KR20010079542A - 개선된 세척 성능을 가진 폴리펩티드-중합체 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중합체가 동종중합체, 그래프트, 블럭, 교호 또는 랜덤 공중합체인것으로, 모 폴리펩티드에 공유결합된 한 종 이상의 중합체를 가지는 폴리펩티드-중합체 결합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 결합체를 포함하는 공업용 조성물 및 제품, 그리고 세제 조성물과 같은 공업용 조성물 및 제품의 세척 성능을 개선하기 위한 상기 결합체의 사용에 관한 것이다.

Description

개선된 세척 성능을 가진 폴리펩티드-중합체 결합체{A POLYPEPTIDE-POLYMER CONJUGATE WITH IMPROVED WASH PERFORMANCE}
세제 산업에서 효소가 30년 이상동안 세척 조제물에 도구가 되어왔다. 이러한 조제물에 사용된 효소는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 셀룰라제 뿐만 아니라 다른 효소, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 상업적으로 가장 중요한 효소는 프로테아제이다.
예를 들어 프로테아제와 같이 증가일로로 상업적으로 많이 사용되는 효소는 예를 들어 DURAZYM(Novo Nordisk A/S), RELASE(Novo Nordisk A/S), MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.), PURAFECT (Genencor International, Inc.)와 같은 자연 발생하는 야생형 프로테아제의 단백질 가공 변이체이다.
그러나, 많은 유용한 효소 변이체가 보고서에 기술되었지만 많은 공업용 사용을 위한 새로운 개선된 효소 또는 효소 변이체에 대한 요구는 여전히 있다.
폴리펩티디는 잠재적으로 도전의 방식에 기초한 -전형적으로는 IgG 및/또는 IgE 반응- 원하지 않는 면역 반응을 일으킬 수 있기 때문에 그것을 감소하기 위한 기법은 최근 삼세기동안 개발되어왔다.
WO 97/24421 및 WO 97/24427은 활성화된 중합체상에서 공유 결합에 의한 효소의 고정화를 개시한다.활성화된 중합체를 사용하는 하나 이상의 효소의 고정화는 특히 효소 단백질의 개선된 항원성 프로필을 보였다. 발명자는 세제 용액에서 효소 성능 프로필에 영향을 주지 않고 효소를 구조적으로 변형시키는 것에 의해 잇점이 달성될 수 있다고 주장한다.
고정화는 공수 물질의 형성을 피해야 하지만, 이 방법은 여전히 고정화 단계의 처리와 과정동안에 먼지의 위험 또는 연무질 형성을 나타낸다.
또다른 기법은 많은 중합체 분자가 당해의 폴리펩티드에 결합되는 결합 기법이다. 이 기법을 사용할 때 면역 체계는 항체의 형성에 책임이 있는 항원 결정부(폴리펩티드 표면상)를 인식하는 어려움을 가지고, 이에 의해 면역 반응을 감소시키기에 어려움을 가진다.
특정 생리적인 효과(즉, 의약)를 부여하기 위해 인체의 순환계에 직접 도입된 폴리펩티드에 대한 전형적인 잠재적인 면역 반응은 IgG 및 /또는 IgM 반응인 반면에, 호흡계를 통해 흡입된 폴리펩티드(즉, 공업용 폴리펩티드)는 잠재적으로 IgE반응(즉, 알레르기 반응)을 일으킬 수 있다.
감소된 면역 반응을 설명하는 이론 중의 하나는 중합체 분자(들)가 항체 형성을 유도하는 면역 반응에 책임이 있는 폴리펩티드 표면의 항원 결정부(들)를 차단한다는 것이다. 또다른 이론 또는 적어도 부분적인 요소는 결합체가 더 무거울수록 더 감소된 면역 반응이 얻어진다는 것이다.
전형적으로 결합체를 형성하기 위해 폴리펩티드의 결합에 사용되는 중합체는 예를 들어 에틸렌 옥사이드(EO), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 프로필렌 옥사이드(PO), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 같은 즉, 하나의 반복 유니트로 구성된 동종중합체이다. 덱스트란과 같은 사카라이드도 또한 사용되었다.
US 특허 번호 4,179,337 는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)과 결합된 효소 및 펩티드 호르몬과 같은 비면역성 폴리펩티드에 관한 것이다.
WO 96/17929 (NoVo Nordisk A/S)는 중합체 분자, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된 변형된 폴리펩티드 결합체에 관한 것이다.
본 발명자는 놀랍게도 중합체-폴리펩티드 결합체가 변형되지 않은 폴리펩티드와 비교하여 개선된 세척 성능을 가진다는 것을 알아냈다.
발명의 개요
첫번째 측면에서 본 발명은 개선된 세척 성능을 가진 폴리펩티드-중합체 결합체에 관한 것이다.
본 발명의 발명자는 0.1kDa 내지 60kDa의 범위의 분자량을 가진 동종중합체가 4kDa 및 100kDa 사이의 분자량을 가진 모 폴리펩티드와 결합할 때 폴리펩티드의 세척 성능은 모 폴리펩티드의 세척 성능에 비하여 개선된다는 것을 발견했다.
본 발명자는 더욱이 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체가 일반식:
EOxPOy(I)
(여기서 x=1-99% y= 1-99% x+y=100%)을 가지고 공업용 이용분야에서 사용되는 모 폴리펩티드에 공유결합으로 결합될 때 세척 성능은 모 폴리펩티드에 비하여 개선된다는 것을 발견했다.
양 경우에 호흡 알레르기는 모 효소와 비교할 때 또한 감소될 수 있다.
후자의 경우에 호흡 알레르기는 PEG또는 다른 동종중합체과 결합된 상응하는 결합체와 비교할 때조차 감소할 수 있다.
두번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합체를 포함하는 공업용 제품에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
세번째 측면에서 본 발명은 세척 성능을 개선하기 위한 결합체의 사용에 관한 것이며 궁극적인 측면에서는 본 발명은 폴리펩티드의 세척 성능을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
공업용 폴리펩티드
공업용 이용분야에서 사용되는 폴리펩티드는 종종 효소 및/또는 항균 작용을 가진다. 공업용 폴리펩티드는 (약학적 폴리펩티드와 대비하여) 체내의 순환계에 도입될 목적이 아니다.
그러므로, 세제 즉, 세탁물 및 그릇 세척 세제와 같은 공업용 조성물 및/또는 제품(하기에 정의된), 직물을 처리하기 위한 조성물 및 화장품을 포함하는 개인용 케어 제품에서 활성 성분으로 사용되는 효소와 같은 공업용 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드(또는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 제품)가 혈액에 주입(또는 이와 유사한 것)되지 않기 때문에, 인간 또는 동물의 체내의 순환계와 직접적인 접촉을 하지 않을 가능성이 높다.
따라서, 공업용 폴리펩티드의 경우에 잠재적인 위험은 호흡기 통과에 의한 폴리펩티드의 흡입의 결과로서의 호흡 알러지(즉, IgE 반응)이다.
본 발명의 명세서에서, "공업용 폴리펩티드"는 펩티드, 단백질 및/또는 효소를 포함하는 폴리펩티드로서 정의되고 그것은 인간 및 /또는 동물의 체내의 순환계에 도입될 목적이 아니다.
이러한 폴리펩티드의 예는 하기에 정의된 대로 효소작용을 가진 폴리펩티드를 포함한다.
그러나, 하나 또는 그 이상의 중합체가 효소에 결합될 때 상기 효소의 성능은 모 효소와 비교하여 대략 같게 남아 있거나 또는 감소할 것이다.
효소의 촉매적 성능은 많은 것들 중에서 활성 부위에서의 효소와 기질 사이의 접촉에 달려있다. 중합체가 효소에 결합할때 중합체는 효소의 표면에 일반적으로 무작위 방식으로 분배될 것이다. 또한 중합체는 상기 효소의 활성 부위 근처 효소에 결합할 것이고 이것은 입체 또는 공간 장애를 일으킨다.우리는 효소 성능은 역으로 영향을 받을 것이라는 것을 예상한다. 따라서, 우리는 효소 성능이 역으로 영향을 받을 것이라는 것을 예견할 것이다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도 효소 성능은 폴리머의 결합에 의해서 증가될 수 있다는 것을 발견했다.
본 발명은 중합체가 폴리펩티드의 표면에 결합된 동종결합체, 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체인 것으로 폴리펩티드-중합체 결합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 결합체를 포함하는 공업용 조성물 및 제품, 공업용 조성물과 제품의 세척 성능을 개선하기 위한 본 발명의 폴리펩티드-중합체 결합체의 사용, 및 궁극적으로 폴리펩티드의 세척 성능을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도 폴리펩티드의 효소 성능이 개선된 폴리펩티드-중합체 결합체를 제공하는 것에 성공했다.
본 발명은 산업 제품에서 활성 성분으로서 산업상 응용 및 병합에 적합한 폴리펩티드-중합체 결합체에 관한 것이다. 본 발명의 중합체는 또한 호흡 알레르기 발현성을 감소시켰을 지도 모른다.
본 발명의 명세서에서 용어 "폴리펩티드-중합체 결합체"는 하나 또는 그 이상의 폴리머가 폴리펩티드에 공유결합된 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "감소된 알레르기 발현성"은 알레르기 상태를 이끌 수 있는 생산된 IgE(인간 및 특정 동물에서 비교할만한 효과를 가진 분자)의 양은 상응하는 모 폴리펩티드에 비하여 본 발명의 변형된 폴리펩티드를 흡입했을때 감소한다는 것을 의미한다. 용어, "호흡 알레르기 발현성"이 대신에 사용될 수 있다.본 발명의 명세서에서 용어 "개선된 세척 성능"은 결합체를 가지고 세척된 시험 물질의 델타 반사 값이 모 효소(비결합체)를 가지고 세척된 시험 물질의 델타 반사 값에 비하여 증가했다는 것을 의미한다.
용어 "증가된 세척 성능"이 델타 반사 값이 이용될 수 없는 예를 들어 피부 케어 제품과 연관되어 사용될 때에는, 용어는 클린징 효과가 모 효소(비결합체)를사용할 때의 클린징 효과와 비교하여 개선되었다는 것을 의미한다.
본 발명자는 변형되지 않은 모 폴리펩티드가 동종-중합체, 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체와 결합될 때 세척 성능은 개선된다는 것을 발견했다.
폴리펩티드의 흡입에 의해 야기되는 잠재적인 알레르기 반응은 또한 상응하는 변형되지 않은 모 폴리펩티드에 비하여 감소될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 모 폴리펩티드가 100Da 내지 10,000Da의 범위안에서, 바람직하게는 100Da 내지 5,000 Da, 더욱 바람직하게는 100Da 내지 2,000Da,특히 100 내지 1,000 Da 의 범위안에서 분자량을 가진 중합체 분자에 결합될 수 있는 결합체에 관한 것이다.
짧고/가벼운 중합체 분자가 폴리펩티드의 기능 활성을 덜 저해하는 경향을 가진다고 알려진 바대로 짧고/가벼운 중합체 분자를 당해 폴리펩티드에 결합하는 것이 유리하다. 예를 들어, 본 발명의 구체예에 따라 정의된 바와 같은 분자량을 가진 중합체 분자에 결합된 효소의 활성화 부위는 크고/무거운 중합체 분자에 결합된 상응하는 효소에 비하여 중합체 분자에 의한 공간 장애가 덜 하기 때문에 기질에 접근하기가 더 쉽다. 더욱이, 작고/가벼운 중합체를 가진 폴리펩티드-중합체 결합체는 무게가 덜 나갈수록 폴리펩티드 구조를 다른 방향에서 끈다는 사실 때문에 폴리펩티드 구조의 변형이 적어져서 폴리펩티드에 결합된 크고/무거운 중합체 분자를 가진 상응하는 결합체에 비하여 개선된 안정성을 보인다.
작은 중합체 분자를 사용하는 또다른 잇점은 중합체가 킬로당 팔리기 때문에 구입하기에 싸다는 것이다. 이것은 본 발명의 결합체의 생산 단가를 낮춘다.
더욱이, 예를 들어, 다중 반응기를 가진 활성화된 중합체에 효소의 다중 공유 결합으로 부착된 고정화된 효소에 비하여, 본 발명의 결합체는 중합체 분자가 단백질 표면에 각각 공유결합으로 부착된 것을 보인다. 그러므로 효소의 가교를 피하는 것은 이용 매개물에서 촉매제의 동등하거나 증가된 배분을 유도한다.
이것은 고정화된 효소에 비하여 유니트 단백질 당 본 발명의 결합체의 더 나은 성능을 유도할 수 있다.
중합체가 분자 구조, 용제(여기서는 물), 온도, 및 농도에 주로 의존하여 서로 다른 구조/형태를 채용할 수 있다는 것이 공지된다(S. Morster 및 M.Antonietti, Adv. Master, 1998, 10, NO.3, pp 195-217). 구조/형태는 다양한 형태의 교질입자, 박막, 정열된 실린더, 또는 상호연속적인 구조를 포함한다. 용제된 랜덤 코일, 연장된 코일, 막대같은 중합체, 하이퍼코일, 및 소포같은 액상의 배지에서의 공중합체의 분자 구조가 공지된다. (가용성 중합체, M.J.Comstock Ed.ACS Symposium Series, 1991)
그러므로, 어떤 이론에 제한되지 않고 폴리펩티드 표면에 결합된 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체는 더 친수성 동종중합체와 마찬가지로 표면을 더 잘 보호할 수 있는 구조를 취한다고 믿는다. 또한 초분자 구조의 형성에 의한 시너지 효과는 폴리펩티드 표면에의 접근성을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 항체를 가진 친유성 공중합체의 증가된 반발력(PEG 동종중합체에 비하여)이 중요한 역할을 함에 틀림없다.
더욱이, 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체의 더욱 단단한 구조( 동종중합체와 비교하여)는 항체가 알레르기 반응을 일으키는 IgE 형성에 책임있는 폴리펩티드 표면상의 항원결정부위로의 "그 경로를 찾는"(더 단단한 중합체 및 채용된 구조를 통해) 것을 더욱 어렵게 만들 수 있다.
중합체의 소수성은 또한 폴리펩티드 중합체 결합체의 잠재적인 알레르기 발현성에 영향을 가지는 것으로 생각된다.
중합체 및 분자 구조의 적당한 선택에 의해서 폴리펩티드의 표면에 각 보호 항원결정부위를 가진 최적의 범위가 얻어질 수 있다. 더욱이, 부착된 중합체의 특성을 조절하여 예를 들어, 세제와 같은 다른 조제물에 최적화된 특성이 얻어질 수 있다.
또다른 측면에서 본 발명은 하나 이상의 중합체가 모 폴리펩티드에 공유결합으로 결합된 폴리펩티드-중합체 결합체에 관한 것이다. 중합체는 일반식:
EOxPOy(I)
(여기서 x=1-99% y= 1-99% x+y=100%)에 의해 특징지워 진다.
중합체는 바람직하게는 일반식: (I), (여기서 x=10-90%, y= 10-90%, 및 x+y=100%으로 특징지워진다.)
본 발명의 바람직한 구체예에서, 중합체는 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 및 90:10의 비율(EO 유니트:PO 유니트)로 에틸렌 옥사이드 유니트(EO) 및 프로필렌 옥사이드 유니트(PO)로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 100에서 100,000Da, 특히 100에서50,000Da, 특별히 100에서 10,000Da의 분자량을 가진다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 100 에서 12,000Da, 더욱 바람직하게는 300에서 3,000Da의 분자량을 가진다.
본 발명의 구체예에서, 중합체는 이중블럭, 삼중블럭, 다중블럭 중합체이다. 일반식(I)은 EO 유니트와 PO 유니트가 각각 배치되는 중합체를 포함하는 것으로서 해석된다.
