ES2291883T3

ES2291883T3 - Proteasas.

Info

Publication number: ES2291883T3
Application number: ES04737239T
Authority: ES
Inventors: Peter Rahbek Oestergaard; Leonardo De Maria
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2003-02-07
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2024-02-09
Also published as: AU2004211446B2; DK1594963T3; US20110124084A1; US20060147499A1; EP1594963A2; DE602004007766D1; US20090238922A1; EP1594963B1; US7588926B2; WO2004072221A2; CN1774504B; CN1774504A; DE602004007766T2; BRPI0407294B1; WO2004072221A3; AU2004211446A1; BRPI0407294A; US7906310B2; ATE368105T1

Abstract

Proteasa de la familia de la peptidasa S2A y/o de la familia de la peptidasa S1E que i) tiene una actividad residual de al menos 0,80 después la incubación durante 164 horas, a pH 7 y 25ºC, en el tampón de ensayo suplementado con 0,1% de sorbato-K, y en la presencia de 1 mM de Cu 2+ , la actividad residual midiéndose con respecto a la actividad después de 0 horas de incubación; y/o ii) tiene una actividad relativa de al menos 0,67 en presencia de 1 mM de Cu 2+ , con respecto a un control sin Cu 2+ ; donde las mediciones de la actividad de i) y ii) están en el sustrato Suc-AAPF-pNA, en el tampón de ensayo a pH 7.0 y 25ºC; y donde para las mediciones de i), la proteasa tiene una pureza por SDS-PAGE de al menos el 90%; dicha proteasa iii) comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende al menos uno de los siguientes: a) (T120+R122+T127+Y129), (T120+N122+P127+F129), o (T120+S122+T127+Q129); y/o b) (T91+T176+1179+N180), o (S91+N176+L179+E180), donde la numeración de cada residuo de aminoácido corresponde a la numeración de la proteasa 10 que consiste en los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO:

Description

Proteasas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una clase determinada de serina proteasas que son estables y/o relativamente inafectadas por el cobre, al igual que al ADN que codifica estas proteasas, su producción recombinante, y su uso en piensos y detergentes.

Antecedentes de la invención

La clonación y expresión de una proteasa derivada de Metarhizium anisopliae se describe en Steven E. Screen y Raymond J. St. Leger en The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 9, 2000, págs 6689-6694. La secuencia de nucleótidos, chy1, de la misma está mostrada en el listado de secuencias como SEC ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos deducida, CHY1, como SEC ID NO: 4 (TREMBL:Q9Y843).

Las proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 están descritas en WO 88/03947. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 están mostradas en la solicitud de patente danesa nº. 1996 00013. WO 01/58276 describe el uso en piensos de proteasas ácido estables relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL nº. 18262. JP 2255081 A describe una proteasa purificada de Nocardiopsis sp. FERM P-1-508. La patente de la RDA no. DD 2,004,328 expone una proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43-647.

Es un objeto de la presente invención, el hecho de proporcionar proteasas alternativas para varios usos industriales, por ejemplo, para el uso en piensos y/o detergentes.

Resumen de la invención

La invención se refiere a una proteasa de la familia de la peptidasa S2A o S1E que i) tiene una actividad residual de al menos 0,80 tras la incubación durante 164 horas, a pH7 y 25ºC, en tampón de ensayo suplementado con sorbato-K (0,1%), y en presencia de 1 mM de Cu^{2+}, la actividad residual midiéndose con respecto a la actividad después de 0 horas de incubación; y/o ii) tiene una actividad relativa de al menos 0,66 en presencia de 1 mM de Cu^{2+}, respecto a un control sin Cu^{2+}; donde las mediciones de actividad de i) y ii) están en el sustrato Suc-AAPF-pNA, en el tampón de ensayo a pH7.0 y 25ºC; y donde para las mediciones de i), la proteasa tiene una pureza por SDS-PAGE de al menos el 90%.

La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican esta proteasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a los métodos para producir y usar la proteasa.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un alineamiento múltiple de la parte del péptido maduro de las proteasas derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (proteasa 10, aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2), Metarhizium anisopliae (proteasa de Metarhizium, aminoácidos 1- 188 de la SEC ID NO: 4), Nocardiopsis prasina DSM 15648 (proteasa 11, aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 6), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (proteasa 35, aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 8), Nocardiopsis alba DSM 15647 (proteasa 08, aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 10), subesp. dassonvillei DSM 43235 de Nocardiopsis dassonvillei (proteasa 18, aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 12), y Brachysporiella gayana CGMCC 0865 (proteasa de Brachysporiella, aminoácidos 1-186 de la SEC ID NO: 14).

Descripción detallada de la invención

Una descripción de las serina proteasas de las familias de la peptidasa S2A y S1E está incluida en la sección titulada "polipéptidos con actividad proteasa".

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Estabilidad e Inhibición en presencia de cobre

La invención se refiere a proteasas que son i) relativamente estables en presencia de Cu^{2+}, y/o ii) inhibidas por Cu^{2+} hasta una extensión relativamente baja.

La característica i) está determinada como actividad enzimática residual (= resto, o restante) después de haber incubado la enzima durante 164 horas, a pH7 y 25ºC, en el tampón de ensayo suplementado con sorbato-K (0,1%) (para fines de conservación), y en presencia de 1 mM de Cu^{2+}. La actividad residual es medida con respecto a la actividad después de 0 horas de incubación. Para la proteasa de la invención, la actividad residual es al menos 0,80 (= 80%).

La actividad proteasa es medida usando el sustrato Suc-AAPF-pNA, en el tampón de ensayo a pH7.0 y 25ºC. Para más detalles, rogamos se refieran al ensayo de pNA descrito en el Ejemplo 4, que también describe con detalle la determinación de acuerdo con i) y ii).

Está actualmente contemplado que la pureza de la proteasa evaluada puede influir en los resultados de estabilidad, y en consecuencia la proteasa, al menos cuando se analiza por su estabilidad de acuerdo con i), preferiblemente tiene al menos el 90% de pureza según ha sido medido por SDS-PAGE. Un procedimiento para determinar la pureza por SDS-PAGE se describe en Ejemplo 2. En formas de realización particulares, la pureza por SDS-PAGE es al menos el 91%; 92%; 93%; 94%, o al menos el 95%. En formas de realización alternativas, la pureza de absorción (ver Ejemplo 3), en particular para los fines de la prueba i), corresponde con una proporción A280/A260 de al menos 1,40; o al menos 1,42, 1,44, 1,46, 1,48, 1,50, 1.60; o al menos 1,70.

La característica ii) está determinada como la actividad enzimática en presencia de 1 mM Cu^{2+}, con respecto a la actividad de la misma enzima bajo las mismas condiciones, salvo para la presencia de Cu^{2+}. Para la proteasa de la invención, esta actividad relativa es al menos 0,66 (=66%). Para los fines de la característica ii), la actividad enzimática (proteasa) es medida según se ha descrito anteriormente.

En formas de realización particulares de las proteasas de la invención, la actividad residual de acuerdo con i) es al menos 0,81;0,82; 0,83; 0,84; 0,85; 0,86; 0,87; 0,88; 0,89; 0,90; 0,91; 0,92; 0,93; 0,94; 0,95; 0,96; o al menos 0,97.

En formas de realización alternativas, la actividad residual de acuerdo con i) es al menos 0,76; 0,77; 0,78; o 0,79. En otras formas de realización alternativas, la actividad residual de acuerdo con i) es determinada tras la incubación durante 116 horas, en cuyo caso la actividad residual para las proteasas de la invención es al menos 0,84; con las mismas gamas preferidas que se han enumerado arriba (de al menos 0,85 en adelante). En otras formas de realización alternativas adicionales, la actividad residual de acuerdo con i) es determinada tras la incubación durante 188,6 horas, en cuyo caso la actividad residual para las proteasas de la invención es al menos 0,73, con las mismas gamas preferidas según se ha enumerado arriba (de al menos 0,76 en adelante, más lo siguiente: o al menos 0,74, o al menos 0,75).

En otro grupo de formas de realización particulares de las proteasas de la invención, la actividad relativa de acuerdo con ii) es al menos 0,67, 0,68, 0,69; 0,70; 0,71; 0,72; 0,73; 0,74; 0,75; 0,76; 0,77; 0,78; 0,79; 0,80; 0,81; o al menos 0,82.

En una forma de realización alternativa, el sustrato Boc-VLGR-pNA se usa en vez de Suc-AAPF-pNA para las mediciones de la actividad - de acuerdo con i) y/o ii).

Los resultados de los estudios de estabilidad y de inhibición de acuerdo con las características i) y ii), respectivamente, están mostrados en las tablas 2 y 1, respectivamente, del Ejemplo 4. A partir de estas tablas es evidente que las proteasas denominadas proteasa 18 y proteasa de Brachysporiella son las únicas proteasas evaluadas que cumplen la característica i), mientras que la característica ii) se cumple en todas las proteasas evaluadas, salvo las proteasas conocidas llamadas Proteasa 10 y proteasa de Metarhizium.

Una observación más cercana a la Tabla 1 revela que la Proteasa 18 y la Proteasa 08 forman un subgrupo muy interesante con una actividad claramente más alta relativa en presencia de cobre (ambas con una actividad relativa por encima de 0,80). No obstante, la proteasa de Brachysporiella es también muy buena (próxima a una actividad relativa de 0,70). Esto significa que las dos pruebas i) y ii) identifican a estas tres proteasas como particularmente interesantes.

Antes de empezar a considerar los elementos estructurales potenciales que podrían explicar los efectos observados, he aquí primero algunas pautas en cuanto a la numeración de los residuos de aminoácidos en las distintas proteasas evaluadas, e instrucciones sobre cómo deducir los residuos de aminoácidos correspondientes en las distintas estructuras.

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Numeración de los residuos de aminoácidos

En este contexto, para los fines de la identificación de residuos de aminoácidos correspondientes en varias proteasas, se hace referencia a la numeración de los residuos de aminoácidos en la parte madura (aminoácidos 1-188) de la SEC ID NO: 2, Proteasa 10, empezando con A1 y terminando con T188. La Fig. 1 muestra, de forma alineada agrupaciones de 10 residuos, los números de los últimos residuos de aminoácidos de cada una de tales agrupaciones, es decir, en las filas superiores del alineamiento. Por ejemplo, el número "10" significa que los últimos residuos de aminoácidos de la Proteasa 10 en esta primera agrupación de 10 residuos, "T", es el residuo del aminoácido número 10 de la secuencia de aminoácidos de la Proteasa 10 madura. Como otro ejemplo, el número "145" significa que el último residuo de aminoácido de la Proteasa 10 en esta última agrupación de residuos en la tercera fila del alineamiento de la Fig. 1, que es una "G", es el residuo número 145 de la secuencia de aminoácidos de la Proteasa 10 madura. Esta numeración es idéntica a la numeración de la SEC ID NO: 2; sin embargo, no es necesariamente idéntica a la numeración de las SEC ID Nos: 4, 6, 8, 10, 12; y 14; la razón siendo que para la identificación de los residuos de aminoácidos correspondientes en varias proteasas, una numeración uniforme se usa en base a la Proteasa 10. El procedimiento para asignar una numeración uniforme está descrita de forma adicional más abajo.

Para cada uno de los residuos de aminoácidos de la Proteasa 10, un residuo "correspondiente" puede ser identificado en cada una de las otras seis proteasas mostradas en la Fig. 1, porque los residuos "correspondientes" son simplemente aquellos que se colocan unos sobre otros, o unos encima de los otros, en el alineamiento de la Fig. 1. Por ejemplo, el décimo residuo de aminoácido, T, de la Proteasa 10 (T10 de la SEC ID NO: 2) corresponde con Y10 de las SEC ID Nos: 4 y 12; a T10 de las SEC ID Nos: 6, 8 y 10; y a V8 de la SEC ID NO: 14. En este contexto, no obstante, para todos los fines salvo para fines del listado de secuencias, a todos estos residuos se les asigna el mismo número, porque se califican como "residuos correspondientes", y el número asignado es aquel del residuo correspondiente en la Proteasa 10, es decir, el residuo número 10. Por consiguiente, T10 de la Proteasa 10 corresponde a Y10, T10, T10, T10, Y10, y V10, de la proteasa de Metarhizium, Proteasa 11, Proteasa 35, Proteasa 08, Proteasa 18, y la proteasa de Brachysporiella, respectivamente. Cuando no se indique nada más, se usará esta numeración de ahora en adelante.

El alineamiento múltiple de la Fig. 1, en algunas filas, en algunas posiciones, incluye espacios, que pueden ser considerados como deleciones de residuos de aminoácidos. En este contexto, los espacios, o los residuos de aminoácidos delecionados, son numerados asignándoles a cada espacio letras minúsculas en orden alfabético, es decir, a, b, c, d, - - - - -, t, u, v, x, y, z. En el caso de necesitar más de 25 de tales designaciones, la numeración continuaría con aa, bb, cc etc. Por ejemplo, el espacio entre G12 y G13 de la Proteasa 10 corresponde a una deleción de dos residuos de aminoácidos en las posiciones 12a, y 12b. Por consiguiente, los residuos correspondientes en la proteasa de Metarhizium (SEC ID NO: 4) mostrada en la segunda fila de la Fig. 1 están designadas R12a, y S12b. Por analogía, los residuos de aminoácidos sucesivos FPGSA en la proteasa de Metarhizium correspondiente a FPGN en las posiciones 57-60 de la Proteasa 10 son numeradas como sigue: F57, P58, G59, S59a, y A60; la posición 59a siendo equivalente a una deleción de un aminoácido en la Proteasa 10.

