CN103476916A - 包含m7或m35金属蛋白酶的去污剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及M7或M35金属蛋白酶在清洁工艺，如洗衣和洗碟中的用途。本发明亦涉及包含M7或M35金属蛋白酶的去污剂组合物和清洁组合物。

Description

包含M7或M35金属蛋白酶的去污剂组合物

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。

技术领域

本发明涉及包含金属蛋白酶(E.C3.4.24)的清洁和/或去污剂组合物。本发明进一步涉及所述金属蛋白酶在清洁工艺，如洗碟和洗衣中的用途。此外，本发明涉及进行清洁如洗碟和洗衣的方法。

发明背景

去污剂工业已在去污剂配制剂中应用不同酶超过30年，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，其每种均适于去除不同类型的污渍。除了酶之外，去污剂组合物通常包含成分的复杂组合。例如，多数清洁产品包含表面活性剂系统，漂白剂或助洗剂。尽管目前去污剂的复杂性，仍存在对于开发包含新的酶和/或酶共混物的去污剂组合物的需求。

金属蛋白酶是其活性绝对需要金属离子的蛋白水解酶。多数金属蛋白酶是锌依存性的，尽管一些使用其它过渡金属。金属蛋白酶广泛用于不同产业如食品和酿造工业。最良好表征的金属蛋白酶组之一是嗜热菌蛋白酶。嗜热菌蛋白酶属于M4家族金属蛋白酶，并已用于，例如肽合成工艺。对于此类工艺，所述嗜热菌蛋白酶需要在高温具活性，并已着眼于增加其在高温的性能。在WO 2004/011619(Stratagene)中，描述了具有改变的切割特异性的嗜热菌蛋白酶样蛋白酶的热稳定性变体。例如，称作嗜热菌蛋白酶的M4金属蛋白酶已用作非特异性蛋白酶以获得供肽测序的片段，如描述于例如EP 0 316725。其亦用作肽合成酶，如描述于WO 2000/37486，其公开了供产生人工增甜剂阿司帕坦(aspartame)的方法。另一种M4金属蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)金属蛋白酶，亦称作Neutrase^TM，其已在多种食品和饲料产品中，和例如在酿造中用作添加剂很多年。该金属蛋白酶亦已描述用于去污剂和清洁组合物以及工艺，如描述于WO 2007/044993中，在去污剂中使用具储藏稳定性的金属蛋白酶，或WO 2009/058518，和EP 1 288 282(Unilever)，其描述了金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的共混物供用于洗碟。WO2000/60042亦描述了含有金属蛋白酶的去污剂组合物。

然而，在去污剂工业中金属蛋白酶的使用非常受限，且着眼点在于使用如金属蛋白酶Neutrase^TM和/或WO 2007/044993中列出的“NprE”。一般而言，金属蛋白酶在常规洗涤条件下和在常规去污剂组合物中非常不稳定。因此，在洗涤和清洁工艺中以及在去污剂中金属蛋白酶的使用受到限制。

对于改善洗涤工艺以使其更加环境友好的增加的灌注导致全球趋于减少洗涤时间、pH和温度，减少会对环境造成不利影响的去污剂成分的量。本发明针对这些以及其它重要的目的。

发明内容

本发明涉及M7和M35金属蛋白酶在清洁工艺如洗衣和洗碟中的用途，并特别涉及在低温洗涤和去除蛋渍(egg stain)中的用途。本发明亦涉及包含M7和M35金属蛋白酶的去污剂组合物和清洁组合物。

在一个具体实施方案中，本发明涉及M7或M35金属蛋白酶在清洁工艺中的用途。

在一个具体实施方案中，本发明涉及清洁方法，所述方法包括下述步骤：将需要清洁的表面与M7或M35金属蛋白酶相接触。

在一个具体实施方案中，本发明涉及包含M7或M35金属蛋白酶和表面活性剂的组合物。

在一个具体实施方案中，本发明涉及从表面去除污渍的方法，其包括将所述表面与根据本发明的组合物相接触。

发明详述

定义

术语“蛋白酶活性”或“肽酶活性”在本文中定义为通过水解在多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键从而降解蛋白的酰胺键的能力。

术语“金属蛋白酶”如用于本文中指在结合/活性位点具有一个或多个金属离子的蛋白酶。

术语“M7金属蛋白酶家族”或“M7金属蛋白酶”或“M7”或“snapalysin家族”如用于本文中意指根据Rawlings等,Biochem.J.,290,205-218(1993)属于M7金属蛋白酶家族，并进一步描述于MEROPS-(Rawlings等,MEROPS:thepeptidase database,Nucl Acids Res,34Database issue,D270-272,2006)中的多肽。蛋白酶家族M7包括一种金属内肽酶，snapalysin。snapalysin在中性pH具活性。其唯一已知的活性是切割脱脂乳的蛋白以在生长中的细菌菌落周围形成清晰的噬斑。锌结合于HEXXHXXGXXD序列基序中的两个组氨酸和一个天冬氨酸；谷氨酸是催化残基。M7蛋白酶具有由SignalP预测程序识别的明显的信号肽。其均具有可切割去的前肽。

术语“M35金属蛋白酶家族”或“M35金属蛋白酶”或“M35”或“deuterolysin家族”如用于本文中意指根据Proteolysis in Cell Function,pp13-21,IOS Press,Amsterdam(1997),Rawlings等,Biochem.J.,290,205-218(1993)属于M35金属蛋白酶家族，并进一步描述于MEROPS-(Rawlings等,MEROPS:the peptidasedatabase,Nucl Acids Res,34Database issue,D270-272,2006)中的多肽。家族M35成员在HEXXH基序中含有两个锌结合组氨酸和催化性谷氨酸。在组氨酸锌配体C端的GTXDXXYG基序中存在第三个锌配体，一个Asp(参见比对)。就此原因，该家族中的蛋白酶有时称作“aspzincin”，尽管其中第三个锌配体是Asp的肽酶亦存在于家族M6，M7和M64。

术语“分离的多肽”如用于本文中指从来源分离的多肽。在一个方面，所述变体或多肽为至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，最优选至少90%纯和甚至最优选至少95%纯，如通过SDS-PAGE确定。

术语“基本上纯的多肽”在本文中指多肽制备物，其按重量计含有最多10%，优选最多8%，更优选最多6%，更优选最多5%，更优选最多4%，更优选最多3%，甚至更优选最多2%，最优选最多1%，和甚至最优选最多0.5%与其天然或重组结合的其它多肽物质，因此，优选所述基本上纯的多肽按制备物中存在的总多肽物质的重量计为至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99.5%纯，和甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯的形式。这可通过例如，藉由公知的重组方法或经典的纯化方法制备所述变体或多肽来实现。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277;http://emboss.org)，优选3.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的参数为缺口开放罚分(gap openpenalty)为10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文;http://emboss.org)，优选3.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定。使用的参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有蛋白酶活性。

术语“多肽的功能性片段”或“其功能性片段”用于描述来源于更长的多肽例如成熟多肽的多肽，且所述多肽在N端区和/或C端区经截短以生成亲本多肽的片段。作为功能性多肽，所述片段必须保持全长/成熟多肽的蛋白酶活性的至少20%，优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少100%。可截短M7或M35金属蛋白酶从而去除特定域以生成功能性片段，其可为从成熟M7或M35金属蛋白酶去除少于200个氨基酸的多肽，优选地，少于150个氨基酸，更优选少于120、100、80、60、40、30个氨基酸，甚至更优选少于20个氨基酸，和最优选少于10个氨基酸从成熟多肽去除。

术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端去除一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸，其中所述亚序列编码具有蛋白酶活性的片段。

术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失的、具有金属蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接着占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

术语“清洁组合物”和“清洁配制剂”指用于从待清洁的物品如织物、地毯、餐具包括玻璃器皿、隐形眼镜、硬表面如瓷砖、锌、地板、和桌表面、毛发(香波)、皮肤(肥皂和乳霜)、牙齿(漱口液、牙膏)等去除不合意的化合物的组合物。该术语涵盖选用于特定类型的合意的清洁组合物的任何材料/化合物，和产品形式(例如液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)，只要所述组合物与用于该组合物的金属蛋白酶和其它酶相容即可。清洁组合物材料的特定选择可通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及组合物对于使用时的清洁条件合意的形式而容易地作出。这些术语进一步指任何适于对任何物体和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的组合物。旨在该术语包括但不限于去污剂组合物(例如液体和/或固体洗衣去污剂和精纺织物(fine fabric)去污剂；硬表面清洁配制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗的；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清凉剂(fabric freshener)；织物软化剂；和纺织品和待洗衣物预处理剂(pre-spotter)，以及洗碟去污剂)。

术语“去污剂组合物”，除非另行指明，包括颗粒或粉末形式的通用或重质(heavy-duty)洗涤剂，特别是清洁去污剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤剂，特别是所谓重质液体(HDL)类型；液体精纺织物去污剂；手洗洗碟剂(hand dishwashing agent)或轻质(light duty)洗碟剂，特别是那些高起泡(high-foaming)类型的；机洗洗碟剂(machine dishwashing agent)，包括用于家用和公用(houshold and institutional use)的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂(rinse-aid)类型的；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型的，清洁条(cleaningbar)，漱口液，义齿清洁剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂；毛发香波和毛发洗剂(hair shampoos and hair-rinse)；沐浴液(shower gel)，泡泡浴(foam bath)；金属清洁剂，以及清洁助剂如漂白添加剂和“固色棒(stain-stick)”或预处理类型的。

术语“去污剂组合物”和“去污剂配制剂”用于指旨在用于洗涤介质中以清洁经污染的物体的混合物。在一些实施方案中，该术语用于指洗涤织物和/或衣物(例如“洗衣去污剂”)。在其他实施方案中，该术语指其它去污剂，如用于清洁碟、刀叉等的那些(例如“洗碟去污剂”)。不意欲本发明限于任何具体去污剂配制剂或组合物。旨在除了根据本发明的M7或M35金属蛋白酶之外，该术语还涵盖含有下述的去污剂：例如表面活性剂，助洗剂(builders)，螯合剂，漂白系统或漂白组分，聚合物，织物调理剂(fabric conditioners)、增泡剂(foamboosters)、抑泡剂(suds suppressors)、香料(perfume)、晦暗抑制剂(tarnishinhibitors)、光学增亮剂(optical brighteners)、杀细菌剂(bactericides)、杀真菌剂(fungicides)、悬污剂(soil-suspending agents)、抗腐蚀剂(anti-corrosion agents)、酶抑制剂或稳定剂(enzyme inhibitors or stabilizers)、酶活化剂(enzymeactivators)、转移酶、水解酶、氧还酶、增蓝剂和荧光染料(bluing agents andfluorescent dyes)、抗氧化剂和增溶剂。

术语“织物”涵盖任何纺织品材料。因此，旨在该术语涵盖衣物，以及织物、纱线、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料，和任何其它纺织品材料。

术语“纺织品”指机织织物，以及定长纤维(staple fiber)和适于转化为或用作纱线的细丝(filament)，机织、针织和无纺织物。该术语涵盖从天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。术语“纺织品材料”是纤维、纱线中间物(yarnintermediate)、纱线、织物和从织物制成的产品(例如衣物和其它制品)的上位术语。