알레르기 발현성의 평가
알레르기 발현성은 본 발명에 따른 상응하는 변형된 폴리펩티드를 가진 기관내(호흡관으로)로 투여된 모 폴리펩티드의 효과를 비교하여 흡입 시험에 기초하여 판단할 수 있다.
많은 동물 모델이 생체내에서의 폴리펩티드의 알레르기 발현성 평가를 위해 존재한다. 이러한 모델 중의 몇몇은 인간에서는 위험성 평가를 위한 적당한 기준을 제공한다. 적당한 모델은 기니아피그 모델 및 마우스 모델을 포함한다. 이 모델은 이전에 감각된 동물에서 유도된 유도 반응의 기능으로서 호흡 알레르겐을 확인하고자 한다. 이 모델에 따르면 추정된 알레르겐은 동물 기관내로 도입된다.
기니아피그의 적당한 혈통인 던킨 하트리 혈통는 인간의 경우에는 아니지만, 알레르기 반응과 관련하여 IgE 항체를 생산한다.
그러나, 그들은 효소를 포함하는 흡입된 폴리펩티드에 대한 알레르기 반응에 책임이 있는 또 다른 형태의 항체IgG1A 및 IgG1B(예를 들어, Prento, ATLA, 19, p.8-14, 1991 참조)를 생산한다. 그러므로 던킨 하트리 동물 모델을 사용할 때, IgG1A및 IgG1B 의 상대적인 양은 알레르기 발현성 수준의 측정이다.
효소와 같은 폴리펩티드에 대한 기관내 노출에 적당한 래트 혈통은 브라운 노르웨이 종이다. 브라운 노르웨이 래트는 알레르기 반응으로 IgE 를 생산한다.
기니아피그와 마우스의 호흡 알레르겐을 판단하는 더 세부적인 사항은 킴벌 et al., (1996), 기초 및 응용 독물학, 33, p. 1-10 에 기술된다.
예를 들어 토끼와 같은 다른 동물은 또한 비교할 수 있는 연구로서 사용될 수 있다.
중합체 분자
폴리펩티드에 결합된 중합체 분자는 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카르복실산 (즉, poly -COOH)과 같은 자연 및 합성 동종중합체 및 더욱이 이종중합체 즉, 예를 들어 히드록실기 및 아민기와 같은 하나 이상의 다른 결합기를 포함하는 중합체를 포함하는 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 분자량을 가진 어떤 적당한 중합체 분자일 수 있다.
적당한 중합체 분자의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메트옥시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜, PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지 PEG, 별 모양의 PEG를 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG)과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 폴리 비닐 알콜 (PVA), 폴리-카르복실산염, 폴리(비닐피로리돈), 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-코-말산무수물, 폴리스틸렌-코 말산 무수물, 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 헤파린,동종 알부민, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스 카르복시에틸셀룰로스 및 히드록시프로필셀룰로스를 포함하는 셀룰로스, 키토산의 가수분해물, 히드록시에틸 전분 및 히드록시 프로필 전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로스 및 이의 유도체, 구아검, 풀룰란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물, 생-중합체, 예를 들어, PEG8 스테아르산염(Myrj 45), PEG40 스테아레이트(Myrj 52) 및 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트와 같은 스테아르산염을 포함하는 폴리옥시에틸렌 에스테르, 2 에틸 에테르, 2 펜틸 에테르, 2 세틸 에테르, 2 스테아린산 에테르, 2 오릴 에테르, 3 헥실 에테르, 3 옥틸 에테르, 3 데실 에테르, 3 라우릴 에테르, 3 미리스틸 에테르, 3 세틸 에테르, 3 스테아린산 에테르, 4 헵틸 에테르, 4 옥틸 에테르, 4 데실 에테르, 4 라우릴 에테르, 4 미리스틸 에테르, 4 세틸 에테르, 4 스테아린산 에테르, 5 헥실 에테르, 5 옥틸 에테르, 5 데실 에테르, 5 라우릴 에테르, 5 미리스틸 에테르, 5 세틸 에테르, 5 스테아린산 에테르, 6 데실 에테르, 6 라우릴 에테르, 6 미리스틸 에테르, 6 세틸 에테르, 6 스테아린산 에테르, 7 데실 에테르, 7 라우릴 에테르, 7 미리스틸 에테르, 7 스테아린산 에테르, 8 데실 에테르, 8 라우릴 에테르, 8 미리스틸 에테르, 8세틸 에테르, 8 스테아린산 에테르, 9 라우릴 에테르, 10 라우릴 에테르, 10 트리데실에테르, 10 세틸 에테르, 10 스테아린산 에테르, 10 오릴 에테르, 20 세틸 에테르, 10 이소헥사데실 에테르, 20 스테아린산 에테르, 20 오릴 에테르, 21 스테아린산 에테르, 23 라우릴 에테르, 100 스테아린산 에테르를 포함하는 폴리옥시에틸렌 에테르, 및 모노라우레이트, 모노올레에이트, 모노팔미테이트, 모노스테아레이트, 트리올레에이트, 트리스테레이트를 포함하는 폴리옥시에틸렌솔비탄을 포함하는 군으로부터 선택된 중합체 분자를 포함한다.
바람직한 중합체 분자는 효소의 표면의 부착기에 공유결합으로 결합하기 위해서 상대적으로 간단한 화학작용을 더 요구하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비독성 중합체 분자이다.
PEG 및 특히 PEG 인 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 일반적으로 보여진 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)는 덱스트란, 풀룰란 및 이와 유사한 것과 같은 다당류와 비교하여 바람직하지 않은 가교를 할 수 있는 반응기가 적은 중합체 분자이기 때문에 바람직한 중합체 분자이다.
폴리펩티드에 결합된 중합체는 또한 일반식을 가지는 그래프트, 블럭, 교호, 또는 랜덤 공중합체일 수 있다:
EOxPOy(I)
상기식에서 x=1-99% y= 1-99% x+y=100%이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 중합체는 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 또는 90:10의 비율(EO 유니트:PO 유니트)로 에틸렌 옥사이드 유니트 및 프로필렌 옥사이드 유니트로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체는 분자량 100 내지 100,000 Da, 특히 100 내지 50,000 Da, 특별히 100 내지 10,000 Da 의 분자량을 가진다.
본 발명의 구체예에서, 중합체는 이중블럭, 삼중블럭, 다중블럭 폴리머이다.
폴리펩티드의 표면에 결합하는데 사용될 수 있는 특정 공중합체의 예는: 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜);폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜)모노 부틸 에테르;폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜)모노 메틸 에테르이다.
바람직한 중합체는 예를 들어, PEG 및 PPG 공중합체를 포함한 비독성 중합체이다. 효소 표면의 부착기에 공유결합으로 결합하기 위해 상대적으로 간단한 화학작용을 요구하는 중합체가 바람직하다.
폴리펩티드의 표면에 결합하는데 사용될 수 있는 특정 블럭 중합체의 예이다:폴리(프로필렌 글리콜)- 블럭-폴리(에틸렌글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜);폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜) -블럭-폴리(에틸렌글리콜);폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)모노 부틸 에테르;폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜)모노 부틸 에테르; 폴리(프로필렌 글리콜) -블럭-폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)모노 부틸 에테르;폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜)모노 메틸 에테르이다.
바람직한 블럭 중합체는 1,100 의 평균 분자량(Mn) 및 10 wt %의 에틸렌 글리콜 함유량, Mn=1,900 및 50wt%,Mn=2,000 및 10wt%, Mn=2,800 및 10wt%,Mn=2,800 및 15wt%,Mn=2,900 및 40wt%,Mn=4,400 및 30wt%, Mn=5,800 및 30wt%, Mn=8,400 및 80wt%를 가지는 일반식: H(-OCH2CH2-)X[-OCH(CO3)CH2-]Y(-OCH2CH2-)ZOH을 가지는 블럭 중합체이다.
다른 바람직한 블럭 중합체는 2,000의평균 분자량(Mn) 및 50 wt %의 에틸렌 글리콜 함유량, Mn=2,700 및 40wt%,Mn=3,300 및 10wt%를 가지는 일반식: H[-OCH(CO3)CH2-]X(OCH2CH2-)Y[-OCH(CH3)CH2-]ZOH을 가지는 블럭 중합체이다.
특정 블럭 중합체의 예는 p7120이다: BASF(독일)로부터 상업적으로 구입할 수 있는 Pluronics, 유니온 카바이드(USA)로부터 상업적으로 구입할 수 있는 Tergitol, 플루카(스위스)로부터 상업적으로 구입할 수 있는 Synperonic.
폴리펩티드의 표면에 결합하는데 사용될 수 있는 특정 공중합체의 예이다.:폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜), 특히 평균 분자량 2,500Mn 과 75wt% 에틸렌 글리콜 및 평균 분자량 12,000Mn 과 76wt%에틸렌 글리콜을 가지는 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜);폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜)모노 부틸 에테르, 특히 970Mn과 50wt% 에틸렌 글리콜, 1,700Mn 과 50wt% 에틸렌 글리콜 및 3,900Mn 과 50 wt% 에틸렌 글리콜을 가지는 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜)모노 부틸 에테르 ;폴리(에틸렌 글리코-코-프로필렌 글리콜)모노 메틸 에테르.
바람직한 중합체는 예를 들어 PEG 및 PPG 공중합체를 포함하는 비독성 중합체이다. 효소의 표면의 부착기에 공유결합으로 결합하기 위한 상대적으로 간단한 화학작용을 요구하는 중합체가 바람직하다.
특정 EO-올리고머의 예이다:디에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜 모노메틸에테르, 트리에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글르콜 모노메틸에테르, 테트라 에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜 모노메틸에테르, 펜타에틸렌 글리콜, 펜타에틸렌 글리콜모노메틸에테르, 헥사에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 모노메틸에테르, 헵타에틸렌 글리콜, 헵타에틸렌 글리콜 모노에틸에테르, 또는 선형 직쇄의 에틸렌 글리콜의 2-C14 모노알킬에테르 및 2-7 에틸렌옥사이드 유니트를 가지는 에틸렌 글리콜 올리고머.
그래프트, 블럭, 교호 또는 랜덤 공중합체는 별 모양 또는 분지일 수 있다.
적당한 중합체의 제조
모 폴리펩티드의 표면에 부착될 중합체는 당업계에서 공지된 표준 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 더욱이, 다양한 중합체가 BASF (독일), 유니온 카바이드(USA), 알디쉬, 쉐어워터, 시그마(USA)등의 회사로부터 상업적으로 이용될 수 있다.
중합체의 활성
당해 폴리펩티드와 접합된 중합체가 활성이 없다면 그것은 적당한 기법을 사용하여 활성화되어야만 한다. 본 발명에 따르면 링커를 통해 폴리펩티드에 블럭 또는 공중합체를 결합시키는 것을 또한 고려해야만 한다. 적당한 링커는 당업자에게 잘 공지된다.
중합체 분자의 활성화뿐만 아니라 폴리펩티드의 접합을 위한 방법과 화학작용은 본명세서에 집중적으로 기술된다.
비용해성 중합체의 활성화를 위해서 일반적으로 사용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 페리오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭사이드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할라이드, 트리클로로트리아진등(R.F.Taylor, (1991), "단백질 고정화. 기초 및 응용", Marcel Dekker, N.Y.;S.S.Wong, (1992), "단백질 접합과 가교의 화학", CRC press, Boca Raton;G.T.Hermason et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic press, N.Y.참조)을 가진 관능기의 활성화를 포함한다.
몇가지 방법은 비용해성 중합체의 활성화에 관한 것이나 또한 예를 들어 페리오데이트, 트리클로로트리아진, 술포닐할라이드, 디비닐술폰, 카르보디이미드 등의 용해성 중합체의 활성에 또한 이용된다. 중합체상의 아미노, 히드록실, 티올, 카르복실, 알데히드 또는 술피드릴인 관능기 및 단백질상의 선택된 부착기는 일반적으로 1)중합체의 활성화, 2)결합 및 3)잔기 활성 기의 블럭킹으로 구성되는 활성화 및 접합 화학작용을 선택하는 것안에서 고려되야만 한다.
하기의 많은 적당한 중합체 활성화 방법은 짧게 기술될 것이다. 그러나, 또한 다른 방법이 사용될 수 있다고 이해된다.
폴리펩티드의 유리 산기와 중합체 분자의 결합은 예를 들어 아미노-PEG 또는 히드라지노-PEG (Pollak et al., (1976), J.Am.Chem.Soc., 98, 289-291)또는 디아존아세테이트/아미드(Wong et al., (1992), " 단백질 접합과 가교의 화학", CRC press)와 같은 디이미드의 도움으로 수행될 수 있다.
히드록실기에 중합체 분자를 결합하는 것은 일반적으로 매우 어렵기 때문에 그것은 물에서 수행되어야만 한다.일반적으로 가수분해는 히드록실기와의 반응에서 우세하다.
유리 설프히드릴기에 중합체를 결합시키는 것은 말레이미도 또는 오르토-피리딜 디설파이드와 같은 특정기에 의해 도달할 수 있다.또한 비닐술폰(US 특허 번호.5,414,135, (1995), Snow et al.)은 설프히드릴기에 바람직하나 언급된 다른 것만큼 선택적이지는 않다.
폴리펩티드 사슬의 접근할 수 있는 아르기닌 잔기는 두개의 근접한 카르보닐 기를 포함하는 기에 의해 공격받을 수 있다.
활성화된 PEG 를 리신의 아미노기에 전기친화적으로 결합하는 것을 포함하는 기법이 또한 이용될 수 있다. 알콜에 대한 많은 보통의 이탈기는 아민 결합을 일으킨다. 예를 들어, 트레실레이트(Nilsson et al., (1984), Methods in Enzymology vol. 104, Jacoby, W. B., Ed., Academic Press: Orlando, p. 56-66; Nilsson et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135; Mosbach, K., Ed.; Academic Press: Orlando, pp. 65-79; Scouten et al., (1987), Methods in Enzymology vol. 135, Mosbach, K., Ed., Academic Press: Orlando, 1987: pp 79-84; Crossland et al., (1971), J. Amr. Chem. Soc. 1971, 93, pp. 4217-4219), 메실레이트(Harris, (1985), supra; Harris et al., (1984), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, pp 341-352), 토실레이트와 같은 아릴 술포네이트, 및 파라-니트로벤젠 술포네이트와 같은 알킬 술포네이트가 사용될수 있다.
예를 들어 트레실 클로라이드와 같은 유기 술포닐 클로라이드는 예를 들어 PEG와 같은 많은 중합체의 히드록시 기를 좋은 이탈기로 효과적으로 전화시켜서 폴리펩티드의 아미노기와 같은 친핵체와 반응할 때 안정한 결합이 중합체와 폴리펩티드 사이에 형성되도록 한다.높은 결합체 수득량에 추가하여 반응 조건은 일반적으로 마일드하며(변성을 피하고 활성의 파괴를 없거나 작게 하기 위해 중성의 또는 약간 알카리성 pH ), 폴리펩티드의 비파괴적 요구를 만족시킨다.
토실레이트는 메실레이트보다 더 반응성이 크지만, 또한 더 불안정하여 PEG, 디옥산, 및 술폰산으로 분해된다. (Zalipsky, (1995), 바이오결합체 화학, 6, 150-165).에폭사이드는 또한 아민 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있지만 상기 언급된 기보다 반응성이 훨씬 적다.
PEG를 포스겐으로 클로로포르메이트로 변환시키는 것은 리신에 카르바메이트의 결합을 일으킨다. 이 주제는 클로린을 N-히드록시 숙신이미드로 대체한 많은 변이체에서 수행될 수 있다.(US patent no. 5,122,614, (1992);Zalipsky et al., (1992), Biotechnol.Appl.Biochim., 15, p.100-114;Monfardini et al., (1995), Bioconjugate Chem., 6, 62-69, with 이미다졸 (Allen et al., (1991), Carbohydr. Res., 213, pp 309-319), 파라-니트로페놀, DMAP (EP 632 082 AL, (1993), Looze, Y) 유도체는 일반적으로 클로로포르메이트를 원하는 이탈기와 반응하는 것에 의해서 만들어진다. 모든 이러한 군은 펩티드에 카르바메이트 결합을 증가시킨다.