Dos de las proteasas incluidas en el alineamiento de la Fig. 1 comprenden extensiones C-terminales en comparación con la Proteasa 10 es decir, la proteasa de Metarhizium y la proteasa de Brachysporiella. Los aminoácidos de tales extensiones son numerados como es usual en la técnica continuando a partir de nº. 188; es decir, 189, 190, 191 etcétera. Por ejemplo, se hace referencia al último aminoácido de la proteasa de Metarhizium como A 189.

Otra proteasa con una secuencia de aminoácidos con una parte de péptido maduro de la SEC ID NO: X puede ser añadida al alineamiento de la Fig. 1 como sigue:

El porcentaje de identidad de la SEC ID NO: X para cada una de las siete proteasas de la Fig. 1 (cada una de las partes del péptido maduro de las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14) es determinado usando el programa "Align" como se describe más abajo. Siete pares de alineamientos son producidos de ese modo. La secuencia con el grado máximo de identidad para la SEC ID NO: X es seleccionada como una proteasa modelo. Si hay más proteasas modelo candidatas, se puede seleccionar aquella que está enumerada en primer lugar en el alineamiento de la Fig. 1. Si, por ejemplo, la SEC ID NO: X tuviera el porcentaje siguiente de identidades con las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12; y 14: 45%; 55%; 50%; 65%; 65%; 45%, y 40%, respectivamente, entonces se debería seleccionar la SEC ID NO: 8 como la proteasa modelo. Como siguiente fase, se utilizará el par de alineamiento de la SEC ID NO: X a la SEC ID NO: 8, se adhiere la SEC ID NO: X (o podría simplemente ser escrita) sobre el alineamiento de la Fig. 1 como la fila inferior, asegurando que los residuos de aminoácidos correspondientes (aquí "correspondiente" se refiere al par de alineamiento de la SEC ID NO: X y la SEC ID NO: 8) se colocan uno sobre el otro.

Mientras que el alineamiento de la Fig. 1 permanece inalterada por este procedimiento de adición de una nueva secuencia a la misma, el procedimiento descrito puede dar lugar a espacios en la SEC ID NO: X; "bucles" en la SEC ID NO: X, y/o extensiones N- o C-terminales de la SEC ID NO: X, en comparación con la Proteasa 10 de la Fig. 1.

En cuanto a la numeración de tales posiciones con el fin de identificar los residuos de aminoácidos correspondientes en la SEC ID NO: X, los espacios y las extensiones C-terminales son tratados según el modo descrito anteriormente. Las extensiones N-terminales, si las hay, son numeradas como es usual en la técnica, -1;-2;-3 etcétera ("-" significando "menos"). Por ejemplo, si la SEC ID NO: X cuando es añadida al alineamiento de la Fig. 1 empezaría con la secuencia ALI situada antes del aminoácido N-terminal Al de la Proteasa 10, se numerarían A-3, L-2, y 1-1, respectivamente. En cuanto a los bucles, si los hay, se corresponde con la SEC ID NO: X que tiene residuos de aminoácidos en "exceso", los cuales no caben en el alineamiento de la Fig. 1. Tipográficamente, tales residuos en exceso son transferidos a una siguiente fila, pero evidentemente se considera que se incluyen en el alineamiento múltiple, y son numerados por analogía con lo que se ha descrito anteriormente para la numeración de espacios (usando las denotaciones a, b, c etc.). Por ejemplo, el par de alineamiento de la SEC ID NO: X y SEC ID NO: 8 podría incluir la parte siguiente:

(parte de la SEC ID NO: 8)	FAAT - - - - - NAAGQP

(parte de la SEC ID NO: X)	YAVSCRTAKNAACQP,

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Los residuos de aminoácidos FAATNAAGQP de la Proteasa 08 (SEC ID NO: 8) tienen números de alineamiento 19 a 28 y llegan a corresponder, en el par de alineamiento, con los siguientes residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: X: YAVSCRTAKNAACQP. Para estos fines, los residuos de aminoácidos de la SEC ID NO: X tendrían que ser numerados como sigue: Y19, A20, V21, S22, C22a, R22b, T22c, A22d, K22e, N23, A24, A25, C26, Q27, y P28.

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En el alineamiento de la Fig. 1, se puede escribir esto de la siguiente manera:

(parte de SEC ID NO: 8)	FAATNAAGQP

(parte de SEC ID NO: X)	YAVSNAACQP, CRTAK 22e

En formas de realización particulares alternativas, los pares de alineaciones a los que se ha hecho referencia antes son producidos usando las partes de CDS completas (que incluyen además de las partes del péptido maduro, cualquier parte del péptido señal, y/o parte de propéptido) de las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

Los siguientes son ejemplos de la denotación usada en la presente para caracterizar proteasas:

Expresiones tales como las siguientes:

: "Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende V166, con la cual la numeración del residuo aminoáciodo corresponde con la numeración de la Proteasa 10 (aminoácidos 1- 188 de la SEC ID NO: 2)"

significa que la secuencia de aminoácidos de la proteasa en cuestión, cuando se añade al alineamiento múltiple de la Fig. 1 según el modo descrito anteriormente, en la posición número 166 (que se refiere al número de alineamiento deducido según se ha descrito anteriormente) tiene una V.

Expresiones tales como "al menos uno de (L114 o Y114); (S121 o D121); (Q130 o M130); (N162 o T162 or S162); (S163 o R163); E174; y/o (S177 o E177)", se utilizan con respecto a una proteasa que cumple cada uno de (al menos uno de) los criterios separados por punto y coma (;). Este es el caso, por ejemplo, para una proteasa que tiene Y114, o S121, o M130, o E174, pero también para una proteasa que tiene L114 y D121.

Expresiones como:

Una proteasa que comprende al menos uno de los siguientes:

a): (T120 + R122 + T127 + Y129), (T120 + N122 + P127 + F129), o (T120 + S122 + T127 + Q129); y/o

b): (T91 + T176 + 1179 + N180), (S91 + N176 + L179 + E180), o (S91 + N176 + L179 + S180)'', se utilizan con respecto a una proteasa que cumple todos de cada uno de los criterios separados por el signo de mas (+) dentro de al menos uno de los seis paréntesis. Este es el caso, por ejemplo, para la Proteasa 18 que tiene T120, R122, T127, y Y129 (primer paréntesis en a)). Esta proteasa, a propósito, también comprende T91, T176, 1179 y N180 (primer paréntesis en b)).

Expresiones tales como "(H35+D61+S143)", se utilizan con respecto a una proteasa que comprende H35, D61 y S143 (residuos de aminoácidos del sitio activo).

Consideraciones estructurales con respecto al Cu

Las conclusiones sorprendentes de la presente invención en lo que se refiere a la influencia variable del cobre en las distintas enzimas evaluadas ha incitado alguna investigación con el propósito de definir, si fuera posible, posibles elementos estructurales que podrían explicar las diferencias observadas. Dos sitios de enlace de cobre potenciales (sitio Nos. I y II como se muestra en la tabla más abajo) fueron identificados, cuyo sitio No. I está previsto que sea el sitio más importante:

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100

En la tabla anterior, se coloca una doble línea (=) entre las proteasas que están relativamente inafectadas por el cobre, y aquellas que están afectadas más negativamente por el cobre (las que se encuentran encima, y debajo, respectivamente, de la doble línea).

De esta Tabla resulta como si las combinaciones siguientes de residuos del sitio No. I fueran desventajosas en cuanto al logro de una estabilidad alta y/o de una inhibición baja por el cobre: a) (T120+N122+Al27+S129), y b) (S120+S122+T127+T129).

Por analogía, las combinaciones siguientes de los residuos del sitio No. II pueden también ser desventajosas:

a)

(S91+N176+L179+Q180), y

b)

(H91+T176+V179+N180).

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En cambio, las combinaciones siguientes de residuos de los sitios Nos. I y II parecen ser favorables:

a)	(T120+R122+T127+Y129),	(T120+N122+P127+F129),	o	(T120+S122+T127+Q129);	y/o

b)	(T91+T176+1179+N180),	(S91+N176+L179+E180),	o	(S91+N176+L179+S180),

Otros residuos que pueden contribuir a una explicación estructural de las diferencias observadas son los residuos en la posición 51, 54, 86, 89, 99, 125, 130, 131, 135, 165; y 166. En consecuencia, en formas de realización particulares, la proteasa de la invención no comprende ninguna de las combinaciones siguientes de residuos: a) (V51 + Q54 + A86 + A89 + S99 + E125 + N130 + M131 + T135 + R165 + T166), y no b) (T51 + G54 + P86 + S89 +S99 + Q125 + S130 + L131 + S135 + S165 + R166). En cambio, en formas de realización adicionales particulares, la proteasa de la invención comprende al menos uno de los siguientes: T51; N54 o G54; Q86 o P86; T89 o F89; A99 o G99; Q125 o V125; S130 o G130; L131; N135 o S135; S165 o T165; V166 o S166. La expresión "al menos uno" significa uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, o los once residuos, en combinación. Para los fines de la presente invención, esta definición de "al menos uno" es generalmente aplicable, por analogía.

En formas de realización alternativas, la presente invención explícitamente se refiere a proteasas tal y como se define en esta sección sin las características funcionales i) y ii) según la reivindicación 1 solicitada, preferiblemente, las proteasas de la familia peptidasa S2A o S1E.

Polipéptidos con actividad proteasa

Los polipéptidos con actividad proteasa, o proteasas, son peptidasas a veces también designadas, proteinasas, péptido hidrolasas, o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidroliza péptidos desde el principio hasta cualquier extremidad de los mismos, o del tipo endo que actúa internamente en las cadenas polipeptídicas (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran actividad en sustratos peptídicos bloqueados N- y C- terminalmente que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

El término "proteasa" se define aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima del grupo enzimático EC 3.4 (que incluye cada una de las trece subclases de las mismas). El número EC se refiere a la nomeclatura enzimática de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, que incluye los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es suplementada y actualizada con regularidad; ver p. ej. el World Wide Web (WWW) en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html).

Las proteasas se clasifican en base a su mecanismo catalítico en los grupos siguientes: las serina proteasas (S), las cisteína proteasas (C), las proteasas aspárticas (A), las metaloproteasas (M), y las desconocidas, o aún sin clasificar, proteasas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

Las proteasas de la invención son seleccionadas del grupo que consiste en:

(a): serina proteasas de la familia de las peptidasas S2A según el manual Handbook anterior; y

(b): las serina proteasas de la familia de la peptidasa S1 E como se describe en Biochem. J. 290:205-218 (1993) y en la base de datos de proteasas MEROPS, publicación 6.20; Marzo 24, 2003; (www.merops.ac.uk). La base de datos está descrita en Rawlings, N.D., O'Brien, E. A. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30, 343-346.

La familia de peptidasas S2A representa fa forma clasificación tradicional de las proteasas. Hoy en día, las proteasas clasificadas generalmente como proteasas S2A son frecuentemente clasificadas según la clasificación MEROPS en la familia de las peptidasas S1E.

En una forma de realización particular, la proteasa es de la familia de las peptidasas S2A. En otra forma de realización particular, la proteasa es de la familia de las peptidasas S1E.

En formas de realización alternativas, las proteasas de la invención son seleccionadas del grupo que consiste en:

(c): proteasas pertenecientes al grupo enzimático EC 3.4.-; y

(d): serina proteasas pertenecientes al grupo S del manual Handbook anterior;

Para determinar si una proteasa dada es una serina proteasa, una familia de proteasas S2A, y/o una familia de proteasas S1E, se hace referencia a las referencias anteriores y los principios indicados en las mismas. Tal determinación puede ser realizada para todos los tipos de proteasas, ya sea las proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o las proteasas creadas genéticamente o sintéticas.

La actividad proteasa puede ser medida usando cualquier ensayo, en el que se emplea un sustrato, que incluye enlaces peptídicos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Asimismo, el pH y la temperatura del ensayo deben ser adaptados a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH del ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11; o 12. Ejemplos de temperaturas del ensayo son 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 o 80ºC.

Ejemplos de sustratos de proteasa son la caseína, tal como la Caseína cruzada con Azurina (Caseína AZCL). Para los fines de esta invención, el ensayo denominado pNA es un ensayo preferido, y un sustrato preferido es Suc-AAPF-pNA.

No hay limitaciones en el origen de la proteasa de la invención. Así, el término proteasa incluye no sólo proteasas naturales o de tipo salvaje obtenidas de microorganismos de cualquier género, sino también cualquier mutante, variante, fragmento etc. de las mismas que presenten actividad proteasa, al igual que las proteasas sintéticas, tales como las proteasas redistribuidas, y las proteasas de consenso. Tales proteasas creadas genéticamente pueden ser preparadas como es generalmente conocido en la técnica, p. ej. por mutagénesis dirigida, por PCR (usando un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de la PCR), por redistribución, o por mutagénesis aleatoria. La preparación de las proteínas de consenso está descrita en p. ej. EP 897985. El término "obtenido de" como se utiliza en este caso con respecto a una fuente dada significará que el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos es producido por la fuente o por una célula en la que la secuencia de ácidos nucleicos de la fuente está presente. En una forma de realización preferida, el polipéptido es segregado extracelularmente.

