JP5507843B2 - 保存安定的な中性金属プロテアーゼの使用及び生産 - Google Patents

保存安定的な中性金属プロテアーゼの使用及び生産 Download PDF

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Description

本発明は保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に用いられる。特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス（Bacillus）種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amylloliquefaciens）から得られる。より更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amylloliquefaciens）中性金属プロテアーゼの変異体である。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amylloliquefaciens）中性金属プロテアーゼの同族体（ホモログ）である。本発明は、特に洗浄、漂白及び殺菌を含む用途に応用されるがこれに限定されるものではない。
本出願は2005年10月12日に出願された米国特許仮出願第60/726,448号の優先権の利益を享受するものである。
洗剤及び他の洗浄のための組成物は、通常活性成分の複合した組み合わせを含む。例えば、殆んどの洗浄用の製品は、界面活性剤系、洗浄のための酵素、漂白剤、原材料（ビルダー）、泡抑制剤、汚れ懸濁化剤、汚れ剥離剤、蛍光増白剤、分散剤、染料移動抑制化合物、研磨剤、殺菌剤及び香料を含む。
現在の洗剤は複合的であるが、完全に取り除くのが難しい汚れは多い。更に、しばしば残留物が蓄積され、これは変色を起し（例えば、黄色化）洗浄が完全でないことにより美観が衰える。これらの問題は、低温での洗浄（例えば、冷水）が増え及び洗浄サイクルが短くなることにより更に深刻化する。更に、汚れの多くは炭水化物及び炭水化物誘導体を含む繊維性材料、繊維及び細胞壁成分（例えば、植物材料、木材、泥/粘土ベースの汚れ、及び果物）を主に含む繊維性材料の複雑な混合物から成っている。これらの汚れは洗剤組成物の調剤及び使用において解決すべき困難な問題を提起する。
更に、有色衣料品は摩耗し、及び見栄えが衰える傾向がある。この色が衰える原因の一部は洗濯の過程での摩耗、特に自動洗濯機及び乾燥機での摩耗によるものである。更に、織物の引張り強度の低下は使用、着用、及び/又は洗濯、乾燥による避けられない機械的及び化学的作用によるものと思われる。したがって、これらの外観の衰えを最小にするための、有色の衣料を能率的及び効果的に洗濯する手段が求められる。
つまり、洗浄用組成物の効果は向上しているが、汚れを落とし、繊維の色及び外観を維持し、染料移動を防ぐ洗剤の需要がある。更に、しわ防止、毛玉防止、及び/又は繊維に収縮防止特性を提供し、しわや型崩れを防止し、繊維に軟らかさを与え、所望の外観色彩、及び繊維の対摩耗特性及び利益を維持するのみならず、引張り強度を提供し及び/又は回復する洗剤及び/又は繊維ケアー組成物の需要がある。特に、洗濯される繊維にしばしば付着している変色した汚れの成分を取除くことのできる組成物を含むことに対する需要がある。更に、織物の漂白に適した改善された方法及び/又は組成物に対する需要がある。
発明の概要
本発明は保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に使用される。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス（Bacillus）種より得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスより得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に洗浄、漂白及び殺菌を含む用途に用いられるがこれに限定されるものではない。
本発明は、新しい中性金属プロテアーゼ、中性金属プロテアーゼ酵素をコ−ドする新しい総称的材料、及びバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼ及びそれから発展したタンパク質変異体を提供する。特に、本発明はバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼ組成物、プロテアーゼをコードするDNA、中性金属プロテアーゼをコードするDNAを含むベクター、ベクターDNAによって形質転換された宿主細胞、及び宿主細胞により生成された酵素を提供する。本発明はまた洗浄のための組成物（例えば、洗剤組成物）、動物用飼料組成物、及びバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼを含む、織物及び皮革加工のための組成物を提供する。代替的な実施の態様においては、本発明は、本明細書に記載の野生型中性金属プロテアーゼ由来の変種（すなわち、変異体）中性金属プロテアーゼを提供する。これらの変種中性金属プロテアーゼはまた多くの用途が見出される。
本発明はバチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる単離した中性金属プロテアーゼを提供する。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，4、又は１８に定めるアミノ酸配列を含む。更なる実施の態様においては、本発明は配列番号3，4、又は１８を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも45%相同性を持つアミノ酸を含む単離した中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも５０%相同性を持ち、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％相同性を持つ。
本発明はまた、バチルス アミロリケファシエンスから得られる金属プロテアーゼと免疫交叉反応性がある単離された中性金属プロテアーゼ及びこれらの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供する。代替的な実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８に規定するアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性がある。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスの中性金属プロテアーゼ、及び/又は配列番号3，４、又は１８に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼの断片（すなわち、部分）と交叉反応性がある。事実、本発明は動物（ヒトを含むがこれに限定されるものではない）での免疫反応を刺激し、及び/又は何れの種類の抗体によって認識されるバチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼの断片（すなわち、エピトープ）を含むことを意図している。本発明は更にバチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼ エピトープと交叉反応性のある金属プロテアーゼ上のエピトープを含む。ある実施の態様においては、金属プロテアーゼエピトープは抗体により認識されるが、動物（ヒトを含むがこれに限定されるものではない）の免疫反応を刺激せず、一方他の実施の態様においては、金属プロテアーゼ エピトープは少なくとも一つの動物種（ヒトを含むがこれに限定されるものではない）の免疫反応を刺激し、及びどの種類の抗体によっても認識される。本発明はまた交叉反応性エピトープを同定し及び評価する方法及び組成物を提供する。
ある実施の態様においては、本発明は配列番号3，４、又は１８に規定のアミノ酸配列を提供する。他の実施の態様においては、配列は配列番号3，４、又は１８の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある特に好ましい代替的実施の態様においては、配列は配列番号１８の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号3，４、又は１８に規定のアミノ酸配列を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号１８に規定するアミノ酸配列を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置に同等な位置に作られたアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。他の実施の形態においては、本発明は配列番号3，４、又は１８の少なくとも一部を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置に同等な位置に作られたアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。ある好ましい他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８の少なくとも一部に多重突然変異を含む。
ある他の好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号１８の少なくとも一部に多重突然変異を含む。
更なる実施の態様においては、本発明は配列番号18に規定のアミノ酸配列を提供する。他の実施の態様においては、配列は配列番号１８の少なくとも一つのアミノ酸位置に置換を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明は配列番号１８に規定するアミノ酸配列を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのある位置に同等な位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。他の実施の態様においては、本発明は配列番号１８の少なくともある部分を含むバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのある位置と同等な位置に作られる少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある他の好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号１８の少なくともある部分に多重突然変異を含む。
ある特に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された機能を持つ。本発明はまた、野生型中性金属プロテアーゼと比べて少なくとも一つの改良された特性を持つ中性金属プロテアーゼ変異体を提供する。ある更に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された安定性を持つ。ある更に好ましい実施の態様においては、これらの変異体は野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼに比べて改良された熱安定性を持つ。更に他の好ましい実施の態様においては、これらの変異体は、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼに比べてより低い、又はより高いｐHの下で改良された機能を持つ。
本発明はまた、配列番号3，４、又は１８に規定するアミノ酸配列の少なくとも一部を含む中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、これらの中性金属プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は配列番号１，２，１２及び/又は１３から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８に規定するアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を持つ変異体である。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは変異体及び/又はホモログである。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは図3乃至５のいずれかに規定の中性金属プロテアーゼである。他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは図3、４及び/又は５に規定の変異体である。
本発明はまた、配列番号3，４、又は１８に規定する中性金属プロテアーゼの少なくとも一つの位置をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明は更に、配列番号3，４、又は１８に規定するアミノ酸配列を含むバチルス 中性金属プロテアーゼのある位置に同等な位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含むアミノ酸配列を持つ少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの配列ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種からなる群れから選択される。本発明はまた、宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。
本発明はまた、中性金属プロテアーゼの少なくとも一部が配列番号１，２、１２、及び/又は１３から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、バチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られ単離された中性金属プロテアーゼの少なくとも一部を含む組成物を提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。本発明はまた、宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。
本発明はまた、中性金属プロテアーゼが配列番号3及び/又は１８のアミノ酸位置に対応する、少なくとも一つの置換を持つ中性金属プロテアーゼである変異体中性金属プロテアーゼを提供し、変異体金属プロテアーゼは、野生型バチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼと比べて、少なくとも一つのより優れた特性を持つ。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はまた、中性金属プロテアーゼが配列番号１８のアミノ酸位置に対応する少なくとも一つの置換を含み、変異体金属プロテアーゼは、野生型バチルス アミロリケファシエンス金属プロテアーゼと比べて、少なくとも一つのより優れた特性を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。
本発明はまた、変異体が配列番号１８に規定のアミノ酸を含む中性金属プロテアーゼのある位置と同等の位置に作られるアミノ酸の少なくとも一つの置換を含み、その位置（単数、又は複数）は以下の位置から選択される、変異体アミノ酸を提供する：
Figure 0005507843
本発明はまた配列番号１８に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼのある位置と同等の位置に作られる少なくとも一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を持つ単離された中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼ変異体は、配列番号8に規定のアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼの以下の位置と同等な位置に作られる置換を持つ：
Figure 0005507843
更なる実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼ変異体は以下のものから選択される少なくとも一つの突然変異変異種を含む：
Figure 0005507843
Figure 0005507843
更なる実施の態様においては、本発明は、金属プロテアーゼが以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する：
Figure 0005507843
Figure 0005507843
また更なる実施の態様においては、本発明は、金属プロテアーゼが以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する：
Figure 0005507843
Figure 0005507843
また更なる実施の態様においては、本発明は、以下から選択される多重突然変異種を含む、単離された変異体中性金属プロテアーゼを提供する：
Figure 0005507843
Figure 0005507843
本発明はまた以下のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する、すなわち、
(i) 配列番号１，２，１２及び/又は１３と少なくとも７０％同一性を持ち、又は
(ii) 中程度から高度の厳格さの条件下で、実施例に示されるプライマ配列を含み、本明細書に規定される任意のヌクレオチド配列に由来するプローブにハイブリッドすることができ、又は
（iii）配列番号１，２，１２及び/又は１３に規定するヌクレオチド配列と相補的である。
ある実施の態様においては、本発明は少なくとも一つのその様なポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はこれらの発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。本発明はまた宿主細胞により生成される中性金属プロテアーゼを提供する。更なる実施の態様においては、本発明は配列番号１，２，１２及び/又は１３に規定する配列の少なくともある一部と相補的であるポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、中性金属プロテアーゼ活性を持つ酵素を生成する方法を提供し、その方法は、配列番号１，２，１２及び/又は１３と少なくとも７０％同一の配列を持つポリヌクレオチドを含む配列ベクターにより宿主細胞を形質転換すること、宿主細胞に適した条件で形質転換された宿主細胞を培養することを含む。
ある好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である。
本発明はまた、配列番号１，２，１２及び/又は１３の対応する断片と実質的に同一の４から１５０のヌクレオチド配列を含むプローブを提供し、前記プローブは金属プロテアーゼ活性を持つ酵素をコードする核酸配列を検出するのに用いられる。ある実施の態様においては、核酸はバチルス種から得られる。
本発明はまた、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号３，４、及び/又は１８に規定するアミノ酸配列を含む。ある更なる実施の態様においては、本発明は配列番号３，４、及び/又は１８を含む中性金属プロテアーゼと少なくとも４５％同一のアミノ酸を含む単離された中性金属プロテアーゼを提供する。ある実施の態様においては、単離された中性金属プロテアーゼは配列番号３，４、及び/又は１８と、少なくとも５０％同一、好ましくは少なくとも５５％同一、より好ましくは少なくとも６０％同一、さらにより好ましくは少なくとも６５％同一、さらにより好ましくは少なくとも７０％同一、さらにより好ましくは少なくとも７５％同一、さらにより好ましくは少なくとも８０％同一、さらにより好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは９９％同一であるのが良い。
本発明は更に少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄用組成物を提供し、中性金属プロテアーゼの少なくとも一つはバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、及び/又は１８に規定されるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと免疫交叉反応性を持つ。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス種中性金属プロテアーゼの断片（すなわち、部分）及び/又は配列番号3，４、及び/又は１８に規定されるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼと交叉反応性を持つ。本発明は更に、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは、配列番号3，４、及び/又は１８に規定するアミノ酸配列を持つバチルス種中性金属プロテアーゼ、特にバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等な位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼである。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はまた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む洗浄組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは配列番号１８に規定するアミノ酸配列を持つバチルス種中性金属プロテアーゼ、特にバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ中のある位置と同等な位置に作られた少なくとも一つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を持つ変異体中性金属プロテアーゼである。
更に他の実施の態様においては、洗浄組成物は配列番号3，４、及び/又は１８に一組の変異種を含む少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む。ある特に好ましい実施の態様においては、変異体中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、及び/又は１８のアミノ酸位置に対応する少なくとも一つの置換を含み、変異体中性金属プロテアーゼは、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比較して、少なくとも一つの優れた特性を持つ。
本発明はまた、少なくとも一つの金属プロテアーゼ酵素の、洗浄に効果的な量を含む洗浄組成物を提供し、前記酵素は配列番号3，４、及び/又は１８と７０％同一の配列を持つアミノ酸配列及び好適な洗浄のための製剤を含む。ある好ましい実施の態様においては、洗浄組成物は更に一以上の追加の酵素又はプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ及びセルラーゼよりなる群から選択される酵素誘導体を含む。
本発明はまた、バチルス種、特にバチルス アミロリケファシエンスから得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供し、前記組成物は更に少なくとも一つの安定剤を含む。ある実施の態様においては、安定剤は、ホウ砂、グリセロール、亜鉛イオン、カルシウムイオン、及びギ酸カルシウム塩から選択される。ある実施の態様においては、本発明は本発明の酵素を陰イオン界面活性剤に対して安定させるために好適な拮抗阻害剤を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス種から得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、及び/又は１８に規定するアミノ酸配列を含む。
本発明は更に、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む組成物を提供し、前記中性金属プロテアーゼは自己分解に安定な変異体である。ある実施の態様においては、少なくとも一つの変異体中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの変異体中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、及び/又は１８に規定するアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本発明の中性金属プロテアーゼを少なくとも0.0001重量%及び任意選択的に、一つの補助成分を含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、前記組成物は一つの補助成分を含む。ある好ましい実施の態様においては、前記組成物は、組成物に約３から約５の純度のｐＨを持つ組成物を提供する、十分な量のｐＨ調整剤を含み。前記組成物は約３から約５のｐＨで加水分解する材料を実質的に含まない。ある特に好ましい実施の態様においては、加水分解する材料は界面活性剤材料を含む。更なる実施の態様においては、洗浄組成物は液状組成物であり、他の実施の態様においては、洗浄組成物は固形組成物であり、更に他の実施の態様においては、洗浄組成物はゲル状である。事実、本発明においては種々の製剤、及び/又は組成物で用いられるため、本発明は特定の製剤及び/又は組成物に限定することを意図するものではない。更なる実施の態様においては、界面活性剤材料は、エチレン オキシド部分を含むアルキル硫酸塩ナトリウム界面活性剤を含む。
本発明は更に、本発明の少なくとも一つの中性金属プロテアーゼに加えて更に少なくとも一つの酸に安定的な酵素を含む洗浄組成物を提供し、前記洗浄組成物は、約３から約５の純度のｐＨを持つ組成物を提供するに十分な量のｐＨ調整剤を含み、組成物は約３から約５のｐＨで加水分解する材料を実質的に含まない。更なる実施の態様においては、加水分解する材料は界面活性剤材料を含む。ある好ましい実施の態様においては、洗浄組成物は液状組成物である。更なる実施の態様においては、界面活性剤材料はエチレンオキシド部分を含むアルキル硫酸塩ナトリウム界面活性剤を含む。ある実施の態様においては、洗浄組成物は好適な補助成分を含む。ある実施の態様においては、組成物は好適な補助成分を含む。ある実施の態様においては、組成物は約0.001から約0.5wt%の中性金属プロテアーゼを含む。
ある代替的な好ましい実施の態様においては、組成物は約0.01から約0.1重量%の中性金属プロテアーゼを含む。
本発明はまた、洗浄方法を提供し、該方法は：
a) 表面及び/又は織物を含む商品を、本発明の中性金属プロテアーゼを適当な濃度で含む洗浄組成物に接触させ、及び
b) 任意選択的に表面又は材料を洗浄及び/又はすすぐこと
を含むステップを含む。
代替的な実施の態様においては、本明細書に記載の好適な組成物は
どの様なものでも用いることができる。ある実施の態様においては、織物は少なくとも一つの草の染みを含む。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は織物から草及び他の染みを除去するのに使用することができる。
本発明はまた、バチルス種から得られる少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む動物の飼料を提供する。ある実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８に規定するアミノ酸配列を含む。ある代替的な特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼは配列番号１８に規定するアミノ酸配列を含む。
本発明は配列番号１８に規定するアミノ酸配列を持つ金属プロテアーゼ活性（例えば、中性金属プロテアーゼ）を持つ単離されたポリペプチドを提供する。ある実施の態様においては、本発明は配列番号１８に規定する配列と約40%から98%同一の配列を持つ単離されたポリペプチドを提供する。
ある好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号18に規定する配列と約50%から95%同一の配列を持つ。更にある好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号18に規定する配列と約60%から90%同一の配列を持つ。更なる実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号3，４、又は１８に規定する配列と約65%から85%同一の配列を持つ。ある特に好ましい実施の態様においては、ポリペプチドは配列番号3，４、又は１８に規定する配列と約90%から95%同一の配列を持つ。
本発明は更に、配列番号3，４、又は１８と少なくとも40%配列が同一であるアミノ酸配列を含む中性金属プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、及び/又は１８と少なくとも50%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８と少なくとも６0%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８と少なくとも７0%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８と少なくとも８0%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８と少なくとも９0%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは配列番号3，４、又は１８と少なくとも９５%配列が同一のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、上に記載のポリヌクレオチドの何れかを含む発現ベクターを提供する。
本発明は更に、本発明の発現ベクターにより形質転換される宿主細胞を提供するため、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼはその宿主細胞により発現される。ある実施の態様においては、宿主細胞はバクテリアであり、他の実施の態様においては、宿主細胞は真菌である。
本発明はまたヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ヌクレオチド配列は
(i) 配列番号１，２，１２及び/又は１３と少なくとも70%配列が同一であり、又は
(ii) 中程度から高度に厳格な条件において、配列番号１，２，１２及び/又は１３のヌクレオチド配列由来のプローブとハイブリッドすることが可能であり、又は
(iii)配列番号１，２，１２及び/又は１３のヌクレオチド配列に相補的である。
ある実施の態様においては、本発明はその様なポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更なる実施の態様においては、本発明はその様なベクターにより形質転換される宿主細胞を提供する。
本発明は更に、中性金属プロテアーゼ活性を持つ少なくとも一つの酵素を生成する方法を提供し、該方法は：配列番号１，２，１２及び/又は１３と少なくとも70%同一配列を持つポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより宿主細胞を形質転換させるステップ、宿主細胞が中性金属プロテアーゼを生成するに適した条件下で形質転換された宿主細胞を培養するステップ、及び中性金属プロテアーゼを回収するステップを含む。ある好ましい実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種であり、他方ある実施の態様においては、宿主細胞はバチルス アミロリケファシエンスである。
本発明はまた、本明細書に記載の中性金属プロテアーゼをコードするDNAの断片（すなわち、部分）を提供する。これらの断片はバチルス アミロリケファシエンスから得られる本明細書に記載の成熟中性金属プロテアーゼ酵素又はプロテアーゼ活性を持つその一部分をコードするポリヌクレオチドを分離し、又は同定するために用いることができる部分的な長さのDNA断片を得るのに用いられる。ある実施の態様においては、配列番号２に記載のDNAの部分は、中性金属プロテアーゼ又は金属プロテアーゼ活性を持つその部分をコードする他の種に由来するDNAの同種の断片を得るために用いられる。
本発明は更に、配列番号:1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15の断片及び/又は本明細書に記載のプライマのいずれとも実質的に同一のポリヌクレオチドを含む少なくとも一つのプローブを提供し、該プローブは金属プロテアーゼ活性を持つ酵素をコードする核酸配列を検出するために用いられ、該核酸配列はバクテリアソースから得られる。ある実施の態様においては、バクテリアソースはバチルス種である。ある好ましい実施の態様においては、バクテリアソースはバチルス アミロリケファシエンスである。
本発明は更に、本明細書に記載の中性金属プロテアーゼの少なくとも一つを含む組成物を提供する。ある好ましい実施の態様においては、組成物は洗浄用組成物である。ある実施の態様においては、本発明は、配列番号18と少なくとも40%同一の配列、少なくとも９0%同一、及び/又は配列番号１８の配列を持つアミノ酸配列を含む少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを洗浄に効果的な量含む洗浄組成物を提供する。ある実施の態様においては、洗浄組成物は更に少なくとも一つの補助洗浄剤を含む。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス種に由来する。ある好ましい実施の態様においては、バチルス種はバチルス アミロリケファシエンスである。
更なる実施の態様においては、洗浄組成物は更に少なくとも一つの酵素又は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、及びセルラーゼよりなる群から選択される酵素の誘導体を更に含む。
本発明はまた、配列番号１８と少なくとも45%同一の配列、配列番号１８と少なくとも60%同一の配列、配列番号１８と少なくとも75%同一の配列、配列番号１８と少なくとも90%同一の配列、配列番号１８と少なくとも95%同一の配列、配列番号１８と同一の配列を持つアミノ酸配列を含む単離された天然の中性金属プロテアーゼを提供し、前記中性金属プロテアーゼはバチルス種から単離される。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから単離される。
更なる実施の態様においては、本発明は、本発明の中性金属プロテアーゼの改変された変異体を提供する。ある実施の態様においては、改変された変異体はDNA組み換え技術を用いて遺伝子的に組み換えられ、他の実施の形態においては、変異体は自然発生したものである。本発明は更に、単離された酵素ホモログのみならず、ホモログ酵素の改変された変異体を含む。ある実施の態様においては、改変された変異体ホモログ中性金属プロテアーゼはDNA組み換え技術を用いて遺伝子的に組み換えられ、一方他の実施の態様においては、変異体ホモログ中性金属プロテアーゼは天然に発生する。
本発明はまた、中性金属プロテアーゼを生成する方法を提供し、該方法は：
(a) 配列番号２と少なくとも70%同一の配列、配列番号２と少なくとも95%同一の配列、配列番号２のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む配列ベクターにより宿主細胞を形質転換し、
(b) 宿主細胞が中性金属プロテアーゼを生成するのに適した条件下で形質転換された宿主細胞を培養し、
(c) 中性金属プロテアーゼを回収する
ことを含む。
ある実施の態様においては、宿主細胞はバチルス種である（例えば、バチルス スブチリス、バチルス クラウシ（Bacillus clausii）又はバチルス リチェニフォルミス（Bacillus licheniformis））。他の実施の態様においては、宿主細胞はバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amylloliquefaciens）である。
更なる実施の態様においては、本発明は本発明の中性金属プロテアーゼを比較的多量に生成することができる宿主細胞を生成する方法を提供する。特に好ましい実施の態様においては、本発明は食料及び/又は飼料成分のみならず、洗浄組成物、織物加工、皮の仕上げ、穀物加工、食肉加工、洗浄、タンパク質加水分解物の生成、消化補助剤、殺菌性成分、静菌性成分、静真菌性成分、個人ケアー製品（例えば、口内ケアー、ヘアケアー、及び/又はスキンケアー）を含み、ポリペプチドの分解又は合成が望まれる場合の種々の商業的応用において中性金属プロテアーゼを生成する方法を提供する。
本発明はまた、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べて改良された機能を持つ変異体中性金属プロテアーゼを提供する。他の好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べ改良された熱安定性を持つ。