더욱이, 이소시아네이트 및 이소티올시아네이트는 각각 우레아 및 티오우레아를 수득하는데 사용될 수 있다.
아미드는 상기에 언급된 대로 같은 이탈기를 사용하여 PEG산 및 고리 이미드 트론으로부터 얻어질 수 있다.(US patent no.5,349,001, (1994), Greenwald et al.).이러한 화합물의 반응성은 매우 높지만 가수분해를 빠르게 만들 수 있다.
숙신산 무수물과의 반응으로 만들어진 PEG 숙신에이트가 또한 사용될 수 있다.이에 포함되어진 에스테르기는 결합체를 가수분해에 훨씬 더 영향을 받기 쉽게 한다(US patent no. 5,122,614, (1992), Zalipsky). 이 기는 N-히드록시 숙신이미드에 의해 활성화될 수 있다.
더욱이, 특정 링커가 도입될 수 있다.가장 오래된 것은 염화 시아누르산이다.( Abuchowski et al., (1997), J.Biol.Chem., 252, 3578-3581;US 특허 번호.4,179,337, (1979), Davis et al.;Shafer et al., (1986), J.Polym.Scil.Polym.Chem. Ed., 24, 375-378.) 또한 중합체는 피리미딘 링을 통해 폴리펩티드에 결합될 수 있다.(US 4,144,128, US 4,195,128 및 US 4,298,395 참조)
디아조테이션에 이어서 PEG와 방향족 아민과의 결합후 디아조화는 원 위치에서 펩티드와 반응할 수 있는 매우 반응성 있는 디아조니움 염을 생산한다. 아미드 결합은 PEG의 아즈락톤 유도체와 반응하여(US patent no.5,321,095,(1994), Greenwald, R.B.) 추가적인 아미드 결합을 도입하는 것에 의해서 얻어질 수 있다.
얼마간의 펩티드는 많은 리신을 포함하지 않기 때문에 같은 리신에 하나 이상의 PEG를 부착하는 것이 유리하다. 이것은 예를 들어 1,3-디아미노-2-프로판올을 사용하여 할 수 있다.
PEG는 또한 카르바메이트 결합에 의해 효소의 아미노 기에 부착할 수 있다.(WO 95/11924, Greenwald et al.) 리신 잔기는 또한 골격으로 사용될 수 있다.
관련있는 결합체의 제조를 위한 중합체 활성화 및 PEG 기능화의 일반적인 개관은 Zaplisky, S., Bioconjugate Chem., 1995, 6, 150-165, Hermanson, G.T.,Academic Press, San Diego, 1996, and S.Herman, G.Hooftman, E.Schacht, Journal of Bioactive and Compatible polymers, Vol.10, 1995, 145-187 에서 알 수 있다.
결합된 블럭 또는 공중합체(들)의 위치
실제로 리신 잔기의 아미노기와 같은 모든 이온화된 군은 폴리펩티드 분자의 표면에 있다. (예를 들어 Thomas E.Creighton, (1993), "단백질", W.H.Freeman and Company, New York 참조) 그러므로, 폴리머펩티드의 표면에 쉽게 접근할 수 있는 부착기(즉, 아미노기)의 수는 폴리펩티드의 일차 구조내의 리신 잔기의 수에 N-말단 아미노기 수를 더한 것과 같다.
본 발명에 따라서, 1 내지 100 중합체, 바람직하게는 4 내지 50 중합체 분자, 5 내지 35 중합체는 당해의 모폴리펩티드에 결합한다.
모폴리펩티드
본 발명의 변형된 폴리펩티드는 전형적으로 4 내지 100kDa의 범위, 바람직하게는 15 내지 60kDa내의 분자량을 가지는 모 폴리펩티드에 기초하여 당업계에 공지된 어떤 적당한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
용어, "모" 폴리펩티드은 어떤 비결합 폴리펩티드(즉, 변형되어질 폴리펩티드)를 나타내고자 한다.폴리펩디트는 바람직하게는 세균같은 미생물 기원, 사상균 또는 효모 기원일 수 있고, 또는 식물 기원일 수 있다. 모 폴리펩티드은 자연 발생 (또는 야생형) 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다.
모폴리펩티드를 선택할 때 많은 양의 부착기를 가진 폴리펩티드를 사용하는 것이 유리하다.
더욱이, 본발명의 바람직한 구체예에서, 중합체는 모 폴리펩티드의 표면에 넓게 퍼진다. 효소를 위해서는 어떠한 블럭 또는 공중합체도 활성 부위에 가까운 범위에서 결합되지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "넓게 퍼지다."는 폴리펩티드의 부착기에 결합된 중합체 분자가 폴리펩티드 표면, 바람직하게는 작은 알레르기 발현성 효소가 얻어질 때 인식될 수 있는 관련있는 항원 결정부위가 차단되고 이에 의해 면역체계의 항체에의해 인식되지 않도록하는 것을 확실히 하기 위해 전체 또는 전체에 가깝운 표면 부위의 다른 부분을 차단하기 위하여 위치를 잡은 것을 의미한다. 폴리펩티드 및 항체 사이의 상호작용의 표면 영역은 500 Å2(26 X 19Å)의 범위에 놓이는 것으로 믿어진다. (Sheriff et al. (1987), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, VOL.84, p.8075 참조)
효소를 위해서는 효소 활성의 최소한의 손실을 확실히하고 활성 부위의 가까운 거리내에서 중합체를 결합하지 않는 것이 바람직하다.일반적으로 활성 부위에서 5Å, 바람직하게는 10Å 안에서 어떤 중합체도 부착하지 않는 것이 바람직한 것으로 보인다.
더욱이, 면역계 또는 상기 항원결정부위 가까이에서 인식될 수 있는 공지된 항원결정부위에 결합된 중합체를 가진 폴리펩티드는 또한 본 발명에 따른 유리한 점으로 여겨진다. 만약 항원결정부위(들)의 위치가 알려져있지 않으면 많은 중합체가 폴리펩티드의 표면에 이용할 수 있는 부착기에 결합하는 것이 유리하다.
상기 부착기는 활성 부위로부터 적당한 거리에서 폴리펩티드의 표면위에 넓게 펴져있는 것이 바람직하다.
폴리펩티드의 표면상의 결합된 중합체의 분배를 위한 상기 청구항을 수행하는 모 폴리펩티드는 본 발명에 따르는 것이 바람직하다.
효소에 대해서는 활성 부위로부터 0에서 5Å, 바람직하게는 0에서 10 Å의 거리내에 결합된 중합체가 없거나 매우 작은 중합체 (즉, 0 에서 2)를 가진 효소가 바람직하다.
효소 활성
모 효소는 하기에 정의된 대로 공업용 조성물 및 제품에 사용되는 것으로 알려진 어떤 활성을 가질 수 있다. 기대되는 효소 활성은 라카아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD)와 같은 옥시도리덕타제(E.C.1, "효소 명명법(1992), Academic press, INC.);프로테아제, 서브틸이신 및 지방분해 효소과 같은 특히 세린 프로테아제를 포함하는 하이드로라제 E.C.3,;트랜스글루타미나제(TGases)와 같은 트랜스퍼아제(E.C.2); 단백질 디설파이드 이소멀아제(PDI)와 같은 이소멀아제 (E.C.5)를 포함한다.
모 프로테아제
모 포로테아제 (즉, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 3.4 하에 분류된 효소)는 이 군내의 프로테아제를 포함한다.
예는 효소 분류(E.C.) 번호하에 분류된 것으로부터 선택된 프로테아제를 포함한다. : 3.4.11.5(프로필 아미노펩티다제), 3.4.11.9.(X-프로 아미노펩티다제)를포함하는 3.4.11 (즉, 소위 아미노펩티다제), 3.4.11.10.(세균 루실 아미노펩티다제), 3.4.11.12.(호열성 아미노펩티다제), 3.4.11.15.(루실 아미노펩티다제), 3.4.11.17.(트립토파닐 아미노펩티다제), 3.4.11.18.(메티오닐아미노펩티다제), 3.4.21.1(키모트리신), 3.4.21.4(트립신), 3.4.21.19(글루타밀 엔도펩티다제), 3.4.21.25(쿠쿠미신), 3.4.21.32(브라키우린), 3.4.21.48(세레비신) 및 3.4.21.62(서브틸이신)을 포함하는 3.4.21.(즉, 소위 세린 엔도펩티다제);
3.4.22.2(파파인), 3.4.22.3(피카인), 3.4.22.6(키모파파인), 3.4.22.7(아스크레파인), 3.4.22.31(아나나인)을 포함하는 3.4.22(즉, 소위 시스테인 엔도펩티다제);
3.4.23.1(펩신 A), 3.4.23.18(아스페르길펩신 I), 3.4.23.20(페니실로펩신) 및 3.4.23.25(사카로펩신)을 포함하는 3.4.23(즉, 소위 아스파르산 엔도펩티다제); 및 3.4.24.28(바실로리신)을 포함하는 3.4.24(즉, 소위 메탈로엔도펩티다제).
관련있는 서브틸리신의 예는 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 아미로사카리티커스, 서브틸리신 168,서브틸리신 메센테리코펩티다제, 서브틸리신 칼스베르그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 서브틸리신 147, 테르미타아제, 아쿠아리신, 바실러스 PB92 프로타아제, 프로테아제 K, 프로테아제 TW7, 및 프로테아제 TW3을 포함한다.
이러한 쉽게 이용할 수 있는 상업적인 프로테아제의 특정 예는 Esperase, Alcalase, Neutrase, Durazym, Savinase, Pyrase, Pancreatic Trypsin NOVO (PTN), Bio-Feed Pro, Clear-Lens Pro, Everlase, Kanase, Relase,V8Proteinase(모두 Novo Nordisk A/S 로부터 이용할 수 있는 효소)를 포함한다.
다른 상업적인 프로테아제의 예는 제네코 인터내셔널에 의해 판매되는 MaxataseMaxacal, Maxapem, Opticlean, Properase및 Purafect를 포함한다.
또한 프로테아제 변이체는 모 프로테아제로 기대된다고 이해된다. 이러한 프로테아제 변이체의 예는 EP 130.756 (Genentech), EP 214.435(Henkel),WO 87/04461(Amgen),WO 87/05050(Genex), EP 251.466(Genencor), EP 260.105(Genencor), Thomas et al., (1985), 네이쳐.318,p.375-376, Thomas et al.,(1987),J.Mol.Biol.,193,pp.803-813, Russel et al., (1987),네이쳐, 328, p.496-500,WO 88/08028(Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S),WO 91/00345(Novo Nordisk A/S), EP 525 610 (Solvay) 및 WO 94/02618(Gist-Brocades N.V)에 개시된다.
EP 482,879 B1(Shionogi)에 개시된 C-성분이 또한 언급되어야 한다. 프로테아제의 활성은 "효소 분석의 방법",제 3판,1984,베르라그 케미,바인하임, 제 5 권에 개시된 대로 결정될 수 있다.
기대되는 단백질 가수분해 효소는 상기에 나타난 특성(즉, 부착기의 수, 부착기의 위치등)을 가진 산성 아스파라산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 서브틸리신 같은 세린 프로테아제, 또는 메탈로 프로테아제의 군으로부터 선택된 프로테아제를 포함한다.
적당한 수의 부착 기를 가진 적당한 모 프로테아제의 특정 예는 하기의 표 1에 나타난다.
효소 부착기의 수 분자량 KDa 참고
PD498 13 29 Seq ID NO.2WO 93/24623
Savinase 6 27 von der Osten et al.,(1993), Journal ofBiotechnology, 28,p. 55+
프로테인아제 K 9 29 Gunkel et al., (1989),Eur. J. Biochem, 179,p. 185-194
프로테인아제 R 5 29 Samal et al, (1990),Mol. Microbiol, 4,p. 1789-1792
프로테인아제 T 14 29 Samal et al., (1989),Gene, 85, p. 329-333
서브틸리신 DY 13 27 Betzel et al. (1993),Arch. Biophys, 302,no. 2, p. 499-502
리온 Y 15 46 SEQ ID NO. 4JP 04197182-A
자 16 5 28 WO 92/17576
테르모리신 12 34 Titani et al., (1972)Nature New Biol. 238,p. 35-37,and SEQ ID NO 5
Alcalase(야생 서브틸리신)칼스버그 변이체 10 27 von der Osten et al.,(1993), Journal ofBiotechnology, 28,p. 55+
서브틸리신 PD498 은 분자량 29kDa 이며, SEQ ID NO:2 에 서 보여지는 바대로 효소의 표면에 중합체 부착을 위한 12 리신 기에다가 하나의 N- 말단 아미노기를 가진다. 상기에 언급된 대로 바람직한 효소는 표면에 넓게 퍼져있는 리신을 가진다. PD 498은 활성 부위에서 0-10Å의 거리내에 어떠한 리신 잔기도 가지지 않는데 이것이 변형된 형태에서 특히 적당하게 한다. 더욱기, 리신 잔기는 효소의 표면에 넓게 퍼져있다. (즉, 활성 부위로부터 멀다)
효소 서브틸리신 DY 는 27 kDa 의 분자량을 가지며 효소의 표면에 12 아미노기(즉 리신 잔기)와 하나의 N-말단 아미노기(SEQ ID NO:3참조)를 가진다.
모 프로테아제 리온 Y는 46kDa의 분자량을 가지고 효소의 표면에 14아미노 기(즉, 리신 잔기)와 하나의 N-말단 아미노기(SEQ ID NO:4참조)를 가진다.
중성의 메탈로 프로테아제 테르모리신은 34 kDa의 분자량을 가지고 표면에 11아미노 기(즉, 리신 잔기)와 하나의 N-말단 아미노기(SEQ ID NO:5참조)를 가진다.
모 리파제
모 리파제(즉, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 3.1.1(카르복시산 에스테르 히드로라제)하에 분류된 효소)는 이 군의 리파제를 포함한다.
예는 효소 분류(E.C.)번호하에 분류된 것으로부터 선택된 리파제를 포함한다:
(3.1.1.3) 트리아실-글리세롤 리파제,(3.1.1.4.)포스포리파제 A2를 포함하는 3.1.1 (즉, 소위 카프복실산 에스테르 하이드로라제)
리파제의 예는 하기의 미생물로부터 유도된 리파제를 포함한다. 지시된 특허 공보는 참고로 여기에 수록된다.
Humicola,e.g..H.brevispora, H.lanugionsa, H.brevis var.theromidea and H.insolens (US 4,810,414)
Pseudomonas, e.g. Ps. fragi, Ps.stutzeri, Ps. cepacia and PS. fluorescens (WO 89/04361), or Ps. plantarii or Ps. gladioli (US patent no. 4,950,417(Solvay enzyme))or Ps. alcaligenes and Ps. pseudoalcaligenes(EP 218 272) or Ps.mendocina (WO 88/09367;US 5,389,536).
Fusarium, e.g.F.oxysporum(EP130,064) or F.solani pisi (wo 90/09446).
Mucor (또한 Rhinzmucor로도 불린다. ), e.g.M.miehei(EP 238 023).
Chromobacterium ( 특히 C.viscosum)
Aspergillus (특히 A.niger)
Candida, e.g. C.cylindracea (또한 C.rugosa으로 불리는 ) or C.antarctica (WO 88/02775) C.antarctica lipase A or B (WO94/01541 WO 89/02916 )
Geotricum, e.g.G.candidum (Schimada et al., (1989), J.Biochem., 106, 383-388)
Penicillium, e.g. P.camembertii (Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61-67)
Rhizopus, e.g. R.delemar (Hass et al., (1991), Gene 109. 107-113) or R.niveus(Kugimiya et al., (1992) Biosci.
