura foiexecutada usando DNA polimerase de alta fidelidade Phusion (Finnzymes;Cat. no. F-530L). Todas as PCRs foram executadas de acordo com oprotocolo de Finnzymes provido com a polimerase. As condições de PCRpara as PCRs primárias foram:para PCR 1 primária:

Iniciador de bar-BglIl-FW e um iniciador de mutagênese reversoNPRE-específico -ambos 1 μΙ (10 μΜ);para PCR 2 primária:

Iniciador de bar-BglII RV e um iniciador de mutagênese diretoNPRE-específico - ambos 1 μl (10 μΜ); juntamente com

5 χ tampão de HF de Phusion 10 μl10 mM de mistura de dNTP 1 μl

DNA polimerase de Phusion 0,75 μl (2 unidades / μΙ)

DMSO1 100% 1 μl

Λ DNAmodeIode pLJBnprE 1 μl (0,1-1 ng / μl)

Água destilada, em autoclave até 50 μΙO programa de PCR foi: 30 segundos 98eC, 30x (10 segundos98SC, 20 segundos 55eC, 1,5 minuto 72eC) e 5 min 72QC, executado em umciclizador térmico de PTC-200 Peltier (MJ Research). Os experimentos dePCR resultam em dois fragmentos de cerca de 2 a 3 kb, que tinha cerca de30 sobreposição de base de nucleotídeo ao redor do códon maduro deNPRE de interesse. Fragmentos foram fundidos em uma terceira reação dePCR usando estes dois fragmentos acima mencionados e os iniciadores deBgIW diretos e reversos. A reação de PCR de fusão foi realizada na soluçãoa seguir:

Iniciador de bar-BglIl-FW e

Iniciador de bar-BglIl-RV ambos 1 μΙ (10 μΜ)

5 χ tampão de HF de Phusion 10 μl

IOmMdemisturadedNTP 1 ,μl

DNA polimerase de Phusion 0,75 μΙ (2 unidades / μl)

DMSO, 100% 1 μl

Mistura de reação da PCR primária 1 1 μl

Mistura de reação da PCR primária 2 1 μl

Água destilada em autoclave até 50 μl

O programa de fusão de PCR foi como segue: 30 segundos98SC, 30x (10 segundos 98eC, 20 segundos 55eC, 2:40 minuto 72eC) e 5 min729C, em um ciclizador térmico de PTC-200 Peltier (MJ Research).

O fragmento de 6,5 Kb linear amplificado foi purificado usando okit de purificação de PCR Qiaquick (Qiagen, Cat. no. 28106) e digerido comenzima de restrição de BgIW para criar extremidades aderentes em ambosos lados do fragmento de fusão:

- 35 μl de fragmento de DNA linear purificado

- 4 μl de tampão de REACT ® 3 (Invitrogen)

-1 μl de BgIW, 10 unidades/ml (Invitrogen)Condições de reação: 1 hora, 30°C.

Ligação do BgIW digerido e purificado usando fragmento de kitde purificação de PCR de Qiaquick (Qiagen, Cat. <no. 28106) resulta émDNA circular e multimérico contendo a mutação desejada:

- 30 μl de fragmento de DNA digerido de BgIW purificado

- 8 μl de tampão de T4 DNA Ligase (Invitrogen®. cat. no. 46300-018)

- 1 μl de T4 DNA Ligase, 1 unidade^L (Invitrogen® cat. no.15224-017)

Condições de reação: 16-20 horas, 16°.Subseqüentemente, a mistura de ligação foi transformada emuma cepa de B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32,AamyE::(xylR,pxylA-comK). Transformação para B. subtilis foi executadacomo descrito em WO 02/14490, incorporado aqui por referência. Para cadabiblioteca, 96 colônias simples foram escolhidas e crescidas em meios deMOPS com neomicina e 1,25 g/L de extrato de levedura para análise daseqüência (BaseClear) e propósitos de triagem. Cada biblioteca incluiu ummáximo de 19 variantes de nprE sítio-específicas.

As variantes foram produzidas cultivando os transformantes deB. subtilis de SEL em MTP de 96 cavidades a 37-C durante 68 horas emmeio de MBD com 20 mg/L de neomicina e 1,25 g/L de extrato de levedura(Vide, acima).

EXEMPLO 9

GERAÇÃO DE BIBLIOTECAS COMBINATÓRIAS DE nprE (RCLs)

Neste Exemplo, métodos usados para gerar bibliotecascombinatórias de nprE são descritos. Para esta enzima, uma propriedade foiescolhida como a propriedade que mais necessitou ser alterada. Estapropriedade é definida aqui como a "propriedade primária". Todas as outraspropriedades eram "propriedades secundárias" para o propósito de projetode biblioteca combinatória. A estratégia básica para melhorar uma proteínacomo aqui usada, foi combinar mutações que melhoram a propriedadeprimária e também mantêm ou melhoram as propriedades secundárias. Osdados de avaliação de sítio foram usados para identificar aquelas mutaçõesque melhoraram a propriedade primária enquanto mantendo ou melhorandoas propriedades secundárias. Mutações que seriam- combinadas foramidentificadas por seu índice de Desempenho (PI ou Pi) e valores de AAGappassociados.

A "Alteração de Energia Livre Evidente" (AAGapp) como aquiusada é definida como:

AAGapp = -RT Ln (Pvariante/Porigem)onde Pvariante é o valor de desempenho para a variante e Porigem é o valor dedesempenho para a enzima de origem sob as mesmas condições. A razãoPvariante/Porigem é definida como o índice de desempenho (Pi) para apropriedade. Esperou-se que os valores de AAGapp se comportassem emuma maneira similar aos valores de AAG atuais por distribuições de dados eaditividade. Porém, uma vez que AAG representa a quantidade máxima detrabalho que pode ser realizado pela variante comparada à enzima deorigem, a quantidade AGapp em geral subestima a AG e pode levar aresultados que parecem sinergísticos em que as propriedades das duasposições aditivas podem ser maiores que o valor prognosticado somandoseus valores de AAGapp.

Por exemplo, quando estabilidade de TIDE® for a propriedadeprimária e atividade de BMI for a propriedade secundária, mutações tendovalores de AGapp < O (Pi >1) e valores de BMI de AAGapp < 0,06 (Pi >0,9)podem ser selecionadas para combinação. De fato, estas relações foramexploradas nestes experimentos.

Para produzir as variantes usadas nestes experimentos,fragmentos de biblioteca de nprE sintético, contendo mutações múltiplas emmúltiplas posições de nprE de DNA maduro, foram produzidos por GeneArt(Geneart). Estes fragmentos de biblioteca de nprE de 1,5 kb foram digeridoscom enzimas de restrição de DNA Pvul e Aval, purificados e ligados nofragmento de vetor de pUB de 5 kb (também digerido com enzimas derestrição de DNA Pvul e Aval) por uma reação de Iigase usando T4 DNALigase (Invitrogen® Catt. no. 15224-017).

Para transformar a mistura de reação de ligação diretamente emcélulas de Bacillus, o DNA da biblioteca (mistura de fragmento de bibliotecade nprE ligado em fragmento de vetor dè pUB) foi amplificado usando o kitde TempIiPhi (Arhersham Cat. Ng 25-6400). Para este propósito, 1 μί damistura de reação de ligação foi misturado com 5 pL de tampão de amostrado kit de TempIiPhi e aquecido durante 3 minutos a 959C para desnaturar oDNA. A reação foi colocada em gelo para esfriar durante 2 minutos e depoisgirada brevemente para baixo. Em seguida, foram adicionados 5 pL detampão de reação e 0,2 pL de polimerase de phi29 do kit de TempIiPhi, e asreações foram incubadas a 30gC em uma máquina de PCR de MJ Researchdurante 4 horas. A enzima de phi29 foi inativada a calor nas reações atravésde incubação a 65eC por 10 min na máquina de PCR.

Para transformação das bibliotecas em Bacillus, 0,1 μΙ doproduto de reação de amplificação de TempIiPhi foi misturado com 500 μΙ decélulas de B. subtilis competentes (AaprE, AnprE, oppA, AspollE, degUHy32,AamyE::(xylR,pxylA-comK) seguido agitando vigorosamente a 379C durante1 hora. Depois, 100 e 500 μΙ foram banhados em placas de Hl-ágarcontendo 20 mg/L de neomicina e 0,5% de leite desnatado. Em geral, atransformação para B. subtilis foi executada como descrito em WO02/14490, incorporado aqui por referência. Bibliotecas combinatórias deNprE de B. subtilis construídas por este método são contempladas paraconter aminoácidos do tipo selvagem em uma ou mais das posiçõesalvejadas para mutagênese.

As variantes obtidas nestas bibliotecas foram depois testadaspara sua estabilidade em TIDE® e seu desempenho em testes dedesempenho de lavagem de BMI como descritos aqui. Tabela 9 prove índicede desempenho para as variantes testadas no ensaio de BMI. Nesta Tabela,"Pos" indica a posição na seqüência de aminoácido de NprE que foialterada, e "AA" indica a substituição de aminoácido feita em cada variante.<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>Continuacao

<table>table see original document page 119</column></row><table>Tabela 9. Resultados (índice de Desempenho) para Variantes Testadas

<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table>EXEMPLO 10

MÉTODO ALTERNATIVO GERA BIBLIOTECAS DE AVALIAÇÃO DE SÍTIODE nprE (SELs) POR MEIO DE MUTAGÊNESE DE QuikChanqe®

Neste Exemplo, métodos alternativos para gerar SELs de nprEsão descritos. Como no Exemplo 8 acima, o vetor de pÜBnprE serviu comoo modelo fonte de DNA para a geração de SELs de nprE. A diferençaprincipal entre os dois métodos é que este método r(equer amplificação dovetor inteiro usando iniciadores mutagênicos Iocodirecionadoscomplementares.Materiais:

Cepa de Bacillus contendo o vetor de pUBnprE

Midi kit de Plasmídeo de Qiagen (Qiagen cat N°12143)Lisozima Ready-Lyse (Epicentro cat N9 R1802M)Kit de dam Metilase (New England Biolabs cat Ne M0222L)Kit de restabelecimento de DNA em Gel de Zymoclean (ZymoResearch cat N° D4001)

Iniciadores mutagênicos Iocodirecionados de nprE, escala de100 nmole, 5' Fosforilados, purificados por PAGE /!ntegrated DNATechnologies, Inc.)

Kit de Mutagênese Multi Locodirigida de QuikChange(Stratagene cat N° 200514)

Ciclizador Térmico de MJ Research PTC-200 Peltier (Bio-RadLaboratories)

1,2% de Ε-géis de agarose (Invitrogen cat N° G5018-01)

Kit de Amplifteação de T^empIiPhi (GE Healthcare cat N°25-6400-10)

Células de B. subtilis competentes (AaprE, AnprE, oppA,AspollE, degUHy32, AamyE::(xylR,pxylA-comK)MÉTODOS:

Para obter o vetor de pUBnprE, uma colônia simples de umacepa de Bacillus contendo o vetor de pUBnprE foi usada para inocular umtubo de neomicina de 5 ml de LB + 10ppm. Este foi a cultura de partida usa-da nestes métodos. A cultura foi cultivada a 37-C, com agitação a 225 rpmdurante 6 horas. Depois, 100 ml de LB fresco + 10ppm neomicina foram i-noculados com 1 ml da cultura de partida. Esta cultura foi cultivada durantea noite a 37eC, com agitação a 225 rpm. Seguindo esta incubação, o péletede célula foi colhido através de centrifugação suficiente para fornecer umpélete de célula. O pélete de célula foi ressuspenso em 10 ml de tampão P1(Midi kit de Plasmídeo de Qiagen). Depois, 10 ul de Lisozima de Ready-Lyseforam adicionados ao pélete de célula ressuspensa e incubados a 37eC por30 min. Depois, o protocolo de Midi kit de Plasmídeo de Qiagen foi continu-ado (usando 10 ml de Tampão P2 e P3 para responder ao volume aumen-tado de cultura de célula). Após isolamento de vetor de pUBnprE de Bacil-lus, a concentração de vetor de pUBnprE foi quantificada. O vetor foi depoismetilado de dam usando o Kit de dam Metilase (New England Biolabs), u-sando os métodos expostos nos protocolos de kit, para metilar cerca de 2 ugde vetor de pUBnprE por tubo. O kit de restabelecimento DNA em gel deZymoclean foi usado para purificar e concentrar o vetor de pUBnprE dam-metilado. O vetor de pUBnprE dam-metilado foi quantificado e depois diluídoa uma concentração de funcionamento de 50 ng/ul. Iniciadores mutagênicosIocodirigidos complementares (1 ul de cada iniciador a 10 uM) (Vide, Tabela10-1), foram usados em uma reação de PCR no Kit de Mutagênese MultiLocodirigida de QuikChange (Stratagene), seguindo o protocolo do fabrican-te (por exemplo, 1 ul vetor de pUBnprE dam-metilado (50 ng/ul), 1 ul de ini-ciador mutagênico de nprE Iocodirigido adiante (10 uM), 1 ul de iniciador mu-tagênico de nprE Iocodirigido adiante (10 uM), 2,5 ul de 10x tampão de rea-ção de-QuikChangef Multi, 1 ul Mistura de dNTP, 1 ul mistura de enzima deQuikChange Multi (2,5U/ul), e 17,5 ul de água destilada em autoclave, parafornecer uma mistura de reação total de 25 ul). As bibliotecas de avaliaçãode sítio de nprE foram amplificadas usando as condições a seguir: 95eC, por1 min. (19 ciclo apenas), seguido por 959C por 1 min., 559C por 1 min, 65eCpor 13 min e V2., e ciclismo repetido 23 vezes. O produto de reação foi para-do em 4gC durante a noite. Depois, a mistura de reação sofreu tratamentode digestão de Dpnl (provido com Kit de Mutagênese Multi Locodirigida deQuikChange) para digerir vetor de pUBnprE parental, usando o protocolo dofabricante (isto é, 1,5 ul enzima de restrição de Dpnl foi adicionada a cadatubo e incubada a 37eC durante 3 horas; 2 ul de reação de PCR digeridacom Dpnl foram depois analisada em um Ε-gel a 1,2% para cada SEL denprE para assegurar reação de PCR trabalhada e que modelo parental foidegradado). Amplificação de círculo rolante de TempIiPhi foi depois usadopara gerar quantidades grandes de DNA para tamanho de biblioteca cres-cente de cada SEL de nprE, usando o protocolo do fabricante (isto é, 1 ul dePCR de Mutagênese Multi Locodirigida de QuikChange tratada com Dpnl, 5ul de Tampão de Amostra de TempIiPhi1 5 ul de Tampão de Reação deTempIiPhi1 e 0,2 ul de Mistura de Enzima de TempIiPhi, para uma reaçãototal de ~11 ul; incubada a 30eC durante 3 horas; a reação de TempIiPhi foidiluída somando 200 ul de água destilada em autoclave e brevemente sub-metidas à vórtice. Depois, 1,5 ul de material de TempIiPhi diluído foi trans-formado em células de B. subtilis competentes, e SELs de nprE foram sele-cionados para usar placas de LA + 10 ppm Neomicina + 1,6% leite desnata-do. Tabela 10-1 provê os nomes, seqüências e SEQ ID NOS para os inicia-dores usados nestes experimentos. Todos os iniciadores foram sintetizadospor Integrated DNA Technologies, em escala de 100 nmole, 5'-fosforilados,e purificados por PAGE.

