CN105400760A - 中性金属蛋白酶在无丝氨酸蛋白酶背景中的用途和生产 - Google Patents

Abstract

本发明提供方法和在相对缺少丝氨酸蛋白酶污染情况下包含至少一种中性金属蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，所述中性金属蛋白酶可用于清洁和其它应用。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供方法和包含被改造以缺少多种丝氨酸蛋白酶的芽孢杆菌菌株的组合物，以及其在产生重组中性金属蛋白酶中的用途。

Description

中性金属蛋白酶在无丝氨酸蛋白酶背景中的用途和生产

本申请为2008年10月6日提交的，发明名称为“中性金属蛋白酶在无丝氨酸蛋白酶背景中的用途和生产”的PCT申请PCT/US2008/078942的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年4月20日，申请号为200880112344.4。

相关申请

本申请要求2007年10月31日提交的美国临时专利申请序列号60/984,040，题为“UseandProductionOfNeutralMetalloproteasesInASerineProtease-FreeBackground”的优先权。

发明领域

本发明提供方法和在相对缺少丝氨酸蛋白酶污染情况下包含至少一种中性金属蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，所述中性金属蛋白酶可用于清洁和其它应用。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供方法和包含被改造以缺少多种丝氨酸蛋白酶的芽孢杆菌菌株(Bacillus)的组合物，以及其在产生重组中性金属蛋白酶中的用途。

发明背景

芽孢杆菌属的成员是分泌许多工业上有用的酶的革兰氏阳性菌，其可通过发酵以大体积廉价地产生。枯草杆菌(B.subtilis)和芽孢杆菌的其它种产生根据其功能和切割位置分类的多种蛋白酶。两个实例包括在酸性pH下切割肽键的酸性蛋白酶，和切割丝氨酸肽键的丝氨酸蛋白酶。

考虑到细菌细胞内存在的大量蛋白酶及其功能多样性，分离产生单一类型蛋白酶的野生型或天然发生的突变体菌株是非常不可能的。同样，已知的蛋白酶纯化方法受到其对多种蛋白酶常见的生物化学性质的依赖的阻碍。当目的蛋白酶对芽孢杆菌生产菌株的蛋白酶污染的降解敏感时，这尤其是个问题。

因此，本领域仍然需要适合于在缺少有害内源蛋白酶活性的宿主菌株中产生目的异源蛋白酶的组合物和方法。具体而言，想要用于在无丝氨酸蛋白酶背景中产生重组中性金属蛋白酶的组合物和方法。

发明概述

本发明提供方法和在相对缺少丝氨酸蛋白酶污染情况下包含至少一种中性金属蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，所述中性金属蛋白酶可用于清洁和其它应用。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供方法和包含被改造以缺少多种丝氨酸蛋白酶的芽孢杆菌菌株的组合物，以及其在产生重组中性金属蛋白酶中的用途。

本发明提供方法，其包括：提供缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)，和内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)的芽孢杆菌宿主细胞；用与启动子有效组合的编码异源NprE酶的核酸转化所述芽孢杆菌宿主细胞；并在适合于产生所述异源NprE酶的条件下培养所述转化的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括收获所产生的异源NprE酶的步骤。在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，在尤其优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6100菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在额外实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，在尤其优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6101菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在额外实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶(bacillopeptidase)F(Bpr)中的一种或两种。在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，在尤其优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6000菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在额外实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)和内源胞外金属蛋白酶(Mpr)中的一种或两种。在优选的实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，在尤其优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6003菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。本发明提供方法，其中所述异源NprE是解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)NprE酶或其变体。在一些实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌NprE变体具有在选自等同于在SEQIDNO:3中阐明的氨基酸序列的位置1、3、4、5、6、11、12、13、14、16、21、23、24、25、31、32、33、35、36、38、44、45、46、47、48、49、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、65、66、69、70、76、85、86、87、88、90、91、92、96、97、98、99、100、102、109、110、111、112、113、115、117、119、127、128、129、130、132、135、136、137、138、139、140、146、148、151、152、153、154、155、157、158、159、161、162、169、173、178、179、180、181、183、184、186、190、191、192、196、198、199、200、202、203、204、205、210、211、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、228、229、237、239、240、243、244、245、248、252、253、260、261、263、264、265、267、269、270、273、277、280、282、283、284、285、286、288、289、290、292、293、296、297和299的至少一个位置(一个、两个、三个、四个或五个)中包含替代的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，所述解淀粉芽孢杆菌NprE变体具有包含至少一个替代(一个、两个、三个、四个或五个替代)的氨基酸序列，所述替代选自T4C、T4E、T4H、T4I、T4K、T4L、T4M、T4N、T4P、T4R、T4S、T4V、T4W、T4Y、G12D、G12E、G12I、G12K、G12L、G12M、G12Q、G12R、G12T、G12V、G12W、K13A、K13C、K13D、K13E、K13F、K13G、K13H、K13I、K13L、K13M、K13N、K13Q、K13S、K13T、K13V、K13Y、T14F、T14G、T14H、T14I、T14K,T14L、T14M、T14P、T14Q、T14R、T14S、T14V、T14W、T14Y、S23A、S23D、S23F、S23G、S23I、S23K、S23L、S23M、S23N、S23P、S23Q、S23R、S23S、S23T、S23V、S23W、S23Y、G24A、G24D、G24F、G24G、G24H、G24I、G24K、G24L、G24M、G24N、G24P、G24R、G24S、G24T、G24V、G24W、G24Y、K33H、Q45C、Q45D、Q45E、Q45F、Q45H、Q45I、Q45K、Q45L、Q45M、Q45N、Q45P、Q45R、Q45T、Q45W、N46A、N46C、N46E、N46F、N46G、N46H、N46I、N46K、N46L、N46M、N46P、N46Q、N46R、N46S、N46T、N46V、N46W、N46Y、R47E、R47K、R47L、R47M、R47Q、R47S、R47T、Y49A、Y49C、Y49D、Y49E、Y49F、Y49H、Y49I、Y49K、Y49L、Y49N、Y49R、Y49S、Y49T、Y49V、Y49W、N50D、N50F、N50G、N50H、N50I、N50K、N50L、N50M、N50P、N50Q、N50R、N50W、N50Y、T54C、T54D、T54E、T54F、T54G、T54H、T54IT54K、T54L、T54M、T54N、T54P、T54Q、T54R、T54S、T54V、T54W、T54Y、S58D、S58H、S58I、S58L、S58N、S58P、S58Q、T59A、T59C、T59E、T59G、T59H、T59I、T59K、T59LT59M、T59N、T59P、T59Q、T59R、T59S、T59V、T59W、T60D、T60F、T60I、T60K、T60L、T60N、T60Q、T60R、T60V、T60W、T60Y、T65C、T65E、T65F、T65H、T65I、T65K、T65L、T65M、T65P、T65Q、T65R、T65V、T65Y、S66C、S66D、S66E、S66F、S66H、S66I、S66K、S66L,S66N、S66P、S66Q、S66R、S66T、S66V、S66W、S66Y、Q87A、Q87D、Q87E、Q87H、Q87I、Q87K、Q87L、Q87M、Q87N、Q87R、Q87S、Q87T、Q87V、Q87W、N90C、N90D、N90E、N90F、N90G、N90H、N90K、N90L、N90R、N90T、N96G、N96H、N96K、N96R、K97H、K97Q、K97W、K100A、K100D、K100E、K100F、K100H、K100N、K100P、K100Q、K100R、K100S、K100V、K100Y、R110A、R110C、R110E、R110H、R110K、R110L、R110M、R110N、R110Q、R110S、R110Y、D119E、D119H、D119I、D119L、D119Q、D119R、D119S、D119T、D119V、D119W、G128C、G128F、G128H、G128K、G128L、G128M、G128N、G128Q、G128R、G128W、G128Y、S129A、S129C、S129D、S129F、S129G、S129H、S129I、S129K、S129L、S129M、S129Q、S129R、S129T、S129V、S129W、S129Y、F130I、F130K、F130L、F130M、F130Q、F130R、F130T、F130V、F130Y、S135P、G136I、G136L、G136P、G136V、G136W、G136Y、S137A、M138I、M138K、M138L、M138Q、M138V、D139A、D139C、D139E、D139G、D139H、D139I、D139K、D139L、D139M、D139P、D139R、D139S、D139V、D139W、D139Y、V140C、Q151I、E152A、E152C、E152D、E152F、E152G、E152H、E152L、E152M、E152N、E152R、E152S、E152W、N155D、N155K、N155Q、N155R、D178A、D178C、D178G、D178H、D178K、D178L、D178M、D178N、D178P、D178Q、D178R、D178S、D178T、D178V、D178W、D178Y、T179A、T179F、T179H、T179I、T179K、T179L、T179M、T179N、T179P、T179Q、T179R、T179S、T179V、T179W、T179Y、E186A、E186C、E186D、E186G、E186H、E186K、E186L、E186M、E186N、E186P、E186Q、E186R、E186S、E186T、E186V、E186W、E186Y、V190H、V190I、V190K、V190L、V190Q、V190R、S191F、S191G、S191H、S191I、S191K、S191L、S191N、S191Q、S191R、S191W、L198M、L198V、S199C、S199D、S199E、S199F、S199I、S199K、S199L、S199N、S199Q、S199R、S199V、Y204H、Y204T、G205F、G205H、G205L、G205M、G205N、G205R、G205S、G205Y、K211A、K211C、K211D、K211G、K211M、K211N、K211Q、K211R、K211S、K211T、K211V、K214A、K214C、K214E、K214I、K214L、K214M、K214N、K214Q、K214R、K214S、K214V、L216A、L216C、L216F、L216H、L216Q、L216R、L216S、L216Y、N218K、N218P、T219D、D220A,D220E、D220H、D220K、D220N、D220P、A221D、A221E、A221F、A221I、A221K、A221L、A221M、A221N、A221S、A221V、A221Y、G222C、G222H、G222N、G222R、Y224F、Y224H、Y224N、Y224R、T243C、T243G、T243H、T243I、T243K、T243L、T243Q、T243R、T243W、T243Y、K244A、K244C、K244D、K244E、K244F、K244G、K244L、K244M、K244N、K244Q、K244S、K244T、K244V、K244W、K244Y、V260A、V260D、V260E、V260G、V260H、V260I、V260K、V260L,V260M、V260P、V260Q、V260RV260S、V260T、V260W、V260Y、Y261C、Y261F、Y261I、Y261L、T263E、T263F、T263H、T263I、T263L、T263M、T263Q、T263V、T263W、T263Y、S265A、S265C、S265D、S265E、S265K、S265N、S265P、S265Q、S265R,S265T、S265V、S265W、K269E、K269F、K269G、K269H、K269I、K269L、K269M、K269N、K269P、K269Q、K269S、K269T、K269V、K269W、K269Y、A273C、A273D、A273H、A273I、A273K、A273L、A273N、A273Q、A273R、A273Y、R280A、R280C、R280D、R280E、R280F、R280G、R280H、R280K、R280L、R280M、R280S、R280T、R280V、R280W、R280Y、L282F、L282G、L282H、L282I、L282K、L282M、L282N、L282Q、L282R、L282V、L282Y、S285A、S285C、S285D、S285E、S285K、S285P、S285Q、S285R、S285W、Q286A、Q286D、Q286E、Q286K、Q286P、Q286R、A289C、A289D、A289E、A289K、A289L、A289R、A293C、A293R、N296C、N296D、N296E、N296K、N296R、N296V、A297C、A297K、A297N、A297Q、A297R和G299N。在一些尤其优选的实施方案中，所述替代包含选自S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P和S120I/F130L/M138L/V190I/D220P的多个突变。在一些优选实施方案中，中性金属蛋白酶与包含SEQIDNO:3阐明氨基酸序列的中性金属蛋白酶具有至少约45％的氨基酸同一性。本发明还提供的是包含本发明方法产生的异源NprE酶的组合物。

此外，本发明提供包含分离的芽孢杆菌中性金属蛋白酶(NprE)或其变体的组合物，其中所述组合物基本没有芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶(AprE)污染。在一些优选实施方案中，所述AprE污染与NprE或其变体相比包含以重量计少于约1％。在一些优选实施方案中，所述AprE污染包含低于0.50U/ml丝氨酸蛋白酶活性，优选低于0.05U/ml丝氨酸蛋白酶活性，并更优选低于0.005U/ml丝氨酸蛋白酶活性。在一些优选实施方案中，所述组合物是清洁组合物。在一些优选实施方案中，所述清洁组合物是去污剂。在一些尤其优选的实施方案中，所述组合物还包含选自淀粉酶、脂酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶(cutinases)、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的至少一种额外的酶或酶衍生物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少约百分之0.0001重量的中性金属蛋白酶变体，并优选从约百分之0.001到约0.5的中性金属蛋白酶变体。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种附加成分。本发明提供还包含足够量pH调节剂的组合物，以提供具有从约3到约5净pH的组合物，所述组合物基本没有在约pH3到约pH5的pH下水解的物质。在一些实施方案中，在约pH3到约pH5的pH下水解的所述物质包含至少一种表面活性剂。在这些实施方案的亚组中，所述表面活性剂是包含环氧乙烷部分的烷基硫酸钠表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物是液体。本发明还提供清洁方法，其包括使包含纤维的表面和/或物品与本发明的清洁组合物接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在使所述表面或物质与所述清洁组合物接触后冲洗该表面的步骤。在其它实施方案中，所述组合物是包含分离的中性金属蛋白酶变体的动物饲料组合物。在备选实施方案中，所述组合物是包含分离的中性金属蛋白酶变体的织物处理组合物。在额外的实施方案中，所述组合物是包含分离的中性金属蛋白酶变体的皮革处理组合物。

本发明还提供缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)，和内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)的分离的芽孢杆菌宿主细胞，其中用与启动子有效组合的编码异源NprE酶的核酸转化所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选实施方案中，所述枯草杆菌是BG6100菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选实施方案中，所述枯草杆菌是BG6101菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在额外实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶F(Bpr)中的一种或两种。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6000菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在额外实施方案中，所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)和内源胞外金属蛋白酶(Mpr)中的一种或两种。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选的实施方案中，所述枯草杆菌是BG6003菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在其它优选的实施方案中，所述异源NprE酶是解淀粉芽孢杆菌NprE酶或其变体。

本发明提供缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)的分离的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选实施方案中，所述枯草杆菌是BG6000菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。在其它实施方案中，本发明提供缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、内源杆菌肽酶F酶(Bpr)、内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)和内源胞外金属蛋白酶(Mpr)的分离的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，所述芽孢杆菌是枯草杆菌，而在一些优选实施方案中，所述枯草杆菌是BG6003菌株(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))。

附图简述

图1显示产生在内源蛋白酶基因中携带缺失的芽孢杆菌宿主菌株的一般图解。该图显示通过使用抗生素壮观霉素和卡那霉素和携带壮观霉素抗性(spec)和卡那霉素抗性(kan)基因的质粒缺失枯草杆菌细胞壁蛋白酶(wprA)基因的示例性策略。

图2提供用作PCR模板的质粒图谱。图A提供质粒pJHT的图谱。图B提供质粒pUBnprE的图谱。

图3提供用于制备包含与aprE启动子序列有效组合的解淀粉芽孢杆菌nprE编码序列的核酸的示例性剪接重叠延伸(SOE)反应的图示。

图4提供上图的SOC反应产生的核酸的DNA序列(SEQIDNO:12)。小写字母表示aprE启动子，具有单下划线的小写字母表示解淀粉芽孢杆菌nprE信号序列，具有双下划线的小写字母表示解淀粉芽孢杆菌nprE前序列，并且大写字母表示成熟解淀粉芽孢杆菌nprE序列。

图5提供通过在芽孢杆菌蛋白酶敲除菌株的发酵液中评估丝氨酸蛋白酶污染获得的结果。分别通过SDS-PAGE分析和AAPF测定来测定丝氨酸蛋白酶表达和活性。通过N末端测序鉴定了20-30kDa和100kDa蛋白条带，揭示了100kDa蛋白酶对应于小胞外蛋白酶Vpr(Sloma等,JBacteriol,173:21,6889,1991)。

图6提供上图凝胶泳道的密度测定图。对应于两个(2)蛋白酶缺失菌株的发酵液的图示于左边，而对应于八个(8)个蛋白酶缺失菌株的发酵液示于右边。

图7显示通过PCR扩增异源上游和下游染色体DNA构建蛋白酶基因缺失质粒，所述染色体DNA具有在引物末端引入的方便的限制性位点(见例如，图7)。

图8提供pLoxSpec质粒的图谱。

图9提供携带上游染色体DNA-Spec-loxP-下游染色体DNA表达盒的线性化质粒的图示。

图10提供pCRM-TsPhleo质粒的图谱。

发明简述

本发明提供方法和在相对缺少丝氨酸蛋白酶污染的情况下包含至少一种中性金属蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，所述中性金属蛋白酶可用于清洁和其它应用。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供方法和包含被改造以缺少多种丝氨酸蛋白酶的芽孢杆菌菌株的组合物，以及其在产生重组中性金属蛋白酶中的用途。

除非另有说明，本发明的实践涉及本领域技术中通常用于分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术。此类技术为本领域技术人员所知并在许多教科书和参考文献中有所描述(参阅例如，Sambrook等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"第二版,ColdSpringHarbor,1989；和Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"1987)。上文和下文中的所有专利、专利申请、文章和此处提及的出版物特此明确引入作为参考。

除非此处另有说明，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同意思。例如，Singleton和Sainsbury,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第二版,JohnWileyandSons,NY(1994)；以及Hale和Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology,HarperPerennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明使用的许多术语的通用词典。尽管与此处描述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于实践本发明，但此处仍然描述了优选的方法和材料。因此，参考说明书整体更详细地描述了下文即将定义的术语。

同样，如此处所用，单数包括复数指代，除非上下文中另外明确指出。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，分别以5'到3'的方向书写核酸；以氨基到羧基方向从左到右书写氨基酸序列。应理解本发明不限制描述的特定方法、方案和试剂，因为这些根据本领域技术人员使用的背景可以变化。

此外，此处提供的标题并非本发明多个方面或实施方案的限制，其可参考说明书整体而得到。因此，下文即将定义的术语通过参考说明书整体而得到更详细定义。然而，为了便于理解本发明，在下文中定义了许多术语。

定义

除非此处另有说明，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同意思。尽管与此处描述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于实践本发明，但此处仍然描述了优选的方法和材料。因此，参考说明书整体更详细地描述了下文即将定义的术语。因此，下文即将定义的术语通过参考说明书整体而得到更详细定义。同样，如此处所用，单数包括复数指代，除非上下文中另外明确指出。除非另有说明，分别以5'到3'的方向书写核酸；以氨基到羧基方向从左到右书写氨基酸序列。应理解本发明不限制描述的特定方法、方案和试剂，因为这些根据本领域技术人员使用的背景可以变化。