Biotech. Biochem 56, 716-719)or R.oryzae.
Bacillus, e.g. B.subtills(Dartois et al., (1993)Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260)or B.stearothermophilus(JP 64/7744992) or B.pumilus (WO 91/16422).
쉽게 이용할 수 있는 상업적 리파제의 특정 예는 Lipolase, Lipolase울트라, Lipozyme, Palatase,Novozym435, Lecitase(모두 Novo NordiskA/S 로부터 이용할 수 있는)를 포함한다.
다른 리파제의 예는 Lumafast,제네코 Int.Inc로부터의 Ps. Mendocian 리파제;Lipomax,기스트 브로케이드/제네코 Int.Inc로부터의 Ps. pseudoalcaligenes 리파제 ;유니레버로부터의 Fusarium solani 리파제(큐티나제);솔베이 효소로부터 Bacillus sp. 리파제이다.
또한 리파제 변이체는 모 효소로 기대되는 것으로 이해된다. 이러한 예는 예를 들어 WO 93/01285 및 WO 95/22615 에 개시된다.
리파제의 활성은 "효소 분석의 방법",제 3판,1984,베르라그 케미,바인하임, 제 4 권에 개시된대로 결정될 수 있거나 또는 AF 95/5 GB (Novo Nordisk A/S로부터 요청하여 이용할 수 있는) 에 개시된 대로 결정될 수 있다.
기대되는 지방 분해 효소는 예를 들어, EP 258068 및 EP 305 216에 개시된 Humicola lanuginosa 리파제, 예를 들어, EP 238 023,Absidia sp.지방분해 효소 (WO 96/13578)에 개시된대로의 Rhizomucor miehei 리파제,예를 들어 EP 214 761에 개시된 C. Antatctica 리파제 A 또는 B인 C.antarctica 리파제와 같은 Candida 리파제,예를 들어 EP218 272 에 개시된 대로 P.alcaligenes 및 P.pseudoalcaligenes 리파제와 같은 Pseudomonas 리파제, 예를 들어 EP 331 376 에 개시된 대로 P.cepacia 리파제, WO 95/14783 에 개시된대로 Pseudomanas sp. 리파제, 예를 들어 B.subtilis 리파제인 Bacillus 리파제 (Dartois et al., (1993) Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260), B.Stearothermophilus 리파제 (JP 64/744992) 및 B.Pumilus 리파제(WO 91/16422)를 포함한다. 다른 형태의 지방분해 효소는 예를 들어, Humicola insolens, Psedomonas mendocina (WO 88/09367),또는 Fusarium solani pisi(예를 들어 WO 90/09446 에 개시된)으로부터 유도된 규티나제를 포함한다.
모 옥시도리덕타제
모 옥시도리덕타제(즉, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 1.(옥시도리덕타제)하에 분류된 효소)는 이 군내의 옥시도리덕타제를 포함한다.
예는 효소 분류(E.C.) 번호하에 분류된 것으로부터 선택된 옥시도리덕타제를 포함한다. :
글리세롤-3-포스페이트 디하이드로겐아제 NAD+ (1.1.1.8), 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로겐아제 NAD(P)+(1.1.1.94),글리세롤-3-포스페이트 1-디하이드로겐아제 NADP(1.1.1.94),글루코즈 옥시다제 (1.1.3.4), 헥소즈 옥시다제 91.1.3.5), 카테콜 옥시다제(1.1.3.14), 비리루빈 옥시다제 (1.3.3.5), 알라닌 디하이드로겐아제 (1.4.1.1), 글루타메이트 디하이드로겐아제 (1.4.1.2), 글루타메이트 디하이드로겐아제 NAD(P)+(1.4.1.3), 글루타메이트 디하이드로겐아제 NADP+(1.4.1.4), L-아미노산 디하이드로겐아제(1.4.1.5), 세린 디하이드로겐아제 (1.4.1.7), 발린 디하이드로겐아제 NADP+(1.4.1.8), 루신 디하이드로겐아제(1.4.1.9), 글리신 디하이드로겐아제 (1.4.1.10), L-아미노산 옥시다제(1.4.3.2) D-아미노산 옥시다제(1.4.3.3),L-글루타메이트 옥시다제(1.4.3.11), 단백질-리신 6-옥시다제(1.4.3.13),L- 리신 옥시다제(1.4.3.14), L- 아스파르테이트 옥시다제 (1.4.3.16), D- 아미노산 디하이드로겐아제 (1.4.99.1), 단백질 디설파이드 리덕타아제 (1.6.4.4), 티오레독신 리덕타아제 (1.6.4.5), 단백질 디설파이드 리덕타아제(글루타티오닌)(1.8.4.2),라카아제(1.10.3.2), 카타라아제(1.11.1.6),페록시다제(1.11.1.7), 리폭시겐아제(1.13.11.12), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (1.15.1.1)
상기 글루코즈 옥시다제는 Aspergillus niger 로부터 유도될 수 있다. 상기 라카아제는 Polyporus pinsitus, Myciliophtora thermophila, Coprinus cinereus, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia praticola, Scytalidium thermolhilum and Rhus vernicifera로부터 유도될 수 있다.
비리루빈 옥시다제는 Myrothechecium verrucaria로부터 유도될 수 있다.
페록시다제는 예를 들어 Soy bean, Horseradish or Copinus cinereus로 유도될 수 있다.
소 기원의 단백질 디설파이드 리덕타아제,Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger로부터 유도된 단백질 디설파이드 리덕타아제,및 Eschrichia coil로부터 유도된 DsbA 또는DsbC를 포함하는 단백질 디설파이드 리덕타제는 DK 특허 출원 번호 768/93,265/94 및 264/94(Novo Nordisk A/S) 의 어디에나 언급될 수 있고 여기에 참고로서 수록된다.
쉽게 이용될 수 있는 상업적 옥시도리덕타제의 특정 예는 Gluzymeⓡ(NovoNordisk A/S로부터 이용할 수 있는 효소)을 포함한다. 그러나, 다른 옥시도리덕타제를 다른곳으로부터 이용할 수 있다. 옥시도리덕타제의 변이체가 모 효소로 기대된다고 이해된다.
옥시도리덕타제의 활성은 "효소 분석의 방법",제 3판,1984,베르라그 케미,바인하임, 제 3 권에 기술된 대로 결정될 수 있다. 기대되는 라카아제는 Novo Nordisk 의 WO 96/00290 및 WO 95/33836 에 개시된 라카아제를 포함한다.
다른 옥시도리덕타제는 카타라제, 글루코스 옥시다제, 페록시다제, 할로페록시다제, 슈터옥시다제 디스뮤타제, 및 리폭시게나제를 포함한다.
모 카르보히드라아제
모 카르보히드라제는 특히 5 및 6개 링 구조(즉, 의 카르보히드레이트 사슬(예를 들어, 전분)을 쪼갤 수 있는 모든 효소(즉, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 3.2 (그루코시다제)하에 분류된 효소) 로서 정의될 수 있다.또한 본 발명에 따라 카르보히드라제군에 포함되는 효소는 예를 들어 D-글루코스 와 같은 6개 링 구조를 예를 들어 D-프럭토스와같은 5개 링 구조로 이성화할 수 있는 것이다.
예는 효소 분류(E.C.)번호하에 분류된 것으로부터 선택된 카르보히드라제를 포함한다:
α- 아밀라제 (3.2.1.1) β-아밀라제 (3.2.1.2), 글루칸 1,4-α-그루코시다제 (3.2.1.3), 셀룰라제(3.2.1.4), 엔도-1,3(4)-β-글루칸아제 (3.2.1.6), 엔도-1,4-β-크란제(3.2.1.8), 덱스트란아제(3.2.1.11), 키티나제(3.2.1.14), 폴리갈락투로나아제 (3.2.1.15), 리소자임(3.2.1.17), β-글루코시다제 (3.2.1.23), 아미로-1,6-글루코시다제 (3.2.1.33), 키란 1,4-β-키로시다제(3.2.1.37), 글루칸 엔도-1,3-β-글루코시다제(3.2.1.59), 글루칸 1,4,-β-글루코시다아제 (3.2.1.74),글루칸 엔도-1,6-β-글루코시다제 (3.2.1.75), 아라비안 엔도-1,5-α-아라비노시다제 (3.2.1.99), 락타아제 (3.2.1.108), 키토나아제 (3.2.1.132) 및 크로즈 아이소멀아제 (5.3.1.5)
관련있는 카르보히드라제의 예는 Trichoderm harzianum 으로부터 유도된 α-1,3-글루칸아제;균주 Paecilomyces 로부터 유도된 α-1,6-글루칸아제;Bacillus subtilis 로부터 유도된 β-글루칸아제;Humicola insolens 로부터 유도된 β-글루칸아제;Aspergillus niger 로부터 유도된 β-글루칸아제; Trichoderma 균주로부터 유도된 β-글루칸아제; Oerskovia xanthineolytica 균주로부터 유도된 β-글루칸아제; Aspergillus niger로부터 유도된 엑소-1,4,-α-D-글루코시다제(글루코아밀라제);Bacillus subtilis 로부터 유도된 α-아밀라제; Bacillus amylolipuefaciens 로부터 유도된 α-아밀라제; Bacillus stearothermophilus 로부터 유도된 α-아밀라제;Aspergillus oryzae로부터 유도된 α-아밀라제;비병원성 미생물로부터 유도된 α-아밀라제; Aspergillus niger로부터 유도된 α-갈락토시다제;Humicola insolens로부터 유도된 펜토산아제,크란아제, 셀로비아제, 셀룰라아제, 헤미-셀룰라아제; Trichoderma reesei로부터 유도된 셀룰라아제; 비병원성 몰드로부터 유도된 셀룰라아제;Aspergillus niger로부터 유도된 펙틴아제,셀룰라아제,아라비나제, 헤미-셀룰라아제; Penicillium lilacinum로부터 유도된 덱스트란아제; 비병원성 몰드로부터유도된 엔도-글루칸아제;Bacillus acidopullyticus 로부터 유도된 플르란아제; Kluyveromyces fragilis 로부터 유도된 β-갈락토시다제 ; Trichoderma reesei로부터 유도된 크란아제;를 포함한다.
쉽게 이용할 수 있는 상업적 카르보히드라제의 특정 예는 Alpha-Gal, Bio-FeedAlpha, Bio-FeedBeta, Bio-FeedPlus, Bio-FeedPlus, Novozyme188, Carezyme, Celluclast, Cellusoft, Ceremyl, Citrozym, Denimax, DezymeDextrozyme,Finizym, Fungamyl, Gamanase, Glucanex, Lactozym, Maltogenase, Pentopan,Pectinex, Promozyme, Pulpzyme, Novamyl, Termamyl, AMG(아밀로글루코시다제 노보), Maltogenase,Sweetzyme, Aquazym, Natalase( 모두 Novo Nordisk A/S 로부터 이용할 수 있는 효소)이다.다른 카르보히드라제는 다른 회사로부터 이용할 수 있다.
또한 카르보히드라제 변이체는 모 효소로 기대된다는 것이 이해된다.
카르보히드라제의 활성은 "효소 분석의 방법",제 3판,1984,베르라그 케미,바인하임, 제 4 권에 개시된대로 결정될 수 있다.
모 트랜스퍼아제
모 트랜스퍼아제(즉, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 2 에 기초하여 분류된 효소)는 이 군내의 트랜스퍼아제를 포함한다.
모 트랜스퍼아제는 트랜스퍼아제의 아군내의 어떤 트랜스퍼아제일 수 있다. :단일-탄소기를 전달하는 트랜스퍼아제(E.C.2.1);알데히드 또는 잔류물을 전달하는 트랜스퍼아제(E.C.2.2);아실트랜스퍼아제(E.C.2.3);글루코실트랜스퍼아제(E.C.2.4);메틸기가 아니면 알킬 또는 아릴기를 전달하는 트랜스퍼아제(E.C.2.5);질소기를 전달하는 트랜스퍼아제(2.6).
바람직한 구체예에서, 모 트랜스퍼아제는 트랜스글루타미아제 E.C 2.3.2.13 (단백질 글루타민 m-글루타밀트랜스퍼아제)이다.
트랜스글루타미나아제는 펩티드가 결합된 글루타민 잔기의 감마-카르복시아미드기가 아실 공여체인 아실 전달 반응을 촉매할 수 있는 효소이다. 다양한 화합물에서 일차 아미노기는 펩티드가 결합된 글루타민산의 단일치환된 감마-아미드의 후속 형성을 가지고 아실 수용체로서 기능할 수 있다. 펩티드-사슬의 리신 잔기의 엡실론-아미노기가 아실 수용체로서 기능할 때, 트랜스퍼아제는 분자내 또는 분자간 감마-글루타밀-엡실론-리실 가교를 형성한다.
글루타밀나아제의 예는 계류중인 DK 특허출원번호 990/94 (Novo Nordisk A/S)에 기술된다.
모 트랜스글루타미나제는 인간, 동물(예를 들어 소) 또는 미생물 기원일 수 있다.
이러한 모 트랜스글루타미나제의 예는 트랜스글루타미나제,FXIIIa;Physarum polycephalum (Klein et al., 미생물학 저널, 제 174권 p.2599-2605)로부터 유도된 미생물 트랜스글루타미나제;Streptomyceslavendulae를 포함하는 Streptomyces sp.으로부터 유도된 트랜스글루타미나제,Streptoverticillium mobaraense를 포함하는 Streptomyces lydicus (Streptomyces libani 전의) 및 Streptoverticillium sp., Streptoverticillium cinnamoneum, 및 Streptoverticillium griseocarneum 으로부터 유도되는 트랜스글루타미나제로부터 유도된 효소이다.
(Motoki et al., US 5,156,956; Andou et al., US 5,252,469;Kaempfer et al., 일반 미생물학 저널, 제 137권 p.1831-1892;Ochi et al., 분류 세균학, 제 44권, pl285-292;Williams et al., 일반 미생물학 저널, 제 129권, pl1743-1813)
또한 트랜스퍼아제 변이체는 모 효소로 기대된다고 이해된다.
트랜스글루타미나아제의 활성은 "효소 분석 방법",제 3 판, 1984,베르라그 케미, 바인하임, 1-10 권에 기술된 대로 결정될 수 있다.
적당한 트랜스퍼아제는 WO 96/06931 (Novo Nordisk A/S) 및 WO96/22366(Novo Nordisk A/S)에 개시된 어떤 트랜스글루타미나제를 포함한다.
모피타아제
모 피타아제는 생화학 및 분자 생물학의 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따른 효소 분류 번호 E.C. 3.1.3 (포스포릭 모노에스테르 하이드로아제)하에 분류된 효소군에 포함된다.
피타아제는 피테이트의 이노시톨 및 무기인산으로의 전환을 촉매하는 미생물에 의해 생산된 효소이다.
피타아제를 생산하는 미생물은 Bacillus subtilis, Bacillsu nattoPseudomonas과 같은 세균; Saccharomyces cerevisiae와 같은 효모; Aspergillus niger Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus 또는 Aspergillus nidulans,및 다양한 다른 Aspergillus 종과 같은 균류를 포함한다.
모 피타아제의 예는 효소 분류(E.C.)번호 하에 분류된 것들로부터 선택된 피타아제를 포함한다. :3-피타아제(3.1.3.8) 및 6-피타아제(3.1.3.26)
피타아제의 활성은 "효소 분석의 방법", 제 3판,1984,베르라그 케미,바인하임, 제 1-10권 에 기술된 대로 결정될 수 있거나 또는 EP-A1-0 420 358,실험예 2A에 기술된 방법에 따라 측정될수 있다.