Tabela 10-1. Iniciadores <table>table see original document page 125</column></row><table>Tabela 10-1. Iniciadores

<table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table>Tabela 10-1. Iniciadores

<table>table see original document page 128</column></row><table>

EXEMPLO 11

IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS DE nprE

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para identificar homó-logos de npr são descritos. Em particular, neste Exemplo, experimentos fo-ram conduzidos para clonar homólogos de protease neutra (npr) de espé-cies de Bacillus diferentes e estritamente relacionadas. As espécies diferen-tes foram escolhidas para explorar a diversidade e propriedades das quaisestas espécies diferentes são isoladas.

Os vários homólogos de npr explorados incluíram:

Npr de B. caldolyticus (P23384)

NprC de B. cereus (P05806)

npr de E33L de B.cereus (AAY60523)

NprT dé B. stearofiermophilus

NprB de B. subtilis

NprE de B. subtilis

NprB de B. thuringiensis (AAK00602)

Aur de S. aureus (P81177)

Figura 3 fornece um alinhamento de seqüência destes homólo-gos (SEQ ID NOS: 173-181) e Figura 4 (SEQ ID NOS: 182-191) fornece ou-tro alinhamento de seqüência de vários outros homólogos.Nestes experimentos, os materiais incluíram:

DNA cromossômico da cepa de B. subtilis 1168

Os plasmídeos de DNA a seguir foram sintetizados no DNA2,0com códon otimização de B. subtilis:

pJ4:G01905 (nprB de B. thuringiensis) (Vide, Figura 6)

pJ4:G01906 (npr de E33L de B. cereus) (Vide, Figura 7)

pJ4:G01907 (nprC de B. cereus) (Vide, Figura 8)

pJ4:G01908 (npr de B. caldolyticus) (Vide, Figura 9)

pJ4:G01909 (aur de S. aureus) (Vide, Figura 10)

pJ4:G01938 (nprT de S. stearothermophilus) (Vide, Figura 11)

vetor de pJHT (Vide, Figura 12)

vetor de pAC (Vide, Figura 13)

Ciclizador térmico de MJ Research PTC-200 Peltier (Bio-RadLaboratories)

Iniciadores(OperonInc)

DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion (Stratagene)

Endonucleases de restrição (Roche)

Células de E. coli quimicamente competentes TOPIO (Invitro-gen)

Células competentes de B. subtilis ((AaprE, LnprE, oppA,

∆spollE, degUHy32, ∆amyE::(xylR,pxylA-comK)

Tabela 11. Iniciadores

<table>table see original document page 129</column></row><table>Tabela 11. Iniciadores

<table>table see original document page 130</column></row><table>

A. CLONAGEM DE nprE DE Β. subtilis

Para construção do plasmídeo de nprE de B. subtilis, o fragmen-to de promotor de aprE amplificado (de vetor de pJHT) e gene de nprE de B.subtilis com fragmento terminador (da cepa de B. subtilis 1168) foram sepa-radamente preparados. Figura 15 fornece um esquemático, ilustrando a am-plificação dos fragmentos de DNA individuais.

Reação de extensão de Sobreposição de Junção de PCR {SOE)foi usada para unir os 2 fragmentos de DNA separados. Nesta reação, osreagentes a seguir foram combinados: 1 ul de promotor de fragmento deDNA de aprE, 1 ul de gene de nprE de B. subtilis + fragmento terminador, 1ul de Iniciador EL-689 (25 uM), 1 ul de Iniciador EL-695 (25 uM), 5 ul detampão de polimerase de DNA de HS de 10x PfuUItra Il Fusion, 1 ul dedNTP (10 mM),1 ul de DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, e 39 ulde água destilada em autoclave para fornecer um volume de reação total de*50 ul. Os ciclos de PCR foram: 959C durante 2 minutos (1e ciclo apenas),seguido por 28 ciclos de 95eC durante 30 segundos, 54eC durante 30 se-gundos, e 729C durante 0:45 segundos.

O fragmento de fusão de PCR de promotor de aprE-gene denprE de B. subtilis + Terminador foi digerido com endonucleases de restri-ção de MfeI e BambW. O vetor de pJHT foi digerido com endonucleases derestrição de EcoRI e de BamH\. O fragmento de DNA de promotor de aprE-gene de nprE de B. subtilis + Terminador digerido por endonuclease de res-trição foi depois ligado ao vetor de pJHT digerido com endonuclease de res-trição. A mistura de ligação foi depois transformada em células de E. co//'deTOPIO quimicamente competentes para seleção em LA + 50 ppm carbenici-lina. Após identificação dos plasmídeos contendo a seqüência de constru-ção de DNA correta para plasmídeo pEL501 (Vide, Figura 16), transforma-ram-se em células de B. subtilis competentes para integração em Iocus dopromotor de aprE. Transformantes foram selecionados para atividade deprotease (isto é, clareamento de leite desnatado) em placas de LA + 5 ppmde cloranfenicol + 1,6% de leite desnatado. Cepas amplificadas foram de-pois transferidas para placas de LA + 25 ppm de cloranfenicol + 1,6% deleite desnatado. Cepas foram depois transferidas para placas de LA + 25ppm de cloranfenicol + 1,6% de leite desnatado para amplificação.

B. CLONAGEM DE nprB DE B. subtilis

Para construção do plasmídeo de nprB de B. subtilis, o fragmen-to de promotor de aprE amplificado (do vetor de pJHT), fragmento de genede nprB de B. subtilis (da cepa de B. subtilis 1168), e fragmento de Termina-dor (do vetor de pJHT) foram separadamente preparados. Figura 17 forneceum diagrama esquemático da amplificação dos fragmentos de DNA indivi-duais.

Reação de Extensão de Sobreposição de Junção de PCR (SOE)foi usada para unir os três fragmentos de DNA separados. Nesta reação, osreagentes a seguir foram combinados: 1 ul de fragmento de DNA de promo-tor de aprE, 1 ul de gene de nprB de B. subtilis + fragmento de Terminador,1 ul de fragmento de DNA de Terminador, 1 ul^lé Iniciados EL-689 (25 uM),1 ul de Iniciador EL-700 (25 uM), 5 ul de 10x tampão de DNA polimerase deHS de PfuUItra Il Fusion, 1 ul de dNTP (10 mM), 1 ul de DNA polimerase deHS de PfuUItra II, e 38 ul de água destilada em autoclave, para um volumede reação total de 50 ul. Os ciclos de PCR foram: 95eC durante 2 minutos(1- ciclo apenas), seguido por 28 ciclos de 95eC durante 30 segundos, 54gCdurante 30 segundos, e 72eC durante 0:45 segundos.

O fragmento de fusão de PCR de promotor de aprE-gene denprB de Β. subtilis + Terminador foi digerido com endonucleases de restri-ção de MfeI e Sphl. O vetor de pJHT foi digerido com endonucleases de res-trição de EcoRI e Sphl. O fragmento de DNA de promotor de aprE-gene denprB de B. subtilis + Terminador digerido por endonuclease de restrição foidepois ligado com o vetor de pJHT digerido com endonuclease de restrição.A mistura de ligação foi depois transformada em células de E. colide TOPIOquimicamente competentes para seleção em LA + 50 ppm de carbenicilina.Após identificação dos plasmídeos contendo a seqüência de construção deDNA correta para plasmídeo pEL508 (Vide, Figura 18), transformaram-seem células de B. subtilis competentes para integração em Iocus do promotorde aprE. Os transformantes foram selecionados para atividade de protease(isto é, calreamento de leite desnatado) em placas de LA + 5 ppm de cloran-fenicol + 1,6% de leite desnatado. Cepas amplificadas foram depois transfe-ridas para placas de LA + 25 ppm de cloranfenicol + 1,6% de leite desnata-do. Cepas foram depois transferidas para placas de LA + 25 ppm de cloran-fenicol + 1,6% de leite desnatado para amplificação.

C. CLONAGEM DE nprT DE B. stearothermophilus

Para construção o plasmídeo de nprT de B. stearothermophilus,o fragmento de promotor de aprE amplificado (do vetor de pJHT) e frâgmen-to de nprT de B. stearothermophilus (do plasmídeo pJ4:G01938) foram se-paradamente preparados. Figura 19 fornece um diagrama esquemático daamplificação dos fragmentos de DNA individuais.

Reação de Extensão de Sobreposição de Junção de PCR (SOE)foi usada para unir os 2 fragmentos de DNA separados. Nesta reação, osreagentes a seguir foram combinados: 1 ul de fragmento de DNÁ de promo-tor de aprE, 1 ul de fragmento de gene de nprT de B. stearothermophilus, 1ul de Iniciador EL-755 (25 uM), 1 ul de Iniciador EL-735 (25 uM), 5 ul de 10xtampão de DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, 1 ul de dNTP (10mM), 1 ul de DNA polimerase de HS de PfuUItra II, e 39 ul de água destiladaem autoclave, para fornecer um volume de reação total de 50 ul. Os ciclosde PCR foram: 95eC durante 2 minutos (1Q ciclo apenas), seguido por 28ciclos de 95-C durante 30 segundos, 549C durante 30 segundos, e 729C du-rante 0:45 segundos.

O fragmento de fusão de PCR de promotor de aprE-gene denprT de B. stearothermophilus + Terminador foi digerido com endonucleasesde restrição de EcoRI e HincAW. O vetor de pAC foi digerido com endonucle-ases de restrição de EcoRI e HindW\. O fragmento de DNA de promotor deaprE-nprT de B. stearothermophilus foi digerido com endonuclease de restri-ção e depois ligado com o vetor de pAC digerido com endonuclease de res-trição. Amplificação de círculo rolante de TempIiPhi foi depois usada paragerar quantidades grandes da molécula de DNA de pAC de promotor de a-prE-nprT de B. stearothermophilus, usando o protocolo do fabricante (isto é,1 ul da reação de ligação de pAC de promotor de aprE-nprT de B. stearo-thermophilus, 5 ul de Tampão de Amostra de TempIiPhi, 5 ul de Tampão deReação de TempIiPhi, e 0,2 ul de Mistura de Enzima de TempIiPhi, parauma de reação total de -11 ul; incubada a 309C durante 3 horas). A reaçãode TempliPhi foi depois transformada diretamente em células de B. subtiliscompetentes para integração em Iocus de promotor de aprE, assim gerandoa cepa de Bacillus EL560, confirmado por análise de seqüenciação de DNA(Vide, Figura 20). Os transformantes foram selecionados para atividade deprotease (isto é, clareamento de leite desnatado) em placas de LA + 5 ppmde cloranfenicol + 1,6% de leite desnatado. Cepas foram depois transferidaspara placas de LA + 25 ppm de cloranfenicol + 1,6% de leite desnatado paraamplificação.

D. CLONAGEM DE npr DE B. caldolyticus

Para construção do plasmídeo de npr de B. caldolyticus, o frag-mento de promotor de ,aprE amplificado (dofvetor de pJHT) e fragmento denpr de B. caldolyticus (do plasmídeo pJ4:G01908) foram separadamentepreparados. Figura 21 fornece um diagrama esquemático da amplificaçãodos fragmentos de DNA individuais.

Reação de Extensão de Sobreposição de Junção de PCR (SOE)foi usada para unir os 2 fragmentos de DNA separados. Nesta reação, osreagentes a seguir foram combinados: 1 ul de fragmento de DNA de promo-tor de aprE, 1 ul de fragmento de gene de npr de B. caldolyticus, 1 ul de Ini-ciador EL-755 (25 uM), 1 ul de Iniciador EL-741 (25 uM), 5 ul de 10x tampãode DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, 1 ul de dNTP (10 mM), 1 ulde' DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, e 39 ul de água destiladaem autoclave, para fornecer um volume de reação total de 50 ul. Os ciclosde PCR foram: 95gC durante 2 minutos (1° ciclo apenas), seguido por 28ciclos de 95°C durante 30 segundos, 54°C durante 30 segundos, e 72°C du-rante 0:45 segundos.

O fragmento de fusão de PCR de promotor de aprE-gene de nprde B. caldolyticus + Terminador foi digerido com endonucleases de restriçãode EcoRI e Hind\\\. O vetor de pAC foi digerido com endonucleases de res-trição de EcoRI e Hind\\\. O fragmento de DNA de promotor de aprE-npr deB. caldolyticus digerido com endonuclease de restrição foi depois ligado como vetor de pAC digerido com endonuclease de restrição. Amplificação decírculo rolante de TempIiPhi foi depois usada para gerar quantidades gran-des da molécula de DNA ligada de pAC de promotor de aprE-npr de B. cal-dolyticus, usando o protocolo do fabricante (isto é, 1 ul da reação de ligaçãode pAC de promotor de aprE-npr de B. caldolyticus, 5 ul de Tampão de A-mostra de TempIiPhi, 5 uj .de Tampão de Reação de TempIiPhi, e 0,2 ul deMistura de Enzima de TempIiPhi, para uma reação total de ~11 ul; incubadaa 30°C durante 3 horas). A reação de TempIiPhi foi depois transformada di-retamente em células de B. subtilis competentes para integração em Iocusde promotor de aprE, assim gerando a cepa de Bacillus EL561 (Vide, Figura22), confirmada por análise de seqüenciação de DNA. Transformantes fo-ram selecionados para atividade de protease (isto é, clareamento de leitedesnatado) em placas de LÁ + 5 ppm de cloranfenicol + 1,6% de leite deis-natado. Cepas foram depois transferidas para placas de LA + 25 ppm decloranfenicol + 1,6% de leite desnatado para amplificação.

E. CLONAGEM DE nprB de B. thuringiensis

Para a construção do plasmídeo nprB de B. thuringiensis, ofragmento de promotor de aprE amplificado (do vetor de pJHT) e fragmentode nprB de B. thuringiensis (do plasmídeo pJ4:G01905) foram separada-mente preparados. Figura 23 fornece um esquemático mostrando a amplifi-cação dos fragmentos de DNA individuais.

Reação de Extensão de Sobreposição de Junção de PCR (SOE)foi usada para unir os 2 fragmentos de DNA separados. Nesta reação, osreagentes a seguir foram combinados: 1 ul de fragmento de DNA de promo-tor de aprE, 1 ul de fragmento de gene de nprB B. thuringiensis, 1 ul de Ini-ciador EL-755 (25 uM), 1 ul de Iniciador EL-744 (25 uM), 5 ul de 10x tampãode DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, 1 ul de dNTP (10 mM), 1 ulde DNA polimerase de HS de PfuUItra Il Fusion, e 39 ul de água destiladaem autoclave, para fornecer um volume de reação total de 50 ul. Os ciclosde PCR foram: 959C durante 2 minutos (1Q ciclo apenas), seguido por 28ciclos de 95eC durante 30 segundos, 54eC durante 30 segundos, e 72eC du-rante 0:45 segundos.