En una forma de realización específica, la proteasa es una variante poco alergénica, diseñada para invocar una respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta a animales, incluido el hombre. El término respuesta inmunológica debe ser entendido como cualquier reacción por el sistema inmunológico de un animal expuesto a la proteasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Las variantes poco alergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo la proteasa puede ser conjugada con fracciones de polímeros que protegen partes o epítopos de la proteasa implicada en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar el acoplamiento químico in vitro del polímero a la proteasa, p. ej. como se describe en WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, y/o WO 99/00489. La conjugación puede implicar además, o de forma alternativa a la misma, el acoplamiento de los polímeros a la proteasa in vivo. Tal conjugación puede ser conseguida por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteasa, la inserción de secuencias de consenso que codifican los sitios de glicosilación adicionales en la proteasa y la expresión de la proteasa en un huésped capaz de glicosilar la proteasa, ver p. ej. WO 00/26354. Otra forma de proporcionar variantes poco alergénicas es la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteasa para provocar que la proteasa se auto-oligomerice, provocando que los monómeros de la proteasa puedan proteger los epítopos de otros monómeros de la proteasa y de ese modo reducir la antigenicidad de los oligómeros. Los productos de este tipo y su preparación está descrita p. ej. en WO 96/16177. Epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden ser identificados por varios métodos tales como el método de exposición en el fago descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos puede ser alterada para producir propiedades inmunológicas alteradas de la proteasa por técnicas de manipulación genética conocidas tales como la mutagénesis sitio dirigida (ver p. ej. WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede ser realizada en una proximidad al epítopo suficiente para que el polímero proteja al epítopo.

En una forma de realización particular, el polipéptido de la invención tal y como se define en la reivindicación 1 comprende una secuencia de aminoácidos con actividad proteasa y con un grado de identidad de al menos el 40% a los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; y/o a los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2 (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos"). En formas de realización particulares adicionales, el grado de identidad es al menos de aproximadamente el 42%; 44%; 46%; 48%; 50%; 52%; 54%; 56%; 58%; 60%; 62%; 63%; 64%; 66%; 68%; 70%; 72%; 75%; 77%; 80%; 82%; 85%; 87%; 90%; 92%; 95%, o al menos aproximadamente del 97%. En otra forma de realización alternativa, cualquiera de los grados anteriores de identidad es relativo a cualquiera de las partes de CDS completas de las SEC ID Nos: 14, 12, 10, 8, 6, 4 o 2; p. ej. los aminoácidos -189 a 186 de la SEC ID NO: 2. En formas de realización particulares, los polipéptidos de la invención i) tienen; o ii) consisten en una secuencia de aminoácidos con cualquiera de los grados de identidad que se ha mencionado anteriormente.

Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, está determinada por el programa "align" que es un alineamiento de Needleman-Wunsch (es decir un alineamiento global). El programa se usa para el alineamiento de polipéptidos, así como de secuencias de nucleótidos. Se usa la matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 para 5 alineaciones de polipéptidos, y la matriz de identidad por defecto se usa para alineaciones de nucleótidos. La penalización para el primer residuo de un espacio es -12 para los polipéptidos y -16 para los nucleótidos. Las penalizaciones para residuos adicionales de un espacio son -2 para los polipéptidos, y -4 para los nucleótidos.

"Align" es parte del paquete FASTA versión v20u6 (ver W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de proteínas FASTA usan el algoritmo de Smith-Waterman sin limitación del tamaño del espacio (ver "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

En una forma de realización particular, las partes del péptido maduro, o las partes del péptido maduro pronosticadas o previstas, de las dos secuencias de aminoácidos son usadas para el alineamiento.

En la alternativa, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado por el método Clustal (Higgins; 1989; CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los parámetros de alineamiento múltiple siguientes: penalización de espacios de 10; y penalización de longitud de espacios de 10. Parámetros de alineamiento por pares son Ktuple=1, gap penalty =3, windows=5, y diagonals=5. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinado usando el mismo algoritmo y el paquete de software según el modo descrito anteriormente con los ajustes siguientes: Penalización de espacios de 10, y penalización de longitud de espacios de 10. Los parámetros de alineamiento por pares son Ktuple=3, gap penalty=3 y windows=20.

En una forma de realización particular, los polipéptidos homólogos tal y como se define en la reivindicación 1 tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de diez, o nueve, u ocho, o siete, o seis, o cinco aminoácidos. En otra forma de realización particular, los polipéptidos homólogos difieren de cuatro, o tres, o dos aminoácidos, o un aminoácido de los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; o de los aminoácidos 1-188 de (SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2). En formas de realización alternativas, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de cuarenta, treinta y cinco, treinta, veinticinco, veinte, o quince aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; o de los aminoácidos 1-188 de (SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2).

En una forma de realización particular, los polipéptidos de la presente invención tal y como se define en la reivindicación 1 comprenden la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; o los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2, o variantes alélicas de los mismos; o fragmentos de los mismos con actividad proteasa.

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos de la presente invención consisten en los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14, o de los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12 o 10, o variantes alélicas de los mismos; o fragmentos de los mismos con actividad proteasa.

Un fragmento es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados del término amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una forma de realización un fragmento contiene al menos 75 residuos de aminoácidos, o al menos 100 residuos de aminoácidos, o al menos 125 residuos de aminoácidos, o al menos 150 residuos de aminoácidos, o al menos 160 residuos de aminoácidos, o al menos 165 residuos de aminoácidos, o al menos 170 residuos de aminoácidos, o al menos 175 residuos de aminoácidos.

Una variante alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa la misma localización cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (nada cambia en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

La presente invención también se refiere a los polipéptidos según se define en la reivindicación 1 con actividad proteasa y los cuales son codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, o baja, o media, o media-alta, o alta, o muy alta, con una sonda de ácidos nucleicos que se hibrida bajo las mismas condiciones con (a) los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1; (b) una subsecuencia de (a), o (c) una cadena complementaria de (a), o (b) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis; 1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). En una forma de realización particular la sonda de ácidos nucleicos está seleccionada entre las secuencias de ácidos nucleicos de (a), (b), o (c) anteriores. Los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1, correspondientes a las partes del péptido maduro respectivo , son sondas preferidas.

La subsecuencia puede tener al menos 100 nucleótidos, o en otra forma de realización al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido con actividad proteasa.

Las secuencias de ácidos nucleicos enumeradas bajo (a) o (b) más arriba, al igual que las secuencias correspondientes de aminoácidos o de fragmentos de los mismos, pueden ser usadas para diseñar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar el ADN que codifica los polipéptidos con actividad proteasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las sondas de este tipo pueden ser usadas para la hibridación con el ADN genómico o el ADNc del género o especie de interés, según procedimientos estándares de Southern blotting, para identificar y aislar el gen correspondiente en los mismos. Las sondas de este tipo pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían tener al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. Sondas más largas pueden también ser usadas. Ambas sondas de ADN y ARN pueden ser usadas. Las sondas son normalmente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P; ^{3}H; ^{35}S, biotina, o avidina). Las sondas de este tipo están incluidas en la presente invención.

Así, un ADN genómico o genoteca de ADNc obtenidos a partir de estos otros organismos pueden ser seleccionados para el ADN que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido con actividad proteasa. El ADN genómico u otro ADN de estos otros organismos pueden ser separados por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado pueden ser transferidos a e inmovilizados en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon homólogo o ADN homólogo, se usa la materia portadora en un Southern blot. Para los fines de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos se hibrida con una sonda de ácidos nucleicos marcada correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada, su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia de muy baja a muy alta. Las moléculas con las que la sonda de ácidos nucleicos se hibrida bajo estas condiciones pueden ser detectadas usando una película de rayos X.

En una forma de realización particular, la sonda de ácidos nucleicos consiste en los nucleótidos 726-1283 de SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1. En otra forma de realización, la sonda de ácidos nucleicos consiste en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica las secuencias de aminoácidos correspondiente a cualquier secuencia o a las secuencias de nucleótidos enumeradas en la frase anterior.

En otra forma de realización preferida, la sonda de ácidos nucleicos consiste en la secuencia de ácidos nucleicos, o preferiblemente la región de codificación del polipéptido maduro de la misma, que está contenida en el plásmido que está contenido en Escherichia coli DSM 15509, donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido con actividad proteasa.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia de muy baja a muy alta se define como la prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE; SDS (0,3%); 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y sea el 25% de formamida para astringencia muy baja y baja; 35% de formamida para astrigencia media y media-alta, o el 50% de formamida para astringencia alta y muy alta, según los procedimientos estándares de Southern blotting.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2 X SSC; SDS (0,2%) preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta), y más preferiblemente al menos a 70ºC (astringencia muy alta).

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridación, hibridación, y lavado post-hibridación a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962; Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 48:1390) en 0,9 M de NaCI; 0,09 M de Tris-HCl pH 7.6, 6 mM de EDTA; NP-40 (0,5%), 1X Solución de Denhardt; 1 mM de pirofosfato de sodio; 1 mM de fosfato monobásico de sodio; 0,1 mM de ATP, y 0,2 mg de ARN de levadura por ml según procedimientos estándares de Southern blotting.

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador es lavado una vez en 6X SSC más SDS (0,1%) durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos usando 6X SSC a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada.

La presente invención también se refiere a variantes del polipéptido definido en la reivindicación 1 que tiene los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID No: 14; y/o los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2 pero que comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de las variantes definidas en la reivindicación 1 pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186; -170 a 186; o -189 a 186 de la SEC ID NO: 14; o de las partes correspondientes de cualquiera de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2; por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza inferior, es decir son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga de la red u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparraguina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, AlaNal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly al igual que a la inversa.

En una forma de realización particular, los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención son ácido estables. Para los presentes fines, el término ácido estable significa que la actividad residual después de 2 horas de incubación a pH 3.0 y 37ºC, es al menos del 20%, en comparación con la actividad residual de una muestra correspondiente incubada durante 2 horas a pH 9.0 y 5ºC. En una forma de realización particular, la actividad residual es al menos del 22%; 24%; 25% o al menos del 26%. De forma alternativa, la definición estabilidad del ácido se refiere a una actividad residual de al menos el 50%, o el 60%, o el 70% cuando se mide a pH 3.5 y 37ºC, en comparación con la actividad residual de una muestra correspondiente incubada durante 2 horas a pH 9.0 y 5ºC. Un ensayo adecuado para determinar la estabilidad del ácido se describe en el Ejemplo 2C de WO 01/58276.

En otra forma de realización particular, los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención tienen una actividad relativa a pH 7.0 de al menos 0,2, 0,3, 0,4; o al menos 0,5. La prueba del perfil de pH del Ejemplo 2B de WO 01/58276 es un ensayo adecuado.

El polipéptido de la invención y para el uso según la invención puede ser un polipéptido bacteriano o fúngico. El polipéptido fúngico puede ser derivado de un hongo filamentoso o de una levadura.

En formas de realización particulares, el polipéptido de la invención es i) una proteasa fúngica; II) una proteasa derivada del tipo Ascomycota; iii) el subtipo Pezizomycotina; iv) la clase Sordariomycetes; v) la clase Sordariales; vi) la familia Annulatascaceae; vii) el género Ascotaiwania y/o Brachysporiella (Brachysporiella siendo el estado anamórfico (asexual) de este hongo, y Ascotaiwania siendo el estado teleomórfico o sexual); y/o viii) una proteasa derivada de una cepa de Ascotaiwania y/o Brachysporiella, por ejemplo Ascotaiwania mitriformis, Ascotaiwania sawada, Brachysporiella gayana, y Brachysporiella sp., por ejemplo Brachysporiella gayana CGMCC 0865, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186;-170 a 186, o -189 a 186 de la SEC ID NO: 14.

Será entendido que para las especies mencionadas, la invención incluye los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, a pesar del nombre de la especie por el cual se conocen. Los expertos en la materia fácilmente reconocen la identidad de los equivalentes apropiados.

La taxonomía anterior se establece principalmente según Ranghoo, V.M., Goh, T.K. & Hyde, K.D. 1999. New observations on Monotosporella rhizoidea. Mycosciences 40: 377-382; y Sivichai, S., Hywel-Jones, N. & J. E.B.G. 1998, Liginicolous freshwater Ascomycota from Thailand: I. Ascotaiwania sawada and its anamorph state Monotosporella. Mycosciense 39: 307-311.

En otra forma de realización particular, el polipéptido de la invención es i) una proteasa bacteriana; ii) una proteasa derivada del filo Actinobacteria; iii) la clase Actinobacteria; iv) el orden Actinomicetales, v) la familia Nocardiopsaceae; vi) el género Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) especies de Nocardiopsis tales como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, o Nocardiopsis dassonvillei, por ejemplo:

: Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, tal como la Proteasa 18, un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -166 a 188, de la SEC ID NO: 12;

: Nocardiopsis alba DSM 15647, tal como una proteasa 08, un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -167 a 188, de la SEC ID NO: 10;

: Las 2 proteasas siguientes no forman parte de la invención: Nocardiopsis prasina DSM 15649, tal como la Proteasa 35, un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -165 a 188, de la SEC ID NO: 8;

: Nocardiopsis prasina DSM 15648, tal como la Proteasa 11, un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -165 a 188, de la SEC ID NO: 6.