术语“非织物去污剂组合物”包括非纺织品表面去污剂组合物，包括但不限于洗碟去污剂组合物，口腔去污剂组合物，义齿去污剂组合物，和个人清洁组合物。

术语“有效量的酶”指在特定应用中，例如在限定的去污剂组合物中达成所需的酶活性所必需的酶的量。此类有效量可由本领域一般技术人员方便地确定，并基于多种因素，如使用的具体酶，清洁应用，去污剂组合物的具体组成，和是否需要液体或干燥(例如颗粒、条)的组合物，等等。术语金属蛋白酶的“有效量”指达成期望水平的酶活性(例如在限定的去污剂组合物中达成期望水平的酶活性)的前述金属蛋白酶的量。

术语酶“洗涤性能”指酶对洗涤的贡献，即与不将酶添加至组合物的去污剂相比，提供额外的清洁性能。将洗涤性能在相关的洗涤条件下进行比较。酶的洗涤性能方便地通过其在合适的测试条件下去除某些代表性污渍的能力来衡量。在这些测试系统中，可控制其它相关因素，如去污剂组合物，去污剂浓度，水硬度，洗涤力学，时间，pH和/或温度，使它们模仿某个市场领域中的家庭应用的典型条件。

术语“水硬度”或“硬度(degrees of hardness)”或“dH”或“°dH”如用于本文中指德国硬度(German degrees of hardness)。一度定义为每升水10毫克的氧化钙。

术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指实际用于去污剂市场领域中家用的条件，特别是洗涤温度，时间，洗涤力学，去污剂浓度，去污剂的类型和水硬度。

术语“改善的性质”用于指与不用该酶进行的相同工艺相比在某个性质方面获得的较佳的最终结果。优选在本发明的工艺中改善的例示性性质包括洗涤性能，酶稳定性，酶活性和底物特异性。

术语“改善的洗涤性能”用于指与不含酶或与参照酶相比，在相关的洗涤条件下从经洗涤的物品(例如织物或餐具和/或刀叉)去除污渍方面获得更好的最终结果，或相对于不含酶或相对于参照酶，获得相同的最终结果需要的酶更少(基于重量)。在此语境中，改善的酶性能也可以是在更短的洗涤时间内获得相同的效果，例如污渍去除效果，例如，所述酶在测试条件下更快地起效。

术语“保持的洗涤性能”用于指某种酶的洗涤性能，基于重量，在相关的洗涤条件下相对于另一种酶为至少80%。

术语“酶去污性”或“去污性”或“去污作用”在本文中定义为相对于不含酶的相同去污剂，酶对去污剂增加的有利的作用。可由酶提供的重要的去污性益处有：在洗涤和/或清洁之后，污渍去除至不存在或仅存在极微的可见污物，防止或减少在洗涤工艺中释放的污物的再沉积(该作用亦称“抗再沉积”)，完全或部分地恢复原本是白色，但在反复使用和洗涤之后外观变为灰白色或浅黄色的纺织品的白度(whiteness)(亦称作增白的作用)。纺织品护理上的益处——其不直接涉及催化性污渍去除或污物再沉积的阻止——对于酶去污性上的益处也是重要的。此类纺织品护理上的益处的实例是：阻止或减少染料从一片织物至另一片织物或相同织物的另一部分的转移(亦称作染料转移抑制或抗返沾色(anti-back staining)的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的起球或起毛(亦称为抗起球的作用)，改善织物柔度(fabric-softness)，织物的颜色澄清和捕获于织物或衣物纤维中的颗粒状污物的去除。酶漂白是另一种酶去污性益处，其中催化活性一般地用于催化漂白组分如过氧化氢或其它过氧化物的形成。

术语“抗再沉积”用于本文中描述减少或阻止溶解或悬于洗涤液剂中的污物再沉积于经清洁的物体。再沉积可见于一次或多次洗涤循环之后(例如作为灰化(greying)、黄化(yellowing)或其它变色(discoloration))。

术语“辅助物质”意指对于合意的去污剂组合物的具体类型和产品的形式(例如液体、颗粒、粉末、条、糊剂、喷雾剂、片剂、凝胶或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体物质，所述物质亦优选与组合物中使用的金属蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物为“紧凑(compact)”形式，而在其它实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。

术语“污渍去除酶”如用于本文中描述协助从织物或硬表面去除污渍或污物的酶。污渍去除酶作用于特异性底物，例如蛋白酶作用于蛋白，淀粉酶作用于淀粉，脂肪酶和角质酶作用于脂质(脂肪和油)，果胶酶作用于果胶，而半纤维素酶作用于半纤维素。污渍通常是不同组分的复杂混合物的沉积，其本身导致所述材料的局部变色，或在物体上留下粘性表面，粘性表面可吸引溶解于洗涤液剂中的污物，从而导致污染区域的变色。当酶作用于其存在于污渍中的特异性底物时，所述酶降解或部分降解其底物，从而协助在洗涤工艺中与所述底物结合的污物和污渍组分的去除。例如，当蛋白酶作用于草渍时，其降解草中的蛋白组分，并允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。

术语“减少的量”在本文上下文中意指组分的量少于在其它相同的条件下在参照工艺中会使用的量。在一个优选实施方案中，所述量减少例如至少5%，如至少10%，至少15%，至少20%，或如本文中另行描述的。

术语“低去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在低于约800ppm去污剂组分的去污剂。亚洲例如日本去污剂通常视为低去污剂浓度系统。

术语“中等去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在约800ppm至2000ppm去污剂组分的去污剂。北美去污剂一般视为中等去污剂浓度系统。

术语“高去污剂浓度”系统包括在洗涤水中存在大于约2000ppm去污剂组分的去污剂。欧洲去污剂一般视为高去污剂浓度系统。

M7和M35金属蛋白酶

本发明一般地涉及M7和M35金属蛋白酶家族的分离的多肽的用途。

具体而言，本发明人鉴定出M7和M35金属蛋白酶令人意想不到地可用于清洁组合物和工艺，如洗碟和洗衣。本领域技术人员会了解MEROPS分类系统，特别是根据MEROPS的亚类的指配，主要是基于序列同一性，但亦包含其它因素如酶活性，和基于相关文献的其它性质。

一般已知金属蛋白酶具备热稳定性，因此，M7和M35在根据本发明的去污剂清洁组合物和工艺，如低温洗涤和蛋渍去除(egg removal)中具有活性，是出人预料的。

本发明使用下式的例示性分离的M7和M35金属蛋白酶来说明。这些M7和M35金属蛋白酶中的一些是公众可获得的，或者是作为完整表达的蛋白，或在序列数据库中作为从基因组测序计划获得的开读框(在表1中标以参考文献)。

表1是用于说明本发明并可应用于本发明的所有用途的M7和M35金属蛋白酶的列表。

表1

本领域技术人员会知道在一些实施方案中，成熟多肽自身可为更长序列的一部分，所述序列包含例如合适的前肽和/或信号肽序列。

表1中的例示性M7和M35金属蛋白酶之间的序列同一性在下表中给出。同一性对应于精确匹配数除以比对的总长度(排除缺口)，并如定义中所示进行计算。

在本发明的一个优选实施方案中，表2中所示的M7和M35的下述亚组可用于去污剂。

表2

在一个具体实施方案中，应用于本发明的用途的M7和M35金属蛋白酶是成熟多肽或其功能性片段。更优选地，将表1-2中的至少一种成熟M7和M35金属蛋白酶或其功能性片段应用于本发明的用途。

除了使用表1中M7和M35金属蛋白酶之外，本发明涵盖使用如下所述的多肽：该多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中任一个的成熟多肽或其功能性片段具有至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%，或甚至100%的序列同一性，且能可被分类为M7和M35金属蛋白酶(在下文中称为“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6任一个相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，甚至更优选相差一个氨基酸。本发明的多肽优选包含或组成为(consists of)SEQ IDNO:1、2、3、4、5或6的氨基酸序列或其等位变体；或它们的功能性片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的成熟多肽。

上述序列的基本上同源的多肽表征为在成熟多肽中具有一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。优选地，氨基酸变化是不重要的(of a minornature)，即不显著影响蛋白折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常为一至约九个氨基酸的缺失，如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个氨基酸缺失，优选一至约15个氨基酸的缺失，如10、11、12、13、14或15个氨基酸的缺失；和最优选一至约30个氨基酸的缺失，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的缺失；小的氨基端或羧基端的延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约五至十个残基，优选10至15个残基，且最优选20至25个残基的小接头肽，或通过改变静电荷或其它功能而便于纯化的小延伸，如聚组氨酸标签，抗原表位，蛋白A，糖结合模块，或其它结合域。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变具体活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且在例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中有说明。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个标准氨基酸，也可用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代野生型多肽中的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以通过化学方法合成，并且优选是可商购的，并包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。

或者，氨基酸变化可以是这样的性质，其使得所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善多肽的热稳定性，改善其底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即去污性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的三维结构，如α-螺旋，β-折叠，以及金属结合位点，或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。也可以基于与本发明多肽的近缘多肽的同一性分析来推断必需氨基酸的身份(identity)。

可以使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后实施相关的筛选程序，例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法，来产生并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。可以使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的部分融合于另一个多肽的部分的N端或C端。

所述亲本可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。

融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。

M7和M35金属蛋白酶的来源

可用于本发明的M7或M35金属蛋白酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源一起使用的术语“获得自”应理解为：由某个核苷酸序列编码的某个多肽由天然存在该多肽的来源所产生，或由其中插入了来自该来源的所述核苷酸序列的菌株所产生。在一个优选的方面，所述获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可为具有金属蛋白酶活性的革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、Janibacter、Kribbella、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在一个方面，所述多肽是Geobacillus caldolyticus，Geobacillusstearothermophilus或Geobacillus thermoglusidasius多肽。

在一个方面，所述多肽是Janibacter sp.多肽。

在另一个方面，所述多肽是Kribbella flavida或Kribbella solani多肽。

在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明的多肽可为真菌多肽，并更优选为酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、毛壳菌属(Chaetomium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、孔座壳属(Poronia)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)或轮枝孢属(Verticillium)多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、棉色二孢(Diplodiagossyppina)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、Magnaporthegrisea、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、点孔座壳(Poronia punctata)、假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)、橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、Trichophaea saccata或Verticillium tenerum多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是灰色链霉菌、紫红链霉菌、Kribbellaflavida、Janibacter sp.、米曲霉或橙橘嗜热子囊菌多肽。在一个方面，所述多肽是灰色链霉菌、紫红链霉菌、Kribbella flavida或Janibacter sp.多肽。在一个方面，所述多肽是米曲霉或橙橘嗜热子囊菌多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述多肽。用于直接从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选此种微生物的基因组DNA或cDNA文库来得到所述多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员公知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

本发明的多肽亦包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

组合物

本发明亦涉及包含M7或M35金属蛋白酶的组合物。优选地，所述组合物富含M7或M35金属蛋白酶。术语“富含”指组合物的蛋白酶活性已经过增加，例如以至少1.1的富集因子增加。