O fragmento de fusão de PCR de promotor de aprE-gene denprB de B. thuringiensis + Terminador foi digerido com endonucleases derestrição de EcoRI e HincHW. O vetor de pAC foi digerido com endonucleasesde restrição de EcoRI e HincAW. O fragmento de DNA de promotor de aprE-nprB de B. thuringiensis digerido com endonuclease de restrição foi depoisligado com o vetor de pAC digerido com endonuclease de restrição. A mistu-ra de ligação foi depois transformada em células de E. colide TOPIO quimi-camente competentes. Após identificação dos plasmídeos contendo a se-qüência de construção de DNA correta para o plasmídeo pEL568, transfor-maram-se em células de B. subtilis competentes. Transformantes foram de-pois selecionados para atividade de protease (isto é, clareamento de leitedesnatado) em placas de LA + 5 ppm de cloranfenicol + 1,6% de leite des-natado. Preparação do plasmídeo de DNA mostra que o plasmídeo f£L568é estável em B. subtilis e não integra no Iocus do promotor de aprE. Figura24 fornece um mapa do plasmídeo pEL568.E. MODELAGEM DE HOMOLOGIA

Em ainda modalidades adicionais, é fornecido um modelo dehomologia do domínio maduro de NprE de Bacillus amyloliquefaciens. Nes-tes experimentos, a seqüência de proteína do domínio maduro da seqüênciade NprE (SEQ ID NO: 192) é passada através do programa BIastP (NCBI).Este programa emparelha a seqüência às outras seqüências conhecidas deidentidade de seqüência variada. Da saída, as seqüências pelas quais umasestruturas de cristal de raio X é conhecida foram identificadas. Estas se-qüências incluíram Npr de S. aureus (pdb id 1BQB) Npr P. aeruginosa (pdbidIEZM), termolisina de B. thermolyticus (pdb id 1KEI) e Npr de B. cereus(pdb id 1NPC). Figura 5 fornece um alinhamento de seqüência das váriasseqüências analisadas. (SEQ ID NOS: 192-195)

A seqüência do Npr de B.cereus foi observada ser mais idênticaa NprE. Termolisina de B. thermolyticus (pdb id 1KEI) foi excluída das eta-pas subseqüentes como é bem parecida com Npr de B. cereus. Um modelode homologia foi depois preparado como detalhado abaixo, e todo o cálculofoi feito usando o programa MOE (Computação Química).

Primeiro, as seqüências de Npr de S.aureus (pdb id 1BQB; SEQID NO: 193) Npr de P. aeruginosa (pdb id1 EZM)(SEQ de ID NO: 194), e Nprde B.cereus (pdb 1NPC id)(SEQ ID NO: 195) foram alinhadas usando estru-tura conhecida para obter o alinhamento de seqüência mais preciso (isto é,uma estrutura com base em alinhamento de seqüência foi produzida). Emseguida, a seqüência madura de NprE foi alinhada com esta estrutura combase em alinhamento de seqüência. Depois, um modelo de homologia inicial de NprE foi produzido usando a estrutura de Npr de B. cereus (pdb id 1 NPC)como um modelo, e usando o alinhamento de seqüência de NprE para Nprde B.cereus produzido acima. Foi claro da inspeção deste alinhamento queenquanto que Npr de B. cereus contém quatro sítios de ligação de íon deCa2+, NprE apenas contém dois sítios de ligação de íon de Ca2+.

Por fim, após o modelo de -homologia inicial ter sido construído,os íons de metal (isto é, Zn2+, e dois Ca2+) foram computacionalmente fixa-dos, como foi seus respectivos Iigandos de proteína. O resto da estruturamodelo foi computacionalmente minimizada usando o parâmetro de ajustede CHARMM22, resultando no modelo de homologia final.

EXEMPLO 12

TESTES DE DESEMPENHO DE LAVAGEM

Neste Exemplo, são descritos experimentos conduzidos paradeterminar o desempenho de lavagem da metaloprotease da presente in-venção. Todos os testes de desempenho de lavagem foram executados sobcondições de lavagem americanas, como indicado abaixo:Testes de Desempenho de Lavagem de RoupaEquipamento: Terg-O-Tometer (Teste padrão americano) mode-lo de bancada de 6 potes

Temperatura: 15°C/60°F ,

TempodeLavagem: 12 minutosAgitação: IOOrpm

Tempo de Enxágue: 3 minutos

Dureza de água: 6 grãos por galão / 105 ppm como Ca-

CO3 (3/1 Ca+2/Mg+2)Concentração de espuma: 1,6 g/l de material base de TIDE®

2005 de detergente líquidoDosagem de enzima: 0,00-0,55-2,75-5,50 mg de proteína/l

solução de lavagem ativaAmostras de tecido: EMPA 116 Fixo, fixado a 20°C: Sangue,

leite, tinta em algçdão (10 χ 7,5 cm)EMPA 116 Solto: Sangue, leite, tinta em algodão (10 χ 7,5 cm)Grama de Equest: Meio de grama esfregado em algodão (10 χ7,5 cm)

CFT C-10: Pigmento, óleo, leite em algodão (10 χ 7,5 cm)EMPA 221: Algodão puro usado como amostra de tecido (10 χ10 cm)

6 EMPA Π 6 fixo + 2 £MPA 221 foram posfos em um vaso6 EMPA 116 solto + 2 EMPA 221 foram postos em um vaso6 grama de Equest + 2 EMPA 221 foram postos em um vaso6 CFT C-10 + 2 EMPA 221 foram postos em um vasoCondições de secagem: secador por giro, manchas de gra-ma foram secadas ao ar, cobertas com roupas escuras. As outras manchasforam passadas a ferro.

Amostras de tecido de medição: Medidor Tristimulus MinoltaCR-300 com equação L (L*a*b), D65 Std. Ilumine, em um fundo branco. Ex-presso em Delta % de Remoção de Sujeira.

3 leituras por amostra de tecido (antes e após lavagem)

% de Remoção de mancha = (valor de L após lavagem-valor deL antes da lavagem)/(L0 algodão branco - valor de L antes da lavagem) χ 100%

Todos os experimentos foram feitos em quadruplicata.

As proteases foram testadas em um teste de lavagem especial-mente desenvolvido, usando três amostras de tecido de algodão diferentes,sujas com:

(a) leite, sangue e tinta (10,0 χ 7,5 cm; EMPA), designada comos números 116 solto e fixo (as manchas foram fixas a 20°C);

(b) meio de grama (10,0 χ 7,5 cm; Equest); e

(c) pigmento, óleo e leite (10,0 χ 7,5 cm designadas com os nú-meros C-10 C FT).

Estes experimentos são descritos em maior detalhe abaixo. Ostestes de lavagem foram executados em um Terg-O-Tometer modelo debancada (Teste padrão americano), equipado com seis vasos de teste deaço inoxidável. Os vasos de teste da aço inoxidável cada um continha 1,6 gde material base de TIDE® 2005 de detergente líquido, dissolvidos em 1000ml de água de 105 ppm/6 grãos por galão, e foram cada um carregados comseis da mesma amostra de tecido de algodão sujo e duas amostras de a-mostras de tecido de algodão extras (EMPA 221). Uma protease seleciona-da (por exemplo, metaloprotease neutra ou outra protease) foi adicionada acada vaso em uma concentração de 0,00 a 5,50 mg de proteína ativa porlitrc-de espumas.

Os lestes foram realizados durante 12 minutos a 15 °C/60 °F,com uma agitação de 100 rpm. Após lavar, as amostras de tecido foram en-xaguadas durante 3 minutos sob água de torneira fria e colocadas em umsecador por giro. As amostras de tecido de grama foram secadas ao ar ecobertas com roupa escura para limitar a sensibilidade das manchas degrama à luz. Todas as outras amostras de tecido foram passados a ferro.Todos os experimentos foram executados em quadruplicação.A refletância das amostras de tecido testadas foi medida comum Medidor Tristimulus Minolta CR-300 usando a equação L (L*a*b). Osvalores de desempenho de lavagem foram calculados usando a relação aseguir:

% de Remoção de mancha = (valor de L após lavagem-valor deL antes da lavagem)/(Lo algodão branco - valor de L antes da lavagem) χ 100%

Os resultados do ensaio de Terg-O-Tometer (TOM) para MUL-TIFECT® purificado estão mostrados na Figura 26, e comparados àquelesde subtilisina (BPN1 Y217L), uma serina protease alcalina. O TOM proveuum meio completamente operacional e válido para discriminar entre os de-sempenhos de lavagem diferentes de várias proteases (por exemplo, serinaproteases, metaloprotease neutra, e variantes das mesmas). Os testes deTOM que foram executados em BMI e superfície de grama meio-suja de E-quest com TIDE® 2005 como o detergente de material base.

Como indicado na Figura 26, foi evidente que a metaloproteaseneutra purificada desempenhou-se claramente melhor no teste de lavagemque a serina protease (BPN1 Y217L). Em particular, 2,75 ppm de metalopro-tease neutra purificada foram requeridos para mostrar um delta de remoçãode sujeira de ~ 10% comparados a apenas 0,55 ppm da serina protease(BPN1 Y217L) na mancha de grama de Equest. O desempenho de lavagemda metaloprotease neutra foi também testado em baixa temperatura e ob-servado desempenhar-se muito bem em tecido sujo de sólido de Equestmédio. Resultados similares foram obtidos com protease neutra purificadaMULTIFECT® comercialmente disponível como com o nprE recombinanteproduzido como descrito acima.

EXEMPLO 13

DESEMPENHO DE VARIANTES DE nprE EM ENSAIO DE DESEMPENHODE BMI-TIDE® 2X

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar o desem-penho de várias variantes de nprE no ensaio de BMI esboçado acima sãodescritos. Os métodos fornecidos pelo Exemplo 1 foram usados (Vide, "Mi-croswatch Assay for Testing Protease Performance"). Os resultados paravariantes multissubstituídas com índice de Desempenho maior que um (PI >1) e aquelas com índice de Desempenho menor que um (PI < 1) são forne-cidos nas Tabelas abaixo.

Na Tabela 13.1, dados obtidos para variantes de substituiçãosimples selecionadas no ensaio de desempenho de BMI-TIDE® 2X são for-necidos. A Tabela fornece índice de desempenho, que onde calculado comodescrito acima para as variantes, que mostram desempenho melhoradocomparadas à enzima de WT. Aquelas variantes tendo um índice de de-sempenho maior que 1 têm um desempenho melhorado.

Na Tabela 13.2, dados obtidos para variantes de multissubstitui-ção selecionadas no ensaio de desempenho de BMI-TIDE® 2X são forneci-dos. A Tabela fornece índices de desempenho, que onde calculado comodescrito acima para as variantes, que mostram desempenho melhoradocomparadas à enzima de WT. Aquelas variantes tendo um índice de de-sempenho maior que 1 têm um desempenho melhorado.

<table>table see original document page 140</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho para Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 141</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho para Todas as Varian- tes com índice de Desemoenho >1

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de DesemDenho para Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho para Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 146</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho Dara Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table><table>table see original document page 149</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho para Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 150</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desempenho oara Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 151</column></row><table>Tabela 13.1 -Resultados de Ensaio de Desemoenho oara Todas as Varian- tes com índice de Desempenho >1

<table>table see original document page 152</column></row><table> Tabela 13.2 - Resultados do Ensaio de Desempenho de TIDE para Todas as Variantes com índice de desempenho > 1

<table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table>Tabela 13.2 - Resultados do Ensaio de Desempenho de TIDE para Todas as Variantes com índice de desempenho > 1 Código de Variante L282M-Q286R BMI TIDE® 2X Detergente Líquido [índice Perf.] 1,69

<table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table>Tabela 13.2 - Resultados do Ensaio de Desempenho de TIDE para Todas as Variantes com índice de desempenho > 1

<table>table see original document page 157</column></row><table>Tabela 13.2 - Resultados do Ensaio de Desempenho de TIDE para Todas as Variantes com índice de desempenho > 1

<table>table see original document page 158</column></row><table>Tabela 13.2 - Resultados do Ensaio de Desempenho de TIDE para Todas as Variantes com índice de desempenho > 1

<table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table>

EXEMPLO 14

ESTABILIDADE DAS VARIANTES DE nprE

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para determinar aestabilidade de variantes de nprE são descritos. Nestes experimentos, osmétodos descritos antes do Exemplo 1 foram usados para determinar o ín-dice de desempenho (Vide, "Ensaios de estabilidade de NprE na presençade detergente" acima). As tabelas a seguir fornecem os resultados para a-quelas variantes com índice de Desempenho maior que um (Pl>1) testadocom e sem DTPA.

A estabilidade foi medida determinando a atividade de AGLAantes e após incubação em temperatura elevada. A tabela contém os valo-res de estabilidade relativa comparados a WT sob estas condições. É oquociente de (atividade de residual de Variante/atividade residual de WT).Um valor maior que um indica estabilidade mais alta na presença de deter-gente. Nas Tabelas 14.1 e 14.2, dados são fornecidos mostrando os dadosde estabilidade relativos de variantes de substituição simples de NprE comrelação à estabilidade da estabilidade de NprE de WT sob estas condições,com e sem DTPA.

Nas Tabelas 14.3 e 14.4, dados são fornecidos mostrando osdados de estabilidade relativa de variantes de substituição múltipla de NprEcom relação à estabilidade da estabilidade de NprE de WT sob estes condi-ções, com e sem DTPA.