预期该说明书中给定的每一个最大数值限制包括每一个更低的数值限制，就如同该更低的数值限制此处更明确书写一样。该说明书中给定的每一个最小数值限制将包括每一个更高的数值限制，就如同该更高的数值限制此处更明确书写一样。该说明书中给定的每一个数值范围将包括处于该更宽数值范围每一个更窄的数值范围，就如同该更窄的数值范围此处更明确书写一样。

在相关部分引用的所有文件此处引入作为参考；任何文件的引用不解释为承认其为本发明的现有技术。

如此处所用，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指显示水解具有肽键的肽或底物能力的蛋白质或肽。存在许多众所周知的方法测定蛋白水解活性(Kalisz,"MicrobialProteinases,"In:Fiechter(编辑),AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,1988)。例如，可通过分析各蛋白酶水解商品化底物能力的比较测定法测定蛋白水解活性。用于蛋白酶或蛋白水解活性的该分析的示例性底物包括，但不限于二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)、牛胶原(SigmaC-9879)、牛弹性蛋白(SigmaE-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical902111)。使用这些底物的比色测定为本领域所熟知(参阅例如WO99/34011；和美国专利号6,376,450，此处将其引入作为参考)。pNA测定(参阅例如，DelMar等,AnalBiochem,99:316-320,1979)也可用于测定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定测量了随着酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺(sAAPF-pNA)释放对-硝基苯胺的速率。在分光光度计上410nm处测定来自水解反应的黄颜色的产生速率，并且其与活性酶浓度成比例。此外，在280nm处的吸光度测定可用于测定总的蛋白质浓度。活性酶/总蛋白质比例给出了酶的纯度。

如此处所用，术语“NprE蛋白酶”和“NprE”指此处描述的中性金属蛋白酶。在一些优选的实施方案中，所述NprE蛋白酶是从解淀粉芽孢杆菌获得的此处指定为纯化的Neutral或PMN的蛋白酶。因此，在一些实施方案中，术语“PMN蛋白酶”指来自解淀粉芽孢杆菌的天然发生的成熟蛋白酶，其与SEQIDNO:3中提供的氨基酸序列具有基本相同的氨基酸序列。在备选实施方案中，本发明提供所述NprE蛋白酶的部分。

术语“芽孢杆菌蛋白酶同源物”指天然发生的蛋白酶，其与来自解淀粉芽孢杆菌的成熟蛋白酶具有基本相同的氨基酸序列，或编码此类天然发生的蛋白酶的多核苷酸序列，并且所述蛋白酶保留了此类核酸编码的中性金属蛋白酶的功能特性。

如此处所用，术语“NprE变体”和“NprE蛋白酶变体”用于指尤其是在其功能上与野生型NprE相似的蛋白酶，但在氨基酸序列中具有突变，使得它们的序列不同于野生型蛋白酶。

如此处所用，“Bacillusssp.”指“芽孢杆菌”属中的所有种，其为分类为芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科成员的革兰氏阳性细菌。“芽孢杆菌”属包括“芽孢杆菌”属中的所有种，如本领域技术人员所知，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus),短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、B.clausii、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。公认的是芽孢杆菌属继续进行分类学重组。因此，预期该属包括具有重新分类的种，包括但不限于这样的生物如嗜热脂肪芽孢杆菌，其现在命名为嗜热脂肪土芽孢杆菌(“Geobacillusstearothermophilus”)。认为在氧气存在下的抗性内生孢子的产生是芽孢杆菌属的确定特征，尽管该特征也应用于最近命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、Aneurinibacillus、Anoxybacillus、Brevibacillus、Filobacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、Salibacillus、热杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus和Virgibacillus。

相关(和衍生)蛋白质包含“变体蛋白质”。在一些优选实施方案中，变体蛋白质通过少数氨基酸残基不同于亲本蛋白质和另外的蛋白质。不同氨基酸残基的数目可以是一个或更多，优选1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50个或更多氨基酸残基。在一些优选实施方案中，变体之间不同氨基酸的数目在1到10之间。在一些特别优选的实施方案中，相关蛋白质，尤其是变体蛋白质包含至少约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同一性。此外，如此处所用，相关蛋白质或变体蛋白质指在显著区域不同于另一相关蛋白质或亲本蛋白质的蛋白质。例如，在一些实施方案中，变体蛋白质具有不同于所述亲本蛋白质的1、2、3、4、5或10个相关显著区域。

适合于产生本发明变体或酶的几种方法为本领域已知，其包括但不限于位点饱和诱变、筛选诱变、插入诱变、随机诱变、位点定向诱变和定向进化，以及多种其它重组方法。

野生型和突变体蛋白质的表征经过任何手段或“检测”完成并优选基于评估目的性质。例如，在本发明的一些实施方案中测定pH和/或温度，以及去污剂和/或抗氧化稳定性。的确，期望在一个或更多这些特征(pH、温度、蛋白水解稳定性、去污剂稳定性和/或抗氧化稳定性)中具有不同程度稳定性的酶将会有用。

此处互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”指任何长度核苷酸的聚合物形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括，但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其它天然的、化学、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖和连接基团如氟代核糖和thioate、和核苷酸分支。在备选实施方案中，核苷酸序列被非核苷酸组分中断。

如此处所用，术语“DNA构建体”和“转化DNA”互换使用，指用于向宿主细胞或生物引入序列的DNA。可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适技术在体外产生DNA。在特别优选的实施方案中，所述DNA构建体包含目的序列(例如作为进入序列)。在一些实施方案中，所述序列有效连接额外的元件，如控制元件(例如启动子等)。所述DNA构建体还包含选择标记。其进一步包含侧翼为同源盒的进入序列。在其它实施方案中，所述转化DNA包含添加到末端(例如填充序列或侧翼)的其它非同源序列。在一些实施方案中，进入序列的末端是闭合的，使得转化DNA形成闭合环。所述转化序列可以是野生型、突变体或经过修饰的。在一些实施方案中，所述DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其它实施方案中，所述DNA构建体包含非同源序列。一旦所述DNA构建体在体外装配完成，其可用于：1)向宿主细胞的期望靶序列插入异源序列，和/或2)诱变该宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替代内源序列)，3)缺失靶基因；和/或向宿主引入复制质粒。

如此处所用，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体，具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其它序列，表达载体的重组表达盒部分还包括待转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中整合并表达异源DNA片段的能力。可通过商业途径获得许多原核和真核表达载体。适当表达载体的选择为本领域技术人员所知。术语“表达盒”与“DNA构建体”以及其语法等同物此处可互换使用。适当表达载体的选择为本领域技术人员所知。

如此处所用，术语“载体”指设计来向一种或更多细胞类型引入核酸的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、表达盒等。在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如前体或成熟蛋白酶)的DNA序列，其有效连接能够实现DNA在合适宿主中表达的合适前序列(例如分泌序列等)。

如此处所用，术语“质粒”指用作克隆载体的环形双链(ds)DNA构建体，并且其在一些真核生物或原核生物中形成染色体外自我复制遗传元件，或整合到宿主染色体中。

如此处所用，在将核酸序列引入细胞的上下文中，术语“引入”指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。用于引入的此类方法包括，但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(参阅例如，Ferrari等,“Genetics,”Hardwood等,(编辑),Bacillus,PlenumPublishingCorp.,第57-72页,1989)。

如此处所用，术语“转化的”和“稳定转化的”指具有非天然(异源)多核苷酸序列整合到其基因组中或作为维持至少两代的游离型质粒的细胞。

如此处所用，术语“选择标记编码核苷酸序列”指核苷酸序列，其能够在宿主细胞中表达并且其中所述选择标记的表达赋予含有表达基因的细胞在存在相应选择剂或缺少基本营养的情况下生长的能力。

如此处所用，术语“选择标记”和“选择性标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)，其允许方便选择含有所述载体的那些宿主。此类选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂。因此，术语“选择标记”指提供这样的指示的基因：宿主已经接纳了进入的目的基因或已经发生了一些其它反应。通常，选择标记是基因，其赋予宿主细胞抗微生物剂抗性或代谢优势以允许将含有外源DNA的细胞与在转化过程中未接受任何外源序列的细胞区分开。“居留选择标记”是位于待转化的微生物染色体上的一个选择标记。居留选择标记编码与转化DNA构建体上的选择标记不同的基因。选择性标记为本领域所熟知。如上说明，优选地，所述标记是抗微生物剂抗性标记(例如，amp^R；phleo^R；spec^R；kan^R；ery^R；tet^R；cmp^R；和neo^R)(参阅例如，Guerot-Fleury,Gene,167:335–337,1995；Palmeros等,Gene247:255-264,2000；和Trieu-Cuot等,Gene,23:331-341,1983)。用于本发明的其它标记包括，但不限于营养缺陷型标记，如色氨酸；和缺失标记，如β-半乳糖苷酶。

如此处所用，术语“启动子”指作用于指导下游基因转录的核酸序列。在优选的实施方案中，所述启动子适合于其中表达靶基因的宿主细胞。所述启动子与其它转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)对于表达给定基因是必须的。一般而言，所述转录和翻译调节序列包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。

当其与另一核酸序列处于功能关系中时，核酸“有效连接”。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，编码分泌前导肽(即，信号肽)的DNA有效连接编码多肽的DNA；如果其影响所述序列的转录，那么启动子或增强子有效连接编码序列；或者，如果其以利于翻译的方式定位，那么核糖体结合位点有效连接编码序列。一般地，“有效连接”表示连接的DNA序列是相邻的，并且在分泌前导肽的情况下是相邻的并处于可读相。然而，增强子不必相邻。通过在方便的限制性位点的连接完成连接。如果该位点不存在，那么根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接子。

如此处所用，术语“基因”指编码多肽的多核苷酸(例如DNA区段)并包括编码区前面和后面的区域，以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如此处所用，“同源基因”指来自不同物种，但一般相关物种的一对基因，其彼此相互对应并且其彼此相同或非常相似。该术语包括通过物种形成(即，新物种发生)分离的基因(例如直向同源基因)，以及已经通过遗传复制分离的基因(例如旁系同源基因)。

如此处所用，“直向同源物”和“直向同源基因”指已经从共同祖先基因(即同源基因)通过物种形成进化来的不同物种中的基因。通常，直向同源物在进化过程中保留相同的功能。直向同源物的鉴定用于在新测序的基因组中可信地预测基因功能。

如此处所用，“旁系同源物”和“旁系同源基因”指通过基因组内复制相关的基因。尽管直向同源物在进化过程中保留相同的功能，而旁系同源物进化出新的功能，即使一些功能经常与最初的功能相关。旁系同源基因的实例包括，但不限于编码胰岛素、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，这些酶都是丝氨酸蛋白酶并在相同物种中发生。

如此处所用，“同源性”指序列相似性或同一性，优选同一性。使用本领域已知的标准技术测定该同源性(参阅例如，Smith和Waterman,AdvApplMath,2:482,1981；Needleman和Wunsch,JMolBiol,48:443,1970；Pearson和Lipman,ProcNatlAcadSciUSA,85:2444,1988；WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,Madison,WI中的程序如GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA；和Devereux等,NuclAcidRes,12:387-395,1984)。

如此处所用，“类似序列”是其中基因功能与基于解淀粉芽孢杆菌NprE蛋白酶的基因功能基本相同的序列。此外，类似基因包括与解淀粉芽孢杆菌NprE蛋白酶的序列具有至少约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％的序列同一性。在额外的实施方案中，多于一种上述性质应用于序列中。通过序列比对的已知方法测定类似序列。常用的比对方法是BLAST，尽管如上文和下文所述，还有也可用于比对序列中的其它方法。

有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用累积式、配对比对从相关序列组中产生多个序列比对。其也可绘制显示用于产生比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle的累积式比对的简化(Feng和Doolittle,JMolEvol,35:351-360,1987)。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似(Higgins和Sharp,CABIOS5:151-153,1989)。有用的PILEUP参数包括3.00的默认空位加权，0.10的默认空位长度加权，和加权末端空位。

有用算法的另一实例是Altschul等(Altschul等,JMolBiol,215:403-410,1990；和Karlin等,ProcNatlAcadSciUSA,90:5873-5787,1993)描述的BLAST算法。尤其有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参阅，Altschul等,MethEnzymol,266:460-480,1996)。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其大多数设置为默认值。用以下数值设置可调参数：重叠区间＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSPS和HSPS2参数是动态值，并由程序本身根据特定序列的组成和目的序列针对进行搜索的特定数据库的组成确定。然而，可调节数值以提高灵敏度。通过匹配的相同残基的数目除以比对区中“更长”序列的残基总数目来确定“％氨基酸序列同一性”。所述“更长的”序列是在比对区具有最实际残基的序列(忽略通过WU-Blast-2引入以使比对得分最大化的空位)。

因此，“百分之(％)核酸序列同一性”定义为候选序列中与起始序列(即目的序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法利用WU-BLAST-2的BLASTN模块设置默认参数，并且重叠区间和重叠分数分别设置为1和0.125。

如此处所用，术语“杂交”指如本领域已知，核酸的一条链与互补链通过碱基配对连接的过程。

如果两条序列在中等到高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性地杂交，那么认为核酸序列与参考核酸序列“选择性地杂交”。杂交条件基于核酸结合复合体或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高的严格性”通常出现在约Tm-5℃(探针Tm以下5°)；“高严格性”在Tm下约5-10℃；“中等严格性”在探针Tm下约10-20℃；并且“低严格性”在Tm下约20-25℃。在功能上，最高严格性条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近似严格同一性的序列；而中等或低严格性杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。

中等和高严格性杂交条件为本领域所熟知。高严格性条件的实例包括在约42℃下50％甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中的杂交，然后在室温2XSSC和0.5％SDS中洗涤两次并在42℃下0.1XSSC和0.5％SDS中额外洗涤两次。中等严格条件的实例包括在37℃下包含20％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性切割的鲑精DNA中过夜温育，然后在约37-50℃下1xSSC中洗涤滤膜。本领域的技术人员知道怎么调整温度、离子强度等以适应如探针长度等因素。

如此处所用，“重组的”包括细胞或载体，已经通过引入异源核酸序列修饰了所述细胞或载体，或该细胞来自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达天然(非重组)形式的细胞内未以相同形式发现的基因，或表达因为刻意人为干扰不正常表达的、减少表达或根本不表达的天然基因。“重组”、“重组”和产生“重组的”核酸通常是两个或更多核酸片段的装配，其中所述装配产生嵌合基因。

在优选实施方案中，在至少一个密码子中利用位点饱和诱变产生突变体DNA序列。在另一优选实施方案中，为一个或更多密码子进行位点饱和诱变。在其它实施方案中，突变体DNA序列与野生型序列具有高于约50％、高于约55％、高于约60％、高于约65％、高于约70％、高于约75％、高于约80％、高于约85％、高于约90％、高于约95％，或高于约98％的同源性。在备选实施方案中，使用任何已知的诱变程序，如放射、亚硝基胍等在体内产生突变体DNA。然后分离想要的DNA序列并用于此处提供的方法中。

如此处所用，术语“靶序列”指宿主细胞中编码这样序列的DNA序列，其中期望进入序列插入到宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，所述靶序列编码功能野生型基因或操纵子，而在其它实施方案中，所述靶序列编码功能突变基因或操纵子，或非功能基因或操纵子。

如此处所用，“侧翼序列”指正在讨论的序列上游或下游的任何序列(例如，对于基因A-B-C，B基因侧翼是基因序列A和C)。在优选的实施方案中，进入序列每一侧翼为同源性盒。在另一实施方案中，所述进入序列和同源性盒包含每一侧翼为填充序列的单元。在一些实施方案中，侧翼序列仅在一边(3’或5’)存在，但在优选的实施方案中，其位于被侧翼序列的每一边上。在一些实施方案中，侧翼序列仅在一边(3’或5’)存在，但在优选的实施方案中，其位于被侧翼序列的每一边上。

如此处所用，术语“填充序列”指在同源性盒(通常是载体序列)侧翼的任何额外DNA。然而，所述术语包括任何非同源DNA序列。不受任何理论限制，填充序列为细胞起始DNA吸收提供非临界靶点。

如此处所用，术语“扩增”和“基因扩增”指特定DNA序列不成比例复制使得扩增的基因以比基因组内最初存在的拷贝数更高的拷贝数存在的过程。在一些实施方案中，通过在药物(例如，可抑制酶的抑制剂)存在下的生长选择细胞导致内源基因的扩增或外源(即，输入)序列的扩增或内源基因和外源序列的扩增，所述内源基因编码在该药物存在下生长需要的基因产物，所述外源基因编码该基因产物。

“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特定事例。其与非特异性模板复制(即依赖模板而不依赖特异模板的复制)相反。模板特异性此处区别于复制的保真性(即，适当多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常描述为“靶标”特异性。在认为靶序列从其它核酸分离的意义上，靶序列为“靶标”。主要从该分离中设计扩增技术。

如此处所用，术语“共扩增”指向单个细胞中引入扩增标记与其它基因序列(即，包含一个或更多非选择基因，如表达载体中含有的那些基因)的组合并应用适当的选择压力使得所述细胞扩增所述扩增标记以及其它非选择基因序列。所述扩增标记可在物理上与其它基因序列连接，或者两条分开的DNA可引入同一细胞中，其中一条含有所述扩增标记，另一条含有非选择标记。

如此处所用，术语“扩增标记”、“扩增基因”和“扩增载体”指基因或编码基因的载体，其允许在适当生长条件下扩增该基因。

通过选择酶在大多数扩增技术中实现“模板特异性”。扩增酶是在使用该酶的条件下将仅处理核酸异质混合物中核酸的特异序列的酶。例如，在Qβ复制酶的情况下，MDV-1RNA是复制酶的特异模板(参阅例如，Kacian等,ProcNatlAcadSciUSA69:3038,1972)并且其它核酸不由该扩增酶复制。类似地，在T7RNA聚合酶的情况下，该扩增酶对其自己的启动子具有严格的特异性(参阅，Chamberlin等,Nature228:227,1970)。在T4DNA连接酶的情况下，所述酶不连接两个寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸底物与模板在连接点具有错配(参阅，Wu和Wallace,Genomics4:560,1989)。最后，发现Taq和Pfu聚合酶由于其在高温下起功能的能力，对结合的序列显示高特异性并因此由引物确定；高温导致利于引物与靶序列进行杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件。

如此处所用，术语“扩增核酸”指可通过任何扩增方法扩增的核酸。认为“扩增核酸”一般包含“样品模板”。

如此处所用，术语“样品模板”指来自样品的核酸，其中分析了所述样品中“靶标”(下文定义)的存在。相反，“背景模板”用于指除样品模板以外的核酸，其可能或不可能存在于样品中。背景模板最经常不被注意。其可能是因为携带污染的结果，或者其可能是由于试图从样品中纯化掉的核酸污染物的存在。例如，来自除待检测的那些生物之外的生物的核酸可作为背景存在于测试样品中。

如此处所用，术语“引物”指寡核苷酸，无论是在纯化的限制性酶切消化物中天然发生的还是合成产生的，当其至于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时(即，在存在核苷酸和诱导剂，如DNA聚合酶并在合适的温度和pH下)能够作为合成起始的位点起作用。所述引物优选为单链，用于扩增中的最大效率，但或者也可以是双链的。如果是双链的，所述引物在用于制备延伸产物前首先经过处理以分开其两条链。优选地，所述引物是寡脱氧核糖核苷酸。该引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