: Las Proteasas 18 y 08, con la proteasa de Brachysporiella gayana CGMCC 0865, la proteasa de Brachysporiella, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186;-170 a 186, o -189 a 186 de la SEC ID NO: 14, forman una forma de realización particular de la invención. Un subgrupo que consiste en la proteasa de Brachysporiella y la Proteasa 18 es otra forma de realización particular de la invención.

La taxonomía anterior se establece según el capítulo: The road map to the Manual por G.M. Garrity & J. G. Holt en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology; 2001; segunda edición, volumen 1; David R. Bone, Richard W. Castenholz. Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles para el público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes incluyendo los microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, composts, agua, etc.) usando las sondas mencionadas arriba. Las técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidos en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos puede luego ser derivada por la selección de forma similar de un ADN genómico o genoteca de ADNc de otro microorganismo. Una vez que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la secuencia puede ser aislada o clonada utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la materia (ver, p. ej., Sambrook et al.; 1989; supra).

Una selección de proteasas que están inafectadas, o están relativamente inafectadas, por el cobre puede ser realizada incorporando los niveles deseados de Cu^{2+} y/o Cu^{+} en los medios de selección apropiados y seleccionando los productores de proteasas más potentes. La expresión "potente" por supuesto se refiere a la actividad proteasa, que puede ser estimada usando cualquier procedimiento de selección de proteasas adecuado, p. ej. basado en el tamaño de las zonas de aclarado en los medios sólidos que contienen leche desnatada. Ejemplos de niveles deseados de cobre son hasta 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500; o hasta 10000 ppm de Cu. El contenido de Cu debería ser al menos 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 ppm. La expresión ppm significa partes por millon (p/p), p. ej. mg/kg, y puede ser convertida a concentraciones molares de Cu usando su peso atómico (aprox. 63,5), como es conocido en la técnica, p. ej. 1 mM de Cu corresponde a 63,5 ppm de Cu.

En una forma de realización particular, la proteasa de la invención es aislada y/o purificada. Tal y como se define aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos, p. ej., al menos tiene aproximadamente el 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 60% de pureza, incluso más preferiblemente aproximadamente el 80% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 90% de pureza, e incluso más preferiblemente aproximadamente el 95% de pureza, como está determinado por SDS-PAGE.

Los polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido es fusionado en el N-término o el C- término del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido fusionando una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen la ligación de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en marcos y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del mismo promotor(es) y terminador.

En formas de realización particulares, el polipéptido de la invención no incluye (es decir, excluye): a) aminoácidos -186 a 188; -167 a 188; o 1-188 de la SEC ID NO: 4; b) los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2; c) la proteasa de Nocardiopsis Dassonvillei NRRL 18133 que está descrita en WO 88/03947, preferiblemente que tiene un peso molecular (PM) por SDS-PAGE de 20.500 dalton, y puntos isoeléctricos, pl, de 9,15 y 8,2; d) la proteasa de nocardiopsis sp. que está descrita en JP 2255081 A, preferiblemente que tiene un PM por SDS electroforesis de 21.000 Da y un pH óptimo de 10-12; y/o e) la proteasa derivada de la cepa ZIMET 43647 de la especie Nocardiopsis dassonvillei descrita por la patente de la RDA no. DD 2,004,328.

Secuencias de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención. Las secuencias de ácidos nucleicos particulares de la invención son los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9. Otra secuencia de ácidos nucleicos particular de la invención es la secuencia, preferiblemente la región de codificación del polipéptido maduro de la misma, que está contenida en el plásmido que está contenido en el microorganismo depositado Escherichia coli DSM 15509. La presente invención también incluye las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14, y/o los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12 o 10, que difieren de las secuencias de nucleótidos correspondientes en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de las secuencias de nucleótidos anteriores que codifican fragmentos de las secuencias de aminoácidos anteriores que tienen actividad proteasa.

En una subsecuencia uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' han sido delecionados. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 150, 190 o al menos 225 nucleótidos, más preferiblemente al menos 300 nucleótidos, incluso más preferiblemente al menos 375, 450, 500, 531, 600, 700, 800, 900, 1000; 0 1100 nucleótidos.

La presente invención también se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican proteasas tal y como se define en la reivindicación 1 que son más estables en presencia de cobre y/o menos inhibidas por cobre, que tienen un grado de identidad de al menos el 40% a los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, a los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, a los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, a los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, a los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, a los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o a los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1. En formas de realización particulares, el grado de identidad es al menos 42%; 45%; 47%; 50%; 52%; 55%; 57%; 60%; 62%; 64%; 65%; 67%; 70%; 72%; 75, 77%; 80%; 82%; 85%; 87%; 90%; 92%; 95%, o al menos 97%.

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos mutantes que comprenden al menos una mutación en cualquiera de las secuencias de nucleótidos anterior, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste en cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes, o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i).

Las técnicas usadas para aislar o donar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, la preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La donación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención de ADN genómico de este tipo puede ser efectuada, p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o la selección de anticuerpos de genotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN donados con características estructurales compartidas. Ver, p. ej., Innis et al.; 1990; PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) pueden ser usados. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser donada de una cepa de Brachysporiella (Ascotaiwania), o una cepa de Nocardiopsis, o de otros organismos u organismos relacionados y así, por ejemplo, pueden ser una variante alélica o de la especie de las regiones de codificación del polipéptido de las secuencias de ácidos nucleicos.

El término "secuencia de ácidos nucleicos aislada" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., al menos tiene aproximadamente el 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente al menos aproximadamente el 60% de pureza, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 80% de pureza, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de pureza según está determinado por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada puede ser obtenida por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos desde su ubicación natural hasta un sitio diferente en el que será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento del ácido nucleico deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula del vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

La modificación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similar al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido que no se producen de forma natural. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna forma creada genéticamente a partir del polipéptido aislado de su fuente nativa, p. ej., las variantes que difieren en la actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, alergenicidad, o similares. La secuencia de la variante puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte codificante del polipéptido de la SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13; p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones del nucleótido que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, sino que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la proteasa, o por la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Los polipéptidos poco alergénicos pueden ser preparados p. ej. según el modo descrito anteriormente.

Será evidente para los expertos en la técnica que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y además darán como resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la invención, y en consecuencia preferiblemente no sometida a la sustitución, pueden ser identificados según los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis sito dirigida o la mutagénesis de barrido de alanina (ver p. ej., Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, se introducen mutaciones en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas para la actividad proteasa para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de sustrato-proteasa pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según está determinado por técnicas tales como el análisis de resonancia magnética nuclear, la cristalografía o el marcado por fotoafinidad (ver, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904 ; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido tal y como se define en la reivindicación 1 de la presente invención, que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia preferiblemente baja, más preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia media-alta, incluso más preferiblemente condiciones de astringencia alta, y más preferiblemente condiciones de astringencia muy alta con una sonda de ácidos nucleicos que se hibrida bajo las mismas condiciones con los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13; los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11; los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9; los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7; los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5; los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3; y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1; o sus cadenas complementarias; o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al.; 1989; supra), tal y como se define en la presente.

También se describen las secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas mediante (a) hibridación de un ADN bajo condiciones de astringencia muy baja, baja, media, media-alta, alta, o muy alta con (i) los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1; (ii) una subsecuencia de (i), o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucleicos. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica un fragmento del polipéptido con actividad proteasa.

En formas de realización particulares, la secuencia de ácidos nucleicos de la invención no incluye (es decir, excluye): a) los nucleótidos 1-1122 y/o 559-1122 de la SEC ID NO: 3; y/o b) los nucleótidos 1-1596 y/o 900-1466 de la SEC ID NO: 1.

Métodos para producir secuencias de ácidos nucleicos mutantes

La presente invención también se refiere a métodos para producir una secuencia de ácidos nucleicos mutante, comprendiendo la introducción de al menos una mutación en la secuencia que codifica el polipéptido maduro de los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466, de la SEC ID NO: 1, o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos correspondientes; o fragmentos de los mismos con actividad proteasa.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis sitio dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Particularmente útil es el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. Al incorporar los cebadores, un plásmido mutado que contiene cortes en bisel es generado. Después de la variación de la temperatura, el producto es tratado con DpnI que es específico para ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar el ADN sintetizado conteniendo la mutación. Otros procedimientos conocidos pueden también ser usados en la técnica.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que la expresión incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a la transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

"Constructo de ácidos nucleicos" se define aquí como una molécula de ácidos nucleicos, bien mono- o bicatenaria, que está aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para que contenga segmentos de ácidos nucleicos combinados y yuxtapuestos en cierta manera que de lo contrario no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención. El término "secuencia de codificación" se define aquí como una secuencia de ácidos nucleicos que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. Los bordes de la secuencia de codificación están generalmente determinados por un centro de unión al ribosoma (procariotas) o por el codón de iniciación ATG (eucariotas) localizado justo hacia encima del marco de lectura abierto en el extremo 5' dei ARNm y una secuencia terminadora de la transcripción localizada justo debajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada de varias maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica.

El término "secuencias de control" se define aquí por incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o externa a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Las secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, de poliadenilación, secuencia de propéptidos, promotora, secuencia de péptido señal, y terminadora de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas de enlazadores para la introducción de sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido. El término "enlazado operativamente" se define aquí como una configuración donde una secuencia de control es apropiadamente colocada en una posición con respecto a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirige la expresión de un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotora puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo, promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de los genes que codifican los polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son los promotores obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa amilasa ácido estable de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus nidulans, y la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), al igual que el promotor NA2-Tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y los promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

En un huésped de levadura, los promotores útiles son obtenidos de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, la alcohol deshidrogenasa/gliceraldeh ido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y la 3-fosfoglicerato-quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Romanos et al.; 1992; Yeast 8: 423-488.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de lactamasa (penP) de Bacillus licheniformis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 80: 21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American; 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al.; 1989;
supra.

La secuencia de control puede también ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención.

Los terminadores preferidos para las células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

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Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al.; 1992; supra.

Los terminadores preferidos para las células huéspedes bacterianas, tales como una célula huésped de Bacillus, son los terminadores del gen de la alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, o el gen de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens.

La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder es operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Los líderes preferidos para las células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Los líderes adecuados para las células huéspedes de levadura se obtienen de los genes para la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, la 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y la alcohol deshidrogenase/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y que, al ser transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, y la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.

Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman; 1995; Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control puede también ser una región del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos puede intrínsecamente contener una región de codificación del péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido señal que es externa a la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido señal externa puede ser requerida donde la secuencia de codificación naturalmente no contiene una región de codificación del péptido señal. De forma alternativa, la región de codificación del péptido señal externa puede simplemente reemplazar la región de codificación del péptido señal natural para aumentar la secreción del polipéptido. No obstante, cualquier región de codificación del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.

Las regiones de codificación del péptido señal eficaces para las células huéspedes bacterianas son las regiones de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, la subtilisina de Bacillus licheniformis, la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, las proteasas (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señales están descritos por Simonen y Palva; 1993; Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las regiones de codificación del péptido señal eficaces para las células huéspedes filamentosas fúngicas son las regiones de codificación del péptido señal obtenidas de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la amilasa neutra de Aspergillus niger, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la celulasa de Humicola insolens, y la lipasa de Humicola lanuginosa.

Los péptidos señales útiles para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para el alfa factor de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones de codificación del péptido señal útiles están descritas por Romanos et al.; 1992; supra.

En una forma de realización preferida, la región de codificación del péptido señal es seleccionada de las regiones de codificación del péptido señal de la SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13.

La secuencia de control puede también ser una región de codificación del propéptido que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido en un polipéptido maduro activo por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido del propolipéptido. La región de codificación del propéptido puede ser obtenida, p. ej., a partir de los genes para la proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, la proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

En una forma de realización preferida, la región de codificación del propéptido está seleccionada de las regiones de codificación del propéptido de la SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13.

Cuando tanto las regiones del péptido señal como del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las distintas secuencias de ácidos nucleicos y de control anteriormente descritas pueden ser unidas entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido en estos sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser expresada mediante la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos o de un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación está localizada en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser sometido de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante y que puede provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique junto con el (los) cromosoma(s) en el(los) que se haya integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis. Los marcadores adecuados para las células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica incluyen, pero no se limitan a, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), al igual que los equivalentes de los mismos. Para el uso en una célula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) una integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped en un(os) lugar(es) preciso(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1.500 pares de bases, y más preferiblemente 800 a 1.500 pares de bases, que sean altamente homólogos a la secuencia meta correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia meta en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos no codificantes o codificantes. En cambio, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAM\beta1 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CENE. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que provoque que su temperatura de funcionamiento sea sensible en la célula huésped (ver, p. ej., Ehrlich; 1978; Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 1433).

Más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Un aumento en el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos puede ser obtenido mediante la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácidos nucleicos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto las copias adicionales de la secuencia de ácidos nucleicos, pueden ser seleccionadas mediante el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por un experto en la materia (ver, p. ej., Sambrook et al.; 1989; supra).