他の好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べより低い又はより高いｐＨにおいて改良された機能を持つ。更なる、好ましい実施の態様においては、改良された機能には、野生型バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼと比べ、改良された自己分解安定性を含む。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明の酵素組成物は、現在用いられている中性金属プロテアーゼに比肩する又はそれより改良された洗濯機能を持つ。本発明の他の目的及び優位性は本明細書の記載より明らかである。
発明の詳細な説明
本発明は改良された保存安定性を持つ少なくとも一つの中性金属プロテアーゼ酵素を含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に使用することができる。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある更に特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼの変異体である。更なる実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に漂白及び殺菌を含む分野で応用されるが、これに限定されるものではない。
特に断らない限り、本発明の実施においては当業者の技術範囲にある分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びDNA配列決定、及びDNA組み換え分野で通常使用される従来の技術を用いる。その様な技術は当業者に知られており、数多くの論文及び参考文献に記載されている（Sambrook他, 「分子クローン：実験室マニュアル」（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第二版 (Cold Spring Harbor), [1989]);及びAusubel 他、 「分子生物学における現在の手順」（Current Protocols in Molecular Biology）[1987])）。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び出版物は既に挙げたもの、以下に挙げるものの何れも参照により本明細書に組み入れられる。
更に、本明細書に記載の各見出しは、本発明の種々の特徴又は実施の態様を限定するものではなく、本発明は明細書を全体として考察することにより把握することができる。したがって、これに直ぐ続く定義は明細書を全体として考察することにより更に十分に理解される。しかし、本発明の理解の促進を図るために、多くの用語を以下に定義する。
定義
本明細書において、他の意味として規定しない限り、本明細書の全ての技術及び科学用語はこの発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されると同じ意味を持つ。例えば、
Singleton and Sainsbury, 「微生物及び分子生物学辞典」（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）第二版., John Wiley and Sons, NY (1994); 及び Hale 及びMarham, 「Harper Collins 生物学辞典」（The Harper Collins Dictionary of Biology）、Harper Perennial, NY (1991)はこれらの当業者に本明細書で使用される多くの用語の一般的辞典を提供する。本明細書に記載のこれらの方法と同様又は同等な方法及び材料は、本発明の実施に使用できるが、本明細書では好ましい方法及び材料が記載されている。したがって、以下に、続いて定義される用語は明細書を全体として考察することにより、より完全に把握することができる。また、本明細書で使用する単数を表わす「a」「an」及び「the」は、文意より明確に異なる意味に解せられない限りその複数系をも含む。他に断らない限り、核酸は左から右へ、5’ から3’の方向へ記載され；アミノ酸配列は左から右へ、アミノ基からカルボキシ基の方向に記載される。本発明は記載された特定の方法論、手順、及び試薬に限定されるものではないことを理解するべきである。これらは当業者により使用される状況により変わりうるからである。
本明細書を通じ記載されている各最大限界数値は、その下限数値が本明細書に記載されているかの様に、各下限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各最小限界数値は、その上限限界値が本明細書に記載されているかの様に、各上限値を含んでいることを意図している。本明細書を通じ記載されている各数値範囲は、そのより狭い数値範囲が、全て本明細書に記載されている様に、その様なより広い数値範囲内にある各狭い数値範囲を含む。
本明細書に引用される全ての書類は、その関係する部分において、参照により本明細書に組み入れられる。各書類を引用することにより、それらの書類は、本発明との関係において先行技術文献であると認めたものと解してはならない。
本明細書で用いる「漂白」（bleaching）は材料（織物、洗濯物、パルプ等）に光沢を与え（すなわち、白くする）及び/又は材料を洗浄するため、材料又は表面を十分な時間及び適切なｐＨ及び温度条件で処理することを言う。漂白のための好適な化学品の例には、ClO2, H2O2, 過酸、NO2等を含むがこれに限定されるものではない。
本明細書で用いる「殺菌」（disinfecting）は品物の表面の微生物を抑制し又は殺すのみならず、表面から汚染物質を除去することを言う。本発明は特定の表面、品物又は汚染物質、又は微生物の除去に限定されるものではない。
本明細書で用いる、「多量体」（multimer）は共有結合的に、又は非共有結合的に結合され、及び溶液中で複合物として存在する2以上のタンパク質又はペプチドを言う。
「二量体」（dimer）は2つのタンパク質又はペプチドを含む多量体である。「三量体」（trimer）は3つのタンパク質又はペプチドを含む。本明細書で用いる「八量体」（octamer）は８つのタンパク質又はペプチドの多量体である。
本明細書で用いる、「パーソナルケア製品」（personal care product）は、これらに限定されるものではないが、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所用の肌の保湿剤、歯磨き粉及び/又は他の局所用洗浄剤を含む、髪、皮膚、頭皮及び歯の洗浄、漂白及び/又は殺菌に使用する製品を指す。ある特に好ましい実施の態様においては、これらの製品は人に用いられるが、他の実施の態様においては、これらの製品は人以外の動物に用いる（例えば、獣医による使用）ことができる。
本明細書で用いる「洗浄（用）組成物」（cleaning composition）及び「洗浄（用）製剤」（cleaning formulation）は、特に断らない限り、織物、皿、コンタクトレンズ、他の汚染された基質、ヘア（シャンプー）、皮膚（石鹸及びクリーム）、歯（うがい薬、歯磨き粉）等の様な洗浄される物品から望まれない化合物を除去するのに使用される組成物を指す。この用語は、組成物が中性金属プロテアーゼ及び組成物に用いられる他の酵素と両立しうる限り、特定の種類の所望の洗浄組成物及び製品の形式（例えば、液体、ゲル、顆粒又はスプレー組成物）用に選定される任意の材料/化合物を含む。洗浄組成物材料の特定のものの選択は、洗浄される表面、品物又は織物及び、使用時の洗浄条件に合う組成物の所望の形を考慮することにより容易に行うことができる。
この用語は更に、任意の物品及び/又は表面の洗浄、漂白、殺菌及び/又は殺菌消毒するのに適した任意の組成物を指す。この用語は、洗剤組成物（例えば、液体及び/又は固体洗濯用洗剤及びきめの細かい織物用洗剤；ガラス、木、セラミック及び金属カウンター甲板及び窓の様な固い表面洗浄用製剤；カーペットクリーナ；炉用クリーナ；織物用消臭脱臭剤；織物軟化剤；繊維及び洗濯用事前染み抜き；皿用洗剤は当然のことである）を含むが、これに限定されるものではない。
事実、本明細書で用いる「洗浄用組成物」（cleaning composition）は、特に断らない限り、顆粒状又は粉末状汎用又は強力洗濯剤、特に洗浄洗剤；液体、ゲル、又はペースト状汎用洗濯用剤、特にいわゆる強力液（ＨＤＬ）タイプ；液状のきめ細かい織物用洗剤；手洗い用皿洗い用洗剤又は軽質皿洗い用洗剤、特に高泡立ちタイプの皿洗い用洗剤；家庭用及び業務用の種々の錠剤、顆粒、液体及びすすぎ補助タイプを含む機械洗い皿洗い用洗剤；抗菌性手洗いタイプ、洗浄用石鹸、うがい薬、入れ歯洗浄剤、車又はカーペット用シャンプー、フロ洗浄剤を含む液体洗浄剤及び殺菌剤；ヘアシャンプー、及びヘアリンス；シャワーゲル及び泡バス及び金属洗浄を含み、並びに漂白用添加剤及び「汚れ棒」（stain stick）又は事前処理タイプの様な洗浄補助剤を含むのはもちろんである。
本明細書で用いる「洗剤（用）組成物」（detergent composition）及び「洗剤（用）製剤」（detergent formulation）は、汚れた物を洗浄するための洗剤媒体で使用されることが意図されている混合物を指すのに用いられる。ある好ましい実施の態様においては、この用語は織物及び/又は衣料を洗濯する（例えば、洗濯洗剤）こととの関連で用いられる。他の実施の態様においては、この用語は、皿、刃物等の洗浄に用いられる他の洗剤を指す（例えば、皿洗い用洗剤）。本発明においては特定の洗剤調剤又は組成物に限定することを意図するものではない。事実、中性金属プロテアーゼに加えて、この用語は、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、原材料（ビルダー）、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、固化抑制剤、マスキング剤、酵素活性剤、抗酸化剤及び可溶剤を含む洗剤を含む。
本明細書で用いる、「出願人酵素」（Applicant enzyme）は本発明の中性金属プロテアーゼを言う。
本明細書で言う、洗剤の「改善された機能」（enhanced performance）は、標準洗濯サイクル後に、通常の評価によって決定される、漂白に敏感な汚れ（例えば、草、お茶、ワイン、血、くすみ等）を洗浄する力が増すことと定義される。ある特異な実施の態様においては、本発明の中性金属プロテアーゼは、有色の染み及び汚れを除去することにおいて改良された機能を提供する。更なる実施の態様においては、本発明の酵素はしみの除去及び/又は脱色において改善された機能を提供する。
本明細書で用いる、「硬表面洗浄組成物」（hard surface cleaning compositon）は、床、壁、タイル、風呂場、及び台所備品などの様な硬い表面を洗浄するための洗剤組成物を指すが、その組成物は固体状、液体状、エマルジョンなどを含むがこれに限定されず任意の形で提供される。
本明細書で用いる「皿用洗浄組成物」（dishwashing composition）は顆粒状、液状を含むあらゆる形の皿用洗浄剤を指すが、これらに限定されるものではなく、任意の形の組成物を指す。
本明細書で用いる、「織物洗浄組成物」（fabric cleaning composition）は、織物を洗浄する全ての形の洗剤組成物を指し、顆粒状、液状及び棒状のものを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で用いる、「布地」（textile）は、糸、織物、ニット及び不織布へ転換し又はこれらとして使用するに適した短繊維、及び繊維のみならず、織物を指す。この用語は、合成（例えば、製造された）繊維から得られるもののみならず、天然に得られる糸を含む。
本明細書で用いる、「布地材料」（textile material）は、繊維、糸の中間材、糸、織物、及び織物から得られる製品（例えば、衣料及び他の商品）の一般的総称である。
本明細書で用いる、「織物」（fabric）は任意の布地材料を含む。したがって、この用語は織物、糸、繊維、不織布材料、天然材料、合成材料、及び他の任意の布地材料にみならず衣料品をも含む。
本明細書で用いる、「適合可性のある」（compatible）は、洗剤組成物材料が、中性金属プロテアーゼが通常の使用条件において所望の効果を発揮することができない程度に、中性金属プロテアーゼの酵素活性を低減させないことを言う。
特定の洗剤組成物材料については以下に詳細に説明する。
本明細書で用いる、「酵素の効果的な量」（effective amount of enzyme）は、特定の応用（パーソナルケア製品、洗剤組成物等）において必要とされる酵素活性を得る為に必要な酵素の量を言う。その様な効果的な量は当業者により容易に確認することができ、使用される特定の酵素の変異体、洗剤使用分野、洗浄組成物の特定の組成物、及び液状又は乾燥した（例えば、顆粒状、棒状）組成物が必要であるか等多くの要素に基づく。
本明細書で用いる、「非繊維洗浄組成物」（non-fabric cleaning composition）は、硬表面洗浄組成物、皿洗浄用組成物、パーソナルケア洗浄組成物（例えば、口内洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物、パーソナル洗浄組成物等）及びパルプ及び製紙工業の使用に適した組成物を含む。
本明細書で用いる、「口内洗浄組成物」（oral cleaning composition）は、歯磨き剤、練り歯磨き、歯磨き用ゲル、歯磨き粉、うがい薬、口腔用スプレー、口腔用ゲル、チュウインガム、トローチ剤、におい袋、 錠剤、バイオゲル、病気予防ペースト、歯治療用液体等を言う。
本明細書で用いる、「トランスフェラーゼ」（transferase）は官能基を含む化合物を基質の範囲への移転を触媒する酵素を言う。
本明細書で用いる、「離脱基」（leaving group）は、アシル供与体が他の求核試薬により置換されることで開裂される求核試薬を言う。
本明細書で用いる、「酵素的変換」（enzymatic conversion）は、基質又は中間体を酵素に接触させることにより、ある基質を中間体に、又は中間体を最終製品に修飾することを言う。ある実施の態様においては、接触は基質又は中間体を直接適当な酵素に暴露することにより行われる。他の実施の態様においては、接触は基質又は中間体を、各々酵素を発現させ及び/又は分泌する有機体に暴露することを含み、及び/又は所望の基質及び/又は中間体を所望の中間体及び/又は最終製品に代謝する。
本明細書で用いる、「洗浄安定性」（detergent stability）は、洗剤組成物の安定性を言う。ある実施の態様においては、安定性は洗剤の使用中に評価され、他の実施の態様においては、この用語は保存中の洗剤組成物の安定性を言う。
本明細書で用いる、「タンパク質分解に対する安定性」（stability to proteolysis）はタンパク質分解に抵抗するタンパク質（例えば、酵素）の能力を言う。この用語はタンパク質の安定性を評価するためのある特定のプロテアーゼの使用に限定することを意図しているものではない。
本明細書で用いる、「酸化安定性」（oxidative stability）は酸化される条件下でタンパク質が機能する能力を言う。特に、この用語は種々の濃度のH2O2及び/又は過酸の存在下で機能するタンパク質の能力を言う。種々の酸化性条件下での安定性は、当該技術分野で知られている標準的手順及び/又は本明細書に記載の方法により測定することができる。酸化に対する安定性の本質的変化は、酸化性化合物が存在しない場合の酵素活性に比べて、酵素活性の半減期において少なくとも約５％以上増大するか又は減少するか（殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い）により示される。
本明細書で用いる、「ｐＨ安定性」（pH stability）は特定のｐＨでタンパク質の機能する能力を言う。一般的に殆んどの酵素は機能するｐＨの範囲が限定されている。さらに中間範囲のｐＨ（例えば、約ｐＨ７）で機能する酵素に加えて、非常に高い、又は非常に低いｐＨ条件下で機能することの可能な酵素がある。種々のｐＨでの安定性は、該技術分野で知られている標準的手順及び/又は本明細書に記載の方法により測定することができる。ｐHの安定性の本質的変化は、酵素の最適ｐＨでの酵素活性に比べて、酵素活性の半減期において少なくとも約５％以上増大するか又は減少するか（殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い）により示される。しかし、本発明は特定のｐＨでの安定性又はｐＨ範囲に限定されるものではない。
本明細書で用いる、「熱安定性」（thermal stability）はある特定の温度で機能するタンパク質の能力を言う。一般に、殆んどの酵素は機能する温度範囲が限られている。中間範囲の温度（例えば、室温）で機能する酵素に加えて、非常に高い、又は非常に低い温度で機能することのできる酵素がある。熱安定性は既知の手順、又は本明細書に記載の方法により測定することができる。熱安定性における本質的変化は、酵素の最適温度と異なる温度に曝されたときの変異体の触媒活性の半減期において、少なくとも約５％以上増大するか又は減少するか（殆んどの実施の態様において、好ましくは増大するのが良い）により示される。しかし、本発明は特定の温度レベルでの安定性又は温度範囲に限定されるものではない。
本明細書で用いる、「化学的安定性」（chemical stability）はその活性に悪影響を与える化合物質に対するタンパク質（例えば、酵素）の安定性を言う。ある実施の態様においては、その様な化合物質は、過酸化水素、過酸、陰イオン洗剤、陽イオン洗剤、非イオン洗剤、キーラント（chelant）等を含むがこれに限定されるものではない。しかし、本発明は特定の化学物質に対する安定性のレベル又は化学物質の範囲に限定されるものではない。
本明細書で用いる、「中性金属プロテアーゼ活性の改良」（neutral metalloprotease activity improvement）は、標準的酵素と比べた中性金属プロテアーゼ活性の相対的改良度を言う。他の実施の態様においては、この用語は加水分解製品の生成がより少ない組成物を含む。ある実施の態様においては、この用語は製品の製剤での改良度合いを言い、他の実施の態様においては、この用語は改変された基質特異性を持つ中性金属プロテアーゼを言う。
本明細書で用いる、「基質特異性の変化」（alteration in substrate specificity）は酵素の基質特異性における変化を言う。ある実施の態様においては、基質特異性の変化は、酵素の、酵素変異体又は他の酵素組成物と対比したKcat/Km比の間の差異と定義される。酵素基質の特異性は試験される基質により変わる。酵素基質の特異性は、酵素が異なる基質に対して示す触媒効率を比較することにより決定される。これらを決定することは、一般に、特に関心のある基質において、より大きな比率を示す変異体酵素を生成することが望まれるため、特に変異酵素の効率を評価するのに用いるのが有用である。
しかし、本発明は、特定の基質組成物や特定の基質の特異性を持つものに限定されるものではない。
本明細書で用いる、「表面特性」（surface property）は、タンパク質の表面に現れる疎水性及び/又は親水性のような性質のみならず、帯電に関しても用いられる。
本明細書で用いる、「よりなる群から独立に選択され」（is independently selected from the group consisting of . . .）の語句は、以下の例に示される様に、参照されるマーカッシュ群から選択される部分又は要素が同じ、異なる又はこれらの要素の混合であり得ることを言う。その例としては、３Ｒ基を持つ分子であり、各Ｒ基はＡ，Ｂ及びＣよりなる群から独立に選択される。ここで3つのＲ基は、AAA, BBB, CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB, 又はABCである。
化学組成物については、本明細書で用いる「置換され」（substituted）の用語は、この用語が適用される有機組成物又はラジカルが：
(a) 少なくとも一つの元素又はラジカルを除くことにより不飽和となる、
(b) 化合物又はラジカル中の少なくとも一つの水素が、一以上の(i) 炭素、(ii) 酸素、(iii) 硫黄、(iv)窒素、又は (v)ハロゲン原子を含む部分により置換され、又は
(c) 上の(a) 及び(b)の両方である、
ことを言う。
炭素及び水素原子のみを含む、前記(b)に記載の様に、水素を置換する部分は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルジエニル、シクロアルキル、フフェニル、アルキルフェニル、ナフチル、アントリル、フェナアントリル、フルオリル、ステロイド基、及びこれらの基と各他の基との組み合わせ、及びアルキレン、アルキリデン、及びアルキリデン（alkylidyne））基のような多価炭化水素基との組み合わせを含む炭化水素部分であるが、これに限定されるものではない。前記(ｂ)に記載の様に、水素を置換する酸素原子を含む部分は、ヒドロキシ、アシル、ケト、エーテル、エポキシ、カルボキシ、及びエステルを含む基を含むが、これに限定されるものではない。前記(ｂ)に記載の様に、水素を置換する硫黄原子を含む部分は、硫黄含有酸及び酸エステル基、チオエーテル基、メルカプト基及びチオケト基を含むが、これに限定されるものではない。前記(ｂ)に記載の様に、水素を置換する窒素原子を含む部分は、アミノ基、ニトロ基、アゾ基、アンモニア基、アミド基、アジド基、イソシアネート基、シアノ基及びニトリル基を含むが、これに限定されるものではない。前記(ｂ)に記載の様に、水素を置換するハロゲン原子を含む部分は、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素基及び上に記載の任意の部分を含み、ここで水素又は側基アルキル基はハロ基で置換されて安定した置換部分を形成する。
上の(b)(i) から(b)(v)の任意の部分は、一価置換により又は多価置換により水素を失うことにより、夫々他の中に置換されて、有機化合物又はラジカル中の水素を置換することのできる他の一価部分を形成すると理解される。
本明細書で用いる、「精製され」（purified）及び「単離され」（isolated）はサンプルから汚染物質を除去することを言う。例えば、中性金属プロテアーゼは溶液中の汚染するタンパク質及び他の化合物、又は中性金属プロテアーゼでない調剤を除去することにより精製される。ある実施の態様においては、組み換え中性金属プロテアーゼは細菌性又は真菌性宿主細胞で発現し、これらの組み換え中性金属プロテアーゼは他の宿主細胞成分を除去することにより精製され、それによってサンプル中の組み換え中性金属プロテアーゼポリペプチドのパーセントが増大する。特に好ましい実施の態様においては、本発明の金属プロテアーゼはSDS-PAGE 又は技術分野で知られている他の標準的な方法により決定される様に、タンパク質の成分が本質的に少なくとも約99%のレベルにまで精製される。他の好ましい実施の態様においては、本発明の金属プロテアーゼは組成物中に少なくとも９９％のプロテアーゼ成分を含む。更に他の実施の態様においては、金属プロテアーゼは全タンパク質及び/又はプロテアーゼの少なくとも約９０−９５％の範囲で存在する。
本明細書で用いる、「関心の対象のタンパク質」（protein of interest）は分析され、同定され及び/又は修飾されるタンパク質（例えば、酵素又は「関心の対象の酵素」（enzyme of interest））を言う。組み換えタンパク質のみならず天然のタンパク質も本発明で用いることができる。
本明細書で用いる、「タンパク質」（protein）はアミノ酸よりなる任意の組成物及び当業者によりタンパク質として認められている任意の組成物を言う。「タンパク質」及び「ペプチド」の用語は相互交換的に用いられる。ペプチドはタンパク質の一部分であり、当業者はこの用語の意味を文意中で理解するであろう。
本明細書で用いる、機能的及び/又は構造的に類似のタンパク質は「関連タンパク質」（related proteins）と考えられる。ある実施の態様においては、これらのタンパク質は、有機体の種の間の差異（例えば、細菌タンパク質及び糸状菌タンパク質）を含み、異なる属及び/又は種に由来する。ある実施の態様においては、有機体の種の間の差異（例えば、細菌酵素及び真菌酵素を含み）これらのタンパク質は異なる属及び/又は種に由来する。他の実施の態様においては、関連タンパク質は同じ種から提供される。事実、本発明はある特定のソースに由来の関連タンパク質に限定されることを意図するものではない。さらに、「関連タンパク質」の用語は三次構造ホモログ及び一次配列ホモログ（例えば、本発明の中性金属プロテアーゼ）を含む。例えば、本発明は図３−５に示す様なホモログを含む。更に他のホモログも、オーレオリシン（aureolysin）、細胞外エラスターゼ（extracellular elastase）及び中性プロテアーゼＢのみならず、バチルス セレウス（B. cereus）、バチルス セレウスE33L（B. cereus E33L）、バチルス カルドリチクス（B. caldolyticus）、バチルス プムリス（B.pumulis）、バチルス メガテリウム（B. megaterium）、バチルス スブチリス アミロサッカリチクス（B subtilis amylosacchariticus）、ブレビバチルス ブレビス（Brevibacillus brevis））、パエニバチルス ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa） バチルスポリミクサ（Bacillus polymyxa）、バチルス ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス ツリンゲンシス（B. thuringiensis）、バチルス スブチリス （Bacillus subtilis）及び Ｓ アウレウス（Ｓ. aureus）、から得られる金属プロテアーゼを含むが、これに限定されるものではない。
更なる実施の態様においては、この用語は免疫的に交叉反応性を持つタンパク質を含む。
本明細書で用いる、「誘導体」（derivative）は、一以上のアミノ酸を、Ｃ及びＮ末端に付加することにより、一以上のアミノ酸をアミノ酸配列の一又は多くの異なる部位で置換し、及び/又はタンパク質の一方の端又は両端で、又はアミノ酸配列の一以上の部位で、一以上のアミノ酸を欠失し、及び/又はアミノ酸配列の一以上の部位で一以上のアミノ酸を挿入することにより、タンパク質から誘導されたタンパク質を言う。タンパク質の誘導体の生成は、好ましくは天然のタンパク質をコードするDNA配列を修飾し、そのDNA配列を好適な宿主細胞に形質転換し、及び修飾されたDNA配列を発現させて誘導体タンパク質を形成することにより実施されるのが良い。
関連（及び誘導体）タンパク質は、「変異体タンパク質」（variant protein）を含む。ある好ましい実施の態様においては、変異体タンパク質は親タンパク質と異なり、また互いにその小数のアミノ酸残基が異なる。異なるアミノ酸残基の数は一以上、好ましくは1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 又はそれ以上であることもある。ある好ましい実施の態様においては、変異体間の異なるアミノ酸の数は1乃至１０の間である。ある好ましい実施の態様においては、関連タンパク質及び変異体タンパク質は、少なくとも35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 97%, 98% 又は99% アミノ酸配列が同一である。更に、本明細書で用いる関連タンパク質又は変異体タンパク質は、顕著な領域の数において他の関連タンパク質又は親タンパク質と異なるタンパク質を言う。例えば、ある実施の態様においては、変異体タンパク質は、親タンパク質と異なる1, 2, 3, 4, 5, 又は10の対応する顕著な領域を持つ。
本発明の酵素の変異体を産み出すのに好適な方法は、部位飽和突然変異法、走査突然変異法、挿入突然変異法、ランダム突然変異法、部位特異突然変異法、及び指向進化法、及び種々の他の組み換えによるアプローチを含みいくつかの方法が知られているが、これに限定されるものではない。
野生型及び変異タンパク質の特徴付けは任意の適当な方法で実施することができ、好ましくは関心のある特性の評価に基づくのが良い。例えば、本発明のある実施の態様においては、ｐＨ及び/又は温度並びに洗剤及び/又は酸化安定性が決定される。事実、これらの一以上の特徴（ｐＨ，温度、タンパク質分解安定性、洗剤安定性、及び/又は酸化安定性）において種々の異なる安定性を持つ酵素を用いることが意図されている。
本明細書で用いる、「発現ベクター」（expression vector）は、好適な宿主中でDNAを発現させることのできる好適な制御配列に動作可能にリンクされているDNA配列を含むDNA構築体を言う。その様な制御配列は、転写を行うプロモータ、その様な転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、又は単にゲノム挿入可能物であっても良い。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは複製され、そして宿主ゲノムとは独立に機能する、又はある場合には、ゲノム自身と一体となる。プラスミドは現在最も良く用いられるベクターの形であるため、本明細書では、「プラスミド」（plasmid）、「発現プラスミド」（expression plasmid）及び「ベクター」（vector）はしばしば相互交換的に用いられる。しかし、本発明では、同等機能を持つその様な他の形の発現ベクターで、当業者に知られており、又は知られるであろうものを含むことを意図している。
ある好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼ遺伝子は適当な発現プラスミドに結紮している。クローンされた中性金属プロテアーゼ遺伝子が、その後中性金属プロテアーゼ遺伝子を発現させるために宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクするために使用される。このプラスミドは、プラスミドを複製するために必要な周知の要素を含む、又はプラスミドが宿主染色体に統合されるようにデザインされるという意味で宿主中で複製される。効果的な遺伝子発現のために必要な要素が提供される（例えば、関心の対象となる遺伝子に動作可能にリンクされたプロモータ）。ある実施の態様においては、これらの必要な要素はもし認識される場合（すなわち、宿主により転写される）は遺伝子自身の同族プロモータとして供給され、転写ターミネータ（真核性宿主細胞のためのポリアデニル化領域）は外生的であるか、又は中性金属プロテアーゼ遺伝子の内生ターミネータ領域により供給される。ある実施の態様においては、抗菌を含む培養体中で成長することにより、プラスミドに感染した宿主細胞を連続的に培養維持することのできる耐抗生物質遺伝子の様な選択遺伝子もまた含まれる。
他の方法を使用することもできるが、以下のカセット式変異誘発法は、本発明の中性金属プロテアーゼ変異体の構築を促進するために用いても良い。まず、本明細書に記載の様に、中性金属プロテアーゼをコードする天然の遺伝子を得て、その全部又は一部を配列決定する。その後、配列は、コードされた中性金属プロテアーゼ中の一以上のアミノ酸の変異（欠失、挿入又は置換）を起させたい所を探してスキャンする。この箇所に隣接する配列については、オリゴヌクレオチドが発現される場合に種々の変種をコードするそのオリゴヌクレオチドプールにより遺伝子の小部分を置換する制限部位が存在するか評価される。その様な制限部位は、好ましくは遺伝子小部分の置換を促進するために、タンパク質内の特異部位であるのが良い。しかし、制限的消化により生成される遺伝子断片が適正な配列に再構築されるならば、中性金属プロテアーゼ遺伝子中の過度に余分でない従来の任意の制限部位を用いることができる。もし制限部位が選択された箇所から好都合な距離の位置にない場合（１０−１５ヌクレオチド）は、その様な部位は遺伝子中のヌクレオチドを置換することにより、最終的構築体においてリーディング フレーム及びコードされたアミノ酸の何れもが変えられない様な方法により生成される。
遺伝子の配列を所望の配列に変えるために、遺伝子の変形は通常知られているＭ１３プライマ伸長法により実施されうる。適当な隣接領域を確認し、及び２つの都合の良い制限部位配列に到達するための必要な変化を評価する仕事は、遺伝子コードの重複、遺伝子の制限酵素マップ及び数多くの異なる制限酵素により日常的に行われる。もし都合の良い隣接制限部位が使用できる場合は、上記の方法は、部位を持たない隣接領域との関連においてのみ必要となることに留意すべきである。
天然のDNA及び/又は合成DNAがクローンされると、変異される位置に隣接する制限部位は同族の制限酵素により消化され、そして複数の末端相補的オリゴヌクレオチドカセットが遺伝子に結紮される。突然変異はこの方法では簡素化される。その理由は、全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限部位を持つように合成され、制限部位を生成するために合成リンカーは必要ないからである。
本明細書で用いる、「対応する」（corresponding to）タンパク質又はペプチド中の列挙された位置の残基、又はタンパク質又はペプチド中の列挙された位置の残基に類似の、同族の、又は同等の残基を言う。
本明細書で用いる、「対応領域」（corresponding region）は関連タンパク質又は親タンパク質に沿った類似の位置を言う。
「核酸分子をコードする」(nucleic acid molecule encoding)、「核酸配列をコードする」（nucleic acid sequence encoding）、「DNA配列をコードする」((DNA sequence encoding))、「DNAをコードする」(DNA encoding)はデオキシリボ核酸のらせん構造に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指すこれらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。この様にDNA配列はアミノ酸配列をコードする。
本明細書で用いる、「類似配列」（analogous sequence）は同様な機能、三次構造及び/又は関心の対象であるタンパク質としての保存残基（すなわち、典型的には関心のあるタンパク質の元の形）を提供するタンパク質内の配列を言う。
例えば、アルファらせん又はベータシート構造を持つエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は同じ特異構造を維持するのが好ましい。この用語はまたアミノ酸配列のみならず、ヌクレオチド配列を言う。ある実施の態様においては、置換アミノ酸が同様な又は改良された機能を示す変異体酵素となる様に、類似配列が開発される。ある好ましい実施の態様においては、関心の対象となるタンパク質中の三次構造及び/又はアミノ酸の保存残基は、関心のある区分又は断片において又はその近くに位置する。この様に、関心のある部分又は断片は、例えば、アルファらせん又はベータシート構造を含む場合は、好ましくは置換アミノ酸はその特異構造を維持するのが良い。
本明細書で用いる、「相同タンパク質」（homologous protein）は、関心の対象となるタンパク質（例えば、他のソースからの中性金属プロテアーゼ）として同様な作用及び/又は構造をもつタンパク質（例えば、中性金属プロテアーゼ）を言う。ホモログ（また、「相同物」（homologue）とも呼ばれる）は必ずしも進化的に関連することを意味しているものではない。したがって、この用語は異なる種から得られる同じ又は類似の酵素（すなわち、その構造及び機能において）を含むことを意図している。ある好ましい実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質中の部分又は断片を、ホモログからの類似部分により置換することによって変化の混乱を低減させることとなるため、関心の対象となるタンパク質に類似の第四次、第三次及び/又は第一次構造を持つホモログを同定することが望ましい。
本明細書で用いる、「ホモログ遺伝子」（homologous genes）は、異なる種からの少なくとも一対の遺伝子を言い、これらの遺伝子は互いに対応し、及びお互いに同一又は非常に類似している。この用語は遺伝子複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）のみならずスペシエーション（すなわち、新しい種の開発）（例えば、オルソロガス遺伝子）によって分離された遺伝子を含む。これらの遺伝子は「相同タンパク質」をコードする。
本明細書で用いる、「オルソログ」（ortholog）及び/又は「オルソロガス遺伝子」（orthologous gene）はスペシエーションによって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）より進化した異なる種の遺伝子を言う。典型的には、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの同定は新しく配列決定されたゲノムにおいて遺伝子機能を予測する信頼される方法として用いられる。
本明細書で用いる、「パラログ」（paralog）及び「パラロガス遺伝子」（paralogous gene）はゲノム内で複製されることにより関連する遺伝子を言う。オルソログが進化の過程で同じ機能を保持するのに対し、パラログは、その幾つかの機能は元の機能としばしば関連するものであるが、新しい機能を発展させる。
パラロガス遺伝子の例には、全てセリン プロテナーゼであり、同じ種内で共に生じるトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子を含むがこれに限定されるものではない。