如此处所用，术语“探针”指寡核苷酸(即，核苷酸的序列)，无论是在纯化的限制性酶切消化物中天然发生的还是合成、重组或通过PCR扩增产生的，其能够与另一目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于检测、鉴定和分离特定的基因序列。认为用于本发明的任何探针将标记有任何“报告分子”，使得其在任何检测系统，包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统中是可以检测的。不期望本发明受限于任何特定检测系统或标记。

如此处所用，当用于聚合酶链式反应时，术语“靶标”指用于聚合酶链式反应的引物结合的核酸区域。因此，试图将所述“靶标”与其它核酸序列区分开。“区段”定义为靶序列内的核酸区域。

如此处所用，术语“聚合酶链式反应”("PCR")指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188(特此引入作为参考)的方法，其包括在不进行克隆或纯化的情况下提高基因组DNA的混合物中靶序列区段的浓度的方法。用于扩增靶序列的该方法由向含有想要的靶序列的DNA混合物中引入大量过量两条寡核苷酸引物，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序组成。两条引物与其双链靶序列的各条链互补。为了完成扩增，将所述混合物变性，然后将所述引物退火到靶分子内的其互补序列上。退火后，利用聚合酶延伸所述引物，以形成新的互补链对。可重复变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤多次(即，变性、退火和延伸组成一个“循环”；可有许多“循环”)，以获得高浓度的想要的靶序列的扩增区段。通过引物彼此间相对位置测定想要的靶序列的扩增区段的长度，并因此，该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法称为“聚合酶链式反应”(下文称“PCR”)。因为靶序列的想要的扩增区段成为混合物中的主要序列(在浓度方面)，称它们为“PCR扩增的”。

如此处所用，术语“扩增试剂”指除引物、核酸模板和扩增酶以外的扩增需要的那些试剂(三磷酸脱氧核糖核苷酸、缓冲液等)。通常，在反应容器(试管、微孔等)中放置并含有扩增试剂以及其它反应组分。

利用PCR可以将基因组DNA中特异靶序列的单拷贝扩增到可通过几种不同方法(例如，利用标记探针杂交；掺入生物素化的引物，然后通过抗生物素蛋白-酶缀合物检测；向扩增区段中掺入³²P-标记的三磷酸脱氧核苷酸，如dCTP或dATP)可检测的水平。除了基因组DNA，可利用适当组的引物分子扩增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。具体而言，通过PCR方法本身产生的扩增区段本身是用于随后PCR扩增的有效模板。

如此处所用，术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”指一个或更多循环的变性、退火和延伸的PCR步骤完成后获得的化合物的混合物。这些术语包括这样的情况，其中已经扩增了一个或更多靶序列的一个或更多区段。

如此处所用，术语“RT-PCR”指RNA序列的复制和扩增。在该方法中，反转录与PCR偶联，大多数经常使用一种酶步骤，其中使用热稳定性聚合酶，如美国专利号5,322,770中所述，此处引入作为参考。在RT-PCR中，由于所述聚合酶的反转录酶活性将RNA模板转化成cDNA，然后使用该聚合酶的聚合活性进行扩增(即，如在其它PCR方法中)。

如此处所用，术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指细菌酶，其各自切割特定核苷酸序列上或附近的双链DNA。

“限制性位点”指给定限制性内切核酸酶识别并切割的核苷酸序列，并且经常是插入DNA片段的位点。在本发明的某些实施方案中，将限制性位点工程化到选择标记中和DNA构建体的5'和3'端中。

如此处所用，术语“染色体整合”指其中将进入序列引入宿主细胞的染色体中的过程。转化DNA的同源区域与染色体的同源区域排列在一起。随后，同源盒间的序列在双交换中被进入序列替换(即同源重组)。在本发明的一些实施方案中，DNA构建体的失活染色体区段的同源部分与芽孢杆菌染色体天然染色体区域的侧翼同源区域排列在一起。随后，所述天然染色体区域在双交换中被DNA构建体缺失(即同源重组)。

“同源重组”表示在相同或近于相同的核苷酸序列的位点处的两个DNA分子和配对染色体之间的DNA片段的交换。在优选的实施方案中，染色体整合是同源重组。如此处所用，“同源序列”表示当最佳比对用于比较时，与另一核酸或多肽序列具有约100％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约88％、约85％、约80％、约75％或约70％的序列同一性的核酸或多肽序列。在一些实施方案中，同源序列具有约85％到约100％的序列同一性，而在其它实施方案中，具有约90％到约100％的序列同一性，并且在更优选的实施方案中，具有约95％到约100％的序列同一性。

如此处所用，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。

如此处所用，术语“异源蛋白质”指并非宿主细胞中天然发生的蛋白质或多肽。异源蛋白质的实例包括酶，如水解酶，包括蛋白酶。在一些实施方案中，编码蛋白质的基因并非天然发生的基因，而在其它实施方案中，使用突变的和/或合成的基因。

如此处所用，“同源蛋白质”指细胞中天然的或天然发生的蛋白质或多肽。在优选的实施方案中，所述细胞是革兰氏阳性细胞，而在特别优选的实施方案中，所述细胞是芽孢杆菌宿主细胞。在备选实施方案中，所述同源蛋白质是其它生物产生的天然蛋白质，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)。本发明包括通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。

如此处所用，“操纵子区”包含一组相邻基因，其作为单一转录单元从共同的启动子转录，并由此受到共调节。在一些实施方案中，所述操纵子包括调节基因。在最优选的实施方案中，使用如通过RNA水平测定高表达的，但具有未知或不必要功能的操纵子。

如此处所用，“抗微生物区”是含有编码抗微生物蛋白质的至少一个基因的区域。

如果多核苷酸处于其天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，其可转录和/或翻译以产生RNA、多肽或其片段，那么称该多核苷酸“编码”RNA或多肽。也认为该核酸的反义链编码所述序列。

如本领域已知，可通过RNA聚合酶转录DNA，以产生RNA，但RNA可通过反转录酶反转录以产生DNA。因此，DNA可编码RNA，反之亦然。

术语“调节区段”或“调节序列”或“表达控制序列”指DNA的多核苷酸序列，其与编码多肽链氨基酸序列的DNA的多核苷酸序列有效连接，以实现所编码氨基酸序列的表达。所述调节序列可抑制、阻抑或促进编码所述氨基酸的有效连接的多核苷酸序列的表达。

“宿主菌株”或“宿主细胞”指包含本发明DNA的表达载体的合适宿主。

如果酶在细胞中以比在相应野生型细胞中的表达水平更高的水平表达，那么酶在宿主细胞中“过表达”。

术语“蛋白质”和“多肽”此处可互换使用。在该公开内容中使用与IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(JCBN)一致定义的氨基酸的3字母密码。也应理解，因遗传密码的简并性，一种多肽可由多于一种核苷酸序列编码。

“前序列”是信号序列与成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，其对蛋白酶的分泌是必须的。前序列的切割将产生成熟的活性蛋白酶。

术语“信号序列”或“信号肽”指参与蛋白质成熟或前体形式分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信号序列的该定义是功能性定义，旨在包括蛋白质基因N末端部分编码的所有那些氨基酸序列，其参与蛋白质分泌的实现。它们经常，但不普遍结合蛋白质的N末端部分或前体蛋白质的N末端部分。所述信号序列可以是内源的或外源的。所述信号序列可以是与蛋白质(例如蛋白酶)正常结合的，或可来自编码另一分泌蛋白质的基因。一个示例性外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前7个氨基酸残基，其融合到来自迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶的信号序列的剩余部分。

术语“杂合信号序列”指信号序列，其中从表达宿主中获得的序列的部分融合到待表达的基因的信号序列上。在一些实施方案中，使用合成序列。

术语蛋白质或肽的“成熟”形式指蛋白质或肽的最终功能形式。为了例证，本发明NprE蛋白酶的成熟形式至少包括SEQIDNO:3的氨基酸序列。

术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有有效连接蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的蛋白质的成熟形式。所述前体也可具有有效连接前序列氨基末端的“信号”序列。所述前体也可具有参与翻译后活性的额外的多核苷酸(例如，从其切割多核苷酸以留下蛋白质或肽的成熟形式)。

“天然发生的酶”指具有与在自然界中发现的酶氨基酸序列相同的未修饰氨基酸序列的酶。天然发生的酶包括天然酶，在特定微生物中自然表达或发现的那些酶。

术语“来自”或“获得自”不仅指正在讨论的生物菌株产生的或可产生的蛋白酶，还指从该菌株分离的DNA序列编码的和含有该DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外，该术语指合成和/或cDNA来源的DNA序列编码的并且具有正在讨论的蛋白酶鉴定特性的蛋白酶。为了例证，“来自芽孢杆菌的蛋白酶”指具有芽孢杆菌天然产生的蛋白水解活性的那些酶，以及类似芽孢杆菌来源产生的那些中性金属蛋白酶的中性金属蛋白酶，但其使用遗传改造技术通过转化有编码该中性金属蛋白酶的核酸的非解淀粉芽孢杆菌生物产生。

该定义范围内的“衍生物”在所述衍生物用于与野生型、天然或亲本形式类似目的的程度上通常保留在野生型、天然或亲本形式中观察到的特征性蛋白水解活性。中性金属蛋白酶的功能衍生物包括天然发生的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本发明中性金属蛋白酶的一般特性。

术语“功能衍生物”指核酸的衍生物，其具有编码中性金属蛋白酶的核酸的功能特性。编码本发明中性金属蛋白酶的核酸的功能衍生物包括天然发生的、合成或重组产生的核酸或片段，并编码本发明的中性金属蛋白酶特性。编码本发明中性金属蛋白酶的野生型核酸包括天然发生的等位基因和基于本领域已知的遗传密码简并性的同源物。

在两条核酸或多肽序列的上下文中术语“相同的”指如使用以下序列比较或分析算法测定，当比对最大对应时时两条序列中相同的残基。

术语“最佳比对”指给出最高百分比同一性得分的比对。

对于两条氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(适当时)，“百分比序列同一性”、“百分比氨基酸序列同一性”、“百分比基因序列同一性”和/或“百分比核酸/多核苷酸序列同一性”指当序列进行最佳比对时，两条序列中相同残基的百分比。从而，“80％氨基酸序列同一性”指两条最佳比对的多肽序列中80％的氨基酸是相同的。

在两条核酸或多肽的上下文中短语“基本相同”因此指利用使用标准参数，使用程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)与参考序列比较，包含至少约70％序列同一性、优选至少约75％、优选至少约80％、优选至少约85％、优选至少约90％、优选至少约95％、优选至少约97％、优选至少约98％并优选至少约99％序列同一性的多核苷酸或多肽。两条多核苷酸基本相同的一个指示是第一条多肽与第二条多肽免疫交叉反应。通常，因保守氨基酸替代而不同的多肽会免疫交叉反应。因此，多肽与第二条多肽基本相同，例如，其中所述两条肽仅因保守替代而不同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子在严格条件(例如在从中等严格性到高严格性的范围内)下彼此杂交。

术语“分离的”或“纯化的”指从其初始环境(例如如果是天然发生的，则是自然环境)中取出来的材料。例如，当其以高于或低于天然发生或野生型生物中存在的浓度存在于特定组合物中时，或与并不是从天然发生的或野生型生物中表达后正常存在的组分结合时，称所述材料为“纯化的”。例如，在活体动物中存在的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从自然系统中一些或所有共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽却是分离的。此类多核苷酸可以是载体的部分，和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且因为该载体或组合物不是其自然环境中的一部分，所以其仍然是分离的。在优选的实施方案中，例如如果在电泳凝胶或印迹中基本产生一条带，则称核酸或蛋白质为纯化的。

当指DNA序列时，术语“分离的”指从其自然遗传环境中取出的DNA序列，并因此没有其它外来的或不想要的编码序列，并且处于适合用于遗传改造蛋白质产生系统的形式。此类分离的分子是从其自然环境中分离的那些分子，并包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子没有其通常结合的其它基因，但可包括天然发生的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。结合区的鉴定对本领域普通技术人员将是显而易见的(参阅例如Dynan和Tijan,Nature316:774-78,1985)。术语“分离的DNA序列”或者称作“克隆的DNA序列”。

当指蛋白质时，术语“分离的”指在除其自然环境外的条件下发现的蛋白质。在优选的形式中，所述分离的蛋白质基本没有其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质。如通过SDS-PAGE测定，分离的蛋白质高于约10％纯，优选高于约20％纯，并甚至更优选高于约30％纯。本发明的其它方面包括如通过SDS-PAGE测定高度纯化形式(即，高于约40％纯，高于约60％纯、高于约80％纯、高于约90％纯、高于约95％纯、高于约97％纯并甚至高于约99％纯)的蛋白质。

可使用以下盒式诱变方法来促进本发明酶变体的构建，尽管也可使用其它方法。首先，如此处所述，获得编码该酶的天然发生的基因并完整或部分地测序。然后，扫描序列寻找一个点，在该点上期望突变(缺失、插入或替代)所编码酶中的一个或更多氨基酸。评估该点侧翼序列上限制性位点的存在，用于用寡核苷酸库替换该基因的短区段，所述寡核苷酸库当表达时将编码多种突变体。此类限制性位点优选为蛋白质基因内的独特位点，以便于替换基因区段。然而，可使用在酶基因中并不十分冗余的任何便利的限制性位点，只要通过限制酶消化产生的基因片段可装配成正确的序列。如果限制性位点在距离所选位点方便距离(从10到15个核苷酸)内的位置上不存在，可以这样的方式通过在基因中替代核苷酸产生此类位点：在最终构建中既不改变读码框，也不改变编码的氨基酸。根据通常已知的方法，通过M13引物延伸完成基因突变，改变其序列以与想要的序列一致。通过遗传密码的冗余、基因的限制性酶切图谱和大量不同限制性酶常规进行定位合适侧翼区和评估到达两个方便的限制性位点序列需要的改变的工作。注意如果可得到便利的侧翼限制性位点，上述方法需要仅与不含位点的侧翼区连接。

一旦克隆了天然发生的DNA和/或合成的DNA，用同源限制性酶消化待突变的位置侧翼的限制性位点，并将多个末端互补寡核苷酸盒连接到基因上。因为可以合成所有寡核苷酸以具有相同的限制性位点并且不需要任何合成连接体来产生限制性位点，所以可通过该方法简化诱变。

如此处所用，“对应于”指在蛋白质或肽中列举位置处的残基或与蛋白质或肽中列举的类似、同源或等同的残基。

如此处所用，“对应区域”一般指沿相关蛋白质或亲本蛋白质的类似位置。

如此处所用，术语“组合诱变”指其中产生起始序列变体文库的方法。在这些文库中，所述变体包含选自预先定义组突变的一种或几种突变。此外，所述方法提供手段以引入随机突变，其不是预先定义组的突变成员。在一些实施方案中，所述方法包括在2000年10月26日提交的美国申请号09/699,250(特此引入作为参考)中阐明的那些方法。在备选实施方案中，组合诱变方法包括市售的试剂盒(例如，Multisite,Stratagene,SanDiego,CA)。

如此处所用，术语“突变体文库”指在其大部分基因组中相同的细胞群，但包括一个或更多基因的不同同源物。此类文库可用于例如鉴定具有改善性状的基因或操纵子。

如此处所用，术语“起始基因”和“亲本基因”指待使用本发明提高和/或改变的编码目的蛋白质的目的基因。

如此处所用，术语“多序列比对”和“MSA”指使用算法(例如ClustalW)比对的起始基因的多个同源物的序列。

如此处所用，术语“共有序列”和“正规序列”指特定蛋白质或目的序列的所有变体针对其比较的原始型氨基酸序列。这些术语也指阐明在目的DNA序列中最经常存在的核苷酸的序列。对于基因的各位置，所述共有序列给出在MSA中该位置中最丰富的氨基酸。

如此处所用，术语“共有突变”指起始基因序列和共有序列中的差异。通过比较起始基因序列与从MSA获得的共有序列鉴定共有突变。在一些实施方案中，将共有突变引入所述起始基因中，使得其与共有序列更相似。共有突变也包括氨基酸改变，所述改变将起始基因内中的氨基酸变成在MSA中该位置上相对于起始基因中所述氨基酸的频率更经常发现的氨基酸。因此，术语共有突变包含用比MSA中氨基酸更丰富的氨基酸替换起始基因中的氨基酸的所有单个氨基酸改变。

术语“修饰序列”和“修饰基因”此处互换使用，指包括天然发生的核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在一些优选的实施方案中，所述修饰序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断)。在一些特别优选的实施方案中，所述截短的蛋白质保留生物学活性。在备选实施方案中，所述修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，包含向核酸序列插入的修饰)。在一些实施方案中，插入产生截短的蛋白质(例如，当所述插入导致终止密码子形成时)。因此，插入可产生截短的蛋白质或延长的蛋白质作为表达产物。

如此处所用，术语“突变体序列”和“突变体基因”互换使用并指在宿主细胞野生型序列中发生的至少一个密码子中具有改变的序列。所述突变体序列的表达产物是相对于野生型具有改变的氨基酸序列的蛋白质。所述表达产物可能具有改变的功能能力(例如提高的酶促活性)。

术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(此处互换使用)旨在表示对应于部分模板序列并能够与其杂交的寡核苷酸组合物。关于诱变引物，所述引物不用精确匹配模板核酸，引物中的错配或多个错配可用于向核酸文库中引入想要的突变。如此处所用，“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一优选实施方案中，设计所述引物使得对于已经包括诱变引物的至少一个区域，在寡核苷酸混合物中也包括非诱变引物。通过添加诱变引物和对应于至少一条诱变引物的非诱变引物的混合物，产生其中呈现多种组合突变模式的所得核酸文库是可能的。例如，如果期望突变体核酸文库的一些成员在某些位置上保留其亲本序列，而其它成员在该位点上突变，那么所述非诱变引物提供在核酸文库内获得给定残基的特定水平非突变体成员的能力。本发明的方法使用诱变和非诱变寡核苷酸，其长度一般在10-50个碱基之间，更优选长度为约15-45个碱基。然而，使用短于10个碱基或长于50个碱基的引物获得想要的诱变结果可能是必须的。对于相应的诱变和非诱变引物，相应的寡核苷酸长度不必相同，只要对应于待添加的突变的区域中具有重叠。

根据本发明按照预先定义的比例加入引物。例如，如果期望所得的文库在相同位点或不同位点处具有显著水平的某些特定突变和更少量的不同突变，通过调整加入的引物量可以产生想要的偏倚文库。或者，通过加入更少或更多量的非诱变引物，可以调整突变体核酸文库中产生相应突变的频率。

术语“野生型序列”或“野生型基因”此处互换使用来指宿主细胞中天然的或天然发生的序列。在一些实施方案中，所述野生型序列指蛋白质改造工程起始点的目的序列。所述野生型序列可编码同源或异源蛋白质。同源蛋白质是宿主细胞不受干预产生的蛋白质。异源蛋白质是宿主细胞只有受干预才产生的蛋白质。