在一个实施方案中，本发明涉及包含M7或M35金属蛋白酶和合适的载体和/或赋形剂的组合物，特别是清洁组合物和/或去污剂组合物。

在一个实施方案中，所述去污剂组合物可适于特定用途，如洗衣特别是家用洗衣，洗碟，或硬表面清洁。

本发明的去污剂组合物可例如配制为手洗或机洗洗衣去污剂组合物，包括适用于预处理有污渍的织物的洗衣添加组合物，和漂洗添加的织物软化剂剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制为供手洗或机洗的洗碟操作。本发明的去污剂组合物可用于硬表面清洁，自动洗碟用途，以及美容用途如义齿、牙齿、毛发和皮肤。

在一个优选实施方案中，所述去污剂组合物包含一种或多种常规载体和/或赋形剂，如下文例示的那些。

本发明的去污剂组合物可为任何便利的形式，例如条，片剂，粉末，颗粒，糊剂或液体。液体去污剂可为水性的，通常含有高至70%水和0-30%有机溶剂，或非水性的。

除非另行指明，本文中提供的所有组分或组合物水平是针对该组分或组合物的活性水平给出的，并排除杂质，例如可存在于商业来源中的残余溶剂或副产物。

所述M7或M35金属蛋白酶通常以按组合物重量计0.000001%至2%的酶蛋白的水平，优选按组合物重量计0.00001%至1%的酶蛋白的水平，更优选按组合物重量计0.0001%至0.75%的酶蛋白的水平，甚至更优选按组合物重量计0.001%至0.5%的酶蛋白的水平组入去污剂组合物中。

此外，所述M7或M35金属蛋白酶通常以使得其在洗涤水中的浓度为洗涤水中0.0000001%至1%酶蛋白的水平，优选0.000005%至0.01%酶蛋白的水平，更优选0.000001%至0.005%酶蛋白的水平，甚至更优选0.00001%至0.001%的酶蛋白的水平的量组入去污剂组合物中。

如公知的，酶的量会根据具体应用和/或作为包含于组合物中的其它组分的结果而变化。

供用于自动洗碟(ADW)的组合物，例如，可按组合物的重量计包含0.001%-50%，如0.01%-25%，如0.02%-20%，如0.1-15%的酶蛋白。

供用于洗衣颗粒(laundry granulation)的组合物，例如，可按组合物的重量计包含0.0001%-50%，如0.001%-20%，如0.01%-15%，如0.05%-10%的酶蛋白。

供用于洗衣液的组合物，例如，可按重量计包含0.0001%-10%，如0.001-7%，如0.1%-5%的酶蛋白。

在一些优选实施方案中，本文中提供的去污剂组合物通常配制为使得在水性清洁操作中使用时，洗涤水具有约5.0至约11.5的pH，或在其它实施方案中，甚至约6.0至约10.5，如约5至约11，约5至约10，约5至约9，约5至约8，约5至约7，约6至约11，约6至约10，约6至约9，约6至to约8，约6至约7，约7至约11，约7至约10，约7至约9，或约7至约8的pH。在一些优选实施方案中，颗粒或液体洗衣产品配制为使得洗涤水具有约5.5至约8的pH。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，对于本领域技术人员是公知的。

酶组分重量基于总活性蛋白。所有百分比和比例均按重量计算，除非另行指明。所有百分比和比例均基于总组合物计算，除非另行指明。在例示的去污剂组合物中，酶水平表示为按组合物重量计的纯酶，且除非另行指明，去污剂成分表示为总组合物的重量。

本发明的酶亦可用于去污剂添加剂产品。包含M7或M35金属蛋白酶的去污剂添加剂产品理想地适于包括在洗涤工艺中，例如当温度较低，pH在6至8，和洗涤时间较短如低于30分钟时。

去污剂添加剂产品可为M7或M35金属蛋白酶，和优选其它的酶。在一个实施方案中，将添加剂包装于剂量形式以供添加至清洁工艺。所述单剂量可包含丸剂，片剂，软胶囊(gelcap)，或其它单剂量单位包括粉末和/或液体。在一些实施方案中，包含填充剂和/或载体物质，合适的填充剂或载体物质包括但不限于多种硫酸盐，碳酸盐，和硅酸盐，以及滑石，黏土等。在一些实施方案中，用于液体组合物的填充剂和/或载体物质包含水和/或低分子量伯醇和叔醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。

在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的M7或M35金属蛋白酶作为颗粒组合物或液体应用，所述金属蛋白酶可为包囊颗粒的形式。在一个实施方案中，包囊材料选自下组：糖、天然或合成树胶，壳多糖和壳聚糖，纤维素和纤维素衍生物，硅酸盐，磷酸盐，硼酸盐，聚乙烯醇，聚乙二醇，石蜡，及其组合。

根据本发明的组合物通常包含一种或多种去污剂成分。术语去污剂组合物包括制品和清洁和处理组合物。除非另行指明，术语清洁组合物包括片剂，颗粒或粉末形式的通用或“重质”洗涤剂，特别是洗衣去污剂；液体，凝胶或糊剂形式的通用洗涤剂，特别是所谓重质液体类型；液体精纺织物去污剂；手洗洗碟剂或轻质洗碟剂，特别是那些高起泡类型的；机洗洗碟剂，包括多种供家用和公用的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型。所述组合物亦可为单位剂量包装，包括本领域已知的那些，和水溶性、水不溶性和/或水渗透性的那些。

在清洁和/或去污剂成分可能与本发明的金属蛋白酶不相容的实施方案中，可使用合适的方法以保持所述清洁和/或去污剂成分和金属蛋白酶分隔开(即，不互相接触)，直至两种成分的合并合适时为止。此类分隔方法包括任何本领域中已知的合适方法(例如，软胶囊，包囊，片剂，物理分隔)。

如上文当本发明的金属蛋白酶用作去污剂组合物(例如洗衣洗涤去污剂组合物或洗碟去污剂组合物)的成分时所述的，其可例如以无尘颗粒、稳定化的液体或受保护的酶的形式包含于去污剂组合物。无尘颗粒可例如如US4,106,991和4,661,452(均授予Novo Industri A/S)中所公开而产生，并可任选地通过本领域已知方法涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；乙氧化脂族醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流动床技术施用的形成薄膜的涂覆材料的实例在GB 1483591中给出。

在一些实施方案中，本文中使用的酶通过提供下述离子给所述酶的完成的组合物中的水溶性来源的锌(II)，钙(II)和/或镁(II)离子，以及其他金属离子(例如钡(II)，钪(II)，铁(II)，锰(II)，铝(III)，锡(II)，钴(II)，铜(II)，镍(II)和氧钒(IV))的存在而稳定化。本发明的去污剂组合物的酶亦可使用常规的稳定化剂如多元醇例如聚乙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸来稳定化，且所述组合物亦可如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。本发明的酶亦可通过添加例如蛋白质类型的(如描述于EP 0 544 777 B1)或硼酸类型的可逆性酶抑制剂来稳定化。其它酶稳定化剂在本领域是公知的，如肽醛和蛋白水解物，水解物，例如根据本发明的金属蛋白酶可使用肽醛或酮来稳定化，如描述于WO2005/105826和WO2009/118375。

供包含于本发明的去污剂组合物中的受保护的酶可如上所述根据EP 238216中公开的方法来制备。

所述组合物可增添一种或多种用于阻止或去除生物被膜(biofilm)形成的试剂。这些试剂可包括但不限于分散剂、表面活性剂、去污剂、其它酶、抗微生物剂和杀生物剂。

其它酶

在一个实施方案中，将M7或M35金属蛋白酶与一种或多种酶，如至少两种酶，更优选至少三种、四种或五种酶组合。优选地，所述酶具有不同的底物特异性，例如蛋白水解活性，淀粉分解活性，脂肪分解活性，半纤维素分解活性或果胶分解活性。

所述去污剂添加剂以及去污剂组合物可包含一种或多种酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般而言所选酶的性质应与选定的去污剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，且该酶应以有效量存在。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括动物、植物或微生物来源的那些。特别合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶为具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例为描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307和WO 1999/001544的那些。

商业上可获得的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(NovozymesA/S)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

肽酶和蛋白酶：合适的肽酶和蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来源于芽孢杆菌属的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，和描述于WO89/06270和WO 94/25583的镰孢属蛋白酶。

可用的蛋白酶的实例为描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上可获得的蛋白酶包括Alcalase^TM，Savinase^TM，Primase^TM，Duralase^TM，Esperase^TM，Kannase^TM，Ovozyme^TM，Polarzyme^TM，Everlase^TM，Coronase^TM和Relase^TM(Novozymes A/S)，Maxatase^TM，Maxacal^TM，Maxapem^TM，Properase^TM，Purafect^TM，Purafect OxP^TM，FN2^TM，和FN3^TM(GenencorInternational Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括包括动物、植物或微生物来源的那些。特别合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。可用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)，例如来自如描述于EP 258 068和EP 305 216的疏棉状腐质霉(T.Lanuginosus)或来自如描述于WO 96/13580的特异腐质霉的脂肪酶，假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，萤光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其他实例为那些描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202的脂肪酶变体。

优选的商业上可获得的脂肪酶包括Lipex^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶包括包括动物、植物或微生物来源的那些。特别合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，从GB 1,296,839更具体描述的地衣芽孢杆菌的特别菌株获得。

可用的淀粉酶的实例为描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424的变体，特别是在一个或多个下述位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上可获得的淀粉酶为Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自Genencor International Inc.)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinerius)的过氧化物酶及其变体，如描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257的那些。

商业上可获得的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

所述去污剂酶均可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂而包含于去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可例如配制为颗粒、液体、浆料等等。优选的去污剂添加剂剂型为颗粒，特别是如上所述的无尘颗粒，液体，特别是稳定化的液体，或浆料。

表面活性剂

通常，所述去污剂组合物包含(按组合物重量计)0%至50%，优选2%至40%，更优选5%至35%，更优选7%至30%，最优选10%至25%，甚至最优选或15%至20%范围的一种或多种表面活性剂。在一个优选实施方案中，所述去污剂是按重量计包含少于40%，优选少于30%，更优选少于25%，甚至更优选少于20%的表面活性剂的液体或粉末去污剂。所述组合物可包含1%至15%，优选2%至12%，3%至10%，最优选4%至8%或甚至最优选4%至6%的一种或多种表面活性剂。优选的表面活性剂是阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，阳离子型表面活性剂，两性离子型表面活性剂，两性表面活性剂或其混合物。优选地，大部分表面活性剂为阴离子型。合适的阴离子型表面活性剂在本领域是公知的，且可包含脂肪酸羧化物(皂类)，支链、直链和随机链烷基硫酸盐或脂肪醇硫酸盐或伯醇硫酸盐或烷基苯磺酸盐如LAS和LAB，或苯基烷基磺酸盐或烯基磺酸盐或烯基苯磺酸盐或烷基乙氧硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐或α-链烯基磺酸盐或十二碳烯基/十四碳烯基琥珀酸。所述阴离子型表面活性剂可以是烷氧化的。所述去污剂组合物亦可包含1wt%至10wt%的非离子型表面活性剂，优选2wt%至8wt%，更优选3wt%至7wt%，甚至更优选少于5wt%的非离子型表面活性剂。合适的非离子型表面活性剂在本领域是公知的，且可包含醇乙氧化物，和/或烷基乙氧化物，和/或烷基酚乙氧化物，和/或葡糖酰胺如脂肪酸N-葡糖基N-甲基酰胺，和/或烷基聚葡糖苷和/或单乙醇胺或二乙醇胺或脂肪酰胺。所述去污剂组合物亦可包含0wt%至10wt%的阳离子型表面活性剂，优选0.1wt%至8wt%，更优选0.5wt%至7wt%，甚至更优选少于5wt%的阳离子型表面活性剂。合适的阳离子型表面活性剂在本领域是公知的，且可包括烷基季铵化合物，和/或烷基吡啶化合物，和/或烷基季磷化合物，和/或烷基叔锍化合物。所述组合物在洗衣过程中在洗涤液中包含提供100ppm至5000ppm表面活性剂的量的表面活性剂。所述组合物在与水接触之后通常形成包含0.5g/L至10g/L去污剂组合物的洗涤液。许多合适的表面活性化合物是可获得的，并完整地描述于文献，例如Schwartz、Perry和Berch的″Surface-Active Agents and Detergents″,第I和11卷中。