本明細書で用いる、「野生型」（wild-type）及び「天然」（native）のタンパク質は自然に見出されるタンパク質を言う。「野生型配列」（wild-type sequence）及び「野生型遺伝子」（wild-type gene）は、本明細書では相互交換的に使用され、天然に存在し又は宿主細胞中で自然発生的に生じる配列を指す。
ある実施の態様においては、野生型配列はタンパク質組み換え計画の開始点である関心の対象である配列を言う。自然に生じるタンパク質をコードする遺伝子は、技術分野で知られている一般的方法に従って得ても良い。これらの方法は通常、関心の対象となるタンパク質の推定配列コード領域を持つ標識プローブを合成し、タンパク質を発現させる有機体からのゲノムライブラリーを生成し、及びプローブにハイブリッドすることにより関心の対象である遺伝子のライブラリーをスクリーニングすることを含む。確実にハイブリッドするクローンの遺伝子地図が作られそして配列が決定される。
本明細書で用いる「組み換えDNA分子」（recombinant DNA molecule）は、分子生物学の技術により結合されたDNA部分よりなるDNA分子を言う。
「組み換えオリゴヌクレオチド」（recombinant oligonucleotide）の用語は、分子生物学操作により生成されるオリゴヌクレオチドを言い、ポリヌクレオチド配列の制限酵素による消化により生成される２以上のオリゴヌクレオチド配列の結紮、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマ又はオリゴヌクレオチドの合成）等を含むがこれに限定されるものではない。
配列間の相同性の程度は技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて決定することができる(例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics ソフトウエア一式(Genetics Computer Group, Madison, WI)中のGAP, BESTFIT, FASTA, 及びTFASTA の様なプログラム; 及びDevereux 他、Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]を参照)。
例えば、PILEUPは、相同性のレベルを決定する有用なプログラムである。
PILEUPは漸進的な、対合アラインメントを用いて関連配列のグループから複数配列アラインメントを作り出す。それはまた、アラインメントを作るために用いられる一団の関係を示すツリー（tree）をプロットすることができる。PILEUPはFeng and Doolittle, (Feng and Doolittle, J. MoI. Evol., 35:351-360 [1987])の漸進アラインメントを単純化してものを用いる。この方法はHiggins 及びSharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989])により記載されたものと類似する。有用なPILEUPパラメータは、デフォールト ギャップウエイト3.00, デフォールト ギャップ長さウエイト0.10, 及び加重エンドギャップを含む。
有用なアルゴリズムの他の例には、Altschul 他、(Altschul 他、J. MoI. Biol., 215:403-410, [1990]; 及び Karlin 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])により記述されたBLASTアルゴリズムである。
特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2である（Altschul他、Meth. Enzymol、266:460-480 [1996]を参照願いたい）。パラメータ"W," "T," 及び"X"はアラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは11の語長（w）、マトリクスBLOSUM62得点マトリクス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]）、５０のアラインメント（B）、10の期待値（E）、M'5, N'-4, 及び両鎖構造の比較をデフォールトとして用いる。
本明細書で用いる、「パーセント（％）核酸配列の同一性」（percent (%) nucleic acid sequence identity）は、配列のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。
本明細書で用いる、「ハイブリッドする」（hybridization）は、技術分野で知られている様に、核酸のらせんが塩基ペアーを通して相補鎖と結合するプロセスを言う。
本明細書で用いる、「ハイブリッドする条件」（hybridization conditions）は、ハイブリッド反応が実施される条件を言う。これらの条件は、典型的にはハイブリッド化が測定される条件の「厳格さ」（stringency）の程度により分類されている。厳格さの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの溶融温度に基づくことが可能である。例えば、「最も厳格」（maximum stringency）は典型的にはTm−約5°C （プローブのTmより5℃低い）；「高度に厳格」（high stringency）は通常、Tmより5-10℃低い；「中程度に厳格」（intermidiate stringency）はプローブのTmより約10-20℃低い；「低度に厳格」（low stringency）はTmより約20-25℃低い。代替的に、又は追加的に、ハイブリッド条件はハイブリッド条件の塩又はイオン強度及び/又は一以上の洗濯の厳格さに基づいても良い。例えば、6xSSC = 非常に低い厳格さ、3xSSC =低から中程度の厳格さ；１xSSC = 中程度の厳格さ; 及び0.5xSSC = 高度の厳格さである。機能的には、「最も厳格」条件は、ハイブリッドプローブを用いて厳格な同一性又は厳格な同一性に近い同一性を持つ核酸配列を同定するのに用いても良く、プローブと約８０％以上の同一性を持つ核酸配列を同定するのに用いられる。
高選択性を必要とする応用分野では、通常、ハイブリッドを形成するために比較的厳しい条件を使用するのが望ましい（例えば、相対的に低塩及び/又は高温度条件が使用される）。
少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文意においては、「実質的に類似」（substantially similar）「実質的に同一」（substantially identical）は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参考配列（すなわち、野生型）と比べて、少なくとも約４０％の同一の配列、より好ましくは少なくとも約５０％同一、更に好ましくは少なくとも約６０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％の同一、更により好ましくは少なくとも約９０％同一、更に好ましくは少なくとも約９５％の同一、最も好ましくは少なくとも約９７％の同一、時には約９８％及び約９９％同一の配列を持つ配列を含むことを言う。配列の同一性は、例えば、BLAST, ALIGN, 及びCLUSTALの標準パラメータを用いた既知のプログラムを用いて決定しても良い (例えば、Altschul他、 J. MoI. Biol. 215:403-410 [1990]; Henikoff他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]; Karin他、Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; 及びHiggins 他、Gene 73:237 - 244 [1988]をご参照)。
BLAST解析を実施するソフトはNational Center for Biotechnology Informationを通して誰でも入手が可能である。またデータベースはFASTAを用いて検索が可能である（Pearson他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 [1988]）。２つのポリペプチドが実質的に同一であるとする一つの指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫的に交叉反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換が異なるポリペプチドは免疫的に交叉反応する。この様に、例えば、２つのペプチの一つの保存置換のみが異なる場合、ポリペプチドは実質的に第二のポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の指標は、２つの分子が厳格な条件（例えば、中程度から高度の厳格さの範囲内で）下でお互いにハイブリッドすることである。
本明細書で用いる、「同等の残基」（equivalent residue）は、互いに特定のアミノ酸残基を持つタンパク質を言う。例えば、同等の残基はその三次構造はX線結晶学により決定されたタンパク質（例えば、中性金属プロテアーゼ）の三次構造レベルで相同性を決定することにより同定されてもよい。同等の残基は、推定同等残基を持つタンパク質、及び関心の対象のタンパク質の、特定のアミノ酸残基の２以上の主鎖の原子の原子座標（N上のN、CA上のCA、C上のC、及びO上のO）がアラインメント後、0.13nm及び好ましくは0.1nm内にある残基と定義される。アラインメントは、ベストモデルが解析されるタンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標が最大重なるように配向させ、及び位置が決まった後に実現される。好ましいモデルは、結晶学及びタンパク質の特性化/解析の技術分野で知られている方法を用いて、決定された、最高解像度による実験回折データでRを最小とする結晶モデルである。
本明細書で用いる、「ハイブリッド中性金属プロテアーゼ」（hybrid neutral metalloprotease）及び「融合中性金属プロテアーゼ」（fusion neutral metalloprotease）は少なくとも2つの異なる又は「親」（parental）タンパク質から操作されるタンパク質を言う。好ましい実施の態様においては、これらの親タンパク質はお互いにホモログである。例えば、ある実施の態様においては、好ましいハイブリッド中性金属プロテアーゼ又は融合タンパク質はタンパク質のN末端及びタンパク質のホモログのC末端を含む。ある好ましい実施の態様においては、2つの末端は全長サイズの活性タンパク質に対応する様に結合される。
本明細書で用いる、「調節要素」（regulatory element）は核酸配列の発現のある部面を制御する遺伝子因子を言う。例えば、プロモータは動作可能にリンクされたコード領域の転写の開始を促進する調節要素である。更なる調節要素には、スプライシング シグナル、ポリアデニル化シグナル及び終結シグナルを含む。
本明細書で用いる、「宿主細胞」（host cell）は一般的に、技術分野で知られている組み換えDNA技術を用いて構築されたベクターにより形質転換され又はトランスフェクションされた原核生物又は真核性宿主である。形質転換された宿主細胞はタンパク質変異体をコードするベクターを複製し、又は所望のタンパク質変異体を発現させることができる。タンパク質変異体のプリフォーム又はプリプロフォームをコードするベクターの場合、その様は変異体は、発現される場合には、通常宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。
核酸配列を細胞に挿入する場合の「導入される」（introduced）の用語は、形質転換、形質導入又はトランスフェクションを言う。形質転換の方法には、技術分野で知られているプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔法（electroporation）、裸のDNA等を含む。（Chang 及びCohen, MoI. Gen. Genet., 168:111 - 115 [1979]; Smith 他、Appl. Env. Microbiol., 51:634 [1986];及びFerrari他の論文、Harwood, Bacillus中の論文, Plenum Publishing Corporation, 57-72ページ [1989]）を参照）。
「プロモータ/エンハンサー」（promoter/enhancer）は、プロモータ及びエンハンサー機能を共に与えることのできる配列を含むDNAの一部分を示す（例えば、レトロウイルスの長い末端の繰り返しが共にプロモータ/エンハンサーを含む）。
エンハンサー/プロモータは「内因性」又は「外因性」又は「非相同性」であることもある。内因性エンハンサー/プロモータはゲノム中のある遺伝子と自然にリンクしているものである。外因性（非相同性）エンハンサー/プロモータは遺伝子操作（すなわち、分子生物学技術）により遺伝子と並んだ位置に置かれたものである。
発現ベクター上の「スプライシング シグナル」（splicing signal）は、しばしば組み換え転写物のより高度の発現をもたらす。スプライシング シグナルは一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライス ドナー部位及び受容部位よりなる（Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], 16.7-16.8ページ)。通常使用されるスプライスドナー部位及び受容部位はSV40の16S RNAのスプライス部位である。
「安定的なトランスフェクション」（stable transfection）、又は「安定的にトランスフェクトされた」（stably transfected）は外来DNAをトランスフェクトされた細胞のゲノムに導入し、統合することを言う。「安定的トランスフェクタント」（stable transfectant）は、外来又は外因性DNAをトランスフェクトされた細胞の遺伝子DNAに安定的に統合した細胞を言う。
本明細書で用いる、「選択可能なマーカー」（selectable marker）又は「選択可能な遺伝子製品」（selectable gene product）は、選択可能なマーカーが発現される細胞上に抗生物質又は薬物に耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用を言う。
本明細書で用いる、「増幅」（amplification）及び「遺伝子増幅」（gene amplification）は、特異DNA配列が不釣合いに複製され、増幅された遺伝子がゲノムに当初存在したよりも多いコピー数で存在することを言う。ある実施の態様においては、薬剤（例えば、抑制可能な酵素の抑制剤）の存在下で成長によって細胞を選択することは、薬剤の存在下で成長に必要な遺伝子製品をコードする内生性遺伝子を増幅するか、又はこの遺伝子製品をコードする外因性（すなわち、投入された）配列を増幅することのいずれか、又はその双方となる。
「増幅」（amplification）は鋳型特異性（template specificity）を含む核酸の複製の特異な場合である。これは非特異的鋳型複製と対比されるべきである（すなわち、複製は鋳型に依存するが、特定の鋳型に依存するものではない）。ここでの鋳型特異性は、複製が忠実であるかどうか（すなわち、適正なポリヌクレオチド配列の合成）及びヌクレオチド（リボ−又はデオキシリボ−）特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」（target）特異性と呼ばれる。標的配列は、これらが他の核酸から選定されるという意味で「標的」である。増幅技術は、主にこの選定をするために設計されたものである。
本明細書で用いる、「共増幅」（co-amplification）は、単一細胞に他の遺伝子配列（すなわち、発現ベクターに含まれる一以上の非選択性遺伝子）と共に増幅マーカーを導入し、細胞が増幅可能なマーカー及び他の非選択的遺伝子配列を増幅する様に、適当な選択的圧力を与えることを言う。増幅可能なマーカーは物理的に他の遺伝子配列にリンクされても良く、又は代替的に、その一つは増幅可能なマーカーを含み、他は非選択的マーカーを含む２つの別々のDNA が同じ細胞に導入されても良い。
本明細書で用いる、「増幅可能なマーカー」（amplifiable marker）、「増幅可能な遺伝子」（amplifiable gene）及び「増幅ベクター」（amplification vector）は、適当な成長条件でその遺伝子を増幅させるマーカー、遺伝子又は遺伝子をコードするベクターを言う。
本明細書で用いる、「増幅可能な核酸」（amplifiable nucleic acid）は、任意の増幅方法により増幅される核酸を言う。「増幅可能な核酸」は通常「サンプル鋳型」（sample template）を含むと考えられる。
本明細書で用いる、「サンプル鋳型」（sample template）は、「標的」（target）（以下に定義される）の存在が分析されるサンプルに基づく核酸を言う。対照的に、「バックグラウンド鋳型」（background template）は、サンプル中に存在し、又は存在しないサンプル鋳型と異なる核酸について用いられる。バックグラウンド鋳型は殆んどの場合偶然による。それはキャリーオーバーの結果であるか、又はサンプルから精製されて除去される核酸汚染物質によるものである。例えば、検知されるべき有機体以外の有機体からの核酸は、テストサンプル中にバックグラウンドとして存在することもある。
「鋳型特異性」（template specificity）は酵素を選択することにより殆んどの増幅技術によって実現される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、異種の核酸の混合物中の核酸の特異の配列のみを処理する酵素である。例えば、Qβ レプリカーゼの場合, MDV-I RNAがレプリカーゼの特異鋳型である（例えば、 Kacian 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]を参照）。他の核酸はこの増幅酵素によっては複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモータに厳格な特異性を持つ(Chamberlin他、Nature 228:227 [1970]を参照)。T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド基質及び結紮接合点の鋳型間にミスマッチのある2つのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結紮しない(Wu 及びWallace, Genomics 4:560 [1989]を参照)。最後に、Taq 及びPfuポリメラーゼは、高温で機能するという能力のため、プライマにより画され（bounded）、それにより規定される配列に高い特異性を示すことが判明しており、高温はプライマが標的配列とハイブリッドするのに都合が良いが、非標的配列とハイブリッドするにはそうはならない熱力学条件を産み出す。
本明細書で用いる、「プライマ」（primer）は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか、合成により生成されるかを問わず、オリゴヌクレオチドを言う。オリゴヌクレオチドは、プライマ伸長法による、核酸鎖に相補的な合成品が誘発される条件下に置かれる場合、合成の開始点として作動することができる（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼの様な誘発剤の存在下及び好適な温度及びpＨで）。プライマは、増幅で最大の効果を得るためには好ましくは単一鎖であるのが良いが、代替的に、二重鎖であっても良い。もし、二重鎖の場合は、プライマはまず、伸長製品を得るために使用するには、その鎖を分離する処理がなされる。好ましくは、プライマはオリゴデキシリボヌクレオチドであるのが良い。プライマは誘発剤の存在下で伸長製品の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマソース及び使用法を含み数多くの要因に依る。
本明細書で用いる、「プローブ」（probe）は、精製された制限消化の様に自然に生成されるか、合成により、組み換えにより又はPCR増幅により生成されるかを問わず、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を言い、オリゴヌクレオチドは関心の対象である他のオリゴヌクレオチドにハイブリッドすることができる。プローブは単一鎖であるか又は二重鎖であっても良い。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で用いられるどのプローブも任意の「レポーター分子」（reporter molecule）によりラベルを付され、酵素（例えば、酵素ベースの組織化学的アッセイのみならずELISA）、蛍光、放射線、及び発光システムを含む検出システムで検出することができるが、これに限定されるものではない。本発明は特定の検出システム又はラベルに限定されるものではない。
本明細書で用いる、「標的」（target）は、増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）との関係で用いる場合は、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマにより画された（bounded）核酸の領域を言う。したがって、「標的」は他の核酸配列から選定される。「部分」（segment）は標的配列中の核酸の領域として定義される。
本明細書で用いる、「ポリメラーゼ連鎖反応」（polymerase chain reaction (PCR)）は米国特許第4,683,195号, 第4,683,202号及び第4,965,188号に記載の方法を言う。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。この方法は、クローン又は精製をすることなくゲノムDNAの混合物中で標的配列のある部分の濃度を増大させる方法を含む。この標的配列を増幅するプロセスは、2つのオリゴヌクレオチド プライマの十分過度の量を所望の標的配列を含むDNA混合物に導入し、続いてDNAポリメラーゼの存在下で正確な熱サイクルを連続して行うことからなる。二つのプライマは二重鎖標的配列の各鎖に相補的である。増幅を実行するために、混合物は変性させ、その後プライマは標的分子中の相補配列にアニーリングされる。アニーリングに続いて、プライマは新しい1対の相補鎖を形成するためにポリメラーゼにより伸長される。変性のためのステップ、プライマアニーリング、及びポリメラーゼ伸長は、所望の標的配列の増幅部分について高濃度のものを得るため何度も繰り返すことができる（変性、アニーリング及び伸長は一つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」があり得る）。
所望の標的配列の増幅された部分の長さは、プライマの互いの相対的位置により決まり、そのためこの長さは制御可能なパラメータである。プロセスが繰り返されるため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（polymerase chain reaction）（以下PCRという）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅部分が混合物中の主要な配列（濃度において）であるため、これらは「PCR増幅された」と言われる。
本明細書で用いる、「増幅試薬」（amplification reagent）は、プライマ、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く増幅に必要な試薬（デオキリリボヌクレオチド三リン酸、緩衝剤等）を言う。典型的には、増幅試薬は他の反応成分と共に反応容器（テスト管、ミクロウエル等）に置かれ、そして収容される。
PCRでは、ゲノムDNAにおいて特定の標的配列の単一コピーをいくつかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが可能である（例えば、標識を付したプローブとハイブリッドさせ；ビオチニル化したプライマを組み込み、続いてアビジン酵素と結合させることにより検出する；dCTP 又はdATPの様な 32P標識を付したデオキシヌクレオチド三リン酸を増幅された部分に組み込む）。ゲノムDNAの他に、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも適切なプライマ分子のセットによって増幅することができる。
特に、PCRプロセス自身により作られた増幅部分は、それ自身続くPCR増幅のための効果的な鋳型である。
本明細書で用いる、「PCR製品」（PCR product）、「PCRフラグメント」（PCR fragment）及び「増幅製品」（amplification product）は2以上のPCRの変性、アニーリング及び伸長が終了した後の結果の化合物の混合物を言う。これらの用語は一以上の標的配列の一以上の部分の増幅がある場合を含む。
本明細書で用いる、「制限エンドヌクレアーゼ」（restriction endonuclease）及び「制限酵素」（restriction enzyme）は、細菌酵素を言い、そのそれぞれが特異ヌクレオチド配列において、又はその近辺で二重鎖DNAを切断する。
本発明は、保存安定性を向上させた少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある実施の態様においては、中性金属プロテアーゼは洗浄及び他の用途に応用される。ある特に好ましい実施の態様においては、本発明はバチルス種から得られる中性金属プロテアーゼを含む方法及び組成物を提供する。ある特に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンスから得られる。更に好ましい実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼの変異体である。更に他の実施の態様においては、中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼのホモログである。本発明は特に洗浄、漂白及び殺菌を含む応用分野で用いられるがこれに限定されるものではない。
また以下の実施例において更に詳細に説明する様に、本発明は衣類、織物、医療機器等を含む広い範囲の物の洗浄において多くの利点を有するが、これに限定されるものではない。さらに、本発明は洗浄、漂白、及び殺菌において、ある範囲の洗浄温度及びpＨに渡り効果的である組成物を提供する。
通常、プロテアーゼはタンパク質のアミド結合を、ペプチド結合に水分子を添加することにより加水分解する。開裂はペプチド結合のカルボニル基で起こる。
バチルス種の様な細菌種では2種の主要な細胞外プロテアーゼが存在する、すなわち、アルカリ性又はセリンプロテアーゼ及び中性金属プロテアーゼである。
中性金属エンドペプチダーゼ（すなわち、中性金属プロテアーゼ）(EC 3.4.24.4)は、触媒活性のために亜鉛イオンを絶対的に必要とするプロテアーゼ種に属する。これらの酵素は中性pＨで最適に活動し、30 から40 kDa のサイズの範囲にある。中性金属プロテアーゼはタンパク質の構造的安定性に寄与する2乃至４のカルシウムの間を結合する。金属プロテアーゼの活性部位の結合イオンは水分子を活性にする必須の特性である。水分子は求核試薬として機能し、ペプチド結合のカルボニル基を開裂する。
中性亜鉛結合金属プロテアーゼファミリーには、カルボシキペプチダーゼA（消化酵素）及び組織再成形及び分解において反応を触媒するマトリクス金属プロテアーゼのみならず、細菌酵素サーモリシン及びサーモリシン類似のプロテアーゼ(TLP)を含む。安定性及び機能について、これらのプロテアーゼの内唯一十分特徴が分かっているものはサーモリシン及びその変異体(TLP)のみである。
事実、酵素の熱安定性を増大させるためにバチルス種中性プロテアーゼを操作することに多大の研究がなされて来た（例えば、Vriend 他、In, Tweel 他 (編集),「酵素の安定性及び安定化」（Stability and Stabilization of enzymes） Elsevier, 93-99 [1993]ページを参照）。
努力の多くは、タンパク質の自己分解を起こし、中性プロテアーゼを高温で変質させる局所的変性プロセスを防止することとなると見られる分子モデルを使用することにより同定される構造決定因子を変えることによってプロテアーゼの安定性を増すことに向けられた（例えば、van den Burg他、in Hopsu-Havu 他、(編纂), 「細胞機能におけるタンパク質分解、バチルスプロテアーゼの自己分解路の操作」（Proteolysis in Cell Functions Manipulating the Autolytic Pathway of a Bacillus Protease）Biomedical and Health Research Vol. 13, IOS Press [1997] 、576ページを参照）。
本明細書では、改良された特徴を持つ中性金属プロテアーゼを操作するための組成物及び方法が提供する。本明細書に記載の様に、自己分解を防ぐためにサーモリシンの様な他のプロテアーゼに対しカルシウムイオンの使用が報ぜられている。バチルス ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）中性プロテアーゼは、カルシウムを加えることにより自己分解及びタンパク質分解から安定的であった（Durrschmidt他、FEBS J., 272:1523-1534 [2005]参照）。
事実、本発明はその構造的安定性を維持するために、カルシウムを使用しない中性金属プロテアーゼの操作に好適な組成物及び方法を提供する。ある実施の態様においては、操作はタンパク質分解を防ぐある特定の二次構造要素中での局部的変性を防ぐ。
天然の及び操作されたプロテアーゼ、例えば、スブチリシンはしばしばバチルス種で発現され、いくつかはタンパク質性の汚れを除去する洗剤製剤に使用されている。その他のものは例えば、製パン業で用いられる（例えば、バチルスサーモプロテオリチクス（Bacillus thermoproteolyticus）からのサーモリシン；例えば、Galante及びFormantici, Curr. Organic Chem., 7, 1399-1422 [2003]を参照）。一般的に、セリンプロテアーゼは洗剤に広く利用されており、これらのプロテアーゼは比較的容易に安定化させることができるため、少なくともその部分的容易性より広く用いられている。
事実、金属プロテアーゼは産業、特に洗剤工業では多くの理由によりその使用頻度は比較的小さい。これらの酵素は、安定性及び機能を発揮するためには各々カルシウム及び亜鉛イオンを絶対的に必要とするためより複雑なタンパク質系と関係している。更に洗濯プロセスでは使用される水のみならず洗剤溶液中に、しばしば酵素によりそのイオンの結合が干渉を受け又はこれらのイオンをキレートする成分を含むため、タンパク質分解機能が低下し又は失われ及びプロテアーゼが分解される。
現在用いられている中性金属プロテアーゼ酵素システムに比べ、本発明は液状洗濯用洗剤組成物の、棚での長期の保存を容易にするために十分な安定性を持つ中性金属プロテアーゼを提供する。特に好ましい実施の態様においては、金属プロテアーゼの安定性及び活性は酵素をその不可欠な活性部位亜鉛分子により錯体化することにより保たれる。重要なことにはカルシウム及び亜鉛イオンの組合せは酵素の機能に有害な影響を与えないことである。ある実施の態様においては、安定化した中性金属プロテアーゼはバチルス アミロリケファシエンス（例えば、精製されたMULTIFECT（登録商標）Neutral; 「PMN」）から得られる野生型中性金属プロテアーゼである。他の好ましい実施の態様においては、組み換え中性金属プロテアーゼ（例えば、バチルス スブチリス(nprE)にクローンされたバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ）がある。更なる実施の態様においては、改良された安定性を持つ金属プロテアーゼは、酵素の一以上のカルシウム結合部位に対する親和性を増した酵素を含む。好ましい実施の態様においては、本発明の中性金属プロテアーゼは、通常、冷水温度、草の染み、及び/又は低いpＨ条件での使用を含み洗剤において応用することができるが、これに限定されるものではない。
本発明は洗剤の基剤及び/又は組成物において保存安定性を増すために、亜鉛結合中性金属プロテアーゼを安定化させる条件を提供する。好ましい実施の態様においては、洗剤組成物は、洗浄製剤に必須の亜鉛及び/又はカルシウムイオンを含むことにより、自己分解及び変性に対して安定的な少なくとも一つの金属プロテアーゼ（例えば、任意のバチルス中性金属プロテアーゼ）を含む。
ある特に好ましい実施の態様においては、バチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼ(PMN)、及び亜鉛イオンをカルシウムイオンより10倍の親和性で結合するバチルス スブチリス（Bacillus subtilis）(nprE)で発現される組み換え形式は本発明で用いることができる。必須の亜鉛イオンの存在下で安定化されたプロテアーゼは、イオンが存在しない場合の同じプロテアーゼに比べてタンパク質分解に対して改良された安定性を持つ。
幾つかの実験の結果では、nprEは洗剤の基剤を加えた1時間後にタンパク質分解活性をある程度（〜２０％）失うことを示したが、亜鉛イオンの存在下で32℃で培養されたnprEは塩又はカルシウムイオンを追加しないテスト条件において極めて安定していた。カルシウム及び亜鉛イオンがともに存在していても、新たな効果を生じなかった。15 mM未満の亜鉛イオン濃度での中性金属プロテアーゼはほぼ4週間に亙り十分安定的であった。したがって、本発明は洗剤成分の存在する中で中性金属プロテアーゼの保存寿命を長期化するために亜鉛の添加を含む組成物を提供する。
更に、代替的な実施の態様においては、亜鉛カチオンはCo2+, Mn2+ 又はFe2+
によって代替される。これらのイオンは全て結合し、中性金属プロテアーゼのプロテアーゼ活性を回復させることが示されたからである。しかし、Mn2+ 及びFe2+は自然の活性の全てを回復するものではないことが判明した。Co2+は最も高い活性回復パーセントを示すが、Zn2+より結合力は弱いと思われる。
亜鉛カチオンは、基質結合及び酵素触媒反応における役割を果たすことが知られており、全ての中性金属プロテアーゼの活性部位において必須の要素である（例えば、Holmquist及びVallee, J. Biol. Chem., 249:4601-4607 [1974]を参照）。中性金属プロテアーゼの亜鉛カチオンによる比較的高い親和性及びカルシウムに比べてこのイオンの親和性が約１０倍大きいことより亜鉛は安定剤として機能し、そしてその結果自己分解、タンパク質分解及び変性を防ぐと思われる。しかし、本発明は何れかの特定の機構に限定されるものではない。
本発明は工業用洗剤の生産及び開発における応用面で極めて有利な機会を提供する。多くの洗剤がタンパク質、でん粉及び油汚れの除去に対して高い特異性を持つため用いられる。特に、PMN又はEquest Grass (Warwick)上のバチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼの良好な洗濯効果は、亜鉛も含む洗剤の基剤中で本発明の中性金属プロテアーゼは改良された洗剤組成物として用いることができることを示す。
本発明の洗浄及び洗剤製剤の詳細な説明
特に断らない限り、本明細書に記載の成分又は組成物のレベルはすべて、その活性レベルに関して言うものであり、不純物、例えば、市販の商品に存在する残留溶媒又は副生物を除いたものである。
酵素成分の重量は全活性タンパク質に基づく。
全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り重量に基づき計算される。全てのパーセント及び比率は、特に示さない限り全組成物に基づき計算される。
代表的な洗剤組成物においては、酵素レベルは全組成物の重量に基づく純粋な酵素により表わされるものであり、特に断らない限り、洗剤成分は全組成物の重量により表わされる。
中性金属プロテアーゼを含む洗剤組成物
本発明の安定化された中性金属プロテアーゼは種々の洗剤組成物を処方するのに有用である。本発明の洗浄組成物は、例えば、義歯、歯、髪及び皮膚のような美容整形用のみならず、洗濯用、硬い表面の洗浄、自動皿洗い機用に有利に用いることができる。しかし、低温溶液中において効果が増大するという稀有な優位点を持ち、またその優れた色彩安全性プロフィールのために、本発明の酵素は、織物の漂白のような洗濯への応用に非常に適している。更に本発明の酵素は顆粒及び液状組成物の両方で使用することができる。本発明の酵素はまた、洗浄添加剤製品として使用することができる。本発明の少なくとも一つの酵素を含む洗浄添加剤製品は、更に追加の漂白効果を得たい場合に洗浄プロセスに含むのが特に好適である。その様な例には、低温溶液洗浄での応用を含むが、これに限定されるものではない。添加剤製品は、その単純な形としては、本発明により提供される一以上の中性金属プロテアーゼ酵素であっても良い。ある実施の態様においては、過酸化物のソースが用いられ、更に大きい漂白効果が求められる場合、添加剤は洗浄プロセスに添加するために投薬形式に梱包される。