如此处所用，除非另有说明，术语“清洁组合物”包括通用的颗粒或粉剂形式或“重型”洗涤剂，尤其是清洁去污剂；通用的液体、凝胶或糊剂形式的洗涤剂，尤其是所谓的重型液体类型；液体精细织物去污剂；手洗碗剂或轻型洗碗剂，尤其是那些高度发沫类型；机器洗碗剂，包括多种片剂、颗粒、液体和用于家居和工业用途的助冲洗类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗细菌手洗类型、清洁条、漱口剂、牙齿清洁剂、汽车洗涤剂或地毯洗涤剂、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁辅助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。

除非另有说明，所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平，并不计杂质，例如残留溶剂或副产物，其可存在于市售来源中。

酶组分重量基于总的活性蛋白质。通过重量计算所有百分比和比例，除非另有说明。基于总的组合物计算所有百分比和比例，除非另有说明。

术语“清洁活性”指在本发明蛋白水解、水解、清洁或其它过程中普遍的条件下通过蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，通过应用涉及酶灵敏污物，例如草、血液、奶或卵蛋白的多种清洁测定法测定清洁性能，如在将所述污物置于标准的洗涤条件后通过多种色谱、分光光度计测量或其它定量方法测定。示例性测定法包括，但不限于在WO99/34011和美国专利号6,605,458(两者此处引入作为参考)中描述的那些测定，以及实施例中包括的那些方法。

术语蛋白酶的“清洁有效量”指上文描述的蛋白酶的量，其达到了在特定清洁组合物中酶促活性的想要水平。本领域一名普通技术人员容易地确定该有效量并且其基于许多因素，如使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的特定组成和需要液体还是干(例如颗粒、条状)组合物等。

如此处所用，术语“清洁辅助材料”表示为特定类型的想要的清洁组合物和产品形式选择的任何液体、固体或气态物质(例如，液体、颗粒、粉剂、条剂、糊剂、喷雾、片剂、凝胶；或泡沫组合物)，所述物质也优选与所述组合物中使用的蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物是“紧密”形式，而在其它实施方案中，液体组合物处于“浓缩”形式。

如此处所用，“低去污剂浓度”系统包括其中在洗涤水中存在少于约800ppm去污剂组分的去污剂。通常认为日本去污剂是低去污剂浓度系统，因为它们在洗涤水中一般具有大约667ppm去污剂组分。

如此处所用，“中去污剂浓度”系统包括其中在洗涤水中存在约800ppm到约2000ppm去污剂组分的去污剂。一般认为北美去污剂是中等去污剂浓度，因为它们在洗涤水中一般具有大约975ppm的去污剂组分。巴西去污剂在洗涤水中通常具有大约1500ppm的去污剂组分。

如此处所用，“高去污剂浓度”系统包括其中在洗涤水中存在高于约2000ppm去污剂组分的去污剂。一般认为欧洲去污剂是高去污剂浓度，因为它们在洗涤水中一般具有大约3000-8000ppm的去污剂组分。

如此处所用，“织物清洁组合物”包括手动和机械洗衣房去污剂组合物，其包括洗衣房添加组合物和适合用于浸泡和/或预处理污染织物(例如，衣服、亚麻织物和其它纺织材料)的组合物。

如此处所用，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即织物)表面清洁组合物，包括但不限于洗碗去污剂组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物和私人清洁组合物。

此处清洁组合物的“紧密”形式通过密度得到最佳反映，并且在组合物方面，通过无机填充盐的量得到最佳反映。无机填充盐是粉剂形式去污剂组合物的常规成分。在常规去污剂组合物中，所述填充盐通常以总组合物重量计17-35％的基本量存在。相反，在紧密组合物中，所述填充盐以不超过15％总组合物的量存在。在一些实施方案中，所述填充盐以组合物重量计不超过10％，或更优选5％的量存在。在一些实施方案中，所述无机填充盐选自硫酸盐和氯化物的碱和碱土金属盐。优选的填充盐是硫酸钠。

当用于指蛋白质(例如酶)时，术语“内源的”表示其已经从宿主细胞或目的生物的天然基因中表达。

当此处用于指蛋白质(例如酶)时，术语“外源的”表示已经从引入宿主细胞或目的生物的外源基因中表达。

如此处所用，术语“无丝氨酸蛋白酶”、“相对缺少丝氨酸蛋白酶”和“基本没有丝氨酸蛋白酶”指含有很少到没有可测定丝氨酸蛋白酶的组合物(例如，处于或低于检测水平的蛋白质或活性)。在一些实施方案中，组合物的丝氨酸蛋白酶含量低于0.050U/ml，优选低于0.025U/ml，更优选低于0.005U/ml，并最优选低于0.0025U/ml(例如在AAPF测定中测定的)。在一些实施方案中，所述组合物包含中性金属蛋白酶。

如此处所用，术语“无丝氨酸蛋白酶背景”等指目的蛋白质通过表达很少到没有可测定丝氨酸蛋白酶(例如蛋白质或活性)的生物(例如丝氨酸蛋白酶缺失的产生菌株)产生。在一些优选实施方案中，所述生物被修饰，使得编码至少一种丝氨酸蛋白酶的基因已经缺失或突变，使得所述生物不再能够产生所述丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，所述丝氨酸蛋白酶缺失的产生菌株表达低于约1％，优选低于约0.5％，更优选低于约0.1％并最优选低于约0.05％的相应野生型菌株(或不包含丝氨酸蛋白酶基因缺失或失活的亲本菌株)的丝氨酸蛋白酶活性。

发明详述

中性金属内切肽酶(即，中性金属蛋白酶)(EC3.4.24.4)属于蛋白酶种类，其催化活性完全需要锌离子。这些酶在中性pH中具最佳活性并且大小在30到40kDa范围内。中性金属蛋白酶结合两个到四个钙离子，其促进蛋白质结构稳定性。在金属蛋白酶活性位点处结合的金属离子是允许水分子激活的基本特征。所述水分子然后作为亲核基团起作用并切割肽键的羰基。

本发明提供方法和在相对缺少丝氨酸蛋白酶污染情况下包含至少一种中性金属蛋白酶的组合物。在一些实施方案中，所述中性金属蛋白酶可用于清洁和其它应用。在一些尤其优选的实施方案中，本发明提供方法和包含被改造以缺少多种丝氨酸蛋白酶的芽孢杆菌菌株的组合物，以及其在产生重组中性金属蛋白酶中的用途。

如此处所述，制备用于表达NprE的整合质粒并将其转化到具有一个或更多酶基因缺失或失活的芽孢杆菌宿主菌株中。然后将所述整合质粒转化到2-缺失宿主菌株中，产生EL534和EL535(例如实施例7)。然后将EL534的染色体DNA转化到5-缺失宿主菌株(例如实施例10)和8-缺失宿主菌株(例如实施例12)中。为2-缺失、5-缺失和8-缺失菌株运行发酵罐以评估残留的丝氨酸蛋白酶污染。在SDS-PAGE凝胶上、通过AAPF测定和宿主细胞上清液的蛋白质条带的N末端测序分析三种宿主菌株的发酵样品，所述蛋白质条带大小范围在20-30kDa到100kDa之间。以这种方式，将Vpr鉴定为推测的污染性丝氨酸蛋白酶。将来自EL534的染色体DNA转化到3-缺失、4-缺失和6-缺失菌株中。分析3-缺失(EL552)、4-缺失(EL553)和6-缺失(EL547)菌株的发酵样品表明EL547也提供无丝氨酸蛋白酶背景。如此在本发明一些优选的实施方案中，使用所述6-缺失菌株和8-缺失菌株来产生重组中性金属蛋白酶。

本发明清洁和去污制剂的详细描述

除非另有说明，此处提供的所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平，并且不计杂质，例如残留溶剂或副产物，其可存在于市售来源中。酶组分重量基于总的活性蛋白质。通过重量计算所有百分比和比例，除非另有说明。基于总的组合物计算所有百分比和比例，除非另有说明。

在示例性去污剂组合物中，通过以总组合物重量计的纯酶表示酶水平，并且除非另有说明，所述去污剂成分以总组合物的重量表述。

包含中性金属蛋白酶的清洁组合物

本发明的中性金属蛋白酶用于配制多种去污剂组合物。本发明的清洁组合物可有利地用于例如洗衣房应用、硬表面清洁、自动洗碗应用，以及化妆品应用，如假牙、牙齿、头发和皮肤。然而，由于在更低温溶液中具有提高的效果和极好的颜色安全模式的独特优势，本发明的酶理想地适合于洗衣房应用，如漂白织物。此外，本发明的酶用于颗粒和液体组合物中。

本发明的酶也用于清洁添加产品。当想要额外的漂白效果时，包括本发明至少一种酶的清洁添加产品理想地适合包括在洗涤过程中。这种情况包括，但不限于低温溶液清洁应用。添加产品其最简单的形式是如本发明提供的一种或更多中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，所述添加物以剂量形式包装用于添加到清洁过程中，其中使用过氧来源并期望具有提高的漂白效果。在一些实施方案中，单一剂量形式包含丸剂、片剂、软胶囊或包括预定粉剂和/或液体的其它单一剂量单位。在一些实施方案中，包括填充剂和/或载体材料，以增加该组合物的体积。合适的填充剂或载体材料包括，但不限于，多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐以及滑石、粘土等。在一些实施方案中，用于液体组合物的填充剂和/或载体材料包括水和/或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇。此类醇的实例包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，所述组合物包含约5％到约90％的这种物质。在额外的实施方案中，使用酸性填充剂降低组合物的pH。在一些备选实施方案中，所述清洁添加物包括如下文所述至少一种激活的过氧来源和/或如下文更详细描述的添加成分。

本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要本发明提供的有效量的中性金属蛋白酶。在一些实施方案中，通过添加一种或更多种本发明提供的中性金属蛋白酶达到酶的需要水平。通常，本发明的清洁组合物包含至少0.0001重量百分比，从约0.0001到约1，从约0.001到约0.5，或甚至从约0.01到约0.1重量百分比的本发明提供的至少一种中性金属蛋白酶。

在一些优选实施方案中，通常配制此处提供的清洁组合物，使得在用于水性清洁操作中，洗涤水具有从约5.0到约11.5的pH，或在备选实施方案中，甚至从约6.0到约10.5。在一些优选的实施方案中，通常配制液体产品制剂，以具有约3.0到约9.0的净pH，而在一些备选实施方案中，所述制剂具有从约3到约5的净pH。在一些优选实施方案中，通常配制颗粒洗衣房产品以具有从约8到约11的pH。用于将pH控制在推荐使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸，等，并为本领域技术人员所熟知。

在一些特别优选的实施方案中，当在颗粒组合物或液体中使用至少一种中性金属蛋白酶时，所述中性金属蛋白酶是胶囊化颗粒的形式，以保护所述酶在储存过程中免于接触颗粒组合物的其它组分。此外，胶囊化也提供了在清洁过程中控制中性金属蛋白酶可用性的手段并可提高所述中性金属蛋白酶的性能。期望本发明的胶囊化中性金属蛋白酶用于多种环境中。也期望使用任何合适的胶囊化材料和本领域中已知的方法对所述中性金属蛋白酶进行胶囊化。

在一些优选实施方案中，所述胶囊化材料通常将至少一部分中性金属蛋白酶催化剂包入胶囊内。在一些实施方案中，所述胶囊化材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些额外实施方案中，所述胶囊化材料具有0℃或更高的玻璃转化温度(Tg)(为了获得关于玻璃转化温度的更多信息，参阅例如WO97/11151，尤其是从第6页，第25行到第7页，第2行)。

在一些实施方案中，胶囊化材料选自碳水化合物、天然或合成树胶、壳多糖和壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。在一些实施方案中，所述胶囊化材料是碳水化合物，其选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些优选的实施方案中，所述胶囊化材料是淀粉(对于一些示例性的合适淀粉的描述，参阅例如EP0922499；US4,977,252.US5,354,559,和US5,935,826)。

在额外的实施方案中，所述胶囊化材料包含由塑料制成的微球体(例如热塑塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；使用的市售微球体，包括但不限于[CascoProducts,Stockholm,Sweden]、PM6545、PM6550、PM7220、PM7228、和[PQCorp.,ValleyForge,PA]、和[PottersIndustries,Inc.,Carlstadt,NJ和ValleyForge,PA])。

制备并使用申请人的清洁组合物的方法

在一些优选实施方案中，本发明的组合物配制成任何合适的形式并通过配制者选择的任何方法进行制备(对于一些非限制性实例，参阅例如U.S.5,879,584、U.S.5,691,297、U.S.5,574,005、U.S.5,569,645、U.S.5,565,422、U.S.5,516,448、U.S.5,489,392和U.S.5,486,303)。在其中想要低pH清洁组合物的一些实施方案中，通过加入酸性物质如HCl调节该组合物的pH。

辅助材料

虽然对本发明目的并非至关重要，但在一些实施方案中，此处描述的添加剂的非限制性列表适合用于本发明的清洁组合物。实际上，在一些实施方案中，将添加剂掺入本发明的清洁组合物中。在一些实施方案中，辅助材料帮助和/或提高清洁性能、处理待清洁的基质和/或修饰所述清洁组合物的美感(例如香料、着色剂、染料等)。应理解此类添加剂在本发明中性金属蛋白酶之外。这些额外组分的精确性质和其掺入水平依赖于组合物的物理形式和待使用的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括，但不限于，表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、额外的酶和酶稳定剂、催化剂材料、漂白活化剂、漂白加强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合分散剂、粘质土去除/抗再沉积剂、明亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构塑造剂、织物软化剂、载体、助水溶物、操作助剂和/或色素。除了此处明确提供的那些，额外的实例为本领域所知(参阅例如，美国专利号5,576,282、6,306,812B1和6,326,348B1)。在一些实施方案中，上述辅助成分组成了本发明清洁组合物的余量。

表面活性剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。在一些低pH清洁组合物实施方案中(例如具有约3到约5的净pH的组合物)，所述组合物通常不含有烷基乙氧基硫酸盐，因为据信这种表面活性剂可被此类组合物酸性内含物水解。

在一些实施方案中，所述表面活性剂以约0.1％到约60％的水平存在，而在备选实施方案中，所述水平是从约1％到约50％，而在其它实施方案中，以清洁组合物的重量计，所述水平是从约5％到约40％。

助洗剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或更多去污剂助洗剂或助洗剂系统。在掺入至少一种助洗剂的一些实施方案中，所述清洁组合物包含以该清洁组合物重量计约1％，从约3％到约60％或甚至从约5％到约40％的助洗剂。

助洗剂包括，但不限于多聚磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐助洗剂、聚羧酸化合物、羟基聚羧酸醚、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲醚的共聚物、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，和羧基甲氧基琥珀酸、聚乙酸如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸的多种碱金属、铵和取代铵盐，以及聚羧酸盐，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸，及其可溶性盐。实际上，期望任何合适的助洗剂可用于本发明的多个实施方案。

螯合剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括，但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在其中使用至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含以本发明清洁组合物重量计约0.1％到约15％或甚至约3.0％到约10％的螯合剂。

沉积助剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包括至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括，但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、污物释放聚合物如polytelephthalicacid，粘土如高岭土、蒙脱石、atapulgite、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。

染料转移抑制剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包括一种和更多染料转移抑制剂。合适的聚合染料转移抑制剂包括，但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。

在其中使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，本发明的清洁组合物包含以所述清洁组合物重量计约0.0001％到约10％，约0.01％到约5％，或甚至约0.1％到约3％。

分散剂－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种分散剂。合适的水溶性有机材料包括，但不限于均聚酸或共聚酸或其盐，其中聚羧酸包含彼此通过不多于两个碳原子分开的至少两个羧基。

酶－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或更多去污剂酶，其提供清洁性能和/或织物保护益处。合适的酶的实例包括，但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酶、聚戊糖酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些实施方案中，使用酶的组合(例如“混合物”)，其包含常规使用的酶，像使用蛋白酶、脂酶、角质酶和/或纤维素酶与淀粉酶组合。

酶稳定剂－在本发明的一些实施方案中，将用于本发明去污剂制剂中的酶稳定化。期望用于酶稳定化的多种技术可用于本发明。例如，在一些实施方案中，通过在形成的组合物中存在锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源来稳定此处使用的酶，所述组合物为所述酶提供这样的离子，以及其它金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍和oxovanadium(IV))。

催化性金属络合物－在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有一种或更多催化性金属络合物。在一些实施方案中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，所述金属漂白催化剂包含催化剂系统，其包含确定漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有很少或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，并使用对催化和辅助金属阳离子具有确定稳定常数的螯合剂，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参阅例如U.S.4,430,243)。

在一些实施方案中，通过锰化合物催化本发明的清洁组合物。该化合物和使用水平为本领域所熟知(参阅例如U.S.5,576,282)。

在额外的实施方案中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。多种钴漂白催化剂为本领域所知(参阅例如U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。通过已知的方法可容易地制备此类钴漂白催化剂(参阅例如U.S.5,597,936和U.S.5,595,967)。

在额外的实施方案中，本发明的清洁组合物包括大的多环刚性配体(“MRL”)的过渡金属络合物。作为实践，而不是限制，在一些实施方案中，调整本发明提供的组合物和清洁方法以提供在水洗介质中至少亿分之一数量级活性MRL种类，并在一些优选的实施方案中，在洗涤液中提供约0.005ppm到约25ppm，更优选约0.05ppm到约10ppm，并最优选约0.1ppm到约5ppm的MRL。

本发明过渡金属漂白催化剂中的优选过渡金属包括，但不限于锰、铁和铬。优选的MRL还包括，但不限于交联的特定超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷)。通过已知的方法容易地制备合适的过渡金属MRL(参阅例如WO00/32601和U.S.6,225,464)。

制备和使用清洁组合物的方法

将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式，并通过配制者选择的任何合适方法制备(对于一些非限制性实例，参阅例如，U.S.5,879,584、U.S.5,691,297、U.S.5,574,005、U.S.5,569,645、U.S.5,565,422、U.S.5,516,448、U.S.5,489,392、U.S.5,486,303、U.S.4,515,705、U.S.4,537,706、U.S.4,515,707、U.S.4,550,862、U.S.4,561,998、U.S.4,597,898、U.S.4,968,451、U.S.5,565,145、U.S.5,929,022、U.S.6,294,514和U.S.6,376,445，此处全部引入作为参考)。

使用方法

在优选的实施方案中，本发明的清洁组合物用于清洁表面和/或织物。在一些实施方案中，至少一部分表面和/或织物与纯形式的或洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的至少一个实施方案接触，然后任选地洗涤和/或冲洗所述表面和/或织物。为了本发明目的，“洗涤”包括，但不限于擦洗和机械搅拌。在一些实施方案中，所述织物包含在正常消费者使用条件下能够进行洗涤的任何织物。在优选的实施方案中，以溶液中约500ppm到与约15,000ppm的浓度使用本发明的清洁组合物。在其中洗涤溶剂是水的一些实施方案中，水温通常在约5℃到约90℃范围内。在用于织物清洁的一些优选实施方案中，水与织物质量的比例通常是约1:1到约30:1。