助洗剂

助洗剂的主要作用是从洗涤溶液隔离会与表面活性剂系统发生不利的相互作用的二价金属离子(如钙和锰离子)。助洗剂亦有效地从织物表面去除金属离子和无机污物，导致颗粒和饮料污渍的去除改善。助洗剂亦为碱度的来源，并将洗涤水的pH缓冲至9.5至11的水平。该缓冲容量亦称作储备碱度(reservealkalinity)，并应优选大于4。

本发明的去污剂组合物可包含一种或多种去污剂助洗剂或助洗剂系统。许多合适的助洗剂系统已描述于文献中，例如在Powdered Detergents,Surfactant science series,volume 71,Marcel Dekker,Inc.中。助洗剂可按主题组合物的重量计包含0%至60%，优选5%至45%，更优选10%至40%，最优选15%至35%，甚至更优选20%至30%的助洗剂。所述组合物可根据主题组合物的重量计包含0%至15%，优选1%至12%，2%至10%，最优选3%至8%，甚至最优选4%至6%的助洗剂。

助洗剂包括但不限于聚磷酸(例如三磷酸STPP)的碱金属、铵和烷醇胺盐，碱金属硅酸盐，碱土金属和碱金属碳酸盐，铝硅酸盐助洗剂(例如沸石)，和聚羧酸盐化合物，醚羟基多羧酸盐(ether hydroxypolycarboxylates)，马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸，和羧甲氧琥珀酸(carboxymethyloxysuccinic acid)，聚乙酸如乙二胺四乙酸和氮三乙酸的多种碱金属、铵和取代铵盐，以及多羧酸盐(polycarboxylate)，如苯六甲酸，琥珀酸，柠檬酸，羟二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧甲氧琥珀酸和它们的可溶性盐。乙醇胺(MEA，DEA和TEA)亦可在液体去污剂中贡献缓冲容量。

漂白剂

本发明的去污剂组合物可包含一种或多种漂白剂。具体而言，粉末化的去污剂可包含一种或多种漂白剂。合适的漂白剂包括其他光漂白剂(photobleach)、预制的(pre-formed)过酸，过氧化氢源，漂白激活剂，过氧化氢，漂白催化剂，及其混合物。一般而言，当使用漂白剂时，本发明的组合物可包含按主题清洁组合物的重量计约0.1%至约50%或甚至约0.1%至约25%漂白剂。合适的漂白剂的实例包括：

(1)其他光漂白剂，例如维生素K3；

(2)预制的过酸：合适的预制的过酸包括但不限于选自下组的化合物：过羧酸和盐，过碳酸和盐，过亚胺酸(perimid acid)和盐，过氧一硫酸(peroxymonosulfuric acid)和盐，例如臭氧，及其混合物。合适的过羧酸包括具有式R-(C=O)O-O-M的疏水性和亲水性过酸，其中R是烷基基团，任选支化的，当所述过酸为疏水性时，具有6至14个碳原子，或8至12个碳原子，而当所述过酸为亲水性时，具有少于6个碳原子，或甚至少于4个碳原子；且M是反离子，例如钠、钾或氢；

(3)过氧化氢源，例如，无机过氧化氢合盐(perhydrate salt)，包括碱金属盐如钠的过硼酸盐(通常一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐，及其混合物。在本发明的一个方面，所述无机过氧化氢合盐选自下组：钠的过硼酸盐、过碳酸盐，及其混合物。当应用时，无机过氧化氢合盐通常以总组合物的0.05至40wt%，或1至30wt%的量存在，并通常作为可涂覆的晶态固体掺入此类组合物。合适的涂层包括，无机盐如碱金属的硅酸、碳酸或硼酸盐，或其混合物，或有机物质如水溶性或可分散聚合物、蜡、油或脂肪皂类。可用的漂白组合物描述于美国专利号5,576,282和6,306,812；

(4)具有R-(C=O)-L的漂白激活剂，其中R是烷基基团，任选为支化的，当所述漂白激活剂为疏水性时，具有6至14个碳原子，或8至12个碳原子，而当所述漂白激活剂为亲水性时，具有少于6个碳原子，或甚至少于4个碳原子；且L是离去基团。合适的离去基团的实例为苯甲酸及其衍生物，特别是苯磺酸。合适的漂白激活剂包括十二烷酰氧苯磺酸(dodecanoyl oxybenzenesulphonate)，癸酰氧苯磺酸(decanoyl oxybenzene sulphonate)，癸酰氧苯甲酸(decanoyl oxybenzoic acid)或其盐，3,5,5-三甲基己酰氧苯磺酸(3,5,5-trimethylhexanoyloxybenzene sulphonate)，四乙酰乙二胺(tetraacetyl ethylene diamine，TAED)，和壬酰氧苯磺酸(nonanoyloxybenzene sulphonate，NOBS)。合适的漂白激活剂亦公开于WO98/17767。尽管可使用任何合适的漂白激活剂，在本发明的一个方面，主题的清洁组合物可包含NOBS、TAED或其混合物；和

(5)能够从过氧酸接受氧原子并将所述氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂描述于WO 2008/007319。合适的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和多离子；亚胺两性离子；修饰的胺；修饰的胺氧化物；N-磺酰亚胺；N-膦酰亚胺；N-酰亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环糖酮及其混合物。所述漂白催化剂通常会以按重量计0.0005%至0.2%，0.001%至0.1%，或0.005%至0.05%的水平包含于去污剂组合物中。

当存在时，过酸和/或漂白激活剂一般以基于组合物约0.1至约60wt%，约0.5至约40wt%或约0.6至约10wt%的量存在于组合物中。一种或多种疏水性过酸或其前体可与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

可选择过氧化氢源和过酸或漂白激活剂的量使得可用的氧(来自过氧化物源)对过酸的摩尔比例为1:1至35:1，或2:1至10:1。

辅助物质

分散剂-本发明的去污剂组合物亦可含有分散剂。具体而言，粉末去污剂可包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚或共聚的酸及其盐，其中聚羧酸包含至少两个羧基基团，它们彼此被不多于两个碳原子分开。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents,Surfactant science series volume71,Marcel Dekker,Inc.。

染料转移抑制剂-本发明的去污剂组合物亦可包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合染料转移抑制剂包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮聚合物，聚胺N-氧化物聚合物，N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物，聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑，或其混合物。当存在于主题组合物中时，所述染料转移抑制剂可以按组合物重量计以约0.0001%至约10%，约0.01%至约5%或甚至约0.1%至约3%的水平存在。

荧光增白剂-本发明的去污剂组合物会优选亦含有其它可将进行清洁的制品染亮(tint)的组分，如荧光增白剂或光学增亮剂。任何适用于洗衣去污剂组合物的荧光增白剂可用于本发明的组合物。最常用的荧光增白剂是属于二氨基茋磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-二苯乙烯基衍生物类型的。二氨基茋磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括下述的钠盐：4,4′-二-(2-二乙醇胺基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2′-二磺酸，4,4′-二-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2′-二磺酸，4,4′-二-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2′-二磺酸，4,4′-二-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)茋-2,2′-二磺酸，4,4′-二-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2′-二磺酸，和2-(茋基-4″-萘-1.,2′:4,5)-1,2,3-三唑-2″-磺酸。优选的荧光增白剂为可从Ciba-Geigy AG,Basel,Switzerland获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。TinopalDMS是4,4′-二-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋二磺酸的二钠盐，Tinopal CBS是2,2′-二-(苯基-苯乙烯基)二磺酸的二钠盐。

亦优选的荧光增白剂是商业上可获得的Parawhite KX，由ParamountMinerals and Chemicals,Mumbai,India供应。其它适用于本发明的荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷基氨基香豆素。

合适的荧光增亮剂水平包括约0.01，0.05，约0.1或甚至约0.2wt%的低水平至0.5或甚至0.75wt%的高水平。

织物色调剂-本发明的去污剂组合物亦可包含织物色调剂如染料或颜料，其当配制于去污剂组合物中时，当将所述织物与包含所述去污剂组合物的洗液相接触时，可沉积于织物上，从而通过吸收可见光改变所述织物的色泽。荧光增白剂发射至少一些可见光。与之相对，织物色调剂改变表面的色泽，因为它们吸收至少可见光谱的至少一部分。合适的织物色调剂包括染料和染料-黏土缀合物，且亦可包含颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料：属于Colour Index(C.I.)分类为直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红的染料，或其混合物，例如如WO 2005/03274，WO 2005/03275，WO 2005/03276和EP 1 876 226中所述。所述去污剂组合物优选包含约0.00003wt%至约0.2wt%，约0.00008wt%至约0.05wt%，或甚至0.0001wt%至约0.04wt%的织物色调剂。所述组合物可包含0.0001wt%至0.2wt%的织物色调剂，这当所述组合物为单位剂量袋形式时，可为特别优选的。

污物释放聚合物-本发明的去污剂组合物亦可包含一种或多种污物释放聚合物，其协助污物从织物如棉和基于聚酯的织物的去除，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污物。所述污物释放聚合物可例如为非离子型或阴离子型的基于对苯二甲酸的聚合物，聚乙烯己内酰胺和相关的共聚物，乙烯基接枝共聚物，聚酯聚酰胺，参见，例如Powdered Detergents,Surfactant scienceseries volume 71,Marcel Dekker,Inc.中的第7章。另一种类型的污物释放聚合物是两亲性烷氧基化的油脂清洁聚合物，其包含核心结构和多个附于该核心结构的烷氧化物基团。所述核心结构可包含聚亚烷亚胺(polyalkylenimine)或聚烷醇胺(polyalkanolamine)结构，如WO 2009/087523中详述。此外，随机接枝共聚物是合适的污物释放聚合物。合适的接枝共聚物更加详细地描述于WO2007/138054，WO 2006/108856和WO 2006/113314。其它污物释放聚合物是取代的多糖结构，特别是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如描述于EP 1 867 808或WO 2003/040279的那些。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺，及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素，非离子修饰的纤维素，阳离子修饰的纤维素，两亲离子修饰的纤维素，及其混合物。合适的纤维素结合包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，乙基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羧甲基纤维素酯(ester carboxy methyl cellulose)，及其混合物。