Tabela 14.1 - Resultados de Estabilidade na Presença de 25% de TlDE® 2X com DTPA

<table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table>Tabela 14.1 - Resultados de Estabilidade na Presença de 25% de TIDE® 2X com DTPA

<table>table see original document page 163</column></row><table>Tabela 14.1 - Resultados de Estabilidade na Presença de 25% de TlDE® 2X

<table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table><table>table see original document page 167</column></row><table>Tabela 14.1 - Resultados de Estabilidade na Presença de 25% de TIDE® 2X com DTPA

<table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table>Tabela 14.1 - Resultados de Estabilidade na Presença de 25% de TIDE® 2X com DTPA

<table>table see original document page 170</column></row><table><table>table see original document page 171</column></row><table>Tabela 14.2 - Estabilidade de Variantes em TIDE® 2X Sem DTPA

<table>table see original document page 172</column></row><table><table>table see original document page 173</column></row><table>Tabela 14.2 - Estabilidade de Variantes em TIDE® 2X Sem DTPA Códiqo de variante Estabilidade na oresenca de TIDE 2xsem DTPA

<table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table>Tabela 14.2 - Estabilidade de Variantes em TIDE® 2X Sem DTPA

<table>table see original document page 176</column></row><table><table>table see original document page 177</column></row><table>Tabela 14.2 - Estabilidade de Variantes em TIDE® 2X Sem DTPA

<table>table see original document page 178</column></row><table> Tabela 14.3 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25% TIDE® 2X Com DTPA

<table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table>Tabela 14.3 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25% TIDE® 2X Com DTPA

<table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table>Tabela 14.3 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25%

<table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>Tabela 14.3 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25%

<table>table see original document page 184</column></row><table>Tabela 14.3 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25% TIDE® 2X Com DTPA

<table>table see original document page 185</column></row><table>

Tabela 14.4 - Resultados de Ensaio de Estabilidade Presença de 25% TIDE® 2X Sem DTPA

<table>table see original document page 185</column></row><table><table>table see original document page 186</column></row><table><table>table see original document page 187</column></row><table>TabeJa 14.4 - Resultados de Ensaio de Estabilidade na Presença de 25% TIDE® 2X Sem DTPA

<table>table see original document page 188</column></row><table><table>table see original document page 189</column></row><table><table>table see original document page 190</column></row><table><table>table see original document page 191</column></row><table>

Os dados na tabela a seguir (Tabela 14.5) representam os da-dos de estabilidade relativa de variantes de NprE com relação à estabilidadeda estabilidade de NprE de WT no ensaio de estabilidade de citrato. A esta-bilidade foi medida determinando a atividade de caseína determinando aatividade de AGLA antes e após incubação em temperatura elevada (Vide,"Ensaio de Estabilidade de Citrato" acima). A tabela contém os valores deestabilidade relativa comparados a WT sob estas condições. É apresentadocomo o quociente de (atividade residual de variante/atividade residual deWT). Um valor maior que um indica estabilidade mais alta na presença dedetergente.

<table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table>Tabela 14.5 - Resultados de Ensaio de Estabilidade de Citrato Código de variante Estabilidade relativa de citrato

<table>table see original document page 194</column></row><table><table>table see original document page 195</column></row><table><table>table see original document page 196</column></row><table><table>table see original document page 197</column></row><table>

EXEMPLO 15

PERFIL DE DESEMPENHO DE PH DE NPRE COMPARADO A BPN1 217L

Neste Exemplo, experimentos conduzidos são descritos paraavaliar o desempenho comparativo de nprE e BPN'Y217L. Nestes experi-mentos, EMPA 116 (BMI) e manchas de grama de Equest foram usadas.Materiais:

NprE1 8 mg/mlBPN1 Y217L, 25,6 mg/ml

pano de sujeira de EMPA 116, 7,62 * 11,43 cm (3" χ 4,5") (Test-fabrics)

Grama de Equest (med.), 7,62 χ 10,16 cm (3" χ 4") (WarwickEquest)

amostras de tecido de algodão branco de EMPA 221, 7,62 *11,43 cm (3" χ 4,5")

Minolta Chromameter CR200

TIDE® 2005 (fornecido por Procter & Gamble)

Concentrado de dureza de água: 15.000 grãos por galão (gpg),3:1 Ca:Mg

tampão de Bis-TRIS-propano a 1M

concentração de ácido sulfúrico

tanque de mistura de 50 L com espicho e agitador

Terg-O-Tometer

Água Dl

As amostras de tecido foram preparadas para tratamento. Trêsréplicas foram conduzidas por tratamento, com 18 amostras de tecido usa-das por tratamento. As amostras de tecido de grama foram preparadas emum quarto escuro para impedir desvanecimento. Os valores de refletânciade cerca de 18 amostras de tecido sujo foram obtidos usando um MinoltaChromameter. Três leituras por amostra de tecido foram obtidas. Os valoresde L, valor de L médio e desvio-padrão foram registrados. Este é o valor del—inicial·

A solução de detergente foi preparada coífio segue (f/ara 40 Ltotal). Preferiu-se preparar esta solução à noite antes de testar. A solução foiarmazenada no frio durante a noite. A solução foi preparada acrescentando39,724 Kg de água Dl em tanque de mistura de 50 L1 iniciando o agitador,misturando em 60 gramas de detergente líquido de TIDE®, misturando em16 ml de solução de dureza de água, e 200 ml de Bis-TRIS-propano a 1 M.O pH foi ajustado usando ácido sulfúrico concentrado (ajustado em 0,2 uni-dades de pH abaixo do pH desejado, se a solução fosse armazeanada du-rante a noite, à medida que o pH diminui durante a noite). As concentraçõesfinais foram: TIDE® = 1,5 g/L; dureza de água = 6 gpg; e Bis-TRIS-propano= 5 mM.

Para testar no Terg-O-Tometer, 1 L de solução de detergente foiadicionado a cada pote de Terg e deixado vir para a temperatura. Enzima foiadicionada aos potes em concentrações variadas. Para testes de BMI1 asconcentrações de enzima usadas foram 0 mg/L, 0,275 mg/L, 0,55 mg/ml,1,65 mg/L, 2,65 mg/L, e 5,50 mg/L. Para manchas de grama, as concentra-ções de nprE usadas foram 0 mg/L, 0,1925 mg/L, 0,385 mg/L, 1,155 mg/L,1,925 mg/L, e 3,85 mg/L (as concentrações de BPN' Y217L foram iguais à-quelas usadas nos testes de BMI). Agitação foi iniciada e as amostras detecido foram adicionadas. Todas as réplicas foram passadas de lado a ladono mesmo Terg-O-Tometer (por exemplo, 0X & 1/2 X na 1a corrida, 1X & 3Xna 2-corrida, e 5X & 10X na 3a corrida). A temperatura foi de 15°C, a veloci-dade de agitação foi de 100 cpm, e o tempo de lavagem foi de 12 minutos.As amostras de tecido tratadas foram enxaguadas três vezes em 4 L de á-gua de torneira (gpg de ~6). As amostras de tecido foram secadas ao ar du-rante a noite com toalhas de papel. As amostras de tecido de grama foramcobertas com toalhas de papel e deixadas secar em um quarto escurecido.Os valores de refletância das amostras de tecido secadas foram determina-dos como descrito acima. Três leituras foram obtidas por amostra de tecido.Os valores de L, valor de L médio e desvio-padrão foram registrados. Este éo valor de Lfinal.

A porcentagem de remoção de sujeira (% SR) foi determinadapara cada condição de testagem e ambas as eximas usando a equaçãoabaixo:

<formula>formula see original document page 199</formula>

onde: L0 = refletância das amostras de tecido purasLinicial = refletância das amostras de tecido sujasLfinal = refletância das amostras de tecido lavadasO delta de % SR em nenhum controle de enzima foi determina-do usando a fórmula a seguir:

<formula>formula see original document page 200</formula>

BPN1 Y217L foi comparado a nprE em EMPA 116 (BMI), nosvalores de pH de 6,7, 7,5, 8,5, e 9,5. O desempenho de nprE em EMPA 116pareceu formar pico em cerca de pH 8, enquanto o desempenho de BPN'Y217L formou pico em cerca de pH 8,8. Os resultados mostraram que nprEdesempenhou-se melhor que BPN' Y217L em pH 7,5 e 8,5, embora não de-sempenhou-se tão bem quanto BPN1 Y217L em pH 6,7. O desempenho des-tas enzimas foram iguais em pH 9,5. Além disso, não houve nenhuma dife-rença no desempenho destas enzimas em grama de Equest (med) em pH7,8-8,4.

EXEMPLO 16

COMPARAÇÃO DE ENZIMAS DE PMN E DE nprE EM DETERGENTE LÍ-QUIDO

Este Exemplo descreve experimentos de limpeza para determi-nar o desempenho de limpeza de PMN e nprE. O desempenho de limpezadas enzimas de PMN e de nprE foi testado em detergente de TIDE® Líquidocomparado com uma serina protease de ponto de-referência (Protease A)em manchas sensíveis à protease. Como mostrado na tabela abaixo, PMN enprE removem manchas muito melhor que protease A, até mesmo em bai-xos níveis de enzima. Nas Tabelas a seguir, os valores de SRI mais altosindicam um desempenho de limpeza melhor.

<table>table see original document page 200</column></row><table><table>table see original document page 201</column></row><table>

<table>table see original document page 201</column></row><table>

<table>table see original document page 201</column></row><table>

EXEMPLO 17

Termoestabilidade de NprÉ e Variantes de NprE

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para determinar atermoestabilidade de NprE e variantes de NprE são descritos. As enzimasforam produzidas e purificadas como descrito acima. As proteínas purifica-das foram julgadas ser suficientemente homogêneas, com maior que 95%de pureza como determinado usando 10% de SDS-PAGE, como apenasuma proteína principal foi observada no gel. Esta proteína foi cerca de 32kDa que é o peso molecular da seqüência de nprE madura. A proteína foiformulada para armazenamento usando 25 mM de tampão de MES, pH 5,8,contendo 1 mM de cloreto de zinco, 4 mM de cloreto de cálcio, e 40% depropileno glicol. Os ensaios usados nestes experimentos foram o ensaio deprotease usando atividade de fluorescência de AGLA descrita acima e calo-rimetria diferencial de varredura (DSC), descrita abaixo.

CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE VARREDURA (DSC)

Curvas de capacidade de calor excessivo, foram medidas usan-do um microcalorímetro de processamento alto de varredura ultra-sensívelde DSC de VP-Cap (Microcal). O procedimento-padrão para medições deDSC e a teoria da técnica são bem-conhecidos àqueles versados na técnica(Vide por exemplo, Freire, 1995) Meth. Mol. Biol., 41, 191-218 [1995]). Bre-vemente, aprox. 500 uL de 200-400 ppm de amostras de proteína concen-tradas puras ou ultrafiltradas (UFC) foram necessários. Tipicamente, 400ppm de NprE e as proteínas variantes (na ausência e presença 130 mM decitrato) foram varridos em faixa de temperatura de 20-1 OOsC usando umataxa de varredura de 200eC/h em 5 mM de tampão de HEPES, pH 8,0. Amesma amostra foi depois revarrida para verificar a reversibilidade do pro-cesso. Para NprE, o processo de desdobramento térmico foi irreversível.Dados de dependência da taxa de varredura da fundição térmica para NprEforam avaliados em uma taxa de varredura de 25 a 200-C/h. O efeito de vá-rios aditivos (por exemplo, alcoóis primários e secundários, sais, ciclodextri-na, PEG, sorbitol, glicerol) no ponto de fusão térmica de NprE foram tam-bém avaliados.

RESULTADOS

A estabilidade térmica de NprE do tipo selvagem fôi determinadaem duas concentrações diferentes para mostrar o efeito de concentração deproteína no ponto de fusão térmica. Os valores de Tm para 220 ppm e 440ppm foram determinados ser 67,6 ± 0,5 e 69,2 ± 0,55C, respectivamente. Oefeito da concentração de proteína realça um evento de segunda-ordem. Écontemplado que isto seja ou agregação ou autólise. Porém, não é intencio-nado que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismo particu-lar. No entanto, estes resultados indicam que para uma determinação preci-sa e qualquer comparação de pontos de fundição térmica para NprE requerque as concentrações de proteína sejam bem emparelhadas. O efeito dataxa de varredura no ponto de fusão térmica também mostrou uma depen-dência onde a Tm foi dependente da taxa de varredura até 1509C/h, e depoisnivelado entre 150-200eC/h. Com base nestes resultados, 200sC/h foi sele-cionado como a taxa de varredura superior para todos os estudos para mi-nimizar a dependência da Tm sobre a taxa de varredura.

Todos os dados colhidos para NprE e variantes estão mostradosna Tabela 4. Tabela 4 também inclui os pontos de fundição térmica de DSCobtidos para NprE e variantes na presença de 130 mM de citrato. Na maioriados casos, duas concentrações de proteína foram varridas. Como indicadonesta Tabela, no caso das varreduras na presença de 130 mM de citratonem todas as proteínas mostraram um perfil de desdobramento térmico.

Tabela 17. Resultados de DSC

<table>table see original document page 203</column></row><table>Tabela 17. Resultados de DSC

<table>table see original document page 204</column></row><table>Tabela 17. Resultados de DSC <table>table see original document page 205</column></row><table>Tabela 17. Resultados de DSC

<table>table see original document page 206</column></row><table>

Uma Figura representativa dos perfis de desdobramento térmico

(varredura de DSC) para tipo selvagem e vários mutantes de NprE são mos-trados na Figura 27. Os perfis de desdobramento indicam o ponto central dotipo selvagem e mostram mutantes seletivos que exibem pontos de fundiçãotérmica aumentados com relação ao do tipo selvagem e aqueles que exibempontos de fundição diminuídos com relação ao do tipo selvagem. Esta Figu-ra claramente destaca que o DSC se distinguiu entre as variantes de NprEestáveis e menos estáveis, e é útil como uma triagem secundária. Uma ten-dência geral é observada entre os pontos de fundição térmica das variantese sua estabilidade em detergente. Por exemplo, as variantes S66E, S199E,D220P/E, S129I/V são todas vencedoras em TIDE® e mostram um aumentoaproximado de 1eC no ponto de fusão térmica com relação ao NprE do tiposejvagem. Este aumento de 1SC no ponto de fusão térmica ainda é pducosignificativo, visto que estabilidade térmica tipicamente requer substituiçõesde aminoácido múltiplas.

Figura 28 mostra o desdobramento térmico de variantes de N-prE que exibem um perfil de desdobramento térmico na presença de 130mM de citrato. Citrato é um componente de detergente que rapidamentecausa o autólise de NprE, na ausência de cálcio. Para NprE do tipo selva-gem, não há nenhum perfil de desdobramento térmico na presença de citra-to que é consistente com uma proteína que já é desdobrada ou carece deum núcleo hidrofóbico bem formado. Mutantes que exibem um perfil de des-dobramento térmico na presença de citrato são incluídos na Tabela 17. Es-tas variantes têm pontos de fundição térmica na faixa de 47 - 56eC. A varre-dura de DSC na presença de 130 mM de citrato indicou variantes que sãomais estáveis que NprE do tipo selvagem para citrato. Por exemplo, varian-tes estáveis em citrato são mostradas conter S129I ou S129V e combinató-rias contendo qualquer uma destas substituições mostram um aumento de +5eC no ponto de fusão térmica.

Efeito de Aditivos nos Pontos de Fusão térmica de NprE

Figura 29 mostra os resultados de experimentos incluindo váriosaditivos. O tampão era 5 mM de HEPES1 pH 8,0. As amostras foram varri-das de 20 - 100eC usando uma taxa de varredura de 2009C/h. Nesta Figura,a linha horizontal representa a Tm para NprE do tipo selvagem sem aditivo.Nestes experimentos, os dados mostraram pouco ou nenhum efeito no pon-to de fusão térmica (Tm) de NprE na presença destes reagentes. A inclusãode um inibidor de atividade de NprE, a saber fosforamidon, foi mostradoaumentar a Tm e, aprox. 1eC, sugerindo que o inibidor possa dar alguma es-tabilização a NprE contra o processo de desdobramento térmico. Nenhumadas condições acima ajudou a tornar o processo de desdobramento térmicoreversível. Porém, não é intencionado que a presente invenção seja limitadaa qualquer mecanismo particular.