ある実施の態様においては、単一の投薬量は、丸薬、錠剤、ゲルキャップ又は事前に計量された粉末及び液体を含む他の単一の投薬単位を含む。ある実施の態様においては、充填剤及び/又はキャリア材料は、その組成物の容量を増すために含まれる。好適な充填剤又はキャリア材料は、タルク、粘土等のみならず種々の硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、液状組成物のための充填剤及び/又はキャリア材料には、水及び/又はポリオール及びジオールを含む低分子量第一級及び/又は第二級アルコールを含む。その様なアルコールの例には、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールを含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、組成物はその様な材料を約5%から約90%含む。更なる実施の態様においては、組成物のpＨを減少させるために酸性充填剤が使用される。他の代替的な実施の態様においては、洗浄用添加剤には、以下に述べる少なくとも一つの活性過酸化物ソース及び/又は更に詳細を以下に述べる補助成分を含む。
本発明の洗浄組成物及び洗浄添加剤は、本発明で提供される効果的な量の中性金属プロテアーゼ酵素を必要とする。ある実施の態様においては、酵素の必要レベルは、本発明により提供される一以上の中性金属プロテアーゼ種の添加により達成される。典型的には、本発明の洗浄組成物は、本発明により提供される少なくとも一つの中性金属プロテアーゼを、少なくとも0.0001 重量%, 約0.0001 から約1, 約0.001 から約0.5, 又は更には約0.01から約0.1重量%含む。
ある好ましい実施の態様においては、本発明が提供する洗浄組成物は典型的には、水を使用する洗浄作業において、洗浄水は約5.0から約11.5のｐH、又は他の実施の態様においては、更には約6.0 から約0.5のｐHである様に製剤される。ある好ましい実施の態様においては、液状製品製剤は、典型的には純度約 3.0から約9.0のｐHを持ち、他の実施の態様においては、純度約3から約5のｐHを持つ。ある好ましい実施の態様においては、顆粒状の洗濯用製品は、典型的には約8から約11のｐHを持つ様製剤される。推奨される使用レベルにｐHを制御する技術には、緩衝液、アルカリ、酸等を用いることを含み、これらは当業者に周知である。
ある特に好ましい実施の態様においては、少なくとも一つの中性金属プロテアーゼが顆粒状組成物又は液状で使用される場合、中性金属プロテアーゼは、保存中に顆粒組成物の他の成分から酵素を保護するためにカプセルに収めた粒子の形をとる。更に、カプセルに収めることは、洗浄プロセスの間に中性金属プロテアーゼの使用を制御する方法を提供し、中性金属プロテアーゼの効果を高める。本発明のカプセルに収められた中性金属プロテアーゼは種々の場面設定下で用いることができることを想定している。また、中性金属プロテアーゼは既知の任意の好適なカプセル化材料及びそのための方法によりカプセル化することが意図されている。
ある好ましい実施の態様においては、カプセル化材料は典型的には、中性金属プロテアーゼ触媒の少なくとも一部をカプセル化する。ある実施の態様においては、カプセル化材料は水溶性であり及び/又は水分散性を持つ。ある更なる実施の態様においては、カプセル化材料は0℃以上のガラス転移温度（Tg）を持つ（例えば、ガラス転移温度についてのより詳細な情報については、WO 97/11151, 特に6ページ, 25 行から7ページ、2行を参照,）。
ある実施の態様においては、カプセル化材料は炭水化物、天然又は合成ゴム糊、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。カプセル化材料が炭水化物である、ある実施の態様においては、それは単糖類、オリゴ糖、多糖類及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される。ある好ましい実施の態様においては、カプセル化材料はでん粉である（例えば、幾つかの代表的な好適なでん粉についてはEP 0 922 499; 米国特許第4,977,252号、米国特許第5,354,559号, 及び米国特許第5,935,826号を参照）。
更なる実施の態様においては、カプセル化材料はプラスチックからなるミクロスフェアを含む（例えば、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物；市販されているもので利用可能なミクロスフェアには、EXPANCEL（登録商標）[Casco Products, Stockholm, Sweden], PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES（登録商標）, 及びQ-CEL（登録商標） [PQ Corp., Valley Forge, PA], LUXSIL （登録商標）及び SPHERICELl（登録商標） [Potters Industries, Inc., Carlstadt, NJ 及びValley Forge, PA]）を含むがこれに限定されるものではない）。
出願人の洗浄用組成物を生成及び使用するプロセス
ある好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄用組成物は製剤者によって選択される任意のプロセスによって任意の好適な形に製剤されまた調整される（例えば、米国特許第 5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第 5,574,005号、米国特許第 5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第. 5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第 5,486,303号を参照願いたいが、これらに限定されるものではない）。低pＨ洗浄用組成物が望まれるある実施の態様においては、その様な組成物のpＨはHCLのような酸性材料を添加することにより調整される。
補助材料
本発明の目的との関係では必須ではないが、ある実施の態様においては、本明細書に記載の補助材料の例の一部を挙げることが本発明の洗浄用組成物を使用するために適当である。事実、ある実施の態様においては、補助材料は本発明の洗浄用組成物に組み入れられる。ある実施の態様においては、補助材料は洗浄を助けその機能を向上させ、洗浄される基質を処理し及び/又は洗浄用組成物の美観を整える（例えば、香水、顔料、染料等）。その様な補助剤は本発明の中性金属プロテアーゼに添加されると了解される。これらの添加成分の厳密な性質及び組み入れられるレベルは、組成物の物理的形式及び/又はそれが用いられる洗浄作業の性質による。好適な補助材料には、界面活性剤、ビルダー、キレート材、染料移動抑制剤、堆積助剤、分散剤、追加酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白推進剤、過酸化水素、過酸化水素のソース、事前生成過酸、ポリマー系分散剤、粘土質土壌/再堆積防止剤、光沢剤、泡抑制剤、染料、香水、構造弾力付与剤、織物柔軟剤、キャリアー、可水溶剤（hydrotrope）、プロセス補助剤及び/又は色素を含むが、これに限定されるものではない。本明細書に明記されているものの他、更なる例は当業者に知られている（例えば、米国特許第5,576,282号, 米国特許第6,306,812号Bl 及び米国特許第6,326,348号Blを参照）。
ある実施の態様においては、前記の補助剤の成分は本発明の洗浄組成物のバランス部分を構成する。
界面活性剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの界面活性剤又は界面活性剤システムを含み、前記界面活性剤はノンイオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極性ノンイオン性活性剤、及びこれらの混合物から選択される。
ある低pＨ洗浄組成物の実施の態様（例えば、約３から約５の純度のpＨの組成物）においては、界面活性剤はその様なその組成物中の酸含有物により加水分解されると信じられているため、その組成物は典型的にはアルキルエトキシ硫酸塩を含まない。
ある実施の態様においては、界面活性剤は、洗浄組成物の重量に基づき約０．１％から約６０％のレベルで存在し、他の実施の態様においては約１％から約５０％のレベルで存在し、更に他の実施の態様においては約５％から約４０％のレベルで存在する。
原材料（ビルダー（builder））
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の洗剤原材料（builder）又は原材料システムを含む。少なくとも一つの原材料を組み入れるある実施の態様においては、洗剤組成物は、洗浄組成物の重量に基づき、少なくとも約１％、約３から約６０％の又は更に約５から約４０％の原材料を含む。
原材料（ビルダー）は、アルカリ金属、アンモニア及びポリリン酸塩のアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩原材料ポリカルボン酸塩化合物、ヒドロキシカルボン酸塩エーテル、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルのコポリマー、1, 3, 5-トリヒドロキシ ベンゼン−2, 4, 6-トリスルホン酸及びカルボキシメチルオキシスルホン酸及び種々のアルカリ金属、エチレンジアミンテトラ酢酸及びニトリロトリ酢酸の様なポリ酢酸のアンモニア又は置換アンモニア塩、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、1,3,5-カルボン酸ベンゼン、カルボキシメチルオキシコハク酸及びそれらの可溶塩を含むがこれに限定されるものではない。事実、本発明の種々の実施の態様においては、任意の好適な原材料（ビルダー）が使用されることが想定される。
キレート剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つのキレート剤を含む。好適なキレート剤は、銅、鉄及び/又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。少なくとも一つのキレート剤が使用される実施の態様においては、本発明のキレート組成物は、主題となっているキレート組成物の重量に基づき、約０．１％から約１５％の、又は更に約3.0%から約１０％のキレート剤を含む。
沈殿助剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの沈殿助剤を含む。好適な沈殿助剤には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸の様な汚れ遊離ポリマー、カオリナイト、モントモリオナイト、アタプルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトのような粘土及びこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。
染料移動抑制剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は、一以上の染料移動抑制剤を含む。好適な重合体染料移動抑制剤には、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミン Ｎ−酸化物ポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾール、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾールのコポリマー又はこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。
少なくとも一つの染料移動抑制剤が使用される実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は、洗浄組成物の重量に基づき、約0.0001%から約10％、約0.01%から約5％、又は更に約0.1から約3％含む。
分散剤
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は少なくとも一つの分散剤を含む。好適な水溶性有機材料は、ホモ又は共重合酸又はその塩を含むがこれに限定されるものではなく、その場合ポリカルボン酸は、2を超えない原子で互いに分離されている少なくとも2つのカルボキシル ラジカルを含む。
酵素
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は洗浄機能及び/又は織物へのケアーを提供する一以上の洗剤酵素を含む。好適な酵素の例には、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β―グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ又はこれらの混合物を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、酵素の組み合わせ（すなわち、カクテル）が使用され、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び/又はセルラーゼの様な従来使用される酵素を含む組み合わせがアミラーゼと共に使用される。
酵素安定剤
本発明のある実施の態様においては、本発明の洗剤の製剤に用いられる酵素は安定化される。酵素の安定化のための種々の技術が本発明で用いられることが予定される。例えば、ある実施の態様においては、本発明で用いられる酵素は、その様なイオンを酵素に提供する最終組成物中に水溶性亜鉛（ＩＩ），カルシウム（ＩＩ）及び/又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、及び/他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ），スカンジウム（ＩＩ），鉄（ＩＩ），マグネシウム（ＩＩ），アルミニウム（ＩＩＩ），スズ（ＩＩ），コバルト（ＩＩ），銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ），及びオキソバナジウム（ＩＶ）のソースの存在により安定化する。
触媒金属複合体
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は一以上の触媒金属複合体を含む。ある実施の態様においては、金属含有漂白触媒を用いることができる。ある好ましい実施の態様においては、金属含有漂白触媒は規定の漂白触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をほとんど又は全く持たない補助的金属カチオン（例えば、亜鉛、アルミニウムカチオン）及び触媒及び補助的金属カチオンの規定された安定係数を持つセクエストレート（sequestrate）を含む触媒システムを含む。特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びそれらの可水溶塩が用いられる（例えば、米国特許第4,430,243号を参照）。
ある実施の態様においては、本発明の洗浄組成物はマンガン化合物により触媒される。その様な化合物及び使用のレベルは周知である（例えば、米国特許第5,576,282号を参照）。
更なる実施の態様においては、コバルト漂白触媒を本発明の洗浄組成物に用いることができる。種々のコバルト漂白触媒が知られている（例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照)。その様なコバルト触媒は既知の手順で容易に生成される（例えば、米国特許第5,597,936号及び第5,595,967号を参照）。
更なる実施の態様においては、本発明の洗浄組成物はマクロ多還式硬リガンド（ＭＲＬ）の遷移金属複合体を含む。限定する意味ではなく、実際の問題としある実施の態様においては、本発明により提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗濯媒体中で、活性を持つＭＲＬ種を１００ミルあたり少なくとも１のオーダーで提供する様に調整され、ある好ましい実施の態様においては、洗濯液中で約0.005 ppmから約25ppm、より好ましくは約0.05 ppmから約10ppm、最も好ましくは約0.1ppmから約5ppmのＭＲＬを提供する。
容易に手に入る遷移金属漂白触媒の好ましい遷移金属はマンガン、鉄、及びクロムを含むが、これに限定されるものではない。好ましいＭＲＬはまた、交差結合している特別な超硬度リガンド(例えば、5,12-ジエチル-l,5,8,12-テトラアザビシクロ [6.6.2]ヘキサデカン)を含むがこれに限定されるものではない。好適な遷移金属ＭＲＬは既知の手順により容易に生成される（例えば、WO 00/32601, 及び米国特許第6,225,464号)を参照。
洗浄組成物の生成及び使用プロセス
本発明の洗浄組成物は製剤者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形に製剤され、生成される（例えば、米国特許第5,879,584号、米国特許第5,691,297号、米国特許第5,574,005号、米国特許第5,569,645号、米国特許第5,565,422号、米国特許第5,516,448号、米国特許第5,489,392号、米国特許第5,486,303号、米国特許第4,515,705号、米国特許第4,537,706号、米国特許第4,515,707号、米国特許第4,550,862号、米国特許第4,561,998号、米国特許第4,597,898号、米国特許第4,968,451号、米国特許第5,565,145号、米国特許第5,929,022号、米国特許第6,294,514号、及び米国特許第6,376,445,を参照。これらの引用文献は参照により本明細書に組み入れられる）。
使用方法
好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は表面及び/又は織物の洗浄に使用できる。ある実施の態様においては、表面及び/又は織物の少なくとも一部は、本発明の洗浄組成物の少なくとも一つの実施の態様で示すものと純粋な形又は水で希釈された形で接触させ、そして表面及び/又は織物は任意選択的に洗濯され及び/又は濯がれる。本発明の目的との関係においては、「洗濯」（washing）には、手洗い、及び機械的攪拌を含むがこれに限定されるものではない。
ある実施の態様においては、織物には、通常の消費者の使用条件で洗濯することのできる織物を含む。ある好ましい実施の態様においては、本発明の洗浄組成物は溶液中で約５００ppmから約１５００ppmの濃度で使用される。洗濯液が水である場合のある実施の態様においては、水の温度は通常約5℃から約90℃である。織物洗浄でのある好ましい実施の態様においては、水と織物の質量比は通常約１：１から約３０：１である。
実験
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施の態様及び特徴を示し、更に説明するものであるが、これらは本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
以下に開示される実験においては、以下の略称が使用される：
℃（摂氏度）；ｒｐｍ（分当り回転数）；Ｈ２Ｏ（水）；ＨＣＬ（塩酸）；aa及びAA（アミノ酸）；ｂｐ（塩基ペア）；ｋｂ（キロベースペア）；ｋＤ（キロダルトン）ｇｍ（グラム）；μｇ及びuｇ（ミクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；nｇ（ナノグラム）；μｌ及びυｌ（ミクロリットル）；ml (ミリリットル); mm (ミリメータ); nm (ナノメータ); μm 及び um (ミクロメータ); M (モルの); mM (ミリモルの); μM及び uM (ミクロモルの); U (単位); V (ボルト); MW (分子量); sec (秒); min(s) (分); hr(s) (時間); MgCl2 (塩化マグネシウム); NaCl (塩化ナトリウム); OD280 (280 nmの光学濃度); OD405 (405 nmの光学濃度); OD600 (600 nmの光学濃度); PAGE (ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法); EtOH (エタノール); PBS (リン酸緩衝生理食塩水 [150 mM NaCl, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2]); LAS (ラウリル硫酸ナトリウム); SDS (ドデシル硫酸ナトリウム); Tris (トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン); TAED (N,N,N'N'-テトラアセチルエチレンジアミン); BES (スルホンポリエステル); MES (2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl2 (無水塩化カルシウム; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); DMF (N,N-ジメチルフォルムアミド, f.w. 73.09, d = 0.95); Abz-AGLA-Nba (2-アイノベンゾイル-L- アラニルグリシル-L-ロイシル-L-アラニノ-4-ニトロベンジルアミド, f.w. 583.65; Bachem # H-6675, VWR catalog # 100040-598); SBGl % ("Super Broth with Glucose"; 6 g Soytone [Difco], 3 g イースト抽出、6 g NaCl, 6 g グルコース)；pHは、技術分野で知れらている方法を用いて殺菌前にNaOHによって７．１に調整された；w/v (重量対容積); v/v (容積体容積); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ); SEQUEST（登録商標） (SEQUEST データベースサーチプログラム、, University of Washington); Npr及びnpr (中性金属プロテアーゼ遺伝子); nprE 及びNprE (バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ); PMN (精製されたMULTIFECT（登録商標）金属プロテアーゼ); MS (質量分光法); SRI (汚れ除去指数); TIGR (ゲノム調査機構（The Institute for Genomic Research）, Rockville, MD); AATCC (米国繊維化学者・色彩技術者協会（American Association of Textile and Coloring Chemists)）; Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL); Corning (Corning International, Corning, NY); ICN (ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Equest (Equest, Warwick International Group, Inc., Flintshire, UK); EMPA (スイス材料検査及び試験協会（Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt）, St. Gallen, Switzerland); CFT (材料試験センター（Center for Test Materials）、Vlaardingen, The Netherlands); Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA); ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ); Perkin-Elmer (Perkin-Elmer, Wellesley, MA); Rainin (Rainin Instrument, LLC, Wobura, MA); Eppendorf (Eppendorf AG, Hamburg, Germany); Waters (Waters, Inc., MiIf ord, MA); Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Germany); Perseptive Biosystems (Perseptive Biosystems, Ramsey, MN); Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, OR); BioRad (BioRad, Richmond, CA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Cargill (Cargill, Inc., Minneapolis, MN); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); GIBCO BRL 又はGibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Inc., Edison, NJ); Thermoelectron (Thermoelectron Corp., Waltham, MA); BMG (BMG Labtech, GmbH, Offenburg, Germany);Greiner (Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austria); Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI); Novex (Novex, San Diego, CA); Finnzymes (Finnzymes OY, Finland) Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); DuPont Instruments (Asheville, NY); Global Medical Instrumentation or GMI (Global Medical Instrumentation; Ramsey, MN); MJ Research (MJ Research, Waltham, MA); Infprs (Infors AG, Bottmingen, Switzerland); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ); Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA); S-Matrix (S-Matrix Corp., Eureka, CA); US Testing (United States Testing Co., Hoboken, NY); West Coast Analytical Services (West Coast Analytical Services, Inc., Santa Fe Springs, CA); Ion Beam Analysis Laboratory (Ion Bean Analysis Laboratory, The University of Surrey Ion Beam Centre (Guildford, UK); TOM (Terg-o-Meter); BMI (blood, milk, ink); BaChem (BaChem AG, Bubendorf, Switzerland); Molecular Devices (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA); Corning (Corning International, Corning, NY); MicroCal (Microcal, Inc., Northhampton, MA); Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canada); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Argo Bioanalytica (Argo Bioanalytica. Inc, New Jersey); Vydac (Grace Vydac, Hesperia, CA); Minolta (Konica Minolta, Ramsey, NJ); 及び Zeiss (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)。
これらの実験において、反応の完了後に形成された製品の吸光度を測定するために分光光度計が使用された。材料見本の反射率を測定するために反射率計が使用された。特に断らない限り、タンパク質濃度はＢＳＡを標準としてCoomassie Plus (Pierce)により推定した。
以下に記す実施例では次のアッセイを用いた。
Ａ．９６ウエルマイクロタイタープレート（Microtiter Plates (MTP)）でのタンパク質含有決定Bradfordアッセイ
これらのアッセイでは、ＭＴＰスケール上でNprEプロテアーゼサンプル中のタンパク質濃度の決定にBradford染色試薬（Quick Start）アッセイが用いられた。このアッセイシステムでは使用された化学試薬及び溶液は：
Quick Start Bradford 染料試薬 BIO-RAD, #500-0205
希釈緩衝液 10mM NaCl, 0.lmM CaC12, 0.005% TWEEN(登録商標)-80
であった。
使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman) 及びSpectraMAX (type 340) MTP リーダーであり、MTPはCostar (type 9017)製であった。
テストでは、200 μl Bradford 染色試薬が各ウエルにピペットで入れられ、続いて15 μl希釈緩衝液が加えられた。最後に、ろ過された培養ブロス10μlがウエルに加えられた。十分攪拌後にＭＴＰは室温で少なくとも10分培養された。発生する空気の泡が吹き払われ、各ウエルのＯＤは５９５nｍと計測された。
タンパク質濃度を決定するため、このサンプルの計測数値よりノイズ数値（すなわち、予防接種されていないウエルから）が差し引かれた。得られたOD595値はサンプル中のタンパク質含有量の相対的測定値を提供する。
0から5 μgの間のNprE校正ラインが線形であることは、OD595値をタンパク質含有量の相対値として使用することを可能にした。浮遊物中の予想NprE含有量は200-300 μg/mlであるので、テストで使用されたl0μlサンプル容積は5 μgより小さいタンパク質を含み線条の範囲にある数値を示す。
Ｂ.プロテアーゼ機能をテストするためのミクロ材料見本
このアッセイで使用した洗剤は酵素を含んでいなかった。使用した機器はBiomek FX Robot (Beckman)及びSpectraMAX (type 340) MTPリーダーで、MTPはCostar (type 9017)製であった。
洗剤の調製（冷水液洗剤； 米国の条件）
Milli-Q水が6 gpgの硬度(Ca/Mg=3/1)に調製され、0.78 g/1 TIDE（登録商標） 2007-2x洗剤が加えられた。洗剤溶液は少なくとも15分強く攪拌された。その後5 mM HEPES（遊離酸）が加えられ、ｐＨが８．２に調整された。
ミクロ材料見本
1/4”円状直径のミクロ材料見本がCFTから得られた。材料見本を切断する前に、織物(EMPA 116)が水で洗濯された。2つのミクロ材料見本が各９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに垂直に置かれ、全表面面積が露出された（すなわち、ウエルの底に平たく置くのではなく）。
テスト方法
培養器は20℃に設定された。ろ過された培養ブロス見本は10 mM NaCl, 0.1 mM CaC12 及び0.005% TWEEN（登録商標）-80溶液の混合物により希釈され適当な濃度でテストされた。所望の洗剤溶液が上に述べた様に生成された。その後、190 μlの洗剤溶液がミクロ材料見本を含むＭＴＰの各ウエルに加えられた。この混合物に10 μlの希釈酵素溶液が添加された（全体の容積を200 μl/ウエルとした）。ＭＴＰはテープでシールされ培養器に30分間置かれ、１４００ｒｐｍで攪拌された。適当な条件下で培養するのに続いて、各ウエルから100 μlの溶液が採られ新たなＭＴＰに置かれた。新しいMTPを含む各ウエル100 μlの溶液はＭＴＰリーダー中で４５０nmで読み取られた。２つのミクロ材料見本及び洗剤を含むが酵素を含まない実験対照（コントロール）及び何も含まない対照も含まれた。
ＢＭＩ効果の算出
得られた吸光度は空試験値（すなわち、酵素の存在しない場合でのミクロ材料見本を培養したものについて得た）に対比し修正された。得られた吸光度は、加水分解活性を測定するものであった。各見本（例えば、nprE 又は変異体）に付き効果指数が算出された。効果指数は、同じタンパク質濃度で、変異体の効果（実際値）及び標準酵素（理論値）と比較された。更に、標準酵素のLangmuir等式のパラメータを用いて値論値が計算された。１より大きい効果指数（performance index (PI) ）(PI>1)は（標準（例えば、野生型）と比べて）良い変異体を示し、１のPIを持つもの(PI=I)は標準と同じ効果を持つ変異体、そして１より小さいPI (PI<1) は標準より効果が劣る変異体である。したがって、PIは勝者、ならびにある条件下で使用するのにはより好ましくない変異体を同定した。
Ｃ．NprEプロテアーゼのクエン酸塩安定性アッセイ
クエン酸塩に対する安定性が、５０mMクエン酸中で野生型NprE及び変異体を培養後測定された。当初及び残存活性がＤＭＣ加水分解アッセイを用いて決定された。このアッセイシステムでは使用された化学品及び試薬溶液は次の通りである：
Figure 0005507843
これらの希釈緩衝液の濃度は最終濃度として示す。当初濃度は比例的により高く、希釈率による。他の実験例では、HEPESはTrisに変えて使用可能である。使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman), 及び培養器/攪拌器 (Innova, type 4230; New Brunswick)であった。PIPES緩衝液は4 N HCl (最終濃度、55 mM)によりｐＨ５．８に調整された。Tris緩衝液は4 N HCl (最終濃度、25 mM)によりｐＨ８．２に調整された。50 mM クエン酸/25 mM Tris緩衝液は4 N NaOHによりｐＨ８．２に調整された。HEPES緩衝液は4 N HCl (最終濃度、25 mM) によりｐＨ８．２に調整された。50 mM クエン酸/25 mM HEPES緩衝液は4 N NaOHによりｐＨ８．２に調整された。
タンパク質の決定
クエン酸安定アッセイにおいて所望の希釈度を決定するために、各プレートの野生型NprE対照（コントロール）のプロテアーゼ濃度がTCAアッセイで決定された。この方法では、25 μlのろ過された培養ブロスが200 μl 16.875% (w/v) TCAに加えられた。大気温度で１０から１５分培養された後、４０５nmで光散乱/吸光度が決定された。タンパク質濃度は精製されたNprEで構築された校正線を用いて決定された。
テスト方法
ろ過された培養ブロスの希釈率が、上に述べたTCAアッセイを用いて決定された。
ストレス付加条件
ろ過された培養ブロスが希釈液２で希釈された。ＭＴＰはテープで覆われ、数秒振動させ、培養器中に25℃で60分間２００ｒｐｍで置かれた。培養の後、20μlの混合物が各ウエルから採られ、180 μlの 1 % DMCの予熱された基質（基質は25℃で予熱された）を含む新たなＭＴＰに移された。ＭＴＰは直接培養器/振とう器に置かれ、25℃で３0分間、２００ｒｐｍで攪拌しつつ培養された。残留プロテアーゼ活性は、以下に述べる様に、ジメチルカゼイン加水分解アッセイを用いて決定された。
ストレスを付加しない条件
ろ過された培養ブロスが希釈液１で希釈された。直ちに20μlの混合物が各ウエルから採られ、180 μlの 1 % DMC予熱された基質（基質は25℃で予熱された）を含む新たなＭＴＰに移された。ＭＴＰは直接培養器/振とう器に置かれ、25℃で３0分間、２００ｒｐｍで攪拌しつつ培養された。残留プロテアーゼ活性は、以下に述べる様に、ジメチルカゼイン加水分解アッセイを用いてＴＮＢＳにより決定された。
全ての残留活性値（ジメチルカゼイン加水分解により決定）は以下の式を用いて算出した。
% 残留活性 = OD6omin 値 * 100/OD00min値
Ｄ．ジメチルカゼイン加水分解アッセイ
このアッセイシステムでは、以下の化学品及び試薬溶液が使用された：
Figure 0005507843
方法
基質を生成するために、４ｇジメチルガゼインが400 ml PIPES緩衝液に溶解された。ろ過された培養浮遊物はPIPES緩衝液により希釈された。その後、各10 μlの希釈浮遊物がウエルのMTP中の200 μl基質に加えられた。ＭＴＰはテープで覆われ、数秒振動され、そいて攪拌されることなく25℃の炉に30分置かれた。
炉から第一のプレートが除去される約15分前にTNBS試薬が、50 mlの試薬A当り1 ml TNBSを混合して生成された。ＭＴＰはウエルごとに60 μl TNBS 試薬Aで満たされた。培養されたプレートは数秒振動され、その後10 μlがTNBS 試薬Aと共にＭＴＰに移された。プレートはテープで覆われ、20分間ベンチ振とう器（BMG Thermoster）により、室温及び５００ｒｐｍで振動された。最後に200 μl試薬Bがウエルに加えられ、振とう器で1分混合され、４０５nmでＭＴＰリーダーを用いて吸光度が決定された。得られた吸光度数は空試験値と対比し訂正された（すなわち、酵素なしの基質）。得られた吸光度は加水分解活性の指標となった。見本の（任意）特異活性が吸光度及び決定されたタンパク質濃度を除して算出された。