La proteasa puede también ser coexpresada junto con al menos otra enzima de interés para piensos para animales, tal como la fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); la xilanasa (EC 3.2.1.8); la galactanasa (EC 3.2.1.89); la alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); la proteasa (EC 3.4.-.), la fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); la fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); la lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); la fosfolipasa C (3.1.4.3); la fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); y/o la beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

Las enzimas pueden ser coexpresadas a partir de distintos vectores, a partir de un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes, y orígenes diferentes de replicación. Cuando se usa sólo un vector, los genes pueden ser expresados a partir de uno o más promotores. Si se clonan bajo la regulación de un promotor (di- o multicistrónico), el orden en que los genes son clonados puede afectar a los niveles de expresión de las proteínas. La proteasa puede también ser expresada como una proteína de fusión, es decir que el gen que codifica la proteasa ha sido fusionado en el marco con el gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huéspedes

La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, que son ventajosamente usadas en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" comprende cualquier progenie de una célula madre que sea idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped en gran parte dependerá del gen que codifica el polipéptido y de su fuente.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota.

Las células unicelulares son células bacterianas tales como bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan, a la célula de Bacillus, o a una célula de Streptomyces, o a células de bacterias del ácido lático; o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. Las bacterias del ácido lático incluyen, pero no se limitan a, especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, y Enterococcus.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por la transformación del protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen; 1979; Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson; 1971; Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula animal no humana, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula fúngica.

En una forma de realización particular, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (tal y como se define por Hawksworth et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi; 8ª edición; 1995; CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) al igual que el Oomycota (como se cita en Hawkswort et al.; 1995; supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al.; 1995; supra).

En otra forma de realización particular, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye la levadura ascosporogénea (Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura perteneciente a los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series nº. 9,
1980).

La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

La célula huésped fúngica puede ser una célula micótica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (tal y como se define por Hawksworth et al.; 1995; supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por el hecho de que una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por el injerto de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

Ejemplos de células huéspedes filamentosas fúngicas son células de especies de, pero no limitadas a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavía, Tolypocladium, o Trichoderma.

Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y en Yelton et al.; 1984; Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 81: 1470-1474. Unos métodos adecuados para transformar especies de Fusarium están descritos por Malardier et al.; 1989; Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I, editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; lto et al.; 1983; Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al.; 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 1920.

Métodos de producción

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una cepa, que en su forma tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido. Preferiblemente, la cepa es del género Brachysporiella, tal como Brachysporiella gayana o del género Nocardiopsis, tal como Nocardiopsis dassonvillei o ocardiopsis alba. Muchas cepas de tipo salvaje preferidas son: Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis alba DSM 15647, Nocardiopsis prasina DSM 15649, Nocardiopsis prasina DSM 15648, y Brachysporiella gayana CGMCC 0865.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención tal y como se define en la reivindicación 1 comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante comprendiendo al menos una mutación en los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica los polipéptidos correspondientes que (i) consisten en los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14, o los aminoácidos 1-188 de cualquiera de las SEC ID Nos: 12 o 10, o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante tal y como se define en la reivindicación 1 comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica tal y como se define en la reivindicación 1 de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento tal y como se define en la reivindicación 1 de cualquiera de las secuencias de (i).

En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frascos de agitación, fermentación a pequeña o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en flujo discontinuo, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y de carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, este puede ser recuperado de los lisatos celulares.

Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto, o la desaparición de un sustrato. Por ejemplo, un ensayo de proteasa puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido como se describe en este caso.

El polipéptido resultante puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p. ej., por intercambio iónico, por afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfoque, y por exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York; 1989).

Plantas

La presente invención también se refiere a una planta transgénica, a parte de la planta, o a la célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades reivindicables. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o de parte de la planta. De forma alternativa, la planta o la parte de la planta conteniendo el polipéptido recombinante puede ser usada como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, p. ej., mejorando el valor nutritivo, apetencia, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

En una forma de realización particular, el polipéptido está dirigido a las vacuolas de almacenamiento del endosperma en las semillas. Esto puede ser obtenido mediante la sintetización como un precursor con un péptido señal adecuado, ver Horvath et al en PNAS, Feb. 15, 2000; vol. 97; nº. 4; p. 1914-1919.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (dicot) o monocotiledónea (monocot) o variantes creadas genéticamente a partir de las mismas. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa pratense (poa común, Poa), hierba de forraje tal como Festuca, Lolium, hierba templada, tal como Agrostis, y cereales, p. ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (mazorca). Ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, leguminosas, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (de la familia Brassicaceae), tales como la coliflor, la semilla de colza, y el organismo modelo muy relacionado Arabidopsis thaliana. La plantas bajas en fitato como se describe p. ej. en la patente estadounidense nº. 5,689,054 y en la patente estadounidense nº. 6,111,168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente.

Ejemplos de partes de plantas son el tallo, el callo, las hojas, la raíz, los frutos, las semillas, y los tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, p. ej. la epidermis, el mesófilo, la parénquima, los tejidos vasculares, los meristemas. Asímismo los compartimentos celulares vegetales específicos, tales como el cloroplasto, el apoplasto, la mitocondria, la vacuola, los peroxisomas, y el citoplasma están considerados como una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, sea cual sea el origen del tejido, está considerada como una parte de la planta. Asimismo, las partes de la planta tales como los tejidos específicos y las células aisladas para facilitar la utilización de la invención están también consideradas partes de la planta, p. ej. embriones, endospermas, aleurona y epispermas.

También se incluye dentro del campo de la presente invención la progenie de tales plantas, las partes de la planta y las células vegetales.

La planta transgénica o la célula vegetal que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida conforme a los métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propagando la planta modificada o la célula vegetal resultante en una planta transgénica o célula
vegetal.

Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado con las secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células huéspedes en las que el constructo de expresión ha sido integrado y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto dependerá del método de introducción de ADN que se utilice).

La elección de las secuencias reguladoras, tales como las secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las secuencias señal o de tránsito son determinadas, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde, y cómo se desea que el polipéptido sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, fase o tejido específica, y el producto genético puede dirigirse a un tejido específico o parte de la planta tal como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras están, por ejemplo, descritas por Tague et al.; 1988; Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva, se puede usar lo siguiente: se puede usar el promotor 35S-CaMV (Franck et al.; 1980; Cell 21: 285-294), la ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity folloing transfer to portoplasts by electroporation), o el promotor de la actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Los promotores órgano-específicos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como las semillas, los tubérculos de la patata, y los frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como los meristemas (Ito et al.; 1994; Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico para semillas tal como el promotor de la glutelina, la prolamina, la globulina, o la albúmina del arroz (Wu et al.; 1998; Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen desconocido de la proteína de la semilla de Vicia faba (Conrad et al.; 1998; Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo del aceite de semilla (Chen et al.; 1998; Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico para semillas conocido en la técnica, p. ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico para las hojas tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kiozuka et al.; 1993; Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor de gen de la adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins; 1994; Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor aldP del gen del arroz (Kagaya et al.; 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por daño tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al.; 1993; Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como la temperatura, la sequía o alteraciones en la salinidad o inducible por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, p. ej. el etanol, los
estrógenos, las hormonas vegetales como el etileno, el ácido abscísico, el ácido giberélico, y/o los metales pesados.

Un elemento potenciador del promotor puede también ser usado para conseguir una mayor expresión de la proteasa en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor, y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al.; 1993; supra, revelan el uso del primer intrón del gen de la actina 1 del arroz para potenciar la expresión.

Aún incluso, el uso del codón puede ser optimizado para las especies vegetales en cuestión para mejorar la expresión (ver Horvath et al a quienes se ha hecho referencia antes).

El gen marcador seleccionable y otras partes cualquiera del constructo de expresión pueden ser elegidos a partir de aquellos disponibles en la técnica.

El constructo de ácidos nucleicos es incorporado en el genoma vegetal, según las técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada por virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística, y la electroporación (Gasser et al.; 1990; Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Actualmente, la transferencia genética mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), y se puede usar también para transformar monocotiledóneas, aunque generalmente se prefieren otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método elegido para generar monocotiledóneas transgénicas, suplementando el enfoque del Agrobacterium, es el bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno revestidas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou; 1992; Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo de transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación del protoplasto como se describe por Omirulleh et al.; 1993; Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que han incorporado en su interior el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad proteasa de la presente invención bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Animales

La presente invención también se refiere a un animal transgénico no humano y a productos o elementos del mismo, cuyos ejemplos son los líquidos biológicos tales como la leche y la sangre, los órganos, la carne, y las células animales. Las técnicas de expresión de proteínas, p. ej. en células mamíferas, son conocidas en la técnica, ver p. ej. el manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins y Hames (eds), Oxford University Press (1999), y otros tres manuales en esta serie sobre la transcripción genética, la maduración del ARN, y el tratamiento postraduccional. En términos generales, para preparar un animal transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado son transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido. El polipéptido puede ser recuperado del animal, p. ej. de la leche de animales hembra, o el polipéptido puede ser expresado para el beneficio del propio animal, p. ej. para ayudar a la digestión del animal. Ejemplos de animales están mencionados a continuación en la sección titulada.

Piensos para animales

Para producir un animal transgénico con el propósito de recuperar la proteasa de la leche del animal, un gen que codifica la proteasa puede ser insertado en los ovarios fertilizados del animal en cuestión, p. ej. usando un vector de expresión transgénica que comprende un promotor de proteínas de la leche adecuado, y el gen que codifica la proteasa. El vector de expresión transgénica es microinyectado en los ovarios fertilizados, y preferiblemente integrado de forma permanente en el cromosoma. Un vez que el ovario empieza a crecer y a dividirse, el embrión potencial es implantado en una madre portadora, y los animales portadores del transgen son identificados. El animal resultante puede después multiplicarse por reproducción convencional. El polipéptido puede ser purificado de la leche del animal, ver p. ej. Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez y J. P. Hoeffler, (eds.), Academic
Press.

De forma alternativa, para producir un animal transgénico no humano que lleva en el genoma de sus células somáticas y/o germinales una secuencia de ácidos nucleicos que incluye un constructo transgénico heterólogo que incluye un transgén que codifica la proteasa, el transgén puede ser operativamente enlazado a una primera secuencia reguladora para la expresión específica en la glándula salival de la proteasa, como se describe en WO 2000064247.

Composiciones

En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención.

Las composiciones del polipéptido pueden ser preparadas conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipéptido que debe ser incluido en la composición puede ser estabilizado conforme a los métodos conocidos en la técnica.

Más abajo se dan ejemplos de usos preferidos de los polipéptidos o composiciones de los polipéptidos de la invención.

Piensos para animales

La presente invención está también dirigida a los métodos para usar la proteasa de la invención en piensos para animales, así como a las composiciones de los piensos y a los aditivos de los piensos que comprenden estos polipéptidos.

El término animal incluye todos los animales, incluídos los seres humanos. Ejemplos de animales son los no rumiantes, y los rumiantes, tales como las ovejas, cabras, caballos, y ganado vacuno, p. ej. el ganado vacuno para carne, vacas, y terneros jóvenes. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p. ej. cerdos o puercos (que incluyen, pero no se limitan a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollos (que inclyen pero no se limitan a pollos para asar, gallinas ponedoras); terneros jóvenes; y peces (que incluyen pero no se limitan a salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas); y crustáceos (que incluyen pero no se limitan a camarones y gambas).

El término pienso o composición para piensos se refiere a cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada a la ingesta por un animal.

En el uso según la invención la proteasa puede ser suministrada al animal antes, después de, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

En una forma de realización particular, la proteasa, en la forma en que es añadida al pienso, o cuando se incluye en un aditivo para piensos, está bien definida. Bien definido significa que la preparación de proteasa tiene al menos un 50% de pureza, como está determinado por la cromatografía por exclusión de tamaños (ver ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares la preparación de proteasa tiene al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94; o al menos un 95% de pureza según está determinado por este método.

Una preparación de proteasa bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el pienso una proteasa que no pueda interferir o contaminar esencialmente a otras proteasas. El término dosis se refiere correctamente en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y a la capacidad de optimizar la dosificación en base al efecto deseado.

Para el uso en piensos, no obstante, la proteasa no necesita tener esta pureza; puede p. ej. incluir otras enzimas, en cuyo caso podría ser denominada preparación de proteasa.

La preparación de proteasa puede ser (a) añadida directamente al pienso (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas vegetales), o (b) puede ser usada en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos para piensos o premezclas que son posteriormente añadidas al pienso (o usadas en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de proteasa original, si se utiliza de acuerdo con (a) o (b) más arriba.

Las preparaciones de proteasa con purezas de este orden de magnitud pueden ser obtenidas particularmente usando métodos de producción recombinantes, mientras que éstas no se obtienen tan fácilmente y también son sometidas a una variación entre lotes mucho más alta que cuando la proteasa es producida por los métodos de fermentación tradicionales.

Una preparación de proteasa de este tipo puede ser mezclada por supuesto con otras enzimas.

En una forma de realización particular, la proteasa para el uso según la invención es capaz de solubilizar proteínas vegetales. Un ensayo adecuado para determinar la proteína solubilizada se describe en el Ejemplo 4 de WO 01/58276.

El término proteínas vegetales según se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada a partir de un vegetal, incluyendo las proteínas modificadas y los derivados de proteínas. En formas de realización particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es al menos del 10, 20, 30, 40, 50; o 60% (p/p).

Las proteínas vegetales pueden derivar de fuentes de proteínas vegetales, tales como las leguminosas y los cereales, por ejemplo materiales vegetales de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tales como la harina de soja, la harina de altramuz y la harina de colza.

En una forma de realización particular, la fuente de la proteína vegetal es el material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p. ej. la semilla de soja, altramuz, guisante, o judía.