实验

提供以下实施例以阐明并进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，并不解释为限制其范围。

在随后的实验公开内容中，应用以下简写：℃(摄氏度数)；rpm(每分钟转数)；H₂O(水)；HCl(盐酸)；aa和AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒钟)；min(s)(分钟/分钟)；hr(s)(小时/小时)；MgCl₂(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD₂₈₀(280nm处的光密度)；OD(光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mMNaCl,10mM磷酸钠缓冲液,pH7.2])；LAS(十二烷基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N,N,N’N’-四乙酰基乙二胺)；BES(聚酯砜)；MES(2-吗啉乙磺酸,一水合物；f.w.195.24；Sigma#M-3671)；CaCl₂(氯化钙,无水；f.w.110.99；Sigma#C-4901)；DMF(N,N-二甲基甲酰胺,f.w.73.09,d＝0.95)；Abz-AGLA-Nba(2-氨基苯甲酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苯甲基酰胺,f.w.583.65；Bachem#H-6675,VWRcatalog#100040-598)；SBG1％(“SuperBrothwithGlucose”；6gSoytone[Difco],3g酵母提取物,6gNaCl,6g葡萄糖)；在使用本领域已知的方法灭菌之前用NaOH将pH调整到7.1；w/v(重量体积比)；v/v(体积体积比)；Npr和npr(中性金属蛋白酶)；(SEQUEST数据库搜索程序,UniversityofWashington)；Npr和npr(中性金属蛋白酶基因)；NprE和nprE(解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶)；PMN(纯化的金属蛋白酶)；MS(质谱)；和SRI(污物去除指数(StainRemovalIndex))。

以下简写应用于这样的公司，在实验实例中已经参考了其产品或服务：TIGR(TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD)；AATCC(AmericanAssociationofTextileandColoringChemists)；Amersham(AmershamLifeScience,Inc.ArlingtonHeights,IL)；Corning(CorningInternational,Corning,NY)；ICN(ICNPharmaceuticals,Inc.,CostaMesa,CA)；Pierce(PierceBiotechnology,Rockford,IL)；Equest(Equest,WarwickInternationalGroup,Inc.,Flintshire,UK)；EMPA(EidgenossischeMaterialPrufungsundVersuchAnstalt,St.Gallen,Switzerland)；CFT(CenterforTestMaterials,Vlaardingen,TheNetherlands)；Amicon(Amicon,Inc.,Beverly,MA)；ATCC(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)；BectonDickinson(BectonDickinsonLabware,LincolnPark,NJ)；Perkin-Elmer(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)；Rainin(RaininInstrument,LLC,Woburn,MA)；Eppendorf(EppendorfAG,Hamburg,Germany)；Waters(Waters,Inc.,Milford,MA)；Geneart(GeneartGmbH,Regensburg,Germany)；PerseptiveBiosystems(PerseptiveBiosystems,Ramsey,MN)；MolecularProbes(MolecularProbes,Eugene,OR)；BioRad(BioRad,Richmond,CA)；Clontech(CLONTECHLaboratories,PaloAlto,CA)；Cargill(Cargill,Inc.,Minneapolis,MN)；Difco(DifcoLaboratories,Detroit,MI)；GIBCOBRLorGibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD)；NewBrunswick(NewBrunswickScientificCompany,Inc.,Edison,NJ)；Thermoelectron(ThermoelectronCorp.,Waltham,MA)；BMG(BMGLabtech,GmbH,Offenburg,Germany)；Greiner(GreinerBio-One,Kremsmuenster,Austria)；Novagen(Novagen,Inc.,Madison,WI)；Novex(Novex,SanDiego,CA)；Finnzymes(FinnzymesOY,Finland)Qiagen(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)；Invitrogen(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)；Sigma(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)；DuPontInstruments(Asheville,NY)；GlobalMedicalInstrumentationorGMI(GlobalMedicalInstrumentation；Ramsey,MN)；MJResearch(MJResearch,Waltham,MA)；Infors(InforsAG,Bottmingen,Switzerland)；Stratagene(StratageneCloningSystems,LaJolla,CA)；Roche(HoffmannLaRoche,Inc.,Nutley,NJ)；Agilent(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)；S-Matrix(S-MatrixCorp.,Eureka,CA)；USTesting(UnitedStatesTestingCo.,Hoboken,NY)；WestCoastAnalyticalServices(WestCoastAnalyticalServices,Inc.,SantaFeSprings,CA)；IonBeamAnalysisLaboratory(IonBeanAnalysisLaboratory,TheUniversityofSurreyIonBeamCentre(Guildford,UK)；TOM(Terg-o-Meter)；BMI(blood,milk,ink)；BaChem(BaChemAG,Bubendorf,Switzerland)；MolecularDevices(MolecularDevices,Inc.,Sunnyvale,CA)；Corning(CorningInternational,Corning,NY)；MicroCal(Microcal,Inc.,Northhampton,MA)；ChemicalComputing(ChemicalComputingCorp.,Montreal,Canada)；NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)；ArgoBioanalytica(ArgoBioanalytica.Inc,NewJersey)；Vydac(GraceVydac,Hesperia,CA)；Minolta(KonicaMinolta,Ramsey,NJ)；和Zeiss(CarlZeiss,Inc.,Thornwood,NY)。

实施例1

测定法和去污剂

以下测定法用于下文描述的实施例或重组蛋白酶的其它分析中。在实施例中说明了下文提供的方案的任何偏离。在这些实验中，在反应完成后使用分光光度计测定所形成的产物的吸光度。使用反射计来测定样品的反射率。

A.蛋白质含量测定

1.96孔微量滴定板(MTP)中用于蛋白质含量测定的BCA(双金鸡宁酸)测定法

在这些测定中，BCA(Pierce)测定法用于测定MTP规模上蛋白酶样品中的蛋白质浓度。在该测定体系中，所用的化学药品和试剂溶液为：BCA蛋白质测定试剂和Pierce稀释缓冲液(50mMMES,pH6.5、2mMCaCl₂、0.005％)。所用设备为SpectraMAX(340型)MTP读数器。从Costar获取MTP(9017型)。

在测试中，用移液器将200μlBCA试剂移入每孔中，随后加入20μl稀释的蛋白质。彻底混匀后，将MTP在37℃温育30分钟。将可能出现的空气泡去除，在562nm处读取孔内溶液的光密度(OD)。为了测定蛋白质浓度，从样品读数中减去背景读数。将针对蛋白质标准品(纯化的蛋白酶)对OD₅₆₂作图来产生标准曲线。从标准曲线中外推出样品的蛋白质浓度。

2.96孔微量滴定板(MTP)中用于蛋白质含量测定的Bradford测定

在这些测定中，Bradford染料试剂(QuickStart)测定用于测定MTP规模上蛋白酶样品中的蛋白质浓度。

在该测定体系中，所用的化学药品和试剂溶液为：QuickStartBradfordDyeReagent(BIO-RADCatalogNo.500-0205)、稀释缓冲液(10mMNaCl、0.1mMCaCl2、0.005％)。所用设备为BiomekFXRobot(Beckman)和SpectraMAX(340型)MTP读数器。从Costar获取MTP(9017型)。

在测试中，用移液器将200μlBradford染料试剂移入每孔中，随后加入15μl稀释缓冲液。最后向孔中加入10μl过滤后的培养液。彻底混匀后，将MTP在室温下温育至少10分钟。将可能出现的空气泡驱散并在595nm处读取孔内溶液的OD值。为了测定蛋白质浓度，从样品读数中减去背景读数(即来自未接种的孔)。所获的OD₅₆₂值提供了样品中蛋白质含量的相对度量。

B.蛋白酶测定

1)偶氮酪蛋白测定：

使用偶氮酪蛋白终末点测定来评估在特定条件下发生的蛋白质水解的量。在这些测定中，将75uL酶与加入至250μl1％(w/v)偶氮酪蛋白(Sigma)的过量钙或锌或钙和锌温育。反应在30℃下进行15分钟，随后加入10％(w/v)三氯乙酸(TCA)以终止反应。通过在14,000rpm离心10分钟去除沉淀的蛋白质和未反应的偶氮酪蛋白。通过加入750μL1M氢氧化钠产生偶氮基的颜色。显色反应进行5分钟，随后终止反应并在440nm处测定吸光度。

2)琥珀酸基化酪蛋白测定：

使用QuantiCleaveProteaseAssayKit^TM(Pierce)测定中性金属蛋白酶(NprE)的活性。该测定基于该酶对琥珀酸基化酪蛋白的消化。所形成的伯氨基然后与三硝基苯磺酸(TNBSA)反应并形成在450nm处具有最大吸光度的有色络合物。所述测定在96孔微量滴定板中进行。测定需要与琥珀酸基化酪蛋白进行15分钟温育并与TNBSA进行15分钟反应。在两次温育中，将样品置于摇床上。TPCK胰蛋白酶(Pierce)是用于总蛋白酶活性测定的一般标准。然而，特定蛋白酶活性的最佳条件需要使用目的蛋白酶。在这些实验中进行的测定的情况下，使用胰蛋白酶和目的蛋白酶来校准测定。测定的准确性需要由0.5mg/mL胰蛋白酶产生的标准稀释总是导致吸光度值(450nm处)低于0.5。

将每一样品相对于不含酪蛋白的对照来测定。报道的吸光度变化(450nm处的ΔAbs)是由于来自酪蛋白氨基基团的干扰。进一步，以这种方式还校正了来自缓冲液中的伯氨基和/或去污剂的其它组分的任何可能的干扰。在相同时长和相同温度下相对于未加入中性金属蛋白酶的去污剂测定所有样品的活性，以及试剂盒附带的BupH^TM硼酸盐缓冲液中温育的酶。

该检测为终点测定，其中在32℃使用50mMpH8.5的硼酸盐缓冲液。通常以一式两份进行蛋白酶测定。尽管在某些实验中也使用1:500或1:200的稀释度，但在测定稳定性的大部分实验中，使用上述缓冲液按1:1000稀释蛋白质和去污剂，以获得其中空白的吸光度低于0.5的读数。这些实验中使用的微量滴定分光光度计为(MolecularDevices)并且在培养基蛋白结合的96孔板(Corning)中进行所有测定。

这些测定中获得的标准蛋白质样品(例如胰蛋白酶和纯化的金属蛋白酶)的结果说明存在非线性应答(可能仅在窄的测定范围内具有线性标度)。因此，将曲线拟合二次方函数，其中f＝y₀+ax²+bx；f拟合y(v.9；SPSS,Inc.)。因此，如果使用线性方程来对蛋白质量定量，获得的是不准确的数据；需要二次方程来获得准确结果。应注意生产商(Pierce)试剂盒内说明书指出“x”为对数标尺，可以拟合结果。

3.二甲基酪蛋白(DMC)水解测定

在该测定体系中，使用的化学药品和试剂溶液为：

二甲基酪蛋白(DMC)SigmaC-9801

SigmaP-8074

PIPES缓冲液(游离酸)SigmaP-1851；15.1g溶于约960ml水中；用4NNaOH调节pH值为6.0，加入1ml5％并将体积调至1000ml。PIPES和的终浓度分别为50mM和0.005％。

苦基磺酸(TNBS)SigmaP-2297(5％的水溶液)

试剂A将45.4gNa₂B₄O₇.10H₂O(Merck6308)和15ml4NNaOH共同溶解至1000ml终体积中(如需要通过加热)

试剂B将35.2gNaH₂PO₄.1H₂O(Merck6346)和0.6gNa₂SO₃(Merck6657)共同溶解至1000ml终体积中。

方法

为了制备底物，将4gDMC溶解于400mlPIPES缓冲液中。用PIPES缓冲液稀释过滤的培养物上清液。随后，向MTP孔中200μl底物加入10μl每一稀释的上清液。用带子覆盖MTP，振荡几秒并置于烘箱中于25℃不摇动放置30分钟。从烘箱中取出第一板前约15分钟，通过每50ml试剂A混合1mlTNBS溶液来制备TNBS试剂。按每孔60μlTNBS试剂A填充MTP。将温育的平板振荡几秒，随后转移10μl至含TNBS试剂A的MTP中。用带子覆盖平板并在台式振荡器(BMGThermostar)中室温下以500rpm振荡20分钟。最后，向孔中加入200μl试剂B，在振荡器上混合1分钟，并使用MTP读数器在405nm处测定吸光度。

将所获的吸光度值对空白值校正(即无酶的底物)。所获的吸光度为水解活性的量度。通过除以吸光度和测定的蛋白质浓度来计算样品的(任意)比活性。

4.2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄基酰胺测定(Abz-AGLA-Nba)

下文提供的方法提供了不依赖时间和空间产生可重复蛋白酶测定数据的一定程度的技术细节。虽然测定可适合于给定的实验室条件，但通过修饰的程序获得的任何数据必须与最初方法产生的结果一致。中性金属蛋白酶切割2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酰-L-亮氨酰-L-丙氨酰-4-硝基苄基酰胺(Abz-AGLA-Nba)的甘氨酸和亮氨酸之间的肽键。溶液中的游离2-氨基苯甲酰基-L-丙氨酰甘氨酸(Abz-AG)在415nm处具有荧光发射最大值，在340nm处具有激发最大值。通过完整Abz-AGLA-Nba分子中的硝基苄基酰胺淬灭Abz-AG的荧光。

在这些实验中，通过荧光光谱学(Ex.340/Em.415)监测蛋白酶切割Abz-AGLA-Nba对Abz-AG的释放。Abz-AG的出现速度是蛋白水解活性的量度。测定在非底物限制的初始速度条件下进行。

可再现测定结果需要具有温度控制(例如EppendorfThermomixer)的微量培养板混合器。在加入酶之前，将测定溶液在微量培养板混合器中温育至想要的温度(例如25℃)。将酶溶液加入到混合器中的平板中，剧烈混合并快速转移到平板读数器中。

需要具有连续数据记录能力、线性回归分析和温度控制的荧光分光光度计(例如，SpectraMaxM5,GeminiEM,MolecularDevices)。将所述读数器始终维持在想要的温度(例如25℃)。设置所述读数器用于最高读数荧光检测并在不使用截止滤光片的情况下将激发设置在350nm，发射设置在415nm。将PMT设置在中等灵敏度和每孔5次读数上。打开自动校正，但仅在第一次读数之前进行校正。使用根据所选待监测的孔的数目最小化的读数间隔进行所述测定3分钟。设置所述读数器以计算毫-RFU/分钟(每分钟千分之一相对荧光单位)的速度。将用于计算速度(Vmax点)的读数数值设置在等于2分钟的数值，如通过读数间隔测定(例如，每隔10秒的读数将使用12个点计算比率)。最大RFU设置为50,000。

用容积式移液管(RaininMicroman)完成对酶和底物贮存液的所有移液。通过单或多通道空气移位移液管(RaininLTS)从管、试剂贮器或储藏微量培养板中吸取缓冲液、测定物和酶工作溶液。当使用很少的孔时，重复式移液管(Eppendorf)用于向微量培养板孔中转移测定溶液，以将试剂损失降到最低。自动移液装置如BeckmanFX或CybioCybi孔也用于从工作贮存微量培养板中将酶溶液转移到测定微量培养板中，以便一次启动整个微量培养板。

试剂和溶液：

52.6mMMES/NaOH,2.6mMCaCl₂,pH6.5–MES缓冲液

MES酸(10.28g)和292mg无水CaCl₂溶解在约900mL纯化水中。用NaOH将所述溶液滴定到pH6.5(在25℃或利用温度调节pH探头)。pH-调节缓冲液补充至1L总体积。利用0.22μm无菌过滤器过滤最终的溶液并在室温下保存。

DMF-Abz-AGLA-Nba贮存液中的48mMAbz-AGLA-Nba

将大约28mg的Abz-AGLA-Nba放置在小管中。其溶解在DMF(体积将根据一起的Abz-AGLA-Nba变化)并涡旋几分钟。所述溶液在室温下避光保存。

50mMMES,2.5mMCaCl₂,5％DMF,2.4mMAbz-AGLA-NbapH6.5–测定溶液

向19mLMES缓冲液中加入1mLAbz-AGLA-Nba贮存液并涡旋。所述溶液在室温下避光保存。

50mMMES,2.5mMCaCl₂,pH6.5–酶稀释缓冲液

通过向95mLMES缓冲液中加入5mL纯化的水产生该缓冲液。

50mMMES,2.5mMCaCl₂,5％DMF,pH6.5–底物稀释缓冲液

向95mLMES缓冲液中加入5mL纯的DMF。该缓冲液用于测定动力学参数。

酶溶液

用酶稀释缓冲液将酶贮存液稀释到大约1ppm(1ug/mL)的浓度。将中性蛋白酶(野生型NprE)稀释到低于6ppm(6ug/mL)的浓度。优选连续稀释。溶液在室温下稳定1小时，但为了更长时期的储存，将所述溶液维持在冰上。

程序

首先制备所有的缓冲液、贮存液和工作溶液。一式三份测定各酶稀释液，除非另有说明。当不完全充满时，将酶工作溶液贮存微量培养板从平板的左边开始排列在完全垂直的列中(以适应平板读数器)。类似地设置相应的测定平板。如前所述设置微量培养板荧光分光光度计。

首先，将测定溶液的200μL等分试样置于96孔微量培养板的孔中。所述平板在室温控制的微量培养板混合器中25℃避光温育10分钟。通过从贮存微量培养板向混合器中的测定微量培养板中转移10uL工作酶溶液开始测定。理想的是，96孔移液头或8孔多通道移液管用于从最左边的列开始转移。所述溶液剧烈混合15秒(在EppendorfThermomixer中900rpm)。立即将测定微量培养板转移到微量培养板荧光分光光度计中并在350nm的激发和415nm的发射下进行荧光测定的记录。所述荧光分光光度计软件计算各孔中荧光的增加与毫RFU/分钟的线性回归线的反应比例。在一些实验中，将第二个平板置于微量培养板混合器中用于温度平衡，而对第一个平板进行读数。

比初速度与高达0.3mM产物的产物浓度(即，释放的2-氨基苯甲酰荧光)成线性关系，其对应于以2.3mMAbz-AGLA-Nba开始的溶液中的大约50,000RFU，具有大约22,000RFU的背景荧光。Abz-AGLA-Nba溶解在DMF中并在其制备的当天使用。

5.suc-AAPF-pNA测定

通过测定N-琥珀酰-L-Ala-L-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对-硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)底物的切割测定丝氨酸蛋白酶活性。该测定基于N-琥珀酰试剂的苯丙氨酸与对-硝基苯胺之间的酰胺键的蛋白酶切割。在410nm处通过分光光度计监测对-硝基苯胺，并且对-硝基苯胺的出现速度是蛋白水解活性的量度。蛋白酶单位定义为在25℃下具有1cm径长的比色杯中0.1MTris缓冲液中1.6mMsuc-AAPF-pNA的标准溶液的增加410nm处的吸光度1个吸光单位(AU)/分钟的蛋白酶的量。