Ｅ.TIDE（登録商標）安定性アッセイ
NprE及び変異体の安定性は、25% TIDE（登録商標）コンパクト洗剤の存在下で培養ステップの後に測定された。当初活性及び残留活性は、以下に述べるAGLA-アッセイを用いて決定された。使用された機器はBiomek FX Robot (Beckman), 蛍光メータ(FLUOstar Optima; BMG)、培養器/攪拌器(iEMS; Thermoelectron) 及び培養器/振とう器(Innova; New Brunswick (type 4230))；
ＭＴＰはCostar (type 9017) 製及びGreiner (black plates, type 655076)製であった。
化学品及び試薬：
このアッセイシステムでは、以下の化学品及び試薬を用いた：
Figure 0005507843
試験方法
ストレス無負荷条件
まず、20 μlのろ過培養ブロスが180 μl MES希釈緩衝液により希釈された。その後、この20 μl希釈ブロスは180 μl MES希釈緩衝液により希釈された。その後10 μlのこの希釈液は25°Cで予備加熱された190 μl AGLA基質溶液で希釈された。全ての空気の泡が飛ばされ、プレートはAGLAプロテアーゼアッセイ手順に従い測定された。
ストレス負荷条件
まず、20 μlのろ過培養ブロスが、DTPA を含まない180 μl TIDE（登録商標）コンパクト洗剤溶液により希釈され、iEMS 振とう器で5分事前混合された後に更にInnova振とう器で培養された。プレートは32℃、２００ｒｐｍで合計60分培養された。更に20 μ]のろ過された培養ブロスはDTPA を含む1 80 μl TIDE（登録商標）コンパクト洗剤溶液により希釈され、iEMS振とう器で5分事前混合された後に更にInnova振とう器で培養された。プレートは20℃、200rpmで全40分培養された。更に20 μlのこれらの何れの溶液も180 μl MES希釈緩衝液により希釈され、及び10 μlのこの溶液は190 μl AGLA基質溶液により、25℃に事前加熱されたプレートで希釈された。
全ての空気の泡が飛ばされプレートはAGLAプロテアーゼアッセイ手順に従い測定された。
計算
蛍光測定が励起350 nm 及び発光415 nmで行われた。蛍光分光計のソフトが各ウエルの蛍光の反応増加率をミリ-RFU /分の直線回帰線に従い計算した：
残留活性のパーセント：（ストレス負荷条件の傾き）＊１００/ストレス無負荷条件の傾き）
Ｆ．2−アミノベンゾイル−Ｌ−アラニルグリシル−Ｌ−ロイシル-L-アラニノ−4−ニトロベンジルアミド プロテアーゼ アッセイ(Abz-AGLA-Nba)
(2-Aminobenzoyl-L-alanylglycyI-L-leucyI-L-alanino-4-nitrobenzyIaπiide Protease Assay (Abz-AGLA-Nba))
以下に記載の方法は、時間及び場所に関わりなく再生可能なプロテアーゼアッセイデータを産み出すあるレベルの技術的詳細を提供する。アッセイはある与えられた実験室条件に適合しうるが、改変された手順により得られるデータは全て元の方法により作り出される結果と調整されねば成らない。中性金属プロテーゼは２−アミノベンゾイル−L−アラニルグリシル−Ｌ−ロイシル-L-アラニノ−4−ニトロベンジルアミド （2-aminobenzoyl-L-alanylglycyI-L-leucyI-L-alanino-4-nitrobenzyIaπiide）(Abz-AGLA-Nba)）のグリシン及びロイシンの間のペプチド結合を開裂する。
溶液中の自由−2−アミノベンゾイル−Ｌ−アラニルグリシル（2-aminobenzoyl-L- alanylglycyI(Abz-AG)）は最大３４０nmで励起されて最大４１５nmの蛍光発光をする。Abz-AGの蛍光は原型のAbz-AGLA-Nba分子中でニトロベンジルアミドにより急却される。これらの実験では、Abz-AGLA-Nbaのプロテアーゼ開裂によるAbz-AGの解放は蛍光分光法（励起340 / 発光415)によりモニターされた。Abz-AGの出現速度はタンパク質分解活性の目安となる。アッセイは非基質限定初期速度条件で実施された。
温度制御付きのマイクロプレートミキサー（例えば、Eppendorf サーモミキサー）が再現可能なアッセイ結果のために必要であった。アッセイ溶液が、酵素の添加前にマイクロプレートミキサー中で所望の温度（例えば、25℃）に培養された。酵素溶液がミキサー中のプレートに加えられ、強く混合され迅速にプレートリーダに移された。
連続してデータを記録し、線形回帰分析及び温度制御の可能な蛍光分光計が必要であった（例えば、SpectraMax M5, Gemini EM, Molecular Devices）。リーダー（reader）は常に所望の温度に維持された（例えば、25℃）。リーダーは最高感度（top-read）の蛍光検出に設定され、カットオフフィルターを使用しないで励起は３５０nm及び発光は４１５nmに設定された。ＰＭＴは中程度の感度及び各ウエルに付き５つの読出しに設定した。最初の読出し前の校正をするためにだけ自動校正装置が作動された。アッセイはモニター用に選択されたウエルの数に応じて最小の読出し間隔で3分間測定された。リーダーはミリ-RFU/分 (分当り1000分の〜の相対蛍光単位)の比率を計算するように設定された。比率（Ｖmax ポイント）の計算に使用される読出し数は、読出し間隔により決定される様に（例えば、10秒ごとに読み出すことは、比率を計算するために12ポイントを使用する）2分に等しい数に設定された。最大RFUは50,000と設定された。
酵素及び基質原液のピペットによる採取は容積式ピペット(Rainin Microman)により行われた。緩衝液、アッセイ及び酵素標準希釈溶液が単一又は複数チャンネル排気ポンプによりチューブ、試薬貯蔵庫、又はストックマイクロプレートからピペット採取された。リピーターピペット(Eppendorf)は、試薬のロスを最小に留めるためウエルが少ない場合にアッセイ溶液をマイクロプレートウエルに移す場合に使用される。Beckman FX又はCybio Cybi-ウエルの様な自動化されたピペット装置は、全てのマイクロプレートを同時に開始するために、通常在庫マイクロプレートから酵素溶液をアッセイマイクロプレートに移す場合に使用される。
試薬及び溶液
52.6 mM MES/NaOH, 2.6 niM CaCl2, pH 6.5 − MES緩衝液
MES酸(10.28 g) 及び292 mg 無水CaCl2が約900mLの純水に溶解された。液はNaOHでpH 6.5まで滴定された（25℃又は温度調節ｐＨプローブにより）。ｐＨ調整された緩衝液は全容量が1Lとされた。最終溶液は0.22 μm殺菌フィルターでろ過され、室温に保たれた。
DMF 中の48 mM Abz-AGLA-Nba - Abz-AGLA-Nba原液
約28ｍｇのAbz-AGLA-Nbaが小さいチューブに入れられた。そして１mLのDMFに溶解され（容量は集められたAbz-AGLA-Nbaにより変わる）そして数分間ボルテックスされた。液は光から遮蔽され室温で保存された。
50 mM MES, 2.5 mM CaCl2, 5% DMF, 2.4 ｍM Abz-AGLA-Nba pH 6.5 -
アッセイ溶液
１mL mL Abz-AGLA-Nba原液が19 mL MES緩衝液に加えられボルテックスされた。液は光から遮蔽され室温で保存された。
50 mM MES, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5 −酵素希釈緩衝液
この緩衝液は95 mL MES緩衝液に5 mL純水を添加して生成された。
50 mM MES, 2.5 mM CaCl2, 5% DMF, pH 6.5 -基質希釈緩衝液
５mL 純粋DMFが95 mL MES緩衝液に加えられた。この緩衝液は動的パラメータを決定するために用いられた。
酵素溶液
酵素原液が酵素希釈緩衝液により約１ppm(1 ug/mL)の濃度に希釈された。
MULTTFECT（登録商標）中性プロテアーゼ（野生型NprE)が6 ppm (6 ug/mL)未満の濃度に希釈された。連続希釈が好ましい。溶液は室温で1時間安定であったが、より長時間の保存では、溶液は冷却された。
手順
まず全ての緩衝液、原液、及び希釈標準溶液が準備された。断らない限り、各酵素希釈液は3度アッセイされた。完全に一杯になっていない場合は、酵素希釈標準溶液原液マイクロプレートがプレートの左から始めて、一杯となった垂直カラム中に配置された（プレートリーダを収容する様に）。対応するアッセイプレートが同様に設定された。マイクロプレート蛍光分光計が先に述べた様に設定された。まず、200 uLのアッセイ溶液が９６ウエルマイクロプレートのウエルに置かれた。プレートは、光から遮蔽された、温度制御されたマイクロプレートミキサー中で25℃で10分間培養された。アッセイは原液マイクロプレートから10 uLの希釈標準溶液をミキサー中のアッセイマイクロプレートに移すことにより開始された。最も好ましくは、９６ウエルピペット ヘッドが使用されるのが良く、又は８ウエル多チャンネルピペットが最も左のカラムから移すのに使用された。溶液は１５秒強く混合された(Eppendorf Thermomixer中で900rpm)。直ちにアッセイマイクロプレートがマイクロプレート蛍光分光計に移され、励起３５０nm及び発光４１５nmで蛍光測定の記録が始められた。蛍光分光計ソフトは各ウエルの蛍光の増加の反応速度をミリRFU / 分（milli-RFU /分）の直線回帰線に対して計算した。ある実施の態様においては、第一のプレートが読み出されている間に、第二のプレートが温度平衡のために、マイクロプレートミキサーに置かれた。
初速度は製品濃度に関して、0.3mM製品まで直線であり（すなわち、解放）された２−アミノベンゾイル 蛍光）、これは約22,000 RFUのバックグラウンド蛍光を持つ2.3mM Abz-AGLA-Nbaから始めた溶液中で約50,000 RFUに対応する。Abz-AGLA-NbaはＤＭＦ中で溶解され、準備された日に使用された。
洗剤組成物
代表的な洗剤組成物では、酵素レベルは全組成物の重量による純粋酵素により表わされ、断らない限り洗剤成分は全組成物の重量により表わされる。略記による成分表記の意味は以下の通りである：
Figure 0005507843
Figure 0005507843
Figure 0005507843
実施例１
バチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼ遺伝子のクロニング
この実施例では、バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼ遺伝子をクローンする方法について述べる。遺伝子をコードする中性金属プロテアーゼは、その技術分野で確立された方法を用いてバチルス アミロリケファシエンスからクローンされた。除外されない（すなわち、株は遺伝子外DNAを持ち（免除された株において認められるクロラムフェニコールにより選択可能なマーカーに加えて）、特にプラスミドpJM102配列を持つ）BC91504株(BG3594::comK中のaprE/nprE-pJM102)はバチルス スブチリスaprEプロモータ及びバチルス アミロリケファシエンスnprEプロペプチド/ pJM102プラスミドを統合する場合の成熟遺伝子に融合されるシグナル配列を持つ。
バチルス スブチリス及びバチルス アミロリケファシエンスの以下の二つの配列（配列番号１及び配列番号２）は下線を付した配列に対応するオリゴヌクレオチド プライマーによりPCRによって生成された。
バチルス スブチリス染色体EcoRI制限部位(GAATTC)及びaprE 開始コドン (GTG)及びバチルス アミロリケファシエンスnprEストップコドン、並びにプライマー＃４中にデザインされた、合成により導入されたHindIII制限部位(AAGCTT) は以下の配列中太字で示す。
バチルス アミロリケファシエンスaprE 5'上流配列、プロモータ及びシグナル配列コード領域は以下の配列（配列番号１）に示す。プライマー１ (apr-f; GAGCTGGGTAAAGCCTATGAAT;配列番号５)は、その配列の最初の部分に下線を付し、プライマー2及び３のaprE部分(npr-f and npr-r; GTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCT;配列番号６)には配列の最後に二重下線を付した。
Figure 0005507843
バチルス アミロリケファシエンス プロペプチド配列及び成熟nprEコード配列及び転写ターミネータは以下の配列に記載されている。この配列では、プライマー2及び３のnprE部分に下線を付し(GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG;配列番号７)、プライマー４のnpr-r部分(GGCTTCACCATGATCATATATGTCAAGCTTGGGGGG;配列番号８)に二重下線を付した。
Figure 0005507843
全長のNprE (プリ（pre-）、プロ（pro-）及び 成熟配列のアミノ酸配列)を以下に示す。
Figure 0005507843
ある実施の態様においては、本発明では以下のNprE配列を用いることができる。
Figure 0005507843
プライマー2及び３はお互いに逆相補的であり、染色体DNAの非コード（＃２）又はコード（＃３）ストランドに対応する。コード ストランドでは、これらはaprEシグナル配列の最後の２５塩基ペア及びnprEプロペプチドの最初の３０塩基ペアに対応する。プライマー＃４は下線を付した配列と逆相補的であり、nprEストップコドンの２４の3'塩基ペア及び６つのdCTP残基が先行する導入されたHindIII部位を持つターミネータを含み、いわゆる「クランプ」（clamp）を提供し、制限酵素によっては、その認識配列がDNA断片の末端に非常に近い位置にある場合には開裂が非効率であることもある中で、HindIII制限エンドヌクレアーゼによる、より効率的な開裂を行わせる。
2つのPCR断片が以下の手順及び試薬を用いてApplied BiosystemsのrTTH DNA Polymerase, XL Kitを用いて生成された（ただし、DNAテンプレート及びオリゴヌクレオチドプライマーを除く）：
40.6 μl 水
30 μl 33x rTth PCR緩衝液
10 μl 2 mM dNTP ミックス
4.4 μl 25 mM Mg-アセテート
5 μl 50 μM プライマー # 1又は # 3 (フォワードプライマー)
5 μl 50 μM プライマー # 2 又は # 4 (逆プライマー)
2 μl バチルス スブチリス又はバチルス アミロリケファシエンス染色体DNA
2 μl τTth ポリメラーゼ
1 μl Pfu Turbo ポリメラーゼ
100 μl 全反応容量
これらの実験で使用されたＰＣＲ条件は(95°C, 30 秒/58°C, 30秒/68°C, 1 分) x 30 サイクル、それに続いて4℃まで急速冷却するものであった。反応は1.2% アガロース/TBE 調整ゲル上で実施され、QIAGEN（登録商標）Gel Extraction Kitを用いて適当なサイズに切除され及び精製された断片であった。第二の融合では、ＰＣＲ反応は、染色体DNAが2つの分離された断片の各１ulにより置換され外部プライマ＃１及び＃２のみが使用された。上に記載したと同じＰＣＲ条件が用いられた。第一のＰＣＲでの相補プライマー2及び３を使用したことによる二つの断片に形成された相補的末端のため、二つの断片は正確に融合された。
融合断片はEcoRI 及びHindIIIで消化され、上に記載のようにゲル精製された。統合プラスミドpJM102もまたEcoRI 及びHindIIIで消化され、線状プラスミドはその後ゲル精製され、標準技術によって、消化されたapr/npr融合断片に結紮された。この結紮反応は、後のキシロース誘発バチルス スブチリス株を直接形質転換するのに用いられた。
精製の後、二つの断片は野生型バチルス スブチリス染色体DNA由来のプライマー1及び２、及びバチルス アミロリケファシエンス由来の染色体プライマー３及び４を用いてＰＣＲでにより生成された。この断片は、上に述べたように再び精製され、統合プラスミドpJM102の消化及び続く融合断片のプラスミドへの結紮の場合と同様、続いてEcoRI 及びHindIIIにより切断された。
形質転換体の幾つかは染色体由来する配列に融合を持っておりPCRによる変異が存在しないことが確認された。これらのひとつが、その後5 - 25 mg/mLクロラムフェニコール、pJM102上の選択可能なマーカーによって工程ごとに増幅され、結合された発現カセットを共増幅した。
選択された配列が確認された形質転換体は、5 mg/ml CMP（クロラムフェニコール）を含むLB/寒天プレート上のpJM102クロラムフェニコール耐性マーカーを選択することにより得られた。その後、これは10 mg/ml CMPのLB培養液に植菌され、250RPMで攪拌され、37℃で一夜置かれた。
この培養液は、その後単一コロニーを分離するため10 mg/ml CMPのLB/寒天プレートに導入された。一つのコロニーはその後25 mg/ml CMPのLB培養液に植菌され、250RPMで攪拌され、37℃で一夜置かれた。この培養液は単一コロニーを分離するため25 mg/ml CMPのLB/寒天プレートに導入されたこれらのコロニーは、技術分野で知られている方法により採取され、使用されるまで−70℃でグリセロール中に保存された。
バチルス スブチリスに存在する二つの非必須プロテアーゼ（aprE及びnprE）及びアミラーゼの欠失により、金属プロテアーゼの生成中に全細胞外プロテアーゼが低減した。DNAをコードする中性金属プロテアーゼがアミラーゼ欠失宿主細胞にクローンされた。適正発達のための誘発型comKがアミラーゼ遺伝子座の中心に挿入され、株は「amy」と呼ばれた。発現タンパク質の分泌が、遺伝子の配列をコードする前に、シグナル配列をコードするヌクレオチドの挿入によって確実なものとなった。
実施例２
精製された MULTIFECT（登録商標）中性及び組み換え中性金属プロテアーゼ(nprE)発現及び発酵
実施例１に記載の様に生成された組み換えバチルス スブチリスは、以下に記載の様に栄養価のある媒体中で従来のバッチ発酵により培養された。バチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼを含むバチルス スブチリス培養液の一つのグリセロール水薬瓶（実施例１に記載の様に準備）が、200 m g/Lクロラムフェニコールを含む600 mlの SBGl %媒体を植菌するために使用された。培養液は37℃で48時間成長させ、その後培養液が技術分野で知られている方法により12,000ｒｐｍで遠心分離により回収された。この手順は2度行われた。得られた酵素の最終濃度は約から約1.4 及び約2 g/Lの範囲であった。
実施例３
中性金属プロテアーゼの精製及び特徴
この実施例では、実施例２に記載の有機体により発現された中性金属プロテアーゼを精製するために使用される方法について述べる。37℃で36時間培養した後発酵培養液は回収され、12000rpmで遠心分離された（SORVALL（登録商標）遠心分離モデル RC5B）。分泌された中性金属プロテアーゼは培養液から分離され、BES (ポリエーテルスルホン酸) 10kDa 分画（cutoff）を持つAmiconろ過システム 8400を使って約10倍に濃縮された。
濃縮された浮遊物は、pH 5.4の、10 mM NaClを含む2 5 mM MES緩衝液で温度4℃で一夜透析された。透析物はその後、以下に記載のカチオン交換カラムPorous HS20 (全容量 ~ 83 mL; 結合能力~ 4.5g タンパク質/mL カラム; Waters)に投入された。カラムはpH 5.4の、10 mM NaClを含む2 5 mM MES緩衝液で事前平衡されていた。その後約200-300 mLのサンプルがカラムに装入された。結合されたタンパク質は、1 0-カラム容量の5.4から 6.2 の傾斜のpHのMES緩衝液を用いて溶出させた。タンパク質の溶出はpH 5.82から6.0の間であり、本明細書に記載の様にタンパク質分解活性及び10 % (w/v) NUPAGE（登録商標）SDS-PAGE (Novex)を用いて評価された。その後、
中性プロテアーゼを含む部分が集められた。ｐHを5.8に調整する前にカルシウム及び塩化亜鉛が比率3:1で加えられた。タンパク質精製にはPerceptive Biosystems BIOCAD（登録商標）Vision (GMI)が使用された。
10 % (w/v) NUPAG（登録商標）SDS-PAGEを用いて評価された、精製されたタンパク質は、95％より高純度であり均質であることが確認された。通常、１％未満の純度の精製調剤は、小基質suc-p-AAPF-pNA (N-スクシニル-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L- Phe-p-ニトロアニリド) (Sigma)による標準プロテアーゼアッセイを用いて評価した時に、セリンプロテアーゼ活性を示した。このアッセイは10 mM CaCl2 及び0.005 % TWEEN（登録商標）80を含むpH 8.5、100 mM Tris-HCl緩衝液を用いてミクロタイタープレートフォーマット（96ウエル）で実施された。基質(p-AAPF NA)は、DMSO (ジメチルスルホキシド) (100 mg/ml)中で160 mM原液を作り、この原液をCaCl2 及び0.005 % TWEEN-80を含むTris-HCl緩衝液で100倍に薄めて作った。その後、希釈されたプロテアーゼ溶液10 uL（希釈液は10 mM CaCl2 及び0.005 % TWEEN（登録商標）80を含むpH 8.5、100 mM Tris-HCl緩衝液を用いて生成した）が190 uL lmg/ml p-AAPF 溶液に加えられた。このアッセイは5分攪拌され、410nmでの運動変化が２から5分読み取られた。反応の傾斜が測定され、セリンプロテアーゼの量、活性の指標として使用された。タンパク質は、塩化亜鉛1 mM、塩化カルシウム及び40 % のプロピレングリコールを含むpH 5.8のMES緩衝液25 mMを用いて保存用に製剤された。
実施例４
精製されたMULTIFECT（登録商標）中性金属プロテアーゼ（Purified MULTIFECT（登録商標））Neutral Metalloprotease (PMN)）のカルシウム及び亜鉛イオンに対する親和性
この実施例においては、上の実施例で述べた様に生成された中性金属プロテアーゼ(PMN)の親和性の決定方法について述べる。カルシウム及び亜鉛イオンに対するPMNの親和性が、それぞれMolecular Probesから得られるFluo-3及びFluoZin-3の蛍光指示薬を用いて実施された。すべての蛍光測定はLS50B発光 分光光度計(Perkin-Elmer)に記録された。Fluo-3の結合は励起500 nmでモニターされ、発光スペクトルは505から550 nmで記録された。同様に、FluoZin-3の結合は励起495 nmでモニターされ、発光スペクトルは500から550 nmで収集された。励起及び発光スリット幅は共に2.5 nmに設定された。
これらを決定するために、50 mM Tris-HCl 緩衝液, pH 8.4中の100 uM中性金属プロテアーゼが、関連指薬を増大させつつ滴下された。滴下曲線は図１に示す。
この図では三角形は、516 nmでモニターしたFluo-Zin3染料を用いてZn2+について得た曲線結合データを表し、円は522 nmでモニターしたFluo染料を用いてCa2+について得た結合データを表わす。亜鉛及びカルシウム（単一結合部位を想定）の結合定数（Ka）が、各々0.401 nM 及び0.037 nMと決定された。これらの結果は、精製MULTIFECT（登録商標）中性金属プロテアーゼは、亜鉛イオンをカルシウムイオンよりも約10倍大きい親和性を持って結合したことを示す。カルシウムのより弱い結合をべースとして、当初のタンパク質操作実験は、(i) より強いカルシウム結合部位をデザインする、及び/又は、(ii) カルシウムの構造的安定性に必要な条件を除去する（例えば、タンパク質を80 %以上に安定させる）の何れかを実行する様にデザインされる。
実施例５
保存安定性
この実施例では、バチルス スブチリスで発現されたPMN 及び組み換えバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼの保存安定性を評価するための実験ついて述べる。これらの中性金属プロテアーゼ調剤のタンパク質分解がLAS (硫酸ナトリウムラウリル（lauryl sodium sulfate; Sigma)溶液を増大させて(0 % から10 %を含み10％まで)行く中で評価された。
精製MULTIFECT（登録商標）中性金属プロテアーゼから生成されたタンパク質分解断片が10 % (w/v) NUPAGE（登録商標）SDS-PAGEを用いて観察された。
上に述べた様にバチルス スブチリスで発現されたバチルス アミロリケファシエンス由来の組み換え中性金属プロテアーゼの保存安定性が緩衝液(50 mM Tris-HCl 緩衝液, pH 8.4)のみ、及びProcter & Gamble製洗剤基材の存在下で決定された。緩衝液及び/又は洗剤基材は亜鉛イオン、カルシウムイオン又はこれらの組み合わせを含むものであった。亜鉛及びカルシウムイオンの濃度は共に0から25 mMの間で変えられた。これらの結果は、全て緩衝液のみ中で培養された中性金属プロテアーゼの結果と対比された。
プロテアーゼ アッセイ
アゾーカゼイン アッセイ
アゾーカゼイン エンドポイント アッセイはある条件で起きるタンパク質分解量を評価するために用いられた。これらのアッセイでは、75 uLの酵素が、250 μl の1 % (w/v) アゾーカゼイン(Sigma)に加えられた過剰のカルシウム又は亜鉛又はその両方のイオンにより培養された。反応は３０℃で15分進行し、その後反応を停止されるために10 % (w/v)トリクロロ酢酸が加えられた。沈殿したタンパク質及び未反応アゾーカゼインが14 000 rpmで１０分間遠心分離することにより除去された。アゾー基の色彩は750 μL 1 Mの水酸化ナトリウムを加えることで明確になった。色彩は５分間深化させ、その後反応を停止させ440 nmで吸光度が測定された。
コハク酸化−カゼイン及びTNBSAアッセイ
中性金属プロテアーゼの活性がQuantiCleave Protease Assay Kit（登録商標）(Pierce)を用いて決定された。このアッセイは酵素によるコハク酸化−カゼインの消化に基づく。形成された第１級アミノ基は、その後トリニトロベンゼン スルホン酸（TNBSA）と反応させ、４５０nmで最大吸光度をもつ着色複合体を形成した。このアッセイは９６ウエル マイクロタイター形式で実施される。このアッセイでは、コハク酸化−カゼインで１５分培養し、そしてTNBSAと１５分間反応させることが必要である。いずれの培養中にでもサンプルは振とう器に置かれる。TPCK-トリプシン (Pierce)が、プロテアーゼの全体の活性を決定するための通常の標準として使用される。
しかし、特異のプロテアーゼの活性の最適な条件のためには、関心の対象とするプロテアーゼを使用する必要がある。これらの実験で実施されたアッセイでは、アッセイを校正するために、トリプシンと対象とするプロテアーゼの両方が用いられた。アッセイの精度を満たすために、0.5 mg/mLトリプシンより成る標準希釈液は常に（450 nmにおける）吸光度が0.5未満であることが必要である。
各サンプルはカゼインを含まないコントロールに対比して測定された。報告された吸光度 (ΔAbs(450nm))の変化はカゼインのアミノ基による干渉であることを説明している。
さらに、緩衝液及び/又は洗剤の他の成分中の、第１級アミノ基による全ての干渉もまたこの方法によって修正された。
すべてのサンプルの活性は、キットにより提供されるBupH（登録商標）ホウ酸塩緩衝液中で培養された酵素のみならず、中性金属プロテアーゼを加えていない洗剤との比較で、同じ時間及び同じ温度において決定された。
このテストはエンドポイント アッセイであり、pH 8.5のホウ酸塩緩衝液50 mMが32℃の温度で使用された。プロテアーゼアッセイは通常２回実施された。安定性の測定値を決定するための殆どの実験では、タンパク質及び洗剤は上記の緩衝液を用いて１：１０００に希釈された。しかし、ある実験では、何も使用しない場合の吸光度を０．５未満とするために、希釈度は1:500 又は1: 200をも使用した。これらの実験で用いたマイクロタイター分光光度計は
SpectraMax250（登録商標）(Molecular Devices)であり、すべてのアッセイは中程度のタンパク質結合９６ウエルプレート(Corning)で実施された。これらのアッセイで得られた、標準タンパク質サンプル（例えば、トリプシン及び精製金属プロテアーゼ）の結果は、非線形応答（線形目盛は狭いアッセイの範囲でのみ有効であろう）があることを示していた。したがって、曲線は二次関数f = yo+ax2 +bxに適合させ、ｆはｙに適合する(SigmaPlot（登録商標） v. 9; SPSS, Inc.)。この様に、もし一次関数がタンパク質の量を数値化するために用いられる場合は、不正確なデータが得られるであろう；正確な結果を得るためには二次関数が必要となることが判明した。
キットの製作者(Pierce)の注意書きは、結果は、ログ目盛りである「ｘ」に適合することを示していることは注目すべきである。
実施例６
中性金属プロテアーゼ活性に対するｐH及びLASの影響
0.36 mg/mLの製剤されたnprEの活性の最適ｐHも決定された。この検討で調査された緩衝液はｐHの範囲が3.5-5.5 (pKa = 4.76) の50 mMの酢酸ナトリウム、ｐHの範囲が5.5 から7.0 (pKa = 6.10)の50 mM MES緩衝液、及びpH 8.4
の50 mM Tris-HClであった。製剤されたnprEの最適ｐHは5.5 及び6.0の間であると決定された。
0.36 mg/mの製剤されたnprEの活性に対するLAS洗剤成分の影響が、0 から1 % (w/v) LASによる培養により調査された。これらの結果は図２のグラフに示す。これらの結果が示す様に、プロテアーゼは洗剤成分により極めて大きく不活性化され、この有害な影響に対してプロテアーゼを安定化させる方法が必要であることがわかる。
ある実験では、Procter & Gamble製のTIDE（登録商標）2005の名称の高密度液状洗剤(high density liquid detergent (HDL))成分が用いられた。供給製品そのままの形で、この製品は、本発明の中性金属プロテアーゼを除いて必要な全ての成分を含んでいた。
時間の関数としての液状洗剤基材の保存安定性
安定性試験が小保存法において実施された。変えられた条件、及び添加されるカルシウム及び塩化亜鉛の種々の濃度が、FusionPro（登録商標）(S-Matrix)ソフトを用いてデザインされたマトリクスを用いてアッセイされた。以下の表は、バチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼの長期保存安定性を確認するために用いた試験条件を纏めたものである。
Figure 0005507843
各試験条件での最終容量は１ｍｌLであった。TIDE（登録商標）2005はmL当り0:36 mgの酵素が投与された。製剤された培養液及び精製組み換え金属プロテアーゼがTIDE（登録商標）2005基材中32℃で約4週間の間培養された。洗剤中の金属プロテアーゼの保存安定性は、50 mM MES緩衝液, pH 5.8中の中性金属プロテアーゼの安定性と比較された。
試験開始の前に、サンプルはアッセイ緩衝液(50 mM ホウ酸塩緩衝液, pH 8.5)を用いて1000に対して5の割合で希釈された。残留活性が決定され、アッセイ緩衝液中の中性金属プロテアーゼと比較された。全ての測定は2度実施された。各サンプルは適当なコントロールと平行して試験された（すなわち、洗剤、緩衝液及び必要な全ての添加剤が試験された）。サンプルは、その後QuantiCleave（登録商標）プロテアーゼアッセイキット(Pierce)による説明書に記載の様にアッセイされた。
３−４週の間実施されたこれらの安定性試験の結果を図22に示す。
TIDE（登録商標）2005では、イオンが存在しない（すなわち、追加の塩がない）中性金属プロテアーゼは、カゼインに対する全てのタンパク質分解/加水分解活性を急速に失った。事実1時間未満の培養で、20％未満の活性しか残っていないことが判明した。対象的に、亜鉛イオン（15mMを含み、15mMまで）を含むTIDE（登録商標）2005中のnprEの培養では、7日間プロテアーゼを安定させ及びタンパク質の分解を防いだ。 この様に、この製剤中の亜鉛イオンの存在は、プロテアーゼ活性の少なくとも60％を維持する機能を十分持っていた。同様に、7.5 mMの亜鉛イオン濃度は同様な安定性効果を生み出した。亜鉛イオンのこの濃度は最低値を超え、種々の洗剤製剤に用いることができることが考えられる。これらの実験では、カルシウムイオンを含むことによる更なる効果はなかった。
さらに、カルシウムイオンを15 mMを超え、25mMを含み25mMまで追加することにより、TIDE（登録商標）2005基材に追加する場合には沈殿を引き起こした。
本発明は、特定の機構に限定されるものではないが、これらの実験においてプロテアーゼの安定性に対する追加されるカルシウムイオンの効果が存在しないことは、洗剤成分の結果によるものであることが考えられる。
バチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼと55％アミノ酸配列が同一である（CLUSTAL W, v. 1.82を用いて配列アラインメントを実施）サーモリシンでは、亜鉛イオンは活性にとって必須であるが、カルシウムイオン及びカルシウム結合部位の操作は安定のための役割をすることが明白に示された（例えば、Mansfield他、 J. Biol. Chem., 272:11152-11156 [1997];及びVan den Berg他., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:35-40 [1999]を参照）。他の実施の態様においては、他のカチオン（例えば、Co2+, Mn2+及びFe2+）は、本発明において、バチルス アミロリケファシエンス由来の中性金属プロテアーゼの安定に用いることができる。これは、これらのイオンの何れもが、特定の活性の100％の回復とならないことを示す先のデータと対照的である(Holmquist及びVallee, J. Biol. Chem., 249:4601-4607 [1974])。
これらのイオンは、金属プロテアーゼの変性を防止し、続く金属プロテアーゼのタンパク質分解を防ぐことにより安定性に影響すると考えられている。しかし、本発明は何れの特定の機構活動に限定されるものではない。
実施例７
nprE発現pUBnprEを用いたバチルス スブチリスにおけるNprEプロテアーゼの生成
この実施例では、バチルス スブチリスでNprEを生成する実験、特にバチルス スブチリスにpUBnprEプラスミドを形質転換するために用いられる方法について述べる。形質転換は技術分野で知られた方法で実施された（例えば、WO 02/14490を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる）。以下に記載するDNA配列（バチルス アミロリケファシエンス由来のnprE リーダー, nprE プロ（pro）及びnprE成熟DNA配列）はNprE前駆体タンパク質をコードする：
Figure 0005507843
上の配列では、太字は成熟NprEプロテアーゼをコードするDNAを、標準フォントはリーダー配列(nprEリーダー)、及び下線を付したものはプロ配列(nprE pro)を示す。
以下に示すアミノ酸配列(NprE リーダー, NprE プロ及びNprE 成熟DNA 配列) (配列番号：13)はNprE前駆体タンパク質をコードする。この配列では、下線を付したものはプロ配列を、太字は成熟NprEプロテアーゼを示す。
配列番号１７は、成熟NprEプロテアーゼとは別のNprEプロ配列であり、配列番号１８は成熟NprE配列である。この配列は本明細書に記載の変異体ライブラリーを作るべースとして用いられた。
Figure 0005507843
pUBnprE発現ベクターは、2つの特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによりバチルス アミロリケファシエンスの染色体DNAからnprE遺伝子を増幅することにより構築された：
Figure 0005507843
ＰＣＲはPhusion High Fidelity DNAポリメラーゼを用いて熱サイクラー上で実施された（フィンザイム(Finnzyme)）。ＰＣＲ混合物は10 μl 5x緩衝液(Finnzymes Phusion)、lμl 10mM dNTP, 1.5μl DMSO, 各プライマーlμl、lμl Finnzymes Phusion DNA ポリメラーゼ, lμl 染色体DNA 溶液50ng/μl, 34.5 μl MiIIiQ 水を含んでいた。使用された手順は以下の通り：
ＰＣＲ手順：
1) 30 秒98°C；
2) 10秒98°C；
3) 20秒55°C；
4) 1分72°C;
5) 2から4のステップを25サイクル;
6) 5分72°C.；
この結果1.9 kb DNAが生成され、このDNAはBgIII及びBcII DNA制限酵素を用いて消化された。多コピーバチルスベクターpUBl 10 (例えば、Gryczan, J. Bacterid., 134:318-329 [1978]を参照)はBamHIにより消化された。ＰＣＲ断片ｘBgIIIｘBcII はその後pUB110 x BamΗIベクター中で結紮されpUBnprE発現ベクターを形成した（図１４を参照）。.