抗再沉积剂-本发明的去污剂组合物亦可包含一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)，丙烯酸的均聚物，丙烯酸和马来酸的共聚物，和乙氧化的聚乙烯亚胺。在上文污物释放聚合物部分描述的基于纤维素的聚合物亦可作为抗再沉积剂起作用。

其它合适的辅助材料包括但不限于抗缩剂(anti-shrink agent)，抗皱剂(anti-wrinkling agent)，杀细菌剂，粘合剂，载体，染料，酶稳定化剂，织物柔顺剂(fabric softener)，填充剂，泡沫调节剂(foam regulator)，水溶增溶剂(hydrotrope)，香味料(perfume)，颜料，消泡剂(sod suppressor)，溶剂，对于液体去污剂的结构剂(structurant)，和/或结构弹性剂(structure elasticizing agent)。

在一个方面，所述去污剂是紧凑的液体洗衣去污剂组合物，其包含：a)按组合物重量计至少约10%，优选20至80%的表面活性剂，其选自阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，皂类，及其混合物；b)按组合物重量计约1%至约30%，优选5至30%的水；c)按组合物重量计约1%至约15%，优选3至10%的非氨基官能团溶剂(non-aminofunctional solvent)；和d)按组合物重量计约5%至约20%的性能添加剂，其选自螯合剂，污物释放聚合物，酶，及其混合物，其中所述紧凑的液体洗衣去污剂组合物包含下述至少之一：

(i)所述表面活性剂具有阴离子型表面活性剂对非离子型表面活性剂约1.5:1至约5:1的重量比，所述表面活性剂包含按组合物重量计约15%至约40%的阴离子表面活性剂，且包含按组合物重量计约5%至约40%的皂类；(ii)按组合物重量计约0.1%至约10%的增泡剂(suds boosting agent)，其选自增泡聚合物(suds boosting polymer)，阳离子型表面活性剂，两性离子型表面活性剂，胺氧化物表面活性剂，两亲性表面活性剂，及其混合物，和(ii)(i)和(ii)两者。所有成分描述于WO 2007/130562。其它可用于去污剂配制剂的聚合物描述于WO 2007/149806。

在一个方面，所述去污剂是紧凑的颗粒(粉末)去污剂，其包含a)按组合物重量计至少约10%，优选15至60%的的表面活性剂，其选自阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，皂类，及其混合物；按组合物重量计约10至80%的助洗剂，优选20%至60%，其中所述助洗剂是选自下组的助洗剂的混合物：i)磷酸盐助洗剂，优选少于20%，更优选少于10%，甚至更优选少于5%的总助洗剂是磷酸盐助洗剂；ii)沸石助洗剂，优选少于20%，更优选少于10%，甚至更优选少于5%的总助洗剂是沸石助洗剂；iii)柠檬酸盐，优选0至5%的总助洗剂是柠檬酸盐助洗剂；iv)聚羧酸盐，优选0至5%的总助洗剂是聚羧酸盐助洗剂；v)碳酸盐，优选0至30%的总助洗剂是碳酸盐助洗剂，和vi)硅酸钠，优选0至20%的总助洗剂是硅酸钠助洗剂；c)按组合物重量计约0%至25%的填充剂，如硫酸盐，优选按组合物重量计优选1%至15%，更优选按组合物重量计2%至10%，更优选3%至5%的填充剂；和d)按组合物重量计约0.1%至20%的酶，优选按组合物重量计1%至15%，更优选2%至10%的酶。

M7和M35金属蛋白酶在去污剂中的用途

对于去污剂配制者重要的污物和污渍包含许多不同的物质，且已开发了多种不同的酶(均具有不同的底物特异性)以供用于涉及洗衣和硬表面清洁如洗碟的去污剂。认为这些酶提供了酶去污性效益，因为与不含所述酶的相同工艺相比，它们特异地改善了在施用它们的清洁工艺中的污渍去除。在本领域已知的污渍去除酶包括酶如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶和果胶酶。

在一个方面，本发明涉及M7和M35金属蛋白酶在去污剂组合物和清洁工艺如洗衣和硬表面清洁中的用途。因此，在一个方面，本发明说明了多种示例性M7和M35金属蛋白酶对于多种污渍和在多种条件下的去污作用。在本发明的一个具体方面，所述去污剂组合物和在清洁工艺中的用途涉及将M7和M35金属蛋白酶与至少一种上述提及的污渍去除酶如另一种蛋白酶且特别是丝氨酸蛋白酶一同使用。

在本发明的一个优选的方面，根据本发明可用的M7和M35金属蛋白酶可与至少两种酶组合。这些其它酶在“其它酶”部分详细描述，更优选至少三种、四种或五种酶。优选地，所述酶具有不同的底物特异性，例如糖分解活性(carbolytic activity)、蛋白水解活性、淀粉分解活性、脂肪分解活性、半纤维素分解活性或果胶分解活性。所述酶组合物可例如为M7或M35金属蛋白酶与另一种污渍去除酶，例如M7或M35金属蛋白酶和蛋白酶，M7或M35金属蛋白酶和淀粉酶，M7或M35金属蛋白酶和纤维素酶，M7或M35金属蛋白酶和半纤维素酶，M7或M35金属蛋白酶和脂肪酶，M7或M35金属蛋白酶和角质酶，M7或M35金属蛋白酶和果胶酶或M7或M35金属蛋白酶和抗再沉积酶。更优选地，将所述M7或M35金属蛋白酶与至少两种其它污渍去除酶组合，例如M7或M35金属蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和淀粉酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和脂肪酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和半纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶和半纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，脂肪酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，脂肪酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，脂肪酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，脂肪酶和半纤维素酶。甚至更优选地，可将M7或M35金属蛋白酶与至少三种其它污渍去除酶组合，例如M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，淀粉酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，淀粉酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，淀粉酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，淀粉酶和半纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶和半纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，脂肪酶和果胶酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，脂肪酶和角质酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，脂肪酶和纤维素酶；或M7或M35金属蛋白酶，蛋白酶，脂肪酶和半纤维素酶。根据本发明可用的M7或M35金属蛋白酶可与任何选自下组(非穷尽的)的酶组合：糖酶如淀粉酶，半纤维素酶，果胶酶，纤维素酶，黄素酶(xanthanase)或普鲁兰酶(pullulanase)，肽酶，蛋白酶或脂肪酶。

在一个优选实施方案中，将M7或M35金属蛋白酶与丝氨酸蛋白酶例如S8家族蛋白酶如Savinase组合。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明可用的M7或M35金属蛋白酶可与一种或多种其它金属蛋白酶如M4金属蛋白酶包括Neutrase^TM或Thermolysin组合。此类组合可进一步包含上文概述的其它去污剂酶的组合。

所述清洁工艺或纺织品护理工艺可例如为洗衣工艺、洗碟工艺，或硬表面如浴室瓷砖、地板、桌面、水槽、地漏和浴盆的清洁。洗衣工艺可例如为家用洗衣，但其亦可为工业洗衣。此外，本发明涉及用于洗涤织物和/或衣物的工艺，其中所述工艺包括用含有去污剂组合物和至少一种嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶的洗涤溶液处理织物。所述清洁工艺或纺织品护理工艺可例如在机洗工艺或在手洗工艺中进行。所述洗涤溶液可例如为含有去污剂组合物的水性洗涤溶液。

进行本发明的洗涤、清洗或纺织品护理工艺的织物和/或衣物可为常规的可洗涤的待洗衣物，例如家用待洗衣物。优选地，待洗衣物的主要部分为衣物和织物，包括针织、机织、粗斜棉布、无纺、毯、纱线和毛巾料。所述织物可为基于纤维素的，如天然纤维素，包括棉、亚麻(flax)、亚麻布(linen)、黄麻、苎麻、剑麻或椰子壳纤维，或者人造纤维素(例如来源于木浆)包括纤维胶/人造丝、苎麻、纤维素醋酸纤维(tricell)，lyocell，或其混纺物。所述织物亦可基于非纤维素如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛(camel)、羊绒(cashmere)、马海毛(mohair)、兔毛(rabit)和丝，或合成聚合物如尼龙、芳香聚酰胺(aramid)、聚酯、丙烯酸(arylic)、聚丙烯和斯潘德克斯(spandex)/elastane，或其混纺物，以及基于纤维素和基于非纤维素的纤维的混纺物。混纺物的实例是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或多种相伴材料(companion material)如羊毛、人造纤维(例如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳香聚酰胺纤维)和含纤维素纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻、亚麻布、黄麻、纤维素醋酸纤维、lyocell)的混纺物。

过去数年来，人们对于用可再生的生物组分(如酶和多肽)替换去污剂中来源于石油化学品的组分，而又不削弱洗涤性能的兴趣日增。当去污剂组合物的成分改变时，需要新的酶活性或新的酶，这样的新的酶活性或新的酶与常用的去污剂酶如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶相比具有可替代的和/或改善的性质，以取得与传统的去污剂组合物相比类似的或改善的洗涤性能。

本发明进一步涉及M7或M35金属蛋白酶在蛋白性污渍去除工艺中的用途。所述蛋白性污渍可为污渍如食物污渍，例如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、乳、墨水、草，或其组合。

通常的去污剂组合物除了酶之外还包含多种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分，如表面活性剂，降低去污剂中的表面张力，这允许提升起(lift)待清洗的污渍，并加以分散然后洗去，其它组分，如漂白系统，去除通常由氧化造成的变色，且许多漂白剂亦具有强烈的杀细菌性质，并用于消毒和灭菌。还有其它组分，如助洗剂和螯合剂，通过从液体去除金属离子而软化例如洗涤水。

在一个具体实施方案中，本发明涉及包含M7或M35金属蛋白酶的组合物在洗衣或洗碟中的用途，其中所述酶组合物进一步包含下述至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统或漂白组分。

在本发明的一个优选实施方案中，与不添加M7或M35金属蛋白酶时使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比，减少了表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统和/或漂白组分的量。优选地，表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统和/或漂白组分中至少一种组分以与不添加M7或M35金属蛋白酶的系统中该组分的量，例如此种组分的常规量相比，以1%更少，如2%更少，如3%更少，如4%更少，如5%更少，如6%更少，如7%更少，如8%更少，如9%更少，如10%更少，如15%更少，如20%更少，如25%更少，如30%更少，如35%更少，如40%更少，如45%更少，如50%更少的量存在。在一个方面，将M7或M35金属蛋白酶用于去污剂组合物，其中所述组合物不含表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统或漂白组分、和/或聚合物中的至少一种组分。

洗涤方法

本发明的去污剂组合物理想地适用于洗衣用途。相应地，本发明包括用于洗涤织物的方法。所述方法包括将待洗涤的织物与包含根据本发明的去污剂组合物的清洁洗衣溶液相接触的步骤。所述织物可包含任何能够在正常消费者使用条件下进行洗涤的织物。所述溶液优选具有约5.5至约8的pH。所述组合物可在溶液中以约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm的浓度使用。水温度通常范围为约5℃至约90℃，包括约10℃，约15℃，约20℃，约25℃，约30℃，约35℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，约80℃，约85℃至约90℃。水对织物的比例通常为约1:1至约30:1。