이성화효소
모 이성화효소는 생화학 및 분자 생물학 국제 연합(IUBMB)의 추천(1992)에 따라 효소 분류 번호 E.C. 5 하에서 분류된 효소군에 포함된다.
모 이성화효소 예는 단백질 이황화 이성화효소이다. 거기에 제한되지 않고 적당한 단백질 이황화 이성화효소는 WO 95/01425( Novo Nordisk A/S)에 기술된 PDIs를 포함한다.
공업용 조성물
본발명의 더나은 측면은 개선된 세척 성능을 가지고 개선된 폴리펩티드를 포함하는 "공업용 조성물"에 관한 것이다.
본 발명의 명세서에서 "공업용 조성물"은 순환계에 도입되지 않을 목적인 조성물을 의미한다. 즉,조성물이 피내로, 정맥내로, 또는 피하로 투약을 목적으로 하지 않는 다는 것을 의미한다.
상기에 언급한대로 효소와 같은 폴리펩티드의 주요 문제는 순환계 즉 기관내 노출에 의한 흡입으로 야기되는 호흡 알레르기의 잠재적인 위험이다.
"공업용 조성물"의 예는 세탁물 및 식기 세척 세제를 포함하는 세제와 같은 조성물 또는 제품,가정 용품 제품, 농-화학, 화장품 및 욕실용품을 포함하는 피부 케어 제품과 같은 개인적인 케어 제품,구강 및 피부 약품, 직물의 처리/가공에 사용되는 조성물, 경표면 클린징 등을 위한 조성물에 사용되는 폴리펩티드, 특히 효소 및 항균성 폴리펩티드이다. 본 발명에 따라 특히 기대되는 것은 피부 케어 제품 및 세제이다.
피부 케어 제품
본 발명의 명세서에서 "피부 케어 제품"은 클린징, 케어 및/또는 신체 피부의 미화 및 더욱이 사용동안 피부 또는 호흡계와 접촉할 수 있는 머리카락 케어 제품과 같은 다른 제품에 사용되는 모든 개인적인 케어 제품을 포함한다.
또한 동물을 위한 상응하는 제품이 본 발명에 따라 기대된다.
본 발명에 따라 기대되는 피부 케어 제품의 특정 예는 비누, 화장품, 클린징 크림, 클린징 로션, 클린징 밀크, 크림 비누, 표백가루, 가루 비누, 케이크 비누, 투명 비누, 손톱 광택 제거제, 샴푸, 발삼, 헤어 린스등이다.
피부 케어에 적당한 효소 활성
본 발명의 피부 케어 조성물은 개선된 세척 또는 클린징 효과 및 예를 들어 감소된 알레르기 발현성 그리고 더욱이 피부 케어 조성물에 사용되는 것으로 공지된 성분을 포함한다.
많은 효소 활성이 피부 케어 조성물에 사용되는 것으로 공지된다.
프로테아제
프로테아제는 피부 클린징 제품에 효과적인 성분이다. 프로테아제는 피부 세포의 죽은 각질의 상피층을 제거하고 이에 의해 피부를 더 밝고 더 생생하게 보이게 한다. 더욱이, 프로테아제는 또한 피부의 부드러움을 개선한다.
프로테아제는 샴푸, 컨디셔너, 로션, 크림, 비누 바, 화장실 비누, 및 액체 비누를 포함하는 욕실용품, 목욕 및 샤워 제품에 사용된다.
리파제
리파제는 피부 케어 제품에 활성 성분인 동시에 과도한 피부 지방을 제거하기 위한 피부 클린징 제품 및 항-여드름 제품 및 크림 및 로션 같은 목욕 및 샤워 제품에서 활성 성분으로서 화장품용 사용에 이용될 수 있다.
리파제는 머리 표피로부터 피지 및 다른 지방 물질의 효과적인 제거를 위해 클린징 제품(예를 들어, 샴푸)에 또한 사용될 수 있다.
옥시도리덕타제
개인적 케어 목적을 위한 가장 흔한 옥시도리덕타제는 예를 들어, SCN-또는 I-를 과산화효소에 의해 (일반적으로 락토퍼옥시다아제) 항균 반응체(SCN-또는 I2) 로 의 산화를 개시할 것인 H2O2의 생산을 확실히 할 수 있는 기질(예를 들어, 글루코우스)를 가진 옥시다제 (일반적으로 글루코스 옥시다제)이다. 이 효소 복합체는 자연, 예를 들어 우유 및 타액으로부터 알려진다.
옥시도리덕타제는 또한 글루코스를 생산하기 위하여 아밀로글루코시다제와 결합할 수 있는 구강 케어 제품(구강 린스, 치약, 씹는 껌)에서 항균 시스템으로서 상업적으로 이용된다.
옥시도리덕타제의 또다른 이용분야는 옥시다제, 퍼옥시다제 및 라카아제를 사용하여 산화적 머리 염색이다. (예를 들어,Novo Nordisk로부터 WO 96/00290 또는 WO 95/33836 참조).
피부 노화 과정(머리카락의 변질)과 피부(및 머리카락)의 표면에 형성된 자유 래디칼이 연관된다는 것이 알려진다.
자유 래디칼은 지방 막, 콜라겐, 및 세포의 파괴를 이끄는 사슬 반응을 활성화시킨다.
슈퍼옥시드 디스뮤타제와 같은 자유 래디칼 스캐빈져의 화장품으로의 이용이 잘 알려져있다.(R.L.Goldemberg, DCI,Nov.93,p.48-52).
단백질 이황화 이황화효소(PDI) 역시 옥시도리덕타제이다. 그것은 머리의 퍼머넌트 웨이브(머리카락의 이황화 결합의 환원 및 재산화) 및 손상된 머리카락의 회복에 이용될 수 있다. (손상은 주로 존재하는 이황화 결합의 환원이다.)
트랜스글루타미나제
인간 피부, 머리카락 또는 손톱에 응용하기 위한 피부 케어 조성물은 (a)아미노-관능 활성 성분, (b) 피부, 머리카락, 손톱에 대한 활성 성분의 가교를 촉매하기 위한 트랜스글루타미나제 (c) US 특허 번호.5,490,980 으로부터 알려진 담체를 포함한다.
포유동물 피부, 머리카락 또는 손톱에 이용되기에 적합한 화장품용 조성물이다:(a) 피부, 모발 또는 손톱에 보호층을 제공하기 위한 충분한 양의 적어도 한가지의 코르네오시트 외피 단백질; (b) 코르네오시트 외피 단백질과 상기 피부, 모발 또는 손톱의 각질층에 존재하는 외부로 노출된 코르네오시트 외피 단백질 사이에 공유 결합을 형성하기 위한 충분한 양의 트랜스글루타미나제; (c) 트랜스글루타미나제를 활성화하기 위한 충분한 양의 칼슘 이온; 및 (d) 화장용으로 허용되는 부형제를 포함하는 포유류의 피부, 모발 또는 손톱에 도포하기에 적합한 화장용 조성물로서, 여기에서 조성물은 두개의 상을 가지는 에멀젼을 포함하며, 코르네오시트 외피 단백질이 상들 중 하나에 함유되고, 트랜스글루타미나제가 나머지 상 내에 함유된다(US 특허 no. 5,525,336 참조).
JP3083908 은 수용성 물질로 변형된 트랜스글루타미나제를 함유하는 피부 화장품 물질을 개시한다. 변형된 물질은 예를 들어 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜,프로필렌 글리콜, 글리세린, 폴리비닐 알콜, 글루코스, 수크라제, 아르긴산, 카르복시메틸 셀루로스, 전분, 및 히드록시프로필 셀룰로스이다.
변형은 예를 들어, 반응기의 도입 및 효소의 결합에 의해서 이루어진다. 피부에 부드러운 물질을 제공하고, 시간 경과에 따른 탈색 및 악취를 감소시키고, 거칠어진 피부를 케어하는 좋은 효과를 가지고, 수분을 보유하고 피부를 아름답게 조절하기 위함이다.
본 발명의 피부 케어 제품
세 번째 측면에서, 본 발명은 발명의 피부 케어 조성물을 포함하는 피부 케어 제품에 관한 것이다. 용어 "피부 케어 제품"은 상기에 정의된다.
본 발명의 피부 케어 제품은 본 발명의 효과적인 양의 변형된 효소를 포함한다. 당업자에게 알려진 이러한 효과적인 양은 최종 피부 케어 제품의 0이상 5%의 범위에 종종 놓일 것이다.
본 발명의 기대되는 피부 케어 제품은 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기의 제품을 포함한다: 비누, 화장품, 클린징 크림, 클린징 로션, 클린징 밀크, 크림 비누, 가루 비누, 케이크 비누,투명 비누,손톱 광택 제거제, 샴푸, 헤어 린스, 등.
일반적인 피부 케어 제품 조제물
용어 "피부 케어 제품에 사용되는 성분"은 피부 케어 제품 조제물에 사용되는 것으로 알려진 모든 제품을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 성분의 예는 윌프라이드 움바흐에 의해 편집되고 엘리스 하우드, 리미티드, 잉글란드에 의해 출판된 "화장품 및 욕실용품" (1991) 및 제이.팔베에 의해 편집되고 스프링-베르라그에 의해 출판된 "소모 제품에서의 계면 활성제"(1987)에서 발견될 수 있다.
하기에 무제한의 목록의 안내 조제물이 열거된다. 이는 본 발명에 따라 기대되는 중요한 피부 케어 제품의 개략적인 조제물을 제공한다.
화장 비누
성분 예 %
계면 활성제 비누(나트륨 염) 83-87
격리제 에틸렌디아민 테트라아세트 0.1-0.3
점조도 조절자 염화 나트륨 대략 0.5
염료 ＜0.1
광 증백제 ＜0.1
산화방지제 2,6-비스(1,1-디메틸에틸) 0.1-0.3
-4-메틸 페놀(BHT)
증백제 티타늄 디옥사이드 0.1-0.3
향기 1.0-2.0
효소 프로테아제/리파제 0-5
물 나머지
합성세제
성분 예 %
계면활성제 라우릴 술페이트 30-50
라우릴 술포 숙신에이트 1-12
재지방제 지방 알콜 10-20
가소제 스테릴 모노/디글리세라이드 0-10
충전제 전분 0-10
활성제 살리실산 0-1
염료 ＜0.2
방향제 0-2
효소 프로테아제/리파제 0-5
물 나머지
폼배스 및 샤워배스
성분 예 % %
폼배스 샤워배스
계면활성제 라우릴 에테르 술페이트 10-20 10-12
코코 아미도프로필
디메틸 베타인 2-4 2-4
에톡실화된 지방산 0.5-2 -
재지방제 지방산 알콜 0.5-3
에톡실화된 지방산 알콜 0.5-5 0-4
효소 프로테아제/리파제 0-5 0-5
성분 예 % %
폼배스 샤워배스
거품 안정제 지방산 알칸올 아미드 0.2-2 0-4
조정제 4차 히드록시프로필 셀루로스 - 0-0.5
농축기 염화나트륨 0-3 0-3
진주광택제 에틸렌글리콜 스테아르산염 0-2 -
활성제 식물 추출분 0-1 0-1
방부제 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산 0.1 0.1
염료 0.1-0.2 0.1
방향제 0.3-3 0.3-2
효소 프로테아제/리파제 0-5 0-5
물 나머지 나머지
헤어 샴푸
성분 예 %
계면 활성제 라우릴 에테르 술폰산염 12-16
코코 지방산 아미도프로필 2-5
디메틸 베타인
지방 산 폴리글리콜 에스테르 0-2
거품 부스터 지방산 에탄올 아미드 0.5-2.5
컨디셔너 4차 히드록시에틸 셀룰로스 0.4-1
단백질 가수분해물 0.2-1
재지방제 에톡시화된 라놀린 알콜 0.2-1
첨가제 비듬방지제 0-1
보존제 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산 0.1-0.3
진주광택제 에틸렌글리콜 스테아레이트 0-2
염료 ＜0.1
pH-조절자 산/염기 0.1-1
방향제 0.3-0.5
효소 프로테아제/리파제
물 나머지
헤어 린스 및 헤어 컨디셔너
성분 예 % %
헤어린스 헤어 컨디셔너
계면 활성제 지방산 알콜 폴리-
글리콜 에테르 0.1-0.2 1.5-2.5
세틸 트리메틸
염화 암모늄 0.5-1 -
디메틸 벤질
스테아릴 암모늄 - 0.5-1
염화물
재지방제 세릴/세테아릴 모노/
디글리세라이드 0.5-1.5 1.5-2.5
일관성 조절자 지방 알콜 1-2.5 2.5-3.5증점제 메틸 히드록시프로필
셀룰로스 0.3-0.6 0.4-0.8
컨디셔너 4등분된 히드록시에틸
셀룰로스 0.1-0.3 0.3-0.4
보존제 P-히드록시 벤조산
에스테르 0.1-0.3 0.1-0.3
염료 ＜ 0.1 ＜ 0.1
pH 조절자 산/염기 0.1-1 0.1-1
방향제 0.2-0.5 0.2-0.5
효소 프로테아제/리파제 0-5 0-5
물 나머지
세제 개시
발명의 세제 조성물은 예를 들어, 세탁물 부가 조성물을 포함하는 손 및 기계 세탁물 세제 조성물 및 얼룩진 직물의 선처리에 사용되기에 적합한 조성물, 직물을 더 연화하기 위한 조성물에 첨가되는 린스, 그리고 생물막 제거 및 식기 세척기를 포함하는 일반적인 경표면 클린징 기계에 사용하기 위한 조성물로서 공식화된다.
생물막 제거에서 알긴산 분해효소는 바람직한 효소로서 언급되어야만 한다.(참고로서 여기에 수록된 JP10127281 A K.K. GUNZE 및 TANABE SEIYAKU CO 참조)
본 발명의 세제 조성물은 본 발명의 결합체 및 계면활성제를 포함한다. 추가적으로, 그것은 빌더, 또다른 효소, 거품 억제인자, 연화제,염료 전달 억제제 및 토양-현탁화제, 토양-해방제,증백제, 연마제, 살균제, 타니시 억제제, 착색제, 및/또는 캡슐화 또는 캡슐화되지 않은 향수와 같은 세제에 전통적으로 사용되는 다른 화합물을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 세제 조성물은 액체, 페이스트, 겔, 바 또는 과립 형태일 수 있다. pH(사용 농도 및 수용액에서 측정한)는 일반적으로 예를 들어, 7-11의 범위에서 중성 또는 알카리성일 것이다. 본 발명에 따른 과립상의 조성물은 또한 "압밀 형태"일 수 있는데 즉, 전통적인 과립상 세제 보다 상대적으로 높은 밀도 즉, 550 에서 950g/l 을 가질 수 있다.
본 발명의 효소 결합체 또는 세제 조성물에 선택적으로 포함된 다른 효소는 일반적으로 조성물의 0.00001중량% 에서 2중량% 효소단백질, 바람직하게는 0.0001중량% 에서 1중량% 효소단백질, 더욱 바람직하게는 0.001중량% 에서 0.5중량% 효소단백질, 가장 바람직하게는 0.01중량% 에서 0.2중량% 효소단백질의 수준에서 세제 조성물에 포함된다. 그러나, 효소 투여량은 알레르기 발현성과 효소의 개선된 세척 성능에 의존한다. 즉, 낮은 알레르기 발현성에 대해서는 높은 투여량이 사용될 수 있고 개선된 세척성능에 대해서는 낮은 투여량이 사용될 수 있다.
계면 활성제 시스템:
계면 활성제 시스템는 비이온, 음이온, 양이온, 양쪽성, 및 /또는 쯔비터이온 세제를 포함할 수 있다.세제 시스템는 바람직하게는 음이온 세제 또는 50-100%의 음이온 세제 및 0-50%비이온과 같이 음이온 및 비이온 세제의 조합으로 구성된다. 세탁물 세제 조성물은 또한 양이온, 양쪽성, 쯔비터이온,및 세미 극성 계면 활성제 뿐만아니라 여기서 이미 개시된 것을 제외한 비이온 및/또는 음이온 세제를 포함한다. 계면 활성제는 전형적으로 0.1중량%에서 60중량% 수준으로 존재한다. 세제이 어떤 예가 하기에 기술된다.