pUBnprE はバチルス スブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換された。バチルス スブチリスへの形質転換はWO 02/14490に記載の様に実施された。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。pUBnprEベクターを宿すバチルス スブチリス形質転換体を選択的に成長させることは、20 mg/L ネオマイシンにより、25 ml MBD媒体（定義されたMOPSベースの媒体）を含む振とうフラスコで実施された。MBD媒体は、NH4Cl2, FeSO4 及びCaCl2が塩基媒体から除かれたこと、3 mM K2HPO4 が用いられたこと、及び塩基媒体に60 mM 尿素、75 g/Lグルコース、及び1 % ソイトン（soytone）が追加されたことを除いては本質的に技術分野で知られた方法により生成された。また、微量栄養素は、100Ｘ原液として、１リットル中に400 mg FeSO4 .7H2O, 100 mg MnSO4 .H2O, 100 mg ZnSO4.7H2O, 50mg CuCl2.2H2O, 100 mg CoCl2.6H2O, 100 mg NaMoO4.2H2O, 100 mg Na2B4O7.10H2O, 10 mlの１M CaCl2,及び10 ml の0.5 Mクエン酸ナトリウムを含むものであった。
培養液は培養器/振とう器(Infors)で37℃で3日間培養された。この培養により、プロテアーゼアッセイにより示されたタンパク質分解活性を持つ分泌NprEプロテアーゼが生成された。ゲル分析がNuPage Novex 10% Bis-Tris ゲル (Invitrogen, Cat.番号NP0301BOX)を用いて実施された。分析のためのサンプルを準備するため、２容量の浮遊物が、１容量の１M HCl、１容量の4xLDS サンプル緩衝液 (Invitrogen, Cat.No. NP0007)、及び1% PMSF (20 mg/ml)と混合され、その後に70℃で10分加熱された。
その後、各サンプル25 μLが、10 μLのSeeBlue プラス2 つの事前に染色された標準(Invitrogen, Cat.No.LC5925)と共にゲルに導入された。この結果は、この実施例に記載のNprEクローン戦略は、バチルス スブチリスにより生成される活性を持つNprEを生成することを明確に示した。
実施例８
nprE部位評価ライブラリー（nprE Site Evaluation Libraries (SELs)）の生成この実施例では、nprE SELの構築で使用される方法について述べる。
上に述べたnprE発現カセットを含み、pUBnprEベクターがテンプレートDNAとして使用された。このベクターは独特のBglII制限部位を含み、これは部位評価ライブラリー構築（site evaluation library construction）において使用された。
Invitrogen (脱塩、50 nmol スケール)において合成されたpUBnprE発現ベクター、プライマーがライブラリーを生成のために使用された。プライマーの配列は表８−１に示す。
nprE部位評価ライブラリーを構築するために、３つのＰＣＲ反応が実施され、その2つは突然変異生成ＰＣＲであり、突然変異させた関心の対象のコドンを成熟nprE DNA配列に導入し、3つ目のＰＣＲは、成熟nprE配列に所望の突然変異したコドンを含むUBnprE発現ベクターを構築するために、2つの突然変異ＰＣＲを融合させるために用いる。
突然変異の方法は、コドンー特異の突然変異アプローチに基づくものであり、特異DNAトリプレット中で全ての可能な突然変異を同時に生成するが、特異にデザインされたトリプレットDNA配列NNS ((A,C,T又は G), (A,C,T又はG), (C 又はG))を含む２５から４５のヌクレオチドの長さを持つ前進（forward）及び逆(reverse)オリゴヌクレオチド プライマーを用いて実施された。NNSは突然変異されるコドンの配列に対応し、そしてその特異nprE成熟コドンにヌクレオチドをランダムに組み入れることを保証するものであった。
プライマー名称（表８−１参照）に記載の数は特異nprE成熟コドンの位置に対応する。
部位評価ライブラリーを構築するために使用される追加の2つのプライマーは、BglII制限部位に隣接して位置するpUBnprE DNA配列の一部分と共にBglII制限部位を含んでいた。これらのプライマーは、Invitrogen (脱塩、50 nmol スケール)により生成され、表８−１に記載されている。
Figure 0005507843
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Figure 0005507843
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各部位評価ライブラリーの構築は、pUB-Bglll-FWプライマー及び特異nprE逆突然変異プライマーを用いて2つの主PCR増幅により開始された。第２のPCRでは、pUB-BglII −Rvプライマー及び特異前進突然変異プライマー（前進及び逆突然変異プライマーのためのnprE 成熟コドンと同等位置)が使用された。
成熟nprE配列中での突然変異の導入は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes; Cat. no. F-530L)を用いて実施された。全てのPCRは供給ポリメラーゼを含み、Finnzymesに示す手順により実施された。主PCRの条件は：
主PCR１：
pUB-BglII-FW プライマー及び特異NPRE 逆突然変異プライマー−共に1 μL (10 μM) ;
主PCR２：
pUB-BglII-FW プライマー及び特異NPRE 前進突然変異プライマー−共に1 μL (10 μM) ;及び
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% l μL
pUBnprE テンプレートDNA l μL (0.1 - l ng/ μL)
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCRプログラムは以下の通りであった：
30秒98°C, 30x (10 秒 98°C, 20 秒 55℃, 1,5分 72°C)及び5 分72°C、PTC-200 Peltier 熱サイクル（MJ Research）で実施。
PCRの実験により、約2から3 kBの2つの断片が生成され、これらは対象となるNPRE成熟コドンの周囲に約30ヌクレオチド塩基が重なるものである。断片は、前記の2つの断片及び前進及び逆行BglIIプライマーを用いて第3のPCR反応で融合された。この融合PCRは以下の溶液を用いて実施された：
pUB-BlII-FW プライマー及び pUB-BglII-RV プライマー−共に1 μL (10 μM)
5 x Phusion HF 緩衝液 10 μL
10 mM dNTP混合物 1 μL
Phusion DNAポリメラーゼ 0.75 μL (2 単位/ μL)
DMSO, 100% 1 μL
主PCR 1 反応ミックス 1 μL
主PCR ２ 反応ミックス 1 μL
精製された, オートクレーブ水 50 μLまで
PCR融合プログラムは以下の通り：
30秒98°C, 30x (10 秒 98°C, 20 秒 55℃, 2.40分 72°C)及び5 分72°C、PTC-200 Peltier 熱サイクル（MJ Research）で実施増幅された線状6.5 Kb断片は、QiaquickPCR精製キット(Qiagen, Cat. no. 28106)を用いて精製され、融合断片の両端に付着端を生成するためにBglII制限部位で消化された：
- 35 μL 精製線状DNA 断片
- 4 μL REACT（登録商標）３緩衝液 (Invitrogen)
- 1 μLBglII, 10 単位/ml (Invitrogen)
反応条件：1時間、30℃
BglIIによる消化及びQiaquickPCR精製キット(Qiagen, Cat. no. 28106)を用いて精製された断片の結紮により、所望の突然変異体を含む環状及び多重結合DNAが生成された：
- 30μL 精製BglII消化DNA 断片
- 8 μL T4 DNAリガーゼ緩衝液 (Invitrogen（登録商標）Cat. no. 46300-018)
- 1 μL T4 DNA リガーゼ, 1 単位/μL (Invitrogen（登録商標）Cat. no. 15224-017)
反応条件：16-20時間、16℃
その後、結紮された混合物はバチルス スブチリス(ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK)株に形質転換された。バチルス スブチリスへの形質転換は、WO 02/14490に記載の様に実施された。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。各ライブラリーについて、９６単一コロニーが採取され、後の配列分析(BaseClear)及びスクリーニングの目的のために、ネオマイシン及び1.25 g/L イーストエキスを含むMOPS媒体中で成長させた。各ライブラリーは最大19 nprE部位特異変異体を含んでいた。
変異体は、バチルス スブチリスSEL形質転換体を９６ウエルMTPで20 mg/L ネオマイシン及び1.25 g/Lイーストエキスを含むMBD媒体中で37℃の温度68時間、成長させることにより生成された（上記を参照）。
実施例９
nprE組み換えライブラリー(RCL)の生成
この実施例では、nprE組み換えライブラリーを生成するために使用する方法について述べる。この酵素は、一つの特性が最も大きく変えられる必要がある特性として選ばれた。この特性はここでは「主要特性」と定義される。他の全ての特性は組み換えライブラリーのデザインの目的にとっては「二次的特性」であった。本明細書で用いるタンパク質を改良する基本的な戦略は、主要特性を改良し、また二次的特性を維持し又は改良する突然変異体を組み合わせることであった。部位評価データは、二次的特性を維持し又は改良しつつ、主要特性を改良するこれらの突然変異体を同定するために使用された。組み合わされる突然変異体は機能指標（Performance Index (PI 又はPi)）及び関連するΔΔGapp 値により同定された。
本明細書で定義される「明確な自由エネルギーの変化」（Apparent Free Energy Change (ΔΔGapp)）は以下の様に定義される：
ΔΔGapp = -RT Ln (P変異体/P親)
式中P変異体は変異体の機能値であり、P親は同じ条件での親酵素の機能値である。
(P変異体/P親)の比率は特性の機能指数(Pi)と定義される。
ΔΔGapp値は、そのデータ分布及び加算性において実際のΔΔGappと同様に行動すると予想された。しかし、ΔΔG値は親酵素と比べて変異体により実行され得る最大仕事量を表すため、ΔΔGappの数量はΔΔGを過少に評価し、２つの追加位置の特性が、そのΔΔGapp値を加えることにより予想される数値より大きいという相乗作用と思われる結果をもたらす。
例えば、TIDE（登録商標）の安定性は主要特性であり、BMI活性は二次的特性である場合、ΔΔGapp 値< 0 (Pi >1) 及びBMI ΔΔGapp 値< 0.06 (Pi >0.9)を持つ変異体が組み合わせとして選択される。事実、これらの関係はこの実験において検討された。
この実験で使用される変異体を生成するために、複数nprE 成熟DNA位置での多重突然変異を含む合成nprEライブラリー断片がGeneArt (Geneart)により生成された。これらの1.5 kB nprEライブラリー断片は、DNA 制限酵素Pvul 及びAvalにより消化され、5 kB pUB ベクター断片中で精製され、及びT4 DNA Ligase (Invitrogen（登録商標）Cat. no. 15224-017)を用いてリガーゼ反応により結紮された(又 DNA制限酵素Pvul 及びAvalにより消化された)。
結紮反応ミックスを直接バチルス細胞に形質転換するために、ライブラリーDNA（pUBベクター断片中で結紮されたnprEライブラリー断片ミックス）は、TempliPhi キット (Amersham cat. #25-6400)を用いて増幅された。
この目的のために、１uLの結紮反応ミックスがTempliPhi キット の5μLのサンプル緩衝液と混合され、95℃で3分間加熱されDNAを変性させた。反応物は2分間冷やされ、そして短時間沈降させた。次に、5μLの反応緩衝液、及びTempliPhiキットの 0.2μLのphi29ポリメラーゼが加えられ、そして反応物はMJ Research PCR装置中で30℃で4時間培養された。phi29酵素は、PCR装置中で65℃で10分培養することにより反応物中で加熱により不活性にされた。
ライブラリーをバチルス中に形質転換するために、0.1 uLのTempliPhi増幅反応製品が500 μL のコンピテントバチルス スブチリス細胞 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA-comK) と混合され、続いて37°Cで1時間強く振とうされた。その後、100及び500 μLが20 mg/L ネオマイシン及び0.5% スキムミルクを含むHi寒天プレートに平板培地された。通常、バチルス スブチリスへの形質転換は、WO 02/14490に記載の様に実施された。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
この方法により構築されるバチルス スブチリスnprE組み合わせライブラリーは突然変異体の一以上の標的位置に野生型アミノ酸を含むことを意図している。これらのライブラリー中に得られて変異体は、本明細書に記載の様にTIDE（登録商標）中の安定性及びBMI 洗濯機能試験での機能がテストされた。
表９はBMIアッセイでテストされた変異体の機能指数を示す。この表では、「Pos.」は、変わったNprEアミノ酸配列中の位置を示し、「ＡＡ」は各変異体についてのアミノ酸置換を示す。
Figure 0005507843
Figure 0005507843
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実施例１０
QuikChange（登録商標）突然変異によりnprE 部位評価ライブラリー(SEL)を生成する代替方法
この実施例では、nprE SELを生成する代替的方法について述べる。上の実施例８の様に、pUBnprEベクターはnprE SELを生成のためのテンプレートDNAソースとしての役目を果たした。二つの方法の主な違いは、この方法では、相補的部位特異的な突然変異プライマーを用いて全ベクターの増幅をすることが必要であることである。
材料
pUBnprEベクターを含むバチルス株
Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen cat # 12143)
容易に溶解するリゾチーム（Ready-Lyse Lysozyme）（エピセンターcat # Rl802M）
dam メチラーゼ キット(New England Biolabs cat # M0222L)
チモクリーン ゲルDNA（Zymoclean Gel DNA ）回収キット(Zymo Research cat # D4001)
nprE部位特異的突然変異プライマー、100nモルスケール、5'リン酸化され、PAGEにより精製されたもの(Integrated DNA Technologies, Inc.)
QuikChange 複数部位特異的突然変異キット(Stratagene cat # 200514)
MJ Research PTC-200 Peltier 熱サイクラー (Bio-Rad Laboratories)
1.2% 寒天E-ゲル (Invitrogen cat # G5018-01)
TempliPhi 増幅キット(GE Healthcare cat # 25-6400-10)
コンピテントバチルス スブチリス細胞 (ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- comK)
方法
pUBnprEベクターを得る為に、pUBnprEベクターを含むバチルス株単一コロニーが5ml LB + l0ppm ネオマイシン管を植菌するために用いられた。これらはこれらの方法で用いられた開始培養液であった。培養液は37℃で、225ｒｐｍで6時間振とうさせて成長させた。その後、100 mlの新しいLB + l0ppmネオマイシンが１mlの開始培養液により植菌された。
この培養液は、225rpmで振とうさせつつ、37℃で一夜成長させた。この培養に続いて、細胞ペレットを得るために十分な遠心分離を行うことにより細胞ペレットが収集された。細胞ペレットは10 ml 緩衝液Pl (Qiagen Plasmid Midi Kit)中で再けん濁された。その後l0ulのReady-Lyse Lysozymeがけん濁細胞ペレットに添加され、37℃で30分間培養された。その後、Qiagen Plasmid Midi Kitの手順が続けられた（細胞培養液の増加の理由である10ml の緩衝液P2及びP3を使用して）。
バチルス由来のpUBnprEベクターの分離の後に、pUBnprEベクターの濃度が数値化された。ベクターはその後dam Methylase Kit (New England Biolabs)を用いてdamメチル化され、キットの取り扱い手順記載の方法を用いて、一つの管当り約2 ug のpUBnprEベクターがメチル化された。
チモクリーン ゲルDNA（Zymoclean Gel DNA）回収キットがdam メチル化されたpUBnprE ベクターを精製し及び濃縮するために用いられた。
dam メチル化されたpUBnprE ベクターは数値化され、その後50ng/ulの作業濃度に希釈された。相補的部位特異突然変異プライマー（l0uMで1 ulの各プライマー）（表10-1を参照）が以下の製造者の取り扱い手順に従って、QuikChange 複数部位特異的突然変異キット（QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit）(Stratagene)中でのPCR反応に使用された（例えば、1μmのdamメチル化されたpUBnprEベクター(50ng/ul)、1ul nprE 部位特異的前進突然変異プライマー(l0uM), 2.5ul 10x QuikChange Multi Reaction 緩衝液, １ul dNTPミックス, １ul QuikChange Multi 酵素ブレンド (2.5U/ul), 及び17.5ul 希釈, オートクレーブ水であり、全反応ミックスの量は25ulであった)。
nprE部位評価ライブラリーは、以下の条件を用いて増幅された：95°C, 1分 (第一のサイクルのみ), 続いて95°Cで1分, 55°C で1分, 65°Cで13 1/2分及びサイクルを23度繰り返した。
反応生成物は4℃で一夜保存された。その後、反応混合物は、以下の製造者の手順を用いてDpnl 消化処理が行われ (QuikChange 複数部位特異的突然変異キット（Multi Site-Directed Mutagenesis Kit）を用いて)親 pUBnprE ベクターが消化された(すなわち、1.5ul Dpnl 制限酵素が各管に加えられ、37℃で3時間培養され； 2ul のDprcl-消化PCR 反応が1.2% E-ゲル上で各nprE SELについて分析され、PCR 反応が機能しており、親テンプレートが分解されていることが確認された。)。その後、製造者の定める手順を用いて、TempliPhiローリングサークル増幅法が、各nprE SELのライブラリーサイズを大きくするため、多量のDNAを生成することに用いられた（すなわち、1ul Dpnl で処理されたQuikChange PCR Multi Site-Directed Mutagenesis) PCR, 5ul TempliPhi サンプル緩衝液, 5ul TempliPhi 反応緩衝液及び0.2ul TempliPhi 酵素ミックス、11ul までの全反応量; 30℃で3 時間培養; TempliPhi 反応物は200ul の希釈、オートクレーブ水を加えて、短時間攪拌した)。
その後、1.5ulの希釈TempliPhi材料がコンピテントバチルス スブチリス細胞中に形質転換され、及びnprE SELがLA + l0ppm ネオマイシン + 1.6% スキムミルクプレートを用いて選択された。表10-1 はこれらの実験で使用されたプライマーの名前、配列及び配列番号を示す。これらのプライマーは全て、Integrated DNA Technologiesを用いて、l00 nmole スケール, 5'-リン酸化され, 合成され及びPAGE により精製された。
Figure 0005507843
Figure 0005507843
Figure 0005507843
実施例１１
nprEホモログの同定
この実施例では、nprEホモログの同定についての実験について述べる。特に、この実施例では異なる及び近い関係のバチルス種に由来の中性プロテアーゼ(npr)ホモログのクローンが実施された。異なる種が、その分離される多様性及び特性を検討するために選ばれた。
検討された種々のnprホモログには以下のものを含んでいた：
B. カルドリチクスnpr (P23384)
B. セレウスnprC (P05806)
B. セレウス E33L npr (AAY60523)
B. ステアロテルモフィルスnprT
B. スブチリスnprB
B. スブチリスnprE
B. ツルギエンシスnprB (AAK00602)
S. オーレウス オール（P8177）
図３はこれらのホモログ(配列番号:173-181)の配列アラインメントを、及び図４(配列番号:182-191)は、種々の他のホモログの他の配列アラインメントを示す。
これらの実験では、材料は以下のものを含んでいた：
バチルス スブチリスの染色体DNA株Ｉ168
以下のDNAプラスミドは、バチルス スブチリスコドン最適化によりDNA2.0において合成された：
pJ4:G01905 (B. ツルギエンシス nprB) (図6を参照)
pJ4:G01906 (B. セレウス E33L npr) (図７を参照)
pJ4:G01907 (B. セレウスnprC) (図８を参照)
pJ4:G01908 (B. カルドリチクス npr) (図９を参照)
pJ4:G01909 (S. オーレウス オール) (図10を参照)
pJ4:G01938 (S. ステアロテルモフィルスnprT) (図１１を参照)
pJHTベクター （図12を参照)
pAC ベクター(図13を参照)
MJ Research PTC-200 Peltier 熱サイクラー（Thermal Cycler） (Bio-Rad Laboratories)
プライマー (Operon Inc)
PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ (Stratagene)
制限 エンドヌクレアーゼ (Roche)
TOP10 化学的にコンピタントな大腸菌(Invitrogen)
バチルス スブチリス コンピタント細胞 ((ΔaprE, ΔnprE, oppA, ΔspoIIE, degUHy32, ΔamyE::(xylR,pxylA- comK))
Figure 0005507843
Ａ．バチルス スブチリスnprEのクローニング
バチルス スブチリスnprEプラスミドの構築のために、増幅されたaprEプロモータ断片（pJHTベクターから）及びターミネータ断片（バチルス スブチリス株1168から）を持つバチルス スブチリスnprE遺伝子が別々に準備された。図１５は個々のDNA断片の増幅を示す概略図である。
PCRスプライス重複伸張（PCR Splice Overlap Extension (SOE)）反応が2つの別々のDNA断片を結合するために用いられた。この反応では、以下の試薬が組み合わされた：1ul aprE プロモータDNA 断片, 1ul バチルス スブチリス nprE 遺伝子 + ターミネータ断片, １ul プライマーEL- 689 (25uM), 1ul プライマーEL-695 (25uM), 5ul 10x PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ緩衝液, 1ul dNTP (10mM), 1ul PfuUltra H 融合HS DNA ポリメラーゼ及び39ul 蒸留, オートクレーブ水であり、全反応容量は50 ulとなった。
ＰＣＲサイクルは次の通り：
95°C で2分間 (第一のサイクルのみ), 続いて95°C で30秒を54°Cで30秒, 及び72°C で45秒を28サイクル,。
aprE プロモータ-バチルス スブチリスnprE 遺伝子+ ターミネータのPCR 融合断片は Mfel 及びBamHI制限エンドヌクレアーゼで消化された。
pJHTベクターはEcoRI 及びBamΗI制限エンドヌクレアーゼで消化された。
制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprE プロモータ-バチルス スブチリスnprE 遺伝子+ ターミネータDNA断片はその後制限エンドヌクレアーゼで消化されたpJHTベクターで結紮された。結紮された混合物はその後LA + 50ppm カルベニシリン（carbenicillin）上で選択のためTOP10の化学的にコンピタントな大腸菌細胞に形質転換された。プラスミドpEL501（図１６参照）の正しいDNA構築配列を持つプラスミドを同定した後、aprE プロモータローカス（locus）に統合される様にコンピタントバチルス スブチリス細胞に形質転換された。形質転換細胞がLA + 5ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上で、そのプロテアーゼ活性により選択された（すなわち、脱脂乳 除去）。増幅された株はその後LA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。株はその後増幅のためLA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。
Ｂ． B. バチルス スブチリスnprBのクローニング
バチルス スブチリスnprBプラスミドの構築のために、増幅されたプロモータ断片（pJHTベクターから）、バチルス スブチリスnprB遺伝子断片（バチルス スブチリス株l168から）及びターミネータ断片（pJHTベクターから）が別々に準備された。図１７は個々のDNA断片の増幅を示す概略図である。
PCRスプライス重複伸張（PCR Splice Overlap Extension (SOE)）反応が３つの別々のDNA断片を結合するために用いられた。この反応では、以下の試薬が組み合わされた：1ul aprE プロモータDNA 断片, 1ul バチルス スブチリス nprB 遺伝子 + ターミネータ断片, 1ul ターミネータDNA断片、 １ul プライマーEL- 689 (25uM), 1ul プライマーEL-700 (25uM), 5ul 10x PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ緩衝液, 1uI dNTP (10mM), 1ul PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ及び38ul 蒸留, オートクレーブ水であり、全反応容量は50 ulとなった。
ＰＣＲサイクルは次の通り：
95°C で2分間 (第一のサイクルのみ), 続いて95°C で30秒, 54°Cで30秒, 及び72°C で45秒を28サイクル。
aprE プロモータ-バチルス スブチリスnprE 遺伝子+ ターミネータのPCR 融合断片は Mfel 及びSphI制限エンドヌクレアーゼで消化された。
pJHTベクターはEcoRI 及びSphI制限エンドヌクレアーゼで消化された。
制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprE プロモータ-バチルス スブチリスnprB遺伝子+ ターミネータDNA断片はその後制限エンドヌクレアーゼで消化されたpJHTベクターで結紮された。結紮された混合物はその後LA + 50ppm カルベニシリン（carbenicillin）上で選択のためTOP10の化学的にコンペタントな大腸菌細胞に形質転換された。プラスミドpEL508（図１8参照）の正しいDNA構築配列を持つプラスミドを同定した後、aprE プロモータローカスに統合される様にコンピタントバチルス スブチリス細胞に形質転換された。
形質転換細胞がLA + 5ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上で、そのプロテアーゼ活性により選択された（すなわち、脱脂乳 除去）。増幅株はその後LA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。株はその後増幅のためLA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。
Ｃ． Ｂ．ステアロテルモフィルスnprTのクローニング
Ｂ．ステアロテルモフィルスnprTプラスミドの構築のために、増幅されたプロモータ断片（pJHTベクターから）及びＢ．ステアロテルモフィルスnprT断片（プラスミドpJ4:G01938）が別々に準備された。図１９は個々のDNA断片の増幅を示す概略図である。
PCRスプライス重複伸張（PCR Splice Overlap Extension (SOE)）反応が2つの別々のDNA断片を結合するために用いられた。この反応では、以下の試薬が組み合わされた：1ul aprE プロモータDNA 断片, 1ul Ｂ．ステアロテルモフィルスnprT 遺伝子断片, １ul プライマーEL- 755 (25uM), 1ul プライマーEL-735 (25uM), 5ul 10x PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ緩衝液, 1uI dNTP (10mM), 1ul PfuUltra II融合HS DNA ポリメラーゼ及び39ul 蒸留, オートクレーブ水であり、全反応容量は50 ulとなった。
ＰＣＲサイクルは次の通り：
95°C で2分間 (第一のサイクルのみ), 続いて95°C で30秒、54°Cで30秒, 及び72°C で45秒を28サイクル。