EXEMPLO 18

ESTABILIDADE DE HOMÓLOGO DE NprE EM TIDE® E DESEMPENHODE LAVAGEM DE BMI HOMÓLOGO

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para avaliar a estabi-lidade de homólogos de nprE em TIDE®, como também o desempenho delavagem destes homólogos são descritos. NprE purificado ("NprE"), NprE deBacillus subtilis (NprE de B.S.), NprB Bacillus thuringiensis (NprB de B.T.) etermolisina de Bacillus thermoproteolyticus (TLN) foram incubados em 200 ulde 25% TIDE em 10 mM de HEPES, pH 8 a 10 ug/ml a 25eC por 90 min. Asatividades iniciais e atividades restantes foram medidas usando o ensaio deAGLA, como descrito acima. Brevemente, foram adicionados 10 ul de amos-tra em 200 ul de tampão de AGLA (50 mM de MES, pH 6,5, 0,005% deTWEEN®-80, 2,5 mM de CaCI2), depois 10ul de amostra diluída foram adi-cionados em 200 ul de substrato de AGLA (2,4 mM de Abz-AGLA-Nba emtampão de AGLA). A excitação a 350nm e emissão a 415 foram monitora-das nm durante os primeiros 100 segundos, o declive inicial foi registradocomo a atividade da enzima. O percentual de atividade restante foi calcula-do dividindo a atividade restante em atividade inicial. Figura 30 fornece umgráfico que mostra a atividade restante após 90 minutos.

Para determinar o desempenho de lavagem destes homólogosem TIDE®, uma microamostra de tecido de BMI pré-lavada foi adicionadaprimeiro em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades. Depois, 190 ulde 1x TIDE® em pó (780 ug/ml de TIDE® em pó, 5 mM de HEPES, pH 8, 6gpg de dureza de água) foram adicionados. Depois, 10 ul de NprE purifica-do, NprE de Bacillus subtilis, NprB de Bacillus thuringiensis e termolisina deBacillus thermoproteolyticus foram aidicionados aos cavidades para produziruma concentração de enzima final de 0,25 ug/ml. A placa foi incubada a25eC por 30 min com agitação a 1400rpm em Thermomixer. Ao término deincubação, 100ul de sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96cavidades nova. A OD a 405 nm de sobrenadante foi depois medida. A ODdo sobrenadante foi subtraída com a OD de um controle em branco semadição de enzima. O índice de desempenho foi calculado dividindo a OD decada homólogo pela OD de NprE. Figura 31 fornece um gráfico que mostrao BMI foi desempenho de NprE, como também os homólogos de nprE des-critosaqui.

EXEMPLO 19

ANÁLISE DE METAL DE nprE DO TIPO SELVAGEM E VARIANTES

Neste Exemplo, experimentos conduzidos para determinar o teorde zinco e cálcio de nprE e variantes de nprE são descritos. Nestes experi-mentos, análise de metal de traço total através de espectrometria de massade plasma inductivamente acoplado (ICPMS) e emissão de raio X de partí-cula induzida com um feixe microfocalizado (micro-PIXE) foi executada paraconfirmar o teor de zinco e cálcio de NprE. Em geral, um íon de zinco e doisde cálcio estão firmemente ligados.

Todas as amostras de ICPMS e de micro-PIXE foram prepara-das em tampão livre de metal para remover qualquer contaminante de metalexógeno. Tipicamente, 250 uL de 40 mg/ml das amostras de NprE tiveram otampão trocado por três vezes com 20 mM de HEPES, pH 8,2 usando apa-relho de microdiálise YM-10. Tampão de metal livre foi gerado passando otampão através de uma coluna acondicionada com resina Chelax 100. Aconcentração de proteína final foi determinada usando kit de ensaio de de-terminação de proteína de ácido bicinconínico (ensaio de BCA) de Sigma.As amostras de ICPMS foram analisadas emWest Coast Analytical Servies,Inc. As amsotras de Micro-PIXE foram analisadas no Laboratório de Análisede Feixe de íons.

Tabela 19-1 mostra os resultados da análise de metal de ICPMSpara íons de cálcio e zinco de NprE do tipo selvagem. Com relação à con-centração de proteína, dois íons de cálcio e dois íons de zinco foram obser-vados estar presentes na amostra.

<table>table see original document page 209</column></row><table>

O diagrama de análise de composição elementar de MicroPIXEmediu os teores ós metal com relação a uma proteína padrão interna. Todosos picos detectados usando Micro-PIXE foram calculados com relação aopico de enxofre que surge de três metioninas no caso de NprE. Um pico deíon de cloreto grande observado foi devido à presença de sal em tampão.

Tabela 18-2 mostra o teor de metal determinado por Micro-PIXE,que indica que em geral, NprE contém dois íons de cálcio e um íon de zincofirmemente ligados por molécula de proteína. NprE do tipo selvagem mos-trou 1 íon de zinco com 2 íons de cálcio. É contemplado que íons de cálciopossam ser mostrados em uma baixa taxa de ocupação devido à prepara-ção da amostra. S58D e T60D mostraram perto de dois íons de zinco porproteína indicando um possível íon de zinco extra que liga ao sítio. A varian-te dupla tem duas cisteínas adicionadas somando à precisão da técnica.

Porém, não é intencionado que a presente invenção seja limitada a qualquermodalidade particular com um número específico de íons.

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Consistente com outras proteases neutras bem-caracterizadasde cálcio e zinco dependentes tais como termolisina ou proteases seme-lhantes à termolisina (TLPs)(Vide por exemplo, Dahlquist et al., Biochem., 15:1103-1111 [1976]; Srpingman et al., (1995) Biochemistry 34, 15713-15720 [1995]; e Willenbrock et al., (1995) FEBS Lett. 358:189-192 [1995]),NprE foi observado conter pelo menos dois íons de cálcio e um íon de zincofirmemente ligados por molécula. Um terceiro sítio de ligação de cálcio po-tencial é proposto mas esperado ser muito fraco. Uma vez que todas as amostras foram dessalgadas para remover qualquer metal exógeno, estessítios de cálcio de ligação fraca são esperados ficar desocupados.

EXEMPLO 20

ESTABILIZANDO Npre COM FORMATO DE CÁLCIO EM DETERGENTEDE HDL DE TIDE® EM PÓ-COMPACTO Neste Exemplo, experimentos conduzidos para desenvolvermeios de estabilizar NprE em detergente de HDL TIDE® em pó-compactosão descritos. Nestes experimentos, os meios de estabilizar NprE aumen-tando o nível de formato de cálcio a uma concentração de citrato fixa en-quanto diminuindo teor de DTPA em formulação de TIDE® experimental empó ("TIDE® 2x") foram investigados. Um projeto estatístico de metodologiade experimentos (DOE) foi usado para simplificar os experimentos comotambém as análises de dados. Foi mostrado que DTPA presente em TIDE®adversamente afeta estabilidade de NprE, enquanto adição de formato decálcio ajuda a superar o efeito prejudicial na formulação de resistência com-pleta de TIDE® em pó-compacto.

Um modelo de superfície de resposta de compósito central totalcom pontos centrais duplicados foi usado como um método de DOE. Umtotal de 16 formulações únicas que variam em quatro componentes forampré-feitas de acordo com as variações de composição listadas na Tabela19.1. LAS foi variada de 0-6% (p/p) com DTPA (0-0,25%) e formato de cál-cio (0-0,2%) a uma concentração fixa de ácido cítrico (1,9%). Todos os ou-tros componentes do detergente de TIDE® constantes foram retidos. Ascondições de limite de concentração de componente foram determinadascom base na estabilidade de fase das várias misturas. Os testes de estabili-dade de proteína foram conduzidos com 780 ppm de nprE na mistura deformulação de resistência completa (-100%) e incubada a 32eC. Inativaçãofoi medida até 24 horas. Todos os ensaios foram feitos usando kit de ensaiode caseína marcado fluorescente vermelho (Invitrogen) com concentraçãode proteína de 0,5 ppm. Taxas de inativação de NprE foram medidas emtrês experimentos independentes. Os dados de DOE foram analisados u-sando o DOE Pusion Pro (matriz S).

Tabela 20.1. Composição das 16 Formulações de TIDE® Usadas Dara Es- tudos de DOE

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Tabela 20.1. Composição das 16 Formulações de TIDE® Usadas oara Es- tudos de DOE <table>table see original document page 212</column></row><table>

Tabela 20.2 e Figura 31 mostram os resultados das mediçõesde estabilidade de NprE em várias misturas de formulação. Taxas médias eo desvio-padrão foram a taxa de inativação ponderada de NprE (hora'1) detrês medições independentes. Qualitativamente, as formulações com baixoteor de DTPA com carga de cálcio alta tendem a ser mais estáveis em Tl-DE® em pó de resistência completa. Como um exemplo, Formulação Ng 5,sem adição de DTPA e nível de formato de cálcio alto, mostrou a taxa deinativação mais baixa, indicando estabilidade de NprE alta. Em contraste,Formulação N° 9, com concentração de DTPA alta sem formato de cálcioadicionado mostrou estabilidade mais baixa. Na Tabela 20,2, a classificaçãoé com base na estabilidade medida (isto é, taxas ponderadas). Operaçõessão de três experimentos de estabilidade independentes.

Tabela 20.2. Taxas de Inativação de NorE em 16 Misturas cie Formulação

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Figura 33 mostra os efeitos de inativação de NprE por DTPA em

níveis variados de concentração de formato de cálcio fixa. Painel A mostrataxa de inativação de NprE por DTPA sem qualquer formato de cálcio adi-cionado. A correlação mostra que DTPA tem efeito prejudicial significativo.

Painel B mostra algum efeito de DTPA diminuído com 0,1% de formato decálcio. Painel C mostra efeito significativamente diminuído de DTPA com0,2% de formato de cálcio.

Figura 34 mostra software de análise de DOE (Fusion Pro) ge-rada por perfil de predição de DTPA e composição de formato de cálcio com

base em meta resposta (taxa de decaída) de menos de 0,5 hr'1 (Painel A),0,25 h"1 (Painel B) e 0,05 h'1 (Painel C). As áreas sombreadas indicam ra-zões de composição de formato de DTPA e cálcio que são prognosticadaspara mostrar estabilidade com taxa de decaída abaixo da meta fixada. Porexemplo, 0,16% de formato tlé cálcio na presença de 0,04% de DTPA pro-porcionaria estabilidade de taxa de decaída NprE de menos de 0,25 hora'1como mostrado no Painel B da Figura 34. Por outro lado, 0,08% de formatode cálcio não pode sustentar a estabilidade de NprE com taxa de decaídade pelo menos 0,25 hora"1 na presença de 0,16% de DTPA.EXEMPLO 21

Identificação dos Sítios autolíticos induzidos por Citrato para NprE de Meta-loprotease Neutra de B. amvloliauefaciensNeste Exemplo, métodos usados para avaliar a autólise induzidapor citrato de nprE variante do tipo selvagem e recombinante (por exemplo,Variante de B. subtilis) são descritos. Nestes experimentos, autólise da me-taloprotease neutra de B. amyloliquefaciens (natural e a variante recombi-nante expressa em B. subtilis) foi induzida usando citrato de sódio (Sigma).O processo de autólise foi controlado executando a reação a 4eC em 25 mMde MES, pH 6,5, tampão. Nestes experimentos, a autólise de 0,4 mg/ml deNprE foi otimizado variando: (a) o tempo de incubação (10-100 minutos) em10 mM de citrato; ou (b) a concentração de citrato (10-100 mM) em 100 mi-nutos. Um controle de metaloprotease neutra diluída sozinho em tampão(isto é, nenhum citrato) foi incubado sob condições similares. As reaçõesautolítica foram feitas por adição de um volume igual de 1N de HCI, as a-mostras foram precipitadas usando TCA e o pélete foi lavado e secado u-sando acetona. O pélete resultante foi ressuspenso em 20 uL de tampão,pH 6,5, e 4X LDS amostra tampão (NuPage, Invitrogen)

Os fragmentos autolíticos foram ressolvidos por 10% (p/v) deSDS-PAGE e eletrotingidos sobre uma membrana de PVDF. Os primeiros10 resíduos de aminoácido foram seqüencitdos através de degradação deEdman (Argo Bioanalytica). As seqüências de aminoácidos parciais dosfragmentos autolíticos foram determinadas usando digestão em gel de trip-sina e analisadas usando LCQ-MS (Agilent). O processo de digestão em gelenvolveu maceração do pedaço de gel que continha a proteína, remoção dacoloração Coomassie azul seguida por reidratação dos pedaços de gel em25 mM de NH4CO3 contendo 2 M de uréia. Tripsina foi adicionada aos peda-ços de geKreidratados^por aprox. 6 horas á 37eC. Seguindo a digestão, ospeptídeos foram extraídos usando acetonitrila e TCA. Os peptídeos foramseparados em uma coluna de C4-hidrofóbica (Vydac) usando um gradientede acetonitrila - água. Os mapas de peptídeo resultantes foram pesquisadoscom o programa de pesquisa de base de dados de SEQUEST® junto a umabase de dados contendo enzimas de Genencor.

As seqüências de aminoácido dos primeiros 10 aminoácidos decada um dos fragmentos foram comparadas com a seqüência de aminoáci-do conhecida como NprE de B. amyloliquefaciens. Isso permitiu a identifica-ção do aminoácido nos términos N e conseqüentemente o(s) sítios(s) declivagem).

A geração dos fragmentos induzidos por citrato e sua resoluçãoforam mostradas em 10% de SDS-PAGE. Os tamanhos dos fragmentos fo-ram identificados usando um marcador de peso molecular padrão de Invitro-gen. Na presença de 10 mM de citrato, dois fragmentos além de NprE intac-to restante foram observados na faixa de tempo de 100 minutos. Os doisfragmentos formados em concentração baixa de citrato foram observadosser 24 kDa e 9 kDa em tamanho. O nprE intacto é 32 kDa. A faixa de tempode 100 minutos resulta em uma proporção boa de proteína clivada (isto é, osfragmentos de autólise primária). Nenhum fragmento adicional foi observadoou detectado sob estas condições. Um estudo foi executado por 100 minu-tos na presença de citrato crescente para obter os fragmentos autolíticossecundários. Neste experimento, quando concentrações entre 10-30 mMde citrato foram usadas, dois fragmentos descritos acima foram observados.Em 40 mM de citrato, exceto os fragmentos maiores de 24 kDa eram eviden-tes porém um fragmento de 15 kDa foi também evidente. Entre 50- 100 mMde citrato, o fragmento de 24 kDa e os fragmentos de 9 kDa já não erammais detectados mas três outros fragmentos, de tamanhos 21 kDa, 15 kDa e11 kD, foram observados.

A identidade dos términos do 24 kDa, 9 kDa (primeiros doisfragmentos), e os 21 kDa, 15 kDa e 11 kDa (os próximos fragmentos autolí-ticos) foi determinada usando degradação de Edman (Argo Bioanalytica).