En otra forma de realización particular, la fuente de la proteína vegetal es el material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, p. ej. la remolacha, la remolacha azucarera, la espinaca o la quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son la semilla de colza, y el repollo.

La semilla de soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son los cereales tales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena, el maíz (mazorca), el arroz, y el sorgo.

El tratamiento de proteínas vegetales según la invención con al menos una proteasa de la invención resulta en una solubilización aumentada de proteínas de vegetales.

El término solubilización de proteínas básicamente significa poner la(s) proteína(s) en solución. Tal solubilización puede ser debida a la liberación mediada por proteasa de la proteína de otros componentes de las composiciones naturales normalmente complejas tales como los piensos. La solubilización puede ser medida como un aumento en la cantidad de proteínas solubles, por referencia a una muestra en blanco sin tratamiento de proteasa.

En una forma de realización particular de un (pre-) proceso de tratamiento según la invención, la(s) proteasa(s) en cuestión está(n) afectando (o actuando en, o ejercitando su influencia de solubilización sobre) las proteínas vegetales o fuentes proteicas. Para conseguirlo, la proteína vegetal o fuente proteica es normalmente suspendida en un solvente, p. ej. un solvente acuoso tal como agua, y los valores de pH y de temperatura son ajustados teniendo en debida consideración las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a un valor de pH en el que la actividad de la proteasa real es al menos Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a una temperatura en la que la actividad proteasa real es al menos el 40%; 50%; 60%; 70%; 80% o al menos el 90%. Las indicaciones de los porcentajes de actividad anteriores son relativas a las actividades máximas. La reacción enzimática es continuada hasta conseguir el resultado deseado, tras lo cual puede o no puede ser detenida inactivando la enzima, p. ej. mediante una fase de tratamiento con calor.

En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento según la invención, la acción de la proteasa es mantenida, lo que significa p. ej. que la proteasa se añade a las proteínas vegetales o fuentes proteicas, pero su influencia de solubilización es como si no fuera accionada hasta el momento posterior deseado, una vez que las condiciones de solubilización deseadas sean establecidas, o una vez que los inhibidores enzimáticos sean inactivados, o que cualquier otro medio sea aplicado para retrasar la acción enzimática.

En una forma de realización, el tratamiento es un pretratamiento de piensos para animales o de proteínas vegetales para el uso en piensos.

La expresión mejorando el valor nutritivo de un pienso significa mejorando la disponibilidad de las proteínas, de ese modo conduciendo a una extracción de proteínas aumentada, mayores rendimientos de las proteínas, y/o utilización mejorada de las proteínas. El valor nutritivo del pienso es en consecuencia aumentado, y el índice de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión del pienso (es decir el peso del pienso ingerido con respecto al aumento de peso) del animal es/son mejorado(s).

La proteasa puede ser añadida al pienso en cualquier forma, como una proteasa relativamente pura, o mezclada con otros componentes destinados a la adición en piensos para animales, es decir en forma de aditivos para piensos, tales como las denominadas premezclas para piensos.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en piensos para animales, tales como el pienso para animales, y los aditivos para piensos, p. ej. premezclas.

Aparte de la proteasa de la invención, los aditivos para piensos según la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un mineral traza. El aditivo para piensos puede también contener al menos un macromineral

Otros ingredientes de aditivos para piensos opcionales son agentes colorantes, compuestos aromatizantes, estabilizadores, péptidos antimicrobianos, incluyendo polipéptidos antifúngicos, y/o al menos otra enzima seleccionada entre la fitasa (EC 3.1.3.8 0 3.1.3.26); la xilanasa (EC 3.2.1.8); la galactanasa (EC 3.2.1.89); la alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); la proteasa (EC 3.4.-.-), la fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); la fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); la lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); la fosfolipasa C (3.1.4.3); la fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); y/o la beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

En una forma de realización particular estas otras enzimas están bien definidas (tal como se ha definido anteriormente para preparaciones de proteasa).

Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP's) son CAP18; Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1; Tanatina, defensina, lactoferrina, Lactoferricina, y Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer; 2000), Plectasinas, y estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que las variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (AFP's) son el Aspergillus giganteus, y péptidos de Aspergillus niger, al igual que las variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384. Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como el ácido araquidónico, el ácido docosohexaenoico, el ácido eicosapentaenoico y el ácido gamma-linoleico. Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

Las vitaminas liposolubles e hidrosolubles, al igual que los minerales traza forman parte de la denominada premezcla destinada a la adición al pienso, mientras que los macrominerales son normalmente añadidos por separado al pienso. Una premezcla enriquecida con una proteasa según la invención, es un ejemplo de un aditivo para piensos según la invención.

En una forma de realización particular, el aditivo para piensos según la invención está destinado a ser incluido (o está prescrito que se incluya) en las dietas o piensos para animales en niveles del 0,01 al 10,0%; más particularmente del 0,05 al 5,0%; o del 0,2 al 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así particularmente para las premezclas.

Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

: Ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, la vitamina D3, la vitamina E, y la vitamina K, p. ej. la vitamina K3.

: Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, p. ej. Ca-D-Pantotenato.

: Ejemplos de minerales traza son el manganeso, el zinc, el hierro, el cobre, la yodina, el selenio, y el cobalto.

: Ejemplos de macrominerales son el calcio, el fósforo y el sodio.

Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) están catalogados en la Tabla A de WO 01/58275. El requisito nutritivo significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

De forma alternativa, el aditivo para piensos según la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de WO 01/58275. En este contexto, al menos uno significa cualquiera de, uno o más de uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, al menos este único componente individual está incluido en el aditivo según la invención en una cantidad tal como para proporcionar una concentración en el pienso dentro de la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la Tabla A.

La definición anterior de "al menos uno", a propósito, es generalmente válida en toda esta solicitud de patente - por supuesto en una base por analogía, lo que significa que el límite superior de esta definición, en el ejemplo anterior quince, por supuesto debería reflejar el número máximo de opciones dadas en cada caso particular.

La presente invención también se refiere a composiciones para piensos. Las composiciones de piensos o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de proteínas. Las dietas para aves y cerdos pueden estar caracterizadas como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además estas dietas para peces normalmente tienen un contenido de grasa en bruto de 200-310 g/kg.

Una composición para piensos según la invención tiene un contenido de proteína en bruto de 50-800 g/kg, y además comprende al menos una proteasa como se reivindica en la presente invención.

Además, o de forma alternativa (al contenido de proteína en bruto indicado arriba), la composición para piensos de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, de proteína en bruto, de calcio, de fósforo, de metionina, de metionina más cisteína, y/o de lisina está dentro de cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

La proteína en bruto se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25; es decir proteína en bruto (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno está determinado por el método Kjeldahl (A.O.A.C.; 1984; Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

La energía metabolizable puede ser calculada en base a la publicación del NRC Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas para animales completas se calcula en base a tablas de piensos tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En una forma de realización particular, la composición para piensos según la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente proteica tal como se ha definido anteriormente.

En otras formas de realización particulares adicionales, la composición de piensos según la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-10% de harina de pescado y/o 0-20% de lactosuero.

Las dietas para animales pueden p. ej. ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Normalmente, los productos de piensos molidos son mezclados y se agregan las cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. Se pueden añadir enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación enzimática sólida es normalmente añadida antes o durante la fase de mezcla; y una preparación enzimática líquida es normalmente añadida después de la fase de granulación. La enzima puede también ser incorporada en un aditivo para piensos o premezcla.

La concentración enzimática final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 0,5-25, o 5-30, mg de proteína enzimática por kg de dieta de animal.

La proteasa debería ser aplicada por supuesto en una cantidad eficaz, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o para mejorar el valor nutritivo del pienso. Está actualmente contemplado que la enzima es administrada en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0,01-200, 0,01-100, 0,05-100, 0,5-100, 1-100, 5-100, 10-100, 0,05-50, 1-50; o 0,10-10 - todas estas gamas están proporcionadas en mg de proteína de enzima proteásica por kg de pienso (ppm).

Para determinar la cantidad de mg de proteína enzimática por kg de pienso, la proteasa es purificada de la composición del pienso, y la actividad específica de la proteasa purificada es determinada usando el ensayo pertinente (ver más abajo actividad proteasa, sustratos, y ensayos). La actividad proteasa de la composición del pienso como tal está también determinada usando el mismo ensayo, y en base a estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína enzimática por kg de pienso.

Los mismos principios son aplicables para determinar los mg de proteína enzimática en los aditivos del pienso. Por supuesto, si hay disponible una muestra de la proteasa usada para preparar el aditivo del pienso o el pienso, la actividad específica es determinada a partir de esta muestra (no hay necesidad de purificar la proteasa de la composición del pienso o del aditivo).

En una forma de realización particular, el aditivo para piensos según la invención es una premezcla. Una premezcla está normalmente destinada a la adición (inclusión) en el pienso. Un nivel típico de inclusión de la premezcla en el pienso es del 0,01-10,0%, más particularmente del 0,05-5,0%, o del 0,2-1.0%, normalmente del 0,5-1.0%. Como el nivel de inclusión de la premezcla en el pienso varía, tiene sentido describir tales premezclas con respecto a las concentraciones en el pienso previstas, o prescritas, de los distintos ingredientes.

La premezcla de la invención contiene una proteasa según la invención, y en adición al menos una vitamina liposoluble y/o hidrosoluble, y/o al menos un mineral traza.

En una forma de realización particular, la premezcla incluye, comprende o contiene el cobre del mineral traza, normalmente en forma de sales del ión cúprico o cuproso, es decir Cu^{2+} o Cu^{+}, respectivamente, en particular sales inorgánicas de los mismos. En formas de realización particulares de una premezcla según la invención, la premezcla contiene tal cantidad de cobre (Cu) como para proporcionar, al incluirse en el pienso en el nivel de inclusión prescrito, una concentración en el pienso ("concentración en el pienso") de 1-500 ppm de cobre (ppm significando, p. ej., mg/kg de pienso).

En formas de realización particulares adicionales, la concentración de cobre en el pienso es inferior o igual al 5, 10, 20, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300; o inferior o igual a 400 ppm. En cambio, la concentración de Cu en el pienso debería ser al menos 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1.0, 2,0, 3,0, 4,0; o al menos 5,0 ppm. Cualquier gama de concentraciones en el pienso usando cualquiera de los conjuntos indicados anteriormente y límites inferiores están específicamente incluidos en la presente. Ejemplos no limitativos de los mismos son 0,2-100, 0,4-100, 0,6-200, 0,8-100, 1-25, 1-50, 1- 100, 1-140, 1-150, 2-100, 3-100, 4-100, 5-100, 3- 200, 4-200, 5-200, 3-300, 4- 300 y 5-300 ppm de Cu.

La concentración de Cu en la premezcla como tal es por supuesto superior a la concentración prevista en el pienso, normalmente 100-200 veces la concentración en el pienso (en base a índices de inclusión del 1%, y 0,5%, respectivamente). En consecuencia, una premezcla puede contener, comprender o incluir Cu en concentraciones de hasta 100.000 ppm (200 veces un concentración en el pienso de 500 ppm), o incluso mayores. Los siguientes son ejemplos no limitativos de concentraciones máximas de Cu en la premezcla: 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 ppm de Cu. Los siguientes son ejemplos no limitativos de concentraciones mínimas de Cu en la premezcla: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900; o 2000 ppm de Cu. Cualquier gama de concentraciones en la premezcla usando cualquier conjunto de los límites superiores e inferiores arriba indicados están específicamente incluidos en la presente. Ejemplos no limitativos de los mismos son 100-100.000, 200-90.000, 300- 80.000, 400-70.000, 500-50.000, 100-10.000, 100-5.000; y 100-2000 ppm de Cu.

Los siguientes son ejemplos específicos de composiciones de la premezcla según la invención, todos ellos incluyen además una proteasa según la invención para proporcionar una concentración en el pienso de 1-50 mg/kg. Las concentraciones indicadas abajo de otros varios componentes distintos de la premezcla son también concentraciones en el pienso (por kg de pienso).

Premezcla para una dieta de lechón (pienso del compuesto completo): 135 ppm de Cu; 100 ppm de Zn; 90 ppm de Fe; 50 mg de Mn; 1.24 ppm de 1; 0,3 ppm de Se; 0,10 ppm de Co; 10000 IE/kg de vit. A; 2000 IE/kg vit. D3, 90 mg/kg de vit. E; 2,25 ppm de vit. B1, 3,75 ppm de vit. B2, 10,50 ppm de vit. B3, 7,5 ppm de vit. B6, 0,03 ppm de vit. B12, 0,75 ppm de vit. K; 0,06 ppm de vit. H; 0,9 ppm de ácido fólico; 16,5 ppm de niacina.

Premezcla para otra dieta de lechón: 14400 IE vit. A; 120000 IE vit. D3, 1440 mg de vit. E; 2,4 mg de vit. B1, 7,2 mg de vit. B2, 30 mg de niacina; 4,8 mg de vit. B6, 48 pg de vit. B12, 240 pg de biotina; 21.6 mg de ácido pantoténico; 600 mg de cloruro de colina; 120 mg de Zn; 90 mg de Fe; 90 mg de Mn; 24 mg de Cu; 1.8 mg 1, 0,84 mg de Co; 0,48 mg de Se; 600 mg de Mg.

Premezcla para una tercera dieta de lechón: 210 mg de Zn; 246 mg de Fe; 84 mg de Mn; 24 mg de Cu, y 4 mg de I.