在具体实施方案中，所述洗涤方法在约5.0至约11.5的pH进行，或在另一个实施方案中，在甚至约6至约10.5，如约5至约11，约5至约10，约5至约9，约5至约8，约5至约7，约5.5至约11，约5.5至约10，约5.5至约9，约5.5至约8，约5.5.至约7，约6至约11，约6至约10，约6至约9，约6至to约8，约6至约7，约6.5至约11，约6.5至约10，约6.5至约9，约6.5至约8，约6.5至约7，约7至约11，约7至约10，约7至约9，或约7至约8，优选约5.5至约9，和更优选约6至约8的pH进行。

在具体实施方案中，所述洗涤方法在约0°dH至约30°dH，如约1°dH，约2°dH，约3°dH，约4°dH，约5°dH，约6°dH，约7°dH，约8°dH，约9°dH，约10°dH，约11°dH，约12°dH，约13°dH，约14°dH，约15°dH，约16°dH，约17°dH，约18°dH，约19°dH，约20°dH，约21°dH，约22°dH，约23°dH，约24°dH，约25°dH，约26°dH，约27°dH，约28°dH，约29°dH，约30°dH的硬度进行。在通常的欧洲洗涤条件下，硬度为约15°dH，在通常的美国洗涤条件下为约6°dH，而在通常的亚洲洗涤条件下为约3°dH。

本发明涉及用包含M7或M35金属蛋白酶的去污剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。

一个优选实施方案涉及清洁的方法，所述方法包括下述步骤：将物体与包含M7或M35金属蛋白酶的清洁组合物在适于清洁所述物体的条件下接触。在一个优选实施方案中，所述清洁组合物是去污剂组合物，且所述工艺是洗衣或洗碟工艺。

仍旧另一个实施方案涉及用于从织物去除污渍的方法，其包括将所述织物与包含M7或M35金属蛋白酶的组合物在适于清洁所述物体的条件下相接触。

在一个优选实施方案中，供用于上述方法的组合物进一步包含一种如列于上述“其它酶”部分中的其它酶，如选自下组的酶：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶或角质酶，或其组合。还在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含减少量的至少一种或多种下述组分：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白系统或漂白组分、或聚合物。

亦涵盖的是使用一种或多种本发明的金属蛋白酶处理织物(例如对纺织品退浆)的方法。所述金属蛋白酶可用于任何本领域中公知的织物处理方法(参见，例如美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，通过包括将织物与金属蛋白酶在溶液中相接触的方法来改善织物的触感和外观。在一个方面，在压力下用所述溶液处理织物。

在一个方面，所述金属蛋白酶在纺织品机织过程中或之后，或在退浆阶段中，或一个或多个其它织物处理步骤中施用。在纺织品机织过程中，纺线暴露于相当大的机械应力。在机械织机上机织之前，通常将经纱用上浆淀粉或淀粉衍生物包被以增加其拉伸强度和防止断裂。可施用金属蛋白酶以去除这些上浆蛋白或蛋白衍生物。在纺织品机织完成之后，可将织物进行至退浆阶段。退浆是从纺织品去除上浆物(size)的过程。在机织之后，上浆包被可在进一步加工织物之前去除以确保均质和不受洗涤影响的结果。还提供了一种退浆的方法，其包括通过酶作用来酶促水解上浆物。

低温用途

如前所述，M7和M35金属蛋白酶是金属蛋白酶。其它金属蛋白酶如M4金属蛋白酶，亦称作嗜热菌蛋白酶家族，因为称作“嗜热菌蛋白酶”的M4金属蛋白酶是首先表征的M4金属蛋白酶，且亦为表征最充分的一个。嗜热菌蛋白酶以其高温性能为人所知。高温性能在例如频繁使用嗜热菌蛋白酶的蛋白合成的工艺中是优选的。因此，因为高温性能在这些工艺中是有利的，所以已经制成了几种嗜热菌蛋白酶的变体。

因此，令人意想不到的是，其它金属蛋白酶，即当如下述实施例中所述在AMSA中测试时，根据本发明可用的M7和M35金属蛋白酶实际上在低温，例如约40℃或更低的温度，与在较高温度例如60℃或更高相比，性能相对较佳。

而且，在一个具体优选的实施方案中，当如本文中所述在AMSA中测试时，M7和M35金属蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶如Savinase相比，在约40℃或更低的洗涤温度性能相对较佳。

因此，本发明的一个实施方案涉及进行洗衣、洗碟或工业清洁的方法，其包括将待清洁的表面与M7和M35金属蛋白酶相接触，且其中所述洗衣、洗碟、工业或公共清洁在约40℃或更低的温度进行。本发明的一个实施方案涉及金属蛋白酶在洗衣、洗碟或清洁工艺中的用途，其中洗衣、洗碟、工业清洁中的温度为约40℃或更低。

在另一个实施方案中，本发明涉及金属蛋白酶在蛋白去除工艺中的用途，其中蛋白去除工艺中的温度为约40℃或更低。

本发明亦涉及与丝氨酸蛋白酶或与Savinase相比具有至少一个改善的性质的M7和M35金属蛋白酶在洗衣、洗碟或工业清洗工艺中的用途，且其中洗衣、洗碟或清洗工艺中的温度是在40℃或更低的温度进行的。

在每个上述鉴定的方法和用途中，洗涤温度为约40℃或更低，如约39℃或更低，如约38℃或更低，如约37℃或更低，如约36℃或更低，如约35℃或更低，如约34℃或更低，如约33℃或更低，如约32℃或更低，如约31℃或更低，如约30℃或更低，如约29℃或更低，如约28℃或更低，如约27℃或更低，如约26℃或更低，如约25℃或更低，如约24℃或更低，如约23℃或更低，如约22℃或更低，如约21℃或更低，如约20℃或更低，如约19℃或更低，如约18℃或更低，如约17℃或更低，如约16℃或更低，如约15℃或更低，如约14℃或更低，如约13℃或更低，如约12℃或更低，如约11℃或更低，如约10℃或更低，如约9℃或更低，如约8℃或更低，如约7℃或更低，如约6℃或更低，如约5℃或更低，如约4℃或更低，如约3℃或更低，如约2℃或更低，如约1℃或更低。

在另一个优选实施方案中，洗涤温度是约5-40℃，如约5-30℃，约5-20℃，约5-10℃，约10-40℃，约10-30℃，约10-20℃，约15-40℃，约15-30℃，约15-20℃，约20-40℃，约20-30℃，约25-40℃，约25-30℃，或约30-40℃的范围。在一个具体的优选实施方案中，洗涤温度为约30℃。

在具体实施方案中，所述低温洗涤方法在约5.0至约11.5的pH进行，或在其它实施方案中，甚至在约6至约10.5，如约5至约11，约5至约10，约5至约9，约5至约8，约5至约7，约5.5至约11，约5.5至约10，约5.5至约9，约5.5至约8，约5.5.至约7，约6至约11，约6至约10，约6至约9，约6至to约8，约6至约7，约6.5至约11，约6.5至约10，约6.5至约9，约6.5至约8，约6.5至约7，约7至约11，约7至约10，约7至约9，或约7至约8，优选约5.5至约9，和更优选约6至约8的pH进行。

在具体实施方案中，所述低温洗涤方法在约0°dH至约30°dH，如约1°dH，约2°dH，约3°dH，约4°dH，约5°dH，约6°dH，约7°dH，约8°dH，约9°dH，约10°dH，约11°dH，约12°dH，约13°dH，约14°dH，约15°dH，约16°dH，约17°dH，约18°dH，约19°dH，约20°dH，约21°dH，约22°dH，约23°dH，约24°dH，约25°dH，约26°dH，约27°dH，约28°dH，约29°dH，约30°dH的硬度进行。在通常的欧洲洗涤条件下，硬度为约15°dH，在通常的美国洗涤条件下为约6°dH，而在通常的亚洲洗涤条件下为约3°dH。

在去除蛋渍中的用途

本发明的另一个具体实施方案涉及去除蛋渍。这些类型的污渍通常非常难以完全去除。蛋渍通常在硬表面清洁如洗碟中是成问题的，其中污渍通常在洗涤之后残留在碟和刀叉上。M7和M35金属蛋白酶特别适于去除蛋渍。

因此，本发明进一步涉及用于从纺织品、织物和/或硬表面如碟和刀叉，特别是从织物和纺织品去除蛋渍的方法。本发明的一个优选的方面涉及从纺织品和/或织物去除蛋渍的方法，包括使需要去除蛋渍的表面与M7或M35金属蛋白酶相接触。在一个实施方案中，本发明包括从纺织品和/或织物去除蛋渍的方法，其包括使需要去除蛋渍的表面与包含M7或M35金属蛋白酶的去污剂组合物相接触。本发明亦涉及去除蛋渍的方法，其包括将M7或M35金属蛋白酶添加至待洗衣物和/或涉及洗涤工艺，其中所述纺织品和/或织物包含多种蛋渍。

本发明的一个实施方案涉及用于从硬表面或从待洗衣物去除蛋渍的方法，所述方法包括将含蛋渍的硬表面或含蛋渍的待洗衣物与含有M7或M35金属蛋白酶的清洁或去污剂组合物，优选洗衣或洗碟组合物相接触。

另一个实施方案涉及用于从织物或纺织品去除蛋渍的方法，其包括将所述织物或纺织品与包含M7或M35金属蛋白酶的清洁或去污剂组合物，优选洗衣或洗碟组合物相接触。

又一个实施方案涉及用于从织物或纺织品去除蛋渍的方法，其包括将所述织物或纺织品与包含M7或M35金属蛋白酶的组合物相接触，其中所述组合物进一步包含至少一种如上文“其它酶”部分列出的其它酶，如选自下组的酶：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、角质酶，或其组合。

在具体实施方案中，所述蛋去除方法在约5.0至约11.5的pH进行，或在其它实施方案中，甚至在约6至约10.5，如约5至约11，约5至约10，约5至约9，约5至约8，约5至约7，约5.5至约11，约5.5至约10，约5.5至约9，约5.5至约8，约5.5.至约7，约6至约11，约6至约10，约6至约9，约6至to约8，约6至约7，约6.5至约11，约6.5至约10，约6.5至约9，约6.5至约8，约6.5至约7，约7至约11，约7至约10，约7至约9，或约7至约8，优选约5.5至约9，更优选约6至约8的pH进行。

在具体实施方案中，所述蛋去除方法在约0°dH至约30°dH，如约1°dH，约2°dH，约3°dH，约4°dH，约5°dH，约6°dH，约7°dH，约8°dH，约9°dH，约10°dH，约11°dH，约12°dH，约13°dH，约14°dH，约15°dH，约16°dH，约17°dH，约18°dH，约19°dH，约20°dH，约21°dH，约22°dH，约23°dH，约24°dH，约25°dH，约26°dH，约27°dH，约28°dH，约29°dH，约30°dH的硬度进行。在通常的欧洲洗涤条件下，硬度为约15°dH，在通常的美国洗涤条件下为约6°dH，而在通常的亚洲洗涤条件下为约3°dH。