비이온 계면활성제:
계면활성제는 알킬 페놀의 축합물인 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드)를 포함할 수 있다. 알킬기는 직쇄 또는 분지에서 약 6에서 약 14 탄소원자를 함유할 수 있다. 에틸렌 옥사이드는 알킬 페놀의 몰당 약 2에서 약 25 몰과 같은 양으로 존재할 수 있다.
계면활성제는 또한 약 1 에서 약 25 몰의 에틸렌 옥사이드를 가진 일차 및 이차 지방족 알코올의 축합생성물을 포함할 수 있다.
지방족 알코올의 알킬 사슬은 직쇄 또는 분지일 수 있고 일반적으로 약 8 에서 약 22 탄소 원자를 함유한다.
더욱이, 비이온 계면활성제는 알킬 페놀의 폴리에틸렌 축합물, 약 1에서 약 25 몰의 에틸렌 옥사이드를 가진 일차 및 이차 지방족 알콜의 축합생성물, 알킬폴리사카라이드, 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 가장 바람직한 것은 3에서 15 에톡시기를 가지는 C8-C14 알킬 페놀 에톡시레이트 및 2에서 10 에톡시기를 가지는 C8-C18알콜 에톡시레이트(바람직하게는 C10 avg.),및 이의 혼합물이다.
음이온 계면 활성제:
적당한 음이온 계면 활성제는 식 RP(A)mSO3M,상기식에서 R은 비치환 C10-C-24 알킬 또는 C10-C24알킬 화합물을 가지는 히드록시알킬,바람직하게는 C12-C20알킬 또는 히드록시알킬, 더욱 바람직하게는 C12-C18 알킬 또는 히드록시알킬이고, A는 에톡시 또는 프로폭시 유니트이고, m은 0보다 크고, 전형적으로 약 0.5 와 약 6 사이, 더욱 바람직하게는 0.5와 3 사이이고, M 은 H 또는 예를 들어, 금속이온(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리듐, 칼슘, 마그네슘등), 암모늄 또는 치환된 암모늄 양이온일 수 있는 양이온인 가용성 염 또는 산의 수용성염 또는 산인 알킬 알콕시화된 황산염을 포함한다. 알킬 에톡시화된 황산염뿐만 아니라 알킬 프로폭시화된 황산염이 여기서 기대된다. 치환된 암모늄 양이온의 특정 예는 메틸-, 디메틸, 트리메틸-암모늄 양이온 및 테트라메틸암모늄 및 디메틸 피페리디늄 양이온 및 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 이의 혼합물, 등과 같은 알킬아민으로부터 유도된 것과 같은 4차암모늄 양이온을 포함한다.
다른 적당한 음이온 계면 활성제는 식 ROSO3M 에서 R은 바람직하게는 C10-C-24 히드로카르복실, 바람직하게는 C10-C20 알킬 화합물을 가지는 알킬 또는 히드록시알킬, 더욱 바람직하게는 C12-C18 알킬 또는 히드록시알킬이고, M은 H 또는 예를 들어, 알카리성 금속이온(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리듐), 또는 암모늄 또는 대체된 암모늄 양이온인 가용성 염 또는 산의 알킬 황산염 계면활성제를 포함한다.
다른 음이온 계면 활성제는 비누의 염 (예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 및 모노-디- 및 트리에탄올아민염과 같은 대체된 암모늄염을 포함하는), C8-C22 일차 또는 이차 알칸술폰산염, C8-C24 올레핀술폰에이트, 알칼리 토금속 시트르산염의 열분해 생성물의 술폰화반응에 의해 제조된 술폰화된 폴리카르복시산을 포함한다.
알킬 벤젠 술폰에이트는 알킬기가 바람직하게는 10 에서 18 탄소 원자를 포함하는 사슬(직쇄) 알킬 벤젠 술폰에이트(LAS)가 특히 적당하다.
세탁물 세제 조성물은 전형적으로 이러한 음이온 계면활성제의 약 1중량% 에서 약 40중량%, 바람직하게는 약 3중량%에서 약 20중량%를 포함한다.
빌더 시스템:
본 발명에 따른 조성물은 더욱이 빌더 시스템을 포함할 수 있다.종래의 어떤 빌더 시스템은 규산알루미늄 물질, 규산염, 폴리카르복실에이트 및 지방산, 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA)와 같은 물질, 아미노폴리포스포네이트와 같은 금속이온 격리제를 포함하는 여기서의 사용에 적당하다. 인산 빌더가 또한 여기에 사용될 수 있다.
적당한 빌더는 무기 이온 교환 물질, 일반적으로 수화된 무기 규산알루미늄 물질, 더욱 특별하게는 수화된 제올라이트 A,X,B,HS 또는 MAP 와 같은 수화된 합성 제올라이트일 수 있다.
세제 빌더 염은 일반적으로 조성물의 5 중량% 에서 80중량 %의 양으로 포함된다. 액체 세제를 위한 빌더의 바람직한 수준은 5%에서 30%이다.
다른 세제 효소 활성:
세제 조성물은 특정 활성을 가진 본 발명의 결합체에 추가하여 예를 들어클린징 성능 및/또는 직물 케어 편익 예를 들어 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 셀룰라제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시다제, 옥시다제 (예를 들어 라카아제)같은 본 발명에 따라 기술된 바와 같은 효소 결합체의 형태내에서 다른 효소 활성을 더 포함할 수 있다.
기대되는 효소의 특정 예는 "효소의 활성"단락에서 상기에 열거된다.
표백제:
세제 조성물(특히 과립 세제의 경우에)은 또한 예를 들어, 산소 표백 또는 할로겐 표백과 같은 표백제를 포함할 수 있다.
산소 표백은 과붕산염(예를 들어, PB1 또는 PB4) 또는 과카르복시산염과 같은 과산화수소 방출제일 수 있거나 예를 들어 과카르복시산일 수 있다. 입자 크기는 400-800 마이크론일 수 있다. 존재할 때에는,산소 표백 화합물은 전형적으로 약 1%에서 약 25%의 수준으로 존재할 것이다.
과산화수소 방출제는 테트라아세틸에틸렌디아민(TAED) , 노나노일옥시벤젠-술폰산염(NOBS), 3,5- 트리메틸-헥산올옥시벤젠-술폰산염(ISONOBS)또는 펜타아세틸글루코스(PAG) 와 같은 표백 활성제와 함께 사용될 수 있다.
수소 표백은 예를 들어 삼염화 이소시아누르산 및 나트륨 및 칼륨 디클로로이소시아누르산염 및 N-염화 및 N-브로모 알칸 술폰아마이드와 같은 차아염소산염 표백제일 수 있다. 이러한 물질은 일반적으로 가공 제품의 0.5-10 중량 %, 바람직하게는 1-5 중량%이다.
섬유 이용분야
프로테아제
프로테아제는 실크의 정련 및 모래 세척에 사용된다.
리파제
리파애제는 직물의 끝손질 동안에 소수성 에스테르(예를 들면 트리글리세라이드)를 함유하는 지방성 물질을 제거하기 위해 사용된다.(예를 들어 Novo Nordisk A/S의 WO 93/13256 참조)
산화환원효소
직물의 표백제를 씻어냄에 있어서, 카탈라제는 과도한 과산화수소를 제거하는데 사용될 수 있다.
카르보히드라제
셀룰로스 분해효소는 직물의 색상 밀도에서 국부화된 변화를 제공하기 위해서 데님 의류의 가공에 넓게 사용된다. ("돌 세척"을 촉매하는 효소)
또한 셀룰로스 분해효소는 바이오-광택 과정에서의 사용이 발견된다. 바이오-광택은 실 표면의 특이적 처리로서 직물의 습광도의 손실 없이 핸들 및 외관에 관한 직물 질을 개선한다. 바이오-광택은 예를 들어, WO 93/20278에 기술된 방법을 적용하여 얻어질 수 있다.
섬유의 제직동안, 실은 상당한 기계적 스테레인에 노출된다. 파손을 방지하기 위하여 일반적으로 젤라틴 물질(사이즈)로 코팅(사이징)하여 보강된다. 가장 흔한 사이징제는 원형 또는 변형된 형태의 전분이다. 따라서, 균일하고 내구력있는가공은 소위 탈사이징인 직물의 사이즈를 제거한 후에만 얻어진다.
전분 또는 변형된 전분을 포함하는 사이즈로 사이즈화된 직물의 탈사이징은 바람직하게는 녹말분해 효소의 사용으로 촉진된다.
물질 및 방법
물질
효소
PD498: 재 93/24623 에서 보여지는 서브틸리신 타입의 프로테아제.PD 498 의 서열은 SEQ ID NO: 1과 2에서 보여진다.
서브틸리신 DY : Bacillus sp. 변이체 (Betzel et al.(1993),Archives of Biophysics,Vol.302,No.2,p.499-502)에서 분리된 SEQ ID NO:3에서 보여지는 서브틸리신 타입의 프로테아제.
Sarvinase:
사비나제 변이체 R247K (BPN' 번호매김을 사용하여 위치 247의 아르기닌이 리신으로 대체되었다.)
ELISA 시약
돼지 항-토끼-Ig 로 라벨된 서양고추냉이 퍼옥시다제(Dako, DK, P217, 희석 1:1000).
래트 항-마우스 IgE (Serotec MCA419; 희석 1:100). 마우스 항-래트 IgE (Serotec MCA193;희석 1:200).
바이오틴 라벨된 마우스 항-래트 IgG1 단일클론 항체(Zymed 03-9140;1:1000)
바이오틴 라벨된 래트 항-마우스 IgG1 단일클론 항체(Serotec MCA336B ;희석 1:2000)
스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 (Kirkegard&Perry 14-30-00; 희석 1:1000)
완충액 및 용액:
-PBS(pH 7.2 (1 liter))
NaCl 8.00 g
KCl 0.20 g
K2HPO4 1.04 g
K2HPO4 0.32 g
-세척 완충액 PBS, 0.05% (v/v)트윈 20
-블로킹 완충액 PBS, 2% (wt/v) 스킴 밀크 파우더
-희석 완충액 PBS, 0.05% (v/v)트윈 20, 0.5% (wt/v) 스킴 밀크 파우더
-시트르산염 완충액 (0.1M, pH 5.0-5.2 (1 liter)
시트르산 나트륨 20.60g
시트르산 6.30g
-정지- 용액 (DMA- 완충용액)
-붕산나트륨, 붕사 (시그마)
-3,3-디메틸 글루탐산 (시그마)
-염화 칼슘 (시그마)
-twen20: 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 모노 라우레이트(Merck cat no. 822184)
-N-하이드록시 숙신이미드 (Fluka art. 56480)
-포스겐 (Fluka art. 79380)
-락토오스 (Merck 7656)
-PMSF (phenyl methyl sulfonyl flouride ) from slgma
-숙시닐-알라닐-알라닌-프롤린-페닐알라닌-파라-니트로아닐리드(Suc-AAPF-pNP) sigma no. s-7388, Mw 624.6 g/mole.
-mPEG (Fluka )
프로테아제 Model 세제 '95는 가정에서 세제 조제물이다.
26% 표준상태 ( Na5P3O10)
25% Na2SO4
10% Na2CO3
20% LAS ( Nansa 80S )
5% NI(Dobanol 25-7)
5% Na2SiO5
0.5% 카르복실메틸 셀룰로오즈( CMC)
9.5% 물
EMPA 116: 혈액, 우유, 면위의 인디안 잉크
EMPA 117: 혈액, 우유, PE/BO위의 인디안 핑크
염색 기질:
OPD: o-페닐렌- 디아민, (Kementec cat no. 4260)
시험 동물:
브라운 노르웨이 래트(Charles River, DE)
장비 :
XCEL Ⅱ (Novex)
ELISA reader (UVmax, Molecular Devices)
HPLC (물)
PFLC (파마시아)
슈퍼덱스075 컬럼, 모노-큐, 파마시아, SW 로부터 모노 에스.
SLT: SLT Lab Instruments로부터 포토메터
크기- 배타 크로마토그레피( Spherogel TSK-G2000 SW).
크기-제외 크로마토그레피( 슈퍼덱스 200,Pharmacia,SW)
아미콘 셀
오메가 10K 막을 가진 필트론 울트라세트
미니워시 로봇
CLX 75W Zenon 램프와 fibre optics로 설치된 J&M Tidas MMS/16 포토메터
방법
브라운 노르웨이 래트의 기관내 (IT) 자극
분자의 IT 투약을 위해서 2 1/2" 의 긴 금속 프로브를 가진 1회용의 주사기가 사용된다. 이 프로브는 래트의 후두개 아래 대략 1cm 기관내에 주입되고, 분자 용액의 0.1 ml 를 침전한다. 시험 동물은 10 군의 브라운 노르웨이 래트(BN)이다. 시작시에 무게는 200 g 보다 무겁고 종료시에는 대략 450 g 이다.
브라운 노르웨이 래트의 IgE 항체의 상대적인 농도를 측정하기 위한 ELISA 과정
세 층의 샌드위치 ELISA 는 특정 IgE 혈정의 상대적인 농도를 결정하는데 사용된다.
1) ELISA-평판을 10mg의 마우스 항-래트 IgE 완충액 1( 50 마이크로L/웰)으로 코딩.4℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션.
2) 평판을 비우고 실내온도에서 적어도 1/2 시간동안 블라킹 완충액으로 블럭 (200마이크로L/웰). 부드럽게 쉐이크. 세척 완충액으로 플레이트를 3번 세척.
3) 희석되지 않은 래트 혈청(50 마이크로L/웰)를 인큐베이션하고 2배 희석된 것으로 인큐베이션. 어떤 웰은 완충액 4 를 위해 방치 (블랭크). 실내온도에서 30분동안 50 마이크로L/웰를 인큐베이션.부드럽게 쉐이크. 세척 완충액으로 플레이트를 3번 세척.
4) 희석 완충액에서 효소를 적정 단백질 농도로 희석한다. 실내온도에서 30분동안 50 마이크로L/웰를 인큐베이션.부드럽게 쉐이크. 세척 완충액으로 플레이트를 3번 세척.
5) 희석 완충액에서 결합된 항체를 찾기 위해 특정 폴리클론 항-효소 항혈청 혈정(pIg)을 희석. 실내온도에서 30분동안 50 마이크로L/웰를 인큐베이션.부드럽게 쉐이크. 세척 완충액으로 플레이트를 3번 세척.
6) 희석 완충액에서 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 항-pIg-항체를 희석. 실내온도에서 30분동안 50 마이크로L/웰를 인큐베이션.부드럽게 쉐이크. 세척 완충액으로 플레이트를 3번 세척.
7) 기질 완충액에서 0.6 mf ODP/ml + 0.4 마이크로L H2O2/ml 혼합. 사용 직전에 용제를 만듬. 10분동안 인큐베이션. 50 마이크로L/웰.
8) 620 nm 를 기준으로하고 492 nm 에서 플레이트를 해독. 데이타를 계산하고 로터스에 제시
분자량의 결정
단백질의 전기영동상의 분리를 4-20% 기울기 SDS 폴리아크릴아마이드 겔(Novex)를 사용하여 표준 방법에 의해 수행했다. 단백질을 은 염색으로 찾았다. 분자량을 Novex의 넓은 범위 분자량 표준인 Mark12의 움직임에 대해 상대적으로 측정했다.
프로테아제 활성
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa 에 의한 분석:
프로테아제는 펩티드와 니트로아닐린 사이의 결합을 쪼개서 405nm 에서 분명한 노란 색상 흡수를 부여한다.