Tabela 21. Seqüência N-terminal de Fraamentos

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Bandas Α1, A3 e Α4 têm a seqüência N-terminal nativa que em-parelha o término N para o NprE intacto. O relatório de seqüenciação paraBanda A2 mostrou três fragmentos onde a seqüência menos intensa pareciaser idêntica à seqüência mais intensa, exceto a que tinha dois resíduos e umresíduo mais curto que as mais intensas seqüências, respectivamente. Issofoi consistente com um desafio daquele fragmento de proteína particular. Opadrão e os tamanhos dos fragmentos de gel sugerem que o fragmento de15 kDa (Banda A4) pode ser derivado do 21 kDa (Banda A3) e conseqüen-temente õ término C é deduzido para estar na ou próximo da posição 198.Porém, não é intencionado que a presente invenção seja limitada a estamodalidade particular.

Figura 35 provê as seqüências de aminoácido para os váriosfragmentos (1-5 ou A1-5 para propósitos de seqüenciação N-terminal).Fragmento 1 (A1) tem os resíduos N-terminais equivalentes àquela proteínanativa intacta (SEQ ID NO: 222), término N do fragmento 2 (Ad2) inicia emou perto de D220 (SEQ ID NO: 223). Os seguintes dois resíduos de aminoá-cido (A221 e G222) são também destacados porque este fragmento foi iden-tificado como sendo desfiantes. Fragmento 3 (A3) (SEQ ID NO: 224) efragmento 4 (A4) (SEQ ID NO: 225) têm o término N da proteína intacta,.efragmento 5 (A5) (SEQ ID DNO:226)'começa er§ L198. O término C dofragmento 4 é provavelmente de estar em ou perto de M138 (com base nadiferença de tamanho entre A3 e A4). O fragmento correspondente para A3não foi detectado.

Digestão de tripsina seguida por LCQ-MS dos mapas de peptí-deo para fragmentos 1 a 5 positivamente identificou vários peptídeos de a-minoácido dentro dos respectivos fragmentos. Isto é destacado na Figura35. O LCQ-MS proveu um controle positivo para a identidade dos fragmen-tos.

Com base na análise N-terminal e de LCQ-MS dos fragmentosde clivagem, sítios de clivagem primários foram identificados nas posiçõesde aminoácido D220, A221, G222, M138, e L198. Estes sítios foram alveja-dos usando mutagênese dirigida e bibliotecas de avaliação de sítio de D220,A221, G222, L198, e M138, D139 foram criadas. As proteínas mutantes fo-ram tríadas para estabilidade crescente em detergente e para desempenhode lavagem de BMI, como indicado aqui. Em algumas circunstâncias, os a-minoácidos ao lado destes sítios foram também selecionados para criaçãode proteína, para assegurar que o sítio de Iigador fosse alvejado de fato.

Os resultados da criação de proteína claramente indicaram quesubstituições de aminoácido ou Pro ou Glu em D220 geraram uma moléculade NprE que é mais estável em detergente. Além disso, estabilidade adicio-nal foi dada à molécula de NprE substituindo G222 com Cys, e M138 comIle ou Leu. Em geral, estas substituições de aminoácido específicas fornece-ram vantagens de estabilidade de detergente de NprE sem o desempenhode lavagem de BMI que é comprometido. Desse modo, estes experimentosprovêem dados de mapeamento importantes para os sítios de autólise indu-zida por citrato, facilitando a identificação de resíduos de aminoácido fun-damentais que alteram e afetam a estabilidade geral de NprE. Citrato (umbuilder acrescentou à matrizes de detergente) desestabiliza e realiza autóli-se de NprE e é sugerido fazê-lo quelando os átomos essenciais ligados aocálcio. A aplicação de NprE em condições de detergente extremas requerque uma molécula de NprE mais estável seja usada nestes cenários. Nestesexperimentos, substituições de um ou mais dos sítios autolíticos de NprEresultarão em uma molécula de nprE mais estável a detergente para o usonestes detergentes extremos.

EXEMPLO 22

COMPOSIÇÕES DE DETERGENTE PE LAVAGEM DE ROUPA LÍQUIDO

Neste Exemplo, várias formulações para composições de deter-gente de lavagem de roupa líquido são fornecidas. As composições de de-tergente de lavagem de roupa líquido a seguir da presente invenção sãopreparadas:

<table>table see original document page 218</column></row><table><table>table see original document page 219</column></row><table>

N-1: adicionar de sol. aq. de HCI a 1N. para ajustar o pH líquidoda fórmula na faixa de cerca de 3 a cerca de 5.

O pH dos Exemplos acima 22(l)-(ll) é cerca de 5 a cerca de 7, ede 22(III)-(V) é cerca de 7,5 a cerca de 8,5.

EXEMPLO 23

COMPOSIÇÕES DE DETERGENTE LÍQUIDO PARA DE LAVAGEM DE PRATO À MÃO

Neste Exemplo, várias formulações de detergente líquido paralavagem de prato à mão são fornecidas. As composições detergente líqui-das para lavagem de prato à mão a seguir da presente invenção:

<table>table see original document page 219</column></row><table><table>table see original document page 220</column></row><table>

O pH dos Exemplos 23(I)-(VI) é cerca de 8 a cerca de 11.

EXEMPLO 24

COMPOSIÇÕES DE DETERGENTE LÍQUIDO PARA LAVAGEM DE PRA-TOS AUTOMÁTICA

Neste Exemplo, várias formulações de detergente líquido de la-vagem de pratos automática são fornecidas. As composições de detergentelíquido de lavagem de pratos à mão a seguir da presente invenção:

<table>table see original document page 220</column></row><table><table>table see original document page 221</column></row><table>

EXEMPLO 25

COMPOSIÇÕES DE LAVAGEM DE ROUPA GRANULARES E/OU DE TA-BLETE

Este Exemplo fornece várias formulações para detergentes delavagem de roupa granulares e/ou de tablete. As composições de lavagemde roupa a seguir de presente invenção que pode ser na forma de grânulosou tablete são preparadas.

<table>table see original document page 221</column></row><table><table>table see original document page 222</column></row><table>

* Perfume, tintura, abrilhantador / SRP1 / carboximetilcelulose de Na / foto-alvejante / MgSO4 / PVPVI / supressor de espumas / PEG de peso molecu-lar alto / argila.EXEMPLO 26

DETERGENTES DE LAVAGEM DE ROUPA LÍQUIDOS

Este Exemple provê várias formulações para detergentes delavagem de roupa líquidos. As formulações de detergente de lavagem deroupa líquido a seguir da presente invenção são preparadas:

<table>table see original document page 222</column></row><table><table>table see original document page 223</column></row><table><table>table see original document page 224</column></row><table>

EXEMPLO 27

DETERGENTES DE LAVAGEM DE PRATOS DE DENSIDADE ALTA

Este Exemplo provê várias formulações para detergentes delavagem de pratos de densidade alta. Os detergentes de lavagem de pratosde densidade alta em pó a seguir da presente invenção são preparados:

<table>table see original document page 224</column></row><table><table>table see original document page 225</column></row><table>

* Abrilhantador / tintura / SRP1 / carboximetilcelulose de Na / fotoalvejante /MgSO4 / PVPVI / supressor de espumas / PEG de peso molecular alto / argi-la.

O pH dos Exemplos 27(I) a (VI) é de cerca de 9,6 a cerca de 11,3.

EXEMPLO 28

COMPOSIÇÕES DE DETERGENTE EM TABLETE

Este Exemplo fornece várias formulações de detergente em ta-blete. As composições de detergente em tablete a seguir da presente inven- ção são preparadas por compressão de uma composição de detergente delavagem de pratos granular a uma pressão de 13KN/cm2 usando uma 12prensa giratória de cabeça padrão:

<table>table see original document page 225</column></row><table><table>table see original document page 226</column></row><table>

* Abrilhantador / SRP1 / carboximetilcelulose de Na / fotoalvejante / MgSO4 /PVPVI / supressor de espumas / PEG de peso molecular alto / argila.

O pH dos Exemplos 28(l) a 28(VII) é de cerca de 10 a cerca de11,5; pH de 15(VIII) é de 8-10. O peso de tablete dos Exemplos 28(l) a28(VIII) é de cerca de 20 gramas a cerca de 30 gramas.EXEMPLO 29

DETERGENTES DE LIMPEZA LÍQUIDOS DE SUPERFÍCIE DURA

Este Exemplo provê várias formulações para detergentes delimpeza líquidos de superfície dura. As composições de detergente líquidode limpeza de superfície dura da presente invenção são preparadas:

Composto

Formulações

<table>table see original document page 227</column></row><table>O pH dos Exemplos 29(1) a (VII) é de cerca de 7,4 a cerca de9,5.

Embora as modalidades particulares da presente invenção te-nham sido ilustradas e descritas, será evidente para aqueles versados natécnica que várias outras alterações e modificações podem ser feitas semdivergir do espírito e escopo da invenção. É intencionado portanto abrangernas reivindicações em anexo todas tais alterações e modificações que estãodentro do escopo desta invenção.

Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório des-critivo são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica ao qual a in-venção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadaspor referência na mesma extensão como se cada publicação individual fos-se específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

Tendo descrito as modalidades preferidas da presente invenção,parecerá àqueles normalmente versados na técnica que várias modificaçõespodem ser feitas nas modalidades descritas, e que tais modificações sãointencionadas estar dentro do escopo da presente invenção.

Aqueles versados na técnica facilmente apreciarão que a pre-sente invenção é bem-adaptada para realizar os objetivos e obter os fins evantagens mencionados, como também aqueles inerentes a ela. As compo-sições e métodos descritos aqui são representativos das modalidades prefe-ridas, são exemplares, e não são intencionado como limitações no escopoda invenção. É facilmente evidente a alguém versado na técnica que substi-tuições e modificações variadas podem ser feitas à invenção descrita aquisem divergir do escopo é espírito da invenção.

A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser adequada-mente praticada na ausência de qualquer/quaisquer elemento ou elementos,limitação ou limitações que especificamente não são descritas(os) aqui. Ostermos e expressões que foram empregados são usados como termos dedescrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção que no uso de taistermos e expressões exclua quaisquer equivalentes das características mos-tradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que váriasmodificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.Desse modo, deveria ser entendido que embora a presente invenção tenhasido especificamente descrita por modalidades e características preferidasopcionais, modificação e variação dos conceitos aqui descritos podem serclassificados por aqueles versados na técnica, e que tais modificações evariações são consideradas estar dentro do escopo desta invenção comodefinida pelas reivindicações em anexo. A invenção( foi descrita de formaampla e genericamente aqui. Cada uma das espécies mais estreitas e agru-pamentos subgenéricos que caem dentro da revelação genérica tambémfazem parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção comuma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gêne-ro, independente se ou não o material retirado é especificamente citado a-qui.

Claims (49)

1. Metaloprotease neutra isolada tendo estabilidade sob arma-zenamento melhorada, em que a dita metaloprotease neutra é uma metalo-protease neutra de Bacillus.

2. Metaloprotease neutra de acordo com a reivindicação 1, emque o dito Bacillus é B. amyloliquefaciens.

3. Metaloprotease neutra de acordo com a reivindicação 1, emque a dita metaloprotease neutra tem pelo menos 45% de identidade de a-minoácido com a metaloprotease neutra compreendendo SEQ ID NO: 3 ouSEQ ID NO: 18.

4. Metaloprotease neutra de acordo com a reivindicação 1, emque a dita metaloprotease neutra compreende a seqüência de aminoácidoexposta na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 18.

5. Seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma por-ção da metaloprotease neutra como definida na reivindicação 1, em que adita seqüência de nucleotídeo é selecionada das SEQ ID NOS: 1, 2, 12, e 13.

6. Vetor de expressão compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 3.

7. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão co-mo definido na reivindicação 6.

8. Metaloprotease neutra estável sob armazenamento obtida dadita célula hospedeira como definida na reivindicação 7, em que a dita meta-loprotease neutra é codificada através do dito vetor de expressão.

9. Metaloprotease neuirá isolada tendo reatividade imunológicacruzada com a metaloprotease neutra como definido na reivindicação 1.

10. Seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 18.

11. Seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO: 3.

12. Seqüência de aminoácido de acordo com a reivindicação 10,em que a dita seqüência compreende pelo menos uma substituição de umaminoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em umametaloprotease neutra compreendendo a seqüência de aminoácido expostana SEQ ID NO: 18, em que as ditas posições são selecionadas dasposições 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31, 32, 33, 35, 36,-38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 69,-70, 76, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 109, 110, 111,-112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136, 137, 138, 139,-140, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 169, 173,-178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198, 199, 200, 202,-203, 204, 205, 210, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223,-224, 228, 229, 237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253, 260, 261, 263,-264, 265, 267, 269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289,-290, 292, 293, 296, 297, e 299.

13. Variante de metaloprotease neutra isolada tendo umaseqüência de aminoácido compreendendo pelo menos uma substituição deum aminoácido feita em uma posição equivalente a uma posição em umametaloprotease neutra compreendendo a seqüência de aminoácido expostana SEQ ID NO: 18.

14. Variante de metaloprotease neutra isolada como definido nareivindicação 13, em que as ditas substituições são feitas em posiçõesequivalentes às posições 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 21, 23, 24, 25, 31,-32, 33, 35, 36, 38, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62,-63, 65, 66, 69, 70, 76, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 99, 100, 102,-109, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 119, 127, 128, 129, 130, 132, 135, 136,-137, 138, 139, 140, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161,-162, 169, 173, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 190, 191, 192, 196, 198,-199, 200, 202, 2CO, 204, 205^210, 211, 214, 215/ 216, 217, 218, 219, 220,-221, 222, 223, 224, 228, 229, 237, 239, 240, 243, 244, 245, 248, 252, 253,-260, 261, 263, 264, 265, 267, 269, 270, 273, 277, 280, 282, 283, 284, 285,-286, 288, 289, 290, 292, 293, 296, 297, e 299, de uma metaloproteaseneutra compreendendo a seqüência de aminoácido exposta na SEQ ID NO:-18.