C.去污剂组合物：

在示例性去污剂组合物中，通过以总组合物重量计的纯酶表示酶水平，并且除非另有说明，以总组合物重量计表示所述去污剂成分。其中缩写的成分标识具有以下意思：

缩写成分

LAS:线性C_11-13烷基苯磺酸钠

NaC16-17HSA:C_16-17高度可溶性烷基硫酸钠

S

TAS:牛脂烷基硫酸钠

CxyAS:C_1x-C_1y烷基硫酸钠

CxyEz:与平均z摩尔环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y主要线性伯醇

CxyAEzS:与平均z摩尔环氧乙烷缩合的C_1x-C_1y烷基硫酸钠。在实施例中添加分子名。

非离子的:混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，例如PlurafacLF404是具有3.8乙氧基化平均程度和4.5丙氧基化平均程度的醇。

QAS:R₂.N+(CH₃)₂(C₂H₄OH)，其中R₂＝C₁₂-C₁₄。

硅酸盐:无定形硅酸钠(SiO₂:Na₂O比例＝1.6-3.2:1)。

偏硅酸盐:偏硅酸钠(SiO₂:Na₂O比例＝1.0)。

沸石A:通式Na12(A1O₂SiO₂)₁₂.27H₂O的水合铝硅酸盐

SKS-6:通式δ-Na₂Si₂O₅的结晶层状硅酸盐。

硫酸盐:无水硫酸钠

STPP:三聚磷酸钠

MA/AA:4:1丙烯酸酯/马来酸酯的随机共聚物，平均分子量约70,000-80,000。

AA:平均分子量4,500的聚丙烯酸钠聚合物。

聚羧酸:包含羧化单体如丙烯酸酯、马来酸酯和甲基丙烯酸酯的混合物的共聚物，具有在2,000-80,000之间变化的MW，如可从BASF商业途径获得的Sokolan，是丙烯酸的共聚物，MW4,500。

BB1:3-(3,4-二氢异喹啉)丙烷磺酸盐

BB21-(3,4-二氢异喹啉)-癸烷-2-硫酸盐

PB1:过硼酸钠一水合物

PB4:命名通式NaBO₃.4H₂O的过硼酸钠四水合物

过碳酸盐:命名通式2Na₂CO₃.3H₂O₂的过碳酸钠

TAED:四乙酰基乙二胺

NOBS:钠盐形式的壬酰氧基苯磺酸盐

DTPA:二乙三胺五乙酸

HEDP:1,1-羟基乙烷二膦酸

DETPMP:二乙基三胺五(亚甲基)膦酸酯，由Monsanto以商品名Dequest2060上市。

EDDS:其钠盐形式的乙二胺-N,N'-二琥珀酸，(S,S)异构体

二胺:二甲氨基丙胺；1,6-hezane二胺；1,3-丙二胺；2-甲基-1,5-戊二胺；1,3-戊二胺；1-甲基-二氨基丙烷

DETBCHD5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6,6,2]十六烷,二氯化物,Mn(II)SALT

PAAC:五胺乙酸钴(III)盐

石蜡:Wintershall在商品名Winog70下出售的石蜡油

磺化石蜡:其中一些氢原子已经替换为磺酸基团的石蜡油或蜡。

醛糖氧化酶:NovozymesA/S以商品名醛糖氧化酶出售的氧化酶。

半乳糖氧化酶:来自Sigma的半乳糖氧化酶

nprE:在枯草杆菌中表达的中性金属蛋白酶的重组形式

PMN:来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶

淀粉酶:在WO94/18314、WO96/05295中描述的Genencor在商品名Ox下出售的淀粉分解酶；和DURAMYL^TM均可从NovozymesA/S获得。

脂酶:NovozymesA/S以商品名、Ultra出售、Gist-Brocades以Lipomax^TM出售的脂肪分解酶。

纤维素酶:在NovozymesA/S以商品名Carezyme、Celluzyme和/或Endolase出售的Cellulytic酶。

果胶裂合酶:可从NovozymesA/S获得的和。

PVP:具有平均分子量60,000的聚乙烯吡咯烷酮。

PVNO:聚乙烯吡啶-N-氧化物，平均分子量为50,000。

PVPVI:乙烯基咪唑与乙烯基砒咯烷酮的共聚物，平均分子量为20,000。

明亮剂1:4,4'-二(2-sulphostyryl)联苯基二钠

硅酮消泡剂:具有硅氧烷-氧化烯共聚物作为分散剂的聚二甲基硅氧烷泡沫控制剂，所述泡沫控制剂与所述分散剂的比例是10:1到100:1。

抑泡剂:12％硅酮/二氧化硅,18％硬脂醇,70％颗粒形式的淀粉。

SRP1:阴离子封端的聚酯。

PEGX:聚乙二醇,分子量为x。

PVP:乙烯基吡咯烷酮均聚物(平均MW160,000)

:来自Huntsman的保护的聚乙二醇

ED-2001

AS:来自Enichem的分支醇烷基硫酸酯

MMEPEG:来自FlukaChemieAG的一甲基醚聚乙二醇(MW2000)。(2000)

DC3225C:硅酮泡沫抑制剂，硅酮油与来自DowCorning的二氧化硅的混合物。

TEPAE:四乙五胺乙氧基化物

BTA:苯并三唑

甜菜碱:(CH₃)₃N⁺CH₂COO^-

糖:工业级D-葡萄糖或食品级糖

CFAA:C₁₂-C₁₄烷基N-甲基葡糖酰胺

TPKFA:C₁₂-C₁₄顶端全切口脂肪酸(C₁₂-C₁₄toppedwholecutfattyacids)

粘土:通式Al₂O₃SiO₂·xH₂O的水合硅酸铝。类型：高岭石、蒙脱石、atapulgite、illite、膨润土、多水高岭土。

pH:在20℃蒸馏水中测定为1％的溶液。

实施例2

枯草杆菌中NprE蛋白酶的产生

在该实施例中，描述了在枯草杆菌中进行产生NprE蛋白酶的实验。具体而言，提供了用于将质粒pUBnprE转化至枯草杆菌的方法。如本领域已知地进行转化(参阅例如WO2002/014490和WO2007/044993，此处均参考引入)。下文提供的DNA序列(来自解淀粉芽孢杆菌的nprE前导序列、nprE前序列和nprE成熟DNA序列)编码NprE前体蛋白质：

GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCGGGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG ACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTCTGTCAGTGA CAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCC TTCTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCAC TTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTAT TCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGAT GTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGAT CATGCTTATAAAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTG CAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATAC CGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGG AAGTAACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTG GAGCAT TAA(SEQIDNO：1)

在上述序列中，粗体代表编码成熟NprE蛋白酶的DNA，标准字体代表前导序列(nprE前导序列)，下划线的代表前序列(nprE前序列)。下文提供的氨基酸序列(NprE前导序列、NprE前序列和NprE成熟DNA序列)(SEQIDNO：2)，对应于全长的NprE前体蛋白质。在该序列中，下划线的代表前序列，粗体代表成熟NprE蛋白酶。

MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDK AIKQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVD KSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNK AELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEH (SEQIDNO：2)

成熟NprE序列如SEQIDNO：3所示。将该序列用作产生此处描述的变体文库的基础。

AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(SEQIDNO：3)

通过PCR使用两条特异引物从解淀粉芽孢杆菌的染色体DNA中扩增nprE基因来构建pUBnprE表达载体：

OligoAB1740：CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG(SEQIDNO：4)

OligoAB1741：

GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC(SEQIDNO：5)

在热循环仪中用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)进行PCR。PCR混合物包含10μl5x缓冲液(FinnzymesPhusion)、1μl10mMdNTP’s、1.5μlDMSO、1μl每种引物、1μlFinnzymesPhusionDNA聚合酶、1μl染色体DNA溶液50ng/μl、34.5μlMilliQ水。使用以下方案：

PCR方案：

1)30秒98℃；

2)10秒98℃；

3)20秒55℃；

4)1分钟72℃；

5)步骤2至步骤4，25个循环；和

6)5分钟72℃。

这产生了1.9kbDNA片段，使用BglII和BclIDNA限制酶对其消化。使用BamHI消化多拷贝芽孢杆菌载体pUB110(参阅例如Gryczan,JBacteriol,134:318-329,1978)。随后将PCR片段xBglIIxBclI连接至pUB110xBamHI载体以产生pUBnprE表达载体。

将pUBnprE转化到枯草杆菌(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)菌株中。如此处引入作为参考的WO02/14490中描述的进行向枯草杆菌的转化。在含20mg/L新霉素的25mlMBD培养基(以MOPS为基础的确定成分培养基)的摇瓶中进行携带pUBnprE载体的枯草杆菌转化体的选择性生长。基本如本领域已知地来制备MBD培养基(参阅Neidhardt等,JBacteriol,119:736-747,1974)，除了从基础培养基中去除NH₄Cl₂、FeSO₄和CaCl₂之外，还使用3mMK₂HPO₄，并且基础培养基中添加了60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％的soytone。同样，将微量营养素制成100X贮存液，其在一升中含400mgFeSO₄.7H₂O、100mgMnSO₄.H₂O、100mgZnSO₄.7H₂O、50mgCuCl₂.2H₂O、100mgCoCl₂.6H₂O、100mgNaMoO₄.2H₂O、100mgNa₂B₄O₇.10H₂O、10ml的1MCaCl₂和10mlof0.5M柠檬酸钠。在培养箱/振荡器(Infors)中37℃下将培养物温育3天。该培养导致产生如经蛋白酶测定显示的具有蛋白水解活性的分泌的NprE蛋白酶。使用NuPageNovex10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，目录号NP0301BOX)进行凝胶分析。为了制备样品用于分析，将2体积的上清液与1体积1MHCl、1体积4xLDS样品缓冲液(Invitrogen，目录号NP0007)和1％PMSF(20mg/ml)混合。随后将样品在70℃加热10分钟。然后，将25μL的每一样品以及10μL的SeeBlueplus2预染的蛋白质标准品(Invitrogen，目录号LC5925)装载至凝胶中。结果清楚地显示在该实施例中描述的nprE克隆策略适合于在枯草杆菌中产生活性NprE。

实施例3

产生位点评估文库(SEL)

在该实施例中，描述了用于构建nprESEL的方法。

产生nprESELs－方法I

将包含上述的nprE表达盒的pUBnprE载体用作模板DNA。该载体包含唯一的BglII限制性位点，其在位点评估文库构建中使用。简述之，为了构建nprE位点评估文库，进行三次PCR反应，包括两次诱变PCR以在成熟nprEDNA序列中引入目的突变密码子以及第三次PCR用于融合两次诱变PCR以构建在成熟nprE序列中包括想要的突变密码子的pUBnprE表达载体。

诱变的方法基于密码子特异突变方法，其中使用具有长度为25至45个核苷酸围绕特定设计的三重DNA序列NNS(N＝A、C、T或G；且S＝C或G)的正向和反向寡核苷酸引物在特定DNA三联体中同时进行所有可能突变的产生，所述三重DNA序列符合待突变的密码子序列并且保证了在特定nprE成熟密码子上随机掺入核苷酸。引物名称中列出的数字对应于特定nprE成熟密码子的位置。评估包括的多个位点。引物序列的示例性列表描述于WO2007/044993中，此处引入作为参考。

用于构建位点评估文库的两条额外引物包含BglII限制性酶切位点以及在BglII限制性酶切位点侧翼的pUBnprEDNA序列的一部分。由Invitrogen合成以下引物(50nmole规模，脱盐的)：

pUB-BglII-FWGTCAGTCAGATCTTCCTTCAGGTTATGACC(SEQIDNO:6)；和

pUB-BglII-RVGTCTCGAAGATCTGATTGCTTAACTGCTTC(SEQIDNO:7)。

使用pUB-BglII-FW引物和特异nprE反向诱变引物以两次初级PCR扩增开始每一SEL的构建。对于第二次PCR，使用pUB-BglII–RV引物和特异nprE正向诱变引物(正向和反向诱变引物具有同等的nprE成熟密码子位置)。

使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes；目录号F-530L)在成熟nprE序列中进行突变的引入。根据随聚合酶提供的Finnzymes方案进行所有PCR。用于初级PCR的PCR条件为：

对于初级PCR1：

pUB-BglII-FW引物和特异NPRE反向诱变引物－均为1μL(10μM)；

对于初级PCR2：

pUB-BglII-RV引物和特异NPRE正向诱变引物－均为1μL(10μM)；以及

PCR程序为：98℃30秒，30x(98℃10秒，55℃20秒，72℃1.5分钟)及72℃5分钟，在PTC-200Peltier热循环仪(MJResearch)中进行。PCR实验获得约2至3kB的两条片段，其与目的NprE成熟密码子存在约30个核苷酸碱基的重叠。使用这两条前文提及的片段和正向和反向BglII引物在第三个PCR反应中将片段融合。在以下溶液中进行融合PCR反应：

pUB-BglII-FW引物和pUB-BglII-RV引物－均为1μL(10μM)

以及

PCR融合程序如下：在PTC-200Peltier热循环仪(MJResearch)中98℃30秒，30x(98℃10秒，55℃20秒，72℃2:40分钟)及72℃5分钟。

使用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28106)纯化扩增的线性6.5Kb片段并用BglII限制酶消化以在融合片段的两端产生粘性末端：

-35μL纯化的线性DNA片段

-4μL3缓冲液(Invitrogen)

-1μLBglII，10单位/ml(Invitrogen)

反应条件：30℃1小时。

BglII消化并使用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28106)纯化的片段的连接产生包含想要的突变的环状和多聚体DNA：

-30μL纯化的BglII消化的DNA片段

-8μLT4DNA连接酶缓冲液(Invitrogen，目录号46300-018)

-1μLT4DNA连接酶，1单位/μL(Invitrogen，目录号15224-017)

反应条件：16℃16-20小时。

随后，将连接混合物转化至枯草杆菌(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)菌株。如WO02/14490中描述进行向枯草杆菌的转化，此处引入作为参考。对于每一文库，挑取96个单菌落并生长于含有新霉素和1.25g/L酵母提取物的MOPS培养基中用于序列分析(BaseClear)和筛选目的。每一文库包括最多19个nprE位点特异性变体。

通过在37℃下96孔MTP中将枯草杆菌SEL转化体在含有20mg/L新霉素和1.25g/L酵母提取物的MBD培养基中生长68小时来产生变体。

产生nprESELs–方法II

还描述了产生nprESEL的备选方法。这些方法适合于产生其它目的酶的SEL。如上，包含nprE表达盒的pUBnprE载体作为模板DNA来源用于产生nprESEL和NprE变体。两种方法间的主要区别为该方法需要使用互补位点定向诱变引物扩增整个载体。

材料：

含pUBnprE载体的芽孢杆菌菌株

QiagenPlasmidMidiKit(Qiagen目录号12143)

Ready-LyseLysozyme(Epicentre目录号R1802M)

damMethylaseKit(NewEnglandBiolabs目录号M0222L)

ZymocleanGelDNARecoveryKit(ZymoResearch目录号D4001)

nprE位点定向诱变引物，100nmole规格，5‘磷酸化的，PAGE纯化的(IntegratedDNATechnologies,Inc.)

MultiSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene目录号200514)

MJResearchPTC-200PeltierThermalCycler(Bio-RadLaboratories)

1.2％琼脂糖E凝胶(Invitrogen目录号G5018-01)

TempliPhiAmplificationKit(GEHealthcare目录号25-6400-10)

枯草杆菌感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)。

方法：

为了获得含一个突变的pUBnprE质粒(在上文实施例3和WO2007/044993中描述的经nprESEL筛选鉴定，此处引入作为参考)，使用每一目的芽孢杆菌菌株的单菌落来接种5mlLB+10ppm新霉素试管(例如，起始培养物)。培养物生长于37℃下以225rpm振荡6小时。随后用1ml起始培养物接种100ml的新鲜LB+10ppm新霉素。该培养物在37℃下以225rpm振荡生长过夜。温育后，通过足够的离心来收集细胞沉淀来提供细胞沉淀。在10mlBufferP1(QiagenPlasmidMidiKit)中重悬细胞沉淀。随后，将10μl的Ready-LyseLysozyme加入重悬的细胞沉淀中并在37℃温育30分钟。使用10ml的BufferP2和P3继续QiagenPlasmidMidiKit方案来解释细胞培养物增加的体积。在从芽孢杆菌中分离含单一nprE突变的每一pUBnprE质粒后，测定每一质粒的浓度。随后使用damMethylaseKit(NewEnglandBiolabs)根据生产商说明书将质粒dam甲基化，以将每管约2μg的各pUBnprE质粒甲基化。使用ZymocleanGelDNA回收试剂盒来纯化并浓缩dam甲基化的pUBnprE质粒。随后将dam甲基化的pUBnprE质粒定量并稀释至各50ng/μl的工作浓度。对于每一反应分别制备混合的位点定向诱变引物。例如，使用pUBnprET14R质粒作为模板来源，则混合的位点定向诱变引物管将包含10μl的nprE-S23R、10μl的nprE-G24R、10μl的nprE-N46K和10μl的nprE-T54R(所有引物每一种10μM)。按生产商说明书进行使用QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene)的PCR(例如，含一个突变的1μldam甲基化的pUBnprE质粒(50ng/μl)、2μlnprE位点定向诱变引物(10μM)、2.5μl10xQuikChangeMultiReaction缓冲液、1μldNTPMix、1μlQuikChangeMulti酶混合物、和17.5μl高压灭菌的蒸馏水，来提供25μl的总反应混合物)。使用以下条件扩增nprE变体文库：95℃1分钟(仅第一个循环)，接着95℃1分钟、55℃1分钟、65℃13.5分钟，并重复循环29次。反应产物在4℃贮存过夜。随后，使用生产商方案(即，向每一管中加入1.5μlDpnI限制酶并在37℃温育3小时；随后将2μl的DpnI消化的PCR反应物在1.2％E凝胶上分析以确保PCR反应工作并降解了亲本模板)将反应混合物经DpnI消化处理(由MultiSite-DirectedMutagenesisKit提供)来消化亲本pUB-nprE质粒。随后使用TempliPhi滚环扩增来产生大量DNA用于增加nprE多变体的文库大小，使用生产商的方案(即，对于～11μl的总反应物，1μlDpnI处理的QuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesisPCR、5μlTempliPhiSample缓冲液、5μlTempliPhiReactionBuffer、和0.2μlTempliPhiEnzymeMix；在30℃温育3小时；通过加入200μl高压灭菌的蒸馏水来稀释TempliPhi反应并短暂涡旋)。随后，将1.5μl稀释的TempliPhi材料转化到枯草杆菌感受态细胞中，并用LA+10ppm新霉素+1.6％脱脂奶平板来选择nprE多变体。挑取菌落并随后测序来鉴定不同的nprE变体文库的组合。