所有本文中引用的文件通过全文提述并入本文。

本发明通过下述实施例来进一步描述，其不应视为限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

纯化活性测定

Protazyme AK纯化活性测定：

底物：        Protazyme AK片(AZCL-酪蛋白，Megazyme T-PRAK1000)。

温度：        37℃

测定缓冲液：  50mM HEPES/NaOH，pH7.0。

将一片Protazyme AK通过轻柔地搅拌悬于2.0ml0.01%Triton X-100。将500μl的该悬液和500μl测定缓冲液分加到一个Eppendorf管中，并置于冰上。将20μl蛋白酶样品(稀释于0.01%Triton X-100)添加到该冰冷的管中。通过将Eppendorf管转移至设定至测定温度的Eppendorf热混合器来起始测定。将管在Eppendorf热混合器上以其最高振荡速率(1400rpm)温育15分钟。通过将管转移回冰浴来中止温育。然后将管在冰冷的离心机中离心数分钟，并将200μl上清转移至微滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。将缓冲液盲样(buffer blind)包括在测定中(替代酶)。

Protazyme OL纯化活性测定：

底物：        Protazyme OL片(AZCL-胶原，Megazyme T-PROL 1000)。

温度：        37℃

测定缓冲液：  50mM CH₃COOH/NaOH，pH 5.0。

将一片Protazyme OL片通过轻柔地搅拌悬于2.0ml0.01%Triton X-100。将500μl的该悬液和500μl测定缓冲液分加到一个Eppendorf管中，并置于冰上。将20μl蛋白酶样品(稀释于0.01%Triton X-100)添加在冰冷的管中。通过将Eppendorf管转移至设定至测定温度的Eppendorf热混合器来起始测定。将管在Eppendorf热混合器上以其最高振荡速率(1400rpm)温育15分钟。通过将管转移回冰浴来中止温育。然后将管在冰冷的离心机中离心数分钟，并将200μl上清转移至微滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。将缓冲液盲样(buffer blind)包括在测定中(替代酶)。

表征活性测定

Protazyme OL表征测定：

底物：        Protazyme OL片(AZCL-胶原，Megazyme T-PROL 1000)。

温度：        受控的(测定温度)。

测定缓冲液：  100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01%Triton X-100用HCl或NaOH调整至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。

将Protazyme OL片通过轻柔地搅拌悬于2.0ml0.01%Triton X-100。将500μl的该悬液和500μl测定缓冲液分加到一个Eppendorf管中，并置于冰上。将20μl蛋白酶样品(稀释于0.01%Triton X-100)添加在冰冷的管中。通过将Eppendorf管转移至设定至测定温度的Eppendorf热混合器来起始测定。将管在Eppendorf热混合器上以其最高振荡速率(1400rpm)温育15分钟。通过将管转移回冰浴来中止温育。然后将管在冰冷的离心机中离心数分钟，并将200μl上清转移至微滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。将缓冲液盲样(buffer blind)包括在测定中(替代酶)。

用于洗衣的自动机械应力测定(Automatic Mechanical Stress Assay, AMSA)

为了评价在洗衣中洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行了洗涤实验。使用AMSA测试可检查大数量的小体积酶-去污剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有多个用于测试溶液的槽，和一个将洗碟样品、待洗涤的纺织品紧压至所有槽的开口的盖。在洗涤时，将平板、测试溶液、纺织品和盖激烈振荡以使得测试溶液与纺织品相接触，并以规则的、周期振荡的方式施加机械应力。进一步描述可参见WO 02/42740，特别是第23-24页的段落“Specialmethod embodiments”。

洗衣实验在如下特定的实验条件下进行：

模式去污剂和测试材料如下所述：

所有测试材料从EMPA Testmaterials AG 

12，CH-9015St.Gallen，Switzerland从Center For Testmaterials BV，P.O.Box120，3133 KTVlaardingen，the Netherlands，和WFK Testgewebe GmbH，Christenfeld10，D-41379Brüggen，Germany获得。

通过将CaCl₂，MgCl₂，和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:NaHCO₃=4:1:7.5)添加到测试系统调整水硬度至15°dH。在洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗并干燥。

洗涤性能作为洗涤的纺织品颜色的亮度来测量。亮度亦可表示为当用白光照射时从样品反射的光的强度。当样片沾污时，反射光的强度低于干净样品。换言之，更干净的样品会反射更多的光并会具有更高的强度。因此，反射光的强度可用于量度洗涤性能。

颜色测量用专用平台式扫描仪进行(Kodak iQsmart,Kodak,Midtager 29,DK-2605

Denmark)，其用于捕获经洗涤的纺织品的图像。

为了从扫描的图像提取光强度的值，将来自图像的24比特像素值换算为红、绿和蓝的值(RGB)。强度值(Int)通过将RGB值作为矢量加合，然后取所得矢量的长度来计算：

$\ln t=\sqrt{r^2+g^2+b^2}$

实施例1

来自紫红链霉菌的snapalysin蛋白酶Sv1，来自灰色链霉菌的Sg1，来自 Kribbella flavida的Kf1和来自Janibacter sp.NN015841的J1的纯化

将这些snapalysin在枯草芽孢杆菌中表达。

将培养液离心(20000x g，20min)，并将上清小心地从沉淀倾出。将上清通过Nalgene 0.2μm过滤单元过滤以去除剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将固体硫酸钠添加至0.2μ滤过物至0.6M的终(NH₄)₂SO₄浓度。由于硫酸钠的添加，酶溶液变得略微浑浊，因此通过另一个Nalgene0.2μm过滤单元过滤而加以澄清。将滤过物施加到在100mM H₃BO₃，10mM MES，2mM CaCl₂，0.6M(NH₄)₂SO₄，pH6中平衡的苯基sepharose FF(高取代型)柱(来自GEHealthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，将snapalysin蛋白酶用平衡缓冲液和含25%(v/v)2-丙醇的100mM H₃BO₃，10mM MES，2mM CaCl₂，pH6的线性梯度以两个柱体积洗脱。对来自柱的级分分析蛋白酶活性(ProtazymeAK纯化活性测定)。汇集具有活性的级分，并转移至100mM H₃BO₃，10mMMES，2mM CaCl₂，100mM NaCl，pH6的G25sephadex柱(来自GE Healthcare)上。将G25sephadex转移的酶施于在100mM H₃BO₃，10mM MES，2mM CaCl₂，pH6中平衡的Bacitracin琼脂糖柱(来自Upfront chromatography)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，用含25%(v/v)2-丙醇的100mM H₃BO₃，10mM MES，2mM CaCl₂，1M NaCl，pH6洗脱snapalysin蛋白酶。对来自柱的级分分析蛋白酶活性(Protazyme AK纯化活性测定)，并进一步通过SDS-PAGE分析活性级分。当考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅见一个条带时，将级分汇集并转移至G25sephadex柱上的20mM HEPES/NaOH，500mM NaCl，pH7作为纯化的制备物，并将其用于进一步表征。

实施例2

来自米曲霉的deuterolysin蛋白酶Ao1的纯化

将deuterolysin蛋白酶在米曲霉中表达。

将培养液离心(20000xg，20min)，并将上清小心地从沉淀倾出。将上清通过Nalgene 0.2μm过滤单元过滤以去除剩余的曲霉宿主细胞。将0.2μm滤过物转移至G25 sephadex柱(来自GE Healthcare)上的100mM H₃BO₃，10mM二甲基戊二酸，2mM CaCl₂，pH 7。将G25 sephadex转移的酶施于在100mMH₃BO₃，10mM二甲基戊二酸，2mM CaCl₂，pH7中平衡的Q-sepharose FF柱(来自GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，将deuterolysin蛋白酶用相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0至500mM)在5个柱体积洗脱。对来自该柱的级分分析蛋白酶活性((Protazyme OL纯化活性测定)并汇集活性级分。将固体(NH₄)₂SO₄添加至Q-sepharose汇集物至2M终浓度，然后将经过盐调整的溶液施于在20mM Tris/CH₃COOH，2mM CaCl₂，2M(NH₄)₂SO₄，pH 7.0中平衡的苯基-sepharose FF(高取代型)柱(来自GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，将deuterolysin蛋白酶用相同缓冲液中的线性减少(NH₄)₂SO₄梯度(2M至0mM)以5个柱体积洗脱。对来自柱的级分分析蛋白酶活性(Protazyme OL纯化活性测定)，并通过SDS-PAGE进一步分析活性级分。当考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅见一个条带时，将级分汇集并转移至G25 sephadex柱上的10mM Tris/CH₃COOH，1mM CaCl₂，pH 7.5作为纯化的制备物，并将其用于进一步表征。

实施例3

来自桔橙嗜热子囊菌的deuterolysin蛋白酶Ta1的纯化

将deuterolysin蛋白酶在米曲霉中表达。

将培养液离心(20000xg，20min)，并将上清小心地从沉淀倾出。将上清通过Nalgene 0.2μm过滤单元过滤以去除剩余的曲霉属宿主细胞。将0.2μm滤过物转移至G25 sephadex柱(来自GE Healthcare)上的50mM H₃BO₃，5mM二甲基戊二酸，1mM CaCl₂，pH 7。将G25 sephadex转移的酶施于在50mMH₃BO₃，5mM二甲基戊二酸，1mM CaCl₂，pH 7中平衡的Bacitracin琼脂糖柱(来自Upfront chromatography)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，将deuterolysin蛋白酶用含25%(v/v)2-丙醇的100mM H₃BO₃，10mM MES，2mMCaCl₂，1M NaCl，pH 6洗脱。对来自该柱的级分分析蛋白酶活性((ProtazymeOL纯化活性测定)并将活性级分转移至G25 sephadex柱(来自GE Healthcare)上的50mM H₃BO₃，5mM二甲基戊二酸，1mM CaCl₂，pH 7。将pH调整的酶溶液施于在50mM H₃BO₃，5mM二甲基戊二酸，1mM CaCl₂，pH 4.5中平衡的SP-sepharose HP柱(来自GE Healthcare)。在用平衡缓冲液彻底洗涤柱之后，将deuterolysin蛋白酶用相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0至500mM)在5个柱体积上洗脱。对来自柱的级分分析蛋白酶活性(Protazyme OL纯化活性测定)，并通过SDS-PAGE进一步分析活性级分。当仅一个条带见于考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上时，将级分汇集并用3%NaOH将pH调整至pH 7.0。将pH调整的汇集物作为纯化的制备物，并将其用于进一步表征。

实施例4

snapalysin Sv1，Sg1，Kf1，J1的表征：pH活性，pH稳定性和温度稳定 性

将Protazyme OL表征测定用于获得在37℃的pH活性概貌，pH稳定性概貌(在所示pH值2小时之后的剩余活性)和在pH7.0的温度活性概貌。对于pH稳定性概貌，将蛋白酶在不同表征测定缓冲液中稀释至少8x，并在37℃温育2小时。在温育之后，将蛋白酶温育物的pH转移至pH7，然后通过在pH 7测定缓冲液中稀释来测定剩余活性。结果示于下表。对于表3，所述活性为相对于酶的最适pH的相对值。对于表4，所述活性为相对于维持在稳定条件(5℃，pH 7)的样品的剩余活性的相对值。对于表5，所述活性为相对于在pH 7的最适温度的相对值。