15. Variante de metaloprotease neutra isolada de acordo com areivindicação 14, em que a dita protease compreende pelo menos umamutação selecionada de T004C, T004E, T004H, T004I, T004K, T004L,T004M, T004N, T004P, T004R, T004S, T004V, T004W, T004Y, G012D,G012E, G012I, G012K, G012L, G012M, G012Q, G012R, G012T, G012V,G012W, K013A, K013C, K013D, K013E, K013F, K013G, K013H, K013I,K013L, K013M, K013N, K013Q, K013S, K013T, K013V, K013Y, T014F,T014G, T014H, T014I, T014K, T014L, T014M, T014P, T014Q, T014R,T014S, T014V, T014W, T014Y, S023A, S023D, S023F, S023G, S023I,S023K, S023L, S023M, S023N, S023P, S023Q, S023R, S023S, S023T,S023V, S023W, S023Y, G024A, G024D, G024F, G024G, G024H, G024I,G024K, G024L, G024M, G024N, G024P, G024R, G024S, G024T, G024V,G024W, G024Y, K033H, Q045C, Q045D, Q045E, Q045F, Q045H, Q045I,Q045K, Q045L, Q045M, Q045N, Q045P, Q045R, Q045T, Q045W, N046A,N046C, N046E, N046F, N046G, N046H, N046I, N046K, N046L, N046M,N046P, N046Q, N046R, N046S, N046T, N046V, N046W, N046Y, R047E,R047K, R047L, R047M, R47Q, R047S, R047T, Y049A, Y049C, Y049D,Y049E, Y049F, Y049H, Y049I, Y049K, Y049L, Y049N, Y049R, Y049S,Y049T, Y049V, Y049W, N050D, N050F, N050G, N050H, N050I, N050K,N050L, N050M, N050P, N050Q, N050R, N050W, N050Y, T054C, T054D,T054E, T054F, T054G, T054H, T054I T054K, T054L, T054M, T054N,T054P, T054Q, T054R, T054S, T054V, T054W, T054Y, S058D, S058H,S058I, S058L, S058N, S058P, S058Q, T059A, T059C, T059E, T059G,T059H, T059I, T059K, T059L T059M, T059N, T059P, T059Q, T059R,T059S, T059V, T059W, T060D, T060F, T060I, T060K, T060L, T060N,T060Q, T060R, T060V, T060W, T060Y, T065C, T065E, T065F, T065H,T065I, T035K, T065L, T065M, T065P, T065Q, T065R, T065V, T065Y,S066C, SÒ66D, S066E, S066F, S066H, S066I, S066K, S066L, S066N,S066P, S066Q, S066R, S066T, S066V, S066W, S066Y, Q087A, Q087D,Q087E, Q087H, Q087I, Q087K, Q087L, Q087M, Q087N, Q087R, Q087S,Q087T, Q087V, Q087W, N090C, N090D, N090E, N090F, N090G, N090H,N090K, N090L, N090R, N090T, N096G, N096H, N096K, N096R, K097H,K097Q, K097W, K100A, K100D, K100E, K100F, K100H, K100N, K100P,K100Q, K100R, K100S, K100V, K100Y, R110A, R110C, R110E, R110H,R110K, R110L, R110M, R110N, R110Q, R110S, R110Y, D119E, D119H,D119I, D119L, D119Q, D119R, D119S, D119T, D119V, D119W, G128C,G128F, G128H, G128K, G128L, G128M, G128N, G128Q, G128R, G128W,G128Y, S129A, S129C, S129D, S129F, S129G, S129H, S129I, S129K,S129L, S129M, S129Q, S129R, S129T, S129V, S129W, S129Y, F130I,F130K, F130L, F130M, F130Q, F130R, F130T, F130V, F130Y, S135P,G136I, G136L, G136P, G136V, G136W, G136Y, S137Α, Μ138Ι, Μ138Κ,M138L, M138Q, M138V, D139A, D139C, D139E, D139G, D139H, D139I,D139K, D139L, D139M, D139P, D139R, D139S, D139V, D139W, D139Y,V140C, Q151I, Ε152Α, E152C, E152D, E152F, E152G, Ε152Η, E152L,Ε152Μ, Ε152Ν, E152R, E152S, E152W, N155D, Ν155Κ, N155Q, N155R,D178A, D178C, D178G, D178H, D178K, D178L, D178M, D178N, D178P,D178Q, D178R, D178S, D178T, D178V, D178W, D178Y, Τ179Α, T179F,Τ179Η, Τ179Ι, Τ179Κ, T179L, Τ179Μ, Τ179Ν, Τ179Ρ, T179Q, T179R,T179S, T179V, T179W, Τ179Υ, Ε186Α, E186C, E186D, E186G, Ε186Η,Ε186Κ, E186L, Ε186Μ, Ε186Ν, Ε186Ρ, E186Q, E186R, E186S, Ε186Τ,E186V, E186W, Ε186Υ, V190H, V190I, V190K, V190L, V190Q, V190R,S191F, S191G, S191H, S191I, S191K, S191L, S191N, S191Q, S191R,S191W, L198M, L198V, S199C, S199D, S199E, S199F, S199I, S199K,S199L, S199N, S199Q, S199R, S199V, Υ204Η, Υ204Τ, G205F, G205H,G205L, G205M, G205N, G205R, G205S, G205Y, Κ211Α, K211C, K211D,K211G, Κ211Μ, Κ211Ν, K211Q, K211R, K211S, Κ211Τ, K211V, Κ214Α,K214C, Κ214Ε, Κ214Ι, K214L, Κ214Μ, Κ214Ν, K214Q, K214R, K214S,K214V, L216A, L216C, L216F, L216H, L216Q, L216R, L216S, L216Y,Ν218Κ, Ν218Ρ, T219D, D220A, D220E, D220H, D220K, D2Z0N, D220P,A221D, A221E, A221F, A221I, A221K, A221L, A221M, A221N, A221S,A221V, A221Y, G222C, G222H, G222N, G222R, Y224F, Y224H, Y224N,Y224R, T243C, T243G, T243H, T243I, T243K, T243L, T243Q, T243R,T243W, T243Y, K244A, K244C, K244D, K244E, K244F, K244G, K244L,K244M, K244N, K244Q, K244S, K244T, K244V, K244W, K244Y, V260A,V260D, V260E, V260G, V260H, V260I, V260K, V260L, V260M, V260P,V260Q, V260R, V260S, V260T, V260W, V260Y, Y261C, Y261F, Y261I,Y261L, Τ263Ε, T263F, Τ263Η, Τ263Ι, T263L, Τ263Μ, T263Q, T263V,T263W, Τ263Υ, S265A, S265C, S265D, S265E, S265K, S265N, S265P,S265Q, S265R, S265T, S265V, S265W, Κ269Ε, K269F, K269G, Κ269Η,Κ269Ι, K269L, Κ269Μ, Κ269Ν, Κ269Ρ, K269Q, K269S, Κ269Τ, K269V,K269W, Κ269Υ, A273C, A273D, Α273Η, Α273Ι, Α273Κ, A273L, Α273Ν,A273Q, A273R, Α273Υ, R280A, R280C, R280D, R280E, R280F, R280G,R280H, R280K, R280L, R280M, R280S, R280T, R280V, R280W, R280Y,L282F, L282G, L282H, L282I, L282K, L282M, L282N, L282Q, L282R,L282V, L282Y, S285A, S285C, S285D, S285E, S285K, S285P, S285Q,S285R, S285W, Q286A, Q286D, Q286E, Q286K, Q286P, Q286R, A289C,A289D, Α289Ε, Α289Κ, A289L, A289R, A293C, A293R, N296C, N296D,Ν296Ε, Ν296Κ, N296R, N296V, A297C, Α297Κ, Α297Ν, A297Q, A297R, eG299N.

16. Variante de metaloprotease neutra isolada de acordo com areivindicação 13, em que a dita protease compreende mutações múltiplasselecionadas de S023W/G024M, T004V/S023W/G024W,S023W/G024Y/A288V, T004US023W/G024Y, N046Q/N050F/T054L,N050Y/T059R/S129Q, S023W/G024W, A273H/S285P/E292G, r-S023Y/G024Y, S023Y/G024W, T004S/S023Y/G024W, N046Q/T054K,S023W/G024Y, T004V/S023W, T059K/S066N,N046Q/N050W/T054H/T153A, T004V/S023W/G024Y,L282M/Q286P/A289R, N046Q/R047K/N050Y/T054K,L044Q/T263W/S285R, T004LyS023W/G024W, R047K/N050F/T054K,A273H/S285R, N050Y/T059K/S066Q, T054K/Q192K, N046Q/N050W,L282M/Q286K, T059K/S066Qr T004S/S023W, ''L282M/Q286R/A289R/K011N, L282M/A289R, N046Q/N050W/T054H,T059K/S129Q, T004S/S023N/G024Y/F210L, T004V/S023W/G024M/A289V,L282M/Q286K/A289R/S132T, N050W/T054H, L282M/Q286R,L282F/Q286K/A289R, T059R/S066Q, R047K/N050W^T054H,S265P/L282M/Q286K/A289R, L282M/Q286R/T229S, L282F/Q286K,T263W/S285R, S265P/L282M/Q286K, T263H/A273H/S285R,T059R/S129V, S032T/T263H/A273H/S285R, T059R/S066Q/S129Q,T004S/G024W, T004V/S023W/G024M, T059K/S066Q/S129Q,L282M/Q286K/A289R/I253V, T004V/S023Y/G024W, T059R/S066N/S129Q,N050F/T054L, T004S/S023N/G024W, T059R/S066N, T059R/S066N/S129V,Q286R/Á289R, N046Q/R047K/N050F/T054K, S265P/L282M/Q286P/A289R,S265P/L282M/Q286R/A289R Q062K/S066Q/S129I, S023N/G024W,N046Q/R047K/N050W/T054H, R047K/T054K, T004UG024W,Τ014M/T059R/S129V, T059R/S066Q/N092S/S129I, R047K/N050W/T054K,T004V/G024W, N047K/N050F/T054K, S265P/L282F/Q286K/N061Y1L282F/Q286K/E159V, T004V/S023Y/G024M, S265P/L282F/A289R/T065S,T059K/F063L7S066N/S129V, T004L/S023W, N050F/T054H,T059R/S066Q/S129V, V190I/D220E/S265W/L282F, T004S/S023Y/G024M,T004L/S023N/G024Y, T059K/S066N/S129I, T059R/S066N/S129I,L282M/Q286R/A289R/P162S, N046Q/N050F/T179N, T059K/Y082C/S129V,T059K/S129I, N050Y/T054K, T059K/S066Q/V102A/S129Q,T059R/S066Q/S129I, T059W/S066N/S129V/S290R, T059R/S129I,T059K/S066Q/S129I, T059K/S066Q/S129V,S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T004V/S023N/G024W,S265P/Q286K, S265P/L282F/A289R, ,D220P/S265W,L055F/T059W/S129V, T059R/S129Q/S191R, N050W/T054K,T004S/S023W/G024M, R047K/N050F/T054H, T059K/S066N/K088E,T059K/S066Q/S129I/V291L, L282M/Q286R/A289R,T059R/S066N/F085S/S129I, L282F/Q286P/A289R, L282F/Q286R/A289R,G099D/S265P/L282F/Q286K/A289R, N046Q/N050F,N050Y/T059W/S066N/S129V, T009I/D220P/S265N, V190F/D220P/S265W,N157Y/T263W/A273H/S285ÍV T263W/A273H/S285R, T263W/S285W,T004V/S023Y, N046Q/R047K/N050W, N050W/T054L,N200Y/S265P/L282F/Q286P/A289R, T059R/S066Q/P264Q, T004V/G024Y,T004L/G024Y, N050Y/S191I, N050Y/T054L, T004L7S023W/G024Y/N155K,F169I/L282F/Q286R/A289R, L282M/Q286K/A289R,F130 L/M 138 L/E 152 W/D 183 N1 N046Q/R047K/N050Y/T054H,T004V/G024M, N050Y/T059W/S066Q/S129V, S023N/G024Y,T054H/P162Q, T004S/S023W/G024Y, N050Y/T054H,L282F/Q286R/A289R/F169I, R047K/N050W, V190F/D220P, L282M/F173Y,T004L/S023Y, N050W/A288D, V190I/D220P/S265Q,S265P/L282F/Q286P/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R,N046Q/N050Y/T054K, T059W/S066Q, T263W/A273H/S285WT263W/A273H/S285P, S023Y/G024M, T004L/S023N/G024W,T004V/S023N/G024Y, T059W/S066N/S129Q, T004S/S023Y,T004S/S023N/G024M, T059W/S066N/A070T, T059W/S066Q/S129Q,T263W/A273H, A273H/285P, N046Q/R047K/N050Y/T054L,N046Q/R047K/N050Y, R047K/N050Y, T263H/S285W, R047K/N050F,N046Q/R047K/N050F/T054H, S023N/G024M, T004S/G024Y,R047K/N050Y/T054H, T059W/S066N/S129I, R047K/T054L,T004S/S023W/G024W, M138UE152F/T146S, D220P/S265N,T004S/G024M, T004V/S023N, N046Q/N050F/T054K,N046Q/N050Y/T054H, Q062H/S066Q/S129Q, T059W/S129Q,T059W/S129V, N050F/T054K, R047K/N050F/T054L, V190I/D220P/S265W,N112I/T263H/A273H/S285R, T059W/S066N/S129V, T059W/S066Q/S129I,T059W/S129I, T263W/S285P, V190I/D220P, A289V/T263H/A273H,T263H/A273H/S285P, N90S/A273H/S285P, R047K/N050Y/T054L,T004S/S023N, T059R/S129Q, N046Q/R047KTT054H,T059W/S066Q/S129V, E152W/T179P, N050Y/S066Q/S129V,T202S/T263W/A273H, T263W/A273H/S285P, M138UE152W/T179P,N046Q/R047K, N046Q/T054H/F176L, T004L/G024M, T004S/L282M,T263H/A273H, T263H/A273H/S285W, T004L7S023Y/G024M,L282F/Q286P, T004V/S023Y/G024Y, V190F/S265W, M138L/E152F,V190F/D220E/S265W, N046Q/N05ÕFÁT054H, N157Y/S285W,T004F/S023Y/G024MÍ T004V/S023N/G024M, L198I/D220E/S265Q,N046Q/N050Y/T054K/A154T, S016L/D220E/S265W, D220E/S265W,D220E/A237S/S265W, S066Q/S129Q, V190F/D220E/S265Q/T267I,L282M/F173Y/T219S, E152F/T179P, V190I/S265W, M138L7S066Q,M138L7E152W, T059W/S066Q/A070T/S129I, V190F/D220E/S265N,V190F/S265N, N046Q/N050Y, e M138L7E152F/T179P.