整合DNA技术合成了用于诱变的所有引物(100nmole规格，5’磷酸化的，且PAGE纯化的)。评估的位点包括：4、12、13、23、45、49、50、54、59、60、65、82、90、110、119、128、129、130、135、136、137、138、139、140、151、152、155、179、190、197、198、199、204、205、214、216、217、218、219、220、221、222、224、243、244、260、261、263、265、269、273、282、285、286、289、293、296、297和299。示例性诱变引物描述于WO2007/044993，此处引入作为参考。

实施例4

变体蛋白酶的表达、发酵和纯化

本实施例描述了用于表达、发酵和纯化转化的枯草杆菌的蛋白酶的方法。

中性金属蛋白酶

在营养培养基中经常规分批发酵培养重组枯草杆菌。使用一甘油管的枯草杆菌培养物(含有解淀粉芽孢杆菌中性金属蛋白酶或其变体)来接种600ml含200mg/L氯霉素的SBG1％培养基。培养物在37℃生长36-48小时。所用的备选方法涉及重组枯草杆菌在35℃下在确定成分培养基中生长60小时。随后，如本领域已知地经12,000rpm离心回收培养液(离心机型号RC5B)。从培养液中分离分泌的中性金属蛋白酶并使用具有BES(聚醚砜)10kDa截断的Amicon过滤系统8400将其浓缩约10倍。

在4℃下将浓缩的上清液对含1mMCaCl₂的pH5.4的25mMMES缓冲液透析过夜。随后将透析液装载至阳离子交换柱PorosHS20(具有总体积～83mL的AppliedBiosystems柱；结合容量为～4.5g蛋白质/mL柱；水)。用含1mMCaCl₂的pH5.4的25mMMES缓冲液预平衡柱子。使用从25mMMES、pH5.4、1mMCaCl₂至50mMMES、pH6.2、2mMCaCl₂和100mMNaCl的pH值和盐梯度洗脱结合的蛋白质。蛋白质的洗脱介于pH值5.8至6.0之间。将纯蛋白质浓缩并缓冲液交换至含2mMCaCl₂和40％丙二醇的pH5.8的25mMMES缓冲液中。通过测定蛋白水解活性并经10％(w/v)NovexSDS-PAGE(InvitrogenCorp.)来评测制备物的纯度并发现其大于95％。

实施例5

芽孢杆菌宿主菌株的遗传改造

本实施例简述了用于提高重组酶产生的多种枯草杆菌宿主菌株的构建。示例性方法使用以下步骤：

步骤1－碱性蛋白酶的缺失和scoC的引入：

使用重组DNA技术从枯草杆菌168衍生的研究菌株中缺失碱性蛋白酶基因(aprE)(Stahl和Ferrari,JBacteriol,158:411-418,1984；和Yang等,JBacteriol,160:15-21,1984)。通过PBS1转导引入缺失。尽管最初由重组DNA(rDNA)技术产生该缺失，在质粒切除后不存在异源DNA。在引入aprE缺失的同时，还引入了另一个突变scoC。之前已将该突变描述为增加胞外蛋白酶产生的突变(Dod等,MolecGeneGenet,163:45-56,1978)。

步骤2－中性蛋白酶的缺失：

还使用重组DNA技术完成第二个胞外蛋白酶中性蛋白酶(npr)缺失的引入。在向来自步骤1的aprEΔscoC菌株引入突变基因之前首先在研究菌株的npr基因中产生缺失。

步骤3－去除苏氨酸营养缺陷型：

由于步骤2的菌株是氨基酸组氨酸、苏氨酸和色氨酸营养缺陷型(即，需要这三种营养用于生长)，所以使用感受态细胞转化将其变成对苏氨酸原养型。结果，来自步骤3的菌株不再需要苏氨酸用于生长，但仍需要色氨酸和组氨酸。

步骤4－引入孢子形成突变并去除色氨酸营养缺陷型：

该步骤涉及引入不影响酶产生的孢子形成缺陷(spo^-)突变。使用本领域已知的化学诱变剂N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对产蛋白酶的研究菌株进行诱变(Gerhardt(编辑)ManualofMethodsforGeneralBacteriology,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC,226页,1981)。分离并筛选保留与非诱变菌株相当的高水平蛋白酶产生的Spo^-突变体。为了向步骤3的菌株中引入spo^-突变，从诱变菌株中制备染色体DNA并使用感受态细胞转化向步骤3的菌株中引入色氨酸标记和spo^-突变。以这种方式获得的菌株含有spo^-突变并不再需要色氨酸用于生长，但仍需要组氨酸。

步骤5－引入sacU(h)基因并去除组氨酸营养缺陷型：

通过PBS-1介导的转导向来自步骤4的菌株中引入sacU(h)基因。与scoC突变截然不同的sacU(h)基因的该等位基因导致在枯草杆菌中几种胞外酶的产量增加(Kunst等,Biochemie,56:1481-1489,1974)。引入sacU(h)基因的同时消除了对组氨酸的需求。所获菌株为孢子形成缺陷的原养型菌株。

步骤6－引入孢子形成控制缺失：

引入sacU(h)基因后，引入称为spo-3501缺失的另一孢子形成突变。通过转座子诱变鉴定该突变。克隆了该基因，产生缺失并将其引入宿主菌株中。综合起来，spo^-和spo-3501缺失孢子形成突变明显降低了孢子形成频率。

步骤7－引入蛋白酶：

步骤6的枯草杆菌宿主菌株已用于高水平地产生几种酶。这通过用携带与合适的启动子有效组合的目的酶的编码区的质粒表达载体转化宿主菌株来实现。

步骤8－NTG诱变：

为了增强步骤7的重组酶的表达，用NTG处理转化的宿主。筛选比亲代菌株具有产生更多产物能力的大量独立隔离群。以这种方式分离高效生产者。

步骤9－基因产物的环出：

为了将步骤7或步骤8中产生的宿主菌株用作一般生产宿主，通过标准技术去除目的酶的基因。这涉及在芽孢杆菌宿主中通过同源重组将基因环出。

步骤10－去除胞外蛋白酶：

使用与用于缺失aprE相似的重组DNA技术从宿主菌株(Sloma等,JBacteriol,170:5557-5563,1988)中缺失最小胞外蛋白酶(Epr)。通过Southern杂交确认epr基因中的缺失。

步骤11－去除胞内丝氨酸蛋白酶：

使用与用于缺失aprE相似的重组DNA技术产生胞内丝氨酸蛋白酶(ISP)基因的缺失(Koide等,JBacteriol,167:110-116,1986)。通过测定ISP活性以及Southern印迹来监测isp的缺失功效。

步骤12－去除杆菌肽酶F蛋白酶：

使用与用于缺失aprE相似的重组DNA技术产生杆菌肽酶F(BPF)基因的缺失(Sloma等,JBacteriol,172:1470-1477,1990)。通过Southern杂交来确认bpf基因的缺失。

步骤13－去除淀粉酶：

将体外产生的野生型淀粉酶(amyE)基因的缺失引入至步骤12的枯草杆菌菌株中。通过自然感受性将携带破坏的淀粉酶基因的质粒amy/pUCTskan转化至BG3934中。该质粒还携带卡那霉素抗性基因(kanr)和温度敏感的复制起点(TsOri)。本工作中使用的kanr基因最初从粪链球菌(Streptococcusfaecalis)质粒pJH1中分离出来(Trieu-Coet和Courvalin,Gene,23:331-341,1983)。

由于TsOri的存在，在非允许温度下(例如48℃)该质粒在与淀粉酶基因具有同源性的区域整合到染色体中。整合后，在允许温度下，携带该质粒的菌株在不存在卡那霉素时大量生长。这使得质粒切割或丧失，产生亲代菌株或缺少淀粉酶基因的突变体。

步骤14－去除细胞壁蛋白酶：

通过去除编码氨基末端WprA残基的核苷酸向步骤13的菌株中引入细胞壁蛋白酶基因(wprA)的缺失。产生含wprA上游区(5’)侧翼区以及编码羧基末端WprA残基的下游区(3’)的壮观霉素基因的第一个质粒。产生含卡那霉素和温度敏感的复制起点(TsOri)的第二个质粒，其允许在高于37℃的温度下整合。尽管在第二个质粒中不存在破坏5’和3’wprADNA片段的壮观霉素基因，但第二个质粒还包含与第一个质粒相同的5’和3’wprADNA片段。

通过双交换先将含壮观霉素的质粒整合至宿主菌株中取代完整的wprA基因。随后，通过Campbell整合将含TsOri的质粒转化至含壮观霉素的菌株中。第二次转化向宿主染色中引入了如图1中描述的含wprA缺失的盒。使用来自二元转化体的染色体DNA向宿主中转化该盒，并且在不存在任何抗生素的情况下在允许温度(30℃)下生长。随后筛选种群中已失去卡那霉素和壮观霉素抗性的克隆来获得缺少异源DNA的wprA缺失突变体。

实施例6

构建携带多个蛋白酶基因缺失的芽孢杆菌宿主菌株

本实施例提供使用Cre/loxP位点特异重组系统改造枯草杆菌来消除内源蛋白酶产生的一般方法(Palmeros等,Gene,247:255-264,2000)。示例性方法采用以下步骤：

步骤1－将方便的限制性酶切位点设计在引物末端，通过PCR扩增目的蛋白酶基因缺失位点上游和下游片段上约1000bp的同源染色体DNA来构建枯草杆菌蛋白酶基因缺失质粒(例如见图7)。

步骤2－使用BamHI消化来自pLoxSpec质粒的Spec-loxP片段(例如见图8)。

步骤3－使用BamHI消化枯草杆菌蛋白酶基因缺失质粒，并将Spec-loxP片段亚克隆至枯草杆菌蛋白酶基因缺失质粒中。

步骤4－用在上游染色体DNA-Spec-loxP-下游染色体DNA盒中不切割的限制性内切核酸酶消化枯草杆菌蛋白酶基因缺失质粒来将质粒线性化(例如见图9)。

步骤5－使用线性化质粒转化枯草杆菌宿主菌株。选择培养基上所获的任何转化体将具有经双交换整合到染色体中在目的基因缺失位点上的Spec-loxP盒。

步骤6－制备新宿主菌株的枯草杆菌感受态细胞。

步骤7－向新宿主菌株转化pCRM-TsPhleo质粒(例如见图10)并在30℃腐草霉素平板上选择。

步骤8－在不含抗生素的情况下例如无选择压力)用单个腐草霉素抗性菌落接种LB摇瓶(并在42℃生长6小时。

步骤9－在不含抗生素的情况下将培养物接种至LB琼脂板上并在37℃培育。

步骤10－挑取并将菌落铺至新鲜平板上(一块含抗生素而另一块不含抗生素)来鉴定具有目的基因缺失但缺少异源整合载体DNA的菌落(例如在壮观霉素平板或腐草霉素平板上均不能生长)。这些菌落已在染色体DNA中缺失了靶蛋白酶基因并不再携带pCRM-TsPhleo质粒。

使用该方法来产生下文提及的各种BG6000和BG6100菌株。

将携带目的蛋白酶基因缺失的菌株测序来验证蛋白酶基因序列的切除。验证之后，随后用来自枯草杆菌菌株EL534的染色体DNA转化缺失突变体来产生多种NprE蛋白酶产生菌株。随后如实施例4中描述，使用大型发酵罐将菌株转移用于生产。通过测定蛋白酶活性和SDS-PAGE分析来评估发酵液的蛋白酶组合物。

用蛋白酶基因敲除的数字来表示目的菌株。例如，术语2缺失菌株指携带同源aprE(丝氨酸蛋白酶/碱性蛋白酶)和nprE(胞外中性金属蛋白酶)基因缺失的枯草杆菌。

2缺失(akaSC6.1)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

3缺失(akaBG6100)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

Δvpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

4缺失(akaBG6101)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

Δepr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

Δvpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

5缺失(akaBG3934)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

Δepr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

ΔispA(主要胞内丝氨酸蛋白酶)

Δbpr(丝氨酸蛋白酶)

6缺失(akaBG6000)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

Δepr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

ΔispA(主要胞内丝氨酸蛋白酶)

Δbpr(丝氨酸蛋白酶)

Δvpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

8缺失(akaBG6003)

ΔaprE(丝氨酸碱性蛋白酶)

ΔnprE(胞外中性金属蛋白酶)

Δepr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

ΔispA(主要胞内丝氨酸蛋白酶)

Δbpr(丝氨酸蛋白酶)

Δvpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)

ΔwprA(细胞壁相关蛋白酶)

Δmpr-ybfJ(胞外金属蛋白酶)

实施例7

携带两种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了在经改造以缺失两种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE)、EL534和EL535的枯草杆菌宿主菌株中NprE的产生。在图2中提供了质粒pJHT和pUBnprE的图谱。

材料：

pJHT质粒

pUB-nprE质粒

引物EL-755、EL-818、EL-819和EL-820(operonBiotechnologies，Inc.)

SC6.1芽孢杆菌感受态细胞

KODHotStartDNA聚合酶(Novagen)

QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)

pJM102质粒

TempliPhiAmplificationKit(GEHealthcare)

BG3594感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE：：(xylR，pxylA-comK))

引物序列：

EL-755：CGTCTTCAAGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：8)

EL-818：CAGACAATTTCTTACCTAAACCCACTCTTTACCCTCTCCT

TTTAAAAAAATTCAG(SEQIDNO：9)

EL-819：CTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGGGTTTAG

GTAAGAAATTGTCTG(SEQIDNO：10)

EL-820：GCTTATGGATCCGATCATGGTGAAGCCACTGTG(SEQIDNO：11)

方法：

为了构建含有aprE启动子(来自枯草杆菌)与nprE基因(来自解淀粉芽孢杆菌)的整合载体，进行两次分开的PCR反应。

图3中说明的第一次PCR反应涉及从质粒pJHT上扩增aprE启动子。在该反应中，组合以下试剂：1μlpJHT质粒(50ng/μl)、1μl引物EL-755(25uM)、1μl引物EL-818(25μM)、10μl10xKOD缓冲液、10μldNTP(2mM)、4μlMgSO4(25mM)、1ulKODHotStartDNA聚合酶和72μl高压灭菌Milli-Q水以提供100μl的总反应体积。PCR循环是：95℃，2分钟(仅第一个循环)；随后是28个循环的95℃，30秒，54℃，30秒，和72℃，16秒。

第二次PCR反应涉及从质粒pUB-nprE上扩增nprE基因。在该反应中，组合以下试剂：1μlpUB-nprE质粒(50ng/ul)、1μl引物EL-819(25uM)、1μl引物EL-820(25uM)、10μl10xKOD缓冲液、10μldNTP(2mM)、4μlMgSO4(25mM)、1ulKODHotStartDNA聚合酶和72μl高压灭菌Milli-Q水以提供100μl的总反应体积。

PCR循环是：95℃，2分钟(仅第一个循环)；随后是28个循环的95℃，30秒，56℃，30秒，和72℃，40秒。

在扩增各片段后，使用QIAquickPCR纯化PCR产物。PCRSpliceOverlapExtension(SOE)反应然后用于将两个分离的DNA片段连接在一起。在SOE反应中，组合以下试剂：1μlaprE启动子DNA片段、1μl解淀粉芽孢杆菌nprE基因片段、1μl引物EL-755(25uM)、1μl引物EL-820(25uM)、10μl10xKOD缓冲液、10μldNTP(2mM)、4μlMgSO₄(25mM)、1ulKODHotStartDNA聚合酶和69μl高压灭菌Milli-Q水以提供100μl的总反应体积。

PCR循环是：95℃，2分钟(仅第一个循环)；随后是28个循环的95℃，30秒，58℃，30秒，和72℃，55秒。

用EcoRI和BamHI限制性内切核酸酶消化aprE启动子-解淀粉芽孢杆菌nprE基因的PCR融合片段。用EcoRI和BamHI限制性内切核酸酶消化pJM102载体。限制性内切核酸酶消化的aprE启动子-解淀粉芽孢杆菌nprE片段然后连接到限制性内切核酸酶消化的pJM102载体上。然后根据生产商的方案使用TempliPhi滚环扩增来产生大量的连接DNA材料用于提高芽孢杆菌转化效率。尤其是，在11μl总反应物中将1μlDNA连接混合物、5μlTempliPhi样品缓冲液、5μlTempliPhi反应缓冲液和0.2μlTempliPhi酶混合物在30℃温育3小时。通过加入100μl高压灭菌的Milli-Q水稀释所述TempliPhi混合物，并短暂涡旋。

将2μl稀释的TempliPhi材料转化到BG3594-comK感受态细胞中，并且通过使用LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板选择整合到染色体aprE基因座中的质粒。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL534的产生。提取菌株EL534的染色体DNA，然后通过PCR扩增整合的aprE启动子-解淀粉芽孢杆菌nprE基因片段并测序以证实其身份。在图4(SEQIDNO:12)中提供包括融合到nprE可读框的aprE启动子的核酸片段的序列。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL535。

实施例8

携带三种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了NprE在改造以缺失三种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE、Δvpr)、EL549和EL552的枯草杆菌宿主菌株中的产生。

材料：

EL534的染色体DNA

BG6100感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))

方法：

通过加入1μl的EL534染色体DNA(100ng/μl)转化100μl的BG6100感受态细胞。然后在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上选择转化的细胞。在挑取能够在5ppm氯霉素上生长并且在脱脂奶平板上产生晕圈的转化体后，接种5mlLB+5ppm氯霉素试管并在37℃下生长过夜用于染色体DNA提取。使用所提取的染色体DNA，完成向BG6100感受态细胞中的第二轮转化，以保证所述芽孢杆菌染色体含有所有3种蛋白酶缺失。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL549的产生。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的异源NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL552。

实施例9

携带四种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了NprE在经改造以缺失四种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、Δvpr)、EL550和EL553的枯草杆菌宿主菌株中的产生。

材料：

EL534的染色体DNA

BG6101感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))

方法：

通过加入1μl的EL534染色体DNA(100ng/μl)转化100μl的BG6101感受态细胞。然后在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上选择转化的细胞。在挑取能够在5ppm氯霉素上生长并且在脱脂奶平板上产生晕圈的转化体后，接种5mlLB+5ppm氯霉素试管并在37℃下生长过夜用于染色体DNA提取。使用所提取的染色体DNA，完成向BG6101感受态细胞中的第二轮转化，以保证染色体含有所有4种蛋白酶缺失。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL550的产生。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的异源NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL553。

实施例9

携带五种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了NprE在改造以缺失五种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf)、EL543和EL546的枯草杆菌宿主菌株中的产生。

材料：

EL534的染色体DNA

BG3934感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))

方法：

通过加入1μl的EL534染色体DNA(100ng/μl)转化100μl的BG3934-comK感受态细胞。然后在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上选择转化的细胞。在挑取能够在5ppm氯霉素上生长并且在脱脂奶平板上产生晕圈的转化体后，接种5mlLB+5ppm氯霉素试管并在37℃下生长过夜用于染色体DNA提取。使用所提取的染色体DNA，完成向BG3934感受态细胞中的第二轮转化，以保证染色体含有所有5种蛋白酶缺失。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL543的产生。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的异源NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL546。

实施例11

携带六种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了NprE在经改造以缺失六种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr)、EL544和EL547的枯草杆菌宿主菌株中的产生。