완충액:예를 들어 브리톤과 로빈손 완충액 pH 8.3
기질: 100mg suc-AAPF-pNa 는 1 ml 디메틸 술폭사이드(DMSO)로 용해된다. 이의 100 ml는 브리톤 및 로빈손 완충액으로 10 ml 로 희석된다.
분석
기질 및 프로테아제 용액은 혼합되고 흡수성은 405 nm에서 시간의 진행에 따라 측정되고 ABS405 NM/min이다. 온도는 조절되여야만 한다. (프로테아제에 따라 20-50 ℃) 이것은 표본에서의 프로테아제 활성의 측정이다.
실시예 1
N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 1.900 (50 wt% 에틸렌글리콜)의 활성화
ALDRICH로부터의 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 1.900 (50 wt% 에틸렌 글리콜)을 톨루엔에서 용해했다.(중합체의 5 ml/g). 반응체를 건조시키기 위해서 일반 압력하에서 약 20%를 함께 끊여서 증류했다. 용액을 20℃로 냉각했고 톨루엔내의 포스겐(1.93 M 7 몰/몰 중합체)을 첨가했다. 다음으로 혼합물을 하룻밤동안 실내온도에서 교반했다. 용제 및 과도한 포스겐을 진공 상태에서 제거했고 중간체 비스(클로로포르메이트)가 오일로서 얻어졌다.
톨루엔(건조 4 ml/g 중합체)을 오일을 재용해하기 위해 첨가했다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS)(2.4 몰/몰 중합체)를 첨가했고 아이스-베쓰로 냉각했다.트리에틸아민(2.2 몰/몰 중합체)을 0℃에서 방울지게 첨가했다. 트리에틸아민 하이드로클로라이드 (Et3N.HCl)의 즉각적인 침전을 관찰할 수 있었다.이 혼합물을 실내온도에서 하룻밤동안 교반했다.이 혼합물을 Et3N.HCl 를 제거하기 위하여 유리 프리트(G5)를 사용하여 여과했다. 여과액을 감압하에서 건조를 위해 증발했고 따라서 97 % (몰/몰)의 오일을 수득했다. NMR 지표＞90% 활성 및 결합되지 않은 NHS 의 ＜8 o/o (몰/몰). 폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 1.900 비스(숙신이미딜 카르보산염)(50 wt % 에틸렌글리콜)(CDC13) δ에 대한 1H-NMR (400 MHz):1.15 bs (PPG 에서 I=330-CH3), 2.69 s (I=1.7 반응하지 않은 NHS), 2.83 s(I=41, 숙신이미드), 3.41m (I=110, PPG 에서 CH-CH2), 3.55 m (I=220, PPG 에서 CH-CH2), 3.61 m(I=440 메인 피크), 4.46 t(I=19, PPG 에서 CH2-O-C0-).
실시예 2
N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 폴리(에틸렌 글리콜)-코-(프로필렌 글리콜)모노부틸 에테르 970 (카. 50wt% 에틸렌글리콜)의 활성화
ALDRICH로부터의 폴리(에틸렌 글리콜)-코-(프로필렌 글리콜)모노부틸 에테르 970 (카.50wt% 에틸렌글리콜)을 톨루엔에서 용해했다.(중합체의 4 ml/g). 반응체를 건조시키기 위해서 일반 압력하에서 약 20%를 함께 끊여서 증류했다. 용액을 0℃로 냉각했고 톨루엔내의 포스겐(1.93 M 5 몰/몰 중합체)을 첨가했다. 다음으로 혼합물을 하룻밤동안 실내온도에서 21 시간동안 교반했다. 용제 및 과도한 포스겐을 진공 상태에서 제거했고 중간체 클로로포르메이트가 오일로서 얻어졌다.
톨루엔(건조 2 ml/g 중합체)을 오일을 재용해하기 위해 첨가했다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS)(1.2 몰/몰 중합체)를 실내 온도에서 첨가했다.트리에틸아민(1.1 몰/몰 중합체)을 0℃에서 방울지게 첨가했다. 트리에틸아민 하이드로클로라이드 (Et3N.HCl)의 즉각적인 침전을 관찰할 수 있었다.이 혼합물을 실내온도에서 하룻밤동안 교반했다.이 혼합물을 불용성의 Et3N.HCl 를 제거하기 위하여 유리 프리트(G5)를 사용하여 여과했다. 여과액을 감압하에서 건조를 위해 증발했고 따라서 89 % (몰/몰)의 오일을 수득했다. NMR 지표＞72% 활성 및 결합되지 않은 NHS 의 ＜5 o/o (몰/몰).1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:0.91 t(I=1000 -CH3 부틸), 1.15 s (프로필렌 글리콜에서 I=8744-CH3),1.39m (I=1320, CH3-CH2-CH2 부틸), 1.55 m (I=656, -CH2-O-부틸), 2.68 s(I=60.8 처리되지 않은 NHS), 2.83 s(I=963.2, 숙신이미드), 3.40 m (I=3059, 프로필렌 글리콜에서 CH-CH2), 3.55m (I=2678, 프로필렌 글리콜에서 CH-CH2), 3.61m ( I=1764 주요 피크, 에틸렌 글리콜에서 -CH2-CH2 ), 4.46 m ( CH2-O-C0-).
실시예 3
N- 숙신이미딜 카르보네이트를 가진 mPEG 350 의 활성화
mPEG 350을 톨루엔에서 용해했다(mPEG 의 4ml/g). 반응체를 건조시키기 위해서 일반 압력하에서 약 20%를 함께 끊여서 증류했다. 용액을 20℃로 냉각했고 톨루엔내의 포스겐(1.93 M 1.5 몰/몰 mPEG)을 첨가했다. 다음으로 혼합물을 하룻밤동안 실내온도에서 교반했다. 이 혼합물을 감압하에서 증발했고 중간체 클로로포르메이트를 오일로서 얻었다.
증발후에 디클로로메탄 및 톨루엔(1:2,건조 4 ml/g mPEG)을 무색의 오일을 재용해하기 위해 첨가했다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS)(1.5 몰/몰 mPEG.)를 고형으로 첨가했고 그 다음에 트리에틸아민(1.1 몰/몰 mPEG)을 0℃에서 첨가했다. 트리에틸아민 하이드로클로라이드 (Et3N.HCl)의 즉각적인 침전을 관찰할 수 있었다.이 혼합물을 실내온도에서 하룻밤동안 교반했다.이 혼합물을 Et3N.HCl 를 제거하기 위하여 유리 프리트(G5)를 사용하여 여과했다. 여과액을 감압하에서 건조를 위해 증발했고 따라서 98 % (몰/몰)의 오일을 수득했다.NMR 지표＞85-95% 활성 및 HNEt3Cl의 ＜10 o/o (몰/몰). mPEG 350 숙신이미딜카르보산염에 대한1H-NMR (400 MHz)δ:1.42 t(HNEt3Cl에서 I=1.4 -CH3 ), 2.68 s (처리되지 않은 NHS 에서 I=3.4), 2.84 s (I=6.2 숙신이미드), 3.10dq (I=1.0 -CH2 i HNEt3Cl), 3.38 s(I=5.8 CH3 i OMe ), 3.64 bs ( I=50 주요 피크), 4.46 t ( I=3.0 PEG 에서 CH2).
실시예 4
N- 숙신이미딜 카르보네이트를 가진 mPEG 300 의 활성화
mPEG 300을 톨루엔에서 용해했다(mPEG 의 13ml/g). 반응체를 건조시키기 위해서 일반 압력하에서 약 20%를 함께 끊여서 증류했다. 용액을 20℃로 냉각했고 톨루엔내의 포스겐(1.93 M 3.8 몰/몰 PEG)을 첨가했다. 다음으로 혼합물을 하룻밤동안 실내온도에서 교반했다. 이 혼합물을 감압하에서 증발했고 중간체 비스(클로로포르메이트)를 오일로서 얻었다.
증발후에 건조 톨루엔(10 ml/g PEG)을 무색의 오일을 재용해하기 위해 첨가했다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS)(3.0 몰/몰 mPEG.)를 고형으로 첨가했고 그 다음에 트리에틸아민(2.4 몰/몰 mPEG)을 0℃에서 첨가했다. 트리에틸아민 하이드로클로라이드 (Et3N.HCl)의 즉각적인 침전을 관찰할 수 있었다.이 혼합물을 실내온도에서 하룻밤동안 교반했다. 이 혼합물을 Et3N.HCl 를 제거하기 위하여 유리 프리트(G5)를 사용하여 여과했다. 여과액을 감압하에서 건조를 위해 증발했고 따라서 90 % (몰/몰)의 오일을 수득했다.NMR 지표＞55% 활성 및 HNEt3Cl의 ＜5 o/o (몰/몰).1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:1.11 t(NEt3에서 I=1.8 CH3 ), 2.69 s (처리되지 않은 NHS 에서 I=1.39),2.84 s (I=20.2 숙신이미드), 3.64 bs ( I=113 주요 피크), 4.44 m ( I=10.0 PEG 에서 CH2).
실시예 5
N- 숙신이미딜 카르보네이트를 가진 mPEG 550 의 활성
mPEG 550을 톨루엔에서 용해했다(mPEG 의 9ml/g). 반응체를 건조시키기 위해서 일반 압력하에서 약 10%를 함께 끊여서 증류했다. 용액을 20℃로 냉각했고 톨루엔내의 포스겐(1.93 M 1.5 몰/몰 mPEG)을 첨가했다. 다음으로 혼합물을 하룻밤동안 실내온도에서 교반했다. 이 혼합물을 감압하에서 증발했고 중간체 클로로포르메이트를 오일로서 얻었다.
증발후에 건조 톨루엔(4 ml/g mPEG) 및 건조 디클로로메탄(3ml/g mPEG)을 무색의 오일을 재용해하기 위해 첨가했다. N-하이드록시 숙신이미드(NHS)(1.2 몰/몰 mPEG.)를 고형으로 첨가했고 그 다음에 트리에틸아민(1.2 몰/몰 mPEG)을 0℃에서 첨가했다. 트리에틸아민 하이드로클로라이드 (Et3N.HCl)의 즉각적인 침전을 관찰할 수 있었다.이 혼합물을 실내온도에서 하룻밤동안 교반했다.이 혼합물을 Et3N.HCl 를 제거하기 위하여 유리 프리트(G5)를 사용하여 여과했다. 여과액을 감압하에서 건조를 위해 증발했고 따라서 89 % (몰/몰)의 점성의 오일을 수득했다. NMR 지표＞77% 활성 및 HNEt3Cl의 ＜2 o/o (몰/몰). mPEG 550 숙신이미딜카르보산염에 대한1H-NMR (400 MHz)δ:1.41 t(HNEt3Cl에서 I=4.2 -CH3 ), 2.69 s (처리되지 않은 NHS 에서 I=24.4),2.84 s (I=81 숙신이미드), 3.10dq (I=3.7 CH2 i HNEt3Cl), 3.38 s(I=97 CH3 i OMe ), 3.64 bs ( I=1250 주요 피크), 4.44 m ( I=41, PEG 에서 CH2).
실시예 6
활성화된 mPEG 350 과 PD498 프로테아제의 결합
PD498 의 62mg을 최종 부피 6ml 에서 N-숙신이미딜 카르보네이트(실시예 1에 따라 제조된)를 가진 활성화된 mPEG 350의 20mg(200㎕)을 가지고, pH 9.7, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 최종 6.0 pH 에 0.5 M 숙신산을 첨가하여 중지시켰다. 얻어진 유도체의 분자량은 PD498 몰당 부착된 mPEG 의 약 11몰에 대응하는 대략 33 kDa 이었다.
모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐라이드)
실시예 7
활성화된 mPEG 350 과 서브틸리신 DY 프로테아제의 결합
서브틸리신 DY 를 실시예 2에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 mPEG 350 에 접합했다.
상기의 개시에서 보이듯이 많은 변화와 변형이 본 발명의 취지 또는 이의 범위에서 벗어나지 아니하고 본 발명의 구체화에서 가능할 것이다는 것이 당업계의 당업자에게 분명할 것이다.따라서, 본 발명의 범위는 하기 청구항에 의해 정의된 물질과 일치하여 정해진다.
실시예 8
활성화된 mPEG 350 과 사비나제 변이체 R247K 의 결합
사비나제 변이체의 21mg을 대략 2ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 mPEG 350의 16mg을 가지고, pH 9.5, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0-9.5 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다. 반응체 과도를 50mM 붕산나트륨, 5mM숙신산, 1mM CaCl2, pH 6.0 으로 평형화된 슈퍼덱스 75 힐로드칼럼(Pharmacia,SW)에서 크기 배척 크로마토그래피에 의해 제거했다. 모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 9
활성화된 mPEG 550 과 사비나제 변이체 R247K 의 결합
사비나제 변이체의 21mg을 대략 2ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 mPEG 550의 25mg을 가지고, pH 9.5, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0-9.5 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다. 반응체 과도를 50mM 붕산나트륨, 5mM숙신산, 1mM CaCl2, pH 6.0 으로 평형화된 슈퍼덱스 75 힐로드 칼럼(Pharmacia,SW)에서 크기 배척 크로마토그래피에 의해 제거했다. 모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 10
활성화된 비스-PEG-300 과 사비나제 변이체 R247K 의 결합
사비나제 변이체의 21mg을 대략 2ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 비스-PEG 300의 14mg을 가지고, pH 9.5, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다.반응체 과도를 50mM 붕산나트륨, 5mM숙신산, 1mM CaCl2, pH 6.0 으로 평형화된 슈퍼덱스 75 힐로드 칼럼(Pharmacia,SW)에서 크기 배척 크로마토그래피에 의해 제거했다.모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 11
활성화된 비스-PEG-200 과 사비나제의 결합
사비나제 변이체의 827mg을 대략 30ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 비스-PEG 200의 420mg을 가지고, pH 9, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다.반응체 과도를 필트론-울트라세테를 사용한 한외여과에 의해 10 kD 에서 절단시켜 제거했다.모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 12
활성화된 비스-PEG-300 과 사비나제의 결합
사비나제 변이체의 827mg을 대략 30ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 비스-PEG 300의 610mg을 가지고, pH 9, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다.반응체 과도를 필트론-울트라세테를 사용한 한외여과에 의해 10 kD 에서 절단시켜 제거했다.모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 13
활성화된 비스-PEG-600 과 사비나제의 결합
사비나제 변이체의 827mg을 대략 100ml 부피의 반응에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 비스-PEG 600의 1000mg을 가지고, pH 9, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다. 반응체 과도를 필트론-울트라세테를 사용한 한외여과에 의해 10 kD 에서 절단시켜 제거했다. 모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 14
활성화된 PEG 1000 과 사비나제의 결합
사비나제의 2mg을 최종 부피 대략 200ml에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를가진 활성화된 PEG 1000의 2.8mg을 가지고, pH 9, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다. 반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다.
반응체 과도를 필트론-울트라세테를 사용하여 한외여과에 의해 제거했다.
모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 15
활성화된 PEG 2000 과 사비나제의 결합
사비나제의 2mg을 최종 부피 대략 200ml에서 N-숙신이미딜 카르보네이트를 가진 활성화된 PEG 2000의 7.8mg을 가지고, pH 9, 50mM 붕산나트륨에서 인큐베이션했다. 반응을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 8.5-9.0 사이에서 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.반응 시간은 2 시간이었다. 반응을 1 M HCl을 첨가하여 최종 pH 6.0 에서 중지시켰다.
반응체 과도를 필트론-울트라세테를 사용하여 한외여과에 의해서 제거했다.
모 효소와 비교하여 잔기 활성은 펩티드 기질을 대하여 100 % 에 가까웠다. (숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로-아닐라이드)
실시예 16
폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 1900 비스(숙신이미딜 카르보네이트) (50 wt % 에틸렌 글리콜)을 가진 사비나제의 결합.