aprE プロモータ-Ｂ．ステアロテルモフィルスnprT 遺伝子+ ターミネータのPCR 融合断片は EcoRI 及びHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
ｐＡＣベクターはEcoRI 及びBamIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprE プロモータＢ．ステアロテルモフィルスnprT 遺伝子DNA断片はその後制限エンドヌクレアーゼで消化されたpACベクターで結紮された。
その後、製造者の定める手順を用いて、TempliPhiローリングサークル増幅法が、大量の結紮されたaprE プロモータ Ｂ．ステアロテルモフィルスnprT pAC DNA分子を生成するために用いられ（すなわち、1ul aprE プロモータ Ｂ．ステアロテルモフィルスnprT pAC結紮反応、5ul TempliPhi サンプル緩衝液, 5ul TempliPhi 反応緩衝液及び0.2ul TempliPhi 酵素ミックス、11ul までの全反応量; 30℃で3 時間培養）; TempliPhi 反応物はその後、aprE プロモータローカスに統合するため直接コンピタントバチルス スブチリス細胞に形質転換され、それによりバチルス株EL560を生成した。それがDNA配列分析により確認された（図２０を参照）。
形質転換体はLA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上のプロテアーゼ活性（すなわち、脱脂乳除去）により選定された。
株はその後増幅のため、LA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。
Ｄ． バチルス カルドリチクスnprのクローニング
バチルス カルドリチクス nprプラスミドの構築のために、増幅されたaprEプロモータ断片（pJHTベクターから）及びバチルス カルドリチクス npr（プラスミドpJ4:G01908）が別々に準備された。図21は個々のDNA断片の増幅を示す概略図である。
PCRスプライス重複伸張（PCR Splice Overlap Extension (SOE)）反応が2つの別々のDNA断片を結合するために用いられた。この反応では、以下の試薬が組み合わされた：1ul aprE プロモータDNA 断片, 1ul バチルス カルドリチクス npr 遺伝子断片, １ul プライマーEL- 755 (25uM), 1ul プライマーEL-741 (25uM), 5ul 10x PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ緩衝液, 1ul dNTP (10mM), 1ul PfuUltraII 融合HS DNA ポリメラーゼ及び39ul 蒸留, オートクレーブ水であり、全反応容量は50 ulとなった。
ＰＣＲサイクルは次の通り：
95°C で2分間 (第一のサイクルのみ), 続いて95°C で30秒、54°Cで30秒, 及び72°C で45秒を28サイクル。
aprE プロモータ-バチルス カルドリチクス npr 遺伝子+ ターミネータのPCR 融合断片は EcoRI 及びHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
pACベクターはEcoRI 及びHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprE プロモータ-バチルス カルドリチクス npr DNA断片はその後制限エンドヌクレアーゼで消化されたpACベクターと結紮された。
その後、製造者の定める手順を用いて、TempliPhiローリングサークル増幅法が、大量の結紮されたaprE プロモータ バチルス カルドリチクス npr pAC DNA分子を生成するために用いられ、（すなわち、1ul aprE プロモータ バチルス カルドリチクス npr pAC結紮反応、5ul TempliPhi サンプル緩衝液, 5ul TempliPhi 反応緩衝液及び0.2ul TempliPhi 酵素ミックス、11ul までの全反応量; 30℃で3 時間培養）。TempliPhi 反応物はその後、aprE プロモータローカスに統合するため直接コンピタントバチルス スブチリス細胞に形質転換され、それによりバチルス株EL561を生成し、それがDNA配列分析により確認された（図22を参照）。
形質転換体はその後LA + 5ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上でプロテアーゼ活性により選定された。株はその後増幅のためLA + 25ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上に移された。
Ｅ． バチルス ツリンギエンシス nprBのクローニング
バチルス ツリンギエンシス nprBプラスミドの構築のために、増幅されたaprEプロモータ断片（pJHTベクターから）及びバチルス ツリンギエンシス nprB断片（プラスミドpJ4:G01905）が別々に準備された。図23は個々のDNA断片の増幅を示す概略図である。
PCRスプライス重複伸張（PCR Splice Overlap Extension (SOE)）反応が2つの別々のDNA断片を結合するために用いられた。この反応では、以下の試薬が組み合わされた：1ul aprE プロモータDNA 断片, 1ul バチルス ツリンギエンシス nprB 遺伝子断片, １ul プライマーEL- 755 (25uM), 1ul プライマーEL-744 (25uM), 5ul 10x PfuUltra II 融合HS DNA ポリメラーゼ緩衝液, 1ul dNTP (10mM), 1ul PfuUltra H 融合HS DNA ポリメラーゼ及び39ul 蒸留, オートクレーブ水であり、全反応容量は50 ulとなった。
ＰＣＲサイクルは次の通り：
95°C で2分間 (第一のサイクルのみ), 続いて95°C で30秒、54°Cで30秒, 及び72°C で45秒を28サイクル。
aprE プロモータ-バチルス ツリンギエンシス nprB 遺伝子+ ターミネータのPCR 融合断片はEcoRI 及びHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
pACベクターはEcoRI 及びHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化された。
制限エンドヌクレアーゼで消化されたaprE プロモータ-バチルス ツリンギエンシス nprB DNA断片はその後制限エンドヌクレアーゼで消化されたpACベクターで結紮された。結紮された混合物はその後TOP10の化学的にコンピタントな大腸菌細胞に形質転換された。プラスミドpEL568の正しいDNA構築配列を持つプラスミドを同定した後、コンピタントバチルス スブチリス細胞に形質転換された。
形質転換細胞がLA + 5ppm クロラムフェニコール+ 1.6% 脱脂乳プレート上で、そのプロテアーゼ活性により選定された（すなわち、脱脂乳 除去）。
DNAプラスミドの生成は、プラスミドpEL568はバチルス スブチリス中で安定しており、aprEプロモータローカスに統合されないことを示す。図２４はプラスミドpEL568の地図を示す。
E. ホモログモデル
更なる実施の態様においては、バチルス アミロリケファシエンス由来のNprE成熟領域のホモログモデルが提供される。これらの実験では、NprE配列（配列番号１９２）の成熟領域のタンパク質配列はBlastP (NCBI)プログラムにより起動、マッチされた。このプログラムは種々異なる配列の同一性を持つ他の既知の配列にマッチさせるものである。結果から、Ｘ線結晶構造が知られている配列が同定された。これらの配列は、S オーレス Npr (pdb id 1BQB) P.アエルギノサ（P. aeruginosa） Npr (pdb idlEZM), バチルスサーモリチクス サーモリシン（B. thermolyticus thermolysin） (pdb id IKEI)及びバチルス セレウス.（B. cereus） Npr (pdb id INPC)を含んでいた。図５は分析された種々の配列の配列アラインメントを示す（配列番号１９２−１９５）。
バチルス セレウス.（B. cereus）Nprは配列が最もNprEに近いものと判断された。バチルステルモリチクス サーモリシン（B. thermolyticus thermolysin） (pdb id IKEI)はバチルス セレウス.（B. cereus）Nprに非常に類似しているため以下のステップから除外された。ホモログモデルは以下に詳細述べる様に実施され、全ての計算はMOE (Chemical Computing)プログラムを用いて行った。
まず、最も正確な配列アラインメント（すなわち、構造べースの配列アラインメントを生成）を得るために、S. オーレス Npr (pdb id 1BQB；配列番号１９３)、 P.アエルギノサ（P. aeruginosa） Npr (pdb idlEZM；配列番号１９４)、及びバチルス セレウス.（B. cereus）Npr (pdb id 1NPC；配列番号１９５)が、既知の構造を用いてアラインされた。次にNprE成熟配列が、この構造をベースとする配列アラインメントにアラインされた。そして、NprEの最初のホモログホモログモデルが、バチルス セレウス.（B. cereus）Npr (pdb id 1NPC)をテンプレートとして使用して、及び上で生成したバチルス セレウス.（B. cereus）Nprに配列アラインさせたNprEを用いて作られた。このアラインメントの検討により、バチルス セレウス.（B. cereus）Nprは4つのCa2+ イオン結合部位を含むが、NprEは２つのCa2+ イオン結合部位しか持たないことが明確になった。
最後に、最初のホモログモデルが作られた後に、金属イオン（すなわち、Zn2+,及び2つのCa2+ )が、その各タンパク質配位子とともにコンピュータ計算により確認された。モデルのその他の構造はCHARMM22 パラメ−タセットを用いて計算を簡略化し、その結果最終のホモログモデルを得た。
実施例１２
この実施例では、本発明の金属プロテアーゼの洗濯機能を決定する実験について述べる。全ての洗濯機能テストは、以下に示す様に米国の洗濯条件で実施されたものである：
Figure 0005507843
% 汚れ除去 = (洗濯後のL値−洗濯前のL値)/(L0 白い綿−洗濯前のL値) x 100%
全ての実験は4回行われた。
プロテアーゼは特別に開発された洗濯テストにより、以下のもので汚れている、３つの異なる綿見本材料を用いてテストされた。
（a）ミルク、血液及びインク(10.0 x 7.5 cm; EMPA)であり、番号１１６固定及び非固定で呼ばれる（染みは20℃で固定）
（b）草媒体(10.0 x 7.5 cm; Equest)及び
（c）色素, オイル、及びミルク
(番号C-10 CFTで呼ばれる10.0 x 7.5 cm)
これらの実験は以下にさらに詳細に記載する。洗濯テストは、６つのステンレス製テスト容器を持つ、ベンチ トップモデルTerg-O-Tometer (米国のテスト) で実施された。
ステンレス製テスト容器は1000mlの、各々ガロン当り105 ppm/6グレインが水中に溶解された1.6 gのTIDE（登録商標）2005液体洗剤基材を含んでおり、それぞれは6つの同じ様に汚れた綿見本材料及び2つの予備のバラスト綿見本材料(EMPA 221).を備えていた。
選択されたプロテアーゼ（例えば、中性金属プロテアーゼ又他のプロテアーゼ）が各容器に1リットル当り泡に対して0.00 から5.50 mg の活性タンパク質濃度で加えられた。
試験は100ｒｐｍで攪拌しつつ、15 °C/60°Fで12分実施された。洗濯後、材料見本は冷水道水で3分すすぎそしてスピン乾燥機に置かれた。草の見本材料は空気乾燥され、草の染みが露光することを制限するために黒い布で覆った。他の全ての 見本材料はアイロンをかけられた。全ての実験は4度行われた。
テストされた 見本材料の反射率は方程式L (L*a*b) を用いてTristimulus Minolta Meter CR-300で測定した。洗濯効率値は以下の関係式を用いて計算された：
% 汚れ除去 = (洗濯後のL値−洗濯前のL値)/(L0 白い綿−洗濯前のL値) x 100%
精製MULTIFECT（登録商標）のTerg-OTometer (TOM)アッセイの結果は、図２６に示され、スブチリシン (BPN' Y217L), セリン アルカリ性プロテアーゼのアッセイ結果と比較されている。
TOMは十分機能する、及び種々のプロテアーゼ（例えば、セリン プロテアーゼ、中性金属プロテアーゼ及びその変異体）の異なる洗濯機能の間での違いを示す十分機能する有効な手段を提供する。TOMテストは、TIDE（登録商標）2005を基材洗剤としてBMI 及びEquest 媒体で汚れた草表面上で実施された。
図２６に示す様に、精製された中性金属プロテアーゼは、洗濯テストにおいてセリンプロテアーゼ(BPN' Y217L)よりも明らかによい機能を持つことが明確となった。特に、単に0.55 ppm のセリンプロテアーゼ(BPN' Y217L)の場合と比べて、デルタソイル除去が〜１０％であることを示すために2.75 ppm 精製中性金属プロテアーゼが必要があった。中性金属プロテアーゼの洗濯機能がまた低温でテストされ、中程度の汚れのEquest染みの織物に非常によく作用することが判明した。同様な結果が、上記に示した様に生成された組み換えnprEと同様に、市販の精製されたMULTIFECT（登録商標）でも得られた。
実施例１３
BMI-TIDE（登録商標）2X機能アッセイにおけるnprE変異体の機能
この実施例では、上で概観したBMIアッセイでの種々のnprE変異体の機能の評価を行う実験について述べる。実施例１に先立ち提供された方法が用いられた（「プロテアーゼ機能をテストするためのミクロ材料見本」を参照。
１より大きい(PI > 1)機能指数を持つ複数置換された変異体及び1より小さい(PI < 1)機能指数を持つ変異体での結果が以下の表に示される。表１３．１では、BMI-TIDE（登録商標）2X機能アッセイにおける選択された単一置換変異体について得られたデータが提供される。表は改良された機能指数を提供し上に記載の変異体について計算される場合、ＷＴ酵素と比べて改良された機能を示す。これらの変異体は、1よりも大きい機能指数を持つが、改良された機能を持つ。
表１３．２は、BMI-TIDE（登録商標）2X機能アッセイについて選択複数置換指標
表１３．２は、BMI-TIDE（登録商標）2X機能アッセイにおける選択された複数置換変異体について得られたデータを提供する。表は、上に記載の様に変異体について計算された機能指数を提供するが、これらはＷＴ酵素に比べて改良された機能を示す。これらの変異体は、１より大きい機能指数を持つが、改良された機能を持つ。
Figure 0005507843
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実施例１４
nprE変異体の安定性
この実施例では、nprE変異体の安定性を決定する実験について述べる。
これらの実験では、実施例１に先立ち記載された方法が機能指数を決定するために用いられた（上の「洗剤の存在下でのnprEの安定性アッセイ」を参照）。
以下の表はDTPAを用い又は用いずに試験された1より大きい機能指数(PI>1)を持つこれらの変異体の試験結果を示す。
安定性は高温で培養する前及びその後にAGLA活性を決定することにより測定した。表はこれらの条件下でWTと比較した相対的安定度の数値を含む。これは（変異体残留活性/ＷＴ残留活性）の商である。１より大きい数値は洗剤の存在下で高い安定性を持つことを示す。表14.1 及び14.2のデータは、これらの条件下で、 DTPAを用いた及び用いない場合のNprEの単一置換変異体のWT NprEの安定性と比較した相対的安定性のデータを示すものである。
表14.3 及び14.4のデータは、これらの条件下で、DTPAを用いた及び用いない場合のNprEの複数置換変異体のWT NprEの安定性と比較した相対的安定性を示すものである。
Figure 0005507843
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Figure 0005507843
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Figure 0005507843
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Figure 0005507843
以下の表（表１４．５）のデータはクエン酸安定性アッセイにおける
NprE変異体のWT NprE安定性と比較した相対的安定性を示す。安定性は、高温で培養する前及びその後にAGLA活性を決定することによりカゼイン活性を決定することにより測定した（上記の「クエン酸安定性アッセイ」を参照）。表はこれらの条件下でＷＴと比較した相対的安定性を含む。これは、（変異体残留活性/ＷＴ残留活性）の商である。１より大きい数値は洗剤の存在下で高い安定性を持つことを示す。
Figure 0005507843
Figure 0005507843
Figure 0005507843
実施例１５
BPN' 217Lと比較したnprE のｐＨ機能データ
この実施例では、nprE及びBPN' 217Lを比較した機能を評価する実験について述べる。これらの実験では、116 (BMI)及びEquest 草の染みが使用された。
Figure 0005507843
材料見本が処理のために準備された。1処理当り１８の材料見本を用いて、1処理当り3反復行われた。草の材料見本が色あせを防ぐため暗室で準備された。Minolta Chromameter CR200を用いて約１８の汚れた材料見本の反射値を得た。材料見本ごとに3つの読み取り数値を得た。Ｌ値、平均Ｌ値及び標準偏差値が記録された。これはＬ初期値（Ｌinitial value）である。
洗剤溶液が以下の様に準備された（全４０Ｌ）。この溶液は試験の前夜に準備するのが好ましい。溶液は冷所に一夜保存された。溶液は50 L 混合タンクに39.724 Kg のDI水を加え、攪拌を開始し、60 グラムのTIDE（登録商標）液体洗剤中で混合し、16 mL の硬水溶液中、及び200 mLの1 M Bis-TRIS-プロパンでで混合して準備した。
ｐＨは濃硫酸（もし溶液が一夜保存されたばあいは、ｐＨは一夜置くと上がるため、所望のｐＨより、ｐＨは0.2単位低く調整された）最終濃度は：TIDE（登録商標） = 1.5 g/L; 水の硬度 = 6 gpg; 及びBis-TRIS-プロパン= 5 mMであった。
Terg-O-Tometerでの試験のため、１Ｌの洗剤溶液が各Tergポットに加えられ、温度はそのまま置いた状態とした。酵素が種々の濃度でポット添加された。
BMI試験のために、使用された酵素濃度は0 mg/L, 0.275 mg/L, 0.55 mg/ml, 1.65 mg/L, 2.65 mg/L,及び5,50 mg/Lであった。草の染みでは、使用されたnprE濃度は0 mg/L, 0.1925 mg/L, 0.385 mg/L, 1.155 mg/L, 1.925 mg/L, 及び3.85 mg/L（BPN' Y217Lの濃度はBMI試験で使用されたものと同じであった）。攪拌が開始され、そして材料見本が加えられた。全ての複製は同じTerg-O-Tometer (例えば、第一の運転でOX & V2 X, 第二の運転でIX & 3X 及び第三の運転で 5X & 10X)中で並列して行われた。温度は15℃で、攪拌速度は１００ｃｐｍ、及び洗浄時間は12分であった。処理された材料見本は４Ｌの水道水(~6 gpg)中で3度すすがれた。材料見本は紙タオル上で一夜空気乾燥された。草の材料見本は紙タオルで覆われ、そして暗室中で自然乾燥された。乾燥された材料見本の反射値は上に記載した様に決定された。材料見本ごとに3つの読出し値が得られた。Ｌ値、平均Ｌ値、及び標準偏差値が記録された。これはＬ最終（Ｌfinal）値である。
汚れ除去のパーセント(%SR)は以下の式を用いて、各試験条件及び両酵素について決定された：
%SR=[(Lfinal − Linitial)/ (L0 − Linitial)]x 100%
式中L0＝汚れのない材料見本の反射率
Linitial＝汚れのある材料見本の反射率
Lfinal＝洗濯された材料見本の反射率
酵素のないコントロール（no enzyme control）に対するデルタ%SRは以下の式を用いて決定された：
Δ%SR = %SRtreatment（処理） − %SRno enzyme control（酵素コントロールなし）
BPN' Y217LはEMPA 116 (BMI)上のnprEとpH数値 6.7, 7.5, 8.5及び9.5で比較された。
BPN' Y217Lでは約pH 8.8で最高値であったが、EMPA 116上のnprEの機能は約pH 8で最高値をつける様に思われる。この結果よりnprEは、pH 6.7ではBPN' Y217L 同様に効果はないが、pH 7.5 及び8.5においてBPN' Y217Lよりも良く機能することが分かる。これらの酵素の機能はpH 9.5では同等であった。更に、これらの酵素の機能はEquest草 (中程度)上では、pH 7.8-8.4において差はなかった。
実施例１６
液体洗剤中のPMN 及びnprEの比較
この実施例ではPMN 及びnprEの洗浄機能を決定する洗浄実験について述べる。PMN 及びnprE酵素の洗浄機能が、プロテアーゼに反応する汚れについてベンチマーク セリン プロテアーゼ（プロテアーゼＡ）と比較して液状Liquid TIDE（登録商標）洗剤で試験された。以下の表に示す様に、PMN及びnprEは、低い酵素レベルにおいてさえプロテアーゼＡよりも汚れを遥かに効果的に除去する。以下の表ではSRIが高いほど良い洗浄機能を持つことを示す。
Figure 0005507843
実施例１７
NprE 及びNprE変異体の熱安定性
この実施例では、NprE 及びNprE変異体の熱安定性を決定するための実験について述べる。酵素は上に述べた様に生成され及び精製された。精製されたタンパク質は、10% SDS-PAGEを用いて決定された95%を超える純度を持ち、ゲル中に唯一つの主要タンパク質が観察される、十分均質なものであると判断された。
このタンパク質は、成熟nprE配列の分子量である32 kDaであった。このタンパク質は1 mM 塩化亜鉛、4 mM 塩化カルシウム, 及び40 % プロピレングリコールを含む 25 mM MES 緩衝液, pH 5.8を用いて保存用に製剤された。これらの実験でのアッセイは、上に記載の蛍光AGLA活性及び以下に述べる示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いたプロテアーゼアッセイであった。
示差走査熱量計(differential scanning calorimetry (DSC))
過度熱容量曲線が、超高感度走査高処理ミクロ熱量計VP-Cap DSC (Microcal)を用いて測定された。ＤＳＣ測定の標準的手順及びその技術的理論は当業者に周知である（例えば、Freire, 1995、Meth. Mol. Biol., 41, 191-218 [1995]を参照）。簡単に言えば、約500 uL の 200-400 ppm の純粋又は限外ろ過濃度 (UFC) タンパク質サンプルが必要とされた。
典型的には、400 ppm のNprE 及び変異体タンパク質 (130 mMクエン酸が存在しない又は存在する場合)が5 mM HEPES, pH 8.0緩衝液中で200℃/時間の自走査速度を用いて20-100℃に亙り走査された。同じサンプルがプロセスの可逆性を検査するために再走査された。NprEでは、熱変性は不可逆であった。NprEの熱溶融の走査速度依存データが25 から200℃/時間に亙る走査速度に対し評価された。NprEの熱溶融点に対する種々の添加物（例えば、第1級及び第２級アルコール、塩、シクロデキストリン、PEG、ソルビトール、グリセロール）による効果が評価された。
結果
野生型NprEの熱安定性は、熱溶融点でのタンパク質濃度の効果を示すために、2つの異なる濃度で決定された。
220 ppm 及び440 ppmの Tm 値が各々67.6±0.5 及び69.2±0.5 ℃で決定された。タンパク質濃度の効果は二次的事象に影響する。これは凝集又は自己分解であることが予期される。しかし、本発明はこれらの特定の機構に限定することを意図しているものではない。しかし、この結果は、NprEの熱溶融点をを正確に決定し、比較するためにはタンパク質濃度が良く適合することが必要であることを示す。熱溶融点に対する走査速度の効果はまた、Ｔｍが150 °C/時間までは走査速度に依存し、そして150- 200 °C/時間では横ばいとなることを示す。
これらの結果に基づき、Ｔｍの走査速度に対する依存を最小にするために全ての調査において200 °C/時間を走査速度の上限として選定した。
NprE及び変異体について収拾した全てのデータを表４に示す。表４はまた130 mM クエン酸の存在下でNprE及び変異体について得られたＤＳＣ熱溶融点を含む。大半の場合において、2つのタンパク質濃度が走査された。この表に示す様に、130 mM クエン酸の存在下での走査の場合、必ずしも全てのタンパク質が熱変性を示すわけではない。
Figure 0005507843
Figure 0005507843
野生型及び種々のタイプのNprEの突然変異体の熱変性プロフィール（ＤＳＣ走査）の代表的なものを図27に示す。変性プロフィールは野生型中間点を示し、及び野生型と比べて熱溶融点が増大した選択された突然変異体、及び野生型と比べて熱溶融点が低減した選択された突然変異体を示す。この図は、ＤＳＣは安定したNprEと安定性のより小さいNprEを区別し、第二次的選別ふるい（スクリーン）として有用であることを明確に示す。変異体の熱溶融点とその洗剤中の安定性には全体として関連する傾向があることが観察される。例えば、変異体S66E, S199E, D220P/E, S 129FV はTIDE（登録商標）において全て勝者であり、野生型NprEに対し熱溶融点が約1℃増大することを示す。この熱溶融点約1℃の増大は小さいが、熱安定性には、典型的には複数のアミノ酸置換が必要であるため、極めて重要なものである。
図２８は130 mMクエン酸の存在下で熱変性プロフィールを示すNprE変異体の熱変性を示す。クエン酸塩はカルシウムが存在しない場合急速にNprEの自己分解を起す洗剤成分である。野生型NprEでは、クエン酸塩が存在する場合は熱変性が起きず、このことはすでに変性しているタンパク質又は十分形成された疎水性コアーを欠くタンパク質の性質と一致する。クエン酸塩の存在で熱変性プロフィールを示す突然変異体は表１７に含まれる。これらの変異体は47- 56 ℃の範囲に熱溶融点を持つ。130 mMクエン酸の存在下でのDSC走査はクエン酸塩に対して野生型NprEより、より安定的な変異体を示す。例えば、クエン酸に対して安定的な変異体はS129I又はS129Vを含んでいることを示し、これらの置換基の何れかを含む組み合わせは、熱溶融点が+ 5℃増加することを示す。
添加剤のNprEの熱溶融点への影響
図２９は種々の添加剤を含む実験の結果を示す。緩衝液は5 mM HEPES, pH 8.0であった。サンプルは200°C/時間の走査速度で、温度20 - 100 ℃で走査された。この図では、横軸は添加剤を加えない野生型NprEのＴｍを示す。これらの実験ではデータはこれらの試薬の存在下ではNprEの熱溶融点(Tm)に対する影響は殆んど又は全くないことを示した。NprE活性の抑制剤、すなわち、ホスホアミドンを含ませることによりTmが約1℃増大することを示しており、このことは抑制剤はNprEの熱変性プロセスに対する安定性に幾らか与っていることを示唆している。
上の条件の何れも熱変性プロセスの逆行を助けることになるものはなかった。しかし、本発明は特定の機構に限定されるものではない。
実施例１８
TIDE（登録商標）でのNprEホモログの安定性及びホモログBMIの 洗濯機能
この実施例ではTIDE（登録商標）でのNprEホモログの安定性並びにこれらのホモログの洗濯機能を評価する実験について述べる。精製されたNprE (“NprE")、バチルス スブチリスNprE (B.S. NprE)、バチルス ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）NprB (B.T. NprB)及びバチルス サーモプロテオリチクス サーモリシン（Bacillus thermoproteolyticus thermolysin (TLN) ）が10mM HEPES, pH8中の200ul 25%TIDE中、10μg/ml 25°Cで90分培養された。当初の活性及び残留活性が上に述べたAGLAアッセイを用いて測定された。簡単に言えば、l0ulのサンプルが200ul のAGLA 緩衝液 (50mM MES, pH6.5, 0.005% TWEEN（登録商標）-80, 2.5mM CaCl2)に添加され、その後10ul の希釈サンプルが200ulのAGLA 基質 (AGLA緩衝液中の2.4mM Abz-AGLA-Nba)に添加された。
350nmでの励起及び415 nmでの発光が最初の100秒の間モニターされ、初期傾斜は酵素活性として記録された。残留活性のパーセントは残留活性を初期活性で割って算出した。図３０は90分後の残留活性を示すグラフである。
TIDE（登録商標）でのこれらのホモログの洗濯機能を決定するために、ある事前に洗濯されたBMIミクロ材料見本が９６ウエルプレートの各ウエルに加えられた。その後、190ulの１ｘコンパクトTIDE（登録商標） (780ug/ml コンパクト TIDE（登録商標）、5mM HEPES, pH8, 6gpg水硬度)が加えられた。その後l0ulの精製NprE, バチルス スブチリス NprE, バチルス ツルギエンシスNprB及びサーモプロテオリチクス サーモリシンがウエルに添加され、酵素の最終濃度を0.25ug/mlとした。プレートはThermomixer上で1400rpmの回転数で振動させ25℃で30分培養された。培養の最後に、l00ulの浮遊物が新しい９６ウエルプレートに移された。浮遊物の405nmのODが測定された。浮遊物のODから、酵素を添加しないブランクコントロールのODが差し引かれた。機能指数が、各ホモログのODをNprEのODで除して算出した。図３１は本明細書に記載のNprEホモログのみならず、nprEのＢＭＩ洗濯機能を示すグラフである。