17. Variante de metaloprotease neutra isolada de acordo com areivindicação 13, em que a dita protease compreende mutações múltiplasselecionadas de V190I/D220P, V190I/D220P/S265Q, V190L/D220E,V190I/D220E/S265Q, V190I/D220E/S265W/L282F, V190L/D220E/S265Q,V190I/D220E/S265W, V190L7D220E/S265N, T059R/S066Q/S129I,V190I/D220E/S265N, V190UD220E/S265W, V190I/D220E,T059W/S066N/S129V, T059K/S066Q/S129V, T059K/Y082C/S129V,T059R/S066N/S129I, S066Q/S129V, T059R/S066Qy[S129V, T059R/S129I,N050Y/T059W/S066N/S129V, D220P/S265N, S066Q/S129I,T059W/S066Q/S129 V, T059K/S066Q/S129I, T059R/S129V,N050Y/S066Q/S129V, T059W/S066Q/S129I, N050Y/T059W/S066Q/S129V,T059K/S129I, D220P/S265W, F130LyM138L/T179P, S066N/S129I,T059R/S066N/S129V, F130I/M138UT179P, T059R/S066Q/N092S/S129I,S066N/S129V, D220E/S265Q, F130L/M138LyE152W/T179P,T059W/S129V, S265P/L282M/Q286R/A289R, S265P/L282F/Q286R/A289R,T059W/S066N/S129I, V190I/D220P/S265W, F130LyE152W/T179P,F130L/M138L/E152F/T179P, Q062K/S066Q/S129I, T059K/S066N/S129I,E152H/T179P, S265P/L282M/Q286K/A289R, F130LyM138UE152H/T179P,T263W/A273H/S285R, D220E/S265N, F130I/M138L7E152H/T179P,F130V/M138L/E152W/T179P, F130I/M138UE152W/T179P, T059W/S129I,D220E/S265W, F130V/M138LyT179P, F130L7E152V/T179P, T059R/S129Q,T263W/S285P, F130I/M138LVE152F/T179P, E152W/T179P, V190L7S265Q,F130L/E152F/T179P, L282M/Q286R/A289R/P162S, D220P/S265Q,M138L/E152F/T179P, F130I/E152H/T179P, M138UE152W/T179P,F130L/T179P, F130UM138LVE152W/T179P/Q286H, F130L7M138LyE152H,T263W/A273H/S285W, ' ' S265P/Q286K, T059W/S066Q/S129Q,T263W/S285R, T059W/S066N/S129Q, T263W/S285W,T059R/S066N/S129Q, S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N,T059W/S129Q, Q062H/S066Q/S129Q, L282M/Q286R/A289R,V190I_/D220E/S265N/V2911, V190L7S265N, F130UM138L7E152W,N050Y/T059R/S129Q, F130I/T179P, T059K/S066Q/S129Q, T059K/S129Q,S265P/L282M/Q286P/A289R, S265P/L282F/Q286P/A289R,T263W/A273H/S285P, S265P/L282M/Q286K, S016L7D220E/S265W,S066Q/S129Q, S265P/L282M/Q286P, L282F/Q286R/A289R,F130V/E152W/T179 Ρ, L044Q/T263W/S285R L055F/T059W/S129V,V190L/S265W, Q286R/A289R, G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R,F130L/M138L/E152F, T059R/S066Q/S129Q, F130L/E152H, S066N/S129Q,T004S/S023N/G024M/K269N, S265P/L282M, E152F/T179P,T059W/S066N/S129V/S290R, L282F/Q286K/A289R, F130I7M138L,F130I/M138L./E152W, S265P/L282F, F130I/M138UE152H,F130V/M138L/E152H, V190I/S265Q, M138L7E152M, S265P/L282F/Q286P,M138L/E152H, T059K/S066N/K088E, V190I/S265W, F130UE152W,L282M/Q286K/A289R, L282M/Q286K/A289R/I253V, T263W/A273H,V190I/S265N, M138L7E152W, A273H/S285R, F130I/M138L, F130L7E152F,F130V/M138L/E152W, T059K/S066Q/V102A/S129Q, F130V/E152H/T179P,F130I/M138L/E152F, F130 V/M 138 LVE152 F, M138L7E152F, L282M/Q286R,F130I/E152H, S265P/L282F/A289R/T065S, T263H/A273H/S285R,F130V/M138L, T014M/T059R/S129V, L282M/Q286R/A289R/K11N,A273H/S285P, L282M/Q286K/A289R/S132T, T263H/A273H/S285W,F130V/E152W, S265P/L282F/Q286K/N061Y, F130I/E152W,L198I/D220E/S265Q, V190I/S265L, T263H/S285W, S265P/L282F/A289R,M138L/S066Q, F130I/E152F, N90S/A273H/S285P,S032T/T263H/A273H/S285R, L282F/Q286P/A289R,N157Y/T263W/A273H/S285R, V105A/S129V, T263H/A273H/S285P,S129Q/L282H, T059W/S066Q, F130V/E152H, S023W/G024Y,T004V/S023N, T059R/S066Q, N050W/T054L, L282M/Q286P/A289R,A115VA/190US265W, L282M/Q286K, T059R/S066N, L282F/Q286P,T004V/S023W/G024M, S265P/L282F/Q286R/L78K, L282F/Q286K,T004V/S023W/G024Y, S023W/G024M, T059R/R256S, F130V/E152F,T004V/G024W, N050W/T054K, S023Y/G024M, T004V/S023Y,T004V/S023Y/G024M, N050Y/T054H, S023W/G024W,T004V/S023Y/G024Y, T004V/S023N/G024W,F130L/M138L/E152F/T179P/V2911, N050Y/T059K/S066Q,T004V/S023Y/G024W, T059K/S066N, T004V/S023N/G024Y,S023Y/G024W, N050F/T054L, R047K/T054K, S023N/G024W,L282M/A289R, S023Y/G024Y, T004V/G024M, R047K/N050F/T054K,N050F/T054K, T059K/S066Q, S023N/G024M, S023N/G024Y,T004US023N, R047K/N050W/T054H, T004L7S023W/G024Y,T004S/S023W, N046Q/N050W/T054H/A142Τ, T004US023Y,T004V/S023W, N050W/T054H, T004S/S023N, T004S/L282M,T004L/S023W, N050F/T054H, N050Y/T054L, e R047K/N050W/T054K.

18. Variante de metaloprotease neutra isolada de acordo com areivindicação 13, em que a dita protease compreende mutações múltiplasselecionadas de S066Q/S129V, S066Q/S129I, N050Y/S066Q/S129V,S066N/S129I, T059K/S066Q/S129V, S066N/S129V, F130L/E152W/T179P,S265P/L282M/Q286R/A289R, F130L/E152WT179P, T059K/S066Q/S129I,T263W/S285P, T059K/S066N/S129I, T263W/A273H/S285P,S265P/L282F/Q286R/A289R, F130 V/E 152 W/T 179 P, T263W/A273H/S285R,V190I/D220P/S265W, F130L7E152H, S066N/S129Q,S265P/L282M/Q286K/A289R, V190I/D220E, T059R/S066N/S129I,V190I/D220E/S265W, T059K/S129I, T059R/S066Q/S129I,F130I/M138L/E152H/T179P, F130I/T179P, T263W/A273H/S285W,S016UD220E/S265W, S066Q/S129Q, V190I/D220E/S265Q,T059R/S066Q/S129V, D220E/S265N, V190L/D220E, D220E/S265W,V190I/D220P, V190L7D220E/S265N, L044Q/T263W/S285R,S265P/L282M/Q286P/A289R, F130LyM138LyE152H/T179P, T263W/S285R,L282M/Q286R/A289R, T263W/S285W, F130I/E152H/T179P,V190I/D220E/S265N, V190iyD220E/S265W, V190I/D220P/S265Q,T059R/S066N/S129V, V190LyD220E/S265Q, E152H/T179P,F130L/M138L/E152F/T179P, Q062H/S066Q/S£29Q, T059R/S129V,V190I/D220E/S265W/L282F, V190I/S265Q, F130LyE152F/T179P,D220E/S265Q, E152W/T179P, T059K/S066Q/S129Q, F130L/M138L/T179P,F130I/M138L/E152F/T179P, F130UM138L7E152W/T179P,N050Y/T059W/S066Q/S129V, S265P/L282M/Q286K, T059R/S129I,F130V/E152H/T179P, D220P/S265N, S265P/L282M/Q286P, F130I/E152H,T059R/S066Q/N092S/S129I, F130L7T179P,G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R, T263W/A273H, V190I/S265N,D220P/S265W, F130L7E152W, F130LiM138LyE152H, S265P/L282M,V190I/S265Q, F130UE152F, T059K/S129Q, Q286R/A289R,M138L/E152W/T179P, F130I/M138LVE152H, D220P/S265Q, V190US265N,Fl 30I/M138L/E152W, S265P/Q286K, V190US265Q, V190I/S265W,F130L/M138L/E152F, F130V/E152H, E152F/T179P,N050Y/T059W/S066N/S129V, T059R/S066N/S129Q, F130I/E152W,F130V/E152W, T059R/S066Q/S129Q, T263H/A273H/S285P,N90S/A273H/S285P, V190UD220E/S265N/V291I, T059R/S129Q,A273H/S285P, F130I/M138L7E152W/T179P, F130V/M138I7EÍ52F,N050Y/T059R/S129Q, T059W/S066Q/S129I, F130V/M138UT179P,F130V/M138 L/E 152W/T179P, V190L/S265W, F130 V/M 138 LVE152 W,T059W/S066Q/S129V, V190I/S265Q, F130V/M138UE152H, F130I/E152F,N157Y/T263W/A273H/S285R, T263H/S285W, M138LyE152F/T179P,A115V/V190L/S265W, M138LVE152M, T263H/A273H/S285W,F130L/M138L/E152W, T059K/S066N/K088E, F130I/M138UE152F,F130I/M138L/T179P, T004V/S023N, T059K/S066Q/V102A/S129Q,F130L/M138L, N047K/N050F/T054K, T263H/A273H/S285R,F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H, M138L/E152H, M138LyS066Q,L282M/Q286R/A289R/P162S, L282F/Q286R/A289R, Q062K/S066Q/S129I,A273H/S285R, S265P/L282F/Q286P, S265P/L282F/Q286P/A289R,S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N, T059W/S066N/S129I,V190I/S265L, T059W/S066N/S129V, F130I/M138L,L282M/Q286K/A289R/I253V, R047K/N050F/T054K, M138UE152F,N050W/T054K, L198I/D220E/S265Q, L282F/Q286K/A289R, N050F/T054K,L282M/Q286R, 'M138LyE15£W, S265P/L282F, F130V/E152F,T059W/S066N/S129Q, F130V/M138L, T263H/A273H,L282M/Q286K/A289R, N046Q/N050\MT054H/A142T,T059W/S066Q/S129Q, S265P/L282F/A289R/T065S, N050F/T054H,S129Q/L282H, L282M/Q286K/A289R/S132T, L282M/Q286R/A289R/K11N,T059K/S066N, R047K/N050W/T054K, T059K/S066Q, T004V/S023Y,T059W/S066N/S129V/S290R, N050Y/T059K/S066Q, e R047K/N050Y.

19. Variante de metaloprotease neutra tendo desempenhomelhorado quando comparada à metaloprotease neutra de B.amyloliquefaciens do tipo selvagem.

20. Variante de metaloprotease neutra de acordo com areivindicação 19, em que o dito desempenho melhorado compreendetermoestabilidade melhorada, quando comparada à metaloprotease neutrade B. amyloliquefaciens do tipo selvagem.

21. Variante de metaloprotease neutra de acordo com areivindicação 19, em que o dito desempenho melhorado compreendedesempenho melhorado sob condições de pH mais baixo ou mais alto,quando comparada à metaloprotease neutra de B. amyloliquefaciens do tiposelvagem.

22. Variante de metaloprotease neutra de acordo com areivindicação 19, em que o dito desempenho melhorado compreendeestabilidade autolítica melhorada, quando comparada à metaloproteaseneutra de B. amyloliquefaciens do tipo selvagem.

23. Método para produzir uma enzima tendo atividade demetaloprotease neutra, compreendendo: transformar uma célula hospedeiracom um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tendo pelomenos 70% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 3; e cultivar a ditacélula hospedeira transformada sob condições adequadas para a produçãoda dita metaloprotease neutra.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, adicionalmentecompreendendo a etapa de colher a dita metaloprotease neutra produzida.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a ditacéteila hospedeira é uma espécie dQtBaciHus.

26. Sonda de ácido nucléico isolado compreendendo aseqüência de 4 a 150 nucleotídeos substancialmente idêntica a umfragmento correspondente das SEQ ID NOS: 1,2, 12 e/ou 13.

27. Sonda de ácido nucléico isolado de acordo com areivindicação 26, em que a dita sonda é usada para detectar uma seqüênciade ácido nucléico que codifica para uma enzima tendo atividademetaloproteolítica.

28. Seqüência de ácido nucléico como definida na reivindicação-27, em que a dita seqüência de ácido nucléico é obtida de um Bacillus sp.

29. Composição compreendendo pelo menos umametaloprotease neutra obtida de B. amyloliquefaciens, em que a ditacomposição também compreende pelo menos um íon de cálcio e/ou íon dezinco.

30. Composição compreendendo pelo menos umametaloprotease neutra obtida de B. amyloliquefaciens, em que a ditacomposição também compreende pelo menos um estabilizante.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que odito estabilizante é selecionado do grupo que consiste em bórax, glicerol,íons de zinco, íons de cálcio, e formato de cálcio.

32. Composição de acordo com a reivindicação 30, em que odito estabilizante é pelo menos um inibidor competitivo que estabiliza a ditapelo menos uma metaloprotease neutra na presença de um tensoativoaniônico.

33. Composição de limpeza compreendendo a metaloproteaseneutra isolada Cojtio definido na reivindicação 1.

34. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 33,em que a dita composição de limpeza é um detergente.

35. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 33,adicionalmente compreendendo pelo menos uma enzimas adicionais ouderivados de enzimas selecionadas de proteases, amilases, lipases,mananases, pectinases, cutinases, oxidorreductases, hemicelulases, ecelulases.

36. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 34,em que a dita composição compreende pelo menos cerca de 0,0001 porcento em peso da dita metaloprotease neutra.

37. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 36,em que a dita composição compreende de cerca de 0,001 a cerca de 0,5por cento em peso da dita metaloprotease neutra.

38. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 36,em que a dita composição também compreende pelo menos umcomponente adjunto.

39. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 31,adicionalmente compreendendo uma quantidade suficiente de ummodificador de pH para fornecer a composição com um pH líquido de cercade 3 a cerca de 5, a composição sendo essencialmente livre de materiaisque hidrolisam em um pH de cerca de pH 3 a cerca de pH 5.

40. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 39,em que os ditos materiais que hidrolisam em um pH de cerca de pH 3 acerca de pH 5 compreendem pelo menos um tensoativo.

41. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 40,em que o dito tensoativo é um tensoativo de alquil sulfato de sódiocompreendendo uma porção de oxido de etileno.

42. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 33,em que a dita composição é um líquido.

43. Composição de limpeza de acordo com a reivindicação 33,adicionalmente compreendendo pelo menos uma enzima estável em ácido.

44. Método de limpar, compreendendo a etapa de contatar umasuperfície e/ou um artigo compreendendo um tecido com a composição delimpeza como definido na reivindicação 33.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, adicionalmentecompreendendo a etapa de enxaguar a dita superfície e/ou material apóscontatar a dita superfície ou material com a dita composição de limpeza.

46. Método de acordo com a reivindicação 44, em que a ditasuperfície e/ou um artigo compreendendo unf tecido co/jipreende umamancha de grama e a dita etapa de contato compreende a dita mancha degrama com a dita composição de limpeza.

47. Composição de alimentação de animais compreendendo ametaloprotease neutra isolada como definida na reivindicação 1.

48. Composição de processamento têxtil compreendendo ametaloprotease neutra isolada como definida na reivindicação 1.

49. Composição de processamento de couro compreendendo ametaloprotease neutra isolada como definida na reivindicação 1.