Premezcla para una dieta de pollo para asar:: retinol; 4,05; colecalciferol; 0,05; tocoferol; 13,5; menadiona; 2,25; tiamina; 1; colina; 375; riboflavina; 5,4; ácido pantoténico; 13,5; piridoxina; 1.1; cianocobalamina; 0,01; ácido nicotónico; 40; biotina; 0,15; 1; 2,1; Co; 1.4; Se; 0,43; Cu; 7,2; Mn; 86; Zn; 57; Fe; 65; Mg; 110.

Las premezclas para otras dietas de pollos para asar contenían 8 o 10 mg de Cu/kg de dieta.

Composiciones de detergentes

La proteasa según la invención puede ser añadida a un componente de una composición de detergente y convertirse así en este mismo.

La composición de detergente según la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición de detergente para el lavado a mano o a máquina incluyendo una composición de aditivo de lavandería adecuada para el pretratamiento de tejidos teñidos y una composición de suavizante añadida al enjuague, o puede ser formulada como una composición de detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies domésticas duras en general, o puede ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la proteasa según la invención. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una u otras varias enzimas tales como una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, p. ej., una lacasa, y/o una peroxidasa.

En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) deberían estar presentes en cantidades eficaces.

Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente con proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces), p. ej. de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258068 y EP 305216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej. de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360 ), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son variantes de la lipasa tales como aquellas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Enzimas lipasas preferidas comercialmente disponibles incluyen Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (Novozymes A/S).

Las (alfa y/o beta) amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente con proteínas están incluidos. Las amilasas incluyen, por ejemplo, las alfa-amilasas obtenidas de Bacillus, p. ej. una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873; y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408; y 444. Las amilasas comercialmente disponibles son Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM} (Novozymes A/S), Rapidase^{TM} y Purastar^{TM} (de Genencor International Inc.).

Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente con proteínas están incluidos. Las celulasas adecuadas incluyen las celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej. las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495257, EP 531372, WO 96111262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de la celulasa tales como aquellas descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, 5,457,046, 5,686,593, 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 99/01544. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme^{TM}, y Carezyme^{TM} (Novozymes A/S), Clazinase^{TM}, y Puradax HA^{TM} (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)^{TM} (Kao Corporation).

Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente con proteínas están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C. cinereus, y variantes de las mismas como está descrito en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzyme^{TM} (Novozymes).

La(s) enzima(s) de detergente puede(n) ser incluida(s) en una composición de detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo de detergente según la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado p. ej. como un granulado, un líquido, una emulsión, etc. las formulaciones de aditivos de detergentes preferidas son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o emulsiones.

Los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como está descrito en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de óxido de polietíleno (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados con de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuadas para la aplicación por técnicas de lecho fluidificado están dados en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como el propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP 238216.

La composición de detergente según la invención puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta el 70% de agua y un 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.

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La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no fónicos incluso semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos están normalmente presentes a un nivel del 0,1% al 60% en peso.

Al incluirse en el mismo, el detergente normalmente contendrá de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40% de un agente tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfaolefinsulfonato, alquilsulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de alfa-sulfo ácido graso, ácido o jabón alquil o alquenilsuccínico.

Al incluirse en el mismo, el detergente normalmente contendrá aproximadamente del 0,2% a aproximadamente el 40% de un agente tensioactivo no iónico tal como etoxilato de alcohol, nonilfenol, etoxilato de alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxialquil amida de ácido graso, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").

El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).

El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, alcohol polivinílico, poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico.

El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal como perborato o percarbonato que puede ser combinada con un activador decolorante formador de perácidos tal como la tetraacetiletilenodiamina o el nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos de p. ej. tipo amida, imida, o sulfona.

La(s) enzima(s) según la composición de detergente de la invención puede ser estabilizada usando agentes convencionales estabilizantes, p. ej., un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.

El detergente puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como p. ej. acondicionadores del tejido incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de supensión de la suciedad, agentes de antirreposición de la suciedad, tintes, bactericidas, blanqueantes ópticos, hidrótropos, inhibidores de la decoloración, o perfumes.

Actualmente se contempla que en las composiciones de detergentes cualquier enzima, en particular la enzima según la invención, puede ser añadida en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.

La enzima según la invención puede adicionalmente ser incorporada en las formulaciones de detergentes descritas en WO 97/07202.

Depósito de material biológico

Los siguientes materiales biológicos han sido depositados según las condiciones del tratado de Budapest con el NRRL (Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center), el DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemania), y el CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Beijing 100080, China), respectivamente, y se les ha asignado los números de acceso siguientes:

101

La cepa Nocardiopsis dassonvillei subesp. dassonvillei DSM 43235 está disponible al público por el DSM. Esta cepa fue también depositada enm otras instituciones depositarias como sigue: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489. La cepa Nocardiopsis sp. NRRL 18262 fue depositada junto con la solicitud de otra solicitud de patente.

Las cepas han sido depositadas bajo condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos estará disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente para alguien determinado por el Comisario de Patentes y Marcas para que tenga derecho a ellas bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. Los depósitos representan cultivos substancialmente puros de las cepas depositadas. Los depósitos están disponibles según está requerido por las leyes de patentes extranjeras en los estados en los que se hayan depositado los equivalentes de la presente solicitud o su progenie. No obstante, debe ser entendido que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la presente invención al derogarse los derechos de la patente concedidos por la acción gubernamental.

La cepa CGMCC 0865 de Brachysporiella fue aislada de ramas muertas de una planta desconocida en China en Octubre de 1998. Las cepas Nocardiopsis prasina DSM 15648, Nocardiopsis prasina DSM 15649, y Nocardiopsis alba DSM 15647 fueron aisladas de muestras de tierra en Dinamarca en 2001.

La presente invención descrita y reivindicada no debe limitarse en su alcance a las formas de realización específicas descritas en la presente, puesto que estas formas de realización están previstas como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. Otras formas de realización cualquiera equivalentes están destinadas a estar comprendidas dentro del campo de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se volverán evidentes para los expertos en la técnica de la descripción precedente. Se prevé también que tales modificaciones estén incluidas dentro del campo de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, predominará la presente descripción, incluidas las definiciones.

Se han citado varias referencias en la presente, cuyas descripciones están incorporadas como referencia en su totalidad.

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Ejemplos Ejemplo 1 Proteasas

Las proteasas siguientes fueron purificadas usando métodos convencionales de fermentaciones de las cepas de tipo salvaje respectivas o células huéspedes recombinantes:

Proteasa 10 (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2), Proteasa 18 (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO:12), proteasa de Brachysporiella (los aminoácidos 1-186 de la SEC ID NO:14), proteasa de Metarhizium (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 4), Proteasa 08 (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 10), Proteasa 11 (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 6), y Proteasa 35 (los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 8).

La pureza por SDS-PAGE (ver Ejemplo 2) de las preparaciones de proteasa era superior al 95%, y la pureza de absorción (proporción A_{280}/A_{260}; ver Ejemplo 3) fue superior a 1.40.

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Ejemplo 2 Determinación de la pureza por SDS-PAGE

La pureza de las proteasas mencionadas en el ejemplo 1 fue determinada por SDS-PAGE usando el procedimiento siguiente:

Una solución de 40 ul (micro litros) de proteasa (concentración A_{280} = 0,025) fue mezclada con 40 ul 0,1 M de PMSF en un tubo de Eppendorf en hielo y dejada en el mismo durante media hora. Luego 20 ul de ATC (ácido tricloroacético) al 50% (p/v) fueron añadidos al tubo de Eppendorf. Después de otra media hora en hielo el tubo fue centrifugado (5 minutos; 0ºC; 14,000 x g) y el sobrenadante fue cuidadosamente eliminado. 20 ul de tampón de muestra de SDS-PAGE (200 ul de tampón de muestra tris-glicina SDS (2x) (125 mM de Tris/HCI, pH6.8, 4% (p/v) SDS; 50ppm de azul de bromofenol; 20% (v/v) glicerol, LC2676 de Invitrogen^{TM}) +160 ul de agua dest. + 20 ul de beta-mercaptoetanol + 20 ul de base Tris 3M no tamponada (Sigma T-1503) fueron añadidos al precipitado y el tubo fue hervido durante 3 minutos. El tubo fue centrifugado brevemente y 10 ul de muestra fueron aplicados a un gel prefundido de Tris-glicina con un gradiente del 4-20% de invitrogen^{TM} (gel con gradiente de poliacrilamida basado en la química de Laemmli pero sin SDS en el gel, (Laemmli, U.K., (1970) Nature, vol. 227, págs. 680-685), EC60255). La electroforesis fue realizada con un tampón de desplazamiento de Tris-glicina (2,9 g de base Tris; 14,4 g de glicina; 1,0 g de SDS, agua destilada hasta 1 litro) en ambas reservas del tampón a un voltaje constante de 150V hasta que el colorante marcador de azul de bromofenol ha alcanzó el fondo del gel. Después de la electroforesis, el gel fue enjuagado 3 veces; 5 minutos cada vez, con 100 ml de agua destilada por agitación suave. El gel fue luego suavemente agitado con el reactivo Gelcode® Blue Stain Reagent (producto coloidal Comassie G-250 de PIERCE, PIERCE cat. Nº. 24592) durante una hora y lavado con suave agitación durante 8 a 16 horas con agua destilada con diferentes cambios de agua destilada. Finalmente, el gel fue secado entre 2 trozos de celofán. Los geles secados fueron escaneados con un escáner Arcus II de AGFA equipado con el software Fotolook 95 v2.08 e importado al software de evaluación de imágenes CREAM^{TM} para Windows (catálogo nos. 990001 y 990005, Kem-En-Tec, Dinamarca) con el comando Fichero/Adquirir con los ajustes siguientes (de Fotolook 95 v2.08): Original=Reflectivo, Modo=Color RGB, resolución de escaneado=240 ppi, resolución de salida =1201pi, factor de escala =100%, Rango=Histograma con selección Global y Min=0 y Max=215, Curva de tono=Ninguna, Nitidez=Ninguna, Eliminación del moire=Ninguna y Sabor=Ninguno, de ese modo produciendo un fichero de imagen *.img del gel de SDS-PAGE, que fue usado para la evaluación en CREAM^{TM} El fichero de imagen *.img fue evaluado con el comando del menú análisis/1-D. Se colocaron dos líneas de escaneado en el fichero de imagen *.img con la herramienta de Colocación en filas: una línea de escaneado de la Muestra y una línea de escaneado de Información. La línea de escaneado de la Muestra fue colocada en el medio de una fila de la muestra (con la proteasa en cuestión) desde justo debajo de la ranura de aplicación hasta justo encima de la posición del colorante marcador de azul de bromofenol. La línea de escaneado de Información fue colocada paralela a la línea de escaneado de la Muestra, pero a una posición en el gel de SDS-PAGE fotografiado en el que ninguna muestra fue aplicada, los puntos de referencia de partida y finales para la línea de escaneado de Información fueron perpendiculares a los puntos de referencia de partida y finales de la línea de escaneado de la Muestra. La línea de escaneado de Información representa las características reales del gel. La anchura y forma de las líneas de escaneado no fueron ajustadas. La intensidad a lo largo de las líneas de escaneado fueron registradas en este momento con el comando menú 1-D/Scan con sensibilidad Media. Usando el comando menú 1-D/Editor, el escaneado de Información fue restado al escaneado de la Muestra. Luego el comando menú 1-D/Resultados fue seleccionado y el % del Área del valor máximo de la proteasa, según fue calculado por el software CREAM^{TM}, fue usado como la pureza de SDS-PAGE de las proteasas.

Todas las muestras de proteasa tienen una pureza de SDS-PAGE superior al 95%.

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Ejemplo 3 Determinación de la pureza de absorción

La proporción A_{280}/A_{260} de las muestras de proteasa purificadas fue determinada como sigue.

A_{260} significa la absorción de una muestra de proteasa a 260 nm en una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido con respecto a un tampón preliminar.

A_{280} significa la absorción de la misma muestra de proteasa a 280 nm en una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido con respecto a un tampón preliminar.

Las muestras de las proteasas purificadas del Ejemplo 1 fueron diluidas en el tampón hasta que la lectura de A280 del espectrofotómetro estuvo dentro de la parte lineal de su curva de respuesta. La proporción A_{280}/A_{260} fue determinada a partir de las lecturas. Los resultados siguientes fueron obtenidos: Proteasa 10: 1,94, Proteasa 18: 1,96, proteasa de Brachysporiella: 1,48, proteasa de Metarhizium: 1,95, Proteasa 08: 1,86, Proteasa 11: 1,95, Proteasa 35: 1,94.

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Ejemplo 4 Ensayo de proteasa - y la influencia de varios inhibidores en la estabilidad y actividad de las proteasas seleccionadas

La influencia de varios inhibidores potenciales en la actividad y estabilidad de las proteasas del Ejemplo 1 fue evaluada como se describe abajo.

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Tampón de ensayo

100 mM de ácido succínico (Merck 1,00682); 100 mM de HEPES (Sigma H-3375); 100mM de CHES (Sigma C-2885); 100 mM de CABS (Sigma C-5580); 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl; 0,01% Triton X-100 (Sigma T-9284) ajustado a pH 7.0 con NaOH.