実施例１９
野生型nprE及び変異体の金属分析
この実施例では、nprE及びnprE変異体の亜鉛及びカルシウム含有量を決定する実験について述べる。これらの実験では、誘導結合プラズマ質量分析法（inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICPMS)）及び微小焦点ビームの荷電粒子励起X線分析（particle induced X-ray emission with a microfocused beam (micro-PIXE)）による全微量金属分析が実施され、NprEの亜鉛及びカルシウム含有量が確認された。全般に、一つの亜鉛と二つのカルシウムイオンが固く結合している。全てのICPMS 及び micro-PIXEサンプルは、外因性金属汚染を除外するため、金属を含まない緩衝液中で準備された。典型的には、250 uL の40 mg/mL NprEサンプルが、YM-10ミクロ透析装置を用いて20 mM HEPES, pH 8.2により3度緩衝液交換された。金属を含まない緩衝液はChelax 100 樹脂を詰めたカラムを緩衝液を通すことにより生成した。最終タンパク質濃度は、Sigma製Bicinchoninic酸タンパク質決定アッセイキット(BCAアッセイ)を用いて決定した。ICPMSサンプルはWest Coast Analytical Services, Incで分析された。Micro-PIXEサンプルはIon Beam Analysis Laboratoryで分析された。
表19-1は、NprE野生型のカルシウム及び亜鉛イオンのICPMS金属分析結果を示す。タンパク質濃度との対比で、2つのカルシウム及び２つの亜鉛イオンがサンプルに存在することが分かった。
Figure 0005507843
MicroPIXE元素組成分析プロットでは、タンパク質内部標準に対する金属含有量を測定した。Micro-PIXEを用いて検知した全てのピークはNprEの場合3つのメチオニンによる硫黄ピークに関連し算出された。観察された大きい塩化物イオンピークは緩衝液中の塩の存在によるものであった。
表18-2はMicro-PIXEにより決定された金属含有量を示し、これは、通常
NprEはタンパク質１分子当り２つの強く結合したカルシウム及び１つの亜鉛イオンを含むことを示す。野生型NprEは１つの亜鉛イオンと2つのカルシウムイオンを示した。カルシウムイオンはサンプルの準備により低オキュパンシーレートを示していると思われる。
S58D 及びT60Dはタンパク質当り２つの亜鉛イオンに近い数値を示しており、これは追加の亜鉛イオンが部位に結合している可能性を示す。二重変異体（double variant）は２つの追加のシステインを持ち、技術の正確性を増すものである。しかし、本発明は特定の数のイオンを持った実施の態様に限定されるものではない。
Figure 0005507843
サーモリシン又はサーモリシン類似のプロテアーゼ(TLP) （例えば、Dahlquist 他、Biochem., 15:1103-1111 [1976]; Srpingman他、(1995) Biochemistry 34, 15713-15720 [1995];及び Willenbrock他、(1995) FEBS Lett. 358:189-192 [1995]を参照）の様な、他の特徴のはっきりしたカルシウム及び亜鉛依存の中性プロテアーゼと相反せず、NprEは、1分子当り、少なくとも２つの固く結合したカルシウムイオン及び１つの亜鉛イオンを含むことが分かった。潜在的な第3のカルシウム結合部位が提案されているが非常に弱いものであると考えられる。全てのサンプルは外生的金属を除去するために脱塩されているため、これらの弱く結合したカルシウム部位は非占有であると考えられる。
実施例２０
TIDE（登録商標）Compact HDL 洗剤でのギ酸カルシウムによるNprEの安定化
この実施例では、TIDE（登録商標）Compact HDL 洗剤中でNprEを安定化する方法を開発するための実験について述べる。これらの実験では、実験的TIDE（登録商標）コンパクト製剤 (TIDE（登録商標）2x)中のDTPA含有量を低下させつつ、クエン酸濃度を一定にしてギ酸カルシウムを増すことにより、NprEを安定化させる方法を検討する。統計的な実験による設計方法（statistical design of experiments (DOE) methodology）が、データ分析ならびに実験を単純化するために用いられた。
TIDE（登録商標）に存在するDTPAはNprEの安定性にマイナスの影響を与え、他方、ギ酸カルシウムを追加することにより定量のTIDE（登録商標）コンパクト製剤への不利な影響を克服するのに役立つことが示された。
2つの中心点を持つ完全中心複合応答表面モデル（full central composite response surface model）がDOEモデルとして用いられた。４つの成分を変える全１６の特異な製剤が、表19−1に記載の組成物変形に従い事前に生成された。LASは一定のクエン酸濃度(1.9%)において、DTPA (0 - 0.25%)及びギ酸カルシウム (0 - 0.2%)により0 - 6% (w/w)の範囲で変えられた。TIDE（登録商標）洗剤の他の全ての成分は一定に保たれた。成分濃度境界条件が種々のミックスの相（phase）の安定性に基づき決定された。タンパク質安定性試験は定量(〜100%) 製剤ミックス中で780 ppm nprEにより実施され、32℃で培養された。不活性化は24時間まで測定された。全てのアッセイは、0.5 ppmタンパク質濃度で赤色蛍光ラベルを付したカゼインアッセイキット（Invitrogen）を用いて実施された。NprE不活性化率は3つの独立した実験により測定された。DOEデータはDOE Fusion Pro (S-Matrix)を用いて分析された。
Figure 0005507843
表20.2 及び図31は種々の製剤ミックスで測定されたNprEの安定性の測定結果を示す。平均速度及び標準偏差は3つの独立した測定結果の平均したNprE不活化率（時間-1）(hour-1)である。数量的には、低いDTPA含有量で高いカルシウム量を含む製剤は定量コンパクトTIDE（登録商標）においてより安定する傾向がある。例えば、製剤＃５は、DTPAを追加せず高いギ酸カルシウムレベルであるが最も低い不活化率を示し、このことはNprEの安定度が高いことを示す。これと対照的に、製剤＃９は、高いDTPA 濃度を持ち、ギ酸カルシウムを添加しておらずが最も安定性が低かった。表20.2では、ランキングは測定された安定性をベースとしている（すなわち、平均値）。ラン（Run）は３つの独立した安定性実験によるものである。
Figure 0005507843
図３３は、固定されたギ酸カルシウム濃度でDTPAを種々変えたレベルでのNprE不活化における影響を示す。パネルAはギ酸カルシウムを全く追加しない場合のDTPAによるNprE不活化率を示す。この相関関係より、DTPAは極めて不利な影響を与えることが分かる。パネルBは0.1%ギ酸カルシウムの場合DTPAの影響が幾らか減少することを示す。パネルCは、0.2%ギ酸カルシウムの場合DTPAの影響が大きく減少することを示す。図３４は、DOE分析ソフト(Fusion Pro)により作成された、0.5 hr-1未満(Panel A), 0.25 hr-1未満(Panel B)及び0.05 hr-1未満(Panel C)の反応目標（崩壊率）に基づくDTPA及びギ酸カルシウム組成物の予測データを示す。斜線部分は、設定目標未満の崩壊率の安定性を示すと予測されるDTPA及びギ酸カルシウム組成物を示す。例えば、0.04% DTPAが存在する場合、0.16%のギ酸カルシウムは図３４のパネルBに示す様に0.25 hr-1未満の崩壊率の安定性を持つNprEを提供するであろう。他方、0.16% DTPAの存在する場合、0.08%のギ酸カルシウムは少なくとも0.25 hour-1未満の崩壊率の安定性を持つNprEを維持することができない。
実施例２１
バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）中性金属プロテアーゼNprEのクエン酸誘発自己分解部位の同定
この実施例では、野生型及び組み換え変異体nprE（例えば、バチルス スブチリス（Bacillus subtilis）変異体）のクエン酸誘発自己分解の評価に用いる方法について述べる。これらの実験においては、バチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（バチルス スブチリスで発現させた天然及び組み換え変異体）由来の中性金属プロテアーゼの自己分解がクエン酸ナトリウム(Sigma)を用いて誘発された。自己分解プロセスは25 mM MES, pH 6.5の緩衝液中で4℃で反応させることにより制御された。これらの実験では、0.4 mg/ml NprEの自己分解が(a) 10 mMのクエン酸中で培養時間(10-100分)、又は(b)100分の間でクエン酸濃度(10-100 mM)を変えることにより最適化された。緩衝液のみで希釈された（すなわち、クエン酸を使用しない）中性金属プロテアーゼのコントロールが同じ条件で培養された。自己分解反応は同容積の１N HClを加えて終了させ、サンプルはTCAを用いて沈殿させ、ペレットが洗浄されアセトンを用いて乾燥させた。出来たペレットは20 uL 緩衝液, pH 6.5, 及び4X LDS サンプル緩衝液 (NuPage, Invitrogen)で再懸濁された。
自己分解断片は10 % (w/v) SDS-PAGEにより分解され、PVDF膜に電気的に吸着させた。最初の１０のアミノ酸残基がEdman 分解 (Argo Bioanalytica)により配列決定された。自己分解断片の一部のアミノ酸配列が、ゲル中でトリプシン消化により決定され、LCQ-MS (Agilent)を用いて解析された。ゲル中消化プロセスはタンパク質を含むゲル部分を柔らかくし、Coomassieブルー染色を除去し、それに続いて2 M尿素を含む25 mM NH4CO3中でゲル部分を再水和させることを含んでいた。トリプシンが、37℃で約6時間再水和させたゲル部分に加えられた。消化に続いて、ペプチドがアセトニトリル及びTCAを用いて抽出された。ペプチドはアセトニトリル−水の勾配を用いてC4疎水性カラム(Vydac)上で分離された。結果のペプチドマップが、Genencorの酵素を含むデータベースに対して、SEQUEST（登録商標）データベースサーチプログラムによりサーチされた。
各断片の最初の１０のアミノ酸のアミノ酸配列がバチルス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）NprEの既知のアミノ酸配列と比較された。これによりN-末端のアミノ酸、そして開裂部位を同定することができた。
クエン酸誘発断片の生成及びその分解は10 % SDS-PAGEで行われた。断片サイズは、Invitrogen製の標準分子量マーカーを用いて同定した。
10 mMのクエン酸の存在する中で、残りの変化を受けていない（原型）NprEに加えて２つの断片が100分の時間範囲において観察された。低クエン酸濃度で形成された2つの断片はサイズが24 kDa 及び9 kDaであった。変化を受けていないnprEは32 kDaであった。100分の時間範囲ではタンパク質の多くの部分が開裂されている（すなわち、主要自己分解断片）。これらの条件では追加の断片は観測されず、又は検出されなかった。第二次自己分解断片を得るためにクエン酸を増加させた100分の範囲で検討が行われた。この実験では、10 - 30 mM濃度のクエン酸が用いられた場合、上に述べた２つの断片観察された。
40 mMのクエン酸では24-kDaの比較的大きな断片がはっきり見られたが、15-kDaもまたはっきり見られた。50 - 100 mMのクエン酸では、24 kDa断片及び9-kDa断片は最早検出されなかったが、21 kDa, 15 kDa 及び11 kDaの他の3つの断片が観察された。
24 kDa, 9 kDa (最初の2つの断片),及び21 kDa, 15 kDa及び11 kDa (次の自己分解断片)のN末端がEdman 分解 (Argo Bioanalytica)を用いて同定された。
Figure 0005507843
バンドAl, A 3 及びA4は、原型NprEのN末端にマッチする天然のN末端を持つ。バンドA2の配列報告では、最も弱い配列が、２つの残基及び1つの残基が各々より強い配列より短いことを除いては、より強い配列と同一であると見られる3つの断片を示す。これはその特定のタンパク質断片のほころび（fraying）と一致した。ゲル断片のパターン及びサイズは、15 kDa (バンドA4)は21-kDa 断片 (バンドA3)に由来することを示唆し、そしてC末端は位置198であり、又はそれに近いと推定される。
しかし、本発明はこの特定に実施の形態に限定されることを意図するものではない。
図３５は種々の断片（N-末端の配列決定の目的では1-5 又は Al-5）のアミノ酸配列を示す。断片1 (Al)は、原型天然タンパク質（配列番号２２２）のそれに等しいN末端残基を持ち、断片２(Ad2)のN末端はD220 (配列番号223)から、又はその近くから開始される。次の２つのアミノ酸残基(A221及びG222)はまた、この断片がほころびを持つと同定されているため注目される。断片3 (A3) (配列番号224)及び断片4 (A4) (配列番号225)は原型タンパク質のN末端を持ち、断片5 (A5) (配列番号226) はL198から始まる。
断片４のC末端はM138であるか又はその近くにあると思われる（A3 及びA4のサイズの違いに基づく）。A3については対応する断片は検出されなかった。
トリプシンの消化に続くLCQ-MSによる断片１から５のペプチドマップ作成は、各断片内に幾つかのアミノ酸ペプチドを確実に同定した。これらは図３５に取り上げて示す。LCQ-MSは断片の同定を明確にコントロールした。
N末端及び開裂断片のLCQ-MS分析に基づき、主要開裂部位はD220, A221, G222, M138、及びL198のアミノ酸位置であると同定された。これらの部位は特異的突然変異誘発法を用いて標的に定め、D220, A221, G222, L198, 及びM138, D139の部位評価ライブラリーが作られた。突然変異体タンパク質は、本明細書に記載の様に、洗剤及びBMI洗濯機能での安定性を増大させるためにスクリーニングされた。ある例では、クリップ部位（clip site）が事実確実に標的とされる様に、これらの部位と共にアミノ酸もまたタンパク質操作のために選択された。
タンパク質操作の結果は、D220におけるPro又は Gluのアミノ酸置換により洗剤中でより安定性のあるNprE分子が生成されることを明確に示した。更にG222をCysにより、及びM138をHe又はLeuにより置換することによりNprE分子に更に安定性を増すことができた。通常これらの特異アミノ酸置換はBMI洗濯機能を損なうことなくNprEに洗剤安定性の利点を与えた。したがって、これらの実験によりクエン酸誘発自己分解部位のための重要なマップデータを提供し、NprEの全体的安定性を変え及び影響を与える中心となるアミノ酸残基の同定が容易となる。クエン酸（洗剤マトリクスに添加されるビルダー）はNprEを不安定にし及び自己分解させるが、必須カルシウム結合原子をキレートすることによりその様にすると言われる。極めて厳格な洗浄条件でのNprEの使用では、これらの設定の中で、より安定性のあるNprE分子を使用することが必要となる。これらの実験では、NprEの一以上の自己分解部位を置換することにより、これらの極めて厳格な洗浄条件における使用でより洗剤として安定性のあるnprEを生成することが出来た。
実施例２２
液状洗濯洗剤組成物
この実施例では、液状洗濯用洗剤組成物の種々の製剤が提供される。本発明の以下の液状洗濯用洗剤組成物が生成される：
Figure 0005507843
上の実施例２２（I）から（II）のｐHは約8から約11であり、実施例２２（III）から（V）のｐHは約7.5から約8.5である。
実施例２３
皿の手洗い液体洗剤組成物
この実施例では、種々の皿の手洗い液体洗剤製剤を提供する。本発明の皿の手洗い液体洗剤組成物は以下の通りである。
Figure 0005507843
実施例２４
自動皿洗い機用液体洗剤組成物
この実施例では、種々の自動皿洗い機用液体洗剤製剤を提供する。本発明の自動皿洗い機用液体洗剤組成物は以下の通りである。
Figure 0005507843
実施例２５
顆粒及び/又は錠剤洗濯用組成物
この実施例では、種々の顆粒及び/又は錠剤洗濯用洗剤を提供する。本発明の、顆粒及び/又は錠剤形式である、以下の洗濯用組成物が生成される。
Figure 0005507843
実施例２６
液体洗濯用洗剤
この実施例では、種々の液体洗濯用洗剤の製剤を提供する。以下の本発明の液体洗濯用洗剤製剤が生成される。
Figure 0005507843
実施例２７
高密度皿洗い用洗剤
この実施例では、種々の高密度皿洗い用洗剤製剤を提供する。以下の本発明のコンパクトな高密度皿洗い用洗剤が生成される。
Figure 0005507843
実施例２８
錠剤洗剤組成物
この実施例では、種々の錠剤洗剤製剤を提供する。本発明の以下の錠剤洗剤組成物は、標準12ヘッドロタリープレスを用いて13KN/cm2の圧力で顆粒状皿洗い洗剤組成物を圧縮することにより生成される。
Figure 0005507843
実施例２８（I）から（VII）のｐHは約10から約11.5である;
15（VIII）のｐHは８−１０である。実施例２８（I）から（VIII）の錠剤重量は約20グラムから約30グラムである。
実施例２９
液状硬表面洗浄用洗剤
この実施例では、種々の液状硬表面洗浄用洗剤の製剤を提供する。本発明の以下の液状硬表面洗浄用洗剤組成物が生成される。
Figure 0005507843
本願発明の特定の実施の態様が説明及び記載されているが、当業者であれば本願発明の精神及び範囲から外れることなく種々の改変及び修飾が可能であることは明らかであろう。したがって、特許請求の範囲においては本願発明の範囲にある全ての改変及び修飾を含むことを意図するものである。
本明細書に記載の全ての特許、刊行物はこの発明が関係する技術分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許、及び刊行物は、それらの各刊行物が明示的に特定して、又個別に参照により本明細書に組み入れられると同様に、此処に参照により組み入れられる。
本願発明の好ましい実施の形態について記載されているが、当業者にとって開示された実施の形態に対して種々の修飾をすることは可能であり、またそれらの修飾されたものは本願発明の範囲にあることは明らかであろう。
その技術分野の当業者であれば、本発明に固有のものに限らず、本発明を、本明細書に記載の目的を実施するために容易に改変されうることを、直ちに理解し、本明細書に記載の目的と利益を達成するであろう。本明細書に記載の組成物、方法は好ましい実施の形態の代表例であり、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。本発明の範囲及び精神から離れることなく種々の置換、修飾を加えることは当業者にとって容易なことである。
本明細書に説明により記載された発明は、特にそこで記載されていない要素、限定が含まれていない場合においても適切に実施しうると考える。用いられた用語、及び表現は記載のために用いられるもので、限定の意味に解してはならない。そのようは用語及び表現は、その特徴を持つ同等物及びその部分を除外するものではない、しかし、本発明の特許請求の範囲内において種々の修飾が可能であることを認識すべきである。このように、本発明は、好ましい実施の形態及び任意選択された特徴により特に開示されたものであるが、本明細書に開示された概念の、修飾及び変形は当業者により実施が可能であり、したがって、そのような修飾及び変形は特許請求の範囲に記載された、本発明の範囲内であると解される。
本発明は、広く又一般的な表現により記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い範囲の種類、亜属のグループの夫々もまた本発明の部分を構成する。したがって、これは、排除された材料が特に本明細書に記載されているか否かを問わず、その属からあるものを除外するという条件又は否定的限定を持つ本発明の一般的な記載についても同様に適用される。
図１は各々蛍光染料Fluo-Zn3及びFluo-3を用いて精製されたMULTTFECT（登録商標）中性結合タンパク質の亜鉛及びカルシウムカチオンの親和定数の決定結果を示すグラフである。 図２は、QuantiCleave（登録商標）プロテアーゼアッセイによりアッセイされた線状アルキル ベンゼン スルホン酸塩（Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS)）による0.36 mg/mlの調製された組み換えバチルス アミロリケファシエンスnprEのプロテアーゼ活性の抑制を示すグラフである。 図３は本発明で使用できる種々の金属プロテアーゼホモログ（配列番号173-181）の配列アラインメントを示す。 図３は本発明で使用できる種々の金属プロテアーゼホモログ（配列番号173-181）の配列アラインメントを示す。 図４は、本発明で使用できる種々の金属プロテアーゼホモログ（配列番号182-191）の配列アラインメントを示す。この図では、ナンバリングはサーモリシン（B.サーモプロテオリチクス）(B. thennoproteolyticus)についてのものである。図３の様に、「＊」は保存残基を示し、「：」は控えめに置換された残基、及び「．」は同様な残基を示す。 図４は、本発明で使用できる種々の金属プロテアーゼホモログ（配列番号182-191）の配列アラインメントを示す。この図では、ナンバリングはサーモリシン（B.サーモプロテオリチクス）(B. thennoproteolyticus)についてのものである。図３の様に、「＊」は保存残基を示し、「：」は控えめに置換された残基、及び「．」は同様な残基を示す。 図５は、ホモロジーモデリングにより同定された種々の金属プロテアーゼホモログ（配列番号192-195）の配列アラインメントを示す。 図 6 はプラスミド pJ4:GO1905のマップを示す。 図 7 はプラスミドpJ4: GOl 906のマップを示す。 図 8はプラスミドpJ4:G01907のマップを示す。 図 9 はプラスミドpJ4:G01908のマップを示す。 図 10はプラスミドpJ4:G01909のマップを示す。 図 11はプラスミドpJ4:G01938のマップを示す。 図 12 はプラスミドpJHTのマップを示す。 図 13はプラスミドpACのマップを示す。 図 14 はpUBnprEのマップを示す。 図１５はaprEプロモータ及びバチルス スブチリスnprE 遺伝子断片の増幅を示す図式である。 図１６はプラスミドpEL501のマップを示す。 図１７はaprEプロモータ及びバチルス スブチリスnprB 遺伝子断片の増幅を示す図式である。 図１８はプラスミドpEL508のマップを示す。 図１９はEL560株の生成に用いられるaprE プロモータ及びバチルス ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）nprT 遺伝子断片の増幅を示す図式である。 図２０はEL560株の構築を示す略図である。 図２１はEL561株の生成に用いられるaprE プロモータ及びバチルス カルドリチクス（Bacillus caldolyticus） npr 遺伝子断片を示す図表である。 図２２はEL561株の構築を示す略図である。 図２３はaprE プロモータ及びバチルス ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis ）nprB遺伝子断片の増幅を示す図表である。 図２４はプラスミドpEL568のマップである。 図２５は32℃で亜鉛及びカルシウムイオンの存在下でTIDE（登録商標）2005塩基中の中性金属プロテアーゼの0.36 mg/ml のUF濃縮を長期保存することを決定するためにデザインされた実験結果を示すグラフである。比較の目的で塩及び余分なカルシウムを使用することなく試験して得られた結果を示す。 図２６はTerg-O-Tometer (TOM) 及び種々の汚染基質を用いた洗濯機能試験データを示す。パネルＡはTIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗浄した後、EMPA 116（綿上で固定及び非固定）上スブチリシン(BPN' Y217L)及び精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。パネルＢはTIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗濯した後、スブチリシン(BPN' Y217L)及び綿上の草により中程度汚れたEquest（登録商標）上の精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。パネルＣは、TIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗濯した後、CFT C-10（綿上の色素、オイル、ミルク）上のスブチリシン(BPN' Y217L)及び精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。 図２６はTerg-O-Tometer (TOM) 及び種々の汚染基質を用いた洗濯機能試験データを示す。パネルＡはTIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗浄した後、EMPA 116（綿上で固定及び非固定）上スブチリシン(BPN' Y217L)及び精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。パネルＢはTIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗濯した後、スブチリシン(BPN' Y217L)及び綿上の草により中程度汚れたEquest（登録商標）上の精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。パネルＣは、TIDE（登録商標）−2005 洗剤液中で15℃で洗濯した後、CFT C-10（綿上の色素、オイル、ミルク）上のスブチリシン(BPN' Y217L)及び精製MULTIFECT（登録商標）Neutralによるデルタ汚れ除去(%)した結果を示す。 図２７は、440 ppm NprE及びVP-Cap DSC (MicroCa（登録商標）)を用いて得られた変異体のＤＳＣスキャンの結果を示すグラフである。 図２８は、440 ppm NprE及びVP-Cap DSC (MicroCal（登録商標）)を用いて得られた１３０mMクエン酸の存在下での変異体のＤＳＣスキャンの結果を示すグラフである。 図２９は、種々の添加剤の存在下でVP-Cap DSC (MicroCal（登録商標）)を用いて得られた440 ppm NprEの熱融解点を示すグラフである。この図では、横軸は添加剤を加えない野生型NprEのＴｍを表わす。 図３０は、90分後の25℃で25% TIDE（登録商標）中のnprE 及びnprEホモログの残存活性を示すグラフである。 図３１は、nprE 及び nprEホモログのBMI洗濯機能を示すグラフである。 図３２は種々の製剤混合物中でのNprE安定度測定の結果を示すグラフである。 図３３は固定されたギ酸カルシウム塩濃度で異なる% のDTPA濃度に対するNprEを不活化率を示すグラフ（パネルＡ，Ｂ及びＣ）を示す。 図３４は、反応目標（崩壊定数）に基づくDTPA及びギ酸カルシウム塩組成物のDOE解析ソフトウエアによる予測データを示すグラフ（パネルＡ，Ｂ及びＣ）を示す。 図３５は、自己分解部位を取出したNprEのクエン酸塩誘発自己分解の断片のアミノ酸配列（配列番号222-226）を示す。断片1及び２は最初のクリップ（clip）であり、断片３−５は第二のクリップ（clip）を示す。斜字は配列付けされたＮ末端を表わし、太字は各断片のインゲル（in-gel）分解から同定されたペプチドを表わす。

Claims (8)

  1. 配列番号３の親ポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を持つ単離されたバチルス種中性金属プロテアーゼ変異体、又は配列番号１８と９５％のアミノ酸配列同一性を持つ単離されたバチルス種中性金属プロテアーゼ変異体であり、配列番号１８に対応するアミノ酸の位置に関してQ45E, S66E, S129I, S129V, M138I, S199E, D220P, D220E, G222C及びT004V/S023N よりなる群から選択される位置の少なくとも一つに置換を持ち,前記変異体は前記親ポリペプチドと比べて少なくとも１℃高い熱安定性を持つ、前記変異体。
  2. 前記置換がS129I及びS129Vよりなる群から選択される、請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体。
  3. 前記置換がD220P及びD220Eよりなる群から選択される、請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体。
  4. 前記バチルス種中性金属プロテアーゼがバチルス アミロリケファシエンス中性金属プロテアーゼである、請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体。
  5. 前記変異体が親ポリペプチドと比べて洗剤組成物中で少なくとも１℃高い熱安定性を持つ、請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体。
  6. 前記熱安定性が220又は440 ppmのポリペプチド濃度で示差走査熱量計により決定される、請求項５の中性金属プロテアーゼ変異体。
  7. 親ポリペプチドと比べて改良された洗濯能力を持つ、請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体。
  8. 請求項１の中性金属プロテアーゼ変異体を含む洗浄組成物。
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