表3：在37℃的pH活性概貌

pH	Sv1	Sg1	Kf1	J1
					2	0.00	0.02	0.00	0.00
3	0.00	0.00	0.00	0.00
					4	0.00	0.02	0.00	0.00
5	0.12	0.12	0.11	0.15
					6	0.55	0.36	0.30	0.59
7	0.95	0.58	0.38	0.69
					8	1.00	0.78	0.54	0.84
9	0.78	1.00	0.93	1.00
					10	0.54	0.81	1.00	0.60
11	0.10	0.18	0.12	0.06

表4：pH稳定性概貌(在37℃进行2小时之后的剩余活性)

表5：在pH 7.0的温度活性概貌

deuterolysin Ao1和Ta1的表征：pH活性，pH稳定性和温度活性

将Protazyme OL表征测定用于获得在37℃的pH活性概貌，pH稳定性概貌(在所示pH值2小时之后的剩余活性)和在最适pH的温度活性概貌。对于pH稳定性概貌，将蛋白酶在不同表征测定缓冲液中稀释8x，并在37℃温育2小时。在温育之后，通过在最适pH测定缓冲液中稀释来将蛋白酶温育物的pH转移至蛋白酶的最适pH，然后测定剩余活性。结果示于下表。对于表6，所述活性为相对于酶的最适pH。对于表7，所述活性为相对于维持在稳定条件(对于米曲霉酶为5℃，pH 7，对于桔橙嗜热子囊菌酶为5℃，pH 4.5)的样品的剩余活性的相对值。对于表8，所述活性为相对于在酶的最适pH的最适活性的相对值。

表6：在37℃的pH活性概貌

pH	Ao1	Ta1
			2	0.00	0.00
3	0.06	0.03
			4	1.00	0.46
5	0.56	1.00
			6	0.08	0.56
7	0.01	0.32
			8	0.00	0.29

表7：pH稳定性概貌(在37℃进行2小时之后的剩余活性)

表8：在最适pH的温度活性概貌

其它特征

deuterolysin蛋白酶受1,10-菲咯啉抑制。snapalysin蛋白酶受EDTA和1,10-菲咯啉抑制。

实施例5：去污性的评估

在多个温度的示例性M7和M35金属蛋白酶

在如上所述的AMSA中在30nM蛋白酶浓度对不同污渍和温度调查Sv1，Kf1，J1，Sg1和Ta1蛋白酶的去污性。在所有情况下，将液体去污剂调整至pH 7。表格显示使用洗衣液模式去污剂(表9-10)和洗衣粉模式去污剂(表11-12)系统确定的相对于不含蛋白酶的去污剂的强度值。

表9：在洗衣液模式去污剂中测定的示例性M7和M35金属蛋白酶对不 含蛋白酶的去污剂的强度值

M7或M35金属蛋白酶

EMPA112

PC-05

C-10

	(60℃)	(30℃)	(40℃)
				Sv1	6	18	4
Ta1	6	11	2

表10：在洗衣液模式去污剂中测定的示例性M7和M35金属蛋白酶对不 含蛋白酶的去污剂的强度值

表11：在洗衣粉模式去污剂中测定的示例性M7和M35金属蛋白酶对不 含蛋白酶的去污剂的强度值

表12：在洗衣粉模式去污剂中测定的示例性M7和M35金属蛋白酶对不 含蛋白酶的去污剂的强度值

根据上表9-12，显然可见M7和M35金属蛋白酶与不存在蛋白酶时相比，增加了去污性。

实施例6：

示例性M7金属蛋白酶的低温性能的评估

调查M7金属蛋白酶Sv1，Kf1，J1和Sg1在如上所述的AMSA中30nM的蛋白酶浓度下相对于Savinase的低温性能。洗涤性能在洗衣液模式去污剂(表13-14)和洗衣粉模式去污剂(表15-16)中进行调查。在EMPA112和C-10的情况下，将液体去污剂调整至pH 7；在PC-05的情况下调整至pH 6。表格显示金属蛋白酶相对于Savinase的洗涤性能在20℃或15℃，与在60℃相比的改善的系数(系数越高表明在较低温度的洗涤性能相对越好)。例如，相对于Savinase，在调查的条件下，Sv1在20℃对EMPA112显示的洗涤性能比在60℃好1.6倍。

表13：在洗衣液模式去污剂中示例性M7蛋白酶对Savinase的比较

	EMPA112	PC-05
				60℃→20℃	60℃→20℃
Savinase	1,0	1,0
			Sv1	1,6	2,5

表14：在洗衣液模式去污剂中示例性M7蛋白酶对Savinase的比较

	EMPA112	PC-05	C-10
					60℃→20℃	60℃→20℃	60℃→15℃
Savinase	1,0	1,0	1,0
				Kf1	1,1	0,6	0,1
J1	2,1	4,6	13,0
				Sg1	1,0	1,3	1,2

表15：在洗衣粉模式去污剂中示例性M7蛋白酶对Savinase的比较

	WFK10PPM	EMPA112	PC-05
					60℃→15℃	60℃→20℃	60℃→15℃
Savinase	1,0	1,0	1,0
				Sv1	4,0	2,3	6,7

表16：在洗衣粉模式去污剂中示例性M7蛋白酶对Savinase的比较

	EMPA112	PC-05	WFK10PPM
					60℃→40℃	60℃→15℃	60℃→15℃
Savinase	1,0	1,0	1,0
				Kf1	1,8	5,4	8,4
J1	4,8	16,0	11,7
				Sg1	1,3	43,0	7,2

根据表13-16显然可见，当与在这些温度的Savinase的洗涤性能相比时，当温度从60℃下降时，示例性金属蛋白酶相对洗涤性能增加。

实施例7：

示例性M7和M35金属蛋白酶对蛋的性能的评估

调查Sv1，Kf1，J1，Sg1和Ta1蛋白酶在如上所述的AMSA中30nm蛋白酶浓度下相对于Savinase对不同蛋渍的性能。将液体去污剂分别调整至pH7(表17，表19)和pH 6(表18)。表格显示在30℃(表17)和20℃(表18-19)确定的、含M7或M35金属蛋白酶的去污剂相对于含Savinase的去污剂的洗涤性能。

表17：在模式洗涤剂(30℃)中示例性M7和M35金属蛋白酶对Savinase 的比较

表18：在模式去污剂(20℃)中示例性M7和M35金属蛋白酶对Savinase的比较

表19：在模式去污剂(20℃)中示例性M7和M35金属蛋白酶对Savinase 的比较

根据表17-19，显然可见，与Savinase相比，M7和M35金属蛋白酶对于多种蛋渍具有增加的洗涤性能。

本发明亦通过下述具体实施方案来描述

实施方案1：M7或M35金属蛋白酶在清洁工艺中的用途。

实施方案2：实施方案1的用途，其中所述蛋白酶具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少70%序列同一性。

实施方案3：前述任一项实施方案的用途，其中所述清洁工艺是洗衣工艺。

实施方案4：实施方案1-2任一项的用途，其中所述清洁工艺是洗碟工艺。

实施方案5：前述任一项实施方案的用途，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%序列同一性。

实施方案6：前述任一项实施方案的用途，其中所述清洁工艺在40℃或更低，优选35℃或更低，优选30℃或更低，优选25℃或更低，优选20℃或更低的温度进行。

实施方案7：前述任一项实施方案的用途，其中所述清洁工艺在5.5至9，优选6至8的pH进行。

实施方案8：一种清洁方法，所述方法包括下述步骤：将需要清洁的表面与M7或M35金属蛋白酶相接触。

实施方案9：实施方案8的方法，其中所述蛋白酶包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少70%序列同一性。

实施方案10：实施方案8-9任一项的方法，其中所述清洁工艺是洗衣工艺。

实施方案11：实施方案8-10任一项的方法，其中所述清洁工艺是洗碟工艺。

实施方案12：实施方案8-11任一项的方法，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%序列同一性。

实施方案13：实施方案8-12任一项的方法，其中所述清洁工艺在40℃或更低，优选35℃或更低，优选30℃或更低，优选25℃或更低，优选20℃或更低的温度进行。

实施方案14：实施方案8-13任一项的方法，其中所述清洁工艺在5.5至9，优选6至8的pH进行。

实施方案15：一种组合物，其包含M7或M35金属蛋白酶和表面活性剂。

实施方案16：实施方案15的组合物，其中所述蛋白酶包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少70%序列同一性。

实施方案17：实施方案15-16任一项的组合物，进一步包含至少一种选自下组的其它酶：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶或角质酶，或其组合。

实施方案18：实施方案15-17任一项的组合物，其为清洁组合物。

实施方案19：实施方案15-17任一项的组合物，其为去污剂组合物。

实施方案20：实施方案15-19任一项的组合物，其中所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%序列同一性。

实施方案21：实施方案15-20任一项的组合物，供用于低温清洁工艺。

实施方案22：实施方案15-20任一项的组合物，供用于去除蛋渍工艺。

实施方案23：一种用于从表面去除污渍的方法，其包括将所述表面与实施方案15-20任一项的组合物相接触。

实施方案24：实施方案23的方法，其中所述污渍是蛋渍。

实施方案25：实施方案23-24任一项的方法，其为洗碟工艺。

实施方案26：实施方案23-24任一项的方法，其中所述表面是织物或纺织品。

实施方案27：实施方案23-26任一项的方法，其中所述污渍去除工艺在5.5至9，优选6至8的pH进行。

Claims (15)

1.M7或M35金属蛋白酶在清洁工艺中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述蛋白酶包含与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。

3.前述任一项权利要求的用途，其中所述清洁工艺是洗衣工艺。

4.权利要求1-2任一项的用途，其中所述清洁工艺是洗碟工艺。

5.前述任一项权利要求的用途，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%序列同一性的氨基酸序列。

6.前述任一项权利要求的用途，其中所述清洁工艺在40℃或更低，优选35℃或更低，优选30℃或更低，优选25℃或更低，优选20℃或更低的温度进行。

7.前述任一项权利要求的用途，其中所述清洁工艺在5.5至9，优选6至8的pH进行。

8.一种组合物，其包含M7或M35金属蛋白酶和表面活性剂。

9.权利要求8的组合物，其中所述蛋白酶包含与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。

10.权利要求8-9任一项的组合物，还包含至少一种选自下组的其它酶：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶或角质酶，或其组合。

11.权利要求8-10任一项的组合物，其为清洁组合物。

12.权利要求8-10任一项的组合物，其为去污剂组合物。

13.权利要求8-12任一项的组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:1，2，3，4，5或6的成熟多肽具有至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%同一性的氨基酸序列。

14.权利要求8-13任一项的组合物，供用于低温清洁工艺。

15.权利要求8-13任一项的组合物，供用于去除蛋渍的工艺。