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Inhibidores

Fe(II)SO_{4}7H_{2}O, Sigma F-7002

Cu(II)SO_{4}5H_{2}O, Merck 2790

Zn(II)Ac_{2}2H_{2}O, Merck 8802

Mg(II)C_{2}\cdot6H_{2}O, Merck 105832

Mn(II)Cl_{2}\cdot2H_{2}O, Merck 5934

Cloruro de colina, Aldrich C7,970-0

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Ensayo de pNA

Sustrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) o Boc-VLGR-pNA (Bachem L-1205). Temperatura: 25ºC.

20 ul (micro litro) proteasa (diluida en 0,01% Triton X-100) fue colocado en un pocillo de una placa de microtitulación. El ensayo fue comenzado añadiendo 200 ul de sustrato de pNA (50mg disuelto en 1,Oml de DMSO y después diluido 100x con tampón de ensayo). El aumento de la OD_{405} fue vigilado como una medida de la actividad de proteasa.

Relaciones de dosis/respuesta (OD_{405}/min versus (mg enzima)/l) fueron determinadas usando el ensayo de pNA para varias proteasas, con y sin los distintos inhibidores. Las curvas de dosis-respuesta fueron lineales sobre una amplia gama satisfactoria de concentraciones enzimáticas. Grados variables de inhibición fueron observados: algunas proteasas incluidas para fines comparativos, es decir. tripsina porcina y la proteasa SAVINASE^{TM} (una proteasa de subtilisina derivada de Bacillus clausü, comercialmente disponible por Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca) no fueron inhibidas, mientras que otras proteasas sí lo fueron. La adición de inhibidores a la p-nitroanilina ya desarrollada de color amarillo demostró no tener ningún efecto. En consecuencia se concluyó que el ensayo de pNA fue de hecho adecuado para medir la inhibición.

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Ensayo de estabilidad

La proteasa fue diluida hasta aprox. 1 mg/ml (ver abajo) en el tampón de ensayo con 0,1% (p/v) sorbato-K (sal de potasio de ácido sórbico) y 1 mM inhibidor. La mezcla fue incubada a 25ºC). Se retiró, por intervalos, una muestra de la incubación (después de una mezcla profunda) y se congeló. Después de la dilución en el tampón de ensayo, la actividad residual fue medida usando el ensayo de pNA. Para las adiciones de inhibidor de 1 mM, la incubación fue diluida en el tampón de ensayo con 5 mM de EDTA para ver un efecto de estabilidad pura.

Las concentraciones de proteasa fueron estimadas a partir de los coeficientes molares teóricos de extinción, E_{280} (1M), que pueden ser calculados a partir de la composición de los aminoácidos usando la fórmula: E_{280} (1M) = 5690 * N_{Trp} + 1280 * N_{Tyr} + 120 * N_{cys}, donde N_{Trp}, N_{Tyr}, y N_{cys} son el número de residuos de los aminoácidos Trp, Tyr, y Cys en la proteasa (Gill, S.C., von Hippel, P.H., Analytical Biochemistry 182, 319-326; (1989)) y el peso molecular, M_{W}, de la proteasa calculada de la secuencia de aminoácidos. De una medición de A_{280} de una muestra de proteasa pura (más del 95% de pureza según el Ejemplo 2), la concentración de proteasa fue calculada como: Conc (mg/ml) = (A_{280} * Mw)/E_{280} (1 M).

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Resultados de la inhibición

Las curvas de dosis/respuesta (OD_{405}/min versus (mg enzima)/l) no mostró ninguna inhibición de ninguna de las proteasas por Fe^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}, Mn^{2+} o cloruro de colina (en concentraciones de 1 mM, añadidas al tampón de ensayo). Cu^{2+}, no obstante, inhibió todas las proteasas evaluadas (hasta una extensión variable, según resulta de la Tabla 1 abajo).

Primero, el efecto de varias concentraciones de Cu^{2+} fue evaluado con una dosificación enzimática de 1 mg/l. Al menos en la gama de 0 a 1 mM de Cu^{2+} parecío haber una relación lineal entre la inhibición y la concentración de Cu^{2+}, la inhibición manifestándose ella misma como una reducción en la actividad enzimática con concentraciones crecientes de Cu^{2+} (la actividad enzimática midiéndose como promedio del aumento de OD_{405}/tiempo de la parte lineal de las curvas de dosis/respuesta).

La Tabla 1 muestra la actividad de las distintas proteasas evaluadas (a concentraciones enzimáticas de 1 mg/l, usando una concentración de Cu^{2+} de 1 mM, y usando Suc-AAPF-pNA como sustrato, a pH 7 y 25ºC), con respecto a un experimento de control que fue idéntico, salvo por el hecho de que no se añadió Cu^{2+}.

TABLA 1

1

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Resultados de la estabilidad

La estabilidad de las distintas proteasas en presencia de los distintos inhibidores en una concentración 1 mM fue evaluada según el modo descrito anteriormente. El único inhibidor que tuvo algún efecto en la estabilidad de algunas proteasas fue el Cu^{2+}. No obstante, el efecto de este inhibidor no fue el mismo en todas las proteasas: ver los resultados en la Tabla 2 a continuación, los cuales indican que la proteasa 18 y las proteasas de Brachysporiella son de hecho estables en presencia de 1 mM de Cu^{2+}, mientras que las otras proteasas no lo son.

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TABLA 2

2

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante es para la conveniencia lector sólo. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido bastante cuidado al redactar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este aspecto.

Documentos de patente citadas en la descripción

WO 8803947 A [0003] [0090]

DK 199600013 [0003]

WO 0158276 A [0003] [0078] [0079] [0191]

JP 2255081 A [0003] [0090]

DD 2004328 [0003] [0090]

EP 897985 A [0053]

WO 9617929 A [0054]

WO 9830682 A [0054]

WO 9835026 A [0054]

WO 9900489 A [0054]

WO 0026354 A [0054] [0054]

WO 9616177 A [0054]

WO 0026230 A [0054] [0054]

WO 0183559 A [0054]

EP 561907 A [0054]

WO 0022103 A [0054]

WO 9600787 A [0109] [0151]

WO 9533836 A [0127]

EP 238023 A [0151]

US 5689054 A [0161]

US 6111168 A [0161]

WO 9114772 A [0167]

WO 2000064247 A [0177]

WO 0158275 A [0185] [0215] [0216] [0218] [0221]

WO 03044049 A [0210]

WO 03048148 A [0210]

WO 9401459 A [0211]

WO 02090384 A [0211]

EP 258068 A [0247]

EP 305216 A [0247]

WO 9613580 A [0247]

EP 218272 A [0247]

EP 331376 A [0247]

GB 1372034 A [0247]

WO 9506720 A [0247]

WO 9627002 A [0247]

WO 9612012 A [0247]

JP 64744992 B [0247]

WO 9116422 A [0247]

WO 9205249 A [0247]

WO 9401541 A [0247]

EP 407225 A [0247]

EP 260105 A [0247]

WO 9535381 A [0247]

WO 9600292 A [0247]

WO 9530744 A [0247]

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\vskip1.000000\baselineskip

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<110> Novozymes A/S

\hskip1cm

Oestergaard, Peter Rahbek

\hskip1cm

De Maria, Leonardo

\vskip0.400000\baselineskip

<120> proteasas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 10604.504-wo

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Versión de patentIn 3.2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1596

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (900)..(1466)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis sp. NRRL 18262

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Metarhizium anisopliae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1122)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(54)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (559)..(1122)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

6

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Metarhizium anisopliae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1062

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis prasina DSM 15648

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1059)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (496)..(1059)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis prasina DSM 15648

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1062

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis prasina DSM 15649

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1059)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (496)..(1059)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis prasina DSM 15649

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1068

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis alba

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1065)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (502)..(1065)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nocardiopsis alba

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1065

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> subespecie dassonvillei de Nocardiopsis dassonvillei

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1062)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (499)..(1062)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> subespecie dassonvillei de Nocardiopsis Dassonvillei

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brachysporiella gayana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159).. (1283)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_péptido

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (726).. (1283)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brachysporiella gayana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

Claims

1. Proteasa de la familia de la peptidasa S2A y/o de la familia de la peptidasa S1E que

i) tiene una actividad residual de al menos 0,80 después la incubación durante 164 horas, a pH 7 y 25ºC, en el tampón de ensayo suplementado con 0,1% de sorbato-K, y en la presencia de 1 mM de Cu^{2+}, la actividad residual midiéndose con respecto a la actividad después de 0 horas de incubación; y/o

ii) tiene una actividad relativa de al menos 0,67 en presencia de 1 mM de Cu^{2+}, con respecto a un control sin Cu^{2+};

donde las mediciones de la actividad de i) y ii) están en el sustrato Suc-AAPF-pNA, en el tampón de ensayo a pH 7.0 y 25ºC; y

donde para las mediciones de i), la proteasa tiene una pureza por SDS-PAGE de al menos el 90%; dicha proteasa

iii) comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende al menos uno de los siguientes:

a) (T120+R122+T127+Y129), (T120+N122+P127+F129), o (T120+S122+T127+Q129); y/o

b) (T91+T176+1179+N180), o (S91+N176+L179+E180),

donde la numeración de cada residuo de aminoácido corresponde a la numeración de la proteasa 10 que consiste en los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2.

2. Proteasa según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, no comprende ninguno de los siguientes:

a) (T120+N122+Al27+S129), y no

b) (5120+S122+T127+T129);

3. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, no comprende ninguno de los siguientes:

a) (S91+N 76+L179+Q180), y no

b) (H91+T176+V179+N180);

4. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, no comprende ninguno de los siguientes:

a) (V51 + Q54 + A86 + A89 + H91 + S99 + S120 + S122 + E125 + T127 + T129 + N130 + M131 + T135 + R165 + T166 + T176 + V179 + N180), y no

b) (T51 + G54 + P86 + S89 + S91 + S99 + T120 + N122 + Q125 + Al27 + S129 + S130 + L131 + S135 + S165 + R166 + N176 + L179 + Q180);

5. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende al menos uno de los siguientes:

T51; N54 o G54; Q86 o P86; T89 o F89; T91 o S91; A99 o G99; T120; R122 o N122; Q125 o V125; T127 o P127; Y129 o F129; S130 o G130; L131; N135 o S135; S165 o T165; V166 o S166; T176 o N176; 1179 o L179; N180 o E180,

6. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende:

a) (T51 + N54 + Q86 + T89 + T91 + A99 + T120 + R122 + Q125 + T127 + Y129 + S130 + L131 + N135 + S165 + V166 + T176 + 1179 + N180), o

b) (T51 + G54 + P86 + F89 + S91 + G99 + T120 + N122 + V125 + P127 + F129 + G130 + L131 +S 135+T 165+S 166+N 176+L 179+E 180);

7. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que, cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende (H35+D61+S143), donde la numeración de cada residuo de aminoácido corresponde con la numeración de la Proteasa 10 que consiste en los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2.

8. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una secuencia de aminoácidos que cuando está alineada conforme a la Fig. 1, comprende:

(A33 + G34 + H35 + C36 + G37); D61; y (C137 + A138 + E139 + P140 + G141 + D142 + S143 + G144 + G145), donde la numeración de cada residuo de aminoácido corresponde con la numeración de la Proteasa 10 que consiste en los aminoácidos 1-188 de la SEC ID NO: 2.

9. Proteasa según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que, además, es uno de los siguientes:

(a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de al menos el 40% con los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; y/o con los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6,402;

(b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida bajo condiciones de baja astringencia con

(i): la parte codificante de la proteasa madura del plásmido contenido en Escherichia coli DSM 15509,

(ii): los nucleótidos 726-1283 de la SEC ID NO: 13, los nucleótidos 499-1062 de la SEC ID NO: 11, los nucleótidos 502-1065 de la SEC ID NO: 9, los nucleótidos 496-1059 de la SEC ID NO: 7, los nucleótidos 496- 1059 de la SEC ID NO: 5, los nucleótidos 559-1122 de la SEC ID NO: 3, y/o los nucleótidos 900-1466 de la SEC ID NO: 1,

(iii): una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o

(iv): una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii);

(c) una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 186 de la SEC ID NO: 14; y/o los aminoácidos 1-188 de las SEC ID Nos: 12, 10, 8, 6, 4 o 2 que comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos;

(d) una variante alélica de (a) o (b ); y

(e) un fragmento de (a), (b), o (d) con actividad proteasa.

10. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 10 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.

12. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 11.

13. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 11 o el vector según la reivindicación 12.

14. Método para la producción de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, el método comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 13 para producir un sobrenadante que comprende el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

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15. Planta transgénica, o parte de la planta, capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

16. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos de los mismos, siendo capaces de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

17. Uso de al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 (i) en piensos (ii) en la preparación de una composición para el uso en piensos; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un pienso; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en las dietas de animales; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en las dietas de animales; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas vegetales.

18. Aditivo para piensos comprendiendo al menos una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(a) al menos una vitamina liposoluble, y/o

(b) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o

(c) al menos un mineral traza.

19. Aditivo para piensos según la reivindicación 18 que contiene Cu, preferiblemente en una cantidad tal como para proporcionar una concentración de Cu de 1-500 ppm en el pienso.

20. Aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 18-19 que contiene Cu en una concentración de hasta 100.000 ppm.

21. Composición para piensos que tiene un contenido de proteína en bruto de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o al menos un aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 18-20.

22. Composición según la reivindicación para piensos 21 que contiene Cu, preferiblemente en una concentración de 1-500 ppm.

23. Composición de detergente comprendiendo al menos una proteasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y al menos un agente tensioactivo.