材料：

EL534的染色体DNA

BG6000感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))

方法：

通过加入1μl的EL534染色体DNA(100ng/μl)转化100μl的BG6000感受态细胞。然后在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上选择转化的细胞。在挑取能够在5ppm氯霉素上生长并且在脱脂奶平板上产生晕圈的转化体后，接种5mlLB+5ppm氯霉素试管并在37℃下生长过夜用于染色体DNA提取。使用所提取的染色体DNA，完成向BG6000感受态细胞中的第二轮转化，以保证染色体含有所有6种蛋白酶缺失。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL544的产生。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的异源NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL547。

实施例12

携带八种蛋白酶基因缺失的枯草杆菌宿主菌株中的NprE蛋白酶产生

该实施例描述了NprE在经改造以缺失八种内源蛋白酶(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ)、EL545和EL548的枯草杆菌宿主菌株中的产生。

材料：

EL534的染色体DNA

BG6003感受态细胞(ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpf、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE::(xylR,pxylA-comK))

方法：

通过加入1μl的EL534染色体DNA(100ng/μl)转化100μl的BG6003感受态细胞。然后在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上选择转化的细胞。在挑取能够在5ppm氯霉素上生长并且在脱脂奶平板上产生晕圈的转化体后，接种5mlLB+5ppm氯霉素试管并在37℃下生长过夜用于染色体DNA提取。使用所提取的染色体DNA，完成向BG6003感受态细胞中的第二轮转化，以保证染色体含有所有8种蛋白酶缺失。认为能够在LA+5ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板上生长并产生晕圈的转化体含有整合的质粒，导致菌株EL545的产生。然后，使用LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板扩增菌株以获得更高的异源NprE蛋白质表达水平，产生菌株EL548。

实施例13

摇瓶评估

该实施例描述了用于评估多种枯草杆菌宿主菌株中异源NprE的表达的方法。

材料：

芽孢杆菌菌株EL535、EL546、EL547、EL552、EL553和EL548

LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板

LB+25ppm氯霉素

摇瓶评估培养基+25ppm氯霉素

1N盐酸

NuPage10％Bis-TrisGel(Invitrogen)

Novex2xTris-GlycineSDS样品缓冲液(Invitrogen)

NuPage20xMESSDS电泳缓冲液(Invitrogen)

NovexXCellSureLockMini-Cell(Invitrogen)

SimplyBlueSafeStain(Invitrogen)

摇瓶培养基－第1部分(使用1升瓶)

0.03gMgSO₄(无水)

0.22gK₂HPO₄

21.32gNa₂HPO₄*7H₂O

6.1gNaH₂PO₄*H₂O

3.6g尿素

用Milli-Q水将体积加到500ml

摇瓶培养基－第2部分(使用1升瓶)

7gCargill大豆粉

用Milli-Q水将体积加到400ml

摇瓶培养基－贮存液

350gMaltrinM150

210g葡萄糖

用Milli-Q水将体积加到1升

允许冷却、组合第1部分和第2部分，并加入100ml贮存液。

方法：

将表达NprE的多种枯草杆菌菌株的甘油贮存液划线到LA+25ppm氯霉素+1.6％脱脂奶平板。平板在37℃温育过夜。第二天，用待分析的各菌株的单菌落接种2mlLB+25ppm氯霉素管。培养物在37℃下225rpm振荡培养6小时。制备预培养物1:1000的稀释液，加入25ml摇瓶评估培养基+25ppm氯霉素中。培养物在37℃下225rpm培养40小时。40小时后，通过离心收集细胞。将细胞上清液转移到分离的容器中。

为了制备细胞上清液样品用于SDS蛋白质凝胶分析，100μl细胞上清液与25μl冰冷的1N盐酸混合，然后在冰上温育10分钟。然后加入62.5μlNovex2XTris-GlycineSDS样品缓冲液，随后在室温下温育10分钟。使用NuPageMESSDS电泳缓冲液在NovexXcellSureLockMini-Cell中配制NuPage10％Bis-TrisGel(根据生产商的方案)。将细胞上清液样品装载到NuPage10％Bis-TrisGel中，并根据生产商的方案电泳。用水冲洗SDS蛋白质凝胶并用SimplyBlueSafeStain染色(根据生产商的方案)。如图5和图6所示，污染性Vpr蛋白酶存在于2缺失菌株的上清液中，但不存在于8缺失菌株的上清液中。

此外，使用实施例1的方法针对AAPF进行的丝氨酸蛋白酶活性评估表明丝氨酸蛋白酶的活性随酶缺失的增加而降低(表13-1)

*泳道数指图5中所示的蛋白质凝胶。

简言之，编码丝氨酸蛋白酶的基因的缺失导致产生中性金属蛋白酶生产菌株，其具有丝氨酸蛋白酶与金属蛋白酶低于1％的比例。

说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域中技术人员的水平。所有专利和出版物此处引入作为参考，就如同每一出版物被明确和单独地引入作为参考一样。然而，任何出版物的引用不解释为承认其为本领域现有技术。

已经描述了本发明的示例性实施方案，对本领域技术人员显而易见的是可对公开的实施方案进行多种修饰，并期望该修饰处于本发明的范围内。

本领域技术人员容易地理解本发明十分适合实施对象并获得提及的结果和优势，以及其中固有的那些。此处描述的组合物和方法是具代表性的并且不是对本发明范围的限制。对本领域技术人员显而易见的是可对此处公开的发明进行多种替代和修饰，而不背离本发明的范围和精神。

可适当地在缺少此处明确公开的任何元素，限制的情况下实践此处说明性描述的本发明。已经使用的术语和表述用作描述性的术语，而不是限制，并且没有试图使用此类术语和表述排除所示并所述特征的任何等同物或其部分，但公认的是多种修饰在本发明范围内是可能的。因此，应理解尽管通过示例性实施方案和任选的特征已经具体公开了本发明，但本领域技术人员可采用此处公开的概念的修饰和变型，并认为该修饰和变型在所附权利要求定义的本发明范围内。

此处已经广泛并一般性地描述了本发明。位于一般公开内容的每一更窄种类和亚类分组也形成了本发明的部分。这包括本发明的一般描述，条件或负面限制是从属中去除任何主题，不管此处是否明确引用了去除的材料。

Claims (44)

1.用于产生中性金属蛋白酶的方法，其包括

i)提供缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)，和内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)的芽孢杆菌宿主细胞；

ii)用与启动子有效组合的编码异源NprE酶的核酸转化所述芽孢杆菌宿主细胞以提供转化的宿主细胞；和

iii)在适合于产生所述异源NprE酶的条件下培养所述转化的宿主细胞，使得产生所述异源NprE酶。

2.权利要求1的方法，其还包括回收所述产生的异源NprE酶。

3.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌宿主细胞是枯草杆菌。

4.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。

5.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌宿主细胞还缺少内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)，和/或内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。

6.权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌宿主细胞缺少内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，和/或内源胞外金属蛋白酶(Mpr)。

7.权利要求1的方法，其中所述异源NprE酶是解淀粉芽孢杆菌NprE酶或其变体。

8.权利要求7的方法，其中所述解淀粉芽孢杆菌NprE变体具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自等同于在SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列的位置1、3、4、5、6、11、12、13、14、16、21、23、24、25、31、32、33、35、36、38、44、45、46、47、48、49、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、65、66、69、70、76、85、86、87、88、90、91、92、96、97、98、99、100、102、109、110、111、112、113、115、117、119、127、128、129、130、132、135、136、137、138、139、140、146、148、151、152、153、154、155、157、158、159、161、162、169、173、178、179、180、181、183、184、186、190、191、192、196、198、199、200、202、203、204、205、210、211、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、228、229、237、239、240、243、244、245、248、252、253、260、261、263、264、265、267、269、270、273、277、280、282、283、284、285、286、288、289、290、292、293、296、297和299的位置中的至少一个位置上包含替代。

9.权利要求8的方法，其中所述解淀粉芽孢杆菌NprE变体具有氨基酸序列，其包含选自SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列的T4C、T4E、T4H、T4I、T4K、T4L、T4M、T4N、T4P、T4R、T4S、T4V、T4W、T4Y、G12D、G12E、G12I、G12K、G12L、G12M、G12Q、G12R、G12T、G12V、G12W、K13A、K13C、K13D、K13E、K13F、K13G、K13H、K13I、K13L、K13M、K13N、K13Q、K13S、K13T、K13V、K13Y、T14F、T14G、T14H、T14I、T14K,T14L、T14M、T14P、T14Q、T14R、T14S、T14V、T14W、T14Y、S23A、S23D、S23F、S23G、S23I、S23K、S23L、S23M、S23N、S23P、S23Q、S23R、S23S、S23T、S23V、S23W、S23Y、G24A、G24D、G24F、G24G、G24H、G24I、G24K、G24L、G24M、G24N、G24P、G24R、G24S、G24T、G24V、G24W、G24Y、K33H、Q45C、Q45D、Q45E、Q45F、Q45H、Q45I、Q45K、Q45L、Q45M、Q45N、Q45P、Q45R、Q45T、Q45W、N46A、N46C、N46E、N46F、N46G、N46H、N46I、N46K、N46L、N46M、N46P、N46Q、N46R、N46S、N46T、N46V、N46W、N46Y、R47E、R47K、R47L、R47M、R47Q、R47S、R47T、Y49A、Y49C、Y49D、Y49E、Y49F、Y49H、Y49I、Y49K、Y49L、Y49N、Y49R、Y49S、Y49T、Y49V、Y49W、N50D、N50F、N50G、N50H、N50I、N50K、N50L、N50M、N50P、N50Q、N50R、N50W、N50Y、T54C、T54D、T54E、T54F、T54G、T54H、T54IT54K、T54L、T54M、T54N、T54P、T54Q、T54R、T54S、T54V、T54W、T54Y、S58D、S58H、S58I、S58L、S58N、S58P、S58Q、T59A、T59C、T59E、T59G、T59H、T59I、T59K、T59LT59M、T59N、T59P、T59Q、T59R、T59S、T59V、T59W、T60D、T60F、T60I、T60K、T60L、T60N、T60Q、T60R、T60V、T60W、T60Y、T65C、T65E、T65F、T65H、T65I、T65K、T65L、T65M、T65P、T65Q、T65R、T65V、T65Y、S66C、S66D、S66E、S66F、S66H、S66I、S66K、S66L,S66N、S66P、S66Q、S66R、S66T、S66V、S66W、S66Y、Q87A、Q87D、Q87E、Q87H、Q87I、Q87K、Q87L、Q87M、Q87N、Q87R、Q87S、Q87T、Q87V、Q87W、N90C、N90D、N90E、N90F、N90G、N90H、N90K、N90L、N90R、N90T、N96G、N96H、N96K、N96R、K97H、K97Q、K97W、K100A、K100D、K100E、K100F、K100H、K100N、K100P、K100Q、K100R、K100S、K100V、K100Y、R110A、R110C、R110E、R110H、R110K、R110L、R110M、R110N、R110Q、R110S、R110Y、D119E、D119H、D119I、D119L、D119Q、D119R、D119S、D119T、D119V、D119W、G128C、G128F、G128H、G128K、G128L、G128M、G128N、G128Q、G128R、G128W、G128Y、S129A、S129C、S129D、S129F、S129G、S129H、S129I、S129K、S129L、S129M、S129Q、S129R、S129T、S129V、S129W、S129Y、F130I、F130K、F130L、F130M、F130Q、F130R、F130T、F130V、F130Y、S135P、G136I、G136L、G136P、G136V、G136W、G136Y、S137A、M138I、M138K、M138L、M138Q、M138V、D139A、D139C、D139E、D139G、D139H、D139I、D139K、D139L、D139M、D139P、D139R、D139S、D139V、D139W、D139Y、V140C、Q151I、E152A、E152C、E152D、E152F、E152G、E152H、E152L、E152M、E152N、E152R、E152S、E152W、N155D、N155K、N155Q、N155R、D178A、D178C、D178G、D178H、D178K、D178L、D178M、D178N、D178P、D178Q、D178R、D178S、D178T、D178V、D178W、D178Y、T179A、T179F、T179H、T179I、T179K、T179L、T179M、T179N、T179P、T179Q、T179R、T179S、T179V、T179W、T179Y、E186A、E186C、E186D、E186G、E186H、E186K、E186L、E186M、E186N、E186P、E186Q、E186R、E186S、E186T、E186V、E186W、E186Y、V190H、V190I、V190K、V190L、V190Q、V190R、S191F、S191G、S191H、S191I、S191K、S191L、S191N、S191Q、S191R、S191W、L198M、L198V、S199C、S199D、S199E、S199F、S199I、S199K、S199L、S199N、S199Q、S199R、S199V、Y204H、Y204T、G205F、G205H、G205L、G205M、G205N、G205R、G205S、G205Y、K211A、K211C、K211D、K211G、K211M、K211N、K211Q、K211R、K211S、K211T、K211V、K214A、K214C、K214E、K214I、K214L、K214M、K214N、K214Q、K214R、K214S、K214V、L216A、L216C、L216F、L216H、L216Q、L216R、L216S、L216Y、N218K、N218P、T219D、D220A,D220E、D220H、D220K、D220N、D220P、A221D、A221E、A221F、A221I、A221K、A221L、A221M、A221N、A221S、A221V、A221Y、G222C、G222H、G222N、G222R、Y224F、Y224H、Y224N、Y224R、T243C、T243G、T243H、T243I、T243K、T243L、T243Q、T243R、T243W、T243Y、K244A、K244C、K244D、K244E、K244F、K244G、K244L、K244M、K244N、K244Q、K244S、K244T、K244V、K244W、K244Y、V260A、V260D、V260E、V260G、V260H、V260I、V260K、V260L,V260M、V260P、V260Q、V260RV260S、V260T、V260W、V260Y、Y261C、Y261F、Y261I、Y261L、T263E、T263F、T263H、T263I、T263L、T263M、T263Q、T263V、T263W、T263Y、S265A、S265C、S265D、S265E、S265K、S265N、S265P、S265Q、S265R,S265T、S265V、S265W、K269E、K269F、K269G、K269H、K269I、K269L、K269M、K269N、K269P、K269Q、K269S、K269T、K269V、K269W、K269Y、A273C、A273D、A273H、A273I、A273K、A273L、A273N、A273Q、A273R、A273Y、R₂80A、R₂80C、R₂80D、R₂80E、R₂80F、R₂80G、R₂80H、R₂80K、R₂80L、R₂80M、R₂80S、R₂80T、R₂80V、R₂80W、R₂80Y、L282F、L282G、L282H、L282I、L282K、L282M、L282N、L282Q、L282R、L282V、L282Y、S285A、S285C、S285D、S285E、S285K、S285P、S285Q、S285R、S285W、Q286A、Q286D、Q286E、Q286K、Q286P、Q286R、A289C、A289D、A289E、A289K、A289L、A289R、A293C、A293R、N296C、N296D、N296E、N296K、N296R、N296V、A297C、A297K、A297N、A297Q、A297R和G299N的至少一个替代。

10.权利要求8的方法，其中所述解淀粉芽孢杆菌NprE变体具有包含选自S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P和S120I/F130L/M138L/V190I/D220P的多个替代的氨基酸序列。

11.权利要求11的方法，其中所述中性金属蛋白酶与包含如SEQIDNO:3给出的氨基酸序列的中性金属蛋白酶有至少约45％的氨基酸同一性。

12.通过权利要求1所述的方法产生的异源NprE酶。

13.分离的NprE酶，或其变体，所述酶与包含SEQIDNO:3给出的氨基酸序列的中性金属蛋白酶有至少约45％氨基酸同一性。

14.组合物，其包含权利要求13所述的NprE酶或其变体，其中所述组合物基本上没有芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶(AprE)污染。

15.权利要求14的组合物，其中所述AprE污染与所述组合物的NprE或其变体相比以重量计少于约1％。

16.权利要求15的组合物，其中所述AprE污染包含低于约0.50U/ml的丝氨酸蛋白酶活性。

17.权利要求16的组合物，其中所述AprE污染包含低于约0.05U/ml的丝氨酸蛋白酶活性。

18.权利要求17的组合物，其中所述AprE污染包含低于约0.005U/ml的丝氨酸蛋白酶活性。

19.权利要求14的组合物，其中所述组合物是清洁组合物。

20.权利要求19的组合物，其中所述清洁组合物是去污剂。

21.权利要求14的组合物，其还包含选自淀粉酶、脂酶、甘露聚糖酶、果胶酶、角质酶、氧化还原酶、半纤维素酶和纤维素酶的至少一种额外酶或酶衍生物。

22.权利要求14的组合物，其中所述组合物包含至少约0.0001重量百分比的所述NprE酶或其变体。

23.权利要求22的组合物，其中所述组合物包含约0.001到约0.5重量百分比的所述NprE酶或其变体。

24.权利要求14的组合物，其还包含至少一种辅助成分。

25.权利要求14的组合物，其还包含足够量的pH修饰剂来提供具有约3到约5的净pH的组合物，所述组合物基本没有在约pH3到约pH5的pH下水解的物质。

26.权利要求25的组合物，其中在约pH3到约pH5的pH下水解的所述材料包含至少一种表面活性剂。

27.权利要求26的组合物，其中所述表面活性剂是包含环氧乙烷部分的烷基硫酸钠表面活性剂。

28.权利要求14的组合物，其中所述组合物是液体。

29.用于清洁的方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与权利要求19的清洁组合物接触。

30.权利要求29的方法，其还包括在所述表面或材料与所述清洁组合物接触后冲洗所述表面和/或材料的步骤。

31.权利要求14的组合物，其中所述组合物是动物饲料。

32.权利要求14的组合物，其中所述组合物是纺织品和/或皮革处理组合物。

33.芽孢杆菌宿主细胞，其缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)，和内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)，其中所述宿主细胞转化有与启动子有效组合的编码异源NprE酶的核酸。

34.权利要求33的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞是枯草杆菌。

35.权利要求33的芽孢杆菌宿主细胞，其还缺少内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)。

36.权利要求35的芽孢杆菌宿主细胞，其还缺少内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)，和/或内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。

37.权利要求36的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞是枯草杆菌。

38.权利要求36的芽孢杆菌宿主细胞，其还缺少内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)，和/或内源胞外金属蛋白酶(Mpr)。

39.权利要求38的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞是枯草杆菌。

40.权利要求33的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述异源NprE酶是解淀粉芽孢杆菌NprE酶或其变体。

41.分离的芽孢杆菌宿主细胞，其缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)和内源杆菌肽酶F酶(Bpr)。

42.权利要求41的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草杆菌。

43.分离的芽孢杆菌宿主细胞，其缺少内源丝氨酸碱性蛋白酶(AprE)、内源胞外中性金属蛋白酶(NprE)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Vpr)、内源小胞外丝氨酸蛋白酶(Epr)、内源主要胞内丝氨酸蛋白酶(IspA)、内源杆菌肽酶F酶(Bpr)、内源细胞壁相关蛋白酶(WprA)和内源胞外金属蛋白酶(Mpr)。

44.权利要求43的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是枯草杆菌。