3 ml 버퍼내의 사비나제 148mg을 0.5 N NaOH를 가지고 pH 9.0 으로 조절했다. 활성화된 블럭 중합체의 450mg을 효소에 첨가했다. 반응 혼합물을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.2 시간후에 pH는 0.5M 숙신산을 가진 6.0으로 조절되었다. 반응혼합물을 슈퍼덱스 200 컬럼에서 겔-여과에의해 정제했다.DMC에 대한 결합체의 잔기 활성은 모 효소에 비하여 130% 였다.
실시예 17
폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 2900 비스(숙신이미딜 카르보네이트) (40 wt % 에틸렌 글리콜)을 가진 사비나제의 결합.
3 ml 버퍼내의 사비나제 148mg을 0.5 N NaOH를 가지고 pH 9.0 으로 조절했다. 활성화된 블럭 중합체의 700mg을 효소에 첨가했다. 반응 혼합물을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.2 시간후에 pH는 0.5M 숙신산을 가진 6.5으로 조절되었다. 반응혼합물을 슈퍼덱스 200 컬럼에서 겔-여과에의해 정제했다.DMC에 대한 결합체의 잔기 활성은 모 효소에 비하여 84% 였다.
실시예 18
폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 8400 비스(숙신이미딜 카르보네이트) (80 wt % 에틸렌 글리콜)을 가진 사비나제의 결합.
4 ml 버퍼내의 사비나아제 148mg을 0.5 N NaOH를 가지고 pH 9.0 으로 조절했다. 활성화된 블럭 중합체의 2000mg을 6 ml 1mM HCl 에서 용해했고, 효소에 첨가했다. 반응 혼합물을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.2 시간후에 pH는 0.5M 숙신산을 가진 6.5로 조절되었다. 반응혼합물을 슈퍼덱스 200 컬럼에서 겔-여과에의해 정제했다.DMC에 대한 결합체의 잔기 활성은 모 효소에 비하여 103% 였다.
실시예 19
폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 12000 비스(숙신이미딜 카르보네이트) (75 wt % 에틸렌 글리콜)을 가진 사비나제의 결합.
4 ml 버퍼내의 사비나제 148mg을 0.5 N NaOH를 가지고 pH 9.0 으로 조절했다. 활성화된 공중합체의 2800 mg을 효소에 첨가했다. 반응 혼합물을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.2 시간후에 pH는 0.5M 숙신산을 가진 6.0으로 조절되었다. 반응혼합물을 슈퍼덱스 200 컬럼에서 겔-여과에의해 정제했다.DMC에 대한 결합체의 잔기 활성은 모 효소에 비하여 140% 였다.
실시예 20
폴리(에틸렌 글리콜)-블럭-폴리(프로필렌 글리콜)-블럭-폴리(에틸렌 글리콜) 970 비스(숙신이미딜 카르보네이트) (50 wt % 에틸렌 글리콜)을 가진 사비나제의 결합.
4 ml 버퍼내의 사비나제 148mg을 0.5 N NaOH를 가지고 pH 9.0 으로 조절했다. 활성화된 공중합체의 340 mg을 효소에 첨가했다. 반응 혼합물을 0.5 M NaOH 을 부가에 의해 9.0 pH를 유지하는 동안 자기교반을 사용하여 주위의 온도에 따라 실행했다.2 시간후에 pH는 0.5M 숙신산을 가진 6.0으로 조절되었다. 반응혼합물을 슈퍼덱스 200 컬럼에서 겔-여과에의해 정제했다.DMC에 대한 결합체의 잔기 활성은 모 효소에 비하여 124% 였다.
실시예 21
작은 mPEG 중합체의 PD498 결합체의 브라운 노르웨이 래트 인트라트라첼 (IT) 시험
공지된 단백질 농도(유도체에 대한 광학 밀도 및 아미노산 서열 분석에 의해 측정된)를 가진 PD498 샘플은 0.75 마이크로G단백질/ml로 희석되었다.
희석된 샘플을 개개의 면역화를 위해 1.5 ml 조각으로 분취했다. 이 조각을 사용전까지 -20℃ 의 안정된 조건하에서 저장했다. 분석을 연구의 시작과 끝에 실행했다. 각 면역화 및 각 분석을 위해 새로운 조각을 취했다.
효소 결합체를 상기 예에 기술된 것과 같이 N-숙신이미딜 카르보네이를 가진 활성화된 mPEG 350,550,750 을 가지고 접합했다.
상응하는 모 효소는 대조표준으로 사용했다. 하기의 표본을 시험했다.
제 1 군 : PD498 (결합되지 않은 모효소-대조표준)
제 2 군 : PD498-PEG 750
제 3 군 : PD498-PEG 550
제 4 군 : PD498-PEG 350
래트를 0.9%(wt./vol) NaCl 용액 (컨트롤 그룹)의 100 마이크로L 또는 상기에 언급된 PD498 단백질 희석의 100 마이크로L을 가지고 매주 15번 면역하였다.
각 군은 10마리의 브라운 노르웨이 래트를 포함했다. 혈액 샘플 (2ml) 을 두번째 면역화 후에 다음의 면역화전에 눈으로부터 모았다. 혈청을 혈액 크로딩으로얻고, 원심분리하였다.
특이적 IgE 수준을 상기에 기술된 래트 IgE 에 특이적 ELIAS 분석을 사용하여 결정했다. 혈정을 희석되지 않은 것으로부터 시작하여 1/2 희석에서 적정했다.
광학 밀도는 492/620 nm 로 측정됐다.
IT 시험의 결과는 각각 PD498 유도체를 가진 브라운 노르웨이 래트에서 관찰된 바와 같이 연구의 결과로 혈청의 100 마이크로L당 총 광학 밀도를 예시하는 하기의 표에서 보여진다.
PD498 결합체의 결과는 하기 표 2에서 보여진다.
면역화의 수 비변형 PEG 350 PEG 550 PEG 750 NaCl
0 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0.3(0.6)
15 5.3(1.6) 2.7(1.2) 1.6(0.6) 1.5(1.4) 0.3(0.6)
괄호안의 값: 측정된 평균 값의 표준 에러
표 2에서 보여질 수 있는 바와 같이, 결합된 작은 중합체를 가진 PD498 결합체와 기관내로 노출된 래트의 특이적인 IgE 반응 수준은변이되지 않은 모 효소를 가지고 기관내로 노출되었던 래트에 비하여 감소된다. 따라서, 알레르기 발현성은 감소된다.
실시예 22
서브틸리신 DY 결합체의 브라운 노르웨이 래트 인트라트라첼 (IT) 시험
실시예 5에서 기술된 브라운 노르웨이 래트 IT 연구를 상응하는 모 서브틸리신 DY 효소를 가진 서브틸리신 DY-PEG750 결합체와 비교하기 위하여 반복했다.
(SEQ ID NO:3 참조) 서브틸리신 DY-PEG750 시험의 결과는 표 3에 보여진다.
면역화의 수 비변형 PEG 750 NaCl
0 0.3(0.6) 0.3(0.6) 0.3(0.6)
15 7.2(2.0) 1.9(0.4) 0.3(0.6)
괄호안의 값: 측정된 평균 값의 표준 에러
표 3에서 보여질 수 있는 바와 같이, 결합된 750 Da 중합체를 가진 서브틸리신 DY 결합체를 가지고 기관내로 노출된 래트의 특이적인 IgE 반응 수준은 변이되지 않은 모 효소를 가지고 기관내로 노출되었던 래트에 비하여 감소된다.
따라서, 알레르기 발현성은 감소된다.
실시예 23
PD498-PEG 결합체를 포함하는 피부 케어 조제물
하기에 본 발명의 결합체를 포함하는 피부 케어 조제물이 준비되었다:
로션(100 g을 만들기 위한)
오일 상 :
액체 파라핀 35 g
세틸 알콜 5g
트윈 80 7 g
수상:
모노 프로필렌 글리콜(MPG) 10g
0.4% 시트르산 완충액★pH 5.8 42.9g
메틸 파라벤 0.1g
PD498-SPEG550★★ 10mg
( 효소 단백질로서 )
오일상 및 수상을 분리하여 혼합하고 80℃로 가열한다. 오일 상는 교반동안 물에 천천히 붓는다. 혼합물을 대략 35℃로 냉각시키고 PD498-SPEG550 결합체를 가했다. 로션을 빠르게 냉각했다.
★0.4% 시트르산 단일가수분해물, 5.9 로 조정된 pH
★ ★일반적으로 MPG를 가진 식으로 적용될 것이다. 수상에서의 MPG는 효소식에서의 MPG의 양에 따라 조정되어야만 한다.
겔(100g을 만들기 위한)
MPG 20 g★
H2O ad.100g
시트르산 0.4g★★
카르바폴 940 1g
PD498-SPEG350 10mg
(효소 단백질로서)
성분을 상기 순서대로 혼합한다. pH 를 카르바폴을 첨가하기 전에 5.6으로 조정한다. 카르바폴의 첨가후에 pH 를 다시 조정했다.
★효소식의 양에 따라 조정한다.
★★pH 5.6
실시예 24
PEG-사비나제 및 EOPO-사비나제의 세척 성능
세제 용액의 pH를 HCl/NaOH를 사용하여 10.5로 조절했다. 탈이온수에 CaCl2및 MgCl2를 첨가하여 물의 경도를 조절했다(Surfactants in Consumer Product - Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1986 참조). 세제 용액의 pH를 HCl를 첨가하여 pH 10.5로 조절했다.
상업적인 가루 세제에 존재하는 프로테아제를 마이크로웨이브 오븐에서 5분 동안 85℃로 세제 용액을 가열하여 비활성화시켰다.
시험 물질의 반사율 측정을 CLX 75W 크세논 램프 및 광섬유가 장착된 J&MTidas MMS/16 광도계를 사용하여 460nm에서 행했다. 각 직물 조각을 바탕으로써 다른 직물 조각(동일한 세팅)을 사용하여 각각 측정했다.
SAS 6.12 소프트웨어를 실험 데이타에 대한 95% 유의도로 분산 및 t-테스트 비교(Student-Newman-Keuls)의 분석에 사용했다.
상이한 Savinase변이체의 세탁 성능을 델타 반사율(DR) 값을 비교하여 평가했다.
DR =R프로테아제 -R블랭크
DR: 델타 반사율
R프로테아제: 결합 프로테아제를 사용하여 세탁한 시험 물질의 반사율
R블랭크: 비-결합 프로테아제를 사용하여 세탁한 시험 물질의 반사율
결과
대문자는 t-테스트(SNK, α=0.05)를 기초로한 각 칼럼 내의 통계상의 분류를 나타낸다. 동일한 군(동일한 문자)이 두 개인 경우, 그것들은 통계적으로 분리될수 없다.
상기 표에 보여진대로 PEG-사비나제 및 EOPO-사비나제의 세척 성능은 비결합체 사비나제의 세척 성능에 비하여 개선되었다.

Claims (25)

  1. 개선된 세척 성능을 가진 폴리펩티드-중합체 결합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 결합체는 감소된 알레르기 발현성을 가진 것을 특징으로 하는 결합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드는 효소인 것을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 모 폴리펩티드는 0.1 kDa 내지 60 kDa 의 범위, 바람직하게는 100 kDa 내지 10,000 Da 의 범위, 특히 100 Da 내지 2,000 Da 의 범위의 분자량을 가지는 동종중합체와 결합된 4 kDa 내지 100kDa 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합체.
  5. 제 4 항에 있어서, 모 폴리펩티드,특히 효소는 15 내지 60 kDa 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 100 개의 중합체 분자, 바람직하게는 4 내지 50, 특히 5 내지 35 개의 중합체 분자는 모 효소에 공유결합으로 되어있는 것을 특징으로 하는 결합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 분자는 자연 또는 합성 동종- 및 이종중합체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 중합체 분자는 분지 PEG, 별-모양의 PEG, PEG 에테르 및 PEG 에스테르를 포함하는 합성 중합체 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 물질은 100 내지 6,000 Da,바람직하게는 100 내지 2,000 Da 의 분자량을 가진 PEG를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  10. 제 7 항에 있어서, 중합체 분자는 카르복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란 및메틸셀루로스, 카르복시메틸셀루로스, 에틸셀루로스, 하이드록시에틸셀루로스, 하이드록시프로필셀루로스와 같은 셀루로스스 및 키토산의 가수분해물,하이드록시에틸-전분,하이드록시프로필-전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로즈, 구아검, 이누린, 풀루란, 크산탄 검, 카라게닌,펙틴 및 알긴산을 포함하는 자연 발생 중합체 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드-폴리머 결합체는 폴리펩티드의 표면에 결합된 그래프트,블럭,교호 랜덤 공중합체인 것을 특징으로 하는 결합체.
  12. 제 11 항에 있어서, 폴리펩티드-중합체 결합체는 하나 이상의 중합체가 모 폴리펩티드에 공유결합 되어있고, 중합체는 일반식:
    EOxPOy(I)
    여기서 x=1-99% y= 1-99% x+y=100% 로 특징지어지는 것을 특징으로 하는 결합체.
  13. 제 12 항에 있어서, 중합체는 100 내지 100,000 Da, 특히 100 내지 50,000 Da, 특히 100 내지 10,000 Da 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합체.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 모 폴리펩티드는 1 내지 100 kDa 의 분자량을 가지며, 특히 효소는 15 내지 60 kDa 의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 결합체.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 블럭 또는 공중합체(들)는 10:90 또는 20:80 또는 30:70 또는 40:60 또는 50:50 또는 60:40 또는 70:30 또는80:20 또는 90:10 의 범위의 비율로 에틸렌 옥사이드 유니트(EO) 및 프로필렌 옥사이드 유니트 (PO) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합체.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 1 내지 100 개의 중합체 분자, 바람직하게는 4 에서 50, 특히 5 에서 35 개의 중합체 분자가 모 효소에 공유결합되어있는 것을 특징으로 하는 결합체.
  17. 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항 또는 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 세균, 사상균과 같은 미생물 기원이거나 효모 기원 또는 식물 기원인 것을 특징으로 하는 결합체
  18. 제 17 항에 있어서, 폴리펩티드는 서브틸리신 및 메탈로 프로테아제와 같은 세린 프로테아제를 포함하는 프로테아제를 포함하는 하이드롤라제 또는 카르보히드라제 또는 리파제카아제 및 할로퍼옥시다아제와 같은 옥시도리덕타제 또는 슈퍼옥시드 디스뮤타제의 군으로부터의 효소인 것을 특징으로 하는 결합체.
  19. 제 18 항에 있어서, 모 프로테아제는 PD498, Savinase, 사비나제 변이체 R247K, 프로테인아제K, 프로테인아제R 터미타제, 서브틸리신 DY, 리온 Y, Alcalase, 프로테인아제T, 및 JA16 을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 결합체.
  20. 제 18 항에 있어서, 모 카르보히드라제는 Novamyl, Fungamyl, Natalase, Termamyl을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결합체.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 결합체를 포함하는 공업용 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 세탁물 세제 조성물, 식기세척 조성물 또는 경표면 클린징 조성물과 같은 세제인 것을 특징으로 하는 공업용 조성물.
  23. 제 21 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 공업용 조성물의 세척 성능을 개선하기 위한 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 결합체의 사용.
  24. 제 23 항에 있어서, 호흡기 알레르기 발현성을 감소하기 위한 것을 특징으로 하는 결합체의 사용.
  25. 제 4 항 또는 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 동종-중합체와 제 4 항 또는 제 5 항 또는 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 모 폴리펩티드와 결합시키고 및/또는 제 11 항, 제 12 항, 제 13 항, 제 15 항및 제 16 항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 블럭 또는 공중합체와 제 14 항 또는 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에의 모 폴리펩티드와의 결합시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 세척 성능의 개선 